KR20100134687A

KR20100134687A - 5-원 고리 화합물

Info

Publication number: KR20100134687A
Application number: KR1020107023682A
Authority: KR
Inventors: 히토시 후지타; 준야 이케다; 사토키 이마이
Original assignee: 다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2009-04-23
Publication date: 2010-12-23
Also published as: CN102076682A; EP2272844A4; WO2009131170A1; US20110039848A1; JPWO2009131170A1; CA2722007A1; EP2272844A1

Abstract

본 발명은 화학식 (1) 로 나타내는 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 상기 화합물 또는 염을 함유하는 의약을 제공한다. 상기 화합물 또는 염은 호산구 및 림프구 등의 백혈구의 침윤을 억제하며 각종 염증의 치료제로서 유효하며, 상기 화합물을 장기간 복용할 수 있을 정도로 안정하다.

(1)
[식 중, R¹ 은 (치환된) 페닐 또는 피리딜이고; R² 는 (치환된) 피라진디일, 피리미딘디일 또는 피리다진디일이고; R³ 내지 R⁵ 는 각각 알킬 (단, -N(R⁴)(R⁵) 는 모르폴리노일 수 있다) 이고; Y² 는 알킬렌이다]

Description

5-원 고리 화합물 {FIVE-MEMBERED RING COMPOUND}

본 발명은 신규한 5-원 고리 화합물 또는 그 염, 및 그 의약 용도에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 L-트레오-3-(3,4-디히드록시페닐)-N-[3-(4-플루오로페닐)프로필]세린 피롤리딘 아미드의 생체 내 특이적 결합 부위에 결합해, 호산구, 림프구 등을 비롯한 백혈구의 침윤을 저해함으로써 각종 염증의 치료에 유효한 신규한 5-원 고리 화합물 또는 그 염 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

기관지 천식에 있어서의 호흡 곤란의 실험 모델로서 아토피성 천식 환자에게 알레르겐을 흡입 투여시켜 즉시형 천식 반응 (immediate asthmatic response; IAR) 을 일으키는 방법이 실시되고 있다. 구체적으로는, 아토피성 천식 환자에게 알레르겐을 흡입 투여하면, 투여 약 20 분 후에 천식 반응 (즉, 기관지 경련) 이 일어나고, 약 2 시간 후에는 회복된다. 상기 환자를 계속 관찰하자, 그의 약 절반의 환자에 있어서 6 내지 10 시간 후에 다시 기관지 경련이 일어나며, 이는 만기 천식 반응 (Late asthmatic response; LAR) 으로 일컬어진다. 만기 천식에서는, 기관지 경련 반응이 폐의 과대팽창을 수반하며 길게 지속되는데, 이 반응은 스테로이드제에 따라 강하게 억제된다. 따라서, 상기 알레르겐에 의해 유발된 기관지 천식이 스테로이드-의존성 중증의 기관지 천식의 호흡 곤란에 있어서의 임상 모델로서 중요한 것으로 인식되고 있다. 또한, 즉시형 반응은 IgE 항체에 의한 비만 세포 활성화의 결과로서 유발되는 I 형 알레르기로, 만기 반응은 T 림프구와 호산구성 알레르기 (즉, 호산구성 염증) 로 인식되고 있다. 이들 즉시형 및 만기 반응은 또한 알레르기성 비염 및 피부염에 의해서도 유발되는 것이 명백해지고 있다. 기관지 천식 환자에게 있어서 알레르겐에 의해 만기 천식 반응이 유발되는 경우 폐에 호산구가 축적되는 것으로 보고되고 있다. 다수의 기관지 천식 환자의 혈액 및 객담 중에 호산구 증가가 발견되고, 천식으로 사망한 환자의 폐 조직에서 상당한 수의 호산구의 침윤이 발견되고, 환자의 기관지 벽 및 점액전에서 호산구 유래의 조직 상해성 단백질인 주 기저 단백질 (major basic protein; MBP) 의 침착이 발견되는 것 등으로 인해, 만기 천식 발작에 수반되는 기도 표피의 상해에 있어서 호산구 유래의 산물이 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 여겨지고 있다.

스테로이드제는 중증의 기관지 천식 및 아토피성 피부염에 대한 유일한 특효약이지만 이는 강한 효험과 동시에 고혈압, 당뇨병, 비만, 면역 억제, 백내장, 정신 질환, 피부 위축 등을 비롯한 부작용도 갖고 있다. 흡입 스테로이드제는 전신적인 부작용을 경감시킬 목적으로 개발되었지만, 흡입 스테로이드제가 전신을 순환하고 있지 않다는 증명이 곤란하기 때문에 흡입 스테로이드제에 잠재된 부작용에 대한 염려가 불식되고 있지 않다. 최근, 유럽 및 미국에서는 흡입 스테로이드제의 부작용이 보고되어 있어, FDA 는 기관지 천식 치료용 흡입 스테로이드제 및 알레르기성 비염 치료용 경비 스테로이드제의 부작용의 위험성에 관한 경고문을 포장 첨가물에 만들어 넣도록 지시하고 있다.

전술한 바와 같이, 호산구의 연관 부위로의 침윤은, 기관지 천식뿐 아니라 알레르기성 피부염 및 비염의 만기 반응의 발증 및 악화에 중요 역할을 담당하고 있다. 그러나, 호산구의 침윤 및 활성화를 저해함으로써 기관지 천식을 비롯한 알레르기 질환을 치료하는 특효약은 스테로이드제만 존재하여, 스테로이드제를 대체할 수 있는 부작용이 적은 경구 투여가능 항염증제가 의료 현장에서 요구되고 있다. 예를 들어, 호산구성 염증을 억제하는 약제를 개발하려고 시도하기 위해, 호산구 전구 세포의 증식 및 분화, 및 성숙 호산구의 생존 연장을 일으키는 인터류킨 5 를 중화하는 항체인 항 IL-5 중화 항체, 호산구-특이적 접착 인자 매우 늦은 항원 4 (Very Late Antigen 4; VLA-4) 의 저분자 저해제, 및 호산구 이동을 일으키는 호산구-특이적 케모카인 에오탁신 수용체 CCR3 에 대한 저분자 길항제가 고려되고 있지만, 스테로이드제를 대체하는 것은 아니었다.

