KR20110102142A

KR20110102142A - 혈관 장벽 기능을 촉진하고 폐 섬유증을 치료하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20110102142A
Application number: KR1020107029886A
Authority: KR
Inventors: 딘 와이 리; 나일 런던; 웨이촨 주
Original assignee: 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2011-09-16
Also published as: US20120129757A1; BRPI0915287A2; WO2010068917A2; EP2355836A4; CA2729684A1; CN102083452A; WO2010068917A3; JP2012512170A; EP2355836A2

Abstract

폐 염증과 연관된 혈관 내피의 투과성을 억제하거나 장벽 기능을 촉진하는 활성제 및 조성물이 기술된다.

Description

혈관 장벽 기능을 촉진하고 폐 섬유증을 치료하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROMOTING VASCULAR BARRIER FUNCTION AND TREATING PULMONARY FIBROSIS}

혈관 장벽 기능을 촉진하는 활성제 및 조성물이 본원에서 기술된다. 또한 혈관 내피 장벽 기능을 촉진하는 방법이 본원에서 제공된다.

연방차원에서 후원되는 연구에 관한 진술

본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 Grant R01 HL077671 하에 정부 지원으로 완성되었다. 정부는 본 발명에 대한 특정의 권리를 갖는다.

급성 및 만성 폐 혈관 염증 및 유출은 다수의 병리적 상태와 연관된다. 예를 들어, 인플루엔자 감염 및 패혈증은 급성 및 잠재적으로 생명을 위협하는 폐 혈관 염증에 의해 특징화될 수 있다. 또한, 만성 폐 혈관 염증은 폐 섬유증의 발달 및 진행과 연관된다. 폐 섬유증은 폐 내 섬유 유사 반흔 조직의 이상 형성이고, 반흔 형성은 염증에 의해 선행되고 염증과 연관된다. 폐 섬유증은 폐의 폐포 및 간질 조직의 팽윤 및 반흔형성을 야기하는 만성 질환이다. 폐 섬유증의 원인은 흔히 절대 밝혀지지 않지만 (즉, 특발성 폐 섬유증), 어떤 경우 폐 섬유증의 발달 및 진행은 예를 들어 결핵, 전신 홍반 루푸스, 전신 경화증과 같은 질환 또는 감염, 예를 들어 실리카 분진 및 석면으로의 노출과 같은 하나 이상의 환경적 상태, 또는 심지어 니티오푸란토인, 아미오다론 및 블레오마이신과 같은 특정 약물과 연관된다. 폐 섬유증은 증상이 거의 없을 정도로 경도일 수 있지만, 치명적일 수도 있다.

발명의 요약

혈관 장벽 기능을 촉진하는 활성제 및 조성물이 본원에서 기술된다. 본원에서 기술되는 조성물은 혈관 장벽 기능을 촉진할 수 있는 하나 이상의 활성제를 포함하고, 하나의 상기 구현예에서, 본원에서 기술되는 조성물은 혈관 내피의 장벽 기능을 촉진하는 활성제를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본원에서 기술되는 조성물은 폐의 혈관 내피, 신장의 혈관 내피 및 비장의 혈관 내피 중 하나로부터 선택되는 내피 조직 내 혈관 장벽 기능을 촉진하는 활성제를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물은, 급성 폐 염증 및 만성 폐 염증을 초래하거나 그로부터 기인하는 상태와 연관된 혈관 투과성을 포함하는, 폐 염증과 연관된 혈관 투과성을 억제하는 활성제를 포함한다. 본원에서 제공되는 실험적 실시예에 의해 설명되는 바와 같이, 본 명세서에 따른 활성제는, 특정 구현예에서, 예를 들어, 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 를 포함하는 염증 및 혈관 투과성의 다중 매개체의 존재 하에서조차 혈관 장벽 기능을 촉진한다.

또한 혈관 내피 장벽 기능을 촉진하는 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 혈관 내피 장벽 기능을 촉진하는 방법은 하나 이상의 혈관 내피 세포를 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제로 치료하는 것을 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 하나 이상의 혈관 내피 세포를 치료하는 단계는 본원에서 기술되는 바와 같은 치료적 유효량의 활성제를 그것을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 활성제에 의한 하나 이상의 혈관 내피 세포의 치료는 하기 중 하나 이상을 초래한다: 혈관 내피 장벽 기능의 보존; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진. 또다른 상기 구현예에서, 활성제에 의한 하나 이상의 혈관 내피 세포의 치료는 혈관 내피 세포의 하나 이상의 염증 매개체로의 노출 후 혈관 장벽 기능을 적어도 부분적으로 회복시키며, 하나 이상의 염증 매개체는 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하도록 선택된다.

도 1. Slit2N 은 세포 표면에서의 VE-카드헤린 국부화를 증강시킴으로써 내피를 안정화시킨다. (A), Mock 또는 Slit2N 의 존재 하에 LPS, TNF-α 또는 IL-1β 로 자극된 HMVEC-폐에서 시험관내 투과성을 측정하였다. (B), Robo4 또는 대조군 siRNA 녹다운 HMVEC-폐를 Mock 또는 Slit2N 의 존재 하에 IL-1β 로 자극하여 시험관내 투과성을 평가하였다. (C-E), HMVEC-폐를 Mock 또는 Slit2N 으로 처리하여, 막 분획화 및 그후 VE-카드헤린 (C), p120-카테닌 (D) 또는 β-카테닌 (E) 에 대한 면역블로팅을 수행하였다. (F), HMVEC-폐를 Mock 또는 Slit2N 으로 자극하여, VE-카드헤린 (녹색) 에 대해 면역형광검사를 수행하였다. 백색 화살표는 증강된 VE-카드헤린 세포 표면 국부화 부위를 나타낸다. 모든 실험에 대해 N≥3, *P<0.05, ***P<0.005, ****P<O.001 이고, 에러 바는 s.e.m. 을 나타낸다.
도 2. Slit2N 는 VE-카드헤린/p120-카테닌 상호작용을 증강시킨다. (A), HMVEC-폐를 Mock 또는 Slit2N 의 존재 하에 IL-1β 로 자극하고 VE-카드헤린 및 p120-카테닌에 대해 면역염색하였다. 백색 화살표는 Mock 처리 세포에서 VE-카드헤린 또는 p120-카테닌이 결여된 세포 표면 부위를 나타낸다. 황색 화살표는 Slit2N 처리 세포에서 VE-카드헤린 또는 p120-카테닌의 증강된 세포 표면 국부화 부위를 나타낸다. (B), HMVEC-폐를 Mock 또는 Slit2N 의 존재 하에 IL-1β 로 자극하였다. 용해물을 VE-카드헤린에 대해 면역침전시킨 후 p120-카테닌 및 VE-카드헤린에 대해 면역블로팅하였다. (C), HMVEC-폐를 Mock 또는 Slit2N 의 존재 하에 IL-1β 로 자극하였다. VE-카드헤린 내부화 (녹색) 를 평가하고 내부화의 부위를 백색 화살표로 표시하였다. (D), 시험관내 투과성을 대조군 IgG 또는 VE-카드헤린 항체의 존재 하에 측정하였다. 모든 실험에 대해 N≥3, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005 이고, 에러 바는 s.e.m. 을 나타낸다.
도 3. Slit2N 는 LPS-유도 투과성, 단백질 삼출물 및 세포 침윤물을 생체내 억제한다. (A), Robo4 ^+/+ 및 Robo4 ^AP/AP 마우스에게 Mock 또는 Slit2N 을 정맥내 주사한 후 10 ㎍ LPS 를 기관내 주입하였다. 그후 마우스에게 에반스 블루 알부민 (Evans Blue Albumin (EBA)) 을 정맥내 주사하고 폐 내의 EBA 축적을 혈관 투과성을 평가하는데 사용하였다 (N≥4). (B-D), 대안적으로 LPS 투여 24 시간 후, 기관지폐포 세척액을 수득하고 단백질 함량 (B), 총 염증성 세포 축적 (C) 또는 중성구 축적 (D) 에 대해 평가하였다 (N≥5). e, Mock 또는 Slit2N 의 존재 하에 LPS 에 노출된 마우스로부터의 폐 조직에 대해 H&E 염색을 수행하였다. (F), 3.3 ㎍ LPS (N=5) 로 처리된 마우스에서 단백질 삼출물을 측정하였다. g-i, 마우스에게 대조군 또는 VE-카드헤린 차단 항체와 함께 Mock 또는 Slit2N 을 정맥내 주사한 후 LPS 를 기관내 주입하였다. 기관지폐포 세척액을 수득하고 단백질 함량 (G), 총 염증성 세포 축적 (H), 또는 중성구 축적 (N≥5) 에 대해 평가하였다. *P<0.05, ***P<0.005, ****P<0.001 이고, 에러 바는 s.e.m. 을 나타낸다.
도 4. Slit2N 은 패혈증의 천자 모델 및 맹장 결찰에서 투과성 및 사망률을 감소시킨다. (A), 마우스를 CLP 또는 모의 수술하였다. 마우스에게 에반스 블루 알부민 (EBA) 을 정맥내 주사하고 신장 (A) 또는 비장 (B) 에서 EBA 축적을 측정하여 혈관 투과성을 평가하였다 (N=5). (C), Robo4 ^+/+ 마우스를 CLP 하고 Mock 또는 Slit2N 로 처리하고 생존 평가하였다 (Mock 처리 N=15, Slit2N 처리 N=14). Mock 또는 Slit2N 처리된 CLP 마우스 (N=6) 의 혈청 내 사이토카인 (D) 또는 케모카인 (E) 수준. (F), Robo4 ^AP/AP 마우스를 CLP 하고 Mock 또는 Slit2N 로 처리하고 생존 평가하였다 (Mock 처리 N=13, Slit2N 처리 N=13). *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.001, 에러 바는 s.e.m. 을 나타낸다.
도 5. Slit2N 은 H5N1 감염 모델에서의 사망률을 감소시킨다. (A), Balb/c 마우스를 H5N1 바이러스로 비강내 감염시켰다. 마우스에게 에반스 블루 알부민 (EBA) 을 정맥내 주사하고 폐에서 EBA 축적을 측정하여 혈관 투과성을 평가하였다 (N=5). (B), H5N1 감염 후 마우스 생존 (Mock 처리 N=20, Slit2N 처리 N=20). (C), 감염 6 일 후 H5N1 감염된 마우스로부터의 폐 조직에 대해 H&E 염색을 수행하였다. 상위 좌측 패널의 백색 화살표는 폐세동맥 주변의 부종 유체의 축적을 나타낸다. 상위 중간 패널은 과도 폐포 염증을 입증한다. 상위 우측 패널의 흑색 화살표는 포말 대식세포의 존재를 나타낸다. (D), H5N1 바이러스 역가를 감염 후 6 일에 측정하였다 (총체(pooled) 마우스의 군 N=3). 사이토카인 (E) 또는 케모카인 (F) 수준을 감염 후 6 일에 폐에서 측정하였다 (총체 마우스 군 N=3).
도 6. Slit 는 세포 표면에서 VE-카드헤린을 증강시키는 것을 통해 다중 염증성 자극에 의해 야기되는 혈관 유출을 감소시킨다. (A), 정상 조건 하에서, 폐포 모세혈관은 반투과성 장벽을 제공한다. (B), 염증성 자극은 VE-카드헤린의 내부화 및 장벽 기능의 파괴를 초래하는 사이토카인의 큰 방출을 야기한다. 이는 폐포 공간 내 단백질이 풍부한 부종 유체의 축적 및 혈관 유출을 일으킨다. (C), Slit 는 세포 표면에서 VE-카드헤린을 증강시킴으로써 다수의 사이토카인에 대한 혈관 장벽 기능을 증강시킨다.
도 7. Slit2-D1 만큼 작은 (4O kD) 재조합 Slit 펩티드는 활성이다. 도 7A 에서, Slit 단백질에 대한 상이한 구성물을 표시하였다. 4 개 류신 풍부 도메인 (LRR), 상피 성장 인자 상동 부위 (EGF) 및 c-말단 택 (MYC/HIS) 을 표시하였다. 상이한 Slit 구성물 (2nM) 에 의한 VEGF 매개 내피 세포 이동의 억제를 도 7B 에 나타내었다.
도 8. SecinH3 는 블레오마이신-유도 섬유증을 억제한다. 6-8 주령 BL/6 마우스에게 식염수 또는 0.05U 블레오마이신을 비강내 주입하였다. 100 uL 의 운반체 또는 3O uM SecinH3 을 복강내 주사를 통해 1 일 2 회 투여하였다. 시르콜 (Sircol) 콜라겐 검정법으로 폐 섬유증을 평가하였다. 군 당 동물 N ≥ 7, *P < 0.05.
도 9. SecinH3 의 화학적 구조.
도 10. Robo4 신호전달 경로의 설명.
도 11. Robo4 발현은 LPS 주입 6 시간 후 폐에서 증가된다.
도 12. 조류 독감의 마우스 모델에 따른, 조류 독감 바이러스에 감염된 마우스의 생존에 대한 Slit2 단백질 투여의 효과.
도 13. (a) Slit2 는 블레오마이신 투여 11 일 후 Robo4^+/+ 마우스의 폐에서의 블레오마이신-유도 EBA 축적을 유의하게 감소시켰다. Slit2 의 효과는 Robo4 ^AP/AP 마우스에서 손실되었다. (b) Slit2 는 또한 블레오마이신-유도 폐 섬유증을 유의하게 감소시켰다. 이러한 효과는 Robo4 ^AP/AP 마우스에서 손실되었으며, 이는 Slit2 가 내피 세포에 직접적으로 작용하여 폐 섬유증을 감소시킨다는 것을 나타낸다. (c) 콜라겐 침착의 시각화를 증강시키도록 3색 염색을 사용하는 폐의 조직 검사로, Robo4-의존적 방식으로 Slit2 의 효과를 확인하였다.
도 14. Slit 는 투여량-의존적 방식으로 LPS-유도 세포 침윤물을 억제한다. (A) Robo4 또는 대조군 siRNA 녹다운 HMVEC-폐를 면역블로팅에 의해 Robo4 발현에 대해 평가하였다. (B) Z-축의 공초점 이미지를 황색 선으로 표시한 바와 같이 아래 및 측면에 나타내었다. 증강된 연접 두께가 Slit2N 처리 세포에서 관찰되었다. (C-D) 마우스를 증가 수준의 Slit2N 의 존재 하에 LPS-유도 ALI 시켰다. 세포 침윤물 및 중성구를 나타내었다. N=4, *P<0.05.
도 15. Slit2N 은 정량적 조직학에 의해 평가되는 바와 같이 LPS-유도 ALI 를 감소시킨다. Robo4 ^+/+ 및 Robo4 ^AP/AP 마우스를 Slit2N 의 Mock 의 존재 하에 LPS-유도 ALI 시켰다. 상기 마우스로부터의 폐 조직을 H&E 에 대해 염색하고, 폐 상해 정도를 평가하기 위한 정량적 조직학을 맹검 조사자에 의해 수행하였다. N=3, ***P<0.005.
도 16. Slit 는 제 1 인간 PMN 의 이동을 감소시키지 않는다. (A) 세포를 Mock Slit2 의 존재 하에 백혈구 화학유인물질 fMLP 에 대해 이동시켰다. (B) RNA 를 hPMN 으로부터 단리하고 정량적 PCR 을 수행하였다. 뇌 cDNA 를 양성 대조군으로서 사용하였다. N=3, ***P<0.005, 에러 바는 s.e.m. 을 나타낸다.
도 17. Slit2 단백질은 폐 전체에 걸쳐 내피에 아주 근접하게 발현된다. Slit2 는 화살표로 나타낸 Robo4 알칼리성 포스파타아제 (AP) 발현과 함께 동시-국부화된다.
도 18. CLP 동안 유의한 폐 상해는 없다. (A-C) 마우스를 CLP 하고 Mock 또는 Slit2N 으로 처리하였다. 폐 조직을 H&E 으로 염색하고 (A) 폐 상해 정도를 평가하기 위해 정량적 조직학을 수행하였다 (B) N=3. (C) 마우스의 폐에서의 투과성을 에반스 블루 알부민을 사용하여 평가하였다. N=5.
도 19. Robo4 의 손실은 초기 발생 폐에서의 혈관 내피 세포의 패턴화에 영향을 주지 않는다. A-C, D-F 및 G-I 는 각각, 상피 (E-카드헤린) 및 혈관계 (CD31) 에 대해 염색된 Robo4 ^+/+, Robo4 ^+/AP 및 Robo4 ^AP/AP~E12.5 폐를 나타낸다. 화살표는 좌측 폐동맥 EC 튜브의 원위 범위를 나타낸다. B, E 및 H 는 원위 분지의 두정으로부터 외부로 선형 확장되는 CD31+ 신경총 구획의 두께를 나타내는 가로선을 갖는 제 1 좌측 측면 제 2 기도 분지의 원위 분지의 확대도이다. C, F 및 I 는 CD31 에 대해 지정된 항체로 염색된 원위 좌측 폐동맥 EC 튜브 부위의 확대도를 나타낸다. 제 1, 제 2 및 제 3 좌측 흉추 제 2 기도 돌기의 위치를 D1, D2 및 D3 으로 표시하였다.
도 20. Robo4 의 손실은 발생하는 폐에서의 혈관 내피 세포의 패턴화에 영향을 주지 않는다. A-B, C-D 및 E-F 는 각각, 폐 상피 (E-카드헤린) 및 혈관 발생 (CD31) 에 대해 염색된 Robo4 ^+/+, Robo4 ^+/AP 및 Robo4 ^AP/AP~E14.5 폐를 나타낸다. 화살표는 좌측 제 1 기관지에 대해 측면 위치한 좌측 폐동맥을 표시한다. A, C 및 E 에서의 어두운 색 화살표 머리는 우측 부속엽을 공급하며 부속엽에 대한 우측 제 2 기도 분지의 후부에 위치한 우측 폐동맥의 분지를 표시한다.

