KR20100133881A - 병적 혈관형성 및 혈관 투과성을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

병적 혈관형성 및 혈관 투과성을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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크리스토퍼 존스
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Abstract

본 발명은 본원에서 기술된 신호전달 경로를 조절함으로써 혈관 투과성 및 병적 혈관형성을 억제하는 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본원에서 기재된 신호전달 경로를 조절할 수 있고, 혈관 투과성을 억제할 수 있고, 병적 혈관형성을 억제할 수 있는 화합물 및 조성물을 제조하고 스크리닝하는 방법 또한 제공된다.
혈관 투과성, 병적 혈관형성, Robo4, Slit 단백질

Description

병적 혈관형성 및 혈관 투과성을 치료하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PATHOLOGIC ANGIOGENESIS AND VASCULAR PERMEABILITY}
임의의 기관계의 척추동물 혈관구조의 형성은 성장 인자 및 유도 신호물의 배치에 의해 조정되는 복합적인 프로세스이지만 ([Jain et al., 2003]), 최근의 연구로 혈관형성(angiogenesis)을 조절하는 신호전달 케스케이드의 이해가 증가되었다. 예를 들어, 액손의 궤도 및 신경 네트워크의 형성을 지시하는 분자 프로그램이 성숙한 혈관 네트워크의 고도로 정형화된 패턴을 생성시키는데 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 더욱 더 명확하다 ([Carmeliet et al., 2005]; [Urness et al., 2004]; 및 [Jones et al., 2007]).
혈관생성(vasculogenesis)으로 지칭되는, 포유동물에서의 혈관 발달의 최초의 단계 동안, 내피 세포가 분화하고, 이동하고, 유착하여, 중앙 축 혈관, 등쪽 대동맥 및 기본 정맥을 형성한다. 혈관형성으로 지칭되는 두번째 단계는 성숙한 순환계를 형성하기 위한 신생 총으로부터의 새로운 혈관의 발아를 특징으로 한다. VEGF (또는 VPF)가 이러한 처음 2가지 단계인 혈관생성 동안의 내피 세포의 분화 및 생존 둘 모두에 결정적일 뿐만 아니라 혈관형성 동안의 증식 및 투과성에 결정 적이다. 이러한 혈관형성 리모델링에 이어서, 내피가 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF)를 분비하고, 이는 혈관 평활근 세포의 동원 및 분화를 유도한다. 이어서, 혈관 평활근 세포가 안지오포이에틴(angiopoietin)을 분비하고, 이는 내피 세포와 혈관 평활근 세포 간의 적절한 상호작용을 확실하게 한다. 마지막으로, 혈관 평활근 세포가 매트릭스 단백질, 예컨대 엘라스틴을 침착시키고, 이는 혈관 평활근 세포 증식 및 분화를 억제함으로써, 성숙한 혈관을 안정화시킨다. 따라서, 성숙한 혈관 네트워크를 수립하고 유지하기 위해, 혈관의 내피 구획과 평활근 구획이 자가분비성 및 측분비성 신호전달을 통해 상호작용하여야 한다. 혈관 내피를 형성하는 내피 세포들 간의 틈 (세포 접합점)은 조직의 유형 및 생리적 상태에 따라 엄격하게 조절된다. 예를 들어, 성숙한 혈관상에서, 내피 세포들은 서로 독립적으로 행동하지 않으며; 그보다는, 이들은 내피 관강으로부터 주변 조직 내로의 단백질, 유체 및 세포의 이동을 방지하는 단층을 형성한다.
발달 후에도, 혈관계는 손상, 허혈 및 염증을 야기하는 사건, 상태 또는 병원체에 지속적으로 노출되고, 이는 전형적으로 사이토카인 및 혈관형성 인자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 방출을 초래한다. 처음에는, VEGF는, 혈관이 누출되도록 유도하는 능력을 기초로, 혈관 투과성 인자 (VPF)로 기술, 정제 및 클로닝되었다. VEGF는 내피 세포-세포 접합점을 불안정화시켜, 내피 투과성에 이르게 하고, 내피 증식 및 이동을 자극하고, 혈관 발아 및 부종을 촉진한다. 이러한 기능은 안정적인 혈관 네트워크를 파괴하는 작용을 하여, 새로운 누출성 혈관이 생산된다. 여러 정황에서, 손상, 허혈 및 염증에 반응한 사이토카인 및 혈관형성 인자 의 방출은 이같은 반응이 복원성 또는 치유 프로세스를 개시시키는 것에 이른다는 점에서 바람직하다. 그러나, 과도한 혈관형성 및 혈관 누출 (예를 들어, 내피 과투과성)는 여러 질환 및 병적 상태의 병리학을 예고한다.
예를 들어, 선진국에서, 망막 또는 맥락막 혈관상에서의 병적 혈관형성 및 내피 과투과성은 파국적인 시력 상실의 가장 통상적인 원인이다. 새로운 기능장애성 혈관은 누출되거나, 출혈되거나, 또는 섬유증을 자극하고, 또한 이는 시력을 손상시키는 부종, 출혈 또는 망막 박리를 촉진한다. 이러한 발병기전을 공유하는 주요 질환에는 증식성 당뇨병성 망막병증 (DR), 비-증식성 당뇨성 황반 부종 (DME), 및 연령-관련 황반 변성 (AMD) ([Dorrell et al., 2007]; [Afzal et al., 2007])이 포함된다. 65세를 초과하는 약 1500만명의 미국인이 AMD를 앓고 있고, 이러한 환자들 중 10％는 맥락막 혈관신생의 결과로 시력 상실을 경험할 것이다. 또한, 1600만명을 초과하는 미국인이 당뇨병이고, 400,000명을 초과하는 새로운 환자가 망막 부종 또는 혈관신생을 앓는다. 전세계적으로 현재 2억명의 당뇨병 환자가 다음 20년 안에 배가될 것이고, 이같은 환자 중 8％ 초과가 미세혈관 합병증을 앓는다는 것을 가정하면, 당뇨병성 눈 질환으로부터의 시력 상실을 겪을 환자의 숫자가 불행하게도 급속하게 증가하게 된다. DR, DME 및 AMD보다는 덜 유행성이지만, 미숙아 망막병증 (ROP) 및 허혈성 망막 정맥 폐쇄 (IRVO) 또한 망막 또는 맥락막 혈관상에서의 병적 혈관형성 및 내피 과투과성과 관련되고, 효과적인 치료법이 없다.
눈의 질환에 더하여, 병적 혈관형성은 종양 형성 및 성장과 또한 관련된다. 종양 혈관형성은 암성 성장물 내로 침투하여, 영양소 및 산소를 공급하고 노폐물을 제거하는 혈관 네트워크의 증식이다. 혈관형성과 함께 종양 성장이 진행되고, 혈관형성 없이는 종양 증식이 느려지거나 완전히 정지된다. 전형적으로, 종양 혈관형성은 주변의 정상 호스트 조직에, 새로운 혈관의 성장을 장려하는 단백질의 생성을 활성화시키는 신호를 보내는 분자를 방출하는 암성 종양 세포로 시작된다. 혈관형성은 활성화제 및 억제제 분자 양쪽 모두에 의해 조절된다. 정상적인 조건 하에, 억제제가 우세하여, 증식을 차단한다. 그러나, 종양 형성 및 증식 동안에는, 종양 세포가 혈관형성 활성화제를 방출하여, 이같은 활성화제가 수/농도 면에서 증가되도록 한다. 혈관형성 활성화제에서의 이같은 증가로, 혈관 내피 세포의 성장 및 분열이 초래되고, 궁극적으로 새로운 혈관의 형성이 초래된다.
여러 단백질들, 뿐만 아니라 몇몇 더 작은 분자들이 "혈관형성성"으로 확인되었다. 이러한 분자들 중에서, 2개의 단백질이 종양 성장을 유지하는데 가장 중요한 것으로 나타났다: 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF). VEGF 및 bFGF는 여러 종류의 암 세포, 및 특정 유형의 정상 세포에 의해 생산된다. VEGF 및 bFGF는 종양 세포 내부에서 먼저 합성된 후, 주변 조직 내로 분비된다. 내피 세포와 마주치면, 이들은 내피 세포의 외부 표면 상에 놓인, 수용체로 지칭되는 특이적 단백질에 결합한다. VEGF 또는 bFGF가 이의 적합한 수용체에 결합하는 것은 일련의 릴레이 단백질을 활성화시키고, 이는 신호를 내피 세포의 핵 내로 전달한다. 궁극적으로 핵 신호는 새로운 내피 세포 성장에 필요한 생성물을 만들도록 일군의 유전자를 자극한다. VEGF 또는 bFGF에 의한 내피 세포의 활성화는 새로운 혈관의 생성을 향한 일련의 단계를 추진한다. 먼저, 활성화된 내피 세포는 특별한 부류의 분해 효소인 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)를 생산한다. 그후, 이러한 효소가 내피 세포로부터 주변 조직 내로 방출된다. MMP는 세포들 간의 공간을 채우고 단백질 및 다당류로 구성된 지지 물질인 세포외 매트릭스를 파괴한다. 이러한 매트릭스의 파괴는 내피 세포의 이동을 허용한다. 내피 세포가 주변 조직 내로 이동함에 따라, 활성화된 내피 세포가 분할하여 중공관을 구성하기 시작하고, 상기 관은 점차적으로 성숙한 혈관 네트워크로 발달된다.
바람직하지 않은 혈관 투과성을 특징으로 하는 추가적인 질환 및 장애에는, 예를 들어, 뇌 종양과 관련된 부종, 악성종양과 관련된 복수, 메이그스 증후군(Meigs' Syndrome), 폐 염증, 콩팥 증후군, 심낭 삼출, 흉막 삼출, 급성 폐 손상, 염증성 장 질환, 졸중에서의 허혈/재관류 손상, 심근경색증, 및 사이토카인 폭풍(cytokine storm)을 초래하는 감염성 및 비-감염성 질환이 포함된다. 사이토카인 폭풍은 건강하고 정력적인 면역계의 전신성 발현이지만, 급속하게 증식하고 고도로 활성화된 T-세포 또는 천연 킬러 (NK) 세포에 의해 야기되는 과대적인 면역 반응이고, 150가지를 초과하는 염증 매개물 (사이토카인, 산소가 없는 라디칼 및 응고 인자)의 방출을 초래한다. 전(pro)-염증성 사이토카인 (예컨대, 종양 괴사 인자-알파, 인터루킨-1 및 인터루킨-6) 및 항-염증성 사이토카인 (예컨대, 인터루킨 10 및 인터루킨 1 수용체 길항제) 양쪽 모두가 혈청에서 상승되며, 이는 격렬한 물질이고, 종종 이러한 사이토카인의 치사성 상호작용은 "사이토카인 폭풍"으로 지칭된다.
사이토카인 폭풍은, 예를 들어 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 성인성 호흡 곤 란 증후군 (ARDS), 패혈증, 조류 인플루엔자, 천연두 및 전신성 염증 응답 증후군 (SIRS)이 포함되는 다수의 감염성 및 비-감염성 질환에서 발생할 수 있다. 즉각적인 시술의 부재 하에, 사이토카인 폭풍은 영구적인 폐 손상을 초래할 수 있고, 다수의 경우에 사망을 초래할 수 있다. 다수의 환자에서 용적 과부하 또는 저하된 좌심실 기능과 관련되지 않은 폐 부종을 특징으로 하는 ARDS가 발달될 것이다. 사이토카인 폭풍에 참여하는 질환의 최종 단계 증상은 저혈압; 빈맥; 호흡곤란; 열; 허혈 또는 불충분한 조직 관류; 제어불능성 출혈; 중증 대사 조절곤란; 및 다발성 장기 부전 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 사이토카인 폭풍을 촉진하는 감염으로부터의 사망은 사이토카인 폭풍으로부터 초래되는 증상들에 종종 기인하고, 따라서 관련된 병원체에 의해 직접적으로 야기되지 않는다. 예를 들어, 중증 인플루엔자 감염에서의 사망, 예컨대 조류 인플루엔자 또는 "조류 독감"에 의한 사망은, 전형적으로, 바이러스 감염에 의해 촉발된 사이토카인 폭풍으로부터 초래된 ARDS의 결과이다.
혈관형성 및 혈관 투과성에서 수반되기 때문에, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 더 많은 관심이 집중되었다. 그럼에도 불구하고, VEGF는 혈관형성 및 혈관 투과성에 기여하는 수많은 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자 중 단지 하나이기 때문에, VEGF 기능성 뿐만 아니라 또다른 혈관형성 인자, 투과성 인자 또는 염증성 인자의 기능성에 영향을 미치는 경로를 확인하고 이러한 영향을 미치는 방법을 개발하는 것이 계속 유용하다.
<발명의 요약>
Robo4 신호전달이 세포 이동에 관여하는 돌출 사건을 억제하고, 내피 세포-세포 접합을 안정화시키고, 병적 혈관형성을 차단할 수 있는 신호전달 경로가 본원에 기재되어 있다. 본원에서 입증되는 바와 같이, Robo4의 발현은 Slit2에 대한 반응성을 부여하고, Slit2-Robo4 신호전달은 세포 부착에 의해 자극되는 세포 돌출 활성을 음성적으로 조절한다. 이러한 음성 조절은 Robo4와 어댑터 단백질 팍실린(paxillin) 및 그의 파라로그(paralogue)와의 상호작용에 의해 매개되며, ARF-GAP, 예컨대 GIT1를 동원하여 Adp 리보실화 인자 6 (ARF6)의 국소적인 불활성화를 초래한다. 이러한 신호전달 경로에 의해 부착-매개 Rac1 활성화 및 세포 돌출이 방해받는다.
본원에 추가로 기재된 바와 같이, Robo4 신호전달없이 ARF GTPase 활성화 단백질 ("ARF-GAP" (단수 형태) 또는 "ARF-GAPs" (복수 형태)) 및 ARF GTP 교환 인자 ("ARF-GEF" (단수 형태) 또는 "ARF-GEFs" (복수 형태))의 조절이 달성될 수 있으며, 이러한 조절을 이용하여 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제할 수 있다. 따라서, 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성의 억제에 기여하는 신호전달 경로의 조절을 위한 다중 표적 (예를 들어, 현재 기록되어 있는 Slit2-Robo4 신호전달 경로 중에서 정의된 다중 표적 포함)이 본원에서 제공된다.
또한, 본원에서 서술된 신호전달 경로를 조절함으로써 혈관 투과성 및 병적 혈관형성을 억제하는 화합물, 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 또한, 본원에 기재된 신호전달 경로를 조절할 수 있고, 혈관 투과성을 억제할 수 있고, 병적 혈관 형성을 억제할 수 있는 화합물 및 조성물을 제조하고, 스크리닝하는 방법 또한 제공된다.
본 명세서 내에 포함되고 이의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 개시된 방법 및 조성물의 여러 실시양태를 도해하고, 상세한 설명과 함께, 개시된 방법 및 조성물의 원리를 설명하는데 도움이 된다. 본원에서 사용된 용어 "모조물(Mock)"은 활성 Slit 단백질을 포함하지 않는 허위(sham) 제제를 가리킨다.
도 1은 Robo4-매개된 혈관 유도가 수용체의 세포질 꼬리를 필요로 한다는 것을 나타낸다. (A) 미주입, (B) robo4 모르폴리노 주입, (C) robo4 모르폴리노 및 야생형 뮤린(murine) robo4 RNA 주입, 및 (D) robo4 모르폴리노 및 robo4 Δ꼬리 RNA 주입 48 hpf TG ( fli : egfp )y1 배아의 공초점 현미경검사의 결과가 제시된다. 정량이 도 7에서 제시된다. 도 1E는 robo4 모판트(morphant) 배아에서의 결손성 혈관 유도의 모델을 나타낸다. 5× 및 20× 영상이 각각 좌측 및 우측 패널에서 제시된다. DLAV = 등쪽 세로 문합 혈관. PAV = 척삭주위 혈관. DA = 등쪽 대동맥. PCV = 후방 기본 정맥.
도 2는 접촉주성의 Robo4-의존적 억제가 세포질 꼬리의 아미노말단 절반을 필요로 한다는 것을 나타낸다. 도 2A는 접촉주성 이동 분석법에서 사용된 cDNA 구축물의 개략도를 나타낸다. TM은 막횡단 도메인을 나타낸다. CC0 및 CC2는 Robo 부류 구성원에서 발견되는 보존된 세포질 신호전달 모티프(motif)이다. HA = 헤마글루티닌 에피토프. 도 2B 및 도 2C는 HEK 293 세포가 GFP 및 지시된 구축물로 공 동-형질감염되었고, 36시간 후에 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 및 모조물 제제 또는 Slit2로 코팅된 막 상에서 접촉주성 이동에 적용되었음을 나타낸다. Robo4 구축물의 발현이 웨스턴 블롯팅(Western blotting) (인셋(Inset))에 의해 확인되었다. 결과는 평균±SE로 제시된다.
도 3은 Robo4가 HEK 293 세포 내의 Hic-5 및 팍실린과 상호작용한다는 것을 나타낸다. 도 3A는 HEK 293 세포가 Robo4 세포질 꼬리-HA 및 Hic-5 -V5, 또는 빈 벡터 (pcDNA3) 및 Hic-5-V5로 공동-형질감염되었음을 나타낸다. Robo4가 HA 항체로 면역침전되었고, Hic-5가 V5 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 도 3B는 CHO-K1, HEK 293 및 NIH 3T3 세포로부터의 전체 세포 용해물이 Hic-5 및 팍실린에 대한 항체로 프로빙(probing)되었음을 나타낸다. 도 3C는 HEK 293 세포가 팍실린-V5 및 Robo4 세포질 꼬리-HA 또는 빈 벡터 (pcDNA3)로 공동-형질감염되었음을 나타낸다. Robo4가 세포 용해물로부터 HA 항체로 면역침전되었고, 팍실린이 V5 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 도 3D는 HEK 293 세포가 전장 Robo4-HA 및 팍실린-V5로 형질감염되었고, Slit2로 5분 동안 자극되었음을 나타낸다. Robo4가 세포 용해물로부터 HA 항체로 면역침전되었고, 팍실린이 V5 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다.
도 4는 팍실린이 접촉주성의 Robo4-의존적 억제에 필요한 신규 모티프를 통해 Robo4와 상호작용한다는 것을 나타낸다. 도 4A는 패널 B에 제시된 풀-다운(pull-down) 분석법에서 사용된 GST-Robo4 융합 단백질의 개략도를 나타낸다. 도 4B는 GST-Robo4 융합 단백질이 이. 콜라이(E. coli)로부터 정제되어, 정제된 재 조합 팍실린과 함께 인큐베이션되었음을 나타낸다. 팍실린이 팍실린-특이적 모노클로날(monoclonal) 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 도 4C는 패널 D에 기술된 풀-다운 분석법에서 사용된 GST-Robo4 융합 단백질의 개략도를 나타낸다. 도 4D는 GST-Robo4 융합 단백질이 이. 콜라이로부터 정제되어, 정제된 재조합 팍실린과 함께 인큐베이션되었음을 나타낸다. 팍실린이 팍실린-특이적 모노클로날 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 도 4E는 GST-Robo4 야생형 또는 GST-Robo4ΔPIM이 이. 콜라이로부터 정제되어, 정제된 재조합 팍실린, 또는 시험관내에서 전사/번역된 메나(Mena)-V5와 함께 인큐베이션되었음을 나타낸다. 팍실린 및 메나가 각각 팍실린-특이적 모노클로날 항체 및 V5 항체로 검출되었다. 도 4F는 HEK 293 세포가 GFP 및 지시된 구축물로 형질감염되었고, 36시간 후 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 및 모조물 제제 또는 Slit2로 코팅된 막 상에서 접촉주성 이동에 적용되었음을 나타낸다. Robo4 구축물의 발현이 웨스턴 블롯팅 (인셋)에 의해 확인되었다. 결과는 평균±SE로 제시된다.
도 5는 Robo4가 Rac의 불활성화를 통해 세포 확산을 억제한다는 것을 나타낸다. 도 5A, 도 5D 및 도 5G는 HEK 293 세포가 GFP 및 지시된 구축물로 형질감염되었고, 36시간 후 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 및 모조물 제제 또는 Slit2로 코팅된 커버슬립 상에서의 세포 확산 분석법에 적용되었음을 나타낸다. 결과는 평균±SE로 제시된다. 도 5B 및 도 5E는 HEK 293 세포가 지시된 구축물로 형질감염되었고, 36시간 후 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 및 모조물 제제 또는 Slit2로 코팅된 접시 상에 플레이팅되었음을 나타낸다. 5분 인큐베이션 후, 세포가 용해되었고, GTP-Rac가 GST-PBD로 침전되었다. Rac가 Rac-특이적 모노클로날 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 도 5H는 HUVEC이 60분 동안 Slit2와 함께 인큐베이션되었고, 25 ng/㎖ VEGF로 5분 동안 자극되었고, 용해되었으며, GTP-Rac가 GST-PBD로 침전되었음을 나타낸다. Rac가 Rac-특이적 모노클로날 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. (C) 및 (F) 부착 유도 Rac 활성화 및 및 (I) VEGF-유도 Rac 활성화의 Slit2-의존적 억제가 농도계측법에 의해 정량되었다. 결과는 평균±SE로 제시된다.
도 6은 팍실린ΔLim4 돌연변이체가 Robo4와 상호작용하지 않거나, 또는 세포 확산의 Slit2-Robo4-매개된 억제를 지지한다는 것을 나타낸다. 도 6A는 패널 B, C 및 D에서 사용된 팍실린 구축물의 개략도를 나타낸다. 도 6B는 HEK 293 세포가 Robo4 세포질 꼬리-HA 및 팍실린-V5, 또는 빈 벡터 (pcDNA3) 및 팍실린-V5로 공동-형질감염되었음을 나타낸다. Robo4가 세포 용해물로부터 HA 항체로 면역침전되었고, 팍실린이 V5 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 도 6C는 HEK 293 세포가 Robo4 세포질 꼬리-HA 및 야생형 팍실린-V5 또는 팍실린ΔLim4-V5로 공동-형질감염되었음을 나타낸다. Robo4가 HA 항체로 면역침전되었고, 팍실린이 V5 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 도 6D는 내생적 팍실린이 siRNA를 사용하여 HEK 293 세포에서 녹다운(knock-down)되었고, 야생형 닭 팍실린 또는 닭 팍실린ΔLim4로 재구성되었음을 나타낸다. 녹다운 및 재구성이 팍실린 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 시각화되었고, 농도계측법에 의해 정량되었다. 팍실린 발현은 야생형 수준의 35％인 것으로 결정되었다. 도 6E는 녹다운/재구성이 적용 된 HEK 293 세포가 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 및 모조물 제제 또는 Slit2로 코팅된 커버슬립 상에서의 확산 분석법에 적용되었음을 나타낸다. 결과는 평균±SE로 제시된다.
도 7은 팍실린 상호작용 모티프가 반발성 혈관 유도에 필요하다는 것을 나타낸다. 도 7A는 미주입 (n=66), robo4 모르폴리노 주입 (n=56), robo4 모르폴리노 및 야생형 뮤린 robo4 RNA 주입 (n=60), robo4 모르폴리노 및 robo4 Δ꼬리 RNA 주입 (n=17), 및 robo4 모르폴리노 및 robo4 Δ PIM RNA 주입 (n=45) TG ( fli : egfp )y1 배아에서의 혈관 패턴화 결손의 정량을 나타낸다. 대표적인 영상이 도 1에서 제시된다. 도 7B는 세포 이동, 확산 및 Rac 활성화를 억제하는 Slit2-Robo4 신호전달축의 모델을 나타낸다.
도 8은 스플라이스(splice)-차단 모르폴리노가 지브라피쉬(zebrafish) 배아에서 robo4의 발현을 억제한다는 것을 나타낸다. 도 8A는 다니오 레리오(Danio rerio) 및 코팅된 Robo4 단백질에서의 robo4 좌위의 개략도를 나타낸다. 스플라이스-차단 모르폴리노로 표적화된 엑손이 지시되고, robo4 cDNA를 증폭시키는데 사용된 프라이머들의 위치가 또한 지시된다. 도 8B는 미주입 배아 및 robo4 스플라이스 차단 모르폴리노가 주입된 배아로부터의 RNA가 단리되어, cDNA를 역전사하는데 사용되었음을 나타낸다. 그후, cDNA가 robo4를 증폭하는데 사용되었고, 생성된 단편들이 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리되어, 브롬화에티듐 염색에 의해 시각화되었다.
도 9는 Hic-5가 Robo4-상호작용 단백질이라는 것을 나타낸다. 도 9A는 전장 Hic-5 및 효모 2-하이브리드 스크린으로부터 회수된 cDNA 클론의 개략도를 나타낸다. 도 9B는 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 균주 PJ694-A가 지시된 플라스미드로 형질전환되어, 류신 및 트립토판, 또는 류신, 트립토판, 히스티딘 및 알라닌이 없는 합성 배지에 플레이팅되었음을 나타낸다. 영양 결핍 배지 상에서 성장할 수 있는 콜로니들이 동일한 배지 상에 스폿팅(spotting)되었고, 복제 플레이팅되었으며, 이를 촬영하거나 베타-갈락토시다제 분석법에 사용하였다.
도 10은 팍실린 상호작용 모티프가 Robo4 세포질 꼬리의 CC0와 CC2 사이에 있다는 것을 나타낸다. 뮤린 Robo4 단백질의 개략도 및 팍실린 상호작용 모티프를 이루는 아미노산들의 확인을 나타낸다.
도 11은 Robo4 세포질 꼬리가 Cdc42 활성화를 억제하지 않거나 srGAP1과 상호작용하지 않는다는 것을 나타낸다. 도 11A는 Robo4를 발현하는 HEK 293 세포가 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 및 모조물 제제 또는 Slit2로 코팅된 박테리아성 페트리 접시 상에 플레이팅되었음을 나타낸다. 5분 인큐베이션 후, 세포가 용해되었고, GTP-Cdc42가 GST-PBD로 침전되었다. Cdc42가 Cdc42-특이적 모노클로날 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 도 11B는 HEK 293 세포가 지시된 플라스미드로 형질감염되었고, Robo1/Robo4가 HA 항체로 면역침전되었으며, srGAP1이 Flag M2 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었음을 나타낸다.
도 12는 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 및 연령-관련 황반 변성에 영향을 미치는 인자들에 대한 FDA 표준물인 Slit이 미숙아 망막병증을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 12A는 Slit 단백질이 제공된 마우스와 비교된 모조물 제제가 제공된 야생형 마우스에서의 망막의 혈관신생 백분율을 나타낸다. 야생형 마우스와 비교하여 Slit으로 처리된 마우스에서의 혈관신생에서 63％ 감소가 있었다. N=6, P<0.003. 도 12B는 식염수 대조군이 제공된 마우스와 비교된 모조물 제제가 제공된 야생형 마우스에서의 망막의 혈관신생 백분율을 나타낸다. N=5, P<0.85. 도 12C는 Slit과 비교된 녹아웃(knockout) 마우스에서의 망막의 혈관신생 백분율을 나타낸다. N=1.
도 13은 Slit 및 네트린(netrin)이 VEGF-유도 진피 투과성을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 14는 Slit이 VEGF-매개된 망막 투과성을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 15는 세마포린(semaphorin)이 VEGF와 유사하게 진피 투과성을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 16은 Robo4가 Arf6의 억제를 통해 Rac-의존적 돌출 활성을 차단한다는 것을 나타낸다. αIIb 또는 αIIb-Robo4 세포질 꼬리를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포가 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 및 피브리노겐으로 코팅된 접시 상에 플레이팅되었고, 용해되었고, GTP-ARF6가 GST-GGA3으로 침전되었다. ARF6이 ARF6-특이적 모노클로날 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다 (도 16A 참조). αIIb 또는 αIIb-Robo4 세포질 꼬리를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포가 GFP 및 빈 벡터 또는 GIT1-PBS로 공동-형질감염되었고, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 및 피브리노겐으로 코팅된 커버슬립 상에서의 확산 분석법에 적용되었다. GFP-양성 세포의 면적을 ImageJ를 사용하여 결정하였고, 이때 오차 막대는 SEM을 가리킨다 (도 16B 참조). HEK 293 세포가 GFP 및 지시된 구축물로 공동-형질감염되었고, 36시간 후 피브로넥틴, 및 모조물 제제 또는 Slit2 단백질 상에서의 확산 분석법에 적용되었다 (도 16C 참조). 모든 패널에서, 오차 막대는 평균±SE를 의미한다. Robo4 및 ARNO의 발현이 웨스턴 블롯팅에 의해 증명되었다 (데이터는 제시되지 않음). HEK 293 세포가 GFP 및 지시된 구축물로 공동-형질감염되었고, 36시간 후 피브로넥틴, 및 모조물 제제 또는 Slit2 단백질로 코팅된 접시 상에 플레이팅되었다. GTP-Rac가 GST-PBD로 침전되었고, Rac이 Rac1-특이적 모노클로날 항체로 검출되었다 (도 16D 참조).
도 17은 Robo4 수용체가 Slit 리간드에 결합한다는 것을 실연하는 면역침전 반응의 결과를 도해한다. 도 17A는 형질감염되지 않은 인간 배아 신장 세포 (HEK), myc 에피토프가 태그(tag)로 부착된 Slit으로 형질감염된 HEK 세포 (Slit-myc), HA 에피토프가 태그로 부착된 Robo4로 형질감염된 HEK 세포 (Robo4-HA) 및 대조군 벡터로 형질감염된 HEK 세포 (대조군-HEK)로부터의 세포 용해물의 면역침전의 결과를 나타낸다. Slit-myc 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석이 대조군으로 작용하고, Slit 단백질의 질량이 기존에 보고된 바와 같이 약 210 kD라는 것을 실연한다 (레인 1). Slit-myc 및 Robo4-HA 세포 용해물이 조합되어 항-HA 항체로 면역침전된 후 항-myc 항체로의 웨스턴 블롯에 의해 Slit-myc 단백질이 또한 검출된다 (레인 6). 이러한 상호작용의 특이성이 용해물들의 모든 또다른 조합으로의 검출가능한 Slit 단백질의 부재에 의해 확증된다. 동일한 양의 용해물이 각각의 실험 에서 사용되었다. 레인 2-6의 더 낮은 밴드는 면역글로불린 중쇄에 상응한다. 도 17B는 형질감염되지 않은 HEK 세포 (HEK CM), myc 에피토프가 태그로 부착된 Slit 으로 형질감염된 HEK 세포 (Slit-myc CM), HA 에피토프가 태그로 부착된 Robo4의 N-말단 가용성 엑토도메인으로 형질감염된 HEK 세포 (NRobo4-HA CM) 및 대조군 벡터로 형질감염된 HEK 세포 (대조군-HEK CM)로부터의 조건화 배지의 면역침전의 결과를 나타낸다. 전장 Slit-myc 단백질 (210 KD) 및 이의 C-말단 단백질용해성 단편 (70 KD)이 항-myc 항체에 의해 Slit-myc CM에서 검출된다 (레인 1). 도 17A에서와 같이, Slit-myc 및 Robo4-HA 조건화 배지가 조합되어 항-HA 항체로 면역침전된 후 웨스턴 블롯에 의해 Slit-myc 단백질이 또한 검출된다 (레인 6). 이러한 상호작용의 특이성이 조건화 배지들의 모든 또다른 조합으로의 Slit 단백질의 부재에 의해 확증된다. 도 17C - 도 17F에 나타난 바와 같이, Slit 단백질이 Robo4를 발현하는 세포의 형질막에 결합한다. Slit-myc 단백질의 결합이 항-myc 항체 및 알렉사 594 접합 항-마우스 항체를 사용하여 검출되었다. Robo4-HEK 세포의 표면 상에서 결합이 검출되지만 (도 17F), 대조군-HEK 세포에서는 검출되지 않는다 (도 17D).
도 18은 Robo4 발현이 내피-특이적이고 및 자루 세포 중심적이라는 것을 나타낸다. 도 18A는 P5 Robo4 +/ AP 마우스로부터 제조되고 엔도뮤신(Endomucin) (내피 세포), NG2 (혈관주위세포) 및 알칼리성 포스파타제 (AP; Robo4)에 대해 염색된 망막 플랫마운트(flatmount)를 도해한다. 왼쪽 상부 패널 내의 오른쪽을 가리키는 최상부의 화살표는 정단(tip) 세포를 가리키고, 나머지 화살표들은 혈관주위세포를 가리킨다 (NG2-양성). "T" 또한 정단 세포를 가리킨다. 도 18B는 성체 Robo4 +/ AP 마우스로부터 제조되고 NG2 (혈관주위세포) 및 AP (Robo4)에 대해 염색된 망막 플랫마운트를 도해하고, 이때 도 18B에 포함된 화살표들은 혈관주위세포를 가리킨다 (NG2-양성). 도 18C는 PECAM, Robo1 및 Robo4에 특이적인 프라이머를 사용하여 지시된 샘플 상에서 수행된 정량적 RT-PCR (qPCR)의 결과를 나타낸다. 도 18C에서 사용된 "HAEC"는 인간 대동맥 내피 세포를 나타내고, "HMVEC"는 인간 미세혈관 내피 세포를 나타내며, "HASMC"는 인간 대동맥 평활근 세포를 나타낸다. 도 18D는 HMVEC 및 HASMC로부터의 전체 세포 용해물을 Robo4, VE-카드헤린, 평활근 액틴 및 ERK1/2에 대한 항체로 프로빙한 것의 결과를 도해한다.