한편, L-트레오-3-(3,4-디히드록시페닐)-N-[3-(4-플루오로페닐)프로필]세린 피롤리딘 아미드는 호산구 이동에 대해 저해 작용을 갖는 것으로 알려져 있다 (특허문헌 1). L-트레오-3-(3,4-디히드록시페닐)-N-[3-(4-플루오로페닐)프로필]세린 피롤리딘 아미드의 생체 내에서의 특이적 결합 부위는 수용체-형 막 단백질이며, 이는 SMBS 단백질 (SMBP) 이라고도 일컬어지고 있다 (특허문헌 1).

따라서, SMBS 단백질에 결합함으로써, 호산구 이동을 저해하면, 천식을 비롯한 알레르기 질환, 만성 폐쇄성 폐질환을 치료하는 것이 가능하다.

일부 저분자 화합물이 SMBS 단백질에 결합함으로써 천식을 비롯한 알레르기 질환의 치료제로서 유용한 것으로 알려져 있다 (특허문헌 2, 3, 4).

WO 98/26065 호 팜플렛 WO 02/002542 호 팜플렛 WO 2003/057693 호 팜플렛 JP-A-2005-206515 호

본 발명의 과제는, 호산구, 림프구 등을 비롯한 백혈구의 침윤을 저해함으로써 각종 염증의 치료제로서 유효하고 장기간 투여에 있어서 안정성이 높은 화합물 및 이를 포함하는 의약을 제공하는 것이다.

천식 등의 치료용 약제는 장기간 투여하는 것으로 여겨지기 때문에, 안전성이 높은 약제의 사용이 특히 요망되고 있다. 특허문헌 2 에 개시된 화합물은 화합물 농도가 현저히 높은 경우 래트 스테로이드 호르몬 합성에 대해 저해 작용을 갖는 것으로 밝혀졌다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, 특허문헌 2 에 개시된 약리 시험과 래트 스테로이드 호르몬 합성 저해의 평가 시험을 이용하여 선별함으로써, 모르폴리노 또는 디알킬아미노로 치환된 피라지닐, 피리미디닐 또는 피리다지닐이 티아졸리논의 4 위치에 부착되어 있는 구조적 특징을 갖는 화합물에 있어서, SMBS 와의 결합을 통해 호산구, 림프구 등을 비롯한 백혈구의 침윤을 저해함으로써 각종 염증의 치료제로서 유효하며, 스테로이드 호르몬 합성에 대한 저해 작용을 현저히 감소시키는 화합물을 찾아내어, 본 발명을 완성하였다.

본 출원의 본 발명은 다음과 같다:

[1] 하기 화학식 (1) 의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:

[화학식 1]

(식 중, R¹ 은 할로겐 원자, C₁-C₃ 알킬, C₁-C₃ 알콕시 또는 트리플루오로메틸로 임의적으로 치환된 페닐; 또는 할로겐 원자, C₁-C₃ 알킬, C₁-C₃ 알콕시 또는 트리플루오로메틸로 임의적으로 치환된 피리딜이고;

R² 는 할로겐 원자 또는 C₁-C₃ 알킬로 임의적으로 치환된 피라진디일; 할로겐 원자 또는 C₁-C₃ 알킬로 임의적으로 치환된 피리미딘디일; 또는 할로겐 원자 또는 C₁-C₃ 알킬로 임의적으로 치환된 피리다진디일이고;

R³ 은 C₁-C₃ 알킬이고;

R⁴ 및 R⁵ 는 각각 독립적으로 C₁-C₃ 알킬이거나; 또는 -N(R⁴)R⁵ 가 모르폴리노일 수 있고;

Y² 는 C₂-C₄ 알킬렌이다].

[2] R² 가 할로겐 원자 또는 C₁-C₃ 알킬로 임의적으로 치환된 피리다진디일인 상기 [1] 의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.

[3] R² 가 피리다진디일인 상기 [1] 의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.

[4] -N(R⁴)R⁵ 가 모르폴리노인 상기 [1] 의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.

[5] R¹ 이 할로겐 원자로 임의적으로 치환된 페닐인 상기 [1] 의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.

[6] R³ 이 메틸 또는 에틸이고, Y² 가 C₂-C₃ 알킬렌인 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.

[7] 파선이 (Z)-배위를 의미하는 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.

[8] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증 치료제.

[9] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 자기면역성 염증 또는 알레르기성 염증 치료제.

[10] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환 치료제.

[11] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 기관지 천식 치료제.

[12] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 비염 치료제.

[13] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 염증 치료 방법.

[14] 염증 치료제의 제조에 있어서의 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도.

본 발명의 5-원 고리 화합물 또는 그 염은 호산구, 림프구 등을 비롯한 백혈구의 침윤을 저해하고, 그에 따라 각종 염증의 치료제를 제공하는 것이 가능하게 되었다.

각각의 치환기는 본 명세서에서 하기의 의미를 지닌다.

"C₁-C₃ 알킬" 에는 직쇄- 또는 분지-쇄 C₁-C₃ 알킬, 특히 메틸, 에틸, n-프로필, 2-프로필이 포함된다. 바람직한 것에는 메틸, 에틸이 포함되며, 더욱 바람직하게는 메틸이다.

"C₁-C₃ 알콕시" 에는 직쇄- 또는 분지-쇄 C₁-C₃ 알콕시, 특히 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 2-프로폭시가 포함된다. 바람직한 것에는 메톡시, 에톡시가 포함되며, 더욱 바람직하게는 메톡시이다.

"할로겐 원자" 에는 불소, 염소, 브롬, 요오드, 바람직하게는 불소, 염소, 브롬, 더욱 바람직하게는 불소, 염소가 포함된다.

"C₂-C₄ 알킬렌" 에는 직쇄- 또는 분지-쇄 C₂-C₄ 알킬렌, 특히 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌, 메틸에틸렌, 2-메틸트리메틸렌, 등이 포함된다. 바람직한 것에는 에틸렌, 트리메틸렌이 포함된다.

R¹ 이 치환기로 치환되는 경우, R¹ 의 치환기는 상동 또는 상이하며 치환기 개수는 1 내지 3 이다.

본 발명의 화학식 (1) 의 5-원 고리 화합물은 약학적으로 허용되는 염일 수 있다. 약학적으로 허용되는 염으로서는, 산 부가 염 및 염기 부가 염을 들 수 있다. 산 부가 염으로서는, 염산염, 브롬화수소산염, 황산염 등의 무기산 염, 및 시트르산염, 옥살산염, 말산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 말레산염 등의 유기산 염 등을 들 수 있다.

본 발명에 포함되는 화합물은 비대칭 중심 또는 비대칭 탄소를 갖는 임의의 치환기를 가질 수 있으며, 임의의 광학 이성질체 및 기하 이성질체를 가질 수 있다. 본 발명은 각 이성질체의 혼합물 및 단리된 이성질체를 포함한다. 아울러 본 발명은 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 수화물을 비롯한 용매화물도 포함한다.