I. 정의

개시된 활성제, 조성물 및 방법을 위해 사용될 수 있고, 이와 함께 사용될 수 있고, 이의 제조에 사용될 수 있고 또는 이의 산물인 물질, 조성물 및 성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질들이 본원에서 개시되며, 이들 물질들의 조합, 부분집합, 상호작용, 군 등이 개시되는 경우, 이들 화합물들의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 변환의 구체적 언급이 명확히 개시되지 않을 수 있는 한편, 각각은 본원에서 구체적으로 고찰되고 기술되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 폴리펩티드가 개시되고 논의되며 폴리펩티드를 포함하는 많은 분자에 대해 이루어질 수 있는 수많은 수식이 논의되는 경우, 구체적으로 다르게 나타내지 않는 한 폴리펩티드의 각각의 및 모든 조합 및 변환 및 가능한 수식이 구체적으로 고찰된다. 따라서, 분자 A, B 및 C 의 클래스가 개시될 뿐 아니라 분자 D, E 및 F 의 클래스, 및 조합 분자의 예, A-D 가 개시되는 경우, 각각이 개별적으로 인용되지 않는다 해도 각각은 개별적이고 집합적으로 고찰된다. 따라서 이러한 예에서, 각각의 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F 가 구체적으로 고찰되며 A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적 조합 A-D 의 개시로부터 개시되는 것으로 여겨져야 한다. 마찬가지로, 이들의 임의의 부분집합 또는 조합이 또한 구체적으로 고찰되며 개시된다. 따라서 예를 들어 A-E, B-F 및 C-E 의 하위군이 구체적으로 고찰되며 A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적 조합 A-D 의 개시로부터 개시되는 것으로 여겨져야 한다. 이러한 개념은 개시된 조성물의 제조 방법 및 사용 방법 단계를 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 출원의 모든 양상에 대해 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가적 단계들이 존재하는 경우, 각각의 이들 추가적 단계가 개시된 방법의 임의의 특정 구현예 또는 구현예의 조합으로 수행될 수 있으며, 각각의 이러한 조합이 구체적으로 고찰되고 개시되는 것으로 여겨져야 한다는 것으로 이해된다.

당업자는 본원에서 기술되는 방법 및 조성물의 특정 구현예의 동등물들을 단지 통상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있거나 인지할 것이다. 이러한 동등물은 포함된 청구항에 의해 내포되는 것으로 의도된다.

또한, 본원에서 사용되는 용어가 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며, 본원에서 기술되는 발명의 범위를 제한하는 것이 의도되지 않는 것으로 이해된다.

다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서의 문맥에서 당업계의 기술 중 하나에 의해 통상적으로 이해될 수 있는 의미를 갖는다.

문맥에서 명백히 다르게 지시되지 않는 한, 본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 복수형 언급을 포함한다는 것에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 하나의 폴리펩티드에 대한 언급은 이러한 폴리펩티드의 다수를 포함하며, 특정 폴리펩티드에 대한 언급은 하나 이상의 폴리펩티드들 및 당업자에게 알려진 이의 동등물 등에 대한 언급이다.

'임의의' 또는 '임의로' 는 이어서 기술되는 사건, 상황 또는 물질이 발생 또는 존재할 수 있거나 그렇지 않을 수 있고, 그 기술이 사건, 상황 또는 물질이 발생 또는 존재하는 경우, 및 발생 또는 존재하지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다.

범위는 약 하나의 특정 값으로부터 및/또는 약 또다른 특정 값까지로 본원에서 표현될 수 있다. 이러한 범위를 표현할 때, 또다른 구현예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 선행사 "약" 을 사용하여 값을 근사치로 표현할 때, 특정 값이 또다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 각각의 범위의 종결점은 다른 종결점에 관하여, 및 다른 종결점으로부터 독립적으로 유의하다는 것으로 이해될 것이다. 또한, 본원에서 다수의 값들이 개시되고, 각각의 값은 또한 그 값 자체에 추가하여 약 특정 값으로서 본원에서 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 10 이 개시되는 경우, 약 10 이 또한 개시된다. 또한, 2 개의 특정 단위 사이의 각각의 단위도 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 및 15 가 개시되는 경우, 11, 12, 13 및 14 가 또한 개시된다.

알킬은 함께 연결된 1 내지 8 개 탄소 원자를 포함하며 단일 탄소-탄소 결합에 의해 연결된 임의로 치환된 탄화수소기를 의미한다. 알킬 탄화수소기는 직쇄일 수 있거나 하나 이상의 분지를 포함할 수 있다. 이들 기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3 차 부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함한다. 저급 알킬은 1 내지 4 개 탄소를 포함하는 임의로 치환된 분지쇄 또는 직쇄 알킬을 의미한다.

알케닐은 함께 연결된 2-8 개 탄소 원자를 가지며 탄소 원자 사이에 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 임의로 치환된 탄화수소기를 의미한다. 알케닐 탄화수소기는 분지쇄 또는 직쇄일 수 있다.

시클로알킬은 임의로 치환된 시클릭 알킬 또는 임의로 치환된 비방향족 시클릭 알케닐을 의미하며 모노시클릭 및 다중 융합 고리 구조 예컨대 바이시클릭 및 트리시클릭을 포함한다. 시클로알킬은 예를 들어 3 내지 15 개 탄소 원자를 가질 수 있다. 하나의 구현예에서, 시클로알킬은 5 내지 12 개 탄소 원자를 갖는다. 적합한 시클로알킬기의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함한다.

헤테로사이클은 하나 이상의 비탄소 원자를 포함하는 임의로 치환된 포화 또는 부분 포화 비방향족 고리화 부분을 의미한다. 헤테로시클릭 부분은 전형적으로는 단일 고리 또는, 바이시클릭 및 트리시클릭과 같은 다중 융합 고리 구조를 포함한다. 하나의 구현예에서, 고리(들)은 5 내지 6-원이며 전형적으로는 1 내지 3 개의 비탄소 원자를 포함한다. 헤테로사이클에 대한 비탄소 원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황에서 선택될 수 있다.

아릴은 접합된 pi-전자 고리계를 갖는 하나 이상의 고리를 갖는 임의로 치환된 방향족기를 의미하며, 모노시클릭 및, 바이시클릭 및 트리시클릭과 같은 다중 융합 고리 구조를 포함한다. 아릴은 임의로 치환된 카르보시클릭 아릴을 포함한다. 적합한 아릴기의 예는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐 등을 포함한다.

헤테로시클릭 아릴은 하나 이상의 비탄소 원자를 포함하는 접합된 pi-전자 고리계를 갖는 하나 이상의 고리를 갖는 임의로 치환된 방향족기를 의미한다. 헤테로시클릭 아릴 부분은 전형적으로는 하나의 고리 또는, 바이시클릭 및 트리시클릭과 같은 다중 융합 고리 구조를 포함한다. 적합한 헤테로시클릭 아릴기의 예는 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피리디닐 등을 포함한다.

알콕시는 알킬기에 산소가 연결된 것을 의미한다. 저급 알콕시는 저급 알킬기에 산소가 연결된 것을 의미한다. 하나의 구현예에서, 산소는 1 내지 4 개 탄소 길이인 비치환 알킬에 연결된다. 예를 들어, 알콕시는 메톡시, 에톡시 등일 수 있다.

알킬렌은 탄소 원자 사이에 오직 탄소-탄소 단일 결합만을 포함하는 임의로 치환된 탄화수소 사슬을 의미한다. 알킬렌 사슬은 1 내지 6 개 탄소를 가지며 다른 기능기 또는 구조적 부분에 대해 2 개 위치에서 부착된다. 적합한 알킬렌기의 예는 메틸렌, 에틸렌 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 소형 분자는 저분자량 화합물을 의미한다. 예를 들어 특정 구현예에서, 이러한 소형 분자 화합물은 50 달톤 내지 800 달톤의 분자량을 나타내는 화합물이다. 대안적인 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 소형 분자는 100 달톤 내지 500 달톤, 250 달톤 내지 475 달톤의 범위에서 선택되는 분자량을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 '대상' 은 투여의 임의의 표적을 의미한다. 대상은 척추동물, 예를 들어 포유류일 수 있다. 따라서, 대상은 인간일 수 있다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 의미하지 않는다. 따라서, 성인 및 신생 대상 뿐만 아니라 태아 (남성 또는 여성) 가 포함되는 것으로 의도된다. 용어 '환자' 는 병리적 상태로 고생하는 대상을 의미한다. 용어 '환자' 는 인간 또는 수의적 대상을 포함한다.

'억제한다', '억제하는' 및 '억제' 는 활성, 반응, 상태, 질환 또는 기타 생물학적 매개변수를 방지, 감소, 비활성화 또는 반전시키는 것을 의미한다. '억제한다', '억제하는' 및 '억제' 는 활성, 반응, 상태 또는 질환의 완전한 제거를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한, '억제한다', '억제하는' 및 '억제' 는 예를 들어 활성, 반응, 상태, 질환 또는 기타 생물학적 매개변수를 천연 수준 (용어 '천연 수준' 은 억제제의 부재 하에 명백한 수준을 의미함) 과 비교하여 늦추거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, '억제한다', '억제하는' 및 '억제' 는 예를 들어, 활성, 반응, 상태, 질환 또는 기타 생물학적 매개변수를 천연 수준 (용어 '천연 수준' 은 억제제의 부재 하에 명백한 수준을 의미함) 과 비교하여 반전시키는 것을 포함할 수 있다. 이 문맥에서, 감소는 임의의 측정가능한 감소일 수 있다. 특정 구현예에서, 감소는 예를 들어 천연 수준과 비교하여 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 또는 구체적으로 언급된 백분율 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다.

'촉진한다', '촉진' 및 '촉진하는' 은 활성, 반응, 상태 또는 기타 생물학적 매개변수에서의 보존, 회복 또는 증가를 의미한다. '촉진한다', '촉진' 및 '촉진하는' 은 활성, 반응, 상태 또는 생물학적 매개변수의 개시를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 대안적으로는, '촉진한다', '촉진' 및 '촉진하는' 은 그렇지 않은 경우 관련 활성, 반응, 상태 또는 기타 생물학적 매개변수를 붕괴, 감소 또는 제거할 수 있는 상태를 고려하여 활성, 반응, 상태 또는 기타 생물학적 매개변수의 보존을 포함할 수 있다. 또한, '촉진한다', '촉진' 및 '촉진하는' 은 예를 들어 활성, 반응, 상태 또는 생물학적 매개변수를 천연 또는 대조 수준과 비교하여 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성, 반응, 상태 또는 기타 생물학적 매개변수에서의 증가는 천연 또는 대조 수준 (용어 '천연 수준' 은 촉진제의 부재 하에 명백한 수준을 의미함) 과 비교하여, 구체적으로 언급된 백분율 사이의 임의의 양의 증가를 포함하는, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % 또는 초과의 증가일 수 있다.

용어 '담체' 는 화합물 또는 조성물과 조합된 경우 의도된 용도 또는 목적을 위한 화합물 또는 조성물의 제조, 보관, 투여, 전달, 효능, 선택성 또는 임의의 기타 특징을 지원 또는 촉진하는 화합물, 조성물, 물질 또는 구조를 의미한다. 예를 들어, 담체는 약학 제형을 제공하는데 있어서 사용될 수 있고, 활성제의 임의의 붕괴가 최소화되고 대상에서의 임의의 유해한 부작용이 최소화되도록 선택될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 '치료하다', '치료하는' 및 '치료' 는 그로 인해 특정 병리적 상태, 질환, 상태, 사건 또는 상해의 해로운 효과(들) 또는 진행이 방지, 감소, 중단, 반전 또는 지연되는 치료적 유익을 의미한다.

치료적 유효량은 예를 들어 병리적 상태와 연관된 활성, 반응, 상태, 질환 또는 기타 매개변수를 억제 또는 반전시킴으로써와 같이 치료적 유익을 달성시키는 화합물의 양이다. 치료적 유효량은 대상에서의 병리적 상태의 하나 이상의 증상을 적어도 어느 정도까지 경감시키고; 병리적 상태와 연관되거나 그 원인이 되는 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 매개변수를 부분적으로 또는 완전히 정상으로 회복시키고/거나; 병리적 상태의 개시 가능성을 감소시키는 양일 수 있다.

용어 '병리적' 또는 '병리적 상태' 는 질환, 상태, 사건 또는 상해의 결과일 수 있는, 건강한, 정상인 또는 유효한 상태로부터의 임의의 이탈을 의미한다.

본원에서 그 용어가 사용되는 바와 같이, 단백질 및 펩티드는 일반적으로 폴리펩티드 분자를 의미하며 임의의 특정한 크기, 길이 또는 분자량의 폴리펩티드 분자를 의미하는데 사용되지는 않는다. 단백질 변이체 및 유도체는 당업자에게 잘 이해되며 아미노산 서열 변경을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 변경은 전형적으로는 치환, 삽입 또는 결실 변이체의 세 개의 클래스 중 하나 이상에 해당된다. 삽입물은 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입물을 포함한다. 삽입물은 보통 아미노 또는 카르복실 말단 융합물보다 작은 삽입물일 것이다 (예를 들어 약 1 내지 4 개 잔기). 실시예에서 기술되는 것과 같은 면역원성 융합 단백질 유도체는 목표 서열에 면역성을 부여하기에 충분히 큰 폴리펩티드를 시험관내 가교에 의해 융합시킴으로써 또는 융합물을 인코딩하는 DNA 로 형질전환된 재조합 세포 배양물에 의해 생성된다. 결실은 단백질 서열로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 전형적으로는, 약 2 내지 6 개 이하의 잔기가 단백질 분자 내 임의의 한 위치에서 결실된다. 이들 변이체는 보통 단백질 인코딩 DNA 내 뉴클레오티드의 위치-특이적 돌연변이생성, 그로 인한 변이체 인코딩 DNA 생성, 그후 재조합 세포 배양물 내 DNA 발현에 의해 제조된다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내 소정의 위치에서 치환 돌연변이를 생성하기 위한 기술은 공지되어 있고, 예를 들어 M13 프라이머 돌연변이생성 및 PCR 돌연변이생성이 있다. 아미노산 치환은 전형적으로는 단일 잔기의 것이나, 다수의 상이한 위치에서 한번에 발생할 수 있고; 삽입물은 통상 약 1 내지 10 개 아미노산 잔기일 것이며; 결실물은 약 1 내지 30 개 잔기의 범위일 것이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접 쌍에서 생성된다 (즉, 2 개 잔기의 결실 또는 2 개 잔기의 삽입). 치환, 결실, 삽입 또는 이의 임의의 조합은 최종 구성물에 도달하도록 조합될 수 있다. 돌연변이는 판독 프레임 밖의 서열에서 일어나서는 안 되며 바람직하게는 2 차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적 부위를 생성하지 않을 것이다. 치환 변이체는 당업계에서 잘 이해되며 하나 이상의 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것이다. 전형적으로는, 당업계에 공지된 바와 같이 치환 변이체 형성에서 생성되는 치환은 보존적 치환이며, 흔히 치환 변이체는 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 특징 (예를 들어 순환하는 반감기, 안정성 등) 을 증강시키는 한편 폴리펩티드의 생물학적 활성이 유지 또는 개선시키도록 생성될 수 있다.

기능 또는 면역학적 정체성에서의 치환적 변화는 하기를 유지하는 효과가 상이한 치환을 선택함으로써 생성된다: (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조 (예를 들어 시트 또는 나선형 형태), (b) 표적 위치에서의 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 측쇄의 벌크. 일반적으로 단백질 특성에 최대 변화를 생성시키는 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들어 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예를 들어 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐으로 (또는 이에 의해) 치환되거나; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기로 (또는 이에 의해) 치환되거나; (c) 양전성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 라이실, 아르기닐 또는 히스티딜이 음전성 잔기, 예를 들어 글루타밀 또는 아스파르틸로 (또는 이에 의해) 치환되거나; 또는 (d) 벌키 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 것, 예를 들어 글리신으로 (또는 이에 의해) 치환되는, 이 경우 (e) 황화 및/또는 글리코실화를 위한 위치 수를 증가시키는 것에 의한 치환일 것이다.

예를 들어, 1 개의 아미노산 잔기의 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 또다른 잔기에 의한 대체는 당업자에게 보존적 치환으로 알려져 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 1 개의 소수성 잔기를 또다른 소수성 잔기로, 또는 1 개의 극성 잔기를 또다른 극성 잔기로 대체할 것이다. 치환은 예를 들어 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr 과 같은 조합을 포함한다. 각각 명확히 개시된 서열의 이러한 보존적으로 치환된 변이체는 본원에서 제공되는 폴리펩티드 내에 포함된다.