도 19는 Robo4 신호전달이 VEGF-A-유도 이동, 관 형성, 투과성 및 Src 부류 키나제 (SFK) 활성화를 억제한다는 것을 도해한다. Robo4 +/+ 및 Robo4 AP / AP 마우스로부터 단리된 폐 내피 세포 (EC)가 내피 세포 이동 (도 19A), 관 형성 (도 19B), 시험관내 투과성 (도 19C), 마일즈(Miles) 분석법 (도 19D) 및 망막 투과성 분석법 (도 19E)에서 사용되었다. 인간 미세혈관 내피 세포가 모조물 제제 또는 Slit2 단백질의 존재 하에 5분 동안 VEGF-A로 자극되었고, 용해되었으며, 포스포-VEGFR2 항체에 의한 웨스턴 블롯팅 (도 19F), 포스포-Src 항체에 의한 웨스턴 블롯팅 (도 19G) 및 Rac 활성화 분석법 (도 19H)에 적용되었다. 모든 패널에서, *는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.005를 나타내며, ***는 p<0.0005를 나타내고, NS는 "유의하지 않음"을 가리키고, 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 20은 Robo4 신호전달이 산소-유도 망막병증 ("OIR")의 동물 모델 및 맥락막 혈관신생 ("CNV")의 동물 모델에서 병적 혈관형성을 억제한다는 것을 도해한다. 신생 Robo4 +/+ 및 Robo4 AP / AP 마우스에 산소-유도 망막병증을 적용하였고, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-덱스트란 (녹색)을 관류시켰다. 망막 플랫마운트를 각각의 상태에 대해 제조하고, 형광 현미경검사에 의해 분석하였다. 화살표는 병적 혈관형성 영역을 가리킨다 (도 20A 내지 도 20D). 도 20A 내지 도 20D에서 관찰된 병적 혈관형성의 정량화가 도 20E에서 제공된다. CNV 모델에서, 2-3개월령의 Robo4 +/+ 및 Robo4 AP / AP 마우스에 레이저-유도 맥락막 혈관신생이 적용되었다. 맥락막 플랫마운트가 제조되었고, 이소렉틴으로 염색되었으며, 공초점 현미경검사에 의해 분석되었다 (도 20F 내지 도 20I). 도 20F 내지 도 20I에서 관찰된 병적 혈관형성의 정량화가 도 20J에서 제공된다. 모든 패널에서, *는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.005를 나타내며, ***는 p<0.0005를 나타내고, NS는 "유의하지 않음"을 가리키고, 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 21은 Robo4 신호전달이 bFGF-유도 혈관형성 및 트롬빈-자극 내피 과투과성을 억제한다는 것을 도해한다. 도 21A에 도해된 결과를 제공한 실험을 수행하는데 있어서, 뮤린 폐 내피 세포에 bFGF 및 모조물 제제 또는 Slit2 단백질의 존재 하에 매트리젤 상에서의 관 형성 분석법이 적용되었다. 도 21B에 도해된 결과를 제공한 실험을 수행하는데 있어서, 뮤린 폐 내피 세포에 피브로넥틴-코팅 트랜스 웰(Transwell) 상에서의 트롬빈-유도 투과성 분석법이 적용되었다.
도 22는 Robo4 신호전달이 급성 폐 손상 모델에서 손상 및 염증을 감소시킨다는 것을 도해한다. 마우스가 기관내 LPS에 노출되었고, Slit 단백질 또는 모조물 제제로 처리되었다. 기관지폐포 세척 (BAL)에서의 염증 세포 및 단백질의 농도가 Slit 단백질로의 처리에 의해 현저하게 감소되었다
도 23은 Slit 단백질에 대한 여러 구축물을 도해하고, 재조합 Slit 펩티드 뿐만 아니라 Slit2-D1 (40kD)이 활성이라는 것을 나타낸다. 도 23A에서, Slit 단백질에 대한 여러 구축물이 묘사된다. 4개의 류신 풍부 도메인 (LRR), 표피 성장 인자 상동성 영역 (EGF) 및 c-말단 태그 (MYC/HIS)가 지시된다. 여러 Slit 구축물 (2 nM)에 의한 VEGF-매개된 내피 세포 이동의 억제가 도 23B에 제시된다.
도 24는 조류 독감의 마우스 모델에 따라 조류 독감 바이러스로 감염된 마우스의 생존에 대한 Slit2 단백질을 투여하는 것의 효과를 나타낸다.
도 25는 실시예 14에 기술된 녹아웃 마우스의 게놈 형질을 도해한다.
도 26은 Robo4 세포질 꼬리가 피브로넥틴-유도 돌출 활성을 억제함을 나타낸다. 도 26A는 이동 및 확산 분석에서 사용된 cDNA 구축물의 개략도를 나타낸다. TM = 막횡단 도메인. CCO 및 CC2는 Robo 부류 구성원에서 발견되는 보존된 세포질 신호전달 모티프이다. 도 26B에서, HEK 293 세포는 GFP 및 지시된 구축물로 공동-형질감염되었고, 36시간 후에 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 및 모조물 제제 또는 Slit2로 코팅된 커버슬립 상에서 확산 분석에 적용되었다. GFP-양성 세포의 면적을 ImageJ를 사용하여 결정하였다. 모조물은 Slit2의 허위 제제를 가리킨다. Robo4 구축물의 발현이 웨스턴 블롯팅에 의해 확인되었다 (데이터는 제시되지 않음). 도 26C에서는, αIIb 또는 αIIb-Robo4 세포질 꼬리를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포를 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 및 피브리노겐으로 코팅된 커버슬립 상에서 확산 분석에 적용되었다. 세포의 면적을 ImageJ를 사용하여 결정하였다.
도 27은 면역침전 실험의 결과를 나타내며, 여기서 CHO-K1 세포는 지시된 구축물로 형질감염되었고, 36시간 후에 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 또는 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴/피브리노겐으로 코팅된 접시 상에 플레이팅되었다. 5분 인큐베이션 후, 세포가 용해되었고, GTP-Rac가 GST-PBD로 침전되었다. Rac가 Rac-특이적 모노클로날 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다.
도 28은 Slit2가 GIT1을 통해 내피 세포 돌출을 억제한다는 것을 도해한다. 도 28A에서는, EC가 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 및 모조물 제제 또는 Slit2로 코팅된 막 상에서 접촉주성 이동 분석에 적용되었다. 필터 아랫면 상의 세포를 계수하였고, 피브로넥틴/모조물 막 상의 이동을 100％로 설정하였다. 도 28B에서는, EC가 피브로넥틴과 모조물 또는 Slit2 상에서의 확산 분석에 적용되었다. 세포의 면적을 ImageJ를 사용하여 결정하였다. 도 28C에서는, EC는 피브로넥틴과 모조물 또는 Slit2로 코팅된 접시 상에 플레이팅되었고, 용해되었으며, GTP-ARF6이 GST-GGA3로 침전되었다. 도 28D에서는, EC가 VEGF-165 및 모조물 또는 Slit2로 코팅된 접시 상에 플레이팅되었으며, 용해되었고, GTP-ARF6가 GST-GGA3로 침전되었다. ARF6이 ARF6-특이적 모노클로날 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. **p<0.005. 오차 막대는 SEM을 가리킨다. 모조물은 Slit2의 허위 제제를 가리킨 다.
도 29는 Secin-H3의 화학 구조를 도시한다.
도 30은 ARF6 억제가 신생혈관 다발 형성 및 내피 과투과성을 방지함을 도해한다. DMSO 또는 Secin-H3를 야생형 마우스의 반대쪽 눈에 주사하고, 산소-유도 망막병증, 레이저-유도 맥락막 혈관신생 및 VEGF-165-유도 망막 과투과성을 적용하였다. 도 30A에서는, OIR 적용된 신생 마우스로부터 망막 플랫마운트를 제조하고, 형광 이소렉틴으로 염색하고, 형광 현미경검사로 분석하였다. 상부 패널은 낮은 배율 영상이고, 하부 패널은 높은 배율 영상이다 (병적 신생혈관 다발은 각각 황색 및 백색 화살표로 나타난다). 도 30B는 도 30A에 나타낸 병적 혈관신생의 정량화를 도시한다. 도 30C에서는, 맥락막 플랫마운트를 레이저-유도 맥락막 혈관신생을 적용한 2-3개월령 마우스로부터 제조하였고, 형광 이소렉텐으로 염색하고, 공초점 현미경검사로 분석하였다. 도 30D는 도 30C에서 관찰된 병적 혈관형성의 정량화를 나타낸다. 도 30E는 VEGF-165의 유리체내 주사 후의 망막 투과성의 정량화이다. 비히클은 DMSO이다. *p<0.05. 오차 막대는 SEM을 가리킨다.
도 31은 소형 분자(small molecule) Secin-H3가 VEGF 유도 ARF6 GTP를 억제함을 나타낸다.
도 32는 Secin-H3가 VEGF 유도된 HMVEC의 이동을 억제함을 도해한다.
도 33은 Src 키나제 활성화 (인산화)가 ARF6에 의존적이지 않음을 도해한다.
도 34는 GIT1 RNAi가 VEGF 유도된 HMVEC의 투과성을 억제함을 도해한다.
도 35는 본원에 기재된 경로의 개략도이다.
도 36은 SecinH3이 Arf6 활성화를 차단하고, 혈관성 눈 질환의 동물 모델에서 병적 혈관형성 및 내피 과투과성을 억제함을 도해한다. EC를 SecinH3 또는 DMSO로 전처리하고, Arf6 활성화 (도 36A) 및 세포 이동 분석 (도 36B)을 적용하였다. SecinH3 또는 DMSO를 야생형 마우스의 반대쪽 눈에 주사하고, 산소-유도 망막병증 (도 36C), 레이저-유도 맥락막 혈관신생 (도 36E) 및 VEGF-165-유도 망막 과투과성 (도 36G)을 적용하였다. OIR 적용된 신생 마우스로부터 망막 플랫마운트를 제조하고 (도 36C), 형광 이소렉틴으로 염색하고, 형광 현미경검사로 분석하였다. 상부 패널은 낮은 배율 영상이고, 하부 패널은 병적 신생혈관 다발 (도 36D)을 강조하는 백색 박스로 외곽표시한 면적의 높은 배율 영상이다. 병적 혈관신생의 정량화를 도 36C에 도시함. 맥락막 플랫마운트를 레이저-유도 맥락막 혈관신생을 적용한 2-3개월령 마우스로부터 제조하였고, 형광 이소렉텐으로 염색하고, 공초점 현미경검사로 분석하였다 (도 36E). 도 36E에서 관찰된 병적 혈관형성의 정량화 (도 36F). VEGF-165의 유리체내 주사 후의 망막 투과성의 정량화 (도 36G). 비히클은 DMSO이다. *p<0.05. 오차 막대는 s.e.m.을 가리킨다.
도 37은 Slit2가 팍실린이 병소 부착에 동원되는 것을 차단하고, 팍실린을 세포 표면에 동원함을 나타내는 영상을 제공한다.
도 38은 Slit2가 ArfGAP를 통해 내피 세포 돌출을 억제함을 나타낸다. 내피 세포 (EC)를 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴과 모조물 또는 Slit2로 코팅된 막 상에서 접촉주성 이동 분석에 적용하였다 (도 38A). 필터 아랫면 상의 세포를 계수하였고, 피브로넥틴/모조물 막 상의 이동을 100％로 설정하였다. EC를 피브로넥틴과 모조물 또 는 Slit2 상에서의 확산 분석에 적용하였다 (도 38B). 세포의 면적을 ImageJ를 사용하여 결정하였다. EC는 피브로넥틴과 모조물 또는 Slit2로 코팅된 접시 상에 플레이팅되었으며, 용해되었고, GTP-Arf6이 GST-GGA3로 침전되었다 (도 38C). EC는 VEGF-165 및 모조물 또는 Slit2로 코팅된 접시 상에 플레이팅되었으며, 용해되었고, GTP-Arf6이 GST-GGA3로 침전되었다 (도 38D). Arf6이 Arf6-특이적 모노클로날 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 모조물은 Slit2의 허위 제제를 가리킨다. **p<0.005. 오차 막대는 s.e.m.을 가리킨다.
도 39는, Rho 활성화는 Slit2에 의해 변화되지 않았으나, Cdc42 활성화는 Slit2에 의해 유의하게 감소되었음을 나타낸다.
개시된 방법 및 조성물에 대해 사용될 수 있거나, 이와 함께 사용될 수 있거나, 이의 제조에서 사용될 수 있거나, 이의 생성물인 물질, 조성물 및 성분이 개시된다. 이러한 물질 및 기타 물질이 본원에서 개시되고, 이러한 물질들의 조합, 부분집합, 상호작용, 군 등이 개시되는 경우에는, 이러한 화합물들의 각각의 다양한 개별적 및 총괄적 조합 및 치환의 구체적인 언급이 명쾌하게 개시되지 않을 수 있는 한편, 각각이 본원에서 구체적으로 구현되고 기술되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 폴리펩티드가 개시 및 논의되고, 폴리펩티드를 포함하는 다수의 분자에 이루어질 수 있는 다수의 변형이 논의된다면, 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 폴리펩티드의 각각의 모든 조합 및 치환, 및 가능한 변형이 명확하게 구현된다. 따라서, 분자 A, B 및 C의 클래스, 뿐만 아니라 분자 D, E 및 F의 클래스, 및 조합 분자 A-D의 예가 개시되면, 각각이 개별적으로 인용되지 않더라도, 각각이 개별적으로 및 총괄적으로 구현된다. 따라서, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적인 조합 A-D의 개시로부터, A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F 조합 각각이 명확하게 구현되고, 개시된 것으로 고려되어야 한다. 유사하게, 이들의 모든 부분집합 또는 조합 또한 명확하게 구현되고 개시된다. 따라서, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적인 조합 A-D의 개시로부터, 예를 들어, A-E, B-F, 및 C-E의 부분집합이 명확하게 구현되고, 개시된 것으로 간주되어야 한다. 이러한 개념은 개시된 조성물을 제조하고 사용하는 방법들에서의 단계들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본 출원의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가적인 단계들이 있다면, 각각의 이러한 추가적인 단계들이 개시된 방법의 임의의 특정 실시양태 또는 실시양태들의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 이같은 조합이 명확하게 구현되며, 개시된 것으로 간주되어야 하는 것으로 이해된다.
기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 변할 수 있기 때문에 개시된 방법 및 조성물이 이에 한정되지 않는 것으로 이해된다. 본원에서 사용된 용어는 오직 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적이고, 첨부된 청구항에 의해서만 한정될 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는 것으로 또한 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 명세서의 정황에서 당업자가 통상적으로 이해할 의미를 지닌다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형의 "부정관사" 및 "정관사"는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수형 언급을 포함한다는 것을 주지하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩티드(a polypeptide)"에 대한 언급은 다수의 이같은 폴리펩티드를 포함하고, "폴리펩티드(the polypeptide)"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리펩티드 및 당업자에게 공지된 이의 등가물에 대한 언급이다.
"임의적인" 또는 "임의로"는 이에 이어서 기술된 사건, 상황 또는 물질이 발생하거나 존재할 수 있거나, 또는 발생하거나 존재하지 않을 수 있다는 것, 및 설명이 사건, 상황 또는 물질이 발생하거나 존재하는 경우 및 발생하거나 존재하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
범위는 "대략적인 (약)" 한가지 특정 값에서부터 및/또는 또다른 "대략적인 (약)" 특정 값까지로 본원에서 표현될 수 있다. 이같은 범위가 표현될 때, 또다른 실시양태는 한 특정 값에서부터 및/또는 또다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 선행하는 "약"을 사용하여 값들이 근사치로 표현될 때, 특정 값이 또다른 실시양태를 형성하는 것으로 이해된다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여, 그리고 다른 종점과 독립적으로 유의한 것으로 추가로 이해될 것이다. 다수의 값이 본원에서 개시되고, 각각의 값은 값 자체에 더하여 "대략적인 (약)" 이러한 특정 값으로 또한 본원에서 개시되는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "약 10"이 또한 개시된다. 당업자에게 적절하게 이해되는 바와 같이, 값이 개시될 때 이러한 값 "이하" 또는 "이상" 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 개시되는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "10 이하", 뿐만 아니라 "10 이상"이 또한 개시된다. 본 출원 전반에 걸쳐, 데이터가 다수의 상이한 포맷으로 제공되고, 이러한 데이터는 종점 및 출발점, 및 데이터 포인트들의 임의의 조합에 대한 범위를 나타내는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 15가 개시되면, 10 및 15 초과, 10 및 15 이상, 10 및 15 미만, 10 및 15 이하, 및 10 및 15, 뿐만 아니라 10 내지 15 사이가 개시된 것으로 간주된다. 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위가 또한 개시된 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시되면, 11, 12, 13 및 14가 또한 개시된다.
본원에서 사용된 용어 "대상체"은 소정의 질환, 질병, 사건 또는 손상에 대한 치료를 필요로 하는 대상체인 동물 또는 인간, 바람직하게는 포유동물을 지칭한다. 따라서, 대상체는 인간일 수 있다. 이러한 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 성인 (성체) 및 신생 대상체, 뿐만 아니라 태아가 남성 또는 여성 (암컷 또는 수컷)이 포함되도록 의도된다. 환자는 질환 또는 장애로 고생하는 대상체를 지칭한다. 용어 "환자"에는 인간 및 수의학 대상체가 포함된다.
"억제하다", "억제하는" 및 "억제"는 활성, 반응, 상태, 질환 또는 기타 생물학적 파라미터를 감소시키는 것을 의미한다. 이는 활성, 반응, 상태 또는 질환의 완전한 제거를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 이는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 상태 또는 질환에서의 10％ 감소를 예를 들어 포함할 수 있다. 따라서, 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100％, 또는 구체적으로 언급된 백분율들 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다.
"촉진하다", "촉진" 및 "촉진하는"은 활성, 반응, 상태, 질환 또는 기타 생물학적 파라미터에서의 증가를 지칭한다. 이는 활성, 반응, 상태 또는 질환의 개시를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 이는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 상태 또는 질환에서의 10％ 증가를 예를 들어 포함할 수 있다. 따라서, 활성, 반응, 상태, 질환 또는 기타 생물학적 파라미터에서의 증가는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100％, 또는 그 이상 (구체적으로 언급된 백분율들 사이의 임의의 양의 증가 포함)일 수 있다.
용어 "치료상 유효한"은 사용된 조성물의 양이 질환 또는 장애의 하나 이상의 원인 또는 증상을 개선하는데 충분한 분량이라는 것을 의미한다. 이같은 개선에는 단지 감소 또는 변경만이 필요하고, 반드시 제거가 필요하지는 않다.
용어 "담체"는 화합물 또는 조성물과 조합되어 사용될 때, 의도된 용도 또는 목적을 위한 화합물 또는 조성물의 제조, 보관, 투여, 전달, 유효성, 선택성, 또는 임의의 기타 측면을 보조하거나 용이하게 하는 화합물, 조성물, 물질 또는 구조물을 의미한다. 예를 들어, 담체는 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하도록, 그리고 대상체에서의 임의의 불리한 부작용을 최소화하도록 선택될 수 있다.
"알킬"은 탄소-탄소 단일 결합에 의해 결합되고, 함께 결합된 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 탄화수소 기를 지칭한다. 알킬 탄화수소 기는 직쇄일 수 있거나, 또는 하나 이상의 분지를 함유할 수 있다. 이러한 기에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실 등이 포함된다. "저급 알킬"은 1 내지 4개의 탄소를 갖는, 임의로 치환된 분지쇄 또는 직쇄 알킬을 지칭한다.
"알케닐"은 탄소 원자간에 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하면서 함께 결합된 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는, 임의로 치환된 탄화수소 기를 지칭한다. 알케닐 탄화수소 기는 분지쇄 또는 직쇄일 수 있다.
"시클로알킬"은 임의로 치환된 시클릭 알킬 또는 임의로 치환된 비-방향족 시클릭 알케닐을 지칭하며, 여기에는 모노시클릭 및 다중 융합 고리 구조, 예컨대 비시클릭 및 트리시클릭이 포함된다. 시클로알킬은, 예를 들어 3 내지 15개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 시클로알킬은 5 내지 12개의 탄소 원자를 갖는다. 적합한 시클로알킬 기의 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함된다.
"헤테로사이클"은 적어도 하나의 비-탄소 원자를 포함하는 임의로 치환된 포화 또는 부분 포화 비-방향족 고리화 잔기를 지칭한다. 헤테로시클릭 잔기에는 전형적으로 단일 고리 또는 다중 융합 고리 구조, 예컨대 비시클릭 및 트리시클릭이 포함된다. 한 실시양태에서, 고리(들)은 5 내지 6-원 고리이며, 전형적으로 1 내지 3개의 비-탄소 원자를 함유한다. 헤테로사이클에 대한 비-탄소 원자는, 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다.
"아릴"은 컨쥬게이션된 파이-전자 고리계를 갖는 적어도 하나의 고리를 가지는 임의로 치환된 방향족 기를 지칭하며, 여기에는 모노시클릭 및 다중 융합 고리 구조, 예컨대 비시클릭 및 트리시클릭이 포함된다. 아릴에는 임의로 치환된 카르보시클릭 아릴이 포함된다. 적합한 아릴 기의 예로는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐 등이 포함된다.
"헤테로시클릭 아릴"은 적어도 하나의 비-탄소 원자를 포함하는 컨쥬게이션된 파이-전자 고리계를 갖는 적어도 하나의 고리를 가지는 임의로 치환된 방향족을 지칭한다. 헤테로시클릭 아릴 잔기에는 전형적으로 하나의 고리 또는 다중 융합 고리 구조, 예컨대 비시클릭 및 트리시클릭이 포함된다. 적합한 헤테로시클릭 아릴 기의 예로는 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피리디닐 등이 포함된다.
"알콕시"는 산소가 알킬 기에 결합되어 있는 것을 지칭한다. "저급 알콕시"는 산소가 저급 알킬 기에 결합되어 있는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 산소는 비치환된 알킬 (1 내지 4개의 탄소 길이)에 결합되어 있다. 예를 들어, 알콕시는 메톡시, 에톡시 등일 수 있다.
"알킬렌"은 탄소 원자간에 탄소-탄소 단일 결합만을 함유하는 임의로 치환된 탄화수소 쇄를 지칭한다. 알킬렌 쇄는 1 내지 6개의 탄소를 가지며, 다른 관능기 또는 구조적 잔기에 두 위치에서 부착되어 있다. 적합한 알킬렌 기의 예로는 메틸렌, 에틸렌 등이 포함된다.
활성제를 언급하는 경우, "생물학적으로 활성" 및 "원하는 생물학적 활성"은 표적화 분자의 활성 또는 활성화를 조절하는 능력을 지칭한다. 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 생물학적 활성제와 함께 사용되는 경우, "생물학적으로 활성" 및 "원하는 생물학적 활성"은 표적화 물질의 활성 또는 활성화를 직접 또는 간접적으로 억제하거나 차단하는 능력을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "소형 분자"는 저분자량 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 구체적인 실시양태에서, 상기 소형분자 화합물은 50 달톤 내지 800 달톤의 분자량을 나타내는 화합물이다. 다른 실시양태에서, 본원에서 기재된 바와 같은 소형 분자는 100 달톤 내지 500 달톤 및 250 달톤 내지 475 달톤 범위로부터 선택된 분자량을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 구체적인 질환, 질병, 사건 또는 손상의 해로운 효과(들) 또는 진행을 예방하거나, 감소시키거나, 정지시키거나 늦추는 치료적 이점을 지칭한다.
"치료상 유효량"은 치료적 이점, 예컨대 질환을 앓는 대상체의 질환 저해 또는 질환 발병의 예방적 저해 또는 예방을 달성하는 화합물의 양이다. 치료상 유효량은 대상체의 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 다소 완화시키고/거나; 질환 또는 장애와 관련되거나 그의 원인인 생리학적 또는 생화학적 파라미터 하나 이상을 부분적으로 또는 완전히 정상으로 회복시키고/거나; 질환 또는 장애의 발병 가능성을 감소시키는 양일 수 있다.
용어 "병적" 또는 "병적 상태"는 질환, 질병, 사건 또는 손상의 결과일 수 있는, 건강하거나, 정상적이거나 또는 효율적인 상태로부터의 임의의 일탈을 지칭한다.
용어 "조절 서열"은 일반적으로 한 유전자좌의 코딩 영역의 100-1000 킬로베이스 (kb) 이내의 조절 서열을 지칭하지만, 코딩 영역으로부터 더 멀리 있을 수도 있고, 이는 유전자의 발현에 영향을 미친다. 이같은 발현 조절에는 유전자의 전사, 번역, 스플라이싱, 및 메신저 RNA의 안정성이 포함된다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 이렇게 기술된 성분들이 이들이 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병렬을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면, 프로모터가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 또는 전사 인자 결합 부위들의 어레이)과 제2 핵산 서열 간의 기능성 연결을 지칭할 수 있고, 이때 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본원에 개시된 생체분자를 기술하는데 사용되는 경우의 "단리된"은, 예를 들어, 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 펩티드, 단백질 또는 핵산을 의미한다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 단리된 분자(들)에 대한 진단 또는 치료 용도를 전형적으로 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 물질을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 생체분자의 단리 및 정제를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업계에서 입수가능하며, 당업자는 단리될 또는 정제될 물질의 견지에서 적절한 단리 및 정제 방법을 결정할 수 있다. 전형적으로는 1회 이상의 정제 단계를 사용하여 단리된 생체분자가 제조될 것이지만, 본원에서 사용된 "단리된"은, 상동성 세포 유형에서 발현되는 경우에도, 예를 들어 재조합 세포 내의 원위치(in-situ) 펩티드, 단백질, 항체 또는 핵산 물질을 추가적으로 지칭한다.
추가로, 용어 "단리된", "실질적으로 순수한", 및 "실질적으로 균질한"이 단량체성 단백질을 기술하는데 사용되는 경우, 이들은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 단량체성 단백질은 샘플의 적어도 약 60 내지 75％가 단일 폴리펩티드 서열을 나타내는 경우에 실질적으로 순수하다. 실질적으로 순수한 단백질은 전형적으로 단백질 샘플의 약 60 내지 90％ W/W를 이룰 것이고, 원한다면, 실질적으로 순수한 단백질은 약 90％, 약 95％, 또는 약 99％ 초과로 순수할 수 있다. 단백질 순도 또는 균질성은 당업계에 주지된 다수의 수단, 예컨대 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 이은 젤 염색 상에서의 단일 폴리펩티드 밴드의 시각화에 의해 지시될 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 사용되는 당업계에 주지된 기타 수단을 사용함으로써 더 높은 분해능이 제공될 수 있다.
본 명세서의 상세한 설명 및 청구항에 걸쳐, 용어 "포함하다" 및 이러한 단어의 변종, 예컨대 "포함하는"은 "포함하지만 이에 한정되지 않음"을 의미하고, 예를 들어 다른 첨가물, 성분, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다.
단백질 ＆ 펩티드
본원에서 사용된 용어 "단백질" 및 "펩티드"는 일반적으로 폴리펩티드 분자를 단순히 지칭하고, 임의의 특정 크기, 길이 또는 분자량의 폴리펩티드 분자를 지칭하도록 사용되지 않는다. 단백질 변이체 및 유도체는 당업자에게 잘 이해되어 있고, 아미노산 서열 변형을 수반할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형은 전형적으로 3가지 클래스 중 하나 이상으로 분류된다: 치환 변이체, 삽입 변이체 또는 결실 변이체. 삽입에는 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합, 뿐만 아니라 서열내 삽입이 포함된다. 삽입은 통상적으로 아미노 또는 카르복실 말단 융합보다 작은 삽입, 예를 들어, 대략 1개 내지 4개의 잔기일 것이다. 융합물을 코딩하는 DNA로 형질전환된 재조합 세포 배양물에 의해 또는 시험관내에서의 가교에 의해 면역원성을 부여하기에 충분히 큰 폴리펩티드를 표적 서열에 융합시킴으로써 면역원성 융합 단백질 유도체, 예컨대 실시예에 기술된 것들이 제조된다. 결실은 단백질 서열로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 전형적으로, 약 2개 내지 6개 이하의 잔기가 단백질 분자 내의 임의의 한 위치에서 결실될 수 있다. 이러한 변이체는 단백질을 코딩하는 DNA 내의 뉴클레오티드의 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 변이체를 코딩하는 DNA를 생산한 후, DNA를 재조합 세포 배양물에서 발현시킴으로써 통상적으로 제조된다. 공지된 서열의 DNA 내의 미리 정해진 부위에서의 치환 변이체를 제조하기 위한 기술, 예를 들어 M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발이 주지되어 있다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 치환이지만, 다수의 상이한 위치에서 동시에 발생할 수 있고, 삽입은 일반적으로 아미노산 잔기 약 1개 내지 10개일 것이며, 결실은 잔기 약 1개 내지 30개 범위일 것이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접한 쌍에서 이루어지고, 즉, 2개의 잔기의 결실 또는 2개의 잔기의 삽입이다. 치환, 결실, 삽입 또는 이의 임의의 조합이 최종 구축물에 도달하도록 조합될 수 있다. 돌연변이는 서열을 리딩 프레임 밖에 놓지 않아야 하고, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생산할 수 있는 상보성 영역을 생성시키지 않을 것이다. 치환 변이체는 하나 이상의 잔기가 제거되고, 상이한 잔기가 그 자리에 삽입된 것이다. 일반적으로 이같은 치환은 하기의 표 1에 따라 이루어지고, 보존적 치환으로 지칭된다.
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기능 또는 면역학적 신원에서의 실질적인 변화는 표 1에서의 것들보다 덜 보존적인 치환을 선택함으로써, 즉, (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형상과 같은, 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조; (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 부피(bulk)를 유지하는 것에 대한 효과가 더욱 현저하게 상이한 잔기를 선택함으로써 이루어진다. 일반적으로 단백질 성질에서의 최대 변화를 일으킬 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들어 세릴 또는 트레오닐과 소수성 잔기, 예를 들어, 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐의 치환; (b) 시스테인 또는 프롤린과 임의의 다른 잔기의 치환; (c) 양전성 측쇄가 있는 잔기, 예를 들어, 라이실, 아르기닐, 또는 히스티딜와 음전성 잔기, 예를 들어, 글루타밀 또는 아스파르틸의 치환; 또는 (d) 부피가 큰 측쇄가 있는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌과 측쇄가 없는 것, 예를 들어, 글리신의 치환, (e) 술페이트화 및/또는 글리코실화 부위의 수를 증가시키는 것일 것이다.
예를 들어, 하나의 아미노산 잔기를 생물학적 및/또는 화학적으로 유사한 또다른 잔기로 교체하는 것은 보존적 치환으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 하나의 소수성 잔기를 또다른 소수성 잔기로, 또는 하나의 극성 잔기를 또다른 극성 잔기로 교체하는 것일 것이다. 치환은, 예를 들어, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr과 같은 조합을 포함한다. 각각의 명쾌하게 개시된 서열의 이같은 보존적으로 치환된 변종은 본원에서 제공되는 폴리펩티드 내에 포함된다.
치환성 또는 결실성 돌연변이유발이 N-글리코실화 (Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화 (Ser 또는 Thr)를 위한 부위를 삽입하는데 사용될 수 있다. 시스테인 또는 기타 불안정한 잔기의 결실이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어, 염기성 잔기들 중 하나를 결실시킴으로써 또는 이를 글루타미닐 또는 히스티딜 잔기로 치환함으로써, 잠재적인 단백질분해 부위, 예를 들어 Arg의 결실 또는 치환이 달성된다.
특정한 번역후 유도체화는 발현된 폴리펩티드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 빈번하게 번역후에 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기로 탈아미드화환다. 별법으로, 이러한 잔기들이 마일드한 산성 조건 하에 탈아미드화된다. 기타 번역후 변형에는 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노 기의 메틸화 ([T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman ＆ Co., San Francisco pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화, 및 일부 경우에서의 C-말단 카르복실의 아미드화가 포함된다.
본원에 개시된 단백질 및 펩티드의 변이체 및 유도체를 정의하는 한가지 방식은 특정한 공지된 서열에 대한 상동성/동일성의 관점에서 변이체 및 유도체를 정의하는 것에 의한 방식인 것으로 이해된다. 언급된 서열에 대한 상동성이 적어도 70％ 또는 75％ 또는 80％ 또는 85％ 또는 90％ 또는 95％인, 본원에 개시된 이러한 단백질 및 기타 단백질의 변이체가 구체적으로 개시된다. 당업자는 2개의 단백질의 상동성을 결정하는 방법을 쉽게 이해한다. 예를 들어, 상동성이 최고 수준이도록 2개의 서열을 정렬한 후에 상동성을 계산할 수 있다.
상동성을 계산하는 또다른 방식은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열들의 최적의 정렬은 문헌 [Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]의 국소적 상동성 알고리즘에 의해, [Needleman and Wunsch, J. Mol. BioL. 48: 443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이러한 알고리즘들의 전산화된 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지(Wisconsin Genetics Software Package) (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575 소재) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 정밀 검사에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, 문헌 [Zuker, M. Science 244:48-52, 1989], [Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989], [Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989] (적어도 핵산 정렬에 관련된 자료에 대해서는 이들 모두가 본원에 포함됨)에 개시된 알고리즘에 의해 핵산에 대해 동일한 유형의 상동성이 수득될 수 있다.