본 발명의 화학식 (1) 의 5-원 고리 화합물은 하기 방법 및 이의 변형에 따라 제조할 수 있다.

제조법 1

화합물 (1) 은 하기 방법으로 제조된다.

[화학식 2]

[식 중, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 Y² 는 상기에서 정의한 바와 동일한 의미를 지님. X¹ 는 할로겐 원자, 예컨대 염소, 브롬임].

티오우레아 화합물 (3) 을 α-할로케톤 화합물 (4) 와 염기의 존재 또는 부재하 용매 중에서 반응시켜 화합물 (1) 을 수득한다. 용매에는 메탄올, 에탄올, 2-프로판올과 같은 알코올 용매, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란 (THF) 과 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매, 디메틸포름아미드와 같은 비프로톤성 (aprotic) 용매, 톨루엔과 같은 방향족 용매 등이 포함된다. 염기에는 트리에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘과 같은 유기 아민, 탄산칼륨, 탄산나트륨과 같은 무기 염기, 등이 포함된다. 반응 온도는 실온 내지 용매의 비등점 범위에서 선택한다.

제조법 2

화합물 (1) 은 또한 하기 방법에 따라 제조된다. 이 제조법은 R³ 의 도입시 보호기가 요구되는 경우에 유용하다. 통상적인 아미노기의 보호기를 보호기로서 사용할 수 있으며, 하기의 제조법에서는 2-메틸-2-프로필옥시카르보닐 (이하, Boc 로 지칭함) 을 보호기로 이용하여 예시한다.

[화학식 3]

[식 중, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, X¹ 및 Y² 는 상기에서 정의한 의미와 동일한 의미를 지님].

티오우레아 화합물 (5) 을 염기의 존재 또는 부재하 용매 중에서 α-할로케톤 화합물 (4) 과 반응시켜 화합물 (6) 을 수득한다. 용매에는 메탄올, 에탄올, 2-프로판올과 같은 알코올 용매, 디에틸에테르, THF 과 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매, 디메틸포름아미드와 같은 비프로톤성 용매, 톨루엔과 같은 방향족 용매 등이 포함된다. 염기에는 트리에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘과 같은 유기 아민, 탄산칼륨, 탄산나트륨과 같은 무기 염기가 포함된다. 반응 온도는 실온 내지 용매의 비등점 범위에서 선택한다.

이어서, 화합물 (6) 을 산의 존재 하, 용매 중에서 탈보호화하여 화합물 (7) 을 수득한다. 산에는 염산과 같은 무기산, 및 트리플루오로아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 용매에는 디에틸에테르, THF, 디옥산과 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매 등이 포함된다. 반응 온도는 약 0℃ 내지 용매의 비등점 범위에서 선택된다.

화합물 (7) 을 상응하는 이소시아네이트 또는 카르밤산 에스테르와 같은 화합물과 염기의 존재 또는 부재 하 용매 중에서 반응시켜, 화합물 (1) 을 수득한다. 상기 화합물의 구체적인 예에는 알킬 이소시아네이트, 에틸 알킬 카르바메이트, 등이 포함된다. 용매에는 디에틸에테르, THF 와 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매, 디메틸포름아미드와 같은 비프로톤성 용매, 톨루엔과 같은 방향족 용매 등이 포함된다. 염기에는 트리에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘과 같은 유기 아민, 탄산칼륨, 탄산나트륨과 같은 무기 염기, 등이 포함된다. 반응 온도는 실온 내지 용매의 비등점 범위에서 선택한다.

제조법 3

화합물 (1) 은 또한 하기 방법에 따라 제조된다.

[화학식 4]

[식 중, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 Y² 는 상기에서 정의한 의미와 동일한 의미를 지님. R¹⁰ 은 알킬, 또는 할로겐 원자 또는 니트로로 치환된 페닐임].

화합물 (7) 을 클로로포르메이트 (예, R¹⁰OCOCl (식 중, R¹⁰ 은 상기에서 정의한 바와 동일함)) 와 용매 중 염기의 존재 또는 부재 하에서 반응시켜 화합물 (8) 을 수득한다. 용매에는 디에틸에테르, THF 와 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매, 디메틸포름아미드와 같은 비프로톤성 용매, 톨루엔과 같은 방향족 용매, 등이 포함된다. 염기에는 트리에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘과 같은 유기 아민, 및 탄산칼륨, 탄산나트륨과 같은 무기 염기가 포함된다. 반응 온도는 실온 내지 용매의 비등점 범위에서 선택한다.

화합물 (8) 을 R³NH₂ 의 아민과, 용매 중 염기의 존재 또는 부재 하에서 반응시켜 화합물 (1) 을 수득한다. 용매에는 디에틸에테르, THF, 디옥산과 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매, 등이 포함된다. 염기에는 상기에 기술된 바와 같은 염기가 포함된다. 반응 온도는 약 0℃ 내지 용매의 비등점 범위에서 선택된다.

상기 제조법 1 내지 3 에서 사용한 출발 물질은 하기 방법에 따라 제조한다.

[화학식 5]

[식 중, R¹, R³, R¹⁰ 및 Y² 는 상기에서 정의한 바와 동일한 의미를 가짐].

아민 화합물 (9) 을, 이소티오시아네이트 화합물 (10) 또는 디티오카르밤산 에스테르 (11) 와 용매 중에서 반응시켜, 티오우레아 화합물 (3) 을 수득한다. 용매에는 메탄올, 에탄올, 2-프로판올과 같은 알코올 용매, 디에틸에테르, THF 과 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매, 디메틸포름아미드와 같은 비프로톤성 용매, 톨루엔과 같은 방향족 용매, 등이 포함된다. 반응 온도는 실온 내지 용매의 비등점 범위에서 선택한다.

[화학식 6]

[식 중, R¹, R³, R¹⁰ 및 Y² 는 상기에서 정의한 바와 동일한 의미를 지님].

아민 화합물 (12) 을, 이소티오시아네이트 화합물 (13) 또는 디티오카르밤산 에스테르 (14) 와 용매 중 반응시켜 티오우레아 화합물 (3) 을 수득할 수 있다. 용매에는 메탄올, 에탄올, 2-프로판올과 같은 알코올 용매, 디에틸에테르, THF 과 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매, 디메틸포름아미드와 같은 비프로톤성 용매, 톨루엔과 같은 방향족 용매, 등이 포함된다. 반응 온도는 실온 내지 용매의 비등점 범위에서 선택한다.