치환 또는 결실 돌연변이생성은 N-글리코실화 (Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화 (Ser 또는 Thr) 에 대한 위치를 삽입하는 데 사용될 수 있다. 또한, 시스테인 또는 다른 불안정 잔기의 결실이 바람직할 수 있다. 잠재적 단백질분해 위치 (예를 들어 Arg) 의 결실 또는 치환은 예를 들어 염기성 잔기 중 하나를 결실시키거나 글루타미닐 또는 히스티딜 잔기로 치환함으로써 달성된다.

재조합적으로 생성된 폴리펩티드의 문맥에서, 특정 번역후 유도체화는 발현된 폴리펩티드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 흔히 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기로 번역후 탈아미드화된다. 대안적으로는, 이들 잔기는 약간 산성인 조건 하에 탈아미드화된다. 다른 번역후 수식은 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983], 본원에서 참조로 포함됨), N-말단 아민의 아세틸화, 및 일부 경우 C-말단 카르복실의 아미드화를 포함한다.

본원에서 개시되는 폴리펩티드의 유도체, 유사체 및 상동체를 정의하는 하나의 방법은 특정 공지 서열에 대한 상동성/동일성의 면에서 유도체, 유사체 및 상동체를 정의하는 것에 의한다는 것이 이해된다. 당업자는 두 단백질의 상동성을 어떻게 결정하는가를 쉽게 이해한다. 예를 들어, 상동성은 두 서열을 정렬하여 상동성이 최고 수준이 된 후 계산될 수 있다.

상동성을 계산하는 또다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 [Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)] 의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, [Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)] 의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)] 의 유사성 방법 탐색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화 실행에 의해 (Wisconsin Genetics Software Package 내 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.

개시된 폴리펩티드 내로 편입될 수 있는 다수의 아미노산 및 펩티드 유사체가 존재하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 다수의 D 아미노산 또는 상이한 기능적 치환기를 갖는 아미노산이 존재하며, 상기 아미노산을 표 1 에 나타내었다. 자연적으로 발생하는 펩티드의 반대 입체 이성질체 뿐만 아니라 펩티드 유사체의 입체 이성질체가 개시된다. 이들 아미노산은, 선택한 아미노산으로 tRNA 분자를 하전시키고, 예를 들어 앰버 코돈을 이용하는 유전적 구성물을 조작하여 유사체 아미노산을 펩티드 사슬 내로 위치 특이적 방식으로 삽입시킴으로써, 폴리펩티드 내로 편입될 수 있다 (Thorson et al, Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994), 이들 모두 본원에서 참조로 포함됨).

D-아미노산은 보다 안정적인 펩티드를 생성하는데 사용될 수 있는데, 이는 D 아미노산이 펩티다아제 등에 의해 인지되지 않기 때문이다. 공통 서열의 하나 이상의 아미노산의, 동일 유형의 D-아미노산으로의 시스템적 치환 (예를 들어 L-라이신 대신 D-라이신) 이 사용되어 더욱 안정한 펩티드를 생성할 수 있다. 시스테인 잔기가 사용되어 2 이상의 펩티드를 함께 환형화시키거나 부착시킬 수 있다. 이는 펩티드를 특정 형태 내로 제한시키는 데 유익할 수 있다 (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), 본원에서 참조로 포함됨).

본원에서 사용되는 바와 같은, 혈관 투과성은 소형 분자 (예를 들어 이온, 물, 영양분), 대형 분자 (예를 들어 단백질 및 핵산) 또는 심지어 전체 세포 (염증 위치로 가는 림프구) 의 혈관벽을 통과하는 능력을 의미한다.

II. ROBO4 신호전달 경로

Robo4 신호전달이 병리적 혈관생성 및 혈관신생을 억제하는 신호전달 경로가 국제 공개 No. WO 2009/129408, 국제 공개 No. WO 2008/073441 및 Jones et al. (CA. Jones et al., 2008. Robo4 stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability. Nat Med 14:448-453) 에 기술되어 있다. 상기 참조에 기술되어 있는 바와 같이, Robo4 의 발현은 Slit2 에 대한 반응성을 부여하고, Slit2-Robo4 신호전달은 세포 부착에 의해 자극되는 세포 돌출 활성을 음성적으로 조절한다. 상기 음성 조절은, GIT1 과 같은 ARF-GAP 를 동원하는, 어댑터 단백질, 팍실린 및 그의 파랄로그와 Robo4 의 상호작용에 의해 매개되고, ADP 리보실화 인자 6 (ARF6) 의 국부적 비활성화를 초래한다. 상기 신호전달 경로 (도 10 에 나타냄) 는 그렇게 함으로써 부착-매개 Rac1 활성화 및 세포 돌출을 방해한다. 도 10 에 나타낸 신호전달 경로는 Robo-4 신호전달 경로를 조정하기 위한 다중 표적을 나타내며, Jones et al., 국제 공개 No. WO 2009/129408 및 국제 공개 No. WO 2008/073441 은 Robo4 신호전달 경로에 수반되는 ARF-GAP 및 ARF-GEF 의 조정이 Slit/Robo4 신호전달 없이 달성될 수 있음을 추가로 기술한다. Jones et al., 국제 공개 No. WO 2009/129408 및 국제 공개 No. WO 2008/073441 의 각각의 내용은 본원에서 참조로서 포함된다.

Robo4 신호전달은 다중의 상이한 염증 매개체의 존재 하에 혈관 완전성을 보존하는 작용을 한다. 예를 들어, Robo-4 신호전달 경로는, 각각이 공지된 염증 매개체인, 내독소 (예를 들어, 지질다당류 또는 "LPS"), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 인터루킨-1β ("IL-1β") 의 존재 하에 혈관 완전성을 보존하는 데 이용될 수 있다 (Dinarello, CA. 1997. Proinflammatory and antiinflammatory cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Chest 112:321S-329S). 더욱이, Robo-4 신호전달 경로는 예를 들어, 폐, 신장 및 비장 내와 같은 다수의 상이한 조직 내 내피 장벽 기능을 보존하는 기능을 한다. 나아가, Robo4 신호전달 경로는 급성 염증성 반응과 연관된 상태에서 혈관 완전성을 보존하는 역할을 할 뿐만 아니라, Robo-4 신호전달 경로는 급성 및 만성 폐 염증의 모델의 생체내 내피 장벽 기능을 보존하는 데 이용될 수 있다.

II. 활성제 & 조성물

본원에서 기술되는 활성제 및 조성물은 혈관 장벽 기능을 촉진하는 역할을 한다. 각각의 구현예에서, 본원에서 기술되는 조성물은 혈관 장벽 기능을 촉진할 수 있는 하나 이상의 활성제를 포함하고, 하나의 상기 구현예에서, 본원에서 기술되는 조성물은 혈관 내피의 장벽 기능을 촉진하는 활성제를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본원에서 기술되는 조성물은 폐의 혈관 내피, 신장의 혈관 내피 및 비장의 혈관 내피 중 하나로부터 선택되는 내피 조직 내 혈관 장벽 기능을 촉진하는 활성제를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물은 급성 폐 염증을 초래하는 상태 뿐만 아니라, 폐 섬유증의 발달 및 진행과 같은 만성 폐 염증과 연관된 상태와 연관된 혈관 투과성을 억제하는 활성제를 포함한다. 본원에서 제공되는 실험적 실시예에 의해 설명되는 바와 같이, 본 명세서에 따른 활성제는 특정 구현예에서 예를 들어, 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 를 포함하는 염증 및 혈관 투과성의 다중 매개체의 존재 하에 혈관 장벽 기능을 촉진한다.

특정 구현예에서, 본원에서 기술되는 활성제 및 조성물은 폐 섬유증과 같은 병리적 상태 뿐만 아니라, 급성 폐 혈관 염증과 연관된 다른 상태를 앓는 대상을 치료하는 데 적합하다. 하나의 상기 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물은 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증의 발달 또는 진행과 연관된 급성 폐 혈관 부종, 급성 폐 혈관 염증 및 만성 폐 혈관 염증 중 하나 이상을 억제하는 활성제를 포함한다. 또다른 상기 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물은 미생물의 내독소에 노출되거나, 조류 인플루엔자 감염과 같은 인플루엔자 감염을 앓는, 인간을 포함하는 동물 내 혈관 장벽 기능을 촉진하는 활성제를 포함한다. 추가의 구현예에서, 본원에서 기술되는 조성물은 세균성 패혈증, 또는 조류 인플루엔자 감염과 같은 인플루엔자 감염과 같은 병리적 상태와 연관된 혈관 투과성을 억제하고 혈관 장벽 기능을 촉진하는 활성제를 포함한다.

혈관 내피에서, 중요한 안정화 상호작용은 부착 연접 단백질, 혈관 내피 카드헤린 (VE-카드헤린) 에 의해 매개된다(Dejana, E., F. Orsenigo, and M.G. Lampugnani. 2008. The role of adherens junctions and VE-cadherin in the control of vascular permeability. J Cell Sci 121:2115-2122; Vestweber, D. 2008. VE-cadherin: the major endothelial adhesion moleccule controlling cellular junctions and blood vessel formation. Arterioscler Thromb Vase Biol 28:223-232). VE-카드헤린 표면 발현은 p120-카테닌의 VE-카드헤린과의 연합에 의해 조절되고, p120-카테닌의 VE-카드헤린과의 연합은 세포 표면으로부터의 VE-카드헤린 내부화를 억제하고 혈관 안정성을 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Potter, M.D., S. Barbero, and D.A. Cheresh. 2005. Tyrosine phosphorylation of VE-cadherin prevents binding of p120- and beta-catenin and maintains the cellular mesenchymal state. J Biol Chem 280:31906-31912; Xiao, K., J. Garner, K.M. Buckley, P.A. Vincent, CM. Chiasson, E. Dejana, V. Faundez, and A.P. Kowalczyk. 2005. p120-Catenin regulates clathrin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Mol Biol Cell 16:5141-5151). 특정 구현예에서, 본원에서 기술되는 활성제는 세표 표면 연접에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진한다. 하나의 상기 구현예에서, 본 명세서에 따른 활성제는 세표 표면 p120-카테닌 발현을 촉진한다. 특정 이론에 구속됨 없이, 세표 표면 p120-카테닌의 발현을 촉진함에 있어서, 상기 구현예는 VE-카드헤린 및 p120-카테닌 사이의 연합을 보존하고 그렇게 함으로써, 그렇지 않은 경우 하나 이상의 염증 매개체 (예를 들어, 하나 이상의 사이토카인) 의 존재 하에 발생할 수 있는, VE-카드헤린 세포내이입을 감소시킴으로써 혈관 완전성을 촉진하는 것으로 현재 여겨진다. 그러므로, 특정 구현예에서 본원에서 기술되는 활성제는, 혈관 내피 세포와 같은 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 것 및 혈관 내피 세포와 같은 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진하는 것 중 하나 또는 모두에 의해, 인간을 포함하는 동물 내 혈관 장벽 기능을 촉진한다.

본 명세서에 따른 활성제는 Slit2 폴리펩티드와 같은 Slit 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 바와 같은 Slit2 폴리펩티드를 검토하는 경우, 전장 Slit2 단백질 뿐만 아니라, 전장 Slit2 단백질의 유도체, 유사체 및 상동체가, 상기 폴리펩티드가 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능을 촉진하거나, 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출을 억제하거나, 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하거나, 또는 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진한다는 전제 하에, 고려될 수 있다. 유도체 폴리펩티드 분자는 천연(native) 화합물로부터 직접적으로 또는 수식 또는 부분적 치환에 의해 형성되는 폴리펩티드를 언급한다. 상동체 폴리펩티드 분자는 상이한 종으로부터 유래되는 특정 유전자의 폴리펩티드 산물을 언급한다. 유사체 폴리펩티드 분자는 구조가 유사하나 동일하지는 않고, 참조되는 폴리펩티드 서열 내에 포함되는 아미노산의 수 또는 성질의 면에서 상이한 폴리펩티드이다. 예를 들어, 소정의 폴리펩티드에 대한 유사체는 서열 상동성의 수준을 나타낼 것이나, 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 활성제가 Slit2 폴리펩티드인 경우, 활성제는 인간 Slit2 폴리펩티드와 같은 포유류 Slit2 폴리펩티드로부터 선택될 수 있다. 활성제가 포유류 Slit2 인 경우, 활성제는 예를 들어, SEQ ID NO: 1 로 나타내는 Slit2 폴리펩티드와 같은 공지된 전장 자연적으로 발생하는 포유류 Slit2 폴리펩티드 뿐만 아니라, 하기 중 하나 이상이 가능한 그의 유도체, 유사체 및 상동체로부터 선택될 수 있다: 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능을 촉진하고; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출을 억제하고; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하고; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진함. 쉽게 이해될 바와 같이, 자연적으로 발생하는 Slit2 폴리펩티드는 당업계에서 공지된 기술에 따라 단리 및 정제될 수 있다 (Wang, KH et al. 1999. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell Mar 19;96(6):771-84; Chedotal, A. 2007. Slits and their receptors. Adv Exp Med Biol 621:65-80).

자연적으로 발생하는 Slit2 폴리펩티드에 부가하여, 본원에서 고려되는 바와 같은 Slit2 활성제는 당업계에서 공지된 재조합 또는 합성 제조 기술을 통해 수득될 수 있다. 또한, 활성제는 자연적으로 발생하는, 재조합 또는 합성 포유류 Slit2 폴리펩티드의 유도체, 유사체 또는 상동체로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, Slit2 활성제는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3 으로 나타내는 절편과 같은 자연적으로 발생하는 Slit2 단백질의 절편 뿐만 아니라, 하기 중 하나 이상이 가능한 그의 유도체, 유사체 및 상동체로부터 선택될 수 있다: 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능을 촉진하고; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출을 억제하고; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하고; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진함.

여전히 다른 구현예에서, SEQ ID NO: 4 내지 SEQ ID NO: 12 로 나타내는 Slit2 폴리펩티드가 활성제로서 사용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 따른 활성제는 Slit2N (SEQ ID NO: 4), SEQ ID NO: 5 로 나타내는 Slit2 폴리펩티드, Slit2ΔP (SEQ ID NO: 6), Slit2 D1 (SEQ ID NO: 7), Slit2 D1-D2 (SEQ ID NO: 8), Slit2 D1-D3 (SEQ ID NO: 9), Slit2 D1-D4 (SEQ ID NO: 10), Slit2 D1-E5 (SEQ ID NO: 11) 및 Slit2 D1-E6 (SEQ ID NO: 12) 뿐만 아니라, 하기 중 하나 이상이 가능한 그의 유도체, 유사체 및 상동체로부터 선택될 수 있다: 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능을 촉진하고; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출을 억제하고; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하고; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진함.

여전히 다른 구현예에서, 활성제가 본원에서 기술되는 Slit2 폴리펩티드 중 하나의 유도체, 유사체 또는 상동체로부터 선택되는 경우, 활성제는 자연적으로 발생하는 포유류 Slit2 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 4 내지 SEQ ID NO: 12 로 나타내는 Slit2 폴리펩티드 중 하나의 유도체, 유사체 또는 상동체로부터 선택될 수 있고, 상기 활성제는 관련된 자연적으로 발생하는 포유류 Slit2 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 4 내지 SEQ ID NO: 12 중 임의의 하나에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 초과 이상의 폴리펩티드 서열 상동성을 나타낸다. 각각의 상기 구현예에서, 유도체, 유사체 또는 상동체는 하기 중 하나 이상에 대한 능력으로 선택된다: 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능을 촉진하고; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출을 억제하고; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하고; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진함.

또다른 구현예에서, 활성제는 자연적으로 발생하는 포유류 Slit2 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 4 내지 SEQ ID NO: 12 로 나타내는 Slit2 폴리펩티드 중 하나의 유도체, 상동체 또는 유사체이지만, 기원이 되는 폴리펩티드에 대해 예를 들어, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하 또는 50% 이하 중 하나로부터 선택되는 상동성과 같은 더 낮은 폴리펩티드 서열 상동성을 나타내는 한편, 하기 중 하나 이상에 대한 능력을 보유한다: 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능을 촉진하고; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출을 억제하고; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하고; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진함.

하나의 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제는 Robo4 수용체의 리간드이다. 상기 하나의 구현예에서, Robo4 의 리간드는 Robo4 를 통해 작용하여 혈관 장벽 기능을 촉진하는 임의의 분자일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 표현 통해 작용한다는 것은 Robo4 수용체의 존재를 요구하는 내피 세포에 대한 효과를 갖는 리간드를 언급한다. 하나의 구현예에서, 내피 세포에 효과를 갖는 리간드는 Robo4 수용체와 결합 또는 연합됨으로써 Robo4 신호전달을 초래하는 방식으로 Robo4 를 통해 작용할 수 있다. 특정 이론에 구속됨 없이, 본원에서 기술되는 Slit2 폴리펩티드는 Robo4 수용체를 통해 작용하는 것으로 현재 여겨진다. 그러므로, 본 명세서에 따른 활성제가 Robo4 수용체의 리간드인 특정 구현예에서, 활성제는 본원에서 기술되는 Slit 폴리펩티드로부터 선택될 수 있다. 또다른 상기 구현예에서, Robo4 의 리간드는 Robo4 를 통해 작용하여 세표 표면 연접에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 임의의 분자일 수 있다. 특정 구현예에서, Slit 리간드, 또는 그의 절편 또는 변이체는 하기 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 Robo4 와 결합 또는 연합된다: 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진.