변이체가 보존성 돌연변이인 특정 서열에 대한 상동성이 70％ 이상인 실시양태와 같이, 보존성 돌연변이 및 상동성의 설명이 임의의 조합으로 조합될 수 있는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 다양한 단백질 및 단백질 서열이 논의됨에 따라, 이러한 단백질 서열을 코딩할 수 있는 핵산이 또한 개시되는 것으로 이해된다. 이는 특정 단백질 서열에 관련된 모든 축퇴성 서열, 즉, 하나의 특정 단백질 서열을 코딩하는 서열을 갖는 모든 핵산, 및 단백질 서열의 개시된 변이체 및 유도체를 코딩하는 모든 핵산 (축퇴성 핵산 포함)을 포함할 것이다. 따라서, 각각의 특정 핵산 서열이 본원에서 본원에서 기재되지 않을 수 있지만, 개시된 단백질 서열을 통해 각각의 모든 서열이 실제로 본원에 개시되고 기술된 것으로 이해된다.
개시된 조성물 내로 혼입될 수 있는 수많은 아미노산 및 펩티드 유사체가 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 수많은 D 아미노산 또는 표 1에 제시된 아미노산과는 상이한 기능성 치환체가 있는 아미노산이 있다. 천연 발생 펩티드의 반대 입체이성질체, 뿐만 아니라 펩티드 유사체의 입체이성질체가 개시된다. tRNA 분자에 선택된 아미노산을 채우고, 부위 특이적 방식인 방식으로 유사체 아미노산을 펩티드 사슬 내로 삽입하도록, 예를 들어 앰버(amber) 코돈을 사용하는 유전자 구축물을 조작함으로써, 이러한 아미노산들이 폴리펩티드 사슬 내로 쉽게 혼입될 수 있다 ([Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991)], [Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992)]; [Ibba, Biotechnology ＆ Genetic Enginerring Reviews 13:197-216 (1995)], [Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989)]; [Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994)]; [Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994)] (모두 적어도 아미노산 유사체에 관련된 자료에 대해서는 이들 모두가 본원에 포함됨).
D 아미노산은 펩티다제 및 그밖의 것에 인식되지 않기 때문에, 더욱 안정적인 펩티드를 생성시키는데 D-아미노산이 사용될 수 있다. 컨센서스(consensus) 서열의 하나 이상의 아미노산의 동일한 유형의 D-아미노산으로의 계획적 치환 (예를 들어, L-라이신 대신 D-라이신)을 더욱 안정적인 펩티드를 생성시키는데 사용할 수 있다. 시스테인 잔기가 2개 이상의 펩티드를 함께 고리화시키거나 부착시키는데 사용될 수 있다. 이는 펩티드들을 특정 형상으로 구속시키는데 이로울 수 있다 ([Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)] (본원에 포함됨)).
혈관 투과성
본원에서 사용된 "혈관 투과성"은 혈관 벽을 통과하는 소형 분자 (예를 들어, 이온, 물, 영양소), 대형 분자 (예를 들어, 단백질 및 핵산) 또는 심지어 전체 세포 (염증 부위로의 경로 상의 림프구)의 능력을 지칭한다.
바람직하지 않은 혈관 투과성을 특징으로 하는 질환 및 장애에는, 예를 들어, 뇌 종양과 관련된 부종, 악성종양과 관련된 복수, 메이그스 증후군, 폐 염증, 콩팥 증후군, 심낭 삼출 및 흉막 삼출이 포함된다. 따라서, 혈관 투과성 또는 부종에서의 증가와 관련된 이러한 질환 또는 임의의 또다른 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 부종 형성을 억제하는 것은 몇몇 예를 들자면 염증, 알레르기성 질환, 암, 뇌졸중, 심근경색증, 폐 및 심장 기능부전, 신부전, 및 망막병증과 같은 상황에서 전반적인 환자 결과에 이로워야 한다. 또한, 부종은 조직 저산소증의 일반적인 결과이기 때문에, 혈관 누출의 억제는 조직 저산소증의 치료에 대한 잠재적인 접근법을 나타내는 것으로 또한 결론지을 수 있다. 예를 들어, 병리학적 상태 (예컨대, 혈전 형성) 또는 의학 시술 (예컨대, 심장정지, 장기 이식 및 혈관성형술)에 의한 혈류의 중단이 혈관 누출의 억제제를 사용하여 급성으로 및 예방적으로 치료될 수 있다.
또한, 졸중 및 심근경색증 후의 허혈/재관류 손상은 혈관 투과성 및 부종을 특징으로 한다. 조직 관류에서의 결핍은 지속적인 허혈후 혈관기인성 부종에 이르고, 이는 증가된 혈관 투과성의 결과로서 발달된다. 조직 관류는 동맥의 개방성 및 동맥에서의 혈액 흐름으로 인해 소정의 조직에 도달하는 산소화 혈액의 척도이다. 조직 혈관화가 폐쇄로 인해 파괴될 수 있거나, 별법으로, 영향을 받은 부위 상류의 혈관 누출 또는 출혈로부터 초래된 혈류 손실로부터 초래될 수 있다. 급성 심근경색증, 뇌졸중, 수술적 혈관재형성 절차, 및 조직 혈관화가 파괴된 기타 상태 동안의 조직 관류에서의 결핍은 환자 상태의 결과에서 결정적인 요인이다. 부종은 혈관 허탈 및 손상된 전기 기능을 포함하는 다양한 유형의 손상을 야기할 수 있다 (특히 심장에서). 그러나, 이어지는 재관류 또한 일부 환자에서 유사한 손상을 야기하여, 치료 패러독스에 이를 수 있다. 폐색 혈관의 차단을 제거하거나 손상 혈관을 복구 또는 교체하는 것이 필요하지만, 이어지는 재관류는, 일부 경우에, 추가적인 손상에 이를 수 있다. 유사하게, 우회 수술 동안, 심장 박동을 정지시키고, 환자를 심장 펌프에 연결하는 것이 필요하다. 예를 들어, 우회 수술이 진행되는 일부 환자는 수술 동안 심장 기능이 정지되는 동안의 허혈의 결과일 수 있는 상태 악화 ("펌프후 증후군")를 실제로 경험할 수 있다. 동맥 차단이 혈류에서의 감소를 야기할 수 있지만, 차단이 제거되고 동맥이 개방된 후에도, 조직 재관류가 일어나지 못하면, 추가적인 조직 손상이 초래될 수 있다. 예를 들어, 혈병의 파괴가 관류 획득보다는 조직 관류의 손실에 이르는 연쇄 사건을 촉발할 수 있다.
바람직하지 않은 혈관 투과성을 특징으로 하는 추가적인 질환 및 장애에는, 예를 들어, 사이토카인 폭풍을 초래할 수 있는 감염성 및 비-감염성 질환이 포함된다. 사이토카인 폭풍은, 예를 들어 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 성인성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 패혈증, 조류 인플루엔자, 천연두 및 전신성 염증 응답 증후군 (SIRS)을 비롯한 다수의 감염성 및 비-감염성 질환에 의해 촉진될 수 있다.
병적 혈관형성
혈관형성 및 혈관형성 관련 질환은 세포 증식에 밀접하게 영향을 받는다. 본원에서 사용된 용어 "혈관형성"은 조직 또는 장기 내로의 새로운 혈관의 생성을 의미한다. 정상적인 생리학적 조건 하에, 매우 특이적인 제한된 상황에서만 인간 또는 동물이 혈관형성을 겪는다. 예를 들어, 상처 치유, 태아 및 배아 발달, 및 황체, 자궁내막 및 태반의 형성에서 혈관형성이 정상적으로 관찰된다. 용어 "내피"는 장막강, 림프관 및 혈관의 내면을 이루는 편평한 세포들의 얇은 층으로 본원에서 정의된다. 이러한 세포들은 본원에서 "내피 세포"로 정의된다. 용어 "내피 억제 활성"은 일반적으로 혈관형성을 억제하는 분자의 능력을 의미한다. 내피 세포 증식의 억제 또한 혈관형성의 억제를 초래한다.
제어형 및 비-제어형 혈관형성 양쪽 모두 유사한 방식으로 진행되는 것으로 생각된다. 기저막으로 둘러싸인 내피 세포 및 혈관주위세포가 모세 혈관을 형성한다. 혈관형성은 내피 세포 및 백혈구에 의해 방출되는 효소에 의한 기저막의 침식으로 시작된다. 그후, 혈관의 내강의 내면을 이루는 내피 세포가 기저막을 튀어나온다. 혈관형성성 자극물은 내피 세포가 침식된 기저막을 지나 이동하도록 유도한다. 이동 세포는 어버이 혈관으로부터 벗어나 "발아물"을 형성하고, 여기서 내피 세포가 유사분열을 겪고 증식된다. 모세혈관 루프를 형성하도록 내피 발아물들이 서로 합병되어, 새로운 혈관이 생성된다.
새로운 혈관은 또한 혈관생성에 의해 부분적으로 형성될 수 있다. 혈관생성은 내피 세포의 공급원에 의해 혈관형성과 구별된다. 혈관생성은 혈관모세포로 공지된 내피 전구 세포의 동원을 수반한다. 이러한 혈관모세포는 순환계로부터 또는 조직으로부터 올 수 있다. 혈관생성은 혈관형성과 유사한 신호전달 경로에 의해 조절된다. 따라서, 용어 "혈관형성"은 혈관형성을 조정하는 방법이 혈관생성을 또한 조정할 수 있도록 혈관생성과 상호교환가능하게 본원에서 사용된다.
지속적이거나, 조절곤란하거나, 또는 조절되지 않는 혈관형성을 특징으로 할 수 있는 병적 혈관형성이 내피 세포에 의한 다수의 질환 상태, 종양 전이 및 비정상적인 성장에서 발생하고, 이러한 상태들에서 나타나는 병리학적 손상을 지지한다. 병적 혈관형성이 존재하는 다양한 질환 상태들이 혈관형성-의존적, 혈관형성-연합, 또는 혈관형성-관련 질환으로 함께 분류되었다. 이러한 질환들은 비정상적인 또는 바람직하지 않은 세포 증식, 특히 내피 세포 증식의 결과이다.
비정상적인 또는 바람직하지 않은 내피 세포 증식에 의해 매개되는 질환 및 프로세스에는 혈관종, 고형 종양, 백혈병, 전이, 모세혈관확장 건선 공피증, 화농성 육아종, 심근 혈관형성, 플라크 혈관신생, 관상동맥 측부혈관(coronary collaterals), 허혈성 사지 혈관형성, 각막 질환, 피부홍조, 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증 (DR), 수정체후방 섬유증식증, 비-증식성 당뇨성 황반 부종 (DME), 관절염, 당뇨병성 혈관신생, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 미숙아 망막병증 (ROP), 허혈성 망막 정맥 폐쇄 (IRVO), 상처 치유, 소화성 궤양, 골절, 켈로이드, 혈관생성, 조혈, 배란, 월경 및 태반형성이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
ROBO4 신호전달 경로
Robo 부류의 단백질은, Slit 단백질과 상호작용하여 신경계에서 액손의 경로탐색(pathfinding)을 인도하는 것으로 공지된 막횡단 단백질의 부류이다. Robo는 척추동물에서 확인되었으며, Robo 1-3이 신경계에서 우세하게 발현된다 ([Marillat et al., 2002]). 반면에, 매직 라운드어바웃(Magic Roundabout)으로도 공지된 Robo4는 척추동물에서 배타적으로 또는 우세하게 발현된다 (예를 들어, 문헌 [Park et al., 2003]; [Huminiecki et al., 2002]; 및 [Huminiecki et al., 2002]; [Seth et al., 2005] 참조). Robo4는 이의 일탈성 서열에 의해 Robo 1-3과 추가로 구별된다: 뉴런성 Robo의 엑토도메인은 5개의 면역글로불린 (Ig) 도메인 및 3개의 피브로넥틴 제III형 (FNIII) 반복부를 함유하는 반면, Robo4는 2개의 Ig 도메인 및 2개의 FNIII 반복부를 함유한다 ([Huminiecki et al., 2002]; [Park et al., 2003]). 또한, Robo1-3은 4개의 보존된 세포질 (CC) 모티프인 CC0, CC1, CC2 및 CC3을 지니고 ([Kidd et al., 1998]; [Zallen et al., 1998]), 이들 중 CC0 및 CC2만이 Robo4 내에 존재한다 ([Huminiecki et al., 2002]; [Park et al., 2003]).
Robo가 Slit-의존적 및 Slit-비의존적 모두의 방식으로 혈관형성을 촉진할 수 있다는 것이 공개된 보고들에서 제안되었다. 예를 들어, Robo1의 Slit2 자극이 시험관 내에서 이동 및 관 형성을 유도하였고, 생체 내에서 종양 혈관형성을 촉진하였음이 보고되었다 ([Feng et al., 2004]). 또한, 2004년에 수행된 연구는 혈관형성 동안의 Robo4에 대한 양성 역할과 일관적으로, 가용성 Robo4 엑토도메인으로 Robo4 활성을 차단하는 것이 시험관 내에서 이동 및 관 형성을 억제하였음을 나타냈다. 또한, 이러한 연구는 Slit 단백질이 Robo4에 결합하지 않는다는 것을 보고함으로써, 수용체에 대한 미지의 리간드를 관련시켰다 ([Suchting et al., 2004]). Robo4의 과발현이 Slit과 독립적으로 내피 세포 부착 및 이동을 증대시킨다는 것을 나타내는 최근의 데이터로부터 Robo4가 전-혈관형성성이라는 개념이 또한 드러났다 ([Kaur et al., 2006]).
Robo4 신호전달이 세포 이동에 관여하는 돌출 사건을 억제하고, 내피 세포-세포 접합을 안정화시키고, 병적 혈관형성을 차단하는 신호전달 경로가 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 신호전달 경로는 도 35에 도시되어 있으며, 예를 들어 세포 운동성, 혈관 투과성 및 혈관형성에 영향을 미치는 방식으로 조절될 수 있는 다중 표적을 제공한다. 본원에서 사용된 "조절"은 표적의 활성을 변화시키는 것을 포함하고, 본원에서 사용된 "조작"은 세포 상태에서의 변화를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이, Robo4의 리간드, 예컨대 본원에 개시된 바와 같은 Slit-2 단백질에 의한 Robo4 신호전달의 개시는 세포 운동성을 음성적으로 조절하고, 혈관 투과성을 억제한다. 특히, Slit2가 Robo4의 활성화를 통해 내피에서 반발성 신호물을 도출하며, 이같은 활성을 담당하는 신규 신호 변환 케스케이드가 정의된다. 본원에 기술된 바와 같이, Robo4의 Slit2 활성화는 무엇보다도 Rac 활성화를 억제하고, 따라서 Rac에 의해 개시되거나 매개되는 세포 이동 및 세포 확산을 억제한다.
본원에서 제공된 교시내용에서, Robo4와 어댑터 단백질 팍실린 간의 Slit2-의존적 회합이 확립되었고, 이때 본원에서 상술된 실험 데이터는 이러한 상호작용이 세포 이동, 확산 및 Rac 활성화의 Robo4-의존적 억제를 조장한다는 생화학적 및 세포 생물학적 증거를 제공한다. 특히, Robo4 활성화는 GIT1의 팍실린 활성화, 및 ARF6의 GIT1 억제를 개시한다. Robo4 활성화는 내피 장벽 기능을 유지시키고, VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달을 차단하며, 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제한다. Robo4 활성화는 VEGF 신호전달을 차단할 뿐만 아니라, 또한 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자 (트롬빈 및 bFGF 포함)로부터의 신호전달을 억제한다.
본원에 추가로 개시된 바와 같이, ARF-GAP 활성의 조절은 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하기 위해 표적화될 수 있다. 특히, ARF-GAP의 활성화는 ARF6의 활성화를 억제할 수 있으며, ARF6 활성의 억제는 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및 병적 혈관형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본원에서 제공되는 실시예는 ARF-GAP의 불활성화, 예컨대 ARF-GAP GIT1이 내피 원형 상의 Robo4 신호전달의 안정화 효과를 역행시킬 수 있음을 예시한다. ARF-GAP GIT1의 활성화는 ARF6의 활성화를 억제함으로써, VEGF-유도 내피 세포 반응의 억제를 초래한다. 따라서, ARF6 활성의 직접 또는 간접 조절은 혈관 투과성 및 혈관형성을 제어하기 위한 표적을 나타내는 것이다.
ARF-GAP 외에, 1종 이상의 ARF-GEF, 예컨대 1종 이상의 사이토헤신(cytohesin) (사이토헤신의 ARNO 부류 포함)의 조절은 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하기 위해 표적화될 수 있다. 특정 이론에 구애됨 없이, Slit2-Robo4 신호전달의 효과는 1종 이상의 ARF의 GTP 로딩(loading)을 억제 또는 방지하는 것으로 생각된다. 특히, 특정 이론에 구애됨 없이, Slit2-Robo4 신호전달의 효과는 ARF6 및/또는 ARF1의 GTP 로딩을 억제 또는 방지하는 것으로 여겨진다. 본원에 개시된 것을 비롯하여 ARF-GEF는 ARF6의 GTP 로딩을 조장하며, ARF-GEF 활성의 억제는 ARF 활성화 또는 활성을 억제한다. 본원에 기재된 바와 같이, ARF-GEF의 억제제, 예컨대 사이토헤신 (ARNO 및 사이토헤신의 ARNO 부류 포함), ARNO의 억제제는 ARF 활성의 억제 뿐만 아니라 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성의 억제를 초래한다.
조성물
혈관 투과성 및 병적 혈관형성을 억제하기 위한 조성물이 본원에서 제공된다.
ARF의 활성을 조절하기 위한 조성물이 본원에서 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 ARF6 및 ARF1 중 하나 또는 둘 모두로부터 선택된 ARF의 활성 또는 활성화를 직접 또는 간접적으로 억제한다. 이러한 한 실시양태에서, 조성물에는 AFR6 및 ARF1 중 하나 또는 둘 모두로부터 선택된 ARF를 직접 억제하는 1종 이상의 활성제가 포함된다. 이러한 실시양태에서, 1종 이상의 활성제에는 ARF6 및/또는 ARF1의 하나 이상의 리간드가 포함될 수 있다. 이러한 다른 실시양태에서, 1종 이상의 활성제는, ARF6 및/또는 ARF1의 활성 또는 활성화를 직접 억제하는 1종 이상의 소형 분자, 단백질, 펩티드 또는 핵산으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 조성물에는 AFR6 및 ARF1 중 하나 또는 둘 모두로부터 선택된 ARF를 간접적으로 억제하는 1종 이상의 활성제가 포함된다. 이러한 실시양태에서, 1종 이상의 활성제에는 ARF6 또는 ARF1 활성 또는 활성화의 상류 조절자가 포함될 수 있으며, 여기서 상기 상류 조절자는 ARF6 또는 ARF1 활성의 상류 조절자, 예를 들어 Robo4 수용체, ARF-GAP, 예컨대 GIT1 또는 ARF-GEF, 예컨대 ARNO 또는 다른 사이토헤신의 활성 또는 활성화를 직접 억제하는 1종 이상의 소형 분자, 단백질, 펩티드 또는 핵산으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물에는, Rac의 ARF6 활성화를 억제하는 1종 이상의 활성제가 포함된다. 이러한 한 실시양태에서, 1종 이상의 활성제는, VEGF에 의한 Rac 활성화를 억제하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 ARF6 상에서 또는 그를 통해 직접 또는 간접적으로 작용하는 1종 이상의 소형 분자, 단백질, 펩티드 또는 핵산으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 1종 이상의 ARF의 활성을 조절하기 위한 조성물에는 ARF6 활성 또는 활성화를 위해 필요한 액세서리 단백질의 활성화, 활성 또는 이용가능성을 조절함으로써 ARF6 활성 또는 활성화를 간접적으로 억제하는 활성제가 포함될 수 있다. 이러한 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물에는, 1종 이상의 ARF-GEF, 예를 들어 사이토헤신 또는 사이토헤신의 ARNO 부류의 구성원을 직접 또는 간접적으로 억제하여, 1종 이상의 ARF 부류 단백질, 예컨대 ARF6 및/또는 ARF1의 활성 또는 활성화가 감소되게 하는 1종 이상의 활성제가 포함될 수 있다. 이러한 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물에는, ARNO에 결합하고, 개별 ARNO 단백질의 활성을 감소시켜 GTP-결합 상태에 있는 ARF6 및/또는 ARF1 단백질이 적어지게 함으로써 활성 ARF6 단백질의 풀(pool)을 감소시키는 1종 이상의 활성제가 포함될 수 있다. 1종 이상의 ARF-GEF를 직접 또는 간접적으로 억제하는 1종 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 한 실시양태에서, 1종 이상의 활성제는 표적화 ARF-GEF의 리간드일 수 있다. 1종 이상의 ARF-GEF를 직접 또는 간접적으로 억제하는 1종 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 다른 실시양태에서, 1종 이상의 활성제는, 표적화 ARF-GEF의 활성, 활성화 또는 이용가능성을 직접 억제하는 1종 이상의 소형 분자, 단백질, 펩티드 또는 핵산으로부터 선택될 수 있다. 1종 이상의 ARF-GEF를 직접 또는 간접적으로 억제하는 1종 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 다른 실시양태에서, 1종 이상의 활성제는 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 임의의 메커니즘을 조작하는 임의의 작용제일 수 있다.
다른 실시양태에서, 1종 이상의 ARF의 활성을 조절하기 위한 조성물에는, 1종 이상의 ARF-GAP의 활성, 활성화 또는 이용가능성을 증가시켜 1종 이상의 ARF 단백질, 예컨대 ARF6 및/또는 ARF1의 활성 또는 활성화를 감소시키는 1종 이상의 활성제가 포함될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조성물에는, GIT1의 활성, 활성화 또는 이용가능성을 직접 또는 간접적으로 증가시켜 더 적은 수의 ARF 단백질, 예를 들어 ARF6 및/또는 ARF1이 활성화되게 함으로써 ARF6을 통해 작용하거나 그에 의해 전달되는 신호 캐스케이드를 감소시키는 1종 이상의 활성제가 포함될 수 있다. 이러한 한 실시양태에서, 1종 이상의 활성제에는 GIT1에 직접 결합하고 GIT1의 활성화 또는 활성을 증가시켜 1종 이상의 ARF 단백질, 예컨대 ARF6 및/또는 ARF1의 활성 또는 활성화를 감소시키는 GIT1의 리간드가 포함될 수 있다. 조성물이 1종 이상의 ARF-GAP의 활성, 활성화 또는 이용가능성을 직접 증가시키는 1종 이상의 활성제를 포함하는 경우, 1종 이상의 활성제는 표적화 ARF-GAP의 활성, 활성화 또는 이용가능성을 직접 또는 간접적으로 증가시키는 1종 이상의 소형 분자, 단백질, 펩티드 또는 핵산을 포함할 수 있다. 별법으로, 1종 이상의 ARF-GAP의 활성, 활성화 또는 이용가능성을 증가시키는 1종 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 다른 실시양태에서, 1종 이상의 활성제는 1종 이상의 ARF-GAP의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 촉진시키는 임의의 메커니즘을 조작하는 임의의 작용제일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 Robo4 수용체의 리간드를 포함한다. 이같은 한 실시양태에서, Robo4의 리간드는 Robo4를 통해 세포 이동성을 음성적으로 조절하는 작용을 할 수 있는 임의의 조성물 또는 분자일 수 있다. 또다른 이같은 실시양태에서, Robo4의 리간드는 Robo4를 통해 혈관 투과성을 억제하는 작용을 할 수 있는 임의의 조성물 또는 분자일 수 있다. 또다른 이같은 실시양태에서, Robo4의 리간드는 Robo4를 통해 VEGF에 의한 Rac 활성화를 억제하는 작용을 할 수 있는 임의의 조성물 또는 분자일 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물은 Robo4를 통해 GIT1의 팍실린 활성화를 개시하는 작용을 할 수 있는, Robo4 수용체의 리간드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물은 Robo4를 통해 ARF6의 Git1 억제를 활성화하는 작용을 할 수 있는, Robo4 수용체의 리간드를 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물은 Robo4를 통해 내피 장벽 기능의 보존, VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단, 혈관 누출의 억제, 병적 혈관형성의 억제, 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 작용할 수 있는, Robo4 수용체의 리간드를 포함한다.
본 발명의 조성물이 Robo4의 리간드를 포함하는 경우, 리간드는 Robo4의 세포외 도메인에 결합하는 임의의 조성물 또는 분자일 수 있다. 별법으로, Robo4의 리간드는 Robo4 수용체를 통해 VEGF에 의한 Rac 활성화를 억제하는 작용을 하는 임의의 조성물 또는 분자일 수 있다. 또한, Robo4의 리간드는 Robo4 수용체를 통해 ARF6의 Git1 억제를 활성화시키는 작용을 하는 임의의 조성물 또는 분자일 수 있다. 또한, Robo4의 리간드는 Robo4 수용체를 통해 Git1의 팍실린 활성화를 활성화시키는 작용을 하는 임의의 조성물 또는 분자일 수 있다. 또다른 측면에서, Robo4의 리간드는 Robo4 수용체를 모방하여 Git1의 팍실린 활성화를 활성화시키는 임의의 조성물 또는 분자일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 따른 조성물에 포함된 Robo4의 리간드는 아미노산 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400개 길이의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 조성물이 Robo4의 리간드를 포함하는 경우, 이같은 리간드는 Slit 리간드, 예컨대 Slit2 리간드, 또는 Robo4에 결합하여 활성화시키는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 특정 실시양태에서, Slit 리간드, 또는 이의 단편 또는 변이체는 Rac의 억제; ARF6의 억제; 내피 장벽 기능의 보존; VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단; 혈관 누출의 억제; 병적 혈관형성의 억제; 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 Robo4에 결합하여 이를 활성화시킨다. 예를 들어, Robo4의 리간드는 Slit1 (서열 1), Slit2 (서열 2), Slit3 (서열 3), Slit1의 단편, 예컨대 서열 4로 나타내는 단편, Slit2의 단편, 예컨대 서열 5로 나타내는 단편, 및 Slit3의 단편, 예컨대 서열 6으로 나타내는 단편으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, Robo4의 리간드는 서열 7 내지 서열 15로 나타내는 Slit2 리간드로부터 선택될 수 있다. 특히, 본원에 따른 Robo4 리간드는 Slit2N (서열 7), 서열 8로 나타내는 Slit2, Slit2ΔP (서열 9), Slit2 D1 (서열 10), Slit2 D1-D2 (서열 11), Slit2 D1-D3 (서열 12), Slit2 D1-D4 (서열 13), Slit2 D1-E5 (서열 14), 및 Slit2 D1-E6 (서열 15), 또는 Robo4에 결합하는 이들의 단편으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 서열의 단편의 길이는 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산일 수 있다. Robo4의 리간드는, 서열 1, 서열 2, 서열 3으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 서열 4 내지 서열 15 중 임의의 서열, 또는 Rac의 억제; ARF6의 억제; 내피 장벽 기능의 유지; VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단; 혈관 누출의 억제; 병적 혈관형성의 억제; 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 Robo4 수용체와 상호작용하는 이들의 단편으로부터 선택된 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 약 70％, 적어도 약 75％, 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 100％인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 Robo4 리간드로서 적합한 Slit 단편은 Slit의 N-말단 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, Robo4의 리간드는, Slit1의 아미노산 1-1132 (서열 4), Slit2의 아미노산 1-1119 (서열 5), Slit3의 아미노산 1-1118 (서열 6), 또는 도 23에 도시되어 있고 상세히는 서열 7 내지 서열 15인 n-말단 단편 중 어느 것을 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, Robo4의 리간드는 필수적으로 서열 4 내지 서열 15 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열으로 이루어진 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 7 내지 서열 15의 아미노산 서열에서 반영된 바와 같이, 본 발명의 조성물에 포함된 Slit 단편은 N-말단 아미노산 대부분을 포함하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아미노산 서열 중 천연 Slit의 N-말단 아미노산 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개가 존재하지 않을 수 있다. 다른 실시양태에서, Slit 단편은 천연 Slit의 C-말단 아미노산 대부분, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산을 포함하지 않을 수 있다.
예를 들어, 구체적인 실시양태에서, Robo4의 리간드는 필수적으로 Slit1의 아미노산 281-511 (서열 16) 또는 Slit2의 아미노산 271-504 (서열 17)로 이루어진 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, Robo4의 리간드는 서열 15 또는 서열 16, 또는 Robo4에 결합하는 이들의 단편을 포함할 수 있다. Robo4의 리간드는, 서열 16 또는 서열 17, 또는 Rac의 억제; ARF6의 억제; 내피 장벽 기능의 유지; VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단; 혈관 누출의 억제; 병적 혈관형성의 억제; 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 Robo4 수용체와 상호작용하는 이들의 단편에 대한 서열 동일성이 적어도 약 70％, 적어도 약 75％, 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 100％인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 따른 1종 이상의 ARF의 활성을 조절하기 위한 조성물은, 1종 이상의 ARF의 상류 활성화제의 활성을 조절할 수 있는 소형 분자 활성제를 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 소형 분자 활성제는 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 ARF-GAP의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 촉진한다. 이러한 다른 실시양태에서, 소형 분자 활성제는 본원에 기재된 바와 같은 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제한다. 이러한 다른 실시양태에서, 소형 분자 활성제는, Rac의 억제; ARF6의 억제; 내피 장벽 기능의 유지; VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단; 혈관 누출의 억제; 병적 혈관형성의 억제; 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 사이토헤신의 활성을 억제한다.
또다른 이러한 실시양태에서, 소형 분자 활성제는, Rac의 억제; ARF6의 억제; 내피 장벽 기능의 유지; VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단; 혈관 누출의 억제; 병적 혈관형성의 억제; 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 사이토헤신의 ARNO 부류로부터 선택된 사이토헤신의 활성을 억제한다. 다른 실시양태에서, 소형 분자 활성제는, Rac의 억제; ARF6의 억제; 내피 장벽 기능의 유지; VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단; 혈관 누출의 억제; 병적 혈관형성의 억제; 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 ARNO의 활성을 억제한다. 소형 분자 활성제를 포함하는 각각의 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 활성제는 조성물에 포함될 수 있음을 이해해야 한다.
특정 실시양태에서, 혈관 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 조성물은 SecinH3 (도 29에 그 구조가 제시됨)를 포함한다. SecinH3은 사이토헤신의 공지된 억제제이다 (예를 들어, 문헌 [Hafner et al., Inhibition of cytohesins by SecinH3 leads to hepatic insulin resistance, Nature (2006), 444, 941-944] 및 [International Patent App. Publication No. WO 2006/053903] 참조). 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 본원의 내용상 Secin-H3는 ARF6 활성화, VEGF 유도 ARF6- GTP, VEGF 유도된 내피 세포 이동, 산소-유도 망막병증 및 맥락막 혈관신생 모델에서의 신생혈관 다발 형성, 및 VEGF로 인한 망막 과투과성을 억제한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은, Rac의 억제; ARF6의 억제; 내피 장벽 기능의 유지; VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단; 혈관 누출의 억제; 병적 혈관형성의 억제; 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 사이토헤신의 활성, 예를 들어 ARNO의 활성을 억제하는 SecinH3를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은, Rac의 억제; ARF6의 억제; 내피 장벽 기능의 유지; VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단; 혈관 누출의 억제; 병적 혈관형성의 억제; 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로, ARF-GEF, 예컨대 사이토헤신, 사이토헤신의 ARNO 부류로부터 선택된 사이토헤신, 또는 ARNO의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 화합물로부터 선택된 1종 이상의 소형 분자 활성제를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 하기 화학식 (화학식 1)을 갖는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물을 포함할 수 있다.
Figure 112009081744748-PCT00002
상기 식에서,
R1 및 R3은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 시클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클로부터 독립적으로 선택되고;
R2는 수소, 저급 알콕시, 저급 알킬, 할로겐 또는 히드록시로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH, 알킬렌 또는 단일 결합으로부터 선택된다.
이러한 한 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은, R3이 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 헤테로원자 저급 알킬, 히드록시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환기에 의해 치환되고, 여기서 2개의 치환기가 함께 융합 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있는 것인 화학식 1에 의해 기재된 바와 같은 화합물로부터 선택된다. 이러한 다른 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은, R1이 비치환된 아릴 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; R2가 수소, 저급 알콕시 또는 저급 알킬로부터 선택되고; R3이 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환기에 의해 임의로 치환된 아릴이고, 여기서 2개의 치환기가 함께 융합 시클로알킬 또는 헤 테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있고; Z가 O, S 또는 단일 결합으로부터 선택되는 것인 화학식 1에 의해 기재된 바와 같은 화합물로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은, Rac의 억제; ARF6의 억제; 내피 장벽 기능의 유지; VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단; 혈관 누출의 억제; 병적 혈관형성의 억제; 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로, ARF-GEF, 예컨대 사이토헤신, 사이토헤신의 ARNO 부류로부터 선택된 사이토헤신, 또는 ARNO의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 화합물로부터 선택된 1종 이상의 소형 분자 활성제를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 하기 화학식 (화학식 2)을 갖는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물을 포함할 수 있다.
Figure 112009081744748-PCT00003
상기 식에서,
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 시클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
R2는 수소, 저급 알콕시, 저급 알킬, 할로겐 또는 히드록시로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH, 알킬렌 또는 단일 결합으로부터 선택되고;
X는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 헤테로원자 저급 알킬, 히드록시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 2개의 치환기는 함께 융합 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있고;
m은 0 내지 5이다.