2-메틸-2-프로필옥시카르보닐, 등으로 보호된 티오우레아 화합물 (5) 은 하기 방법으로 수득한다.

[화학식 7]

[식 중, R¹, R¹⁰, Y² 및 Boc 는 상기에서 정의한 바와 동일한 의미를 지님].

아민 화합물 (15) 을 이소티오시아네이트 화합물 (10) 또는 디티오카르밤산 에스테르 (11) 와 용매 중 반응시켜 티오우레아 화합물 (5) 을 수득할 수 있다. 용매에는 메탄올, 에탄올, 2-프로판올과 같은 알코올 용매, 디에틸에테르, THF 과 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매, 디메틸포름아미드와 같은 비프로톤성 용매, 톨루엔과 같은 방향족 용매, 등이 포함된다. 반응 온도는 실온 내지 용매의 비등점 범위에서 선택한다.

[화학식 8]

[식 중, R¹, R¹⁰, Y² 및 Boc 는 상기에서 정의한 바와 동일한 의미를 지님.]

아민 화합물 (12) 을 이소티오시아네이트 화합물 (16) 또는 디티오카르밤산 에스테르 (17) 와 용매 중 반응시켜 티오우레아 화합물 (5) 을 수득할 수 있다. 용매에는 메탄올, 에탄올, 2-프로판올과 같은 알코올 용매, 디에틸에테르, THF 과 같은 에테르 용매, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 용매, 디메틸포름아미드와 같은 비프로톤성 용매, 톨루엔과 같은 방향족 용매, 등이 포함된다. 반응 온도는 실온 내지 용매의 비등점 범위에서 선택한다.

이소티오시아네이트 화합물 (10), (13) 및 (16) 은 시중에서 입수가능하거나, 또는 상응하는 아미노 화합물로부터 예를 들어 문헌 [Synlett. 1997, 773-774, J. Org. Chem., 1997, 62, 4539-4540], 또는 [J. Med. Chem., 1984, 27, 1570-1574] 의 방법에 따라 합성할 수 있고, 또한 상응하는 카르복실산 화합물로부터 예를 들어 문헌 [Synth. Commun. 1997, 27, 751-756] 또는 [Indian, J. Chem., 1998, 1153-1156] 의 방법에 따라 합성할 수 있다.

디티오카르밤산 에스테르 화합물 (11), (14) 및 (17) 은 시중에서 입수가능하거나, 또는 상응하는 아미노 화합물로부터 예를 들어 문헌 [J. Chem. Soc. 1956, 1644-1649] 또는 [Syn. Commun. 1984, 537-546] 의 방법에 따라 합성할 수 있다.

α-할로케톤 화합물 (4) 는 시중에서 입수가능하거나, 또는 예를 들어 문헌 [Bioorganic & Medicinal Chemicstry, 2005, 13, 3705] 의 방법에 따라 합성할 수 있다.

본 발명의 5-원 고리 화합물 (1) 또는 이를 제조하기 위한 중간체는 통상적인 방법으로 정제할 수 있다. 본 발명의 5-원 고리 화합물 (1) 또는 이를 제조하기 위한 중간체는 여러 이성질체를 갖는 경우에도 또한 유사한 방법으로 정제할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 칼럼 크로마토그래피, 재결정화 등으로 정제할 수 있다. 재결정화를 위한 용매로서는, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 2-프로판올 등의 알코올 용매, 디에틸에테르 등의 에테르 용매, 에틸 아세테이트 등의 에스테르 용매, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소 용매, 아세톤 등의 케톤 용매, 헥산 등의 탄화수소 용매 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있다.

순수 광학 이성질체를 얻는 방법으로는 광학 분할법을 들 수 있다. 광학 분할법으로는, 본 발명의 화합물 또는 그 중간체가 아미노기 등의 염기성 치환기를 갖는 경우에는 불활성 용매 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올 등의 알코올 용매, 디에틸 에테르 등의 에테르 용매, 에틸 아세테이트 등의 에스테르 용매, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소 용매, 아세토니트릴 및 이들의 혼합 용매) 중에서 광학 활성 산 (예를 들어, 만델산, N-벤질옥시알라닌, 락트산 등의 모노카르복실산, 타르타르산, O-디이소프로필리덴타르타르산, 말산 등의 디카르복실산, 캠퍼술폰산, 브로모캠퍼술폰산 등의 술폰산) 으로 처리하여 염을 형성하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 그 중간체가 카르복실기 등의 산성 치환기를 갖는 경우에는, 광학 활성 아민 (예를 들어, α-페네틸아민, 키닌, 퀴니딘, 신코니딘, 신코닌, 스트리크닌 등의 유기 아민) 으로 처리하여 염을 형성하는 방법을 채용할 수 있다. 상기 광학 분할법에 있어서 염을 형성시키는 반응 온도는, 실온 내지 용매의 비점의 범위를 들 수 있다. 광학 순도를 향상시키기 위해서는, 일단, 용매의 비점 부근까지 반응 온도를 올리는 것이 바람직하다. 석출된 염을 여과하기 전에 필요에 따라 임의적으로 냉각시킴으로써 수율을 향상시킬 수 있다. 광학 활성 산 또는 아민은 기재에 대해 약 0.5 내지 약 2.0 당량의 범위, 바람직하게는 1 당량 정도의 범위로 사용하는 것이 적절하다. 수득한 결정을 임의적으로는 불활성 용매 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올 등의 알코올 용매, 디에틸 에테르 등의 에테르 용매, 에틸 아세테이트 등의 에스테르 용매, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소 용매, 아세토니트릴 및 이들의 혼합 용매) 중에서 재결정화하여 고수율의 광학 활성 염을 수득할 수 있다. 또한, 수득한 염을 임의적으로는 통상적인 방법으로 산 또는 염기로 처리하여 유리 형태를 수득할 수도 있다.