다시 또다른 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제는, 리간드가 Robo4 를 통해 작용하여 p120-카테닌의 세표 표면 발현을 촉진하는, Robo4 의 리간드일 수 있다. 여전히 추가의 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제는, 리간드가 Robo4 를 통해 작용하여 GIT1 의 팍실린 활성화를 개시하는, Robo4 수용체의 리간드를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제는, 리간드가 Robo4 를 통해 작용하여 ARF6 의 GIT1 억제를 활성화시키는, Robo4 수용체의 리간드를 포함한다. 추가의 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제는, 리간드가 하기 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 Robo4 를 통해 작용하는, Robo4 수용체의 리간드를 포함한다: 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진. 본 발명의 활성제가 Robo4 의 리간드를 포함하는 경우, 특정 구현예에서 상기 리간드는 Robo4 의 세포외 영역에 결합하여 Robo4 신호전달을 초래하는 분자일 수 있다.

원하는 구조의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법 및 물질을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 폴리펩티드를 단리하거나 재조합 폴리펩티드를 제조하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 더욱이, 원하는 서열의 폴리펩티드를 합성적으로 제조하는 다양한 방법에 공지되어 있다. 예를 들어, 펩티드는 Fmoc (9-플루오레닐메틸옥시카르보닐) 또는 Boc (테르트-부틸옥시카르보닐) 화학을 사용하는 현재 입수가능한 실험 장비를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). 본원에서 기술되는 Slit 폴리펩티드는 본원에서 기술되는 방법 및, 예를 들어, 국제 공개 No. WO 2009/129408, 국제 공개 No. WO 2008/073441 에 기술된 방법을 포함하는 당업자에게 공지된 재조합 및 합성 기술을 통해 수득될 수 있다.

당업자는 원하는 단백질에 상응하는 펩티드가 표준 화학 반응에 의해 합성될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어, 하나의 펩티드는 합성되고 그의 합성 레진으로부터 절단되지 않을 수 있는 반면에, 단백질의 또다른 펩티드 절편은 합성되고 이어서 레진으로부터 절단됨으로써, 다른 절편에 대해 기능적으로 차단된 말단기를 노출시킬 수 있다. 펩티드 축합 반응에 의해, 상기 2 개의 절편은 카르복실 및 아미노 말단에서 펩티드 결합을 통해 공유결합으로 연결되어, 각각 항체 또는 그의 절편을 형성할 수 있다. (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY (적어도 펩티드 합성과 관련되는 물질에 관해 본원에서 참조로서 포함됨). 대안적으로는, 원하는 단백질 또는 펩티드는 표준 재조합 기술을 사용하여 생체내 합성될 수 있다. 연결되어 원하는 단백질을 형성할 독립적 펩티드가 독립적으로 생체내 제조되는 경우, 상기 독립적 펩티드는 제조되고 단리되자마자 유사한 펩티드 축합 반응을 통해 연결되어 원하는 단백질 또는 그의 절편을 형성할 수 있다.

예를 들어, 클론 또는 합성 펩티드 분절의 효소적 결찰은 비교적 짧은 펩티드 절편이 연결되어 더 큰 펩티드 절편, 폴리펩티드 또는 전체 단백질 영역을 생산하는 것을 가능하게 한다. (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). 대안적으로는, 합성 펩티드의 천연 화학적 결찰이 이용되어 더 짧은 펩티드 절편으로부터 큰 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성적으로 구성할 수 있다. 상기 방법은 2 단계 화학 반응으로 이루어진다. (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). 첫번째 단계는 비보호된 합성 펩티드--티오에스테르와, 아미노-말단 Cys 잔기를 함유하는 또다른 비보호된 펩티드 분절과의 화학선택적 반응으로 초기 공유결합 산물로서 티오에스테르-연결된 중간체를 생성한다. 반응 조건들의 변화 없이, 상기 중간체는 자발적이고 신속한 분자내 반응을 수행하여 결찰 부위에서 천연 펩티드 결합을 형성한다. (Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).

대안적으로는, 화학적 결찰의 결과로서 펩티드 분절 사이에 형성되는 결합이 비정상적 (비-펩티드) 결합인 곳에서 비보호된 펩티드 분절이 화학적으로 연결된다 (Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). 상기 기술은 단백질 영역의 유사체 뿐만 아니라 전 생물학적 활성을 갖는 비교적 순수한 단백질을 대량 합성하는데 사용되어 왔다. (deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)).

또다른 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제는 사이토헤신의 ARNO 패밀리로부터 선택되는 사이토헤신의 활성을 억제하는 소형 분자 활성제일 수 있다. ARF6 및 ARF1 과 같은 하나 이상의 ARF 의 억제를 초래하는 방식으로, 사이토헤신, 사이토헤신의 ARNO 패밀리로부터 선택되는 사이토헤신, 또는 ARNO 와 같은 ARF-GEF 의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 화합물로부터 선택되는 소형 분자 활성제가 Jones et al., 국제 공개 No. WO 2009/129408 및 국제 공개 No. WO 2008/073441 에 기술되어 있다. 본원에서 기술되는 조성물 및 방법의 문맥에서, ARF6 및 ARF1 과 같은 하나 이상의 ARF 의 억제를 초래하는 방식으로, 사이토헤신, 사이토헤신의 ARNO 패밀리로부터 선택되는 사이토헤신, 또는 ARNO 와 같은 ARF-GEF 의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 소형 분자 활성제가 폐 혈관 투과성 및/또는 염증 및 결과로서 발달할 수 있는 폐 섬유증을 억제할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

특정 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 소형 분자 활성제는 하기 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 사이토헤신의 ARNO 패밀리로부터 선택되는 사이토헤신의 활성을 억제한다: ARF6 의 활성 또는 이용가능성의 억제; ARF1 의 활성 또는 이용가능성의 억제; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진. 또다른 구현예에서, 상기 소형 분자 활성제는 하기 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 ARNO 의 활성을 억제한다: ARF6 의 억제; 혈관 내피 장벽 기능의 보존; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진. 다시 또다른 구현예에서, 상기 소형 분자 활성제는 ARF6 의 활성 또는 이용가능성을 억제하여, 하기 중 하나 이상을 초래한다: 혈관 내피 장벽 기능의 보존; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진.

특정 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제는 SecinH3 일 수 있고, 그의 구조가 도 9 에서 제시된다. SecinH3 은 사이토헤신의 억제제이다 (예를 들어, Hafner et al., Inhibition of cytohesins by SecinH3 leads to hepatic insulin resistance, Nature (2006), 444, 941-944, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/053903 을 참조, 이들 내용이 모두 본원에서 참조로서 포함됨). SecinH3 은 염증 및 혈관 투과성의 매개체의 효과를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 하나의 구현예에서, SecinH3 은 ARF6 및 ARF1 로부터 선택되는 ARF 의 억제를 초래하는 방식으로 사이토헤신의 ARNO 패밀리로부터 선택되는 사이토헤신의 활성을 억제하고, 하기 중 하나 이상을 제공하는 소형 분자 활성제로서 선택될 수 있다: 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진.

또다른 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물은 하기 중 하나 이상을 초래하는 방식으로 사이토헤신, 사이토헤신의 ARNO 패밀리로부터 선택되는 사이토헤신, 또는 ARNO 와 같은 ARF-GEF 의 이용가능성, 활성화 또는 활성을 억제하는 화합물로부터 선택되는 하나 이상의 소형 분자 활성제를 포함한다: ARF6 의 활성 또는 이용가능성의 억제; ARF1 의 활성 또는 이용가능성의 억제; 혈관 내피 장벽 기능의 보존; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진.

본 명세서에 따른 활성제가 소형 분자 활성제를 포함하는 경우, 특정 구현예에서 상기 활성제는 하기 화학식 (화학식 1) 을 갖는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화합물 또는 수화물을 포함할 수 있다:

(식 중:

R¹ 및 R³ 은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 시클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로고리로부터 독립적으로 선택되고;

R² 는 수소, 저급 알콕시, 저급 알킬, 할로겐 또는 히드록시로부터 선택되고;

Z 는 O, S, NH, 알킬렌 또는 단일 결합으로부터 선택됨).

하나의 상기 구현예에서, 상기 하나 이상의 화합물은 화학식 1 로 기술되는 바와 같은 화합물로부터 선택되고, R³ 은 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 헤테로원자 저급 알킬, 히드록시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5 개의 치환기로 치환되고, 2 개의 치환기는 함께 융합된 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있다. 또다른 상기 구현예에서, 상기 하나 이상의 화합물은 화학식 1 로 기술되는 바와 같은 화합물로부터 선택되고, R¹ 은 비치환 아릴 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택되고; R² 는 수소, 저급 알콕시 또는 저급 알킬로부터 선택되고; R³ 은 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5 개의 치환기로 임의로 치환된 아릴로부터 선택되고, 2 개의 치환기는 함께 융합된 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있고; Z 는 O, S 또는 단일 결합으로부터 선택된다.

또다른 구현예에서, 본 명세서에 따른 활성제가 소형 분자 활성제를 포함하는 경우, 상기 활성제는 하기 화학식 (화학식 2) 을 갖는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화합물 또는 수화물로부터 선택될 수 있다:

(식 중:

R¹ 은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 시클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로고리로부터 선택되고;

Z 는 O, S, NH, 알킬렌 또는 단일 결합으로부터 선택되고;

X 는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 헤테로원자 저급 알킬, 히드록시 또는 메틸렌 디옥시로부터 독립적으로 선택되고, 2 개의 치환기는 함께 융합된 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리 구조를 형성할 수 있고;

m 은 0 내지 5 임).

하나의 상기 구현예에서, 상기 하나 이상의 화합물은 하기 화합물, 또는 그의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화합물 또는 수화물로부터 선택된다:

또는

.

Jones et al., 국제 공개 No. WO 2009/129408 및 국제 공개 No. WO 2008/073441 에서 기술되는 바와 같이, Robo4 의 활성화는, Robo4 와 어댑터 단백질, 팍실린 및 그의 파랄로그 사이의 상호작용을 초래하여, GIT1 과 같은 ARF-GAP 를 동원하고, ARF6 의 국부적 비활성화를 초래하는 것으로 여겨진다. AFR-GAP 및 ARF-GEF 의 조정이 Robo4 신호전달 없이 달성될 수 있다는 것이 Jones et al., 국제 공개 No. WO 2009/129408 및 국제 공개 No. WO 2008/073441 에서 추가로 기술된다. 특정 이론에 구속됨 없이, 본원에서 기술되는 소형 분자 활성제는, Robo4 리간드의 사용 또는 Robo4 의 직접적 활성화를 요구하지 않으면서, 본원 및 Jones et al., 국제 공개 No. WO 2009/129408 및 국제 공개 No. WO 2008/073441 에서 기술되는 바와 같은 Robo4 신호전달의 유익을 적어도 부분적으로 달성함으로써 기능할 수 있다고 현재 여겨진다.

본원에서 기술되는 바와 같은 활성제를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 상기 조성물은 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제를 하나 이상 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조성물은 약학적 제형물로서 제조된다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 바와 같은 하나 이상의 활성제에 부가하여, 약학적 제형물은 약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 하나 이상의 약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하여 치료적 투여에 적합한 제형물을 제공할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 약학적으로 수용가능한 은 생물학적으로 또는 다른 면에서 바람직하지 않지 않은 물질을 언급하며, 예를 들어, 상기 물질은 원하는 활성제 (예를 들어, 본원에서 기술되는 바와 같은 원하는 활성제) 와 함께 대상에게 투여하는 데 적합하고, 상기 물질이 함유되는 약학적 제형물의 다른 성분과 상용성이다. 상기 담체 및 임의의 부형제(들)은 대상 내 유해한 부작용 또는 활성제의 임의의 붕괴를 최소화하기 위해 자연적으로 선택될 것이다.

본 발명에 따른 약학적 제형물은 투여에 적합한 임의의 형태, 예컨대, 예를 들어, 정제 조성물, 캡슐화용 분말 조성물, 직접적 섭취, 캡슐화 또는 비경구 전달용 용액 조성물, 에멀전, 겔, 크림, 좌약, 또는 현탁액, 예컨대, 예를 들어, 미립자, 매트릭스 물질 또는 리포솜을 포함하거나 그안으로 포함되는 제형물로 제조될 수 있다. 본원에서 기술되는 바와 같은 약학적 제형물은 항체, 수용체 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 유형을 표적으로 삼는 성분을 포함할 수 있다. 약학적 담체 및 부형제 및 그의 제형물은 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995 를 포함하는 문헌에 잘 기술되어 있다.

적절한 경우, 약학적으로 수용가능한 염 또는 다른 긴장성 조절제가 약학적 제형물 내에 사용되어 제형물을 등장성으로 만들 수 있다. 약학적으로 수용가능한 액체 담체의 예는 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 약학적 제형물이, 특히 비경구 전달을 위해, 용액 또는 현탁액으로서 제공되는 경우, 대상으로의 전달 및/또는, 활성제 또는 다른 제형물 성분의 보존을 촉진하기 위해 제형물의 pH 가 바람직하게 조정될 수 있다. 약학적 제형물을 제조하는 데 적합한 담체 및 부형제는, 예를 들어 공지의 다양한 약학적으로 수용가능한 중합체, 당류, 염, 지질, 인지질, 계면활성제, 겔, 폴리펩티드 및 아미노산을 포함한다. 본 명세서에 따른 약학적 제형물은 지효성 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 투여 경로 및 투여될 조성물의 농도에 따라 특정 담체 및/또는 부형제가 더욱 바람직할 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 본원에서 기술되는 바와 같은 약학적 제형물은 하나 이상의 증점제, 향미료, 희석제, 완충제, 보존제, 항균제, 항염증제, 마취제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다.

활성제 및 조성물은 약학적으로 수용가능한 산- 또는 염기- 부가 염으로서 투여될 수 있다. 상기의 경우, 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산 및 인산과 같은 무기 산, 및 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산 및 푸마르산과 같은 유기산과의 반응에 의해, 또는 수산화 나트륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼륨과 같은 무기 염기, 및 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민과 같은 유기 염기와의 반응에 의해 바람직한 염이 형성될 수 있다.

약학적 제형물을 포함하는 본원에서 개시되는 조성물은 국부 치료 또는 전신 치료 중 어느 것이 바람직한 지에 따라 및 치료될 부위에 따라 다른 다수의 방법으로 투여될 수 있다. 조성물의 비경구적 투여는, 사용되는 경우, 일반적으로 주사에 의해 특징화된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체 내 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태로서, 또는 에멀전으로서 통상적 형태로 제조될 수 있다. 비경구적 투여에 대한 수정된 접근은 일정한 투여량이 유지되게 하는 서방성 또는 지효성 시스템의 사용을 수반한다. (예를 들어, 본원에서 참조로서 포함된 미국 특허 제 3,610,795 호 참조.)

치료적 영향을 달성하기 위해 요구되는 소정의 조성물의 정확한 양은, 대상의 종, 연령, 체중 및 일반적 상태, 치료될 병리적 상태의 중증도, 사용되는 특정 활성제, 투여 방법 등에 따라 대상마다 다를 것이다. 조성물의 투여를 위한 투여량 범위는 치료적 효과를 나타내기에 충분한 만큼 넓은 범위이다. 투여량은 원치 않는 교차 반응, 과민 반응 등과 같은 유해한 부작용의 발생을 회피 또는 감소시키기 위해 조정될 수 있다. 투여량은 연령, 상태, 성별 및 환자 내 질환의 범위, 투여 경로, 또는 요법에 다른 약물이 포함되는지 여부에 따라 다를 것이다. 임의의 반대 징후가 발생한 경우 개인 내과의에 의해 투여량이 조정될 수 있다. 투여량은 변할 수 있고, 1 일 또는 수일 동안, 하루에 하나 이상의 투여량 투여로 투여될 수 있다. 소정의 종류의 약학적 산물에 대한 적절한 투여량에 대해 문헌에서 안내가 발견될 수 있다.

III. 방법

혈관 내피 장벽 기능을 촉진하는 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 혈관 내피 장벽 기능을 촉진하는 방법은 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제에 의해 하나 이상의 혈관 내피 세포를 치료하는 것을 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 하나 이상의 혈관 내피 세포를 치료하는 단계는 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 수행될 수 있다. 바람직한 경우, 상기 활성제는 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물을 사용하여 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 활성제에 의한 하나 이상의 혈관 내피 세포의 치료는 하기 중 하나 이상을 초래한다: 혈관 내피 장벽 기능의 보존; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진. 하나의 상기 구현예에서, 상기 활성제에 의한 하나 이상의 혈관 내피 세포의 치료는 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 증강시키고 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진한다. 또다른 상기 구현예에서, 상기 활성제에 의한 하나 이상의 혈관 내피 세포의 치료는, 혈관 내피 세포의 하나 이상의 염증 매개체로의 노출 후, 혈관 장벽 기능을 적어도 부분적으로 회복시키고, 하나 이상의 염증 매개체는 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하도록 선택된다. 활성제는 본원에서 기술되는 활성제로부터 선택될 수 있고, 활성제의 투여는 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물을 사용하는 상기 활성제의 투여에 의해 성취될 수 있다.