이러한 한 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은 하기 화합물, 또는 이들의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물로부터 선택된다.
Figure 112009081744748-PCT00004
,
Figure 112009081744748-PCT00005
,
Figure 112009081744748-PCT00006
다른 실시양태에서, 본원에 따른 조성물은, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 분자의 활성을 직접 또는 간접적으로 조절하는 핵산을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 포함될 수 있는 핵산은, 예를 들어 앱타머(aptamer), 안티센스(antisense) 분자, siRNA, 리보자임 및 삼중 나선 분자로부터 선택될 수 있다. 이러한 분자의 제조 기술 및 용도는 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 본원에 기재되어 있거나, 문헌 [U.S. Patent No. 5,800,998] (본원에 포함됨)에 기재되어 있다.
안티센스 RNA 및 DNA 분자는 표적화 mRNA에 결합하고, 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 DNA와 관련하여, 번역 개시부로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 표적 서열의 -10 내지 +10 영역이 바람직하다. 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는, 1종 이상의 ARF 단백질, ARF6 또는 ARF1, 또는 ARF 단백질, 예컨대 ARF-GEF, 예를 들어 사이토헤신 또는 사이토헤신의 ARNO 부류의 구성원의 상류 활성화제의 번역을 감소시키는 방식으로 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 포함된 핵산은 소형 간섭 RNA (siRNA) 화합물 또는 그의 변형된 등가물이다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 포함된 핵산은 이중-가닥 소형 간섭 RNA (siRNA) 화합물 또는 그의 변형된 등가물이다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 포함된 siRNA는 1종 이상의 ARF 단백질 (ARF6 또는 ARF1 포함), 또는 ARF 단백질, 예컨대 ARF-GEF, 예를 들어 사이토헤신 또는 사이토헤신의 ARNO 부류의 구성원의 상류 활성화제의 수준을 감소시킬 수 있다.
당업계에 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이, siRNA 화합물은, 2개의 상보적 단일-가닥 RNA (19개의 염기쌍을 형성하고 2개의 뉴클레오티드 3' 오버행(overhang)을 포함하는 21개 뉴클레오티드)를 포함하는 RNA 듀플렉스(duplex)이다 (문헌 [Elbashir et al., Nature 411 :494 498 (2001)]; 및 [PCT Publication Nos. WO 00/44895]; [WO 01/36646]; [WO 99/32619]; [WO 00/01846]; [WO 01/29058]; [WO 99/07409]; 및 [WO 00/44914] 참조). 세포에서 siRNA의 뉴클레오티드 서열을 통해 특정 mRNA에 대해 적절하게 표적화되는 경우, siRNA는 RNA 간섭 (RNAi)으로 공지된 프로세스를 통해 유전자 발현을 특이적으로 억제할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zamore ＆ Aronin, Nature Medicine, 9:266 267 (2003)] 참조). siRNA는 특정 mRNA의 세포적 수준을 감소시킬 수 있고, 이러한 mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 수준을 감소시킬 수 있다. siRNA는 파괴를 위해 표적인 mRNA에 상보적인 서열을 이용하며, 이는 서열-특이적이다. 따라서, 이들은 고도로 표적-특이적일 수 있으며, 포유동물에서 동일한 유전자의 서로 다른 대립유전자에 의해 코딩되는 mRNA를 표적화하는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 정확성 때문에, 전통적인 약물과 전형적으로 관련되어 있는 부작용이 감소되거나 제거될 수 있다. 또한, 이들은 상대적으로 안정하므로, 안티센스 또는 리보자임 분자와 유사하게 이들은 또한 변형되어 개선된 약제 특성, 예컨대 증가된 안정성, 전달능력 및 제조의 용이성을 달성할 수도 있다. 또한, siRNA 분자가 천연 세포 경로, 즉 RNA 간섭을 이용하므로, 이들은 표적화 mRNA 분자를 파괴하는데 상당히 효율적이다.
RNAi에 의한 특정 유전자 발현의 생체내 억제가 포유동물을 비롯한 다양한 생물에서 달성되었다. 예를 들어, 문헌 [Song et al., Nature Medicine, 9:347 351 (2003)]은 Fas siRNA 화합물을 자가면역성 간염을 앓는 실험실 마우스에 정맥내 주사함으로써 Fas mRNA 수준 및 마우스 간 세포에서 Fas 단백질의 발현이 특이적으로 감소되었음을 증명한다. 정맥내 주사 후, 유전자 침묵화 효과는 10일 동안 감소되지 않고 지속되었다. 주사된 siRNA는 마우스를 간부전 및 간섬유증으로부터 보호하는데 있어서 효과적이었다 (Song et al., Nature Medicine, 9:347 351 (2003)). 또한, siRNA를 동물에게 전달하는 다른 몇몇 접근방법이 성공적인 것으로 입증되었다 (예를 들어, 문헌 [McCaffery et al., Nature, 418:38 39 (2002)]; [Lewis et al., Nature Genetics, 32:107 108 (2002)]; 및 [Xia et al., Nature Biotech., 20: 1006 1010 (2002)] 참조).
본원에 따라 제공되는 siRNA 화합물은 통상적인 RNA 합성 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 이들은 적절하게 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미다이트 및 통상적인 DNA/RNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. RNA 합성을 위한 여러 적용가능한 방법이, 예를 들어 문헌 [Usman et al., J. Am. Chem. Soc, 109:7845 7854 (1987)] 및 [Scaringe et al., Nucleic Acids Res., 18:5433 5441 (1990)]에 개시되어 있다. 맞춤식 siRNA 합성 서비스는 상업적 공급자, 예컨대 앰비온(Ambion; 미국 텍사스주 오스틴 소재), 다르마콘 리서치(Dharmacon Research; 미국 콜로라도주 라파예트 소재), 피어스 케미컬(Pierce Chemical; 미국 일리노이주 락포트 소재), 켐진(ChemGenes; 미국 매사추세츠주 애 쉬랜드 소재), 프로리고(Proligo; 독일 함부르크 소재) 및 크루아켐(Cruachem; 영국 글라스고우 소재)로부터 이용가능하다.
본원에 기재된 바와 같은 조성물은 제약 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 1종 이상의 소형 분자, 단백질, 펩티드 또는 핵산 외에, 기재된 바와 같은 조성물은 치료적 투여를 위해 적합한 제형을 제공하는 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 것이 아닌 물질, 즉 어떠한 바람직하지 않은 생물학적 효과도 야기하지 않거나 자신이 함유된 제약 조성물의 어떠한 다른 성분과도 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서, 원하는 조성물 (예를 들어, 원하는 리간드, 단백질, 펩티드, 핵산, 소형 분자 치료제 등)과 함께, 대상체에게 투여될 수 있는 물질을 지칭한다. 당업자에게 주지된 바와 같이, 활성 성분의 어떠한 분해도 최소화하도록, 그리고 대상체에서의 어떠한 불리한 부작용도 최소화하도록 담체가 자연스럽게 선택될 수 있다.
본원에 따른 제약 조성물은, 투여를 위해 적합한 어느 것, 예컨대 정제 조성물, 캡슐화를 위한 분말 조성물, 캡슐화 또는 비경구 전달을 위한 용액 조성물, 에멀션 또는 현탁액, 예컨대 혼입물이 마이크로입자, 매트릭스 물질 또는 리포좀 내로 혼입되는 제형으로 제조될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 항체, 수용체 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 유형에 표적화된 성분을 포함할 수 있다. 하기 문헌들은 종양 조직에 대해 특정 단백질을 표적화하는 제형화 기술에 대한 예들이다 ([Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991)]; [Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989)]; [Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988)]; [Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993)]; [Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992)]; [Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992)]; 및 [Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)]). 제약 담체 및 그의 제형이, 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995]에 기재되어 있다. 전형적으로, 적합한 양의 제약상 허용되는 염이 제형에서 사용되어, 제형이 등장성이도록 한다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 식염수, 링거(Ringer) 용액 및 덱스트로스 용액이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이고, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 또한, 담체는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지연 방출 제제를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름, 리포좀 또는 마이크로입자의 형태이다. 예를 들어, 투여 경로 및 투여될 조성물의 농도에 따라, 특정 담체가 더욱 바람직할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 1종 이상의 담체 외에, 증점제, 향미제, 희석제, 완충제, 방부제, 항균제, 항염증제, 마취제, 계면활성제 등을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 (제약 조성물 포함)은 국소 또는 전신 치료를 원하는지 여부, 및 치료되는 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 개시된 조성물이 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 강내, 경피, 경구, 비경구 (예를 들어, 정맥내), 기관내, 안내, 질내, 직장내, 비강내, 국소 등 (국소 비강내 투여 또는 흡입제에 의한 투여 포함)의 방식으로 투여될 수 있다.
사용되는 경우, 조성물의 비경구 투여는 주사에 의한 투여를 일반적으로 특징으로 한다. 주사가능물질은 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체에서의 용해 또는 현탁에 적절한 고체 형태, 또는 에멀션으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 개정된 접근법은 일정한 투여량이 유지되도록 저속 방출 또는 지속 방출 시스템의 사용을 수반한다. 예를 들어, 문헌 [U.S. Patent No. 3,610,795] (본원에 포함됨) 참조.
본원에 개시된 조성물은 혈관 투과성 또는 병적 혈관형성에 대한 위험이 있는 환자 또는 대상체에게 예방적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 조성물의 투여 전에 혈관 투과성 또는 병적 혈관형성에 대한 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계를 방법이 추가로 포함할 수 있다.
필요한 조성물의 정확한 양은 대상체의 종, 연령, 체중 및 일반적인 상태, 치료될 알레르기성 장애의 중증도, 사용된 특정 핵산 또는 벡터, 이의 투여 방식 등에 따라 대상체마다 변할 것이다. 따라서, 모든 조성물에 대한 정확한 양을 특정하는 것은 불가능하다. 예를 들어, 효과적인 투여량 및 조성물의 투여 일정은 실험적으로 결정될 수 있고, 이같은 결정을 내리는 것은 당업계의 기술 내에 속한다. 조성물의 투여를 위한 투여량 범위는 장애의 증상들이 영향을 받는 원하는 효과를 일으키는데 충분히 큰 양이다. 투여량은 불리한 부작용, 예컨대 원치 않는 교차-반응, 아나필락시스성 반응 등을 야기하도록 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 연령, 상태, 성별 및 환자에서의 질환 정도, 투여 경로, 또는 또다른 약물이 요법에 포함되는지 여부에 따라 달라질 것이다. 임의의 금기사항의 경우에, 투여량은 개별 의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 달라질 수 있고, 하루 또는 수일 동안 매일 1회 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 소정의 클래스의 제약 제품에 대한 적합한 투여량에 대해 문헌에서 지침을 확인할 수 있다. 예를 들어, 항체에 대한 적합한 용량을 선별하는 것에서의 지침을 항체의 치료적 사용에 대한 문헌, 예를 들어 [Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 ＆ pp. 303-357]; [Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389]에서 확인할 수 있다.
방법
세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 작용제를 스크리닝하거나 평가하는 방법이 본원에서 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 GIT1의 Robo4-매개된 활성화를 비롯하여 GIT1의 활성화 또는 활성에 영향을 미치는 상기 작용제의 능력을 결정하는 것을 포함한다. 예를 들어, Git1의 Robo4-매개된 활성화는 Robo4를 발현하는 제1 세포를 후보 작용제와 접촉시키는 것, 제1 세포와 본질적으로 동일하지만, Robo4가 실질적으로 결여된 제2 세포를 후보 작용제와 접촉시키는 것, 및 제1 세포 및 제2 세포에서 GIT1 활성화를 분석하는 것 (여기서, 제2 세포와 비교하여 제1 세포에서의 검출가능하게 더 높은 Git1 활성화가 상기 작용제에 의한 Robo4-매개된 Git1 활성화의 지표가 됨)을 포함하는 단계 들에 의해 결정될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, Robo4-매개된 Git1 활성화는 ARF6 불활성화를 초래한다. ARF6은 Rac의 VEGF-매개된 활성화에서 수반되고, Rac은 Pak을 활성화시키며, Pak은 MEK를 활성화시키고, MEK는 ERK를 활성화시키고, ERK는 혈관 투과성을 촉진한다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같이, 활성화 또는 불활성화되는 이러한 신호전달 경로의 성분들 중 임의의 것을 검출함으로써 GIT1 활성화를 분석할 수 있으므로, Robo4-매개된 GIT1 활성화를 ARF6 불활성화, Rac 불활성화, Pak 불활성화, MEK 불활성화, 또는 ERK 불활성화를 검출함으로써 분석할 수 있다. 이러한 신호전달 경로를 모니터링하는 임의의 또다른 공지된 방법 또는 새롭게 발견되는 방법이 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
ARF6, Rac, Pak, MEK 또는 ERK를 억제하는 상기 작용제의 능력을 결정하는 것을 포함하는 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관 형성을 억제하는 작용제를 스크리닝 또는 평가하는 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, ARF6, Rac, Pak, MEK 또는 Erk의 Robo4-매개된 억제가 Robo4를 발현하는 제1 세포를 후보 작용제와 접촉시키는 것, 제1 세포와 본질적으로 동일하지만, Robo4가 실질적으로 결여된 제2 세포를 후보 작용제와 접촉시키는 것, 제1 세포 및 제2 세포에서 ARF6, Rac, Pak, MEK, ERK, 또는 이의 조합물의 억제를 분석하는 것 (여기서, 제2 세포와 비교하여 제1 세포에서의 검출가능하게 더 낮은 ARF6, Rac, Pak, MEK 또는 ERK 활성화가 상기 작용제에 의한 Robo4-매개된 ARF6, Rac, Pak, MEK 또는 ERK 억제의 지표가 됨)을 포함하는 단계들에 의해 결정된다. 별법 으로, Robo4 신호전달의 부재하에 ARF6, Rac, Pak, MEK 또는 ERK를 억제하는 작용제의 능력 또한 결정할 수 있다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은, 제1 세포를 후보 작용제와 접촉시키는 것, 제1 세포와 동일한 제2 세포를 후보 작용제가 결여된 대조군과 접촉시키는 것, 및 제1 세포 및 제2 세포에서 ARF6, Rac, Pak, MEK, ERK, 또는 이의 조합물의 억제를 분석하는 것 (여기서, 제2 세포와 비교하여 제1 세포에서의 검출가능하게 더 낮은 ARF6, Rac, Pak, MEK 또는 ERK 활성화가 상기 작용제에 의한 ARF6, Rac, Pak, MEK 또는 ERK 억제의 지표가 됨)을 포함하는 단계들을 포함한다.
신호전달 단백질, 예컨대 Rac, Pak, MEK, ERK의 활성화를 상기 단백질의 인산화를 검출함으로써 분석할 수 있다. 단백질의 인산화를 검출하기 위한 세포-기반 분석법 및 무세포 분석법들이 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어 항-포스포세린 (케미콘(Chemicon; 등록상표) AB1603) (케미콘 (미국 캘리포니아주 테메쿨라 소제), 항-포스포트레오닌 (케미콘(등록상표) AB1607), 및 항-포스포타이로신 (케미콘(등록상표) AB1599)이 포함되는 항체를 사용하는 것을 포함한다. DDX-3의 인산화 형태에 특이적인 부위-특이적 항체가 또한 생성될 수 있다. 상기 항체를 생성시키고 사용하는 방법이 당업계에 주지되어 있다.
본원에 개시된 분석 방법은 VEGF, TNF, 트롬빈 또는 히스타민의 실질적인 부재 하에 수행될 수 있다. 별법으로, 개시된 분석 방법은 생물학적으로 활성인 양의 VEGF, TNF, 트롬빈 또는 히스타민의 존재 하에 수행될 수 있다.
분자, 예컨대 단백질 또는 펩티드 분자의 "활성"에는, 예를 들어 전사, 번 역, 세포내 전위, 분비, 키나제에 의한 인산화, 프로테아제에 의한 절단, 또다른 단백질에 대한 동종친화성(homophilic) 및 이종친화성(heterophilic) 결합, 유비퀴틴화가 포함된다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 스크리닝 방법은 스크리닝 분석법, 예컨대 고처리량 스크리닝 분석법이다. 따라서, 접촉 단계는 세포 기반 분석법 또는 무세포 분석법에서의 단계일 수 있다. 예를 들어, 혈관 내피 세포가 생체내에서, 생체외에서, 또는 시험관내에서 후보 작용제와 접촉될 수 있다. 세포는 단층 배양물 상에 있을 수 있지만, 바람직하게는 상피를 구성한다. 세포가 시험관내에서 또는 원위치에서 분석될 수 있거나, 또는 상기 세포의 단백질 추출물이 활성화된 (예를 들어, 인산화된) Rac, Pak, MEK, ERX의 검출을 위해 시험관내에서 분석될 수 있다. 리포터 구축물을 발현하도록 내피 세포가 또한 조작될 수 있고, 이때 세포가 후보 작용제와 접촉되어 리포터 발현에 대해 평가된다. 또다른 이같은 세포-기반 분석법 및 무세포 분석법이 본원에서의 사용에 대해 구현된다.
특정 실시양태에서, 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 작용제를 확인하는 방법에는, 예를 들어 문헌 [Hafner et al. (Displacement of protein-bound aptamers with small molecules screened by fluorescence polarization, Nat Protoc (2008), 3, 579-587)]에 기재된 바와 같은 앱타머-치환 스크린 분석이 포함된다. 특히, 이러한 방법을 사용하여, 표적화 ARF-GEF, 예컨대 사이토헤신, 사이토헤신의 ARNO 부류에 속하는 사이토헤신 또는 ARNO의 활성을 억제하는 소형 분자 (예컨대, 본원에 기재된 것)의 활성을 식별하고 확인할 수 있다. 이러한 활성을 확인함으로써, 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제할 수 있는 활성제를 확인할 수 있다. 이러한 앱타머-치환 스크린 분석은, 형광-표지된 앱타머 단백질 억제제와 유사한 활성을 갖는 소형 분자를 식별하기 위해, 형광-표지된 앱타머 단백질 억제제를 이용한다. 앱타머와 그의 표적과의 결합은 형광 극성에 의해 측정한다. 형광-표지된 앱타머는 비-결합된 상태에서 낮은 극성을 나타낸다. 표적 단백질에 결합한 경우, 형광-표지된 앱타머의 형광 극성은 증가된다. 소형 분자가 단백질로부터 앱타머를 나타내는 경우, 형광-표지된 앱타머 형광 극성은 감소하며, 이로 인해 형광 표지된 앱타머와 유사한 활성을 나타내는 소형 분자 후보의 식별이 가능하다.
일반적으로, 당업계에 공지된 방법에 따라 천연 생성물 또는 합성 (또는 반-합성) 추출물의 라이브러리 또는 화학적 라이브러리로부터 후보 작용제가 확인될 수 있다. 약물 발견 및 개발 분야의 당업자는 테스트 추출물 또는 화합물의 정확한 공급원이 본 발명의 스크리닝 절차(들)에 결정적이지 않다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 실제로 임의의 개수의 화학적 추출물 또는 화합물을 본원에 기술된 예시적인 방법을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 이같은 추출물 또는 화합물의 예로는 식물-, 진균류-, 원핵생물- 또는 동물-기반 추출물, 발효 브로스(broth), 및 합성 화합물, 뿐만 아니라 기존 화합물의 변형이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 당류-, 지질-, 펩티드-, 폴리펩티드- 및 핵산-기반 화합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 개수의 화학적 화합물의 무작위 또는 지향성 합성 (예를 들어, 반-합성 또는 전체 합성)을 일으키는데 수많은 방법이 또한 이용가능하다. 예를 들어, 브랜든 어소시에이트(Brandon Associates; 미국 뉴햄프셔주 메리맥 소재) 및 알드리치 케미컬(Aldrich Chemical; 미국 와이오밍주 밀워키 소재)로부터 합성 화합물 라이브러리가 시판된다. 별법으로, 박테리아, 진균류, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 바이오틱스(Biotics; 영국 서섹스 소재), 제노바 (Xenova; 영국 슬라우 소재), 하버 브랜치 오션그래픽스 인스티튜트(Harbor Branch Oceangraphics Institute; 미국 플로리다주 포트 피어스 소재), 및 파마마르, 유.에스.에이.(PharmaMar, U.S.A.; 미국 메사추세츠주 캠브리지 소재)가 포함되는 다수의 공급원으로부터 시판된다. 게다가, 원한다면, 당업계에 공지된 방법에 따라, 예를 들어 표준 추출 및 분획화 방법에 의해, 천연 라이브러리 및 합성-생산 라이브러리가 생산된다. 또한, 원한다면, 표준 화학적, 물리적 또는 생화학적 방법을 사용하여 임의의 라이브러리 또는 화합물이 쉽게 변형된다. 게다가, 약물 발견 및 개발 업계의 당업자는 디리플리케이션(dereplication) (예를 들어, 분류학적 디리플리케이션, 생물학적 디리플리케이션, 및 화학적 디리플리케이션, 또는 이의 임의의 조합) 또는 효과가 이미 알려진 물질들의 복제물 또는 반복물의 제거를 위한 방법이 가능할 때마다 사용되어야 한다는 것을 쉽게 이해한다.
조질의 추출물에 원하는 활성이 있는 것으로 발견되는 경우, 양성 선도 추출물의 추가적인 분획화가 관찰된 효과를 담당하는 화학적 구성성분을 단리하기 위해 필요하다. 따라서, 추출, 분획화 및 정제 프로세스의 목표는 혈관 투과성을 자극하거나 억제하는 활성이 있는 조질의 추출물 내의 화학적 실체의 신중한 특성화 및 확인이다. 화합물들의 혼합물에서의 활성의 검출을 위한 본원에 기술된 동일한 분 석법을 활성 성분을 정제하고 이의 유도체를 테스트하는데 사용할 수 있다. 이같은 이종성 추출물들의 분획화 및 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다. 원한다면, 치료를 위한 유용한 작용제인 것으로 나타난 화합물들이 당업계에 공지된 방법에 따라 화학적으로 변형된다. 이어서, 치료적으로 가치가 있는 것으로 확인된 화합물들을 혈관 투과성을 조절하는 것이 바람직한 질환 또는 상태에 대해 동물 모델을 사용하여 분석할 수 있다.
대상체의 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 방법 또한 본원에서 제공된다. 본원에서 상술된 바와 같이, Robo4의 활성화는 ARF6의 활성화를 억제하거나 감소시키며, 이로써 혈관 투과성을 억제한다. 본원에 기재된 바와 같이, Robo4 신호전달의 활성화는 GIT1의 팍실린 활성화의 개시를 통해 이같은 효과들을 달성하고, 이는 또한 ARF6의 GIT1 억제에 이른다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료상 유효량의 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 방법은 Rac의 억제, VEGF에 의한 Rac 활성화의 억제, 내피 세포 장벽 기능 유지, VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 억제, 혈관 누출의 억제, 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 억제 중 하나 이상으로부터 선택된 효과를 달성하기 위해 본원에 따른 치료상 유효량의 Robo4 리간드를 투여하는 것을 포함한다.
그러나, 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, Robo4 신호전달로 인한 혈관 투 과성 또는 병적 혈관형성의 억제는 Robo4의 활성화 없이도 달성될 수 있으며, 특히 본원에 기재된 Robo4 신호전달 경로 중 하나 이상의 하류 단계를 조절함으로써 또한 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제할 수 있다. 이러한 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법은 Rac의 억제, VEGF에 의한 Rac 활성화의 억제, 내피 세포 장벽 기능 유지, VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 억제, 혈관 누출의 억제, 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 억제 중 하나 이상으로부터 선택된 효과를 달성하기 위해 Robo4 신호전달 경로의 단계들 중 하나 이상을 조절하는 것을 포함한다.
이러한 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법은 ARF6의 활성화를 직접 또는 간접적으로 억제하는 것을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 방법에는 ARF6의 상류 활성화제를 억제하는 것이 포함된다. 이러한 한 실시양태에서, 방법에는 1종 이상의 ARF-GEF 또는 다른 사이토헤신 부류 GEF의 활성을 억제하여 ARF 부류의 단백질 중 1종 이상의 단백질의 활성을 감소시키는 것이 포함된다. 예를 들어, 방법에는, 사이토헤신, 예컨대 ARNO 또는 사이토헤신의 ARNO 부류에 속하는 사이토헤신의 활성, 활성화 또는 이용가능성을 감소시켜 GTP-결합 상태에 있는 ARF6 단백질이 더 적어지게 함으로써 활성 ARF 단백질의 풀을 감소시키는 1종 이상의 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이 포함될 수 있다. 이러한 다른 실시양태에서, 방법은 ARF6의 상류 억제제의 활성을 촉진시키는 것을 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 방법은 1종 이상의 ARF-GAP의 활성을 증가시켜 ARF 부류의 단백 질로부터의 1종 이상의 단백질의 활성 또는 활성화를 감소시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 방법에는 개별 Git1 단백질의 활성 또는 이용가능성을 증가시켜 더 적은 수의 ARF 단백질이 활성화되게 함으로써, ARF 단백질을 통해 작용하거나 그에 의해 전달되는 신호 캐스케이드를 감소시키는 1종 이상의 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이 포함될 수 있다. 이러한 실시양태에서, ARF 부류의 단백질의 활성이 표적화되는 경우, 영향을 받는 ARF 단백질(들)은, 예를 들어 ARF6 및 ARF1로부터 선택될 수 있다.
세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 각각의 방법에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 사용하여 ARF6 활성을 직접 억제하거나, ARF6의 상류 활성화제를 억제하거나, 또는 ARF6의 상류 억제제를 촉진시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 방법에는 본원에 기재된 바와 같은 소형 분자, 단백질, 펩티드 또는 핵산을 투여함으로써 ARF6 활성을 억제하는 것이 포함된다. 다른 실시양태에서, 혈관 투과성 또는 병적 혈관형성을 억제하는 방법에는 ARF-GAP의 활성화제, 예컨대 Git1의 투여에 의해 ARF6 활성을 억제하는 것이 포함된다. 또다른 실시양태에서, 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 방법에는 Rac의 ARF6 활성화 억제제를 투여하는 것이 포함된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 혈관 누출 또는 내피 투과성에 대한 방법에는, 사이토카인 폭풍을 초래할 수 있는 감염성 및 비-감염성 질환, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 성인성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 패혈증, 조류 인플루 엔자, 천연두, 전신성 염증 응답 증후군 (SIRS), 졸중 또는 심근경색증 후의 허혈/재관류 손상, 뇌 종양과 관련된 부종, 악성종양과 관련된 복수, 메이그스 증후군, 폐 염증, 콩팥 증후군, 심낭 삼출 및 흉막 삼출, 염증, 알레르기성 질환, 암, 뇌졸중, 심근경색증, 폐 및 심장 기능부전, 신부전 및 망막병증으로부터 선택된 질환 상태와 관련된 대상체가 경험하는 세포 돌출 활성, 혈관 누출, 내피 투과성 및/또는 병적 혈관형성을 억제하는 것이 포함된다.
추가로, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 병적 혈관형성을 억제하는 방법에는, 혈관종, 고형 종양, 백혈병, 전이, 모세혈관확장 건선 공피증, 화농성 육아종, 심근 혈관형성, 플라크 혈관신생, 관상동맥 측부혈관, 허혈성 사지 혈관형성, 각막 질환, 피부홍조, 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증 (DR), 수정체후방 섬유증식증, 비-증식성 당뇨병성 황반 부종 (DME), 관절염, 당뇨병성 혈관신생, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 미숙아 망막병증 (ROP), 허혈성 망막 정맥 폐쇄 (IRVO), 상처 치유, 소화성 궤양, 골절, 켈로이드, 혈관생성, 조혈, 배란, 월경 및 태반형성으로부터 선택된 질환 상태와 관련된 대상체가 경험하는 병적 혈관형성을 억제하는 것이 포함된다.
또다른 실시양태에서, 조류 인플루엔자에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 조류 인플루엔자를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 성인성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)에 걸렸거나 걸릴 위 험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 성인성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 전신성 염증 응답 증후군 (SIRS)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 전신성 염증 응답 증후군 (SIRS)을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 종양이 형성 또는 증식되었거나 형성 또는 증식될 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 형성 또는 증식을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 호흡 곤란 증후군 (RDS)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 호흡 곤란 증후군 (RDS)을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 허혈성 망막 정맥 폐쇄 (IRVO)에 걸렸거나 걸릴 위험 이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 허혈성 망막 정맥 폐쇄 (IRVO)를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 비-증식성 당뇨성 황반 부종 (DME)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 비-증식성 당뇨성 황반 부종 (DME)을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 미숙아 망막병증 (ROP)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 미숙아 망막병증 (ROP)을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 당뇨병성 망막병증 (DR)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 당뇨병성 망막병증 (DR)을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 습식 황반 변성 (AMD)에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 습식 황반 변성 (AMD)을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 허혈에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 허혈을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 출혈성 졸중에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 출혈성 졸중을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 심근경색증 및 졸중에서 관찰되는 손상과 같은 재관류 손상에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심근경색증 및 졸중에서 관찰되는 손상과 같은 재관류 손상을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 진피 혈관 손상 또는 기형에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체의 피부에 치료상 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 진피 혈관 손상 또는 기형을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, 의학적 진단에 의해 대상체가 확인된다. 예를 들어, 당뇨병성 망막병증 및 황반 변성이 있는 대상체가 눈에서의 과도한 혈관의 시각화에 의해 확인될 수 있다. 울혈성 심부전의 부재 하의 폐 부종에 의해 급성 폐 손상이 진단될 수 있다. 신경학적 제시 및 영상화 (MRI 및 CT)에 의해 허혈성 졸중이 진단될 수 있다. 또다른 공지된 또는 새롭게 발견되는 의학적 결정을 개시된 방법을 사용 하기 위한 대상체를 확인하는데 사용할 수 있다.
또한, 유전학적 형질에 의해 대상체가 확인될 수 있다. 예를 들어, 환자가 연령-관련 황반 변성에 걸리기 쉽게 하는 유전자가 확인되었다 ([Klein RJ, et al, 2005]; [Yang Z, et al. 2006]; [Dewan A, et al. 2006]). 유사하게, 환자가 뇌에서의 혈관 기형에 걸리기 쉽게 하는 유전자 돌연변이가 확인되었다 ([Plummer NW, et al., 2005]). 또다른 공지된 또는 새롭게 발견되는 유전학적 결정을 개시된 방법을 사용하기 위한 대상체를 확인하는데 사용할 수 있다.
하기의 실시예는 설명적인 목적만을 위해 제공되고, 어떠한 방식으로도 본원에 기술된 조성물 및 방법의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 각각의 경우에, 달리 명시되지 않는 한, 표준 재료 및 방법이 제공된 실시예에 기술된 작업들을 수행하는데 사용되었다. 본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 문헌 참고물은 전체적으로 본원에 포함된다.
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 유전학, 면역학, 세포생물학, 세포 배양 및 트랜스제닉(transgenic) 생물학의 통상적인 기술을 사용하고, 이들은 당업계의 기술에 속한다 (예를 들어, 문헌 [Maniatis, T., et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)]; [Sambrook, J., et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)]; [Ausubel, F. M., et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology, (J. Wiley and Sons, NY)]; [Glover, D. (1985) DNA Cloning, I and II (Oxford Press)]; [Anand, R. (1992) Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press)]; [Guthrie, G. and Fink, G. R. (1991) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press)]; [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)]; [Jakoby, W. B. and Pastan, I. H. (eds.) (1979) Cell Culture. Methods in Enzymology, Vol. 58 (Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich (NY)]; [Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames ＆ S. J. Higgins eds. 1984)]; [Transcription And Translation (B. D. Hames ＆ S. J. Higgins eds. 1984)]; [Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)]; [Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)]; [B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; 논문 [Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; [Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)]; [Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.)], [Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)]; [Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]; [Hogan et al. (eds) (1994) Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, 2n Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조). 인간 유전자 지도작성 (인간 염색체 1의 지도작성 포함)을 위한 기술 및 재료의 일반적인 논의가, 예를 들어 [White and Lalouel (1988) Ann. Rev. Genet. 22:259 279]에서 제공된다. 본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 유전학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. (예를 들어, 문헌 [Maniatis et al., 1982]; [Sambrook et al., 1989]; [Ausubel et al., 1992]; [Glover, 1985]; [Anand, 1992]; [Guthrie and Fink, 1991] 참조).
본원의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이같은 개시내용을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않는다. 어떠한 참조물도 종래 기술을 구성하는 것으로 인정되지 않는다. 참조물의 논의는 이의 저자가 주장하는 것을 진술하고, 출원인은 인용된 문서들의 정확성 및 적절성에 이의를 제기할 권리를 갖는다. 다수의 간행물이 본원에서 언급되었지만, 이같은 언급은 임의의 이러한 문서가 당업계의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것이 아님이 명확하게 이해될 것이다.
실시예 1
Robo4 가 생체내에서 혈관 유도에 필요하다: 지난 10년 동안, 지브라피쉬가 혈관 발달의 분석을 위한 흥미로운 모델이 되었고 ([Weinstein, 2002]), 생체내에서 Robo4의 생물학적 중요성을 연구하기 위해 선택되었다. Robo4 유전자 발현을 억제하기 위해, Robo4 프리(pre)-mRNA의 엑손10-인트론10 경계를 표적으로 하는 기존에 기술된 스플라이스-차단 모르폴리노 ([Bedell et al., 2005])를 사용하였다. Robo4 모르폴리노의 효능을 증명하기 위해, RNA를 모르폴리노가 주입되지 않은 배아 및 주입된 배아로부터 단리하고, 표적화된 엑손에 플랭킹된 프라이머로 RT-PCR에 의해 분석하였다 (도 8A). Robo4 모르폴리노의 주입으로 주입되지 않은 대조군과 비교하여 야생형 RNA의 완전한 손실이 초래되었고, 이는 모판트 지브라피쉬가 Robo4에 대해 기능적으로 무효(null)라는 것을 가리킨다 (도 8B).