본 발명의 화학식 (1) 의 5-원 고리 화합물 또는 그 염은 의약으로서 유용하고, 특히 호산구, 림프구 등을 비롯한 백혈구의 침윤 저해 작용을 갖는다. 이러한 작용으로 인해, 자기면역성 염증, 알레르기성 염증, 급성 염증, 기타 세포 침윤성 염증성 질환 등의 치료제로서 유용하다. 상기 자기면역성 염증으로는 류머티즘, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, I 형 당뇨병 등을 들 수 있다. 상기 알레르기성 염증으로는 기관지 천식, 염증성 장 질환, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 두드러기, 알레르기성 결막염 등을 들 수 있다. 본 발명의 5-원 고리 화합물은 기관지 천식 중 특히 만기 천식에 유용하다. 상기 급성 염증으로는 염증성 폐 질환 등을 들 수 있다. 기타 염증성 질환으로는 호산구 증가증, 호산구성 혈관염, 호산구성 육아종, 이식 거부, 종양 전이 등을 들 수 있다. 본 발명의 화합물은 항염증제로서 사용하는 경우 염증성 질환의 치료제로서의 스테로이드제와 병용 투여될 수 있고, 이와 같이 병용하면 본 발명의 화합물의 치료 효과가 증강될 수 있어 부작용이 강한 스테로이드제의 감량이나 배제가 가능해진다. 본 발명의 화합물은 알레르기 질환 치료제로서 사용하는 경우 항알레르기제 (화학적 전달자 유리 저해제, 항히스타민제, 항류코트리엔제, 항트롬복산제 등을 포함), 및 기관지 천식에 있어서는 기관지확장제 (테오필린, β-자극제를 비롯한 크산틴 제제를 포함), 항콜린제, 스테로이드제와 병용 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 류마티즘 등의 자기면역 질환의 치료제로서 사용하는 경우 시클로옥시게나아제 (COX) 저해제 등의 비스테로이드성 항염증제와 병용 투여할 수 있다.

본 발명의 5-원 고리 화합물 또는 그 염은 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 경구 투여는 통상적인 투여 형태로 실시될 수 있다. 비경구 투여는 국소 투여, 주사, 경피 투여, 경비 투여 등의 형태로 실시될 수 있다. 경구제 또는 직장 투여제로는 캡슐, 정제, 필, 분말, 카세제, 좌제, 액제 등을 들 수 있다. 주사제로는 멸균액 또는 현탁액 등을 들 수 있다. 국소 제제로는 크림, 연고 로션, 경피제 (통상적인 패치, 매트릭스 포함) 등을 들 수 있다.

상기의 투여 형태는 통상적인 방법으로 약학적으로 허용되는 부형제 및 첨가제를 이용하여 제형화된다. 약학적으로 허용되는 부형제 및 첨가제로는 담체, 결합제, 향료, 완충제, 증점제, 착색제, 안정화제, 유화제, 분산제, 현탁화제, 보존제 등을 들 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 탄산마그네슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 설탕, 락토오스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등을 들 수 있다.

캡슐제는 본 발명의 화합물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 캡슐 안에 넣어 제형화할 수 있다. 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 부형제와 함께, 또는 부형제 없이 혼합함으로써 캡슐 안에 넣을 수 있다. 카세제도 또한 유사한 방법으로 제형화할 수 있다.

분말제는 약학적으로 허용되는 분말 기제와 함께 제형화된다. 이러한 기제로는 활석, 락토오스, 전분 등을 들 수 있다. 점적제는 수용성 또는 비수용성 기제 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 확산제, 현탁화제, 용해보조제 등과 함께 제형화할 수 있다.

주사용 액제로는 용액, 현탁액, 에멀젼, 예컨대 수용액, 물-프로필렌 글리콜 용액 등을 들 수 있다. 상기 액제는 물을 함유할 수 있고 또한 폴리에틸렌 글리콜 또는/및 프로필렌 글리콜 용액 형태로 제조할 수도 있다. 경구 투여에 적절한 액제는 본 발명의 화합물을 물에 첨가하고 필요에 따라 착색제, 향료, 안정화제, 감미제, 용해보조제, 증점제 등을 함께 첨가하여 제조할 수 있다. 경구 투여에 적절한 액제는 본 발명의 화합물을 분산제와 함께 물에 첨가하여 증점시킴으로써 제조할 수 있다. 증점제로는 약학적으로 허용되는 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 또는 공지된 현탁화제를 들 수 있다.

국소 제제로는 상기 액제, 및 크림, 에어로졸, 스프레이, 분말, 로션, 연고 등을 들 수 있다. 국소 제제는 본 발명의 화합물을 통상적인 약학적으로 허용되는 희석제 및 담체와 혼합하여 제조할 수 있다. 연고 및 크림은 수성 또는 유성 기제에 증점제 및/또는 겔화제를 첨가하여 제형화할 수 있다. 상기 기제로는 물, 액체 파라핀, 식물유 (땅콩유, 피마자유 포함) 를 들 수 있다. 증점제로는 연성 파라핀, 스테아르산알루미늄, 세토스테아릴 알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 라놀린, 수소화 라놀린, 밀랍 등을 들 수 있다.

로션의 경우, 수성 또는 유성 기제에 하나 이상의 약학적으로 허용되는 안정화제, 현탁화제, 유화제, 확산제, 증점제, 착색제, 향료 등을 첨가할 수 있다.

국소 제제는 임의적으로는 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 클로로크레졸, 염화벤잘코늄을 비롯한 방부제, 세포-증식 방지제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 용액 스프레이, 분말 또는 점적제의 형태로 경비적으로 투여할 수도 있다.

투여량 및 투여 횟수는 증상, 연령, 체중, 투여 형태에 따라 상이할 수 있으며, 성인에 대해 1 일 약 1 내지 약 1000 mg, 바람직하게는 약 2 내지 약 500 mg, 특히 바람직하게는 약 5 내지 약 100 mg 의 범위로 1 회 또는 수 회로 나누어 경구 투여할 수 있다. 주사로 투여되는 경우는 약 0.1 내지 약 300 mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 200 mg 의 범위로 1 회 또는 수 회로 나누어 투여할 수 있다.

실시예

실시예 1

본 발명을 실시예로 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

(참고예 1)

3-아세틸-6-클로로피리다진

[화학식 9]

3,6-디클로로피리다진 (1.49 g) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (115 mg) 의 톨루엔 (50 ml) 중의 용액에 (1-에톡시비닐)트리부틸주석 (4.33 g) 을 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 5 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 혼합물에 1N 염산 (20 ml) 을 첨가하고, 혼합물을 60 ℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조한 후, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산:에틸 아세테이트 = 4:1] 로 정제하여 표제 화합물 (653 mg) 을 수득하였다.

(참고예 2)

4-(3-아세틸피리다진-6-일)모르폴린

[화학식 10]

참고예 1 에서 수득한 3-아세틸-6-클로로피리다진에 모르폴린 (652 mg) 을 첨가하고, 혼합물을 110 ℃ 에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하고, 톨루엔으로 2 회 공비시켰다. 그 다음, 여기에 물을 첨가하여, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 [헥산:에틸 아세테이트 = 2:1] 로 정제하였다. 용매를 감압 하에 증류시켰다. 잔사에 70 ℃ 에서 에탄올 (8 ml) 을 첨가하여 석출된 결정을 여과하여 표제 화합물 (432 mg) 을 수득하였다.