본원에서 기술되는 혈관 내피 장벽 기능을 촉진하는 방법은 폐의 혈관 내피, 신장의 혈관 내피 및 비장의 혈관 내피 중 하나로부터 선택되는 내피 조직을 포함하는 다양한 상이한 내피 조직 내 장벽 기능을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 그러므로, 특정 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제에 의한 하나 이상의 내피 세포의 치료는 폐의 혈관 내피 세포, 신장의 혈관 내피 세포 및 비장의 혈관 내피 세포로부터 선택되는 혈관 내피 세포를 치료하는 것을 포함할 수 있다.

또다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 급성 폐 혈관 부종, 만성 폐 혈관 부종, 급성 폐 혈관 염증, 만성 폐 혈관 염증, 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증, 세균성 패혈증, 또는 조류 인플루엔자 감염과 같은 인플루엔자 감염을 앓거나 그에 대한 위험에 처한 환자를 치료하는 것을 포함한다. 그러므로, 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 급성 폐 혈관 부종, 만성 폐 혈관 부종, 급성 폐 혈관 염증, 만성 폐 혈관 염증, 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증, 세균성 패혈증, 또는 조류 인플루엔자 감염과 같은 인플루엔자 감염 중 하나 이상을 앓거나 그에 대한 위험에 처한 환자를 식별하고, 그 환자에게 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 경우, 활성제는 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물을 사용하여 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 활성제의 투여는 하기 중 하나 이상을 초래한다: 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 내피 장벽 기능의 촉진; 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진.

또다른 구현예에서, 본 발명의 방법은, 환자가 급성 폐 혈관 부종, 만성 폐 혈관 부종, 급성 폐 혈관 염증, 만성 폐 혈관 염증, 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증, 세균성 패혈증, 또는 조류 인플루엔자 감염과 같은 인플루엔자 감염으로부터 선택되는 병리적 상태를 앓는 경우, 상기 환자 내 혈관 내피 장벽 기능을 회복시키는 것을 포함한다. 더욱이, 병리적 상태 또는 환경적 상태는 예를 들어, 내독소 (예를 들어, LPS), 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α) 및 IL-1β 중 하나 이상과 같은 하나 이상의 염증 매개체의 존재 또는 발현과 추가로 연관될 수 있다. 본원에서 기술되는 바와 같은 혈관 장벽 기능을 회복하는 방법에 있어서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제의 치료적 유효량이 환자에게 투여된다. 바람직한 경우, 상기 활성제는 본원에서 기술되는 조성물을 사용하여 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 활성제의 투여는 하기 중 하나 이상을 초래한다: 혈관 장벽 기능의 회복; 혈관 유출의 억제; 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재의 촉진; 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현의 촉진.

다시 추가의 구현예에서, 본 발명의 방법은 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 방법은 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제에 의해 하나 이상의 혈관 내피 세포를 치료하는 것을 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 하나 이상의 혈관 내피 세포를 치료하는 단계는 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 수행될 수 있다. 바람직한 경우, 상기 활성제는 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물을 사용하여 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 활성제에 의한 하나 이상의 혈관 내피 세포의 치료는 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 것 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진하는 것 중 하나 또는 모두를 초래한다. 하나의 상기 구현예에서, 활성제에 의한 하나 이상의 혈관 내피 세포의 치료는 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 증강시키고, 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진시킨다.

또한, 혈관 내피 장벽 기능을 촉진하는 제제를 선별하고 평가하는 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 명세서에 따른 활성제를 선별하는 방법은 본원에서 기술되는 시험관내 실험 및 생체내 모델을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제를 선별하는 방법의 특정 구현예에서, 상기 방법은 본원에서 제공되는 실험 프로토콜을 이용하여 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 활성제의 능력을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제를 선별하는 방법의 또다른 구현예에서, 상기 방법은 본원에서 제공되는 실험 프로토콜을 이용하여 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진하는 활성제의 능력을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 다시 추가의 구현예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 활성제를 선별하는 방법은 본원에서 제공되는 실험 프로토콜을 이용하여 내피 장벽 기능을 보존하는 활성제의 능력을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 여전히 추가의 구현예에서, 활성제를 선별하는 방법은 본원에서 기술되는 바와 같은 블레오마이신-유도 섬유증의 동물 모델 내에서 폐 섬유증의 형성을 억제하는 활성제의 능력을 평가하는 것을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, ARF6 및 ARF1 과 같은 하나 이상의 ARF 의 활성 또는 이용가능성을 억제하는 것을 초래하는 방식으로, 사이토헤신, 사이토헤신의 ARNO 패밀리로부터 선택되는 사이토헤신, 또는 ARNO 와 같은 표적이 되는 ARF-GEF 의 활성 또는 이용가능성을 억제하는 제제를 식별하는 방법은, 예를 들어 Hafner et al. (Displacement of protein-bound aptamers with small molecules screened by fluorescence polarization, Nat Protoc (2008), 3, 579-587) 에 의해 기술되는 바와 같은 앱타머-전위 선별 검정을 수반한다. 특히, 상기 방법은 본원에서 기술되는 바과 같은 소형 분자의 활성을 식별하고 확인하는 데 사용될 수 있다. 앱타머의 그의 표적과의 연합은 형광 편광에 의해 검출된다. 형광 표지된 앱타머는 비결합 상태에서 낮은 편광을 나타낸다. 표적 단백질에 결합된 경우, 형광 표지된 앱타머의 형광 편광이 증가한다. 소형 분자가 앱타머를 단백질로부터 전위시키는 경우, 형광 표지된 앱타머의 형광 편광이 감소하고, 그로써 형광 표지된 앱타머에 유사한 활성을 나타내는 소형 분자 후보의 식별이 가능하다.

IV. 실시예

하기 실시예는 오직 설명적 목적을 위해 제공되며, 본원에서 기술되는 조성물 및 방법의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것이 의도되지 않는다. 개시되는 조성물 및 방법은 본원에서 기술되는 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 각각의 경우에, 다르게 명기하지 않는 한, 제공되는 실시예에서 기술되는 작업을 실행함에 있어서 표준 물질 및 방법을 사용하였다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전체가 참조로 본원에서 포함된다.

다르게 나타내지 않는 한, 본 발명의 실행은 당업계의 기술에 속하는 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 유전학, 면역학, 세포 생물학, 세포 배양 및 유전자이식 생물학의 통상적 기술을 이용한다 (예를 들어, Maniatis, T., et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.); Sambrook, J., et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel, F. M., et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology, (J. Wiley and Sons, NY); Glover, D. (1985) DNA Cloning, I and II (Oxford Press); Anand, R. (1992) Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press); Guthrie, G. and Fink, G. R. (1991) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby, W. B. and Pastan, I. H. (eds.) (1979) Cell Culture. Methods in Enzymology, Vol. 58 (Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich (NY); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Hogan et al. (eds) (1994) Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조). 인간 염색체 1 의 지도화를 포함하는 인간 유전자 지도화에 대한 기술 및 물질의 일반적 논의는, 예를 들어 [White and Lalouel (1988) Ann. Rev. Genet. 22:259 279] 에서 제공된다. 다르게 나타내지 않는 한, 본 발명의 실행은 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 유전학 및 면역학의 통상적 기술을 이용한다 (예를 들어 Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991 참조).

선행 발명에 의해 본원의 어떠한 것도 본원에서 교시되는 주제가 이러한 개시를 선행하는 자격이 없음을 허용하는 것으로 해석되지 않는다. 선행 기술을 구성하는 임의의 참조도 허용되지 않는다.

실시예 1 - Slit-Robo4 신호전달은 다중 염증 매개체에 의해 유도되는 내피 과투과성을 감소시킴

Slit-Robo4 신호전달은 모두 중요한 염증 매개체인 내독소 (지질다당류, LPS), 종양 괴사 인자-α (TNF-α) 및 인터루킨-1β (IL-1β) 에 의해 유도되는 내피 과투과성을 감소시킨다 (Dinarello, CA. 1997. Proinflammatory and antiinflammatory cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Chest 112:321S-329S). 시험관내 장벽 기능을 연구하기 위해, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 리포터의 확산에 대한 장벽으로서 작용하는 인간 내피 세포 단일층의 능력을 평가하였다. 단백질분해적 절단에 의해 방출되는 Slit 의 활성 절편인 N-말단 절편 (Slit2N) 을 이용하였다 (Chedotal, A. 2007. Slits and their receptors. Adv Exp Med Biol 621:65-80). 도 1a 에서 나타낸 바와 같이, Slit2N 는 LPS, TNF-α 및 IL-1β 유도된 투과성을 유의하게 감소시켰다. 더욱이, Slit2N 의 억제 효과는 Robo4 에 대해 지정된 siRNA 에 노출된 세포에서 소실되었다 (도 1B; 도 14A).

실시예 2 - Slit2-Robo4 는 세포-세포 상호작용을 책임지는 기관을 직접적으로 증강시킴으로써 혈관 안정성을 촉진함

Slit2-Robo4 경로는 세포-세포 상호작용을 책임지는 기관을 직접적으로 증강시킴으로써 혈관 안정성을 촉진한다. 내피에서, 중요한 안정화 상호작용은 부착 연접 단백질, 혈관 내피 카드헤린 (VE-카드헤린) 에 의해 매개된다 (Dejana, E., F. Orsenigo, and M.G. Lampugnani. 2008. The role of adherens junctions and VE-cadherin in the control of vascular permeability. J Cell Sci 121:2115-2122; 및 Vestweber, D. 2008. VE-cadherin: the major endothelial adhesion molecule controlling cellular junctions and blood vessel formation. Arterioscler Thromb Vase Biol 28:223-232). 인간 미세혈관 폐 내피 세포 (HMVEC-폐) 를 Slit2N 으로 치료하는 것이 세포 표면 연접에서 VE-카드헤린 수준을 유의하게 증가시키는 것을 발견하였다 (도 1C, F; 도 14B). VE-카드헤린 표면 발현은 p120-카테닌의 VE-카드헤린과의 연합에 의해 조절되며, 연합은 세포 표면으로부터의 VE-카드헤린 내부화를 억제하고 혈관 안정성을 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Potter, M.D., S. Barbero, and D.A. Cheresh. 2005. Tyrosine phosphorylation of VE-cadherin prevents binding of p120- and beta-catenin and maintains the cellular mesenchymal state. J Biol Chem 280:31906-31912; 및 Xiao, K., J. Garner, K.M. Buckley, P.A. Vincent, CM. Chiasson, E. Dejana, V. Faundez, and A.P. Kowalczyk. 2005. p120-Catenin regulates clathrin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Mol Biol Cell 16:5141-5151). Slit2N 은 또한 세포 표면 p120-카테닌 발현을 증가시키지만 (도 1D), 다른 연접 또는 카테닌 패밀리 일원에 대한 효과는 관찰되지 않았다 (도 1E, 데이터는 나타내지 않음).

실시예 3 - Slit2 는 IL-1β 로의 노출 후 세포 표면에서 VE-카드헤린을 증강시킴

IL-1β 는 세포 표면에서 VE-카드헤린 수준을 감소시키며 Slit2N 은 이 효과를 무효화시켰다 (도 2A). IL-1β 자극은 세포 표면에서 p120-카테닌을 감소시키며 Slit2N 은 이 효과를 반전시켰다 (도 2A). IL-1β 는 VE-카드헤린의 p120-카테닌으로부터의 해리 및 VE-카드헤린의 내부화를 유도하였다 (도 2B, C). Slit2N 는 VE-카드헤린 및 p120-카테닌의 연합을 회복시키며, VE-카드헤린의 내부화를 차단하였다 (도 2B, C). VE-카드헤린 국부화에 대한 Slit2N 의 효과가 혈관 안정성을 증강시키는 능력에 필요한지 여부를 조사하기 위해, 항-VE-카드헤린 항체가 시험관내 투과성에 대한 Slit2N 의 효과를 차단할 수 있는지를 검사하였다. Slit2N 은 비특이적 IgG 의 존재 하에 시험관내 IL-1β-유도 투과성을 억제하였으나; Slit2N 의 효과는 항-VE-카드헤린 항체의 존재 하에 소실되었다 (도 2D). 동시에, 이들 데이터는 Slit 이 IL-1β 자극에도 불구하고 p120-카테닌의 VE-카드헤린과의 연합을 보존시킴으로써, 사이토카인 유도 VE-카드헤린 엔토사이토시스를 감소시킴으로써 혈관 완전성을 촉진한다는 것을 입증하였다.

실시예 4 - Slit2 는 사이토카인 발작의 조건 하에 생체내 혈관 투과성을 감소시킴

Slit 이 사이토카인 발작을 초래하는 조건 하에 생체내 혈관 투과성을 감소시키는 것을 설명하기 위해, 폐 염증의 박테리아 내독소 모델을 이용하였다. 상기 모델에서, 지질다당류 (LPS) 는 기관내 주입을 통해 마우스의 폐로 투여되어, 그람-음성 감염을 자극한다 (Matute-Bello, G., CW. Frevert, and T.R. Martin. 2008. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 295:L379-399). 폐에서의 LPS 주입은 급성 염증의 모델이다. LPS 의 투여는 대규모 염증 반응 및 사이토카인의 방출을 촉발하여, 폐포 모세혈관 투과성을 유의하게 증가시킨다.

에반스 블루 알부민 (EBA) 을 추적자로서 사용하여, Slit2N 이 LPS 처리된 Robo4^+/+ 마우스의 폐에서의 혈관 유출을 유의하게 감소시킨다는 것을 발견하였다 (도 3A). Slit2N 의 효과는 Robo4-널 (null) (Robo4^AP/AP) 마우스에서 소실되었으며, 이는 Robo4 가 Slit2N 의 생체내 효과에 필요하다는 것을 입증하였다 (도 3A). 또한, 이 결과는 Robo4 가 내피에서만 검출되므로 상기 활성이 내피 특이적이라는 것을 나타낸다 (Huminiecki, L., M. Gorn, S. Suchting, R. Poulsom, and R. Bicknell. 2002. Magic roundabout is a new member of the roundabout receptor family that is endothelial specific and expressed at sites of active angiogenesis. Genomics 79:547-552; 및 Park, K.W., C.M. Morrison, L.K. Sorensen, C.A. Jones, Y. Rao, C.B. Chien, J.Y. Wu, L.D. Urness, and D.Y. Li. 2003. Robo4 is a vascular-specific receptor that inhibits endothelial migration. Dev Biol 261:251-267). 또한, 폐에서의 LPS 주입은 폐포 공간 내 단백질 삼출물 및 백혈구의 축적, 기관지폐포 세척 (BAL) 에 의해 정량화될 수 있는 염증 반응을 유도한다 (Matute-Bello et al., 2008). Slit2N 은 단백질 삼출물, 급성 폐 상해의 키 마커 및 혈관 장벽 파괴의 지표 (Ware, L.B., and M.A. Matthay. 2000. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med 342:1334-1349), 및 Robo4^+/+ 마우스의 기관지폐포 세척액 (BALF) 에서의 염증 세포 축적을 투여량-의존적 방식으로 감소시켰다 (도 3B-D; 도 14C, D). BALF 에서의 단백질 및 백혈구 축적의 억제는 Robo4^AP/AP 마우스에서 소실되었으며, 이는 Slit2N 이 혈관계에 직접적으로 작용하여 폐포에서의 단백질 삼출물 및 염증 세포 축적을 감소시킨다는 것을 다시 나타낸다 (도 3B-D). 최종적으로, 폐의 조직학적 검사로, Slit2N 이 Robo4^+/+ 에서의 LPS-유도 폐 염증을 감소시킴으로써 (Robo4^AP/AP 마우스는 아님) Robo4-의존적 방식으로 작용한다는 것을 확인하였다 (도 3E; 도 15). Robo4^AP/AP 마우스의 폐 혈관계가 정상적으로 발생하였음을 확인하였고 (도 19 및 20), 이는 Robo4^AP/AP 에서의 Slit2 의 효과의 소실이 혈관계에서의 구조적 차이점으로 인한 것이 아님을 나타낸다.

중성구가 세균성 폐렴 및 LPS 챌린지 모델에서 우세한 세포 유형이기 때문에 (Matute-Bello et al., 2008), Slit2N 이 중성구 이동에 대해 직접적 효과를 갖는지 탐색하였다. Slit2 가 중성구 이동에 대해 심원한 영향을 미친다는 것이 종래에 보고된 바 있다 (Wu, J., et al. The neuronal repellent Slit inhibits leukocyte chemotaxis induced by chemotactic factors. Nature 410, 948-952 (2001)). 그러나, 이들 실험은 DMSO-처리된 HL-60 중성구-유사 세포를 사용하여 수행하였다. DMSO-처리된 HL-60 중성구-유사 세포에 대한 Slit2 의 동일한 효과를 관찰하였으나, 제 1 인간 PMN 이 Slit2N 에 반응하지 않는 것을 발견하였으며 이는 그들이 Robo 수용체를 발현하지 않는다는 사실과 일치한다 (도 16A, B).