내피 특이적 fli1 프로모터의 존재 하에 녹색 형광 단백질을 발현하고, 생체 내에서 발달 중인 내피의 상세한 시각화를 허용하는 TG( fli1 : egfp ) y1 지브라피쉬 배아를 사용하여, 혈관 발달에 대한 Robo4의 모르폴리노-매개된 녹다운의 결과를 평가하였다 (도 1A; [Lawson and Weinstein, 2002]). 48 hpf에, Robo4 MO-주사 배아는 주요 축 혈관 (등쪽 대동맥 및 후방 기본 정맥), 뿐만 아니라 등쪽 세로 연결 혈관 및 척삭주위 혈관의 야생형 형성을 나타냈고, 이는 혈관생성 및 혈관형성 각각이 Robo4 수준의 감소에 영향을 받지 않는다는 것을 가리킨다 (도 1B, 우측 패널). 그러나, Robo4 모판트에서 체절간 혈관의 구조에서 두드러진 정도의 이상이 관찰되었다. 야생형 배아에서, 체절간 혈관은 등쪽 대동맥에서 기인하고, 몸분절 경계에 단단하게 덧붙어서 배아의 등쪽 표면을 향해 성장한다. 몸분절들 간의 이러한 정확한 궤도가 체절간 혈관들의 특징적인 역 V자형 형상을 정의한다 (도 1A, 우측 패널). 이러한 정형성 패턴을 채택하기 보다는, Robo4 모판트 배아의 체절간 혈관은 잘못된 방향으로 성장하였다 (도 1B, 우측 패널: 백색 화살표가 비정상적인 혈관을 가리킨다). 48 hpf에, 야생형 배아에서의 5％와 비교하여 Robo MO가 주입 된 배아의 60％가 이러한 결함을 나타냈다. 중요하게, Robo4 모판트를 위상 현미경검사에 의해 대조군 배아와 구별할 수 없었고, 이는 관찰된 혈관 패턴화 결함이 전체적인 형태학적 혼란의 결과가 아니였음을 가리킨다. 종합해서, 이러한 데이터들은 지브라피쉬 혈관 발달 동안의 Robo4에 대한 필요성을 실연하고, 수용체로부터의 기능성 출력이 반발성 유도 신호물을 도출한다는 것을 시사한다.
실시예 2
Robo4 세포질 꼬리가 생체 내에서 혈관 유도에 필요하다: 다음으로, Robo4 모판트에서 관찰된 혈관 결함이 robo4의 재구성에 의해 억제될 수 있는지 여부가 결정되었다. robo4 MO, 및 모르폴리노에 대해 불응성인 야생형 뮤린 Robo4 RNA를 TG(fli1:egfp)y1 배아 내로 주사하고, 혈관 패턴화를 48 hpf에 분석하였다. 모르트 배아의 약 60％에서 Robo4 RNA가 몸통 혈관의 정형성 패턴화를 복원하였고, 이는 유전자 녹다운의 특이성을 증명하였다 (도 1B 및 C, 우측 패널).
혈관 발달을 조절하는 robo4의 능력은 세포질 신호를 전달하는 이의 능력의 결과인 것으로 보인다. 이러한 개념을 실증하기 위해, Robo4 MO, 및 세포질 성분과 상호작용하는 수용체의 부분이 없는 돌연변이체 형태의 뮤린 Robo4 (robo4Δ꼬리)를 공동-주사하고, 혈관 구조를 48 hpf에 평가하였다. 야생형 Robo4 RNA와 다르게, robo4Δ꼬리는 모판트 배아에서의 패턴화 결함을 구조할 수 없었다 (도 1B 및 D, 우측 패널). 이러한 데이터들은 Robo4의 세포질 꼬리 내에 함유된 정보가 지브라피쉬 배아발생 동안의 혈관 유도에 결정적이라는 것을 실연한다. 모두 종합하여, 이러한 생체내 분석들은 Robo4 활성이 척추동물 혈관 발달 동안 체절간 혈관 의 궤도를 정확하게 정의하는데 필요하다는 것을 가리킨다 (도 1E).
실시예 3
Robo4 세포질 꼬리가 접촉주성의 억제에 필요하다: Slit2-Robo4 신호전달은 VEGF의 구배를 향한 초기 내피 세포의 이동, 및 혈청을 향한 Robo4를 이소성으로 발현하는 HEK 293 세포의 이동을 억제한다 ([Park et al., 2003]; [Seth et al., 2005]). 가용성 성장 인자에 더하여, 고정된 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 피브로넥틴이 세포 이동성에서 결정적인 역할을 하고 ([Ridley et al., 2003]), 피브로넥틴의 구배가 접촉주성으로 지칭되는 프로세스에서 이동을 지시할 수 있다. 실제로, 피브로넥틴이 초기 지브라피쉬 배아에서 이동 중인 내피 세포에 인접하여 침착되는 것으로 나타났다 ([Jin et al., 2005]). 생체 내에서 적절한 내피 세포 이동에 Robo4가 필요하다는 관찰 (도 1)은 피브로넥틴-유도 접촉주성을 조절하는 Slit2-Robo4 신호전달의 능력을 가리켰다. HEK 293 세포를 Robo4 또는 Robo4Δ꼬리로 형질감염시키고 (도 2A), 피브로넥틴 및 Slit2 (Slit2N (서열 7))의 혼합물로 코팅된 막 상에서의 접촉주성 이동 분석법에 적용하였다. Slit2는 Robo4를 발현하는 세포의 피브로넥틴-유도 이동을 억제하였지만, Robo4Δ꼬리는 그렇지 않았으며, 이는 Robo4 세포질 꼬리가 수용체의 반발성 활성에 결정적이라는 것을 실연한다 (도 2B).
다음으로, 세포 이동의 억제에 필요한 Robo4 세포질 꼬리의 영역이 정의되었다. HEK 293 세포를 Robo4 결실 구축물 (도 2A)로 형질감염시키고, 접촉주성 이동 분석법에 적용하였다. Robo4-NH2를 발현하는 세포의 피브로넥틴-의존적 이동이 Slit2에 의해 억제되었지만, Robo4-COOH는 그렇지 않았고 (도 2C), 이는 Robo4 세포질 꼬리의 N-말단 절반이 세포 이동성의 조정에 필요충분하다는 것을 실연한다.
Slit2-Robo4 신호전달이 확산을 억제하였는지 평가하기 위해, 본 발명자들은 HEK 293 세포를 Robo4, Robo4 ED-TM 또는 빈 벡터 (pcDNA3)로 형질감염시키고, 피브로넥틴 상에서의 부착 및 확산 분석법에 적용하였다. Robo4를 발현하는 세포는 피브로넥틴 및 Slit2로 코팅된 커버슬립에 정상적으로 부착하였지만 (데이터는 제시되지 않음), Robo4 ED-TM 또는 pcDNA3로 형질감염된 세포보다 현저하게 덜 확산되었으며 (도 36B), 이는 Slit2-Robo4 신호전달이 세포 확산을 제어하는 세포내 경로를 조절한다는 것을 가리킨다.
확산을 억제하기 위해 Robo4 ED-TM을 무력화시키는 것은 Robo4 세포질 도메인이 이러한 활성을 위해 필요함을 나타내었다; 확산 억제를 위해 충분한지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 αIIb 인테그린-Robo4 키메라 단백질을 생성시켰으며, 여기서 Robo4의 세포질 도메인을 인테그린 αIIb 서브유닛의 C-말단 꼬리에 융합시켜 (αIIb-Robo4), 피브리노겐 (αIIbβ3 인테그린에 대한 리간드)에 의한 Robo4 신호전달을 개시하였다. 본 발명자들은 αIIb 및 β3 서브유닛 (αIIb:β3) 또는 αIIb-Robo4 및 β3 서브유닛 (αIIb-Robo4:β3)를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO-K1) 세포를 피브로넥틴 단독 또는 피브로넥틴/피브리노겐의 혼합물 상에 플레이팅하였다. αIIb:β3 발현 세포는 매트릭스 상에서 동일한 정도로 확산되었으나, αIIb-Robo4:β3 발현 세포의 확산은 피브리노겐의 존재하에 현저하게 억제되었다 (도 26C).
다음으로, 본 발명자들은 세포 이동의 억제를 위해 필요한 Robo4 세포질 꼬리의 영역을 정의하였다. HEK 293 세포를 Robo4 결실 구축물로 형질감염시키고 (도 26A), 접촉주성 이동 분석법에 적용하였다. Robo4-NH2를 발현하는 세포의 피브로넥틴-의존적 이동이 Slit2 (Slit2N (서열 7))에 의해 억제되었지만, Robo4-COOH는 그렇지 않았고 (도 2C), 이는 Robo4 세포질 꼬리의 N-말단 절반이 세포 이동성의 조절에 필요충분하다는 것을 실연한다.
실시예 4
팍실린 부류 구성원은 Robo4 -상호작용 단백질이다: 기능적 활성을 부여하는 Robo4 세포질 꼬리의 영역의 확인은 Robo4 신호 변환을 조절할 수 있는 세포질 성분에 대한 조사를 허용하였다. Robo4 꼬리의 N-말단 절반을 미끼로 사용하여, 인간 대동맥 cDNA 라이브러리의 효모 2-하이브리드 스크린을 수행하였고, 팍실린 부류 어댑터 단백질의 구성원인 Hic-5가 잠재적인 Robo4-상호작용 단백질로 확인되었다 (도 8). 이러한 상호작용을 입증하기 위해, Hic-5 플라스미드를 단리하여, Robo4 또는 빈 벡터와 함께 효모 내로 재-형질전환시켰다. Robo4 및 Hic-5를 공동-발현하는 균주만이 영양소 결핍 배지 상에서 성장할 수 있었고, 강한 베타갈락토시다제 활성을 유도할 수 있었다 (도 8B). 이러한 상호작용을 추가로 증명하기 위해, Hic-5 및 Robo4 세포질 꼬리로 공동-형질감염된 포유류 세포를 사용하여 공동-면역침전 실험을 수행하였다. Hic-5가 Robo4 및 Hic-5를 발현하는 HEK 293 세포의 항-Robo4 면역침전물에서 발견되었지만, Hic-5 단독에 대해서는 그렇지 않았다 (도 3A). 총괄적으로, 이러한 데이터들은 Hic-5가 효모 및 포유류 세포 양쪽 모두에서 Robo4 세포질 꼬리와 특이적으로 상호작용한다는 것을 실연한다.
Hic-5 및 이의 파라로그인 팍실린은 세포-유형 특이적 발현을 나타낼 수 있다 ([Turner, 2000]; [Yuminamochi et al., 2003]). 이러한 이유로, 이들 중 어떤 단백질이 접촉주성 이동 분석법에서 사용된 세포주인 HEK 293 세포에서 발현되었는지를 결정하였다. Hic-5 또는 팍실린에 대한 항체를 사용한 CHO-K1, HEK 293 및 NIH3T3 세포로부터의 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅에서 모든 세포주에서 팍실린이 검출된 반면, Hic-5는 CHO-K1 및 NIH3T3 세포에서만 발견되었다 (도 3B). 이는 Hic-5 및 팍실린이 Robo4와 상호작용하여 세포 이동을 조절할 수 있다는 것뿐만 아니라, 팍실린이 아마도 HEK 293 세포에서의 결합 파트너였을 것임을 시사하였다. 이러한 후자의 생각을 염두에 두고, 팍실린 및 Robo4 세포질 꼬리를 발현하는 포유류 세포를 사용하여 공동-면역침전 실험을 수행하였다. Hic-5에서 관찰된 바와 같이, 팍실린이 팍실린 및 Robo4를 발현하는 HEK 293 세포의 항-Robo4 면역침전물에서 확인되었지만, 팍실린 단독에 대해서는 그렇지 않았다 (도 3C).
Slit2가 Robo4의 생리학적 리간드이기 때문에 ([Park et al., 2003]; [Hohenester et al., 2006]), Slit2 자극이 Robo4와 팍실린 간의 상호작용을 조절하였는지 여부를 결정하였다. Robo4를 발현하는 HEK 293 세포를 Slit2 (Slit2N (서열 7))의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션하였다. Slit2의 존재 하에, 내생적 팍실린이 Robo4 면역침전물에서 검출되었다. 뚜렷하게 대조적으로, Slit2의 부재 하에, 팍실린이 면역침전물에서 검출되지 않았다 (도 3E). 따라서, Slit2에 의한 Robo4의 고용이 이의 팍실린과의 회합을 자극하였다.
실시예 5
Robo4 의 팍실린 상호작용 모티프의 확인: 팍실린과의 상호작용에 필요한 Robo4의 영역을 정확하게 정의하기 위해, 세포질 꼬리의 전체 길이에 스패닝된 일련의 GST-Robo4 융합 단백질을 생성시켰다 (도 4A). 정제된 재조합 팍실린으로의 시험관내 결합 분석법에서, Robo4 꼬리의 아미노 말단 절반 (494-731)이 팍실린과의 직접적인 상호작용에 필요충분하다는 것이 실연되었다 (도 4B). 그후, 세포질 꼬리의 아미노 말단 절반의 아미노산 약 70개의 단편을 포함하는 4개의 추가적인 GST-Robo4 융합 단백질이 생성되었다 (도 4C). 시험관내 결합 분석법에서, 팍실린이 CC0와 CC2 모티프 사이에 있는 Robo4 꼬리의 단편 (604-674; 도 4D)과 선택적으로 상호작용하는 것으로 드러났다. Robo4의 이러한 영역이 팍실린과의 상호작용에 필요한지 여부를 결정하기 위해, 아미노산 604-674를 세포질 꼬리로부터 결실시키고, 이러한 돌연변이체 GST-Robo4 융합 단백질을 시험관내 결합 분석법에 적용하였다. 팍실린과의 상호작용이 감소되었지만, 공지된 Robo4-결합 단백질인 메나와의 상호작용도 그러하였고, 이는 아미노산 604-674의 제거가 Robo4 꼬리의 형상에 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 이러한 이슈를 우회하기 위해, 이러한 아미노산 70개의 신축물 내에 더 작은 결실을 생성시키고, 추가적인 시험관내 결합 분석법을 수행하였다. 이러한 접근법을 사용하여, 팍실린에 대한 결합이 상실되었지만 메나에 대한 결합은 유지된 (도 4E), 아미노산 36개가 없는 돌연변이체 GST-Robo4 융합 단백질 (604-639; 도 9)이 확인되었다. Robo4의 이러한 영역이 팍실린 상호작용 모티프 (PIM)로 지칭된다.
실시예 6
팍실린 상호작용 모티프가 접촉주성의 Robo4 -의존적 억제에 필요하다: 다음으로, Robo4의 팍실린 상호작용 모티프가 수용체의 기능적 활성에 중요한지 여부가 결정되었다. 아미노산 604-639가 없는 전장 Robo4의 돌연변이체 형태 (Robo4ΔPIM)가 부위 지정 돌연변이유발에 의해 생성되어, 접촉주성 이동 분석법에서 사용되었다. Robo4ΔPIM은 피브로넥틴 구배를 향한 이동의 Slit2-지시 억제를 매개하는데 실패하였고 (도 4F), 이는 팍실린 결합에 필요한 Robo4 꼬리의 영역이 돌출 활성의 Robo4-의존적 억제에 또한 필요하다는 것을 실연한다.
실시예 7
Slit2 - Robo4 신호전달이 세포 확산, 및 Rac 및 ARF6 을 억제한다: 피브로넥틴 상에서 Robo4를 발현하는 세포의 이동을 억제하는 고정된 Slit2의 능력은 이러한 ECM 단백질 상에서의 부착 및/또는 확산의 음성 조절로부터 잠재적으로 초래될 수 있다. Slit2-Robo4 신호전달이 이러한 프로세스에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, HEK 293 세포를 Robo4 또는 빈 벡터 (pcDNA3)로 형질감염시키고, 피브로넥틴 상에서의 부착 및 확산 분석법에 적용하였다. Robo4를 발현하는 세포는 피브로넥틴 및 Slit2 (Slit2N (서열 7))로 코팅된 커버슬립에 정상적으로 부착하였지만, pcDNA3로 형질감염된 세포보다 현저하게 덜 확산되었다 (도 5A). 이러한 데이터는 Slit2-Robo4 신호전달이 세포 확산을 제어하는 세포내 경로를 조절한다는 것을 가리킨다.
ECM 단백질, 예컨대 피브로넥틴 상에서 확산되는 세포의 능력은 Rho 부류의 소형 GTPase의 활성화에 의해 조절되고, 여기에는 Rho, Cdc42 및 Rac 이동이 포함된다 ([Nobes and Hall, 1995]; [Nobes and Hall, 1998]). 이러한 단백질들 중에서, Rac이 세포 확산 및 이동에 이르는 액틴 중합을 촉진하는데 필수적인 역할을 한다 ([Nobes and Hall, 1995]; [Nobes and Hall, 1998]). Rac과 세포 확산 간의 이러한 확립된 관계는 Slit2-Robo4 신호전달이 Rac의 부착-의존적 활성화를 억제할 수 있음을 가리켰다. 이를 평가하기 위해, HEK 293 세포를 Robo4 또는 pcDNA3로 형질감염시키고, 피브로넥틴 및 Slit2 (Slit2N (서열 7))로 코팅된 접시 상에 플레이팅하고, Rac-GTP 수준을 GST-PBD 풀-다운 분석법을 사용하여 분석하였다. 추가로, αIIb:β3 또는 αIIb-Robo4:β3를 발현하는 세포를 피브로넥틴 및 피브리노겐 상에 플레이팅하고, Rac-GTP 수준을 분석하였다. Robo4 또는 αIIb-Robo4:β3를 발현하는 세포는 pcDNA3 또는 αIIb:β3로 형질감염된 세포와 비교했을 때 부착-자극 Rac 활성화를 현저하게 덜 나타냈다 (도 5B, 5C 및 도 27). 본 발명자들은 Robo4ΔPIM으로 상기 실험을 반복하였으며, 이러한 돌연변이 수용체를 발현하는 세포가 Slit2에 대해 불응성임을 밝혔다 (도 5E).
Robo4를 발현하는 세포에서 Cdc42 활성화를 또한 시험하였다. 본 발명자들은 Robo4를 발현하는 세포에서 Cdc42 활성화가 Slit2에의 노출에 의해 변경되지 않았음을 밝혔다 (도 11A). 이러한 결과는 Robo4가 Cdc42에 대한 공지된 GTPase 활성화 단백질인 Robo1 결합-단백질 srGAP1과 상호작용하지 않는다는 관찰에 의해 지지된다 (도 11B). 종합하여, 이러한 데이터들은 Slit2-Robo4 신호전달이 Rac의 부착-유도 활성화를 특이적으로 억제한다는 것을 실연한다.
세포 확산의 Robo4-의존적 억제가 주로 Rac 활성화의 억제때문이었음을 확증하기 위해, 본 발명자들은 HEK 293 세포를 Robo4 및 우성 활성 형태의 Rac인 Rac (G12V)로 공동-형질감염시키고, 확산 분석법에 적용하였다. Rac (G12V)를 발현하는 세포는 세포 확산의 Robo4-의존적 억제에 불응성이었고 (도 5G), 이는 Slit2-Robo4 신호전달이 Rac를 억제함으로써 돌출 활성을 차단한다는 것을 실연한다.
Robo4가 팍실린과 상호작용하고, 돌출 활성을 억제한다는 본 발명자들의 발견은 Robo4가 ARF6 경로를 침범하는지 여부를 결정하도록 자극하였다. αIIb-Robo4:β3을 발현하는 세포를 피브로넥틴 단독, 또는 피브로넥틴 및 피브리노겐 상에 플레이팅하고, ARF6-GTP 수준을 GST-GGA3 친화성 침전 기술을 사용하여 분석하였다. 피브로넥틴은 ARF6의 활성화를 자극한 한편, 피브리노겐은 αIIb-Robo4:β3를 발현하는 세포에서 ARF6-GTP 수준을 감소시켰다 (도 16A). 이러한 결과는 Robo4 신호전달이 ARF6 활성화를 억제한다는 것을 실연하였고, Rac 활성을 차단하는 Robo4의 능력이 이의 ARF6 조절에서 유래된다는 것을 시사하였다.
실시예 8
팍실린 상호작용 모티프가 세포 확산 및 Rac 활성화의 Robo4 -의존적 억제에 필요하다: 다음으로, Robo4ΔPIM이 피브로넥틴-유도 세포 확산 및 Rac 활성화를 억제할 수 있는지 여부를 평가하였다. HEK 293 세포를 Robo4ΔPIM으로 형질감염시키고, 피브로넥틴 및 Slit2이 코팅된 표면 상에 플레이팅하고, 확산 또는 Rac 분석법에 적용하였다. 이러한 돌연변이체 형태의 수용체는 세포 확산 및 부착-의존적 Rac 활성화를 억제할 수 없었고 (도 5D, E 및 F), 이는 팍실린 상호작용 모티프가 시험관 내에서 Robo4의 기능적 활성에 필수적이라는 것을 실연한다.
세포 확산의 Robo4-의존적 억제가 주로 Rac 활성화의 억제때문이었음을 확증하기 위해, HEK 293 세포를 Robo4 및 우성 활성 형태의 Rac인 Rac (G12V)로 공동-형질감염시키고, 확산 분석법에 적용하였다. Rac (G12V)를 발현하는 세포는 세포 확산의 Robo4-의존적 억제에 불응성이었고 (도 5G), 이는 Slit2-Robo4 신호전달이 Rac 활성을 억제함으로써 확산을 차단한다는 것을 실연한다.
실시예 9
Slit2 가 1차 인간 내피 세포에서 VEGF -유도 Rac 활성화를 억제한다: Slit2는 여러 1차 인간 내피 세포주의 VEGF-자극 이동을 억제하고 ([Park et al., 2003]), Rac은 VEGF-유도 세포 이동성에 필수적인 역할을 한다 ([Soga et al., 2001a]; [Soga et al., 2001b]). 따라서, Slit2-Robo4 신호전달이 내인성 환경에서 Rac 활성화를 억제할 수 있는지 여부를 결정하였다. 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 Slit2 (Slit2N (서열 7))의 존재 및 부재 하에 VEGF로 자극하였고, GTP-Rac 수준을 GST-PBD 풀-다운 분석법을 사용하여 분석하였다. Slit2 처리는 VEGF-자극 Rac 활성화를 완전하게 억제하였고 (도 5H 및 I), 이는 내인성 Slit2-Robo4 신호전달이 Rac 활성화를 조절한다는 것을 실연한다.
실시예 10
팍실린의 Lim4 가 Robo4 와의 상호작용 및 세포 확산의 Robo4 -의존적 억제에 필요하다: Robo4ΔPIM에서 메나와의 상호작용이 유지되지만 (도 4E), 이러한 돌연변이가 팍실린 이외의 단백질과의 Robo4의 상호작용을 교란시켰을 수 있다. 이러 한 이슈를 명확하게 다루기 위해, Robo4와의 회합을 파괴하는 팍실린 돌연변이체를 생성시켰다. 팍실린은 N-말단의 류신/아스파르트산 (LD) 반복부 및 C-말단의 Lim 도메인으로 구성된 모듈형 단백질이다 (도 6A). 효모 2-하이브리드 스크린 (도 9A 참조)으로부터 회수된 클론들의 분석은 Lim 도메인, 특히 Lim3 및 Lim4가 Robo4와의 상호작용에 중요하다는 것을 가리켰다. 이러한 개념을 확인하기 위해, Robo4 꼬리 및 팍실린-LD 또는 팍실린-Lim 중 하나로 공동-형질감염된 HEK 293 세포를 사용하여 공동-면역침전 실험을 수행하였다. 팍실린-Lim은 Robo4 면역침전물에서 발견되었지만 팍실린-LD는 그렇지 않았고 (도 6B), 이는 팍실린의 Lim 도메인이 Robo4와의 상호작용에 필요충분하다는 것을 실연한다. 어떤 Lim 도메인이 Robo4에의 결합에 필요한지를 명백하게 설명하기 위해, 팍실린의 카르복시 말단으로부터 일련의 결실물들을 제조하고, Robo4 꼬리와 함께 HEK 293 세포 내로 공동-형질감염시키고, 공동-면역침전 실험을 수행하였다. 팍실린의 Lim4 도메인의 결실이 Robo4에의 결합을 완전히 폐지하였고 (도 6C), 이는 팍실린의 이러한 영역이 Robo4와 상호작용하는 팍실린의 능력에 결정적이라는 것을 실연한다.
팍실린 상의 Robo4 결합 부위의 서술은 세포 확산의 Robo4-의존적 억제에서의 팍실린의 역할의 직접적인 평가를 허용하였다. 내인성 팍실린을 siRNA를 사용하여 HEK 293 세포에서 녹다운시키고, 야생형 닭 팍실린 (Ch-팍실린) 또는 Ch-팍실린 ΔLim4로 재구성시켰다 (도 6D). 그후, 이러한 세포들을 피브로넥틴 및 Slit2 (Slit2N (서열 7))로 코팅된 커버슬립 상에서의 확산 분석법에 적용하였다. Ch-팍실린 ΔLim4를 발현하는 세포는 세포 확산의 Robo4-의존적 억제에 불응성인 반면, Ch-팍실린을 발현하는 세포는 세포 면적에서의 특징적인 감소를 나타냈다 (도 6E). 이러한 데이터들은 팍실린과 Robo4의 상호작용이 Slit2-Robo4 신호전달이 세포 확산을 억제하도록 한다는 것을 확증한다.
실시예 11
팍실린 상호작용 모티프가 생체 내에서 혈관 유도에 필요하다: 지브라피쉬 혈관 발달 동안의 Robo4의 팍실린 상호작용 모티프의 필요성을 평가하였다. 앞서 기술된 바와 같이, TG( fli1 : egfp ) y1 배아 내로의 robo4 MO의 주입은 체절간 혈관의 해체를 야기하였다 (도 1B 참조). robo4 Δ PIM RNA의 공동 주입은 robo4 MO에 의해 야기된 결함을 악화시켰지만, 야생형 robo4 RNA는 이러한 결함을 억제하였다 (도 7A). robo4 Δ꼬리 및 robo4 Δ PIM RNA 양쪽 모두가 모판트 배아에서의 혈관 패턴화 결함을 구출할 수 없음은 아미노산 36개의 팍실린 상호작용 모티프가 Robo4 세포질 꼬리에서의 결정적인 신호 변환 모듈이라는 것을 실연한다. 또한, 이러한 데이터들은 팍실린과 Robo4 사이의 상호작용이 지브라피쉬 혈관구조의 적절한 패턴화에 필수적이라는 것을 가리킨다.
실시예 12
Robo4 는 AF6 의 억제를 통해 Rac -의존적 돌출 활성을 차단한다: Robo4가 팍실린과 상호작용하고, 돌출 활성을 억제한다는 본 발명자들의 결정은 Robo4가 ARF6 경로를 침범하는지 여부를 결정하도록 자극하였다. αIIb-Robo4:β3을 발현하는 세포를 피브로넥틴 단독, 또는 피브로넥틴 및 피브리노겐 상에 플레이팅하고, ARF6-GTP 수준을 GST-GGA3 친화성 침전 기술을 사용하여 분석하였다. 피브로넥틴은 ARF6의 활성화를 자극한 한편, 피브리노겐은 αIIb-Robo4:β3를 발현하는 세포에서 ARF6-GTP 수준을 감소시켰다 (도 16A). 이러한 결과는 Robo4 신호전달이 ARF6 활성화를 억제한다는 것을 실연하였고, Rac 활성을 차단하는 Robo4의 능력이 이의 ARF6 조절에서 유래된다는 것을 시사하였다.
다음으로, 본 발명자들은 돌출 활성의 Robo4-의존적 억제에서의 팍실린-GIT1 복합체의 필요성을 분석하였다. GIT1 상의 팍실린 결합 서열 (PBS)은 단백질의 카브록시-말단에서 발견되고, GIT1와 팍실린의 상호작용을 방지하는 것으로 나타났다 ([Uemura et al., 2006]). 세포를 αIIb-Robo4:β3 및 빈 벡터 또는 GIT1-PBS 중 하나로 형질감염시키고, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 및 피브리노겐 상에서의 확산 분석법에 적용하였다. 앞서 기술된 바와 같이, αIIb-Robo4:β3을 발현하는 세포가 피브리노겐 상에 플레이팅되었을 때 세포 면적에서의 감소를 나타냈지만, GIT1-PBS로 형질감염된 세포에서 이것이 사라졌다 (도 16B). 본 발명자들은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 및 Slit2 (Slit2N (서열 7)) 상에 플레이팅된 전장 Robo4를 발현하는 세포에서 이러한 실험을 반복하였고, 키메라 수용체 실험과 유사하게, GIT1-PBS는 세포 면적에서의 Slit2-의존적 감소를 방지하였다 (도 16C). 이러한 데이터들은 기능적 팍실린-GIT1 복합체가 Slit2-Robo4 신호전달에 필요하다는 것을 실연한다.
Slit2-Robo4 신호전달이 ARF6을 불활성화시킴으로써 돌출 활성을 억제하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 ARF6 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 ARNO를 Robo4와 공동-발현시키고, 확산 분석법을 수행하였다. ARNO의 과발현은 세포 면적을 감소시키는 Slit2의 능력을 차단하였고, 이는 Slit2-Robo4 신호전달의 주요 효과가 ARF6의 GTP-로딩을 방지하는 것임을 가리킨다 (도 16C). ARNO가 Slit2 상에서 확산되는 Robo4-발현 세포의 능력을 복원시키면, 피브로넥틴에 반응하여 Rac 활성화를 마찬가지로 재-확립시켜야 하는 것으로 본 발명자들은 판단하였다. 실제로, ARNO의 과발현으로 피브로넥틴 및 Slit2 상에 플레이팅된 세포에서 GTP-Rac 수준이 정상이 되었다 (도 16D). 종합하여, 이러한 실험들은 Slit2-Robo4 신호전달이 ARF6을 불활성화시키고, 이는 Rac 활성화의 국소적인 차단에 이르며, 이어서 세포 확산 및 이동에 필요한 막 돌출의 억제에 이른다는 것을 실연한다.
실시예 13
면역침전에서 Slit 리간드와 Robo4 수용체 간의 상호작용이 실연된다: 형질감염되지 않은 인간 배아 신장 세포 (HEK), myc 에피토프가 태그로 부착된 Slit으로 형질감염된 HEK 세포 (Slit-myc), HA 에피토프가 태그로 부착된 Robo4로 형질감염된 HEK 세포 (Robo4-HA) 및 대조군 벡터로 형질감염된 HEK 세포 (대조군-HEK)로부터의 세포 용해물을 면역침전시켰다. Slit-myc 및 Robo4-HA 세포 용해물이 조합되어 항-HA 항체로 면역침전된 후 항-myc 항체로의 웨스턴 블롯에 의해 Slit-myc 단백질이 검출되었다 (도 17A, 레인 6). 이러한 상호작용의 특이성이 용해물들의 모든 또다른 조합으로의 검출가능한 Slit 단백질의 부재에 의해 확증되었다 (도 17A, 레인 2-5). 동일한 양의 용해물이 각각의 실험에서 사용되었다. Slit-myc 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석이 대조군으로 작용하였고, Slit 단백질의 질량이 기존에 보고된 바와 같이 약 210 kD라는 것을 실연하였다 (도 17A, 레인 1). 도 17A의 레인 2-6에 나타난 더 낮은 밴드는 면역글로불린 중쇄에 상응한다.
형질감염되지 않은 HEK 세포 (HEK CM), myc 에피토프가 태그로 부착된 Slit 으로 형질감염된 HEK 세포 (Slit-myc CM), HA 에피토프가 태그로 부착된 Robo4의 N-말단 가용성 엑토도메인으로 형질감염된 HEK 세포 (NRobo4-HA CM) 및 대조군 벡터로 형질감염된 HEK 세포 (대조군-HEK CM)로부터의 조건화 배지를 또한 면역침전시켰다. 전장 Slit-myc 단백질 (210 KD) 및 이의 C-말단 단백질용해성 단편 (70 KD)이 항-myc 항체에 의해 Slit-myc CM에서 검출되었다 (도 17B, 레인 1). Slit-myc 및 Robo4-HA 조건화 배지가 조합되어 항-HA 항체로 면역침전된 후 웨스턴 블롯에 의해 Slit-myc 단백질이 또한 검출되었다 (도 17B, 레인 6). 이러한 상호작용의 특이성이 조건화 배지들의 모든 또다른 조합으로의 Slit 단백질의 부재에 의해 확증되었다.
도 17C - 도 17F에 나타난 바와 같이, Slit 단백질이 Robo4를 발현하는 세포의 형질막에 결합한다. Slit-myc 단백질의 결합이 항-myc 항체 및 알렉사 594 접합 항-마우스 항체를 사용하여 검출되었다. 도 17D 및 도 17F에서 볼 수 있는 바와 같이, Robo4-HEK 세포의 표면 상에서 결합이 검출되었지만 (도 17F), 대조군-HEK 세포에서는 검출되지 않았다 (도 17D).