실시예 1

N-{2-[(2Z)-2-[(3-플루오로페닐)이미노]-3-[6-(모르폴린-4-일)피리다지닐]-1,3-티아졸-3(2H)-일]에틸}-N'-메틸우레아

[화학식 11]

참고예 2 에서 수득한 4-(3-아세틸피리다진-6-일)모르폴린 (249 mg) 을 함유한 48% 브롬화수소 수용액 (4 ml) 에 브롬 (182 mg)-48% 브롬화수소 수용액 (0.5 ml) 을 실온에서 적가하고, 혼합물을 45 ℃ 에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 포화 중탄산나트륨 수용액에 부어 중화하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 그 다음, N-[2-({[(3-플루오로페닐)아미노]카르보노티오일}아미노)에틸]-N'-메틸우레아 (260 mg) 및 에탄올 (6 ml) 을 첨가하고, 혼합물을 70 ℃ 에서 2 시간 동안 교반한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 포화 중탄산나트륨 수용액으로 중화하고, 10% 클로로포름-메탄올 용액으로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조한 후, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [3% 클로로포름-메탄올] 로 정제하여 표제 화합물 (356 mg) 을 수득하였다.

실시예 2 내지 12

실시예 1 과 유사한 방법으로, 참고예 2 에서 수득한 아세토페논을 각종 티오우레아와 반응시켜 표 1 에 나타내는 화합물을 수득하였다

상기 표에서의 분석 조건

MS 검출기 Perkin-Elmer Sciex API 150 EX Mass spectrometer, HPLC Shimadzu LC 8 A, 칼럼 YMC CombiScreen ODS-A-300-CC 4.6 mm X 50 mm, 구배 조건; A: 0.35% TFA/CH₃CN, B: 0.05% TFA/H₂O, 0.0-0.5 분 A 10% B 90% 0.5-4.2 분 A 10% B 90% 에서 A 99% B 1% 로 선형 구배 4.2-6.3 분 A 99% B 1%.

(참고예 3)

N-[2-({[(3-클로로피리딘-5-일)아미노]카르보티오일}아미노)에틸]-N'-메틸우레아

[화학식 12]

3-아미노-5-클로로 피리딘 (51 mg) 의 테트라히드로푸란 (2 ml) 중의 용액에 빙냉하에 트리에틸아민 (277 μl) 및 티오포스겐 (46 μl) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 50 분 동안 교반하였다. 여기에 N-(2-아미노)에틸-N'-메틸우레아 메탄술포네이트 (231 mg) 를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 중탄산나트륨 수용액을 첨가하고 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [3% 클로로포름-메탄올 + 1% 트리에틸아민] 로 정제하여 표제 화합물 (88 mg) 을 수득하였다.

실시예 13

N-{2-[(2Z)-2-[(3-클로로피리딘-5-일)이미노]-3-[6-(모르폴린-4-일)피리다지닐]-1,3-티아졸-3(2H)-일]에틸}-N'-메틸우레아

[화학식 13]

실시예 1 과 유사한 방법으로, 참고예 2 에서 수득한 아세토페논 (16 mg) 을 참고예 3 에서 수득한 N-[2-({[(3-클로로피리딘-5-일)아미노]카르보노티오일}아미노)에틸]-N'-메틸우레아 (16 mg) 와 반응시켜 표제 화합물 (9.5 mg) 을 수득하였다.

MS (ESI-MS) : 475[M+1]⁺., rt = 2.0 분.

실시예 14 내지 15

실시예 13 과 유사한 방법으로, 참고예 2 에서 수득한 아세토페논을 각종 티오우레아와 반응시켜 표 2 에 나타내는 화합물을 수득하였다.

상기 표에서의 분석 조건: MS 검출기 Waters micromass ZQ, HPLC waters 2790 separations module, 칼럼 Impact Cadenza CD-C18 2.0 mm X 20 mm, 구배 조건; A: H₂O, B: CH₃CN, C: 2% HCOOH/CH₃CN, 0.0-0.1 분 A 95% B 2% C 3%, 0.1-3.1 분 A 95% B 2% C 3% 에서 A 1% B 96% C 3% 로 선형 구배 3.1-3.5 분 A 1% B 96% C 3%.

(참고예 4)

3-아세틸-6-N,N-디에틸아미노피리다진

[화학식 14]

참고예 2 와 유사한 방법으로, 참고예 1 에서 수득한 3-아세틸-6-클로로피리다진을 디에틸아민과 반응시켜 표제 화합물을 수득하였다.

실시예 16 내지 17

실시예 1 과 유사한 방법으로, 참고예 4 에서 수득한 3-아세틸-6-N,N-디에틸아미노피리다진을 각종 티오우레아와 반응시켜 표 3 에 나타내는 화합물을 수득하였다.

상기 표에서의 분석 조건

(참고예 5)

4-(3-클로로-4-메틸피리다진-6-일)모르폴린

[화학식 15]

3,6-디클로로-4-메틸피리다진 (815 mg) 에 모르폴린 (5 ml) 을 첨가하고, 혼합물을 50 내지 60 ℃ 에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 포화 중탄산나트륨 수용액 (10 ml) 을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 물, 이어서 포화 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조한 후, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔사에 50 ℃ 에서 에탄올을 첨가하고, 혼합물을 실온으로 냉각하고 밤새 교반하였다. 석출된 결정을 여과하여 표제 화합물 (570 mg) 을 수득하였다.

(참고예 6)

4-(3-아세틸-4-메틸피리다진-6-일)모르폴린

[화학식 16]

참고예 5 에서 수득한 4-(3-클로로-4-메틸피리다진-6-일)모르폴린 (570 mg) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (309 mg) 의 톨루엔 (14 ml) 중의 용액에 (1-에톡시비닐)트리부틸주석 (1.94 g) 을 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 110 ℃ 에서 9.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트로 여과한 후, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산:에틸 아세테이트 = 1:1] 로 정제하여 표제 화합물 (476 mg) 을 수득하였다.

실시예 18 내지 21

실시예 1 과 유사한 방법으로, 참고예 6 에서 수득한 4-(3-아세틸-4-메틸피리다진-6-일)모르폴린을 각종 티오우레아와 반응시켜 표 4 에 나타내는 화합물을 수득하였다.