초기 연구에서, 급성 염증의 LPS-모델에서의 Robo4^+/+ 마우스와 비교하여 Robo4^AP/AP 마우스의 폐에서는 증강된 감수성이 검출되지 않았다 (도 3B-D). 그러나 정량적 PCR 을 사용하여, Robo4 발현이 LPS 주입 6 시간 후 폐에서 유의하게 증가하였음을 발견하였다 (도 11). 이 결과는 Robo4 가 폐에서의 LPS-유도 염증을 억제 또는 해소하기 위해 중요할 수 있다는 것을 암시하였다. LPS 투여 수준이 너무 높은 경우, 그것이 두 유전형 사이의 임의의 차이점이 차폐될 수 있는 심각한 손상을 야기할 것으로 추론되었다. 따라서, 마우스를 시험하는데 사용되는 LPS 의 투여량을 낮추었고, Robo4^AP/AP 마우스가 한배 새끼 Robo4^+/+ 마우스와 비교하여 BALF 삼출물에서 유의하게 더 높은 단백질 수준을 갖는다는 것을 발견하였다 (도 3F). 이 증가된 감수성은 사이토카인의 혈관 효과를 약화시키는데 있어서의 내인성 Slit-Robo4 신호전달에 대한 역할을 나타낸다. 이 모델과 일치되게, Slit2 단백질은 폐 전체에 걸쳐, 및 내피에 아주 근접하게 발현된다 (도 17).

실시예 5 - Slit 는 생체내 VE-카드헤린 의존적 메카니즘을 통해 신호전달함

Slit 가 생체내 VE-카드헤린 의존적 메카니즘을 통해 신호전달하는 것을 확인하기 위해, 인접한 내피 세포에서 발현되는 VE-카드헤린 사이의 동종성 상호작용을 방지하는 특이적 항체로 VE-카드헤린을 차단하였다. Slit2N 은 대조 IgG 항체의 존재 하에 단백질 삼출물 및 염증성 세포 침투를 감소시켰으나, VE-카드헤린 차단 항체의 존재 하에는 그렇지 않았다 (도 3G-I). 따라서, 세포 배양 실험의 결과와 유사하게, 생체내 데이터는 세포 표면에서의 VE-카드헤린 발현을 촉진하고 사이토카인 매개 내피 과투과성을 둔화시키는 Slit-Robo4 모델을 지지한다.

실시예 6 - 다양한 Slit 단백질은 Robo4 를 활성화시키는 작용을 함

도 7 은 Slit2 단백질의 다양한 구성물을 설명한다. 본원에서 상기 기술한 바와 같이, 15OkD 단백질 Slit2N (SEQ ID NO: 4) 이 안구 질환의 OIR 및 CNV 모델에서의 망막 투과성, 관 형성 및 내피 세포 이동에 대한 검정법인 마일스 검정법 (Miles assay) 을 포함하는 시험관내 및 생체내 모델에서 효과적인 것을 발견하였다. 도 7A 에서, Slit 단백질에 대한 상이한 구성물을 나타내었다. 4 개의 류신 풍부 도메인 (LRR), 상피 성장 인자 상동성 부위 (EGF) 및 c-말단 택 (MYC/HIS) 을 표시하였다. 상이한 Slit 구성물 (2nM) 에 의한 VEGF 매개 내피 세포 이동의 억제를 도 7B 에 나타내었다.

실시예 7 - Robo4 녹아웃 마우스

본원에서 상술하는 실험적 실시예에서 이용되는 Robo4 녹아웃 마우스를 표준 기술을 사용하여 생성하였다. 녹아웃 마우스를 생성하기 위해, Robo4 를 발현하는 유전자의 엑손 1 내지 5 를 상동 재조합을 사용하여 알칼리성 포스파타아제 (AP) 리포터 유전자로 대체하였다. 이 대립형질, Robo4 ^AP 는 Slit 단백질과의 상호작용에 요구될 것으로 예상되는 Robo4 엑토도메인의 면역글로불린 (IgG) 리피트를 인코딩하는 엑손이 결핍되어 있다. Robo4 ^+/AP 동물을 교잡시켜 표적 대립형질에 대해 동형인 마우스를 생성시켰다. 마우스의 게놈 구조의 설명을 도 12 에서 제공한다. Robo4 ^AP/AP 동물은 생존가능하고 생식능력이 있으며, 혈관계의 정상 패턴화를 나타내었다. 이들 데이터는 Robo4 가 발생 마우스에 있어서 발아(sprouting) 혈관생성에 요구되지 않는다는 것을 나타내며, 포유류 내피에서의 Robo4 신호전달에 대한 대안적 기능을 시사한다. 알칼리성 포스파타아제 활성을 이들 동물에서 발생 배아에서 및 성체 마우스에서의 모든 혈관 상의 내피 전체에 걸쳐 검출하였으며, 이는 Robo4^AP 대립형질이 Robo4 발현의 유효 마커라는 것을 확인시켰다.

실시예 8 - Slit2 는 생체내 폐 섬유증의 발달 및 혈관 투과성을 감소시킴

Slit2N 은 만성 염증의 환경에서 생체내 혈관 투과성을 감소시킨다 (Matute-Bello, G., Frevert, C., & Martin, T. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 295, 379-399 (2008); Gasse, P., et al. IL- 1R1/MyD88 signaling and the inflammasome are essential in pulmonary inflammation and fibrosis in mice. J Clin Invest 117, 3786-3799 (2007); Russo, R., et al. Role of the chemokine receptor CXCR2 in bleomycin-induced pulmonary inflammation and fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol (2008)). 블레오마이신은 폐에서의 지속성 및 만성 투과성을 야기하는 약품이다 (Tager, A., et al. The lysophosphatidic acid receptor LPA1 links pulmonary fibrosis to lung injury by mediating fibroblast recruitment and vascular leak. Nat Med 14, 45-54 (2008)). 만성 투과성 및 염증에 추가하여, 블레오마이신은 폐 섬유증을 야기한다. Robo4 ^+/+ 마우스에서, Slit2N 은 블레오마이신 투여 11 일 후 폐 내의 블레오마이신-유도 EBA 축적을 유의하게 감소시켰다 (도 13a). Slit2N 의 효과는 Robo4 ^AP/AP 마우스에서 소실되었다 (도 13a). 또한 Slit2N 은 블레오마이신-유도 폐 섬유증을 유의하게 감소시켰다 (도 13b). 이 효과는 Robo4^AP/AP 마우스에서 소실되었으며, 이는 Slit2N 이 내피 세포에 직접적으로 작용하여 폐 섬유증이 감소시킨다는 것을 나타낸다 (도 13b). 콜라겐 침착의 시각화를 증강시키도록 3색 염색 사용하는 폐의 조직 검사로, Robo4-의존적 방식으로 Slit2N 의 효과를 확인하였다 (도 13c). 이들 결과는 폐 섬유증을 감소시키는 데 있어서의 혈관 안정화 가치를 강조하며 섬유증의 발병기전에서의 내피 세포 역할을 강조한다.

실시예 9 - SecinH3 은 생체내 블레오마이신-유도 섬유증을 억제함

폐 섬유증을 억제하는 SecinH3 의 능력을 실시예 8 에서 기술한 바와 같이 블레오마이신-유도 섬유증의 동물 모델에서 평가하였다. 간략하게, 6-8 주령 마우스를 마취시키고 비강내 주입으로 블레오마이신 (40 ㎕ 식염수 중 0.05 U) 을 투여하였다. 대조군 마우스에게 40 ㎕ 식염수를 비강내 주입하였다. 마우스에게 3O uM SecinH3 또는 운반체를 1 일 2 회 복강내 주사하였다. 제 11 일에, 마우스를 CO₂ 질식으로 희생시켜, 폐를 제거하고, 프로테아제 억제제 (Roche) 를 갖는 0.5 M 아세트산 내에 균질화시켰다. Sircol 콜라겐 검정법을 사용하여 폐 콜라겐 함량을 평가하였다. 균질화액을 교반하면서 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 그후 샘플을 원심분리하고 1 ㎖ 의 Sircol 염색 시약을 100 ㎕ 의 상청액에 30 분 동안 첨가하였다. 샘플을 다시 원심분리하고, 펠렛을 1 ㎖ 알칼리 시약으로 재현탁하고, 분광광도법 (Biocolor) 으로 분석하였다. 이들 샘플을 제조사에 의해 제공된 콜라겐 표준 곡선에 대해 비교하였다. 데이터를 조건 당 7 마리 이상의 마우스의 s.e.m. 으로서 나타내었다.

실시예 10 - Slit 는 다균성 패혈증 동안 혈관 안정성을 증강시킴

Slit2N 은 전신 혈관 불안정성의 환경에서 사망률을 감소시키며, Slit2N 의 효과는 폐에 제한되지 않는다. 다균성 패혈증의 모델에서 맹장 결찰 및 천자 (CLP) 로서 알려져 있다 (Hubbard, W.J., M. Choudhry, M.G. Schwacha, J.D. Kerby, L.W. Rue, 3rd, K.I. Bland, and I.H. Chaudry. 2005. Cecal ligation and puncture. Shock 24 Suppl 1:52-57). Slit2N 은 신장 및 비장에서 혈관 투과성을 유의하게 감소시켰으며 (도 4A, B) CLP-유도 패혈증에 노출된 마우스의 생존률을 33 % 에서 거의 80 % 까지 향상시켰다 (도 4C). 이들 실험 조건 하에, CLP 는 폐에 유의한 손상을 야기하지 않았으며, 이는 Slit2N 의 효과가 폐에 제한되지 않는다는 것을 추가로 지지한다 (도 18A-C). 과염증 반응이 패혈증의 발병기전에 기여하기 때문에, Slit2N 이 패혈증 마우스의 혈장에서 사이토카인 및 케모카인 수준에 영향을 미치는지 여부를 시험하였다 (Dinarello, C.A. 1997. Proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Chest 112:321S-329S). Slit2N 은 사이토카인 및 케모카인의 패널의 발현을 변경시키지 않았으며, 이는 Slit2N 의 치료적 효과가 염증성 사이토카인 및 케모카인 수준에서의 감소에 대해 부수적이지 않다는 것을 입증한다 (도 4D, E). 최종적으로, Slit2N 의 효과는 Robo4 ^AP/AP 마우스에서 소실되었으며 (도 4F), 이는 Slit2N 의 활성에 대해 Robo4 가 필요하다는 것을 입증한다. 종합하여, 이들 데이터는 Slit 이 혈관 안정성을 특이적으로 증강시킴으로써 패혈증에 의해 촉발되는 전신 염증 반응 동안 생존을 증강시킨다는 것을 입증한다.

실시예 11 - Slit 는 바이러스 감염에서 기인하는 혈관 안정성을 증강시킴

Slit 의 효과를 H5N1 인플루엔자의 모델에서 검사하였다. 조류 독감 (H5N1) 과 같은 유행성 인플루엔자는 종종 사이토카인 수준의 대량 증가 및 과다 염증을 특징으로 하는 직접 감염에 의해 야기되는 폐 상해의 예이다 (de Jong, M.D., C.P. Simmons, T.T. Thanh, V.M. Hien, G.J. Smith, T.N. Chau, D.M. Hoang, N.V. Chau, T.H. Khanh, V.C Dong, P.T. Qui, B.V. Cam, Q. Ha do, Y. Guan, J.S. Peiris, N.T. Chinh, T.T. Hien, and J. Farrar. 2006. Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia. Nat Med 12:1203-1207; Kobasa, D., S.M. Jones, K. Shinya, J.C. Kash, J. Copps, H. Ebihara, Y. Hatta, J.H. Kim, P. Halfmann, M. Hatta, F. Feldmann, J.B. Alimonti, L. Fernando, Y. Li, M.G. Katze, H. Feldmann, and Y. Kawaoka. 2007; Aberrant innate immune response in lethal infection of macaques with the 1918 influenza virus. Nature 445:319-323; 및 Abdel-Ghafar, A.N., T. Chotpitayasunondh, Z. Gao, F.G. Hayden, D.H. Nguyen, M.D. de Jong, A. Naghdaliyev, J.S. Peiris, N. Shindo, S. Soeroso, and T.M. Uyeki. 2008. Update on avian influenza A (H5N1) virus infection in humans. N Engl J Med 358:261-273). Slit2N 은 H5N1 감염 후 3 일에 폐에서의 내피 과투과성을 유의하게 억제하였고 (도 5A) 사망률을 감소시켰다 (도 5B). Slit2N 처리된 마우스에서의 폐 병리는 mock 처리된 마우스와 비교하여 중증도에 있어서 감소하였다 (도 5C). Slit2N 이 직접적인 항바이러스 활성을 갖는 가능성을 배제하기 위해 폐 바이러스 역가를 측정하였고, Slit2N 이 바이러스 수치를 변경시키지 않으며 (도 5D); 또한, Slit2N 이 H5N1 감염 후 염증성 사이토카인 방출 수준을 유의하게 감소시키지 않는다는 것을 발견하였다 (도 5E, F). 따라서 H5N1 결과는 LPS 및 CLP 연구와 일치하였고, 이는 사이토카인 발작(hypercytokinemia)에 대한 혈관 반응을 특이적으로 제한하는 것이 심각한 감염의 동물 모델에서의 사망률 및 이환률을 감소시키기에 충분하다는 것을 나타낸다.

V. 재료 & 방법

재조합 Slit2N 의 제조. 폴리-L-라이신 (Sigma) 코팅된 디쉬에 플레이팅한 293T 세포를 빈 벡터 pSecTagB 또는 pSecTagB::hSlit2N 으로 일시적 트랜스펙션시켰다. 각 세포의 15 cm 디쉬에 대해, 무혈청 Opti-MEM 중 100 ㎕ 리포펙타민 (Lipofectamine) (Invitrogen) 및 60 ㎍ DNA 를 사용하였다. Slit2N 단백질을 [Jones, C.A., N.R. London, H. Chen, K.W. Park, D. Sauvaget, R.A. Stockton, J.D. Wythe, W. Suh, F. Larrieu-Lahargue, Y.S. Mukouyama, P. Lindblom, P. Seth, A. Frias, N. Nishiya, M.H. Ginsberg, H. Gerhardt, K. Zhang, and D.Y. Li. 2008. Robo4 stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability. Nat Med 14:448-453] 에서 종래에 기술되는 바와 같이 염 추출하였다. 이 프로토콜을 사용하여, Slit2N 농도 0.5-1.5 mg/㎖ 를 통상적으로 수득하였다. 빈 벡터 pSecTagB 로 트랜스펙션된 세포에 대해 동일한 염 추출 절차를 수행하였다. 이러한 제제를 Mock 이라고 언급하며, 모든 실험에서 Slit2N 에 대한 대조군으로서 사용하였다. 1OnM Slit2N 을 사용하여 시험관내 연구를 수행하였다.

LPS-유도 급성 폐 상해. 8 내지 12 주령 C57BL/6 마우스에 식염수 단독 또는 식염수 중 3.5 ㎍ Slit2N 또는 Mock 을 정맥내 주사 (IV) 하였다. 대안적으로는, 정맥내 주사액에는 또한 20 ㎍ 대조 IgG 또는 20 ㎍ VE-카드헤린 차단 항체 (clone BV13, eBiosciences) 가 함유되었다. 기관의 수술적 노출 전에 Avertin 으로 동물을 마취하였다. 100 ㎕ 식염수 중 10 ㎍ 지질다당류 (혈청형 0111:B4, Sigma) 또는 식염수 단독을 기관내 투여 (IT) 하였다. 24 시간 후, 기관을 재-노출하고 도관삽입했다. 1 ㎖ 의 식염수를 주사하여 기관지폐포 세척액 (BALF) 을 수득한 후 흡인을 3 회 반복하였다. BALF 를 5 분 동안 300 g 에서 원심분리하여 염증성 세포를 회수하였다. 펠렛을 3 분 동안 ACK 완충액으로 처리하여 적혈구를 제거하였다. 세포를 5 분 동안 300 g 에서 원심분리하고, 1 % FBS 함유 1 ㎖ PBS 내에 재현탁하였다. 그후 세포 총수를 혈구계로 측정하였다. 중성구 총수를 세포 감별 계수로 측정하였다. BALF 단백질을 단백질 검정법 (BioRad) 으로 평가하였다. 데이터를 조건 당 5 마리 이상의 마우스의 s.e.m. 으로서 나타내었다.

블레오마이신 모델. 블레오마이신 실험을 [Gasse, P., et al. IL-1R1/MyD88 signaling and the inflammasome are essential in pulmonary inflammation and fibrosis in mice. J Clin Invest 117, 3786-3799 (2007)] 에서 기술되는 바와 같이 실행하였다. 간략하게, 6-8 주령 마우스를 마취하고 블레오마이신 (40 ㎕ 식염수 중 0.05 U) 을 비강내 주입하였다. 대조군 마우스에게 40 ㎕ 식염수를 비강내 주입하였다. 마우스에게 5 ㎍ Slit 또는 Mock 을 매일 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에게 식염수를 매일 주사하였다. 제 11 일에, 마우스를 CO₂ 질식으로 희생시키고, 폐를 제거하고, 프로테아제 억제제 (Roche) 를 갖는 0.5 M 아세트산 내에 균질화시켰다. 균질화액을 교반하면서 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 그후 샘플을 원심분리하고 1 ㎖ 의 Sircol 염색 시약을 100 ㎕ 의 상청액에 30 분 동안 첨가하였다. 샘플을 다시 원심분리하고, 펠렛을 1 ㎖ 알칼리 시약으로 재현탁하고, 분광광도법 (Biocolor) 으로 분석하였다. 이들 샘플을 제조사에 의해 제공된 콜라겐 표준 곡선에 대해 비교하였다. 데이터를 조건 당 5 마리 이상의 마우스의 s.e.m. 으로서 나타내었다.