실시예 14
Robo4 녹아웃 마우스: 생체 내에서의 Robo4의 기능적 유의성을 확인하기 위해, 표준 기술을 사용하여 녹아웃 마우스를 생산하였다. 녹아웃 마우스를 생산하 기 위해, Robo4를 발현하는 유전자의 엑손 1 내지 5를 상동성 재조합을 사용하여 알칼리성 포스파타제 (AP) 리포터 유전자로 교체하였다. 이러한 대립유전자 Robo4 AP 에는 Slit 단백질과의 상호작용에 필요한 것으로 예상되는, Robo4 엑토도메인의 면역글로불린 (IgG) 반복부를 코딩하는 엑손이 없었다. Robo4 +/ AP 동물을 이종교배하여, 표적화된 대립유전자에 대해 동종접합성인 마우스를 생성시켰다. 이러한 마우스의 게놈 구조의 도해가 도 25에서 제공된다. Robo4 AP / AP 동물은 생육성 및 번식성이었고, 혈관계의 정상적인 패턴화를 나타냈다. 이러한 데이터들은 Robo4가 발달 중인 마우스에서 발아성 혈관형성에 필요하지 않다는 것을 가리키고, 포유류 내피에서의 Robo4 신호전달에 대한 별법적인 기능을 지적한다. 알칼리성 포스파타제 활성이 발달 중인 배아 및 성체 마우스의 모든 혈관상의 내피 전반에 걸쳐 이러한 동물에서 검출되었고, 이는 Robo4 AP 대립유전자가 Robo4 발현의 효과적인 마커라는 것을 확증하였다.
실시예 15
Robo4 활성화가 성숙한 혈관을 안정화시킨다: 자루 세포로 특이적으로 구성된, 뮤린 망막 혈관총의 중앙 영역은 성숙한, 관강을 형성하는 혈관의 관을 특징으로 하는 분화/안정화된 표현형의 예이다. 따라서, 본 발명자들은 자루에서의 Robo4 발현이 전-혈관형성 인자, 예컨대 VEGF-A에 의해 자극되는 프로세스를 억제함으로써 이러한 표현형을 유지할 수 있을 것으로 판단하였다. VEGF-A에 의해 자 극되는 프로세스에 대한 Robo4 신호전달의 효과를 VEGF-A 내피 세포 이동 분석법 및 VEGF-A 관 형성 분석법을 사용하여 평가하였다. 이같은 분석법 양쪽 모두는 시험관 내에서 혈관형성을 연구하는데 일상적으로 사용된다.
내피 세포 이동 및 관 형성 분석법을 수행하기 위해, Robo4 +/+ 및 Robo4 AP / AP 마우스의 폐로부터의 내피 세포를 단리하였고, 면역세포화학 및 유동세포측정법을 사용하여 이들의 신원을 확인하였다. 그후, 이러한 세포들을 VEGF-A-의존적 내피 세포 이동 및 관 형성 분석법에서 사용하였다. 이러한 분석법에서 사용된 Slit2 분자는 Slit2N (서열 7)이었다. 도 19A 및 도 19B에 나타난 바와 같이, Slit2는 Robo4 +/+ 내피 세포의 이동 및 관 형성 양쪽 모두를 억제하였다. 그러나, Slit2의 억제 활성이 Robo4 AP / AP 내피 세포에서 사라졌다. 이러한 결과들은 Slit2가 Robo4-의존적 방식으로 내피 세포 이동 및 관 형성을 억제한다는 것을 실연하고, Slit2에 의한 Robo4의 활성화가 성숙한 혈관의 혈관 내피를 안정화시키는 작용을 한다는 것을 가리킨다.
실시예 16
Robo4 활성화가 내피 장벽 기능을 보존한다: 성숙한 혈관상에서, 내피 세포는 서로 독립적으로 거동하지 않고, 그보다는 이들은 내피 관강으로부터 주변 조직 내로의 단백질, 유체 및 세포의 이동을 방지하는 단층을 형성한다. 이러한 장벽 기능을 트랜스웰 분석법을 사용하여 시험관 내에서 모델링하여, Robo4 +/+ 및 Robo4 AP/AP 마우스의 폐로부터 취해진 내피 세포의 합류성 세포 단층을 가로지르는 양고추냉이 과산화효소 (HRP)의 전달을 분석하였다. 공지된 투과성-유도 인자인 VEGF-A로의 Robo4 +/+ 및 Robo4 AP / AP 내피 세포의 자극은 트랜스웰의 하부 챔버 내의 HRP의 축적을 강화시켰다. 그러나, 도 19C에 나타난 바와 같이, Slit2 단백질 (Slit2N (서열 7))로의 세포 단층의 전처리는 Robo4 +/+ 내피 세포에서 이러한 효과를 방지하였으나, Robo4 AP / AP 내피 세포에서는 그렇지 않았다.
다음으로, 생체 내에서의 내피 장벽 기능에 대한 Slit2의 영향을 평가하였다. 에반스 블루(Evans Blue)를 Robo4 +/+ 및 Robo4 AP / AP 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사함으로써 마일즈 분석법을 수행하였다. 이어서, Slit2 단백질 (Slit2N (서열 7))의 부재 및 존재 하에 VEGF-A를 진피 내로 주사하였다. 시험관내 분석법과 유사하게, 진피 내로의 에반스 블루의 VEGF-A-자극 누출이 Robo4 +/+ 마우스에서 Slit2 단백질의 동시 투여에 의해 방지될 수 있었지만, Robo4 AP / AP 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 19D에 제시됨). 망막 내피의 VEGF-A 유도 과투과성을 억제하는 Slit2의 능력을 평가함으로써 이러한 관찰들이 확대되었다. 특히, Robo4 +/+ 마우스에서의 VEGF-A의 유리체내 주사는 망막 혈관으로부터의 에반스 블루의 누출 유도하였다. 그러나, 망막 혈관으로부터의 에반스 블루의 이같은 VEGF-A 유도 누출이 Slit2 단 백질 Slit2N (서열 39)의 공동-주사에 의해 Robo4 +/+ 마우스에서 억제되었다 (도 19E). Robo4 AP / AP 마우스의 망막에서 이러한 실험을 반복하였고, Robo4 AP / AP 가 Slit2N (서열 39)으로의 처리에 불응성인 것으로 밝혀졌다. 이러한 데이터들은 Robo4가 시험관내에서 및 생체내에서 VEGF-A-유도 내피 과투과성의 Slit2-의존적 억제를 매개한다는 것을 실연한다.
실시예 17
Robo4 가 VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달을 차단한다: 혈관형성 및 투과성을 촉진하는 VEGF-A의 능력은 리간드 결합에 이은 자가인산화에 의해 발생하는 VEGFR2의 활성화에 의존적이다. 이어서, 다수의 비-수용체 타이로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제 및 소형 GTPase가 활성화되어, VEGF-A 신호전달을 공간 및 시기 특이적 방식으로 실행시킨다. 어디서 Slit2-Robo4 신호전달이 VEGF-A-VEGFR2 경로와 교차하는지를 결정하기 위해, VEGF-A 및 Slit2로의 자극에 이은 VEGFR2 인산화를 Slit2N (서열 7)을 사용하여 분석하였다. Slit2N (서열 7)은 VEGF-A-유도 VEGFR2 인산화에 대한 효과가 없었고 (도 19F), 이는 Slit2-Robo4 경로가 수용체의 하류에서 VEGF-A 신호전달과 교차하여야 함을 가리킨다. 그후, VEGF-A-유도 혈관형성 및 투과성을 매개하는데 있어서의 역할이 잘 문서화되어 있기 때문에 ([Eliceiri et al., 2002]; [Eliceiri et al., 1999]), Src 부류의 비-수용체 타이로신 키나제인 Fyn, Yes 및 Src에 관심이 집중되었다. Slit2N (서열 7)으로의 내피 세포의 처리는 c-Src의 VEGF-A-자극 인산화를 감소시켰다 (도 19G). 최근, 여 러 보고서들이 Rho 부류 소형 GTPase인 Rac1의 Src-의존적 활성화가 VEGF-A-유도 내피 세포 이동 및 투과성에 필수적임을 나타냈다 ([Gavard et al., 2006]; [Garrett et al., 2007]). Slit2N (서열 7)로의 내피 세포 단층의 처리가 VEGF-A-의존적 Rac1 활성화를 방지하였다 (도 19H). 이러한 생화학적 실험들은 Slit2-Robo4 경로가 Src-Rac1 신호전달 축의 억제를 통해 VEGF-A-유도 내피 이동 및 과투과성을 억제한다는 것을 가리킨다.
실시예 18
Robo4 의 활성화가 CNV 및 OIR 모델에서 혈관 누출 및 병적 혈관형성을 감소시킨다: 당뇨병성 망막병증 및 미숙아 망막병증 양쪽 모두에서 관찰되는 허혈-유도 혈관형성을 모방하는 산소-유도 망막병증 (OIR)의 뮤린 모델을 사용하여, 망막 혈관 질환에 대한 Robo4 신호전달의 효과를 조사하였다. 이러한 모델에서, P7 마우스를 75％ 산소 환경에서 5일 동안 유지시킨 후, 추가로 5일 동안 25％ 산소로 돌려보냈다. 지각된 산소 부족은 망막에서의 VEGF-A 발현의 급속한 증가를 개시시켜, 병적 혈관형성에 이른다 ([Ozaki et al., 2000]; [Werdich et al., 2004]). Robo4 +/+ 마우스 및 Robo4 AP / AP 마우스를 이러한 모델을 사용하여 평가하였다. Slit2N (서열 7)의 유리체내 투여는 Robo4 +/+ 마우스에서 혈관형성을 현저하게 감소시켰지만, Robo4 AP / AP 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 20A - 도 20E; 화살표는 병적 혈관형성의 영역을 나타냄). 또한, Robo4 AP / AP 마우스는 과산소성 조건에의 노출 후 에 Robo4 +/+ 마우스보다 더욱 공격적인 혈관형성을 나타냈다 (예를 들어, 도 20A 및 20C 참조).
기술된 OIR 모델에 더하여, 연령-관련 황반 변성을 모방하는 레이저-유도 맥락막 혈관신생이 마우스에서 병적 혈관형성을 연구하는데 통상적으로 사용된다 ([Lima et al., 2005]). 이러한 모델에서, 레이저를 사용하여 브루크(Bruch) 막이 파괴하며, 이는 하부의 맥락막 혈관구조가 망막하 색소 상피 내로 투과하도록 한다. 이러한 병적 프로세스에 대한 Robo4 신호전달의 효과를 식별하기 위해, 8-12주령의 Robo4 +/+ 및 Robo4 AP / AP 마우스에 레이저-유도 맥락막 혈관신생을 일으킨 후, Slit2N (서열 7)을 유리체내로 주사하였다. 산소-유도 망막병증의 마우스 모델에서 달성된 결과와 유사하게, Slit2N의 유리체내 투여는 Robo4 +/+ 마우스에서 혈관형성을 감소시켰지만, Robo4 AP / AP 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 20F - 도 20J 참조). 종합하여, 산소-유도 망막병증 및 맥락막 혈관신생 모델은 독특한 특성이 있는 2개의 혈관상 (하나는 단단한 혈액-뇌 장벽, 또다른 하나는 유창(fenestrated) 내피)이 Slit2-Robo4 신호전달의 활성화에 의해 병적 상해로부터 보호된다는 것을 가리킨다.
실시예 19
Robo4 가 마우스 혈관을 불안정화시키는 다중 인자들로부터의 신호전달을 억제한다: 혈관형성 인자인 bFGF, 및 내피 투과성 인자인 트롬빈의 활성에 대한 Slit2 분자에 의한 Robo4 활성화의 효과를 평가하였다. 도 21에 나타난 바와 같이, Slit2N (서열 7)는 bFGF-유도 내피 관 형성 및 트롬빈-유도 투과성을 차단하였다. 이러한 연구는 Slit-Robo4 신호전달이 다중 혈관형성 인자 및 투과성 인자에 의해 유도되는 신호전달을 억제할 수 있다는 것을 실연하고, Slit-Robo4 경로가 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 사이토카인 인자로부터 성숙한 혈관상을 보호한다는 개념을 지지한다.
Robo4 신호전달이 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 사이토카인 인자로부터 혈관구조를 보호한다는 것을 강화하기 위해, Slit2N (서열 7)에 의한 Robo4 활성화의 효과를 급성 폐 손상의 마우스 모델에서 평가하였다. 이러한 모델에서, 박테리아 내독소 LPS가 기관내 투여를 통해 마우스에 투약되었다. 박테리아 내독소에의 노출은 사이토카인 폭풍에 이르게하고, 이는 폐 혈관상의 파국적인 불안정화를 야기하고 비-심인성 폐 부종을 초래한다 ([Matthay et al., 2005]). LPS의 기관내 투여에 이어서, 마우스를 Slit2N (서열 7), 또는 대조군으로 작용하는 허위 단백질 추출물인 모조물 제제로 처리하였다. 도 22에 나타난 바와 같이, Slit2N (서열 7)으로 처리된 마우스로부터의 기관지폐포 세척 (BAL)에서의 염증 세포 및 단백질의 농도가 모조물 제제로 처리된 마우스에서보다 현저하게 더 낮았다. 이러한 결과들은 이러한 상황에서 Robo4를 활성화시키는 것이 강력한 혈관 안정화를 제공한다는 것을 실연하고, Slit2-Robo4가 성숙한 내피의 통합성을 보존시키고 극단적인 형태의 사이토카인 폭풍에 대항하여 혈관 항상성을 유지하는 작용을 하는 강력한 혈관 안정화 경로라는 것을 시사한다.
실시예 20
Slit2 단백질의 투여가 조류 인플루엔자의 마우스 모델에서 사망률을 감소시킨다: 하기의 예에서, 조류 인플루엔자 바이러스로 감염된 마우스의 생존에 대한 Slit 단백질의 효과를 분석하였다. 총 120마리의 암컷 BALB/c 마우스에게 H5N1/Duck/Mn/1525/81 계통의 조류 인플루엔자 바이러스의 1:400 희석물 50 ㎕를 비강내로 접종하였다. 이러한 예에서 사용된 마우스는 찰스 리버(Charles River)로부터 수득되었고, 평균 체중이 18-20 g 범위였다. 표 2를 참조하여, 마우스를 각각 마우스 20마리의 6개의 우리 내로 무작위 분류하고, 각각의 군에게 5일 동안 일일 처리를 적용하였다. 처리 동안 및 처리 후에 생존 (사망) 및 체중을 관찰하였다.
Figure 112009081744748-PCT00007
간략하게, 표 2에 나타난 바와 같이, 1번 군을 음성 대조군인 생리식염수 (PSS)로 처리하였다. 2번 및 3번 군은 모조물 제제로 처리하였다. 4번 및 5번 군은 상이한 농도의 Slit 단백질 (Slit2N (서열 7))로 처리하였다. 양성 대조군으로서, 6번 군의 마우스 20마리에게 PSS에서 총 부피가 0.1 ㎖가 된 리바비린을 75 ㎎/㎏/일로 복강내 처리하였다.
분석 결과가 도 24에 도해되고, 표 3에서 상술된다. 23일 후, 4번 및 5번 군의 Slit 단백질로 처리된 마우스들은 1번, 2번 및 3번 군의 Slit 단백질이 제공되지 않은 마우스들보다 사망률이 낮았다. 투약 당 12.5 ㎍의 Slit으로 처리된 4번 군의 마우스는 생존율이 25％였다. 투약 당 1.25 ㎍의 Slit으로 처리된 5번 군의 마우스는 생존율이 50％였다. 4번 및 5번 군의 생존과 대조적으로, PSS로 처리된 1번 군의 음성 대조군 마우스의 5％ (1/20)만이 23일 후 생존하였다.
표 3은 접종 14일 후, 1번, 2번 및 3번 군의 생존물의 평균 체중이 4번 및 5번 군의 Slit으로 처리된 생존물보다 현저하게 더 낮았음을 나타낸다. 또한, Slit 처리 농도가 더 낮았던 5번 군의 20마리의 마우스 중 10마리는 21일에 평균 체중 17.6 g으로 생존하였고, 이는 거의 출발 평균 체중 17.7 g만큼 높았다. 따라서, Slit 단백질로 처리된 감염된 마우스들이 처리되지 않은 마우스보다 양호하게 체중을 유지할 수 있었다.
Figure 112009081744748-PCT00008
Figure 112009081744748-PCT00009
실시예 21
Slit 단백질의 단편이 Robo4 를 활성화시키는 작용을 한다: 도 23은 Slit2 단백질의 다양한 구축물을 도해한다. 본원에서 이미 기술된 바와 같이, 150kD 단백질 Slit2N (서열 7)은 마일즈 분석법, 망막 투과성, 관 형성 및 내피 세포 이동에 대한 분석법 및 안구 질환의 OIR 및 CNV 모델을 포함하는 시험관내 및 생체내 모델에서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 또한, 도 23에 나타난 바와 같이, (40kD) 단백질 SlitD1 (서열 42) 및 Slit2N (서열 39) 구축물이 VEGF-유도 내피 세포 이동 분석법에서 전장 Slit2 (서열 40)와 유사한 활성을 나타냈다.
실시예 22
Slit2 는 ARF - GAP 를 통해 내피 세포의 세포 돌출을 억제한다: 본 발명자들의 실험에서, Robo4의 신호 변환 캐스케이드 하류를 해독하기 위해 모델 세포계를 이용하였다. 이러한 분자 메커니즘이 1차 세포의 Robo4 기능에 대해 중요한지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 인간 미세혈관 내피 세포에 피브로넥틴 및 Slit2 (Slit2N (서열 7))의 혼합물로 아랫면 상에 코팅된 트랜스웰 상에서 접촉주성 이동 분석법을 적용하였다. HEK 세포와 유사하게, Slit2는 피브로넥틴-유도된 세포 이동을 차단하였다 (도 28A). 다음으로, 본 발명자들은 피브로넥틴의 9-11 단편 (알파5베타1 인테그린에 대한 리간드) 및 Slit2 (Slit2N (서열 7))로 코팅된 커버슬립 상에서 확산 분석을 수행하였으며, Slit2가 인테그린 결찰에 의해 자극된 세포 돌출 활성을 억제함을 다시 밝혔다 (도 28B). 세포 돌출의 Slit2-의존적 억제에서의 GIT1의 역할을 분석하기 위해, 본 발명자들은 내피 세포를 Arf-GAP의 소형 분자 억제제, Qs11로 전처리한 다음, 이를 9-11 및 Slit2 (Slit2N (서열 7)) 상에서 확산 분석에 적용하였다. Arf-GAP 억제는 Slit2에 의해 유도된 세포 면적의 감소를 방지하였고 (도 28B), 이는 Arf-GAP 활성이 세포 돌출의 Slit2-의존적 억제에 필수적임을 실연한다.
실시예 23
Slit2 는 피브로넥틴 및 VEGF -165에 반응하여 ARF6 활성화를 차단한다: 상기 세포의 생물학적 데이터는, 내피 세포의 Slit2-Robo4 신호전달이 인테그린 결찰에 반응하여 ARF6 활성화를 차단할 것임을 시사한다. 이러한 생각을 확증하기 위해, 본 발명자들은 내피 세포를 피브로넥틴 및 Slit2로 코팅된 접시 상에 플레이팅하고, ARF6-GTP 수준을 GST-GGA3 친화성 침전 기술을 이용하여 분석하였다. CHO 세포로부터의 결과와 일관되게 (도 16A), Slit2 (Slit2N (서열 7))는 ARF6-GTP의 피브로넥틴-유도된 증가를 차단하였다 (도 28C). 피브로넥틴 외에, 혈관형성 및 투과성-유도 인자 VEGF-165 (이는 생체내에서 세포외 매트릭스 결합 형태로 존재함)가 ARF6을 활성화시키는 것으로 시사되었다. ARF6 활성에 대한 VEGF-165 및 Slit2 (Slit2N (서열 7))의 효과를 밝히기 위해, 본 발명자들은 내피 세포를 두 단백질로 코팅된 접시 상에 플레이팅하고, ARF6-GTP 수준을 GST-GGA3 친화성 침전 기술을 이용하여 분석하였다. VEGF-165는 ARF6을 활성화시켰고, Slit2는 이러한 활성화를 방지하였으며 (도 28D), 이는 Slit2가 두 세포외 매트릭스 단백질- 및 성장 인자-유도된 ARF6 활성화를 억제함을 실연한다.
실시예 24
ARF6 의 억제는 병적 혈관형성 및 혈관 누출을 방지한다: Robo4는 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 피브로넥틴, 및 성장 인자, 예컨대 VEGF (REF)에 의해 개시되고 영속되는 프로세스인 신생혈관 다발 형성 및 내피 과투과성 (REF)의 Slit2-의존적 억제를 매개한다. 인테그린 및 VEGF 수용체 신호전달에서 ARF6의 관련성 및 피브로넥틴 및 VEGF-165에 반응하여 ARF6 활성화를 차단하는 Slit2의 능력은, 본 발명자들로 하여금 병적 혈관형성 및 혈관 누출을 조절하는 신호전달 경로에서 ARF6가 결정적으로 관련될 수 있는지 생각케 하였다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 사이토헤신 Arf-GEF의 소형 분자 억제제, SecinH3 (도 29)를 야생형 마우스의 눈에 주사하고, 이 동물을 산소-유도 망막병증 (OIR), 레이저-유도 맥락막 혈관신생 (CNV) 및 VEGF-165-유도된 망막 투과성 분석에 적용하였다. SecinH3는 OIR (도 30A 및 도 30B) 및 CNV (도 30C 및 도 30D)에서의 신생혈관 다발 형성, 및 VEGF-165로 인한 망막 과투과성 (도 30E)을 억제하였으나 DMSO 대조군은 그렇지 않았으므로, 이러한 병리학적 프로세스에서 Arf-GTPase의 주요 관련성을 실연하며, Arf 활성화의 차단이 병적 혈관형성 및 혈관 누출을 특징으로 하는 질환에 대한 잠재적 치료법임을 실연한다.
실시예 25
Secin - H3 는 VEGF 유도된 ARF6 - GTP 를 억제한다: Secin-H3가 ARF6-GTP의 축적을 약화시켰는지 시험하기 위해, 인간 미세혈관 내피 세포 (HMVEC)를 처리하지 않거나 (도 31 가장 좌측 레인), 20 ng/㎖ VEGF＼DMSO로 처리하거나 (도 31 가운데 레인), 또는 20 ng/㎖ VEGF＼50 μM Secin-H3로 처리하였다 (도 31 가장 우측의 레인). 세포 용해물을 ARF6-GTP 항체 또는 ARF6 항체로 프로빙하였으며, 이러한 ARF6 종의 상대적인 양을 웨스턴 블롯팅에 의해 비교하였다. 이후, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 50 mM 트리스 pH 7.0, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.5％ NP-40, 1× 프로테아제 억제제, 1× 포스파타제 억제제 및 50 ㎍/㎖ GST-GGA3-VHS-GAT로 용해시켰다. 용해물을 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 글루타티온 아가로스 50 μl와 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 용해 완충액으로 3회 세척한 다음, 결합된 단백질을 2× 샘플 완충제로 용출시켰다. Arf6를 Arf6-특이적 항체로의 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다. 상기 실험의 결과는 소형 유기 분자 Secin-H3가 ARF6-GTP의 축적을 차단함을 실연한다 (도 31 비교, 상부 패널 가운데 레인 및 상부 패널 우측 레인).
실시예 26
Secin - H3 는 VEGF 유도된 HMVEC 의 이동을 억제한다: 세포 이동 분석을 변형된 보이든(Boyden) 챔버 트랜스웰 분석을 이용하여 수행함으로써 Secin-H3 (도 29)가 시험관내 분석에서 VEGF 유도된 HMVEC 이동을 억제할 수 있는지 시험하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 플레이팅하고, 대조군 처리 또는 실험군 처리에 적용하였다. 대조군 처리에는 0.2％ BSA 및 DMSO가 포함되었고, 실험군 처리에는 0.2％ BSA + 15 ng/㎖ VEGF-165 및 DMSO + 15 μM Secin-H3가 포함되었다. 0.2％ BSA 50 μl, 0.2％ BSA＼15 ng/㎖ VEGF-165, 0.2％ BSA＼15 ng/㎖ VEGF-165＼DMSO, 및 0.2％ BSA＼15 ng/㎖ VEGF-165＼15 μM Secin-H3가 포함된 실험군 처리물을 48-웰 보이든 챔버 기구 (뉴로프로브(NeuroProbe), 미국 메릴랜드주 캐빈 존 소재)의 각 웰에 플레이팅하고, 웰에 50 ㎍/㎖ 인간 피브로넥틴 (바이오메디컬 테크놀로지스 인코퍼레이티드(Biomedical Technologies, Inc.), 미국 메사추세츠주 스타우톤 소재)로 미리 코팅된 8 μm 공극 폴리카르보네이트 막 (뉴로프로브)을 덮었다. 이후, 인간 미세혈관 내피 세포 (HMVEC)의 3.75 x 104개 세포를 상부 챔버에 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 이동이 진행되게 하였다 (5％ CO2). 이후, 막을 제거하고, 메탄올로 고정시키고, Hema 3 염색 세트 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재)로 염색하고, 50 x 75 mm 유리 슬라이드 상에 플레이팅하였다 (이동된 면이 아래쪽으로). 막의 이동된 면에 존재하는 세포를 수동으로 계수하였으며 (웰당 세개의 무작위 200X 영역), 각 실험당 데이터 지점은 6개의 개별 웰로부터 이동된 세포의 평균 수를 나타내었다 (웰당 계수된 세개의 200X 영역).
도 32에 도시된 결과는 VEGF-165로 처리한 세포가 세포 이동 반응을 나타내었고, 이는 DMSO에 의한 추가 처리에 의해 약화되지 않았음을 나타내었다. Secin-H3에 의한 처리는 VEGF-165 유도된 세포 이동 반응을 약화시켰다.
실시예 27
GIT1 RNAi 는 VEGF 유도된 HMVEC 투과성을 증가시킨다: 도 34는 HMVEC 투과성 분석 (여기서, RNAi을 통한 GIT1의 발현에서의 감소가 VEGF 유도된 투과성을 증진시킬수 있는지와 관련된 의문점을 시험함)으로부터의 결과를 도해한다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 플레이팅하고, 대조군 siRNA 또는 GIT1 siRNA에 의해 형질감염시켰다. 각 siRNA 군을 분리하고, 세포의 반을 VEGF-165로 처리하였다. 도 34에 도시된 바와 같이, VEGF 유도된 투과성은 다른 세포에 비해 GIT1 siRNA 세포에서 증진되었다.
실시예 28
Secin - H3 는 Arf6 활성화, VEGF 유도된 내피 세포의 이동, OIR 및 CNV 모델에서 신생혈관 다발 형성, 및 VEGF -165로 인한 망막 과투과성을 억제한다: 본 발명자들은 내피 세포를 억제제 또는 비히클 대조군으로 전처리하고 Arf6 활성화 및 세포 이동 분석을 수행함으로써 VEGF 신호전달에 대한 SecinH3의 효과를 결정하였다. SecinH3은 VEGF-유도된 Arf6 활성화 및 VEGF-유도된 세포 이동 둘 모두를 방지하였다 (도 36 A, B). 다음으로, 본 발명자들은 SecinH3를 야생형 마우스의 눈에 주사하고, 이들 동물을 산소-유도 망막병증 (OIR), 레이저-유도 맥락막 혈관신생 (CNV) 및 VEGF-165-유도된 망막 투과성 분석에 적용하였다. SecinH3은 OIR (도 36 C, D) 및 CNV (도 36 E, F)에서의 신생혈관 다발 형성, VEGF-165로 인한 망막 과투과성 (도 36 G)을 억제하였으나 DMSO의 비히클 대조군은 그렇지 않았으므로, 이러한 병리학적 프로세스에서 Arf-GTPase의 주요 관련성을 실연한다.
산소-유도 망막병증: 요컨대, P7 새끼를 양육하는 어미와 함께 80％ 산소 (이는 프로-옥스(Pro-OX) 산소 조절기 (바이오스페릭스(BioSpherix))로 유지됨)에 두었다. 새끼를 P12 상에 제거하고, 21.6 μM의 최종 농도에서 SecinH3을 안내 주사하였다. 마우스를 P17 상에 희생시키고, 눈을 적출하고, 4％ 파라포름알데히드로 2시간 동안 고정시켰다. 이후, 망막을 절개하고, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488이 접합된 이소렉틴 1:50 (인비트로젠(Invitrogen))을 이용하여 밤새 염색하였다. 망막 플랫마운트를 생성시키고, 액시오버트(Axiovert) 200 형광 현미경검사 (칼 자이스(Carl Zeiss))를 이용하여 영상을 수득하였다. 액시오비젼(AxioVision) 소프트웨어 (칼 자이스)를 이용하여 혈관신생을 정량화하였다. 데이터는 14마리의 야생형 마우스의 평균±s.e.로 제시되었다.
레이저 유도 맥락막 혈관신생: 요컨대, 2-3개월령의 마우스를 아베르틴(Avertin) (2-2-2 트리브로모에탄올, 0.4 mg/g; 아크로스 오가닉스(Acros Organics))으로 마취시키고, 동공을 1％ 트로피카미드 (알콘(Alcon))로 확장시켰다. Slit 램프 전달 시스템이 있는 이리덱스 오큐라이트(Iridex OcuLight) GL 532 nm 레이저 광응고기 (이리덱스)를 사용하여, 하기의 파라미터로 3시, 6시 및 9시에서 시신경 원반으로부터 3-원반 직경의 화상 3개를 생성시켰다: 150 mW 파워, 75 ㎍ 반점 크기 및 0.1초 기간. 브루크 막의 파열을 가리키는 레이저 시점에서의 기포의 생산은 CNV를 수득하는데 있어서 중요한 인자이므로, 기포가 생산된 화상만이 이러한 연구에 포함되었다. 레이저 처리 직후 및 3일 후, 마우스에게 최종 농도 21.6 μM에서의 SecinH3을 유리체내에 주사하였다. 레이저 처리 1주일 후, 마우스를 희생시키고, 맥락막 플랫마운트를 생성시켰다. 알렉사 488 접합된 이소렉틴 (시그마(Sigma))을 사용하여 CNV를 염색하였다. 자이스 LSM 510 공초점 현미경 (칼 자이스)을 사용하여 플랫마운트를 시험하였고, ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 CNV를 정량하였다. 데이터는 적어도 15마리의 야생형 마우스의 평균±s.e.로 제시되었다.
망막 투과성: 망막 투과성을 기존에 기술된 바와 같이 평가하였다24. 요컨대, 8-10주령 마우스를 아베르틴 (2-2-2 트리브로모에탄올, 0.4 mg/g; 아크로스 오가닉스)으로 마취시켰다. 마우스에게 1.5 ㎕의 35.7 ㎍/㎖ VEGF-A (R＆D 시스템즈 인코퍼레이티드(R＆D Systems Inc.))와 2％ DMSO 중 216 μM의 SecinH3 (본 발명자들은 최종 농도가 21.6 μM이고, DMSO는 0.2％인 것으로 예상하였다) 또는 2％ DMSO (단독)를 안내 주사하였다. 6시간 후, 60 mg/㎖의 에반스 블루 용액 50 ㎕를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 2시간 후, 마우스를 희생시키고, 시트레이트-완충 포름알데히드를 관류시켜 정맥내 에반스 블루를 제거하였다. 눈을 적출하고, 망막을 절개하였다. 에반스 블루 염료를 18시간 동안 70℃에서 0.4 ㎖ 포름아미드에서 용출시켰다. 추출물을 5kD 필터를 통해 2시간 동안 초원심분리하였다. 흡광도를 620 nm에서 측정하였다. 배경 흡광도를 740 nm에서 측정하여 차감하였다. 데이터는 6마리의 야생형 마우스의 평균±s.e.로 제시된다.
실시예 29
Slit2 는 팍실린이 병소 부착에 동원되는 것을 차단한다: 팍실린의 세포내 분포에 대한 Robo4의 Slit 결찰의 효과를 평가하기 위해, 세포가 Slit2의 존재 또는 부재하에 피브로넥틴으로 코팅된 커버슬립에 부착되게 하고, 내생적 팍실린에 대해 염색하였다. Slit2 (모조물)의 부재하에, 전장 Robo4를 발현하는 HEK 세포는 정상적으로 확산되었고, 세포 표면 근처에 팍실린에 대해 염색된 풍부한 병소 부착을 형성하였다 (도 37A, 상부 패널). 대조적으로, Slit2 (Slit2N (서열 7)) 및 피브로넥틴 상에 플레이팅된 세포는 확산이 감소되었고, F-액틴에 대해 현저하게 덜 염색되었고, 훨씬 더 적고 더 소형인 팍실린-염색된 병소 부착을 형성하였다 (도 37A, 하부 패널). 피브로넥틴 및 Slit2 상에 부착된 대조군 HEK 세포 (Robo4를 발현하지 않음)는 피브로넥틴 (단독) 상의 부착에 비해 형태에서 차이를 나타내지 않았으며 (데이터는 제시되지 않음), 이는 Slit의 효과가 Robo4에 의존적임을 나타낸다.