상기 표에서의 분석 조건

약리 시험

시험 1

래트 폐 막을 사용한 화합물의 리셉터-결합 평가 시험

평가 시험을 [Sugasawa, T. 등, J. Biol. Chem., 272, 21244-21252 (1997)] 의 방법에 따라 실시하였다.

래트 폐 막의 제조

SD 웅성 래트 (시험시 7 주령, Charles River Laboratories Japan, Inc.) 로부터 적출한 폐에서 기관 및 혈관을 제거하여 가늘게 잘라 빙냉 트리스-식염수 완충액 (10 mM 트리스 염산-154 mM 염화나트륨, pH 7.4) 으로 세척하였다. 수득물을 균질화 완충액 (1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 1 mM 4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐 플루오라이드 (AEBSF), 5μg/ml 아프로티닌, 5μg/ml 류펩틴) 을 함유한 빙냉 트리스-식염수 완충액으로 Hiscotron 에 의해 균질화하였다 (최대 속도: 1 분). 저속 원심분리 (1500×g, 20 분, 4 ℃) 후의 상청액을 초원심분리하고 (100000×g, 20 분, 4 ℃), 펠릿을 트리스-식염수 완충액에 현탁시켜 -80 ℃ 에서 보존하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민 (BSA) 을 표준으로 사용하는 Bio-Rad Protein Assay Kit 로 측정하였다.

리간드 결합 검정

단백질-비흡착성 환저 96-웰 어세이 플레이트 (Iwaki Glass Co., Ltd. 사로부터 입수) 의 각 웰에, 1 nM [¹²⁵I]-요오도시아노핀돌올 (Amersham plc 사로부터 입수), 10 μM 세로토닌, 20 μm dl-프로프라놀올, 10μM 펜톨아민, 1.1 mM 아스코르브산 및 100 μg 폐 막을 함유한 트리스-식염수 완충액 (200 μl) 을 첨가하고, 혼합물을 피펫으로 합친 다음 30 분 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 시험 화합물을 100% 디메틸 술폭사이드 용액에 용해시키고, 여기에 2 μl (최종 DMSO 농도: 1%) 를 첨가하였다. 비특이적 결합량을 산출하기 위해, 상기 시험 화합물 대신에 L-트레오-3-(3,4-디히드록시페닐)-N-[3-(4-플루오로페닐)프로필]세린 피롤리딘 아미드를 최종 농도 100 μM 로 첨가하였다. 그 동안, 멀티스크린 플레이트 (96-웰 B 유리 섬유, Millipore Cat. No. MAFB NOB10) 에 0.3% 폴리에틸렌이민 (PEI)/트리스-식염수 완충액 100 μl 를 첨가하고 30 분 이상 인큐베이션하였다. 수득물을 흡인 여과 (200 μl 빙냉 트리스-식염수 완충액을 첨가하여 흡인) 하여 세정하고, 96-웰 어세이 플레이트 상의 반응액을 멀티스크린 플레이트에서 4 회 흡인 여과하여 세정하였다. 멀티스크린 플레이트의 바닥부에 B 유리 섬유 여과지를 펀칭하고, 여과지 상에 트랩된 [¹²⁵I]-요오도시아노핀돌올의 γ-선량을 결합량으로서 구하였다. DMSO (최종 농도: 1%) 의 존재하의 결합량은 총 결합량이고, 100 μM L-트레오-3-(3,4-디히드록시페닐)-N-[3-(4-플루오로페닐)프로필]세린 피롤리딘 아미드의 존재하의 결합량은 비특적 결합량이었다. 총 결합량으로부터 비특이적 결합량을 뺀 값이 특이적 결합량이었다. 화합물의 결합 활성은 하기 식에 따라 산출하였으며, 이는 시험 화합물에 의해서 래트 폐 막 SMBS 에 대한 [¹²⁵I]-요오도시아노핀돌올의 특이적 결합을 저해하는 비율을 나타낸다.

[수학식 1]

시험 2

스테로이드 호르몬 합성 저해 평가 시험

(1) 물질

셀 스트레이너 (BD Falcon®)

Cell Titer-Glo® (Promega)

클로스트리듐 히스톨리티큠 (Clostridium histolyticum) 으로부터의 콜라게나아제 (Sigma-Aldrich)

코프티코스테론 EIA kit (Cayman)

디메틸술폭사이드 (이하, DMSO) (nacalai tesque)

D-MEM (GIBCO)

DNase I (Invitrogen)

소 태아 혈청 (이하, FBS) (Bioflud)

접착 세포 배양용 멀티플 웰 플레이트, 96 웰 (IWAKI)

N⁶,2'-O-디부티릴아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트 나트륨 염 (이하, cAMP) (Sigma)

페니실린 스트렙토마이신 혼합액 (nacalai tesque)

대조예 1 내지 4: 대조예 1 은 특허문헌 2 의 실시예 350 이었다. 특허문헌 2 에 따라 대조예 2 내지 4 를 합성하였다.

(2) 방법

래트로부터 부신을 적출하여 D-MEM 중에서 여분의 결합 조직, 지방 및 막을 제거하였다. 상기 부신을 폴리튜브로 옮기고, 재빨리 가위로 분절하였다. 여기에 1 mg/mL 콜라게나아제 및 0.25 μL DNase I 을 함유한 D-MEM 을 첨가한 후, 37 ℃ 에서 10 분 동안 80 회/분으로 진탕하였다. 그 다음, 혼합물을 끝을 잘라낸 1 mL 피펫 팁으로 취하고 동일 조건으로 다시 진탕시켰다. 10 분 후에 다시 1 mL 피펫 팁으로 취하고, 세포 현탁액을 금속 메시를 통해 여과하였다. 여액을 4 ℃ 에서 5 분 동안 500g 로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 0.16 M NH₄Cl 및 0.17 M 트리스-HCl 의 혼합액을 3 mL 첨가하였다. 혼합물을 얼음에서 5 분 동안 정치시킨 후 동일 조건으로 원심분리하였다. 그 다음, 상청액을 제거한 후, D-MEM 을 첨가하였다. 세포 현탁액을 제조하여 동일 조건으로 원심분리하였다. 다시, 상청액을 제거한 후, D-MEM 을 첨가하여 세포 현탁액을 수득하였다. 세포 현탁액을 셀 스트레이너 (BD Falcon®) 로 여과하였다. 여액을 동일 조건으로 원심분리하였다. 원심분리 종료 후, 상청액을 제거하고, 1% 페니실린 스트렙토마이신 혼합액 및 10% FBS 를 함유한 D-MEM 을 첨가하였다. 접착 세포 배양을 위해 혼합물을 멀티플 웰 플레이트, 96 웰 (IWAKI) 에 10000 세포/웰로 파종하여 37 ℃ 의 CO₂ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다.