H5N1 감염. 암컷 18-2Og BALB/c 마우스 (Charles River Laboratories) 를 마취하고 H5N1 바이러스 (인플루엔자 A, Duck/MN/1525/81) 를 비강내 주입하여 감염시켰다. 마우스에게 1.56 ㎍ Slit 또는 Mock 을 5 일 동안 매일 정맥내 주사하였다. H5N1 폐 감염된 마우스의 생존률을 조건 당 20 마리의 마우스로 21 일 동안 측정하였다.

맹장 결찰 및 천자 (CLP) 패혈증 모델. 7 내지 11 주령 수컷 C57BL/6 마우스에게 5 ㎍ Slit2N 또는 Mock 을 복강내 주사하였다. 1 시간 후, 마우스를 이소플루란으로 마취하고, [Gomes, R.N., R.T. Figueiredo, F.A. Bozza, P. Pacheco, R.T. Amancio, A.P. Laranjeira, H.C. Castro-Faria-Neto, P.T. Bozza, and M.T. Bozza. 2006. Increased susceptibility to septic and endotoxic shock in monocyte chemoattractant protein 1/cc chemokine ligand 2-deficient mice correlates with reduced interleukin 10 and enhanced macrophage migration inhibitory factor production. Shock 26:457-463] 에서 기술되는 바와 같이 CLP 를 수행하였다. 마우스에게 5 ㎍ Slit2N 또는 Mock 을 1 일 1 회 지속하여 복강내 주사하였다. 모의 수술 군 내의 마우스에 대해, 맹장의 결찰 및 천자를 생략한 것을 제외하고는, 동일한 절차를 실행했다. CLP 를 실행한 마우스의 생존률을 Robo4 ^+/+ 마우스에 대해 Slit2N 처리의 경우 N=14, Mock 처리의 경우 N=15 로 6 일 동안 측정하였다. Robo4 ^AP/AP 마우스에 대해서, Slit2N 처리의 경우 N=13, Mock 처리의 경우 N=13 이었다.

에반스 블루 투과성. 폐에서의 혈관 투과성을 Moitra et al. (Moitra, J., S. Sammani, and J.G. Garcia. 2007. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res 150:253-265) 에서 기술되는 바와 같이 에반스 블루 알부민 (EBA) 을 사용하여 평가하였다. LPS 의 IT 주입 5 시간 후, CLP 4 시간 후, H5N1 감염 3 일 후, 마우스에게 EBA (20 mg/kg) 를 IV 주사하였다. EBA 가 1 시간 동안 순환할 수 있게 하고, 마우스를 깊이 마취시키고, 식염수 + 5 mM EDTA 를 관류시켰다. 폐를 절개하고, 칭량하고, 2 ㎖ PBS 내에서 균질화시켰다. 4 ㎖ 의 포름아미드 (Invitrogen) 를 첨가하고 샘플을 60 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하여 에반스 블루 염료를 추출하였다. 그후 샘플을 원심분리하고 상청액을 620 및 740 nm 모두 에서 분광광도법으로 분석하였다. CLP 처리된 마우스에 대해, 마우스를 관류시키고, 신장 및 비장을 제거하고, 칭량하고, 48 시간 동안 60 ℃ 에서 포름아미드 내에 두었다. 흡광도를 [Moitra et al.] 에서 기술되는 바와 같이 정상화시키고, 각각 폐, 신장 또는 비장의 g 습 중량 당 ㎍ 에반스 블루 염료로 전환시켰다. 데이터를 조건 당 4 마리 이상의 마우스의 s.e.m. 으로서 나타내었다.

조직학. LPS 노출 또는 CLP 24 시간 후, 마우스를 CO₂ 질식에 의해 안락사시켰다. 흉강을 개방하고, 폐를 ZnSO₄ 완충된 10 % 포르말린으로 팽창시켰다. 포르말린 고정 조직을 통상적으로 처리하고, 파라핀 내에 포매하고, 6 마이크론에서 절단하고, H&E 으로 염색하였다. Gupta et al. (Gupta, N., X. Su, B. Popov, J.W. Lee, V. Serikov, and M.A. Matthay. 2007. Intrapulmonary delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves survival and attenuates endotoxin-induced acute lung injury in mice. J Immunol 179:1855-1863) 에서 기술되는 방법으로부터 조직학적 정량을 수정하였다. H5N1 샘플에 대해, 감염 후 6 일에 2 마리 동물로부터의 폐 우측엽을 수확하고 10 % 중성 완충 포르말린 내에 고정시켰다. 포르말린 고정 조직을 통상적으로 처리하고, 파라핀 내에 포매하고, 5 마이크론에서 절단하고, H&E 으로 염색하고, 공인 수의 병리학자에 의해 미시 병변에 대해 평가하였다.

Robo4 의 RNA 침묵. 각 실험에 대해, HMVEC-L, P-4 (Lonza) 를 150 cm 플라스크 내 EGM-2mv 배지 (Lonza) 에서 전면의 70-80 % 까지 성장시켰다. 트립신화하기 전, 12 피브로넥틴-코팅된 6.5 mm 3.0 ㎛ 기공 Transwell (Costar) 에 RNA 현탁 완충액 (Qiagen) 중 480 nM 으로 희석된 huRobo4siRNA duplex (Qiagen, Hs_ROBO4_1_HP, #1919431) 를 25 ㎕/웰로 넣고, 12 transwell 의 2 번째 세트에 등몰의 AllStars NegativeControl siRNA (Qiagen, #1027280) 를 25 ㎕/웰로 넣었다. 트랜스펙션 복합체를 형성하기 위해, siRNA 를 OptiMEM (Invitrogen) 중 1:10 으로 희석된 HiPerfect 트랜스펙션 시약 (Qiagen) 25 ㎕/웰을 갖는 Transwell 에서 실온에서 10 분 동안 사전혼합하였다. 세포를 들어올리고, 2 x 10⁴ 세포/웰을 함유하는 완전 배지 150 ㎕ 를 트랜스펙션 복합체에 파종하였다. 트랜스펙션체를 37 ℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 800 ㎕ 완전 배지를 각 Transwell 의 하부 챔버에 첨가하였다. 기술되는 바와 같이, 시험관내 투과성 검정법을 수행하기 전, 트랜스펙션된 단일층을 추가로 48 시간 배양하였다. Robo4 유전자 산물의 제거를 확인하기 위해, 2 개의 100 mm 디쉬에 잔여 HMVEC-L 를 4.5 ㎖ EGM-2mv 중 10⁶ 세포/디쉬로 파종하고 (12.5 ㎕ 의 20 ㎛ RNA + 70 ㎕ HiPerfect + 500 ㎕ Opti MEM 으로 이루어지는 AllStars Negative Control 트랜스펙션 복합체 또는 Robo4si RNA 를 넣음), 각 디쉬의 세포 현탁액의 상부에 피펫팅하였다. 37 ℃ 에서 30 분 후, 6.5 ㎖ 완전 배지를 첨가하고, 플레이트를 48 시간 동안 인큐베이션한 후, 용해물을 수확하고 1:100 항-Robo4 (N-17) 및 1:200 항-β 튜불린 (Santa Cruz Biotechnology) 으로 웨스턴 블롯팅하였다.

Robo4 siRNA 녹다운. huRobo4 siRNA duplex (Hs_ROBO4_1_HP #1919431, Qiagen) 또는 등몰의 AllStars Negative Control siRNA (#1027280, Qiagen) 트랜스펙션 복합체를 표준 프로토콜에 따라 형성시키고, Transwell 필터의 상부 챔버에 첨가하였다. 24 시간 후, 세포를 huRobo4 또는 대조군 siRNA 로 2 회 트랜스펙션하였다. 추가적 24 시간 후, 시험관내 투과성을 이전에 기술되는 바와 같이 평가하였다. 데이터를 3 반복으로 수행한 셋 이상의 독립적 실험의 평균 ± s.e.m. 으로서 나타내었다. Robo4 단백질 발현의 성공적인 녹다운을 Robo4 (N-17) 또는 β-튜불린에 대한 항체 (Santa Cruz Biotechnology) 를 사용하는 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

시험관내 투과성 검정. 시험관내 투과성을 Jones et al. (Jones, C.A., N.R. London, H. Chen, K.W. Park, D. Sauvaget, R.A. Stockton, J.D. Wythe, W. Suh, F. Larrieu-Lahargue, Y.S. Mukouyama, P. Lindblom, P. Seth, A. Frias, N. Nishiya, M.H. Ginsberg, H. Gerhardt, K. Zhang, and D.Y. Li. 2008. Robo4 stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability. Nat Med 14:448-453) 에서 기술되는 바와 같이 수행하였다. 3 시간 동안 100 ng/㎖ 지질다당류 (혈청형 0111:B4, Sigma), 6 시간 동안 10 ng/㎖ 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α, R&D Systems), 또는 2 시간 동안 10 ng/㎖ 인터루킨-1 베타 (IL-1β, R&D Systems) 를 사용하여 검정을 수행하였다. 나타낸 바와 같이, 25 ㎍/㎖ 대조군 래빗 IgG (Jackson ImmunoResearch) 또는 25 ㎍/㎖ 항-인간 VE-카드헤린 항체 (RDI Fitzgerald) 의 존재 하에 이를 반복하였다. 비자극된 단일층에 대한 기초 투과성을 100 % 로 설정하였다. 데이터를 3 반복으로 수행한 셋 이상의 독립적 실험의 평균 ± s.e.m. 으로서 나타내었다.

세포하(subcellular) 분획화. HMVEC-폐를 0.1 % FBS EBM-2 중 Slit2N 또는 Mock 으로 1.5 시간 동안 처리하였다. 그후 세포를 Ca²⁺/Mg²⁺ 함유 빙냉 PBS 로 2 회, HLB 완충액 (1O mM Tris-HCl PH 7.4, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂) 으로 1 회 세척하고, 프로테아제 억제제 (Roche), 포스파타아제 억제제 (Sigma) 및 1 mM DTT 가 보충된 HLB 완충액에서 수집하였다. 그후 세포를 다운스 (dounce)-균질화하였다 (20 스트로크). 균질화액을 4 ℃ 에서 10 분 동안 40O g 에서 원심분리하여 세포 잔해를 펠렛화시켰다. 생성된 상청액을 4 ℃ 에서 30 분 동안 16,00O g 에서 다시 원심분리하였다. 펠렛을 HLB 로 1 회 세척하고 4 ℃ 에서 30 분 동안 RIPA 완충액 내에 재현탁하였다. 재현탁된 펠렛을 원심분리하고 (4 ℃ 에서 16,000 g/15 분), 생성된 상청액을 이용가능성 막 분획으로서 모았다. 총 세포 용해물을 수득하기 위해, 다운스 균질화 전에 분취액을 모았다. RIPA 완충액을 상기 분취액에 첨가하고 4 ℃ 에서 10 분 동안 13,000 g 에서 원심분리하였다. 상청액을 모으고 총 세포 용해물로서 사용하였다. VE-카드헤린에 대한 항체를 Cell Signaling 에서 입수하고, p120-카테닌 및 β-카테닌을 BD biosciences 에서 입수했다. 셋 이상의 독립적 실험에 대해 밀도 측정을 수행하고 데이터를 평균 ± s.e.m. 으로서 나타내었다.

면역형광법. [Jones, C.A., N.R. London, H. Chen, K.W. Park, D. Sauvaget, R.A. Stockton, J.D. Wythe, W. Suh, F. Larrieu-Lahargue, Y.S. Mukouyama, P. Lindblom, P. Seth, A. Frias, N. Nishiya, M.H. Ginsberg, H. Gerhardt, K. Zhang, and D.Y. Li. 2008.] 에서 기술되는 바와 같이 면역형광법을 수행하였다. 세포를 Slit2N 또는 Mock 으로 30 분 동안 전처리한 후 10 ng/㎖ IL-1β 로 3 시간 동안 자극하였다. VE-카드헤린 (BD biosciences) 또는 p120-카테닌 (Santa Cruz) 에 대한 1 차 항체를 4 ℃ 에서 밤새 적용하였다. 이미지는 세 개의 독립적 실험을 대표한다.

면역침전법. HMVEC-폐를 0.1 % FBS EBM-2 중 Slit2N 또는 Mock 으로 30 분 동안 처리하였다. 그후 세포를 10 ng/㎖ IL-1β 로 10 분 동안 자극하였다. 그후 HMVEC-폐를 빙냉 PBS 로 세척하고, 프로테아제 억제제, 포스파타아제 억제제 및 1 mM DTT 가 보충된 빙냉 용해 완충액 (1O mM Tris-HCl pH 7.4, 5O mM NaCl, 1 % NP-40 및 10 % 글리세롤) 으로 용해시켰다. 세포 용해물을 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션하고 15 분 동안 13,000 g 에서 원심분리하여 세포 잔해를 펠렛화시켰다. 단백질 농도를 BCA 검정법 (PIERCE) 으로 측정하고 0.5 mg 용해물을 8 ㎍ 의 VE-카드헤린 항체 (Cell Signaling) 및 단백질 A/G 세파로오스 (Santa Cruz) 와 함께 4 ℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 복합체를 용해 완충액으로 3 회 세척하였다. 면역침전물을 웨스턴 블롯 분석하였다. 세 개의 독립적 실험에 대해 밀도 측정을 수행하고 데이터를 평균 ± s.e.m. 으로서 나타내었다.

내부화 검정법. VE-카드헤린 내부화를 [Xiao, K., J. Garner, K.M. Buckley, P.A. Vincent, C.M. Chiasson, E. Dejana, V. Faundez, and A.P. Kowalczyk. 2005. p120-Catenin regulates clathrin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Mol Biol Cell 16:5141-5151] 에서 기술되는 바와 같이 수행하였다. 간략하게, HMVEC-폐를 챔버 슬라이드에 파종하고 72 시간 동안 배양하였다. 그후 배지를 제거하고 세포를 항-VE-카드헤린 항체 (clone BV6, RDI Fitzgerald) 로 4 ℃ 에서 30 분 동안 표지하였다. 그후 세포를 Slit2N 또는 Mock 으로 30 분 동안 전처리하였다. 빙냉 배지로 얼음 상에서 2 회 세척하여 과잉 항체를 제거하였다. 챔버 슬라이드를 37 ℃ 로 이동시키고 1O nM Slit2N 또는 Mock 의 존재 하에 10 ng/㎖ IL-1β 및 0.6 mM 프리마퀴닌으로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 표면 결합된 VE-카드헤린을 벗겨내기 위해 세포를 산-세척하였다. 단일층을 세척하고, 고정하고, 투과성화시켰다. 내부화된 VE-카드헤린 항체를 Alexa 488-접합 당나귀 항-마우스 IgG (Molecular Probes) 로 검출하였다. 이미지는 네 개의 독립적 실험을 대표한다.

폐 면역형광법. 성체 Robo4 ^+/AP 마우스를 CO₂ 질식으로 안락사시켰다. 흉강을 개방하고, 폐를 OCT 로 팽창시키고, 드라이아이스 중 OCT 에서 급속 동결시켰다. [Jones, C.A., N.R. London, H. Chen, K.W. Park, D. Sauvaget, R.A. Stockton, J.D. Wythe, W. Suh, F. Larrieu-Lahargue, Y.S. Mukouyama, P. Lindblom, P. Seth, A. Frias, N. Nishiya, M.H. Ginsberg, H. Gerhardt, K. Zhang, and D.Y. Li. 2008. Robo4 stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability. Nat Med 14:448-453] 에서 기술되는 바와 같이 폐 절편을 Robo4 발현 부위를 나타내는 알칼리성 포스파타아제 활성에 대해 염색하였다. 그후 절편을 Slit2 (E-20, Santa Cruz) 또는 CD-31 (Pharmingen) 에 대한 1 차 항체를 사용하여 염색한 후, 형광 2 차 항체 염색을 수행하였다.

사이토카인/케모카인 어레이. CLP 6 시간 후, 마우스를 깊이 마취시켰다. 전체 혈액을 경동맥으로부터 ACD (~1:9 부피) 로 빼냈다. 혈액을 10 분 동안 400O g 에서 원심분리하여 혈장을 단리하였다. Quansys Biosciences (Logan, UT) 에 의해 혈장을 분석하여 사이토카인 및 케모카인 수준을 정량하였다. 데이터를 조건 당 6 마리 마우스의 평균 ± s.e.m. 으로서 나타내었다. H5N1 샘플에 대해, 감염 6 일 후 청정화된 마우스 폐 균질화액을 제조하고, 마우스 사이토카인 및 케모카인 어레이 (Quansys Biosciences; Logan, UT) 를 사용하여 염증성 사이토카인 및 케모카인 프로필을 측정하였다. 데이터를 세 개의 총체 마우스 군의 평균 ± s.e.m. 으로서 나타내었다.