본 발명자들은 Robo4를 내생적으로 발현하는 소 대동맥 내피 (BAE) 세포로 분석을 반복하였다. 피브로넥틴 및 Slit2 (Slit2N (서열 7))로 코팅된 기저 상에서, BAE 세포는 피브로넥틴 단독 (모조물)에 부착된 세포에 비해 확산의 감소를 나타내었으며, 이는 Slit2-Robo4 신호전달의 유사 억제 효과를 나타낸다 (도 37B). 피브로넥틴 및 Slit2에 부착된 BAE 세포는, 피브로넥틴-부착 세포의 성숙 병소 부착 (더 크고 연장되어 있음)과는 다른 소형 팍실린-염색된 구조물을 형성하였다 (도 37B). 세포 확산에 대한 Slit2의 억제 효과는 일시적인 것으로 나타났으며, Slit2의 존재 또는 부재하에 더 오랜 기간 동안 부착된 세포는 유사한 확산 정도 및 병소 부착 형성을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). Slit2가 Robo4에 대한 팍실린의 동원을 유도한다는 관찰 결과와 종합하여, 본 발명자들은, Robo4 결찰이 부착성 구조물로의 동원에 대한 팍실린의 이용가능성을 감소시킴으로써 세포 확산 및 이동을 감소시킴을 제시한다.
실시예 30
Slit2 는 세포 표면에 대해 팍실린을 동원한다: 본 발명자들의 데이터는 Robo4-발현 세포에서, Slit2 처리가 세포 표면 (여기서, 수용체에 의해 공동-국소화됨)에 대한 병소 부착으로부터 팍실린을 재분배시킴을 시사한다. 이러한 개념의 정확도를 결정하기 위해, 본 발명자들은 Slit2 단백질 (Slit2N (서열 7))의 존재 또는 부재하에 인큐베이션된 세포에서 팍실린 및 Robo4의 세포내 분포를 분석하였다. Slit2가 세포 확산을 차단하여 형질막의 선명한 시각화를 방해하기 때문에, 본 발명자들은 피브로넥틴 상에 미리 펼쳐놓은 내피 세포에서 상기 실험을 수행하였다. 모조물로 처리된 세포에서, 팍실린은 거의 오로지 병소 부착에서만 발견되었고, Robo4는 세포 표면에 국소화되었다 (도 37C, 상부 패널). Slit2로 처리된 세포에서, 팍실린의 유의한 부분은 세포 표면에서 나타났으며, Robo4에 의해 공동-국소화되었고; 국소화에서의 이러한 변화는 병소 부착에서 팍실린의 감소와 일치하였다 (도 37C, 하부 패널). 이러한 데이터는 Robo4의 Slit2 자극이 세포 표면 (여기서, Robo4에 대한 접근이 용이함)에 대한 병소 부착으로부터 팍실린을 재분배함을 나타낸다.
실시예 31
팍실린 상호작용 모티프 ( PIM )는 내피 세포에서 Slit2 신호전달을 위해 필요하다: 다음으로, 본 발명자들은 세포 확산의 Slit2-의존적 억제를 위해, Robo4에 팍실린이 결합하는 것의 필요성을 결정하였다. 본 발명자들은 내피 세포에서 Robo4ΔPIM 또는 LacZ를 발현시키고, Slit2 단백질 (Slit2N (서열 7))의 존재 또는 부재하에 피브로넥틴 상에서 확산 분석을 수행하였다. Robo4ΔPIM를 발현하는 세포 (GFP+)는 모조물 및 Slit2 상에서 동등하게 확산되었으나, 내생적 Robo4를 발현하는 형질감염되지 않은 세포 (GFP-)는 Slit2 상에서 현저하게 억제되었으나, 모조물 상에서는 그렇지 않았다 (도 38C 및 D). 이러한 데이터는 Robo4에 대한 팍실린 결합이 Slit2가 세포 돌출 활성을 조절하는데 필요함을 나타낸다.
실시예 32
Slit2 는 내피 세포에서 Rac 및 Arf6 의 활성화를 차단한다: 이러한 세포 생물학적 데이터는 내피 세포에서 Slit2-Robo4 신호전달이 인테그린 결찰에 반응하는 Rac 및 Arf6 활성화를 차단할 것임을 시사한다. 이러한 생각을 확증하기 위해, 본 발명자들은 피브로넥틴 및 Slit2 단백질 (Slit2N (서열 7))로 코팅된 접시 상에 내피 세포를 플레이팅하고, Rac-GTP 및 Arf6-GTP 수준을 분석하였다. HEK 및 CHO 세포로부터의 결과와 일관되게, Slit2는 Rac-GTP (도 38E) 및 Arf6-GTP (도 38F) 수준에서 피브로넥틴-유도된 증가를 효율적으로 차단하였다. 피브로넥틴 외에, 혈관형성 및 투과성-유도 인자 VEGF-165는 세포외 매트릭스의 성분으로서 생체내에 존재한다. Arf6 활성에 대한 VEGF-165 및 Slit2의 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 내피 세포를 두 단백질로 코팅된 접시 상에 플레이팅하고, Arf6-GTP 수준을 분석하였다. VEGF-165 (단독)는 Arf6을 활성화시켰나, Slit2의 첨가는 상기 활성화를 방해하였으며 (도 37D), 이는 Slit2가 세포외 매트릭스 단백질- 및 성장 인자-유도된 Arf6 활성화 둘 모두를 억제함을 실연한다.
Slit2에 의한 Rho 및 Cdc42의 조절에 대한 새로운 시각을 얻기 위해, 본 발명자들은 내피 세포를 Slit2 (Slit2N (서열 7))의 존재 또는 부재하에 피브로넥틴 상에 플레이팅하고, Rho-GTP 및 Cdc42-GTP 수준을 분석하였다. Rho 활성화는 Slit2에 의해 변화되지 않았으나, Cdc42 활성화는 유의하게 감소되었다 (도 39). Cdc42에 대한 Slit2의 효과는 다소 놀랍게도, Robo4가 Robo1 결합-단백질 srGAP1 (Cdc42에 대한 공지된 GTPase 활성화 단백질)과 상호작용하지 않음을 나타내었다 (도 39).
재료 및 방법
시약: HEK 293 및 COS-7 세포, 및 모든 IMAGE 클론은 ATCC로부터의 것이었다. SP6 및 T7 메세지 머신(Message Machine) 키트는 앰비온으로부터의 것이었다. HUVEC, EBM-2 및 불렛(bullet) 키트는 캠브렉스(Cambrex)로부터의 것이었다. 효모 2-하이브리드 플라스미드 및 시약은 클론테크(Clontech)로부터의 것이었다. FBS는 하이클론(Hyclone)으로부터의 것이었다. 항-HA 친화성 매트릭스, Fugene6 및 프로테아제 억제제 칵테일은 로슈(Roche)로부터의 것이었다. 염소 항-마우스-HRP 및 염소 항-토끼-HRP 2차 항체는 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)로부터의 것이었다. 항-V5 항체, DAPI, DMEM, 리포펙트아민 2000, 페니실린-스트렙토마이신, 수퍼스크립트 III 키트, 트리졸 및 TrypLE 익스프레스(Express)는 인비트로젠으로부터의 것이었다. 항-Flag M2, 포스파타제 억제제 칵테일, 대두 트립신 억제제 및 지방산-무함유 소 혈청 알부민 (BSA)은 시그마로부터의 것이었다. 인간 피브로넥틴은 바이오메디컬 테크놀로지스 및 인비트로젠으로부터의 것이었다. 코스타 트랜스웰(Costar Transwell) 및 아미콘 울트라-15(Amicon Ultra-15) 농축기 컬럼은 피셔(Fisher)로부터의 것이었다. 로제타2(Rosetta2) 이. 콜라이는 노바젠(Novagen)으로부터의 것이었다. 글루타티온-세파로스 4B, 어버이 pGEX-4T1 및 ECL PLUS는 아머샴-파마시아(Amersham-Pharmacia)로부터의 것이었다. 쿠마시 블루 및 PVDF는 바이오래드(BioRad)로부터의 것이었다. 퀵 체인지(Quick Change) 부위-지정 돌연변이유발 키트는 스트라타진(Stratagene)으로부터의 것이었다. 노말 래트(Normal Rat) IgG아가로스 접합체는 산타 크루즈(Santa Cruz)로부터의 것이었다. Robo4 모르폴리노는 진 툴즈(Gene Tools)로부터의 것이었다. PCR용 올리고뉴클레오티드는 유타 코어 퍼실러티 대학(University of Utah Core Facility)으로부터의 것이었다. 알렉사564-팔로이딘, 항-GFP 및 염소 항-토끼 알렉스488은 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes)로부터의 것이었다. 저융점 아가로스는 누시브(NuSieve)로부터의 것이었다. T7 생체내 전사/번역 키트는 프로메가(Promega)로부터의 것이었다.
분자 생물학: Robo4-HA, Slit2-Myc-His 및 닭 팍실린 플라스미드는 기존에 기술되어 있다 ([Park et al., 2003]; [Nishiya et al., 2005]). Robo4-NH2가 Robo4-HA로부터 증폭되어, pcDNA3-HA의 EcoRV/NotI 내로 클로닝되었다. Robo4-COOH가 Robo4-HA로부터 중복-확장 PCR에 의해 증폭되어, pcDNA3-HA의 EcoRV/NotI 내로 클로닝되었다. 인간 Robo4 세포질 꼬리의 아미노 말단 절반 (AA 465-723)이 PCR에 의해 증폭되어, pGBKT7의 (EcoRI/BamHI) 내로 클로닝되었다. 뮤린 Robo4 단편이 PCR에 의해 증폭되어, pGEX-4T1의 BamHI/EcoRI 내로 클로닝되었다. 뮤린 Hic-5, 메나 및 팍실린 (결실물 포함)이 IMAGE 클론으로부터 PCR에 의해 증폭되어, pcDNA3-V5의 EcoRV/NotI 내로 클로닝되었다. GST-Robo4ΔPIM 및 전장 Robo4ΔPIM이 퀵 체인지를 사용하여 관련된 야생형 구축물의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생성되었다. 모든 구축물의 통합성이 유타 코어 퍼실러티 대학에서 서열분석에 의해 입증되었다.
배아 배양 및 지브라피쉬 스톡: 지브라피쉬 다니오 레리오를 표준 방법에 따라 유지시켰다 ([Westerfield, 2000]). 28.5℃에서 양식된 배아의 표준 형태학적 특색을 사용하여 발달 단계결정을 수행하였다 ([Kimmel et al., 1995]). 이러한 연구에서 사용된 Tg ( fli1 : EGFP ) y1 트랜스제닉 지브라피쉬 계통이 문헌 [Lawson and Weinstein, 2002]에 기술되어 있다. 영상화된 배아를 24 hpf 후에 0.2 mM 1-페닐-2-티오-우레아 (PTU)로 처리하여, 색소 형성을 방지하였다.
robo4 의 안티센스 결핍: robo4 (5'-tttttagcgtacctatgagcagtt-3', 서열 28)의 엑손 10/인트론 10 스플라이스 부위에 대해 지시된 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (MO)들을 각각 5 ng/nl의 농도로 1× Danieau 완충제에 용해시켰다. 주입 전에, 모르폴리노를 65℃에서 5분 동안 가열하고, 간략하게 냉각시키고, 주입 효율을 모니터링하기 위한 무시할만한 양의 염료와 혼합하고, 약 1 nl을 세포 1-2개 단계의 배아의 유동 난황 내로 주입하였다.
역전사 ( RT ) PCR: 20개의 미주입 배아 및 20개의 robo4 MO-주입 배아로부터 트리졸, 시약을 사용하여 RNA를 추출하였고, 이어지는 cDNA 합성을 무작위 6량체 및 올리고 dT 프라이머 양쪽 모두의 혼합물로 프라이밍된 수퍼스크립트 III를 사용하여 수행하였다. (94℃에서 4', 94℃에서 30", 58℃에서 30", 68℃에서 45", 68℃에서 1')의 파라미터를 사용하여 엑손 8 내의 전방향 프라이머 (5'- caacaccagacacttacgagtgcc-3', 서열 29) 및 엑손 12 내의 역방향 프라이머 (5'- ttcgaaggccagaattctcctggc-3', 서열 30)로의 PCR에 의해 cDNA로부터 robo4가 증폭되었다. PCR 반응의 선형 범위를 확인하기 위해, cDNA를 23, 25, 27 및 30 사이클 동안 증폭시켰다. cDNA 입력을 제어하기 위해 모든 샘플로부터 β-액틴을 전방향 프라이머 (5'-cccaaggccaacagggaaaa, 서열 31) 및 역방향 프라이머 (5'- ggtgcccatctcctgctcaa-3', 서열 32)를 사용하여 증폭시켰다.
전체-마운트 간접 면역형광: 간략하게, 연령이 매칭된 24 및 48 hpf 배아들에서 융모막을 제거하고, 4％ PFA/4％ 수크로스/PBS에서 하룻밤 동안 4℃에서 고정시켰다. 그후, 배아를 PBS/0.1％ 트윈-20에서 세정하고, 무수 메탄올로 탈수시키고, PBS-트윈 20으로 재수화시키고, 추가로 PBS/1％ 트리톤-X에서 투과성이도록 만들고, PBS/1％ 트리톤-X/2％ BSA에서 세정하고, 실온에서 PBS/1％ 트리톤-X/2％ BSA/10％ 양 혈청/1％ DMSO에서 차단시킨 후, 하룻밤 동안 4℃에서 차단 용액 내의 IgG 정제된 항-GFP (1:400)에서 인큐베이션하였다. 다음날, 배아를 PBS/1％ 트리톤-X/2％ BSA에서 강하게 세정한 후, 하룻밤 동안 4℃에서 차단 용액 내의 염소-항-토끼 알렉사 488이 접합된 2차 항체 (1:200)에서 인큐베이션하였다. 다음날, 배아를 PBS/1％ 트리톤-X/2％ BSA에서 광범위하게 세정한 후, PBS 내의 1％ 저융점 아가로스에 매립하고, 라이카(Leica) 공초점 현미경에서 촬영하고, 어도비(Adobe) 포토샵 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하였다.
세포 배양: HEK 293 및 COS-7 세포를 10％ FBS 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 인간 미세혈관 내피 세포 (HMVEC)를 EGM-2MV에서 배양하고, 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 10％ FBS가 보충된 EGM-2에서 배양하였다. 일상적으로 계대 2 내지 5 사이에서 EC를 사용하였다.
형질감염: HEK293 및 COS-7 세포를 Fugene6 또는 리포펙트아민2000으로 제조업자의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다.
농축된 Slit2 단백질의 제조: COS-7 세포를 빈 pSECTAG2 또는 pSECTAG2::hSlit2으로 일시적으로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 PBS로 2회 세정하고, 6 ㎖ 염 추출 완충제 (10 mM HEPES, pH 7.5, 1 M NaCl 및 1× 프로테아제 억제제)와 함께 15분 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 염 추출을 반복하고, 샘플을 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여, 세포 잔해물을 펠렛화시켰다. 상층액을 아미콘 울트라-15 농축기 컬럼/100 kDa 컷오프(cutoff) 상에 로딩하고, 12 ㎖의 염 추출물이 약 500 ㎕로 감소될 때까지 원심분리하였다. 농축된 단백질 제제를 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하고, 40℃에서 1주일까지 보관하였다. 이러한 프로토콜을 사용하여, 20-50 ㎍/㎖의 Slit2 농축물이 일상적으로 수득되었다. Slit2 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 농축된 단백질을 제조하는 것에 더하여, 빈 벡터 (pSECTAG2)로 형질감염된 세포에서 동일한 프로토콜을 수행하였다. 이렇게 생성된 제제를 "모조물" 제제로 지칭하였고, 이는 Slit2의 효과를 분석하는 모든 실험에서 대조군으로 사용되었다.
접촉주성 이동 분석법: 세포를 TrypLE 익스프레스로 조직 배양 접시로부터 제거하고, DMEM 또는 EBM-2 내의 0.1％ 트립신 억제제, 0.2％ 지방산-무함유 BSA로 1회, 관련 배지 내의 0.2％ BSA로 2회 세정하였다. 세정된 세포를 카운팅하고, 0.3×105 개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 1.5×105 개를 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴으로 하부 표면 상에서 예비 코팅된 12μm 코스타 트랜스웰의 상부 챔버 내로 로딩하였다. 0.5 ㎍/㎖ Slit2 또는 등가량의 모조물 제제를 공동-코팅함으로써 접촉주성에 대한 Slit2의 효과를 분석하였다. 6시간 동안 세포 이동이 진행되도록 한 후, 트랜스웰의 상부 표면 상의 세포를 면봉으로 제거하였다. 하부 표면 상의 세포를 4％ 포름알데히드로 5분 동안 고정시키고, PBS로 3회 세정하였다. HEK 293 세포에 대해, 하부 표면 상의 GFP-양성 세포 (HEK 293)의 개수를 도립 형광 현미경 상에서 6개의 10× 영역을 계수함으로써 계산하였다. 피브로넥틴/모조물-코팅 막 상의 이동된 세포의 개수가 데이터 제시 및 이어지는 통계학적 분석을 위해 100％로 간주되었다.
효모 2- 하이브리드 분석법: pGBKT7::hRobo4 465-723을 효모 균주 PJ694A 내로 형질전환시켜, PJ694A-Robo4를 생성시켰다. 인간 대동맥 cDNA 라이브러리를 프레이(prey) 플라스미드 pACT2 내로 클로닝하고, PJ694A-Robo4 내로 형질전환시켰다. 공동-형질전환된 효모 균주를 형질전환 효율을 분석하기 위한 SD-Leu-Trp (-LT) 및 추정 상호작용 단백질을 확인하기 위한 SD-Leu-Trp-His-Ade (-LTHA) 상에 플레이팅하였다. 그후, SD-LTHA 상에서 성장할 수 있는 효모 균주를 필터 리프트(lift) 분석법에 의해 β-갈락토시다제의 발현에 대해 테스트하였다. SD-LTHA 상에서 성장할 수 있고 β-갈락토시다제를 발현할 수 있는 효모 군주로부터 프레이(Prey) 플라스미드를 단리하여, 유타 코어 퍼실러티 대학에서 서열분석하였다.
면역침전: 세포 용해물을 50 mM 트리스-Cl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5％ 트리톤 X-100, 포스파타제 및 프로테아제 억제제에서 제조하고, 14K에서 20분 동안 원심분리하여, 불용성 물질을 펠렛화시키고, 아가로스 비드에 커플링된 정상 IgG로 60분 동안 청정화시키고, 2시간 동안 4℃에서 아가로스 비드에 커플링된 관련 항체와 함께 인큐베이션하였다. 침전물을 용해 완충제에서 광범위하게 세척하고, 2× 샘플 완충제 (125 mM 트리스-Cl, pH 6.8, 4％ SDS, 20％ 글리세롤, 0.04％ 브로모페놀 블루 및 1.4 M 2-메르캅토에탄올)에 재현탁시켰다.
GST 풀-다운 분석법: pGEX-4T1::mRobo4를 보유하는 로제타2 이. 콜라이를 0.6의 OD600으로 성장시키고, 0.3 mM IPTG로 유도하였다. 30℃, 220 rpm에서 3-4 시간 후, 20 mM 트리스-Cl pH 7.4, 1％ 트리톤 X-100, 1 ㎍/㎖ 라이소자임, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제에서의 초음파처리에 의해 세포를 용해시켰다. GST-융합 단백질을 글루타티온-세파로스 4B 상에서 포획하고, 라이소자임이 없는 용해 완충제로 1회 세정한 후, 결합/세정 완충제 (50 mM 트리스-Cl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1％ 트리톤 X-100, 0.1％ BSA 및 프로테아제 억제제)로 2회 세정하였다. GST-융합 단백질을 60 nM의 정제된 재조합 팍실린과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고, 결합/세척 완충제로 광범위하게 세척하고, 2× 샘플 완충제에 재현탁시켰다.
웨스턴 블롯팅: 면역침전물 및 GST-융합 단백질을 2분 동안 100℃에서 인큐베이션하고, SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리하고, 폴리비닐디플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. PVDF 막을 PBS + 0.1％ 트윈20 (PBST) 내의 5％ 무지방 분유 (PBST-M)와 함께 60분 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 차단된 막을 PBST-M 내의 1차 항체 (1:2000의 항-Flag M2; 1:10,000의 항-HA; 1:500의 항-Hic-5; 1:10,000의 항-팍실린; 1:1,000의 항-Rac 및 1:500의 항-Cdc42)와 함께 60분 동안 25℃에서 또는 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 막을 PBST에서 3×10분 동안 세척한 후, 2차 항체 (1:10,000의 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 양고추냉이 과산화효소)와 함께 60분 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 막을 PBST에서 3×10분 동안 세척하고, ECL PLUS로 시각화하였다.
시험관내 전사/번역: 메나-V5를 T7 퀵 커플드(Quick Coupled) 시험관내 전사/번역 시스템으로 제조업자의 프로토콜에 따라 합성하였다.
확산 분석법: 세포를 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 또는 일부 예에서 나타낸 경우 30 ㎍/㎖ 피브로넥틴의 9-11 단편으로 코팅된 커버슬립 상에 플레이팅하였다. 5％ CO2 및 37℃에서 30분 인큐베이션시킨 후, 세포를 빙냉 PBS로 3회 세척하고, 3.7％ 포름알데히드로 10분 동안 실온에서 고정시켰다. 그후, 세포를 0.2％ 트리톤 X-100으로 3분 동안 투과성이게 만들고, PBS + 0.1％ 트윈20 (PBST)으로 3회 세척하고, 10 ㎍/㎖ 로다민-팔로이딘과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. PBS-T에서 3회 더 세정한 후, 커버슬립을 프로-롱 골드(Pro-Long Gold)에 마운팅하고, 공초점 현미경검사에 의해 분석하였다. 3회의 독립적인 실험에서 150개 이상의 세포의 전체 면적을 Image J를 사용하여 결정하였다.
팍실린의 siRNA - 매개된 녹다운: HEK 293 세포를 리포펙트아민 2000을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 100 nM siRNA 듀플렉스 (5'-CCCUGACGAAAGAGAAGCCUAUU-3', 서열 19 및 5'-UAGGCUUCUCUUUCGUCAGGGUU-3')로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 생화학적 분석 또는 세포 확산 분석법에 대해 프로세싱하였다. siRNA 표적 부위 내에 뉴클레오티드 서열 5'-CCCCTACAAAAGAAAAACCAA-3'이 있는 닭 팍실린을 코딩하는 발현 벡터로의 형질감염에 의해 팍실린 재구성이 달성되었다. 팍실린 항체로의 웨스턴 블롯팅에 의해 녹다운 및 재구성이 시각화되었고, 농도계측법에 의해 정량되었다.
Rac 및 Cdc42 활성화 분석법: 세포를 세포 배양 접시로부터 떼어내고, DMEM + 0.2％ BSA에서 1시간 동안 현탁액으로 유지시키고, 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴으로 코팅된 박테리아 페트리접시 상에 5분 동안 플레이팅하였다. 그후, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세정하고, 50 mM 트리스 pH 7.0, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.5％ NP-40, 1× 프로테아제 억제제, 1× 포스파타제 억제제 및 20 ㎍/㎖ GST-PBD에서 용해시켰다. 용해물을 5분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하고, 상층액을 30 ㎕의 글루타티온 아가로스와 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 용해 완충제로의 3회 세척 후, 결합된 단백질을 2× 샘플 완충제로 용출시켰다. Rac 및 Cdc42를 각각의 단백질에 특이적인 항체로의 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다. Rac 활성화 수준을 전체 Rac에 대해 표준화하였고, 각각의 실험에서 가장 높은 값에 1의 값을 할당하였다.
Robo4 AP / AP 마우스의 생성 및 유전자형 결정: Robo4 표적화 벡터를 배아 줄기 (ES) 세포 내로 전기천공시켰다. 표적화된 대립유전자에 대해 이종접합성인 ES 세포를 주머니배 내로 주입한 후, 가임신 암컷 내로 옮겼다. 아구티(agouti) 색상의 존재에 의해 키메라 수컷이 확인되었고, 이를 ES-세포 유래 자손을 생산하도록 C57BL/6 암컷과 교배시켰다. 꼬리 DNA의 서던 블롯 분석에 의해 유전자형을 확인하였다. 귀 펀치 또는 꼬리 샘플로부터의 게놈 DNA를 하기의 조건 하의 PCR 유전자형 결정에 사용하였다; 94℃에서 30초 동안의 변성, 60℃에서 30초 동안의 어닐링, 72℃에서 60초 동안의 확장, 40 사이클. 5' cccttcacagacagactctcgtatttcc 3' (전방향) 및 5'cccagacctacattaccttttgccg 3' (역방향)의 2개의 프라이머가 Robo4의 유전자형 결정에 사용되었고, AP에 대해서는 5' ggcaacttccagaccattggcttg 3' (전방향) 및 5' ggttaccactcccactgacttccctg 3' (역방향)이 사용되었다.
배아 및 발현 분석: 배아의 단계결정, 원위치 혼성화, 파라핀 절편화, 및 전체-마운트 PECAM-I 면역조직화학을 수행하였다. 노던 블롯 분석을 위해, TRIZOL로의 단리 후 레인 당 20 ㎍의 전체 RNA를 로딩하였다. 프라임-잇(Prime-It) II 무작위-프라이머 표지 키트 (스트라타진)를 사용하여 32P-표지 프로브가 생성되었다. 폐 용해물을 용해 완충제 [1％ NP-40, 150 mM NaCl, 50 mM 트리스-Cl (pH 7.5), 1 mM EDTA 및 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈)]로 제조하였다. 기존에 기술된 바와 같은 폴리클로날 항-Robo4 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 폐 용해물로부터의 Robo4 단백질이 검출되었다.
알칼리성 포스파타제 ( AP ) 염색: 배아 또는 조직을 하룻밤 동안 4℃에서 교반하면서 PBS 내의 4％ 파라포름알데히드 및 2 mM MgCl2에 고정시켰다. 샘플을 15분 동안 PBST (PBS, 0.5％ 트윈 20)에서 3회 세척하였다. 내생적 알칼리성 포스파타제를 PBS + 2 mM MgCl2에서 65℃에서 90분 동안 불활성화시킨 후, AP 완충제 (100 mM 트리스-Cl, pH9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 0.1％ 트윈 20, 2 mM 레바미솔(Levamisole))로 15분 동안 2회 세척하였다. 배아(베링거 만하임(Boehringer Mannheim)에 대해 BM 자주색 기질 (베링거 만하임)에서, 또는 성체 조직에 대해 NBT/BCIP에서 염색을 수행하였다. PBS + 5 mM EDTA에서 염색을 정지시켰다.
AP 염색 후의 전체 마운트 면역조직화학: 고정 및 절개된 망막 상에서의 알칼리성 포스파타제 (AP) 염색을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. PBS-5mM EDTA에서 염색을 정지시켰다. 망막을 PBS에서 2회 세척하고, 5분 동안 4％ 파라포름알데히드, 포스페이트-완충 식염수에서 실온에서 후-고정시킨 후, PBS에서 2회 세척하였다. PBlec (PBS, pH 6.8, 1％ 트리톤-X100, 0.1 mM CaCl, 0.1 mM MgCl, 0.1 mM MnCl)에서 2시간 인큐베이션한 후, 망막을 항체와 함께 4℃에서 인큐베이션하였다. 혈관주위세포를 토끼 항-NG2 항체 (1:200; 케미콘)를 사용하여 표지하고, 내피 세포를 래트 항-엔도뮤신 (디트마르 베스트웨버(Dietmar Vestweber)에서 친절하게 제공한 클론 V.7C7; 1:20 희석)을 사용하여 표지하였다. PBS-T (PBS, pH 7.4, 1％ 트리톤-X100)에서 3회 세척 후, 샘플을 PBS 내의 적합한 플루오로크롬 (알렉사 플루오르 488 또는 568 (몰레큘러 프로브즈; 인비트로젠))이 접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세척 및 4％ PFA에서의 간략한 후-고정 후, Mowiol/DABCO (시그마-알드리치)를 사용하여 망막을 편평하게 마운팅하고, 커버슬립을 덮었다. 자이스 액시오캠(Axiocam) HRc 디지털 카메라가 장착된 자이스 스트레오마이크로스코프 스테미 SV 11 바이오쿼드(Stereomicroscope Stemi SV 11 Bioquad)를 사용한 통상적인 광학 및 형광 현미경검사, 및 자이스 LSM 메타(Meta) 510을 사용한 공초점 레이저 스캐닝 현미경검사에 의해 샘플을 분석하였다. 633 nm HeNe 레이저 및 반사 셋팅을 사용하여 AP 염색을 시각화하였다. 볼로서티(Volocity) (4.0 임프로비젼(Improvision))을 사용하여 디지털 영상을 프로세싱하고, 어도비 포토샵 CS2에서 편집하였다.
면역조직화학: 전체-마운트 삼중 면역형광 공초점 현미경검사를 수행하였다. 간략하게, PECAM, NP1, CX40, 2H3, BFABP 및 αSMA에 대한 항체를 사용하여, E15.5에서 Robo4 +/+ 또는 Robo4 -/- 배아의 팔다리 피부를 표지하였다.
Robo4 발현 HEK 세포에 대한 Robo4 작동제의 결합 및 활성: Robo4-HA를 발현하는 안정적인 세포주 (Robo4-HEK), 또는 pcDNA3 벡터 단독 (대조군-HEK)을 100 ㎍/㎖ 폴리-L-라이신으로 예비코팅된 6-웰 배양 접시에 시딩하였다. 세포를 HEK CM 또는 Slit-myc CM과 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 조건화 배지와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBS에서 3회 세척하고, 세포를 4％ 파라포름알데히드에 20분 동안 고정시켰다. 그후, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 마우스 항-myc 항체 (산타 크루즈 바이오테크) 및 항-마우스 알렉사 594-접합 2차 항체 (몰레큘러 프로브즈)와 함께 인큐베이션하였다. Robo4에 결합하여 이동을 억제하는 이러한 작동제의 능력이 [Park KW, Morrison CM, Sorensen LK, et al., "Robo4 is a vascular-specific receptor that inhibits endothelial migration", Dev Biol 2003;261(1):251-67]에 따라 수행되었다.
뮤린 폐 내피 세포의 단리: 양 항-래트 IgG 다이날(Dynal) 비드 (다이날 바이오테크(Dynal Biotech))를 비드 100 ㎕ 당 항체 5 ㎍으로 항-PECAM-1 또는 항-ICAM-2 모노클로날 항체 (BD 팜인젠(BD Pharmingen))와 접합시켰다. 비드를 예비코팅하고, 2주까지 4℃에서 보관하였다 (PBS + 0.1％ BSA 1 ㎖ 당 4×108 개의 비드). 3마리의 성체 마우스로부터의 폐를 수확하였다. 가시적인 기관지 및 세로칸 연결 조직으로부터 폐엽을 절개하였다. 폐를 50 ㎖ 저온 단리 배지 (20％ FBS-DMEM)에서 세척하여, 적혈구를 제거하고, 가위로 잘게 썰고, 부드럽게 진탕시키면서 37℃에서 25 ㎖의 미리 가온된 콜라게나제 (2 ㎎/㎖, 워싱튼(Worthington))에서 45분 동안 분해하였다. 분해된 조직을 14게이지 금속 캐뉼러에 부착된 60 cc 주사기에 12회 분쇄시킴으로써 해리시킨 후, 무균성 70μm 1회용 세포 거르개 (팔콘(Falcon))로 여과하였다. 현탁액을 400×g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 2 ㎖ 저온 PBS에 재현탁시킨 후, 실온에서 10분 동안 PECAM-I 코팅 비드 (세포 1 ㎖ 당 15 ㎕)와 함께 인큐베이션하였다. 마그네틱 분리기를 사용하여, 비드에 결합된 세포를 회수하였고, 이를 단리 배지에서 세척한 후, 완전 배지 (EGM-2 MV, 론자(Lonza))에 재현탁시켰다. 세포를 1개의 피브로넥틴-코팅 75 ㎠ 조직 배양 플라스크 내에 플레이팅하고, 하룻밤 동안의 인큐베이션 후 비-부착성 세포를 제거하였다. 부착성 세포를 PBS로 세척하고, 15 ㎖의 완전 배지를 첨가하였다. 배양된 세포에 격일로 완전 배지를 공급하였다. 배양물이 70 내지 80％ 전면성장에 도달했을 때, 이를 트립신-EDTA로 떼어내고, 2 ㎖ PBS에 재현탁시키고, ICAM-2 접합 비드 (세포 1 ㎖ 당 15 ㎕)를 사용하여 2차로 분류하였다. 상기와 같이 세포를 세척하고 플레이팅하였다. 계대 2 내지 5가 기능적 분석법에 사용되었다.
세포 배양: 인간 진피 미세혈관 내피 세포 (HMVEC, 캠브렉스)가 EGM-2 MV에서 성장되었고, 계대 3 내지 6에서 사용되었다.