시험 물질 농축물을 DMSO 중에서 2000 μM 로 제조하여, D-MEM 중 20 μM 시험 물질을 함유하는 D-MEM 을 제조하였다.

세포를 파종한 플레이트를 밤새 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고 20 μM 시험 물질을 함유한 D-MEM 을 50 μL/웰로 첨가하였다. 그 다음, 혼합물에 즉시 20 μM cAMP 를 함유한 D-MEM 을 50 μL/웰로 첨가하여 시험 물질의 최종 농도가 10 μM 이 되도록 하였다. 2 가지의 D-MEM 을 첨가한 후, 혼합물을 37 ℃ 에서 2 시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 2 시간 후, 배지의 상청액 (50 μL) 을 회수하였다. 세포에 대해서는 Cell Titer-Glo® (Promega) 를 사용하는 통상의 방법에 따라 시험 물질의 세포 독성을 평가하였다. 회수한 상청액에 대해서는 코르티코스테론 EIA 키트 (Cayman) 를 사용하여 통상의 방법에 따라 상청액의 코르티코스테론 농도를 측정하였다.

시험 물질에 의한 세포 독성이 인정되지 않는 것을 확인하여 하기 식에 따라 코르티코스테론 생성에 대한 10 μM 시험 물질의 저해율을 산출하였다.

[수학식 2]

상기 시험 1 및 2 의 결과를 표 5 에 나타낸다.

실시예 화합물의 결합 활성 (작용) 및 스테로이드 합성 저해율 (부작용)

시험 3

기니 피그 (Guinea Pig) 만기 천식 모델에서의 화합물의 평가

실시예 1 에서 수득한 화합물을 이용하여 평가를 수행했다.

Hartley 웅성 기니 피그 (Japan SLC, Inc. 에서 입수) 를 입하 후 약 1 주일간 예비-사육한 다음, 초음파 분무기 (nebulizer; OMRON NE-U12, 조건: 최대 분무량, 최대 풍량) 을 이용해 5 분 동안 플라스틱 박스 (박스 당 4 마리의 기니 피그) 내에서 2% (w/v) 오브알부민 (OA) 식염수를 흡입으로써 노출시켜 감작했다 (제 0 일). 동일한 조작을 제 7 일에 수행했다. 제 14 일 또는 제 15 일에, 각 기니 피그에 2% OA 를 5 분 동안 흡입투여하여 반응을 개시했다 (유발: challenge). 이 유발 1 시간 전에, 항히스타민제 피릴아민 말레에이트 (식염 수 중 용해, 10 mg/2 ml/kg) 를 복강 내 투여했다. 시험 화합물을 0.5% 메틸셀룰로오스 (MC) 중에 현탁하고, 항원 유발 1 시간 전에 3 mg/5 ml/kg 경구 투여했다. 0.5% MC 를 유사한 방식으로 대조군에 투여했다.

문헌 [Penny A. Hutson et al. Am Rev Respir Dis 1988 137, 548-557] 의 방법에 따라 호흡 기능의 측정 및 분석을 수행했다. 호흡 기능을 항원 유발 이전 (약물 투여 이전), 및 항원 유발 후 5 분, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 시간 후에 측정하고, 파형 프로파일을 MacLab Chart v3.4 (AD Instruments) 을 이용해 데이터를 불러와 후에 분석했다. sRaw/TV 를 기초로 하여, 각각의 동물에 대해서 각 시점에서의 sRaw/TV 값에서 전자의 sRaw/TV 값을 빼 평가했다. 측정 시간에 대해서 전자 값을 뺀 sRaw/TV 값을 플롯팅 (plotting) 하고, 항원 유발 후 4 내지 8 시간의 범위에서 각 동물의 각 곡선하면적 (AUC₄ _-8 _hr) 을 산출하여 서로 비교하였다. SAS 임상전 패키지 Version 5.0 을 이용해 통계 분석을 수행했다. Dunnett-형 다중 비교를 통해 대조군과 각각의 약물 투여군간의 임의의 유의차가 존재하는지 여부를 평가했다.

결과를 표 7 에 나타낸다.

실시예 1 의 화합물은 47% 개선율을 나타내었으며, 대조군에 비해 유의차가 확인되었다 (p<0.01; Dunnett's test).

본 발명의 5-원 고리 화합물 또는 그 염은 호산구, 림프구 등을 비롯한 백혈구의 침윤을 저해함에 따라, 각종 염증의 치료에 유용하다.

Claims

하기 화학식 (1) 의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 1]

(식 중, R¹ 은 할로겐 원자, C₁-C₃ 알킬, C₁-C₃ 알콕시 또는 트리플루오로메틸로 임의적으로 치환된 페닐; 또는 할로겐 원자, C₁-C₃ 알킬, C₁-C₃ 알콕시 또는 트리플루오로메틸로 임의적으로 치환된 피리딜이고;
R² 는 할로겐 원자 또는 C₁-C₃ 알킬로 임의적으로 치환된 피라진디일; 할로겐 원자 또는 C₁-C₃ 알킬로 임의적으로 치환된 피리미딘디일; 또는 할로겐 원자 또는 C₁-C₃ 알킬로 임의적으로 치환된 피리다진디일이고;
R³ 은 C₁-C₃ 알킬이고;
R⁴ 및 R⁵ 는 각각 독립적으로 C₁-C₃ 알킬이거나; 또는 -N(R⁴)R⁵ 가 모르폴리노일 수 있고;
Y² 는 C₂-C₄ 알킬렌이다].
제 1 항에 있어서, R² 가 할로겐 원자 또는 C₁-C₃ 알킬로 임의적으로 치환된 피리다진디일인 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제 1 항에 있어서, R² 가 피리다진디일인 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제 1 항에 있어서, -N(R⁴)R⁵ 가 모르폴리노인 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제 1 항에 있어서, R¹ 이 할로겐 원자로 임의적으로 치환된 페닐인 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, R³ 이 메틸 또는 에틸이고, Y² 가 C₂-C₃ 알킬렌인 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 파선이 (Z)-배위를 의미하는 것인 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증 치료제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 자기면역성 염증 또는 알레르기성 염증 치료제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환 치료제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 기관지 천식 치료제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 비염 치료제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 염증 치료 방법.
염증 치료제의 제조에 있어서의 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 5-원 고리 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도.