폐 바이러스 역가 측정. [Sidwell, R.W., K.W. Bailey, M.H. Wong, D.L. Barnard, and D.F. Smee. 2005. In vitro and in vivo influenza virus-inhibitory effects of viramidine. Antiviral Res 68:10-17] 에서 기술되는 바와 같이 수행하였다.

폐 발생. [Metzger, R.J., O.D. Klein, G.R. Martin, and M.A. Krasnow. 2008. The branching programme of mouse lung development. Nature 453:745-750] 에서 기술되는 바와 같이 배아를 해부하고, 고정하고, 재수화하였다. [Metzger et al.] 에서 기술되는 방법의 변형을 사용하여 항-PECAM (BD Pharmingen; clone MEC 13.3) 및 항-E-카드헤린 (clone ECCD-2, Zymed) 1 차 항체로 폐를 연속 면역염색하였다.

중성구 이동. HL-60 세포를 10 % FBS 및 1 % pen/step 이 보충된 RPMI-1640 배지로 표준 조건 하에 성장시켰다. 성장 배지 중 1 ㎖ 당 3 x 10⁶ 으로 HL-60 세포를 파종하고 4-6 일 동안 배양하여, 1.2 % 디메틸 술폭시드 (DMSO) 로 유도된 세포를 수득하였다 (Collins, S.J., F.W. Ruscetti, R.E. Gallagher, and R.C. Gallo. 1978. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proc Natl Acad Sci U S A 75:2458-2462). [Zimmerman, G.A., T.M. Mclntyre, and S.M. Prescott. 1985. Thrombin stimulates the adherence of neutrophils to human endothelial cells in vitro. J Clin Invest 76:2235-2246] 에서 기술되는 기술을 사용하여 ACD 로 건강한 성체 제공자 전체 혈액으로부터 hPMN 을 단리하였다. Slit2 또는 Mock 과 함께 백혈구 화학유인물질 fMLP (10 μM) 를 48-웰 주화성 챔버 (Neuroprobe) 의 하부 웰에 두었다. 피브로넥틴 코팅된 (4 ℃ 에서 밤새) 폴리카르보네이트 막 (Neuroprobe, 5 ㎛) 을 화학유인물질과 세포 사이에 두었다. DMSO 또는 hPMN 으로 유도된 HL-60 세포 (50 ㎕, 50,000 세포) 를 상부 웰에 첨가하였다. 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, 필터의 상부 표면 상의 세포를 제거하고 필터를 통해 표면 밑으로 이동한 세포를 고정하고 Diff-Quic stain set (Dade Behring) 를 사용하여 염색하였다. 5 고배율 시야 (high power field) 에서 이동한 세포를 계수하고 Slit2 또는 Mock 의 부재 하에 fMLP 에 대해 이동한 세포와 비교하여 이동한 세포의 백분율로서 이동을 표현하였다. 데이터를 세 개 이상의 독립적 실험의 s.e.m 으로서 나타내었다.

정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR). 제조사의 프로토콜 (Nucleospin RNA II kit, Clontech) 에 따라 식염수 또는 LPS 처리한 마우스의 폐로부터 총 RNA 를 추 출하였다. 역전사 후, TaqMan 검정법 (Applied Biosystems) 으로 18s rRNA 및 마우스 Robo4 에 대해 qPCR 을 수행하였다. hPMN 연구를 위해, Trizol (Invitrogen) 을 사용하여 RNA 를 단리하고 TaqMan 검정법 (Applied Biosystems) 으로 인간 GAPDH 및 ROBO1-4 에 대해 qPCR 을 수행하였다.

통계적 분석. 적절한 경우, 스튜던트 t-검정, 로그 순위 검정, 또는 사후검정과 함께 ANOVA 를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

본 발명의 근본적 원리에서 벗어나지 않으면서 상기 기술한 구현예의 세부 사항에 많은 변화가 가해질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로 본 발명의 범위는 하기의 청구항에 의해서만 결정되어야 한다.

<110> Navigen Pharmaceuticals Li, Dean <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PULMONARY FIBROSIS AND OTHER CONDITIONS ASSOCIATED WITH VASCULAR INFLAMMATION <130> 38263/31 <150> 61/122265 <151> 2008-12-12 <160> 12 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1529 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Gly Val Gly Trp Gln Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Ile Leu Asn Lys Val Ala Pro Gln Ala Cys Pro Ala Gln Cys 20 25 30 Ser Cys Ser Gly Ser Thr Val Asp Cys His Gly Leu Ala Leu Arg Ser 35 40 45 Val Pro Arg Asn Ile Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Gly 50 55 60 Asn Asn Ile Thr Arg Ile Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His 65 70 75 80 Leu Arg Val Leu Gln Leu Met Glu Asn Lys Ile Ser Thr Ile Glu Arg 85 90 95 Gly Ala Phe Gln Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu Asn Arg 100 105 110 Asn His Leu Gln Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Gly Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Tyr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gln Ile Gln Ala Ile Pro Arg 130 135 140 Lys Ala Phe Arg Gly Ala Val Asp Ile Lys Asn Leu Gln Leu Asp Tyr 145 150 155 160 Asn Gln Ile Ser Cys Ile Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp 165 170 175 Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn Ile Thr Arg Leu Ser Val 180 185 190 Ala Ser Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser 195 200 205 Asn Asn Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu 210 215 220 Arg Gln Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gln Cys Met Gly Pro Ser 225 230 235 240 His Leu Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gln Lys Arg Glu Phe Val 245 250 255 Cys Ser Gly His Gln Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys Ser Val Leu His 260 265 270 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly 275 280 285 Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile Thr Glu 290 295 300 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly Ala Phe 305 310 315 320 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn Gln Ile 325 330 335 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser 340 345 350 Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 355 360 365 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile 370 375 380 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Asn Leu 385 390 395 400 Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly Thr Phe 405 410 415 Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala Gln Asn Pro Phe 420 425 430 Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr Asn 435 440 445 Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala 450 455 460 Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys Ser Ala 465 470 475 480 Lys Glu Gln Tyr Phe Ile Pro Gly Thr Glu Asp Tyr Arg Ser Lys Leu 485 490 495 Ser Gly Asp Cys Phe Ala Asp Leu Ala Cys Pro Glu Lys Cys Arg Cys 500 505 510 Glu Gly Thr Thr Val Asp Cys Ser Asn Gln Lys Leu Asn Lys Ile Pro 515 520 525 Glu His Ile Pro Gln Tyr Thr Ala Glu Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu 530 535 540 Phe Thr Val Leu Glu Ala Thr Gly Ile Phe Lys Lys Leu Pro Gln Leu 545 550 555 560 Arg Lys Ile Asn Phe Ser Asn Asn Lys Ile Thr Asp Ile Glu Glu Gly 565 570 575 Ala Phe Glu Gly Ala Ser Gly Val Asn Glu Ile Leu Leu Thr Ser Asn 580 585 590 Arg Leu Glu Asn Val Gln His Lys Met Phe Lys Gly Leu Glu Ser Leu 595 600 605 Lys Thr Leu Met Leu Arg Ser Asn Arg Ile Thr Cys Val Gly Asn Asp 610 615 620 Ser Phe Ile Gly Leu Ser Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn 625 630 635 640 Gln Ile Thr Thr Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu 645 650 655 Ser Thr Leu Asn Leu Leu Ala Asn Pro Phe Asn Cys Asn Cys Tyr Leu 660 665 670 Ala Trp Leu Gly Glu Trp Leu Arg Lys Lys Arg Ile Val Thr Gly Asn 675 680 685 Pro Arg Cys Gln Lys Pro Tyr Phe Leu Lys Glu Ile Pro Ile Gln Asp 690 695 700 Val Ala Ile Gln Asp Phe Thr Cys Asp Asp Gly Asn Asp Asp Asn Ser 705 710 715 720 Cys Ser Pro Leu Ser Arg Cys Pro Thr Glu Cys Thr Cys Leu Asp Thr 725 730 735 Val Val Arg Cys Ser Asn Lys Gly Leu Lys Val Leu Pro Lys Gly Ile 740 745 750 Pro Arg Asp Val Thr Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gln Phe Thr Leu 755 760 765 Val Pro Lys Glu Leu Ser Asn Tyr Lys His Leu Thr Leu Ile Asp Leu 770 775 780 Ser Asn Asn Arg Ile Ser Thr Leu Ser Asn Gln Ser Phe Ser Asn Met 785 790 795 800 Thr Gln Leu Leu Thr Leu Ile Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Arg Cys Ile 805 810 815 Pro Pro Arg Thr Phe Asp Gly Leu Lys Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu 820 825 830 His Gly Asn Asp Ile Ser Val Val Pro Glu Gly Ala Phe Asn Asp Leu 835 840 845 Ser Ala Leu Ser His Leu Ala Ile Gly Ala Asn Pro Leu Tyr Cys Asp 850 855 860 Cys Asn Met Gln Trp Leu Ser Asp Trp Val Lys Ser Glu Tyr Lys Glu 865 870 875 880 Pro Gly Ile Ala Arg Cys Ala Gly Pro Gly Glu Met Ala Asp Lys Leu 885 890 895 Leu Leu Thr Thr Pro Ser Lys Lys Phe Thr Cys Gln Gly Pro Val Asp 900 905 910 Val Asn Ile Leu Ala Lys Cys Asn Pro Cys Leu Ser Asn Pro Cys Lys 915 920 925 Asn Asp Gly Thr Cys Asn Ser Asp Pro Val Asp Phe Tyr Arg Cys Thr 930 935 940 Cys Pro Tyr Gly Phe Lys Gly Gln Asp Cys Asp Val Pro Ile His Ala 945 950 955 960 Cys Ile Ser Asn Pro Cys Lys His Gly Gly Thr Cys His Leu Lys Glu 965 970 975 Gly Glu Glu Asp Gly Phe Trp Cys 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Pro Arg Thr Phe Asp 785 790 795 800 Gly Leu Lys Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu His Gly Asn Asp Ile Ser 805 810 815 Val Val Pro Glu Gly Ala Phe Asn Asp Leu Ser Ala Leu Ser His Leu 820 825 830 Ala Ile Gly Ala Asn Pro Leu Tyr Cys Asp Cys Asn Met Gln Trp Leu 835 840 845 Ser Asp Trp Val Lys Ser Glu Tyr Lys Glu Pro Gly Ile Ala Arg Cys 850 855 860 Ala Gly Pro Gly Glu Met Ala Asp Lys Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser 865 870 875 880 Lys Lys Phe Thr Cys Gln 885 <210> 11 <211> 1092 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ile Leu Asn Lys Val Ala Pro Gln Ala Cys Pro Ala Gln Cys Ser Cys 1 5 10 15 Ser Gly Ser Thr Val Asp Cys His Gly Leu Ala Leu Arg Ser Val Pro 20 25 30 Arg Asn Ile Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Gly Asn Asn 35 40 45 Ile Thr Arg Ile Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His Leu Arg 50 55 60 Val Leu Gln Leu Met Glu Asn Lys Ile Ser Thr Ile Glu Arg Gly Ala 65 70 75 80 Phe Gln Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu Asn Arg Asn His 85 90 95 Leu Gln Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Gly Thr Ala Lys Leu Tyr 100 105 110 Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gln Ile Gln Ala Ile Pro Arg Lys Ala 115 120 125 Phe Arg Gly Ala Val Asp Ile Lys Asn Leu Gln Leu Asp Tyr Asn Gln 130 135 140 Ile Ser Cys Ile Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp Leu Glu 145 150 155 160 Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn Ile Thr Arg Leu Ser Val Ala Ser 165 170 175 Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser Asn Asn 180 185 190 Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu Arg Gln 195 200 205 Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gln Cys Met Gly Pro Ser His Leu 210 215 220 Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gln Lys Arg Glu Phe Val Cys Ser 225 230 235 240 Asp Glu Glu Glu Gly His Gln Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys Ser Val 245 250 255 Leu His Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys 260 265 270 Arg Gly Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile 275 280 285 Thr Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly 290 295 300 Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn 305 310 315 320 Gln Ile Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu 325 330 335 Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser 340 345 350 Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 355 360 365 Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu 370 375 380 Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly 385 390 395 400 Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala Gln Asn 405 410 415 Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His 420 425 430 Thr Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg 435 440 445 Leu Ala Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys 450 455 460 Ser Gly Thr Glu Asp Tyr Arg Ser Lys Leu Ser Gly Asp Cys Phe Ala 465 470 475 480 Asp Leu Ala Cys Pro Glu Lys Cys Arg Cys Glu Gly Thr Thr Val Asp 485 490 495 Cys Ser Asn Gln Lys Leu Asn Lys Ile Pro Glu His Ile Pro Gln Tyr 500 505 510 Thr Ala Glu Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu Phe Thr Val Leu Glu Ala 515 520 525 Thr Gly Ile Phe Lys Lys Leu Pro Gln Leu Arg Lys Ile Asn Phe Ser 530 535 540 Asn Asn Lys Ile Thr Asp Ile Glu Glu Gly Ala Phe Glu Gly Ala Ser 545 550 555 560 Gly Val Asn Glu Ile Leu Leu Thr Ser Asn Arg Leu Glu Asn Val Gln 565 570 575 His Lys Met Phe Lys Gly Leu Glu Ser Leu Lys Thr Leu Met Leu Arg 580 585 590 Ser Asn Arg Ile Thr Cys Val Gly Asn Asp Ser Phe Ile Gly Leu Ser 595 600 605 Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Gln Ile Thr Thr Val Ala 610 615 620 Pro Gly Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu Ser Thr Leu Asn Leu Leu 625 630 635 640 Ala Asn Pro Phe Asn Cys Asn Cys Tyr Leu Ala Trp Leu Gly Glu Trp 645 650 655 Leu Arg Lys Lys Arg Ile Val Thr Gly Asn Pro Arg Cys Gln Lys Pro 660 665 670 Tyr Phe Leu Lys Glu Ile Pro Ile Gln Asp Val Ala Ile Gln Asp Phe 675 680 685 Thr Cys Asp Asp Gly Asn Asp Asp Asn Ser Cys Ser Pro Leu Ser Arg 690 695 700 Cys Pro Thr Glu Cys Thr Cys Leu Asp Thr Val Val Arg Cys Ser Asn 705 710 715 720 Lys Gly Leu Lys Val Leu Pro Lys Gly Ile Pro Arg Asp Val Thr Glu 725 730 735 Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gln Phe Thr Leu Val Pro Lys Glu Leu Ser 740 745 750 Asn Tyr Lys His Leu Thr Leu Ile Asp Leu Ser Asn Asn Arg Ile Ser 755 760 765 Thr Leu Ser Asn Gln Ser Phe Ser Asn Met Thr Gln Leu Leu Thr Leu 770 775 780 Ile Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Arg Cys Ile Pro Pro Arg Thr Phe Asp 785 790 795 800 Gly Leu Lys Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu His Gly Asn Asp Ile Ser 805 810 815 Val Val Pro Glu Gly Ala Phe Asn Asp Leu Ser Ala Leu Ser His Leu 820 825 830 Ala Ile Gly Ala Asn Pro Leu Tyr Cys Asp Cys Asn Met Gln Trp Leu 835 840 845 Ser Asp Trp Val Lys Ser Glu Tyr Lys Glu Pro Gly Ile Ala Arg Cys 850 855 860 Ala Gly Pro Gly Glu Met Ala Asp Lys Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser 865 870 875 880 Lys Lys Phe Thr Cys Gln Gly Pro Val Asp Val Asn Ile Leu Ala Lys 885 890 895 Cys Asn Pro Cys Leu Ser Asn Pro Cys Lys Asn Asp Gly Thr Cys Asn 900 905 910 Ser Asp Pro Val Asp Phe Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Tyr Gly Phe Lys 915 920 925 Gly Gln Asp Cys Asp Val Pro Ile His Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys 930 935 940 Lys His Gly Gly Thr Cys His Leu Lys Glu Gly Glu Glu Asp Gly Phe 945 950 955 960 Trp Cys Ile Cys Ala Asp Gly Phe Glu Gly Glu Asn Cys Glu Val Asn 965 970 975 Val Asp Asp Cys Glu Asp Asn Asp Cys Glu Asn Asn Ser Thr Cys Val 980 985 990 Asp Gly Ile Asn Asn Tyr Thr Cys Leu Cys Pro Pro Glu Tyr Thr Gly 995 1000 1005 Glu Leu Cys Glu Glu Lys Leu Asp Phe Cys Ala Gln Asp Leu Asn Pro 1010 1015 1020 Cys Gln His Asp Ser Lys Cys Ile Leu Thr Pro Lys Gly Phe Lys Cys 1025 1030 1035 1040 Asp Cys Thr Pro Gly Tyr Val Gly Glu His Cys Asp Ile Asp Phe Asp 1045 1050 1055 Asp Cys Gln Asp Asn Lys Cys Lys Asn Gly Ala His Cys Thr Asp Ala 1060 1065 1070 Val Asn Gly Tyr Thr Cys Ile Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Leu Phe 1075 1080 1085 Cys Glu Phe Ser 1090 <210> 12 <211> 1165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Leu Asn Lys Val Ala