면역세포화학: 세포를 플레이팅하기 2시간 전에 8웰 챔버 슬라이드 (랩-텍(Lab-Tek))를 1.5 ㎍/㎠ 피브로넥틴으로 코팅하였다. 뮤린 폐 내피 세포를 완전 배지 EGM-2 MV에서 하룻밤 동안 37℃에서 플레이팅하였다 (100,000개의 세포/웰). 그후, 세포를 PBS에서 3회 세척하고, 4％ 파라포름알데히드에서 10분 동안 실온에서 고정하였다. PBS에서 추가적으로 3회 세척한 후, 세포를 PBS 내의 1％ 트리톤 X-100에서 15분 동안 실온에서 세척하고 나서, PBST (PBS 내의 0.1％ 트리톤 X-100)에서 3회 세척하였다. 그후, 세포를 PBS 내의 2％ BSA에서 20분 동안 실온에서 차단하고, 2％ BSA 내의 1차 항체 (래트 항-PEC AM-I (파미젠(Pharmigen)), 토끼 항-폰 빌레브란트(Von Willebrand) 인자 (vWF) (DAKO))와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 1차 항체와의 인큐베이션 후, 세포를 PBST로 세척하고, 2％ BSA 내의 2차 항체 (알렉사 플루오르 488 당나귀 항-래트 IgG 및 알렉사 플루오르 594 당나귀 항-토끼 IgG (몰레큘러 프로브즈))와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBST에서 1회, PBS에서 1회 세척하고, 벡타쉴드(Vectashield) 마운팅 배지 (벡터 래브러토리즈(Vector Laboratories))에 마운팅하고, 공초점 현미경검사로 촬영하였다.
형광-활성화 세포 분류 ( FACS ): 뮤린 폐 내피 세포를 37℃에서 간략한 트립신처리 (2분 이하)에 의해 배양 접시로부터 떼어냈다. EBM-2 + 0.1％ BSA 내의 트립신 억제제의 첨가에 의해 단백질분해를 정지시켰다. 세포를 FACS 완충제 (Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS + 0.1％ BSA)에서 2회 세척한 후, 1 ㎖ FACS 완충제에 재현탁시켰다. 세포 표면 마커의 발현 분석을 2단계 면역형광 염색으로 수행하였다. 세포를 30분 동안 4℃에서 정제된 모노클로날 항체 (래트항-PECAM -1, 토끼 항-vWF)와 함께 인큐베이션하였다. 그후, 세포를 FACS 완충제에서 2회 세척하고, 1 ㎖ FACS 완충제에 재현탁시켰다. 그후, 세포를 30분 동안 4℃에서 형광 2차 항체 (알렉사 플루오르 488 당나귀 항-래트 IgG 및 알렉사 플루오르 594 당나귀 항-토끼 IgG (몰레큘러 프로브즈))와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 다시 2회 세척하고, 1 ㎖ FACS 완충제에 재현탁시키고, FACS로 분석하였다.
세포 이동 분석법: 세포를 셀트래커 그린(CellTracker Green) CMFDA (몰레큘러 프로브즈)로 1시간 동안 표지하고, 세척한 후, 하룻밤 동안 0.1％ BSA가 보충된 EBM-2에서 고갈시켰다. 세포를 트립신처리하고, 세척하고, 300,000개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 100 ㎕의 세포 현탁액 (30,000개의 세포)을 5 ㎍/㎖ 인간 피브로넥틴으로 양쪽 면에서 미리 코팅된 8-μm HTS 플루오로블록(FluoroBlock) 필터 (BD Falcon(BD 팔콘)) 상에 로딩하였다. 테스트 인자를 EBM-2/0.1％ BSA에서 희석하고, 하부 챔버 내에 놓았다. 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 웰로부터의 2개의 5× 영역을 도립 형광 현미경 (액시오버트 200) 상에서 촬영하였다. 형광 세포를 카운팅함으로써 이동된 세포의 개수를 계산하였다. Robo4 +/+ 세포의 기본적인 이동을 1로 설정하였다. 데이터는 3회의 독립적인 3중 실험의 평균±S.E.로 제시된다.
관 형성 분석법: 관 형성이 기존에 기술된 바와 같이 수행되었다5. 간략하게, Robo4 +/+ 및 Robo4 AP / AP 마우스로부터 단리된 폐 내피 세포를 48-웰 접시의 매트리젤-코팅 웰 상에 플레이팅하고, 0.5％ 혈청에서 하룻밤 동안 고갈시켰다. 그후, 세포를 3.5시간 동안 Slit2의 부재 또는 존재 하에 0.48 nM VEGF-A로 자극하고, 촬영하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평균 관 길이를 결정하였다. 데이터는 3회의 독립적인 2중 실험의 평균±S.E.로 제시된다.
시험관내 투과성 분석법: Robo4 +/+ 및 Robo4 AP / AP 마우스로부터 단리된 폐 내피 세포 (EC)를 1.5 ㎍/㎠ 인간 피브로넥틴으로 예비-코팅된 3.0 ㎛ 코스타 트랜스웰 상에 플레이팅하고, 전면성장까지 성장시켰다. 세포를 하룻밤 동안 고갈시키고, 0.3 nM Slit2로 30-60분 동안 예비처리한 후, 2.4 nM VEGF-A로 3.5시간 동안 자극하였다. 양고추냉이 과산화효소 (HRP)를 100 ㎍/㎖의 최종 농도로 최상부 챔버에 첨가하고, 30분 후에 하부 챔버로부터 배지를 제거하였다. 분취량을 0.5 mM 구아이아콜, 50 mM Na2HPO4 및 0.6 mM H202와 함께 인큐베이션하고, 470 nm에서의 흡광도 측정에 의해 O-페닐렌디아민의 형성을 결정하였다. 단층의 기본적인 투과성을 100％로 설정하였다. 데이터는 3회의 독립적인 3중 실험의 평균±S.E.로 제시된다.
VEGF -유도 망막 투과성: 간략하게, 8-10주령 마우스를 아베르틴 (2-2-2 트리브로모에탄올, 0.4 mg/g; 아크로스 오가닉스 (미국 뉴저지주 모리스 플레인즈 소재))으로 마취시켰다. 마우스에게 1.4 ㎕의 35.7 ㎍/㎖ VEGF-A (R＆D 시스템즈 인코퍼레이티드; 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재))를 50 ng의 Slit2N (서열 39)와 함께 안내 주사하였다. 등가의 부피의 모조물 제제를 반대쪽 눈에 주사하였다. 지시된 바와 같이, 또다른 조건의 1.4 ㎕의 식염수, 모조물 제제 또는 Slit을 투여하였다. 6시간 후, 마우스에게 60 mg/㎖의 에반스 블루 50 ㎕를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 2시간 후, 마우스를 희생시키고, 시트레이트-완충 파라-포름알데히드를 관류시켜 정맥내 에반스 블루를 제거하였다. 눈을 적출하고, 망막을 절개하였다. 에반스 블루 염료를 18시간 동안 70℃에서 0.3 ㎖ 포름아미드에서 용출시켰다. 추출물을 5kD 필터를 통해 2시간 동안 초원심분리하였다. 흡광도를 620 nm에서 측정하였다. 배경 흡광도를 740 nm에서 측정하여 차감하였다.
Robo4 의 아데노바이러스 발현: Robo4가 기존에 기술된 바와 같이 아데노바이러스를 통해 발현되었다.
마일즈 분석법: 에반스 블루를 6-8주령 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하고, 30분 후, 100 ng의 Slit2의 부재 또는 존재 하의 10 ng의 VEGF-A 또는 식염수를 진피 내로 주사하였다. 추가로 30분 후, 펀치 생검을 수행하고, 에반스 블루를 18시간 동안 60℃에서 포름아미드에서 진피 조직으로부터 용출시켰다. 원심분리 후, 흡광도를 620 nm에서 측정하였다. 식염수가 주사된 동물에서 관찰된 진피 투과성의 양을 1로 설정하였다. 데이터는 각각 2중으로 처리된 5마리의 개별적인 마우스의 평균±S.E.로 제시된다 (동물 당 총 6회의 주사).
생화학적 분석법: HMVEC를 피브로넥틴-코팅 접시 상에서 전면성장까지 성장시키고, 하룻밤 동안 EBM-2 + 0.2％ BSA에서 고갈시켰다. 다음날, 세포를 50 ng/㎖ VEGF-A로 5분 동안 자극하고, 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 50 mM 트리스 pH 7.4, 150 mM NaCl, 10mM MgCl2, 1 mM DTT, 10％ 글리세롤, 1％ NP-40, 0.5％ 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1％ SDS, 1× 프로테아제 억제제, 1× 포스파타제 억제제에서 용해시켰다. 용해물을 2× 샘플 완충제와 합치고, SDS-PAGE에 의해 분리하고, 1:1000으로 포스포-VEGFR2, 포스포-p42/44 및 포스포-Src에 대한 항체 (셀 시그널링(Cell Signaling))에 프로빙하였다. Rac 활성화 분석법을 위해, 조질의 막 프렙을 생성시키고9, GTP-Rac를 20 ㎍/㎖ GST-PBD로 침전시켰다. 용해 완충제로의 3회의 세척 후, 결합된 단백질을 2× 샘플 완충제로 용출시켰다. Rac1이 모노클로날 항체 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))로의 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다.
ARF6 활성화 분석: 세포를 세포 배양 접시로부터 떼어내고, DMEM + 0.2％ BSA 중에서 현탁액으로 1시간 동안 유지시키고, 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴으로 코팅된 박테리아성 페트리 접시 상에 5분 동안 플레이팅하였다. 이후, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 50 mM 트리스 pH 7.0, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.5％ NP-40, 1× 프로테아제 억제제, 1× 포스파타제 억제제 및 50 ㎍/㎖ GST-GGA3-VHS-GAT 중에서 용해시켰다. 용해물을 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 글루타티온 아가로스 50 μl와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 용해 완충제로 3회 세척한 다음, 결합된 단백질을 2× 샘플 완충제로 용출시켰다. ARF6이 ARF6-특이적 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다.
통계학적 분석: 적절한 경우, 스튜던트 t-테스트(Student's t-test) 또는 ANOVA를 이용하여 통계학적 유의성을 결정하였다.
참고문헌
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Figure 112009081744748-PCT00021
SEQUENCE LISTING <110> Navigen Pharmaceuticals Li, Dean <120> BIOLOGICAL PATHWAYS, COMPOSITIONS, AND METHODS USEFUL IN THE TREATMENT OF PATHOLOGIC ANGIOGENESIS AND VASCULAR PERMEABILITY <130> 38263 <160> 17 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1534 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Thr Pro Gly Trp Gly Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Pro 1 5 10 15 Glu Leu Trp Leu Leu Leu Trp Ala Ala Ala Trp Arg Leu Gly Ala Ser 20 25 30 Ala Cys Pro Ala Leu Cys Thr Cys Thr Gly Thr Thr Val Asp Cys His 35 40 45 Gly Thr Gly Leu Gln Ala Ile Pro Lys Asn Ile Pro Arg Asn Thr Glu 50 55 60 Arg Leu Glu Leu Asn Gly Asn Asn Ile Thr Arg Ile His Lys Asn Asp 65 70 75 80 Phe Ala Gly Leu Lys Gln Leu Arg Val Leu Gln Leu Met Glu Asn Gln 85 90 95 Ile Gly Ala Val Glu Arg Gly Ala Phe Asp Asp Met Lys Glu Leu Glu 100 105 110 Arg Leu Arg Leu Asn Arg Asn Gln Leu His Met Leu Pro Glu Leu Leu 115 120 125 Phe Gln Asn Asn Gln Ala Leu Ser Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Ala 130 135 140 Ile Gln Ala Ile Pro Arg Lys Ala Phe Arg 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Gln Ile Gln Ala Ile Pro Arg Lys Ala 115 120 125 Phe Arg Gly Ala Val Asp Ile Lys Asn Leu Gln Leu Asp Tyr Asn Gln 130 135 140 Ile Ser Cys Ile Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp Leu Glu 145 150 155 160 Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn Ile Thr Arg Leu Ser Val Ala Ser 165 170 175 Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser Asn Asn 180 185 190 Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu Arg Gln 195 200 205 Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gln Cys Met Gly Pro Ser His Leu 210 215 220 Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gln Lys Arg Glu Phe Val Cys Ser 225 230 235 240 Gly His Gln Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys Ser Val Leu His Cys Pro 245 250 255 Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly Lys Gly 260 265 270 Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu Ile Arg 275 280 285 Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe Ser Pro 290 295 300 Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn Gln Ile Ser Glu 305 310 315 320 Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln 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Lys Lys Leu Pro Gln Leu Arg Lys 530 535 540 Ile Asn Phe Ser Asn Asn Lys Ile Thr Asp Ile Glu Glu Gly Ala Phe 545 550 555 560 Glu Gly Ala Ser Gly Val Asn Glu Ile Leu Leu Thr Ser Asn Arg Leu 565 570 575 Glu Asn Val Gln His Lys Met Phe Lys Gly Leu Glu Ser Leu Lys Thr 580 585 590 Leu Met Leu Arg Ser Asn Arg Ile Thr Cys Val Gly Asn Asp Ser Phe 595 600 605 Ile Gly Leu Ser Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Gln Ile 610 615 620 Thr Thr Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu Ser Thr 625 630 635 640 Leu Asn Leu Leu Ala Asn Pro Phe Asn Cys Asn Cys Tyr Leu Ala Trp 645 650 655 Leu Gly Glu Trp Leu Arg Lys Lys Arg Ile Val Thr Gly Asn Pro Arg 660 665 670 Cys Gln Lys Pro Tyr Phe Leu Lys Glu Ile Pro Ile Gln Asp Val Ala 675 680 685 Ile Gln Asp Phe Thr Cys Asp Asp Gly Asn Asp Asp Asn Ser Cys Ser 690 695 700 Pro Leu Ser Arg Cys Pro Thr Glu Cys Thr Cys Leu Asp Thr Val Val 705 710 715 720 Arg Cys Ser Asn Lys Gly Leu Lys Val Leu Pro Lys Gly Ile Pro Arg 725 730 735 Asp Val Thr Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gln Phe Thr Leu Val Pro 740 745 750 Lys Glu Leu Ser Asn Tyr Lys His Leu Thr Leu Ile Asp Leu Ser Asn 755 760 765 Asn Arg Ile Ser Thr Leu Ser Asn Gln Ser Phe Ser Asn Met Thr Gln 770 775 780 Leu Leu Thr Leu Ile Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Arg Cys Ile Pro Pro 785 790 795 800 Arg Thr Phe Asp Gly Leu Lys Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu His Gly 805 810 815 Asn Asp Ile Ser Val Val Pro Glu Gly Ala Phe Asn Asp Leu Ser Ala 820 825 830 Leu Ser His Leu Ala Ile Gly Ala Asn Pro Leu Tyr Cys Asp Cys Asn 835 840 845 Met Gln Trp Leu Ser Asp Trp Val Lys Ser Glu Tyr Lys Glu Pro Gly 850 855 860 Ile Ala Arg Cys Ala Gly Pro Gly Glu Met Ala Asp Lys Leu Leu Leu 865 870 875 880 Thr Thr Pro Ser Lys Lys Phe Thr Cys Gln Gly Pro Val Asp Val Asn 885 890 895 Ile Leu Ala Lys Cys Asn Pro Cys Leu Ser Asn Pro Cys Lys Asn Asp 900 905 910 Gly Thr Cys Asn Ser Asp Pro Val Asp Phe Tyr Arg Cys Thr Cys Pro 915 920 925 Tyr Gly Phe Lys Gly Gln Asp Cys Asp Val Pro Ile His Ala Cys Ile 930 935 940 Ser Asn Pro Cys Lys His Gly Gly Thr Cys His Leu Lys Glu Gly Glu 945 950 955 960 Glu Asp Gly Phe Trp Cys Ile Cys Ala Asp Gly Phe Glu Gly Glu Asn 965 970 975 Cys Glu Val Asn Val Asp Asp Cys Glu Asp Asn Asp Cys Glu Asn Asn 980 985 990 Ser Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Asn Tyr Thr Cys Leu Cys Pro Pro 995 1000 1005 Glu Tyr Thr Gly Glu Leu Cys Glu Glu Lys Leu Asp Phe Cys Ala 1010 1015 1020 Gln Asp Leu Asn Pro Cys Gln His Asp Ser Lys Cys Ile Leu Thr 1025 1030 1035 Pro Lys Gly Phe Lys Cys Asp Cys Thr Pro Gly Tyr Val Gly Glu 1040 1045 1050 His Cys Asp Ile Asp Phe Asp Asp Cys Gln Asp Asn Lys Cys Lys 1055 1060 1065 Asn Gly Ala His Cys Thr Asp Ala Val Asn Gly Tyr Thr Cys Ile 1070 1075 1080 Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Leu Phe Cys Glu Phe Ser Pro Pro 1085 1090 1095 Met Val Leu Pro Arg Thr Ser Pro Cys Asp Asn Phe Asp Cys Gln 1100 1105 1110 Asn Gly Ala Gln Cys Ile Val Arg Ile Asn Glu Pro Ile Cys Gln 1115 1120 1125 Cys Leu Pro Gly Tyr Gln Gly Glu Lys Cys Glu Lys Leu Val Ser 1130 1135 1140 Val Asn Phe Ile Asn Lys Glu Ser Tyr Leu Gln Ile Pro Ser Ala 1145 1150 1155 Lys Val Arg Pro Gln 1160 <210> 16 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Cys Pro Ala Met Cys Thr Cys Ser Asn Gly Ile Val Asp Cys Arg 1 5 10 15 Gly Lys Gly Leu Thr Ala Ile Pro Ala Asn Leu Pro Glu Thr Met Thr 20 25 30 Glu Ile Arg Leu Glu Leu Asn Gly Ile Lys Ser Ile Pro Pro Gly Ala 35 40 45 Phe Ser Pro Tyr Arg Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn Gln 50 55 60 Ile Ala Glu Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn 65 70 75 80 Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Asp Leu Pro Arg Gly Val 85 90 95 Phe Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys 100 105 110 Ile Asn Cys Ile Arg Pro Asp Ala Phe Gln Asp Leu Gln Asn Leu Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Ile Gln Ser Leu Ala Lys Gly Thr 130 135 140 Phe Thr Ser Leu Arg Ala Ile Gln Thr Leu His Leu Ala Gln Asn Pro 145 150 155 160 Phe Ile Cys Asp Cys Asn Leu Lys Trp Leu Ala Asp Phe Leu Arg Thr 165 170 175 Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Ala Ser Pro Arg Arg Leu 180 185 190 Ala Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys Ser 195 200 205 Ala Lys Glu Gln Tyr Phe Ile Pro Gly Thr Glu Asp Tyr Gln Leu Asn 210 215 220 Ser Glu Cys Asn Ser Asp Val 225 230 <210> 17 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Leu His Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys 1 5 10 15 Arg Gly Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile 20 25 30 Thr Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly 35 40 45 Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn 50 55 60 Gln Ile Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu 65 70 75 80 Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser 85 90 95 Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 100 105 110 Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu 115 120 125 Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly 130 135 140 Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala Gln Asn 145 150 155 160 Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His 165 170 175 Thr Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg 180 185 190 Leu Ala Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys 195 200 205 Ser Ala Lys Glu Gln Tyr Phe Ile Pro Gly Thr Glu Asp Tyr Arg Ser 210 215 220 Lys Leu Ser Gly Asp Cys Phe Ala Asp Leu 225 230

Claims (44)

  1. Rac의 억제, ARF6의 억제, 내피 장벽 기능의 유지, VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단, 혈관 누출의 억제, 병적 혈관형성(angiogenesis)의 억제, 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 Robo4 수용체와 상호작용하는 Robo4 수용체의 리간드를 포함하며, 여기서 리간드가 Slit 리간드를 포함하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, Slit 리간드가 Slit1 리간드, Slit2 리간드 및 Slit3 리간드 중 하나 이상으로부터 선택된 리간드를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Slit 리간드가 Slit1 (서열 1), Slit2 (서열 2), Slit3 (서열 3), 및 서열 1, 서열 2, 서열 3 중 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 약 70％, 적어도 약 75％, 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 100％인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 중 하나 이상으로부터 선택된 리간드를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, Slit 리간드가 Slit2N (서열 7), 서열 8, Slit2ΔP (서열 9), Slit2 D1 (서열 10), Slit2 D1-D2 (서열 11), Slit2 D1-D3 (서열 12), Slit2 D1-D4 (서열 13), Slit2 D1-E5 (서열 14), Slit2 D1-E6 (서열 15), 및 서열 7 내지 서열 15 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 약 70％, 적어도 약 75％, 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 100％인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 중 하나 이상으로부터 선택된 Slit2 리간드를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, Slit 리간드가 Slit1의 아미노산 1-1132 (서열 4), Slit2의 아미노산 1-1119 (서열 5), Slit3의 아미노산 1-1118 (서열 6), Slit1의 아미노산 281-511 (서열 16), Slit2의 아미노산 271-504 (서열 17), 및 서열 4 내지 서열 6, 서열 16 및 서열 17 중 어느 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 약 70％, 적어도 약 75％, 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 100％인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로부터 선택된 리간드를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 폭풍(cytokine storm)을 초래할 수 있는 감염성 및 비-감염성 질환, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 성인성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 패혈증, 조류 인플루엔자, 천연두, 전신성 염증 응답 증후군 (SIRS), 졸중 또는 심근경색증 후의 허혈/재관류 손상, 뇌 종양과 관련된 부종, 악성종양과 관련된 복수, 메이그스 증후군(Meigs' syndrome), 폐 염증, 콩팥 증후군, 심낭 삼출 및 흉막 삼출, 염증, 알레르기성 질환, 암, 뇌졸중, 심근경색증, 폐 및 심장 기능부전, 신부전 및 망막병증으로부터 선택된 질환 상태와 관 련된 혈관 투과성의 치료를 위한 제약 조성물로서 제조된 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관종, 고형 종양, 백혈병, 전이, 모세혈관확장 건선 공피증, 화농성 육아종, 심근 혈관형성, 플라크 혈관신생(neovascularization), 관상동맥 측부혈관(coronary collaterals), 허혈성 사지 혈관형성, 각막 질환, 피부홍조, 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증 (DR), 수정체후방 섬유증식증, 비-증식성 당뇨병성 황반 부종 (DME), 관절염, 당뇨병성 혈관신생, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 미숙아 망막병증 (ROP), 허혈성 망막 정맥 폐쇄 (IRVO), 상처 치유, 소화성 궤양, 골절, 켈로이드, 혈관생성(vasculogenesis), 조혈, 배란, 월경 및 태반형성으로부터 선택된 질환 상태와 관련된 병적 혈관형성의 치료를 위한 제약 조성물로서 제조된 조성물.
  8. Rac의 억제, ARF6의 억제, 내피 장벽 기능의 유지, VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달 차단, 혈관 누출의 억제, 병적 혈관형성의 억제, 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 억제 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 소형 분자(small molecule)를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 소형 분자가 사이토헤신(cytohesin)의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 것인 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 소형 분자가 ARNO 및 사이토헤신의 ARNO 부류로부터 선택된 사이토헤신의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 것인 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 소형 분자가 하기 화학식 (화학식 1)을 갖는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물로부터 선택되는 것인 조성물.
    <화학식 1>
    Figure 112009081744748-PCT00022
    상기 식에서,
    R1 및 R3은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 시클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클로부터 독립적으로 선택되고;
    R2는 수소, 저급 알콕시, 저급 알킬, 할로겐 또는 히드록시로부터 선택되고;
    Z는 O, S, NH, 알킬렌 또는 단일 결합으로부터 선택된다.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 화합물 중 적어도 하나의 화합물의 R3이 할로 겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 헤테로원자 저급 알킬, 히드록시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환기에 의해 치환되고, 여기서 2개의 치환기가 함께 융합 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있는 것인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 하나 이상의 화합물 중 적어도 하나의 화합물이, 비치환된 아릴 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택된 R1; 수소, 저급 알콕시 또는 저급 알킬로부터 선택된 R2; 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환기에 의해 임의로 치환된 아릴로부터 선택되고, 여기서 2개의 치환기가 함께 융합 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있는 것인 R3; 및 O, S 또는 단일 결합으로부터 선택된 Z를 포함하는 것인 조성물.
  14. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 소형 분자가 하기 화학식 (화학식 2)을 갖는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물로부터 선택되는 것인 조성물.
    <화학식 2>
    Figure 112009081744748-PCT00023
    상기 식에서,
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 시클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
    R2는 수소, 저급 알콕시, 저급 알킬, 할로겐 또는 히드록시로부터 선택되고;
    Z는 O, S, NH, 알킬렌 또는 단일 결합으로부터 선택되고;
    X는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 헤테로원자 저급 알킬, 히드록시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 2개의 치환기는 함께 융합 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있고;
    m은 0 내지 5이다.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 화합물이 하기 화합물, 또는 이들의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물로부터 선택되는 것인 조성물.
    Figure 112009081744748-PCT00024
    ,
    Figure 112009081744748-PCT00025
    ,
    Figure 112009081744748-PCT00026
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 폭풍을 초래할 수 있는 감염성 및 비-감염성 질환, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 성인성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 패혈증, 조류 인플루엔자, 천연두, 전신성 염증 응답 증후군 (SIRS), 졸중 또는 심근경색증 후의 허혈/재관류 손상, 뇌 종양과 관련된 부종, 악성종양과 관련된 복수, 메이그스 증후군, 폐 염증, 콩팥 증후군, 심낭 삼출 및 흉막 삼출, 염증, 알레르기성 질환, 암, 뇌졸중, 심근경색증, 폐 및 심장 기능부전, 신부전 및 망막병증으로부터 선택된 질환 상태와 관련된 혈관 투과성의 치료를 위한 제약 조성물로서 제조된 조성물.
  17. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관종, 고형 종양, 백혈병, 전이, 모세혈관확장 건선 공피증, 화농성 육아종, 심근 혈관형성, 플라크 혈관신생, 관상동맥 측부혈관, 허혈성 사지 혈관형성, 각막 질환, 피부홍조, 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증 (DR), 수정체후방 섬유증식증, 비-증식성 당뇨병성 황반 부종 (DME), 관절염, 당뇨병성 혈관신생, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 미숙아 망막병증 (ROP), 허혈성 망막 정맥 폐쇄 (IRVO), 상처 치유, 소화성 궤양, 골절, 켈로이드, 혈관생성, 조혈, 배란, 월경 및 태반형성으로부터 선택된 질환 상태와 관련된 병적 혈관형성의 치료를 위한 제약 조성물로서 제조된 조성물.
  18. 대상체에게, 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 조성물 및 1종 이상의 ARF-GAP의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 촉진하는 조성물로부터 선택된 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관 투과성을 억제하는 방법.
  19. 대상체에게, 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 조성물 및 1종 이상의 ARF-GAP의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 촉진하는 조성물로부터 선택된 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 병적 혈관형성을 억제하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 대상체에게 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것이 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 대상체에게, 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 조성물 및 1종 이상의 ARF-GAP의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 촉진하는 조성물로부터 선택된 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, Rac 활성화 또는 이용가능성, ARF6 활성화 또는 이용가능성, 혈관 누출, 혈관 투과성, 병적 혈관형성, 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 중 하나 이상을 억제하는 방법.
  22. 제22항에 있어서, 대상체에게 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것이 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 대상체에게, 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 조성물 및 1종 이상의 ARF-GAP의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 촉진하는 조성물로부터 선택된 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 내피 장벽 기능을 유지하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 대상체에게 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것이 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  25. 대상체에게, 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 조성물 및 1종 이상의 ARF-GAP의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 촉진하는 조성물로부터 선택된 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달을 차단하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 대상체에게 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것이 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  27. 대상체에게, 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 조성물 및 1종 이상의 ARF-GAP의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 촉진하는 조성물로부터 선택된 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 사이토카인 폭풍을 초래할 수 있는 감염성 및 비-감염성 질환, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 성인성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 패혈증, 조류 인플루엔자, 천연두, 전신성 염증 응답 증후군 (SIRS), 졸중 또는 심근경색증 후의 허혈/재관류 손상, 뇌 종양과 관련된 부종, 악성종양과 관련된 복수, 메이그스 증후군, 폐 염증, 콩팥 증후군, 심 낭 삼출 및 흉막 삼출, 염증, 알레르기성 질환, 암, 뇌졸중, 심근경색증, 폐 및 심장 기능부전, 신부전 및 망막병증으로부터 선택된 질환 상태와 관련된 혈관 투과성을 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 대상체에게 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것이 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  29. 대상체에게, 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 조성물 및 1종 이상의 ARF-GAP의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 촉진하는 조성물로부터 선택된 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관종, 고형 종양, 백혈병, 전이, 모세혈관확장 건선 공피증, 화농성 육아종, 심근 혈관형성, 플라크 혈관신생, 관상동맥 측부혈관, 허혈성 사지 혈관형성, 각막 질환, 피부홍조, 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증 (DR), 수정체후방 섬유증식증, 비-증식성 당뇨병성 황반 부종 (DME), 관절염, 당뇨병성 혈관신생, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 미숙아 망막병증 (ROP), 허혈성 망막 정맥 폐쇄 (IRVO), 상처 치유, 소화성 궤양, 골절, 켈로이드, 혈관생성, 조혈, 배란, 월경 및 태반형성으로부터 선택된 질환 상태와 관련된 병적 혈관형성을 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 대상체에게 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것이 치료 상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제18항, 제19항, 제21항, 제23항, 제25항, 제27항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 상기 조성물이 하기 화학식 (화학식 1)을 갖는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물을 포함하는 것인 방법.
    <화학식 1>
    Figure 112009081744748-PCT00027
    상기 식에서,
    R1 및 R3은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 시클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클로부터 독립적으로 선택되고;
    R2는 수소, 저급 알콕시, 저급 알킬, 할로겐 또는 히드록시로부터 선택되고;
    Z는 O, S, NH, 알킬렌 또는 단일 결합으로부터 선택된다.
  32. 제31항에 있어서, 대상체에게 투여되는 조성물에 포함된 하나 이상의 화합물 중 적어도 하나의 화합물의 R3이 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 헤테로원자 저급 알킬, 히드록시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환기에 의해 치환되고, 여기서 2개의 치환기가 함께 융합 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 대상체에게 투여되는 조성물에 포함된 하나 이상의 화합물 중 적어도 하나의 화합물이, 비치환된 아릴 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택된 R1; 수소, 저급 알콕시 또는 저급 알킬로부터 선택된 R2; 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환기에 의해 임의로 치환된 아릴로부터 선택되고, 여기서 2개의 치환기가 함께 융합 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있는 것인 R3; 및 O, S 또는 단일 결합으로부터 선택된 Z를 포함하는 것인 방법.
  34. 제18항, 제19항, 제21항, 제23항, 제25항, 제27항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 1종 이상의 ARF-GEF의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 상기 조성물이 하기 화학식 (화학식 2)을 갖는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물을 포함하는 것인 방법.
    <화학식 2>
    Figure 112009081744748-PCT00028
    상기 식에서,
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 시클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
    R2는 수소, 저급 알콕시, 저급 알킬, 할로겐 또는 히드록시로부터 선택되고;
    Z는 O, S, NH, 알킬렌 또는 단일 결합으로부터 선택되고;
    X는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 헤테로원자 저급 알킬, 히드록시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 2개의 치환기는 함께 융합 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있고;
    m은 0 내지 5이다.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여되는 조성물에 포함된 하나 이상의 화합물 중 적어도 하나의 화합물이 하기 화합물, 또는 이들의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물로부터 선택된 화합물을 포함하는 것인 방법.
    Figure 112009081744748-PCT00029
    ,
    Figure 112009081744748-PCT00030
    ,
    Figure 112009081744748-PCT00031
  36. 대상체에게 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관 투과성을 억제하는 방법.
  37. 대상체에게 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 병적 혈관형성을 억제하는 방법.
  38. 대상체에게 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, Rac 활성화 또는 이용가능성, ARF6 활 성화 또는 이용가능성, 혈관 누출, 혈관 투과성, 병적 혈관형성, 및 다중 혈관형성 인자, 투과성 인자 및 염증성 인자의 신호 중 하나 이상을 억제하는 방법.
  39. 대상체에게 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 내피 장벽 기능의 유지 방법.
  40. 대상체에게 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, VEGF 수용체 하류의 VEGF 신호전달을 차단하는 방법.
  41. 대상체에게 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 사이토카인 폭풍을 초래할 수 있는 감염성 및 비-감염성 질환, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 성인성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 패혈증, 조류 인플루엔자, 천연두, 전신성 염증 응답 증후군 (SIRS), 졸중 또는 심근경색증 후의 허혈/재관류 손상, 뇌 종양과 관련된 부종, 악성종양과 관련된 복수, 메이그스 증후군, 폐 염증, 콩팥 증후군, 심낭 삼출 및 흉막 삼출, 염증, 알레르기성 질환, 암, 뇌졸중, 심근경색증, 폐 및 심장 기능부전, 신부전 및 망막병증으로부터 선택된 질환 상태와 관련된 혈관 투과성을 치료하는 방법.
  42. 대상체에게 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바 와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관종, 고형 종양, 백혈병, 전이, 모세혈관확장 건선 공피증, 화농성 육아종, 심근 혈관형성, 플라크 혈관신생, 관상동맥 측부혈관, 허혈성 사지 혈관형성, 각막 질환, 피부홍조, 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증 (DR), 수정체후방 섬유증식증, 비-증식성 당뇨병성 황반 부종 (DME), 관절염, 당뇨병성 혈관신생, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 미숙아 망막병증 (ROP), 허혈성 망막 정맥 폐쇄 (IRVO), 상처 치유, 소화성 궤양, 골절, 켈로이드, 혈관생성, 조혈, 배란, 월경 및 태반형성으로부터 선택된 질환 상태와 관련된 병적 혈관형성을 치료하는 방법.
  43. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, SecinH3를 포함하는 조성물.
  44. 제20항, 제22항, 제24항, 제26항, 제28항, 제30항 및 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 SecinH3를 포함하는 치료상 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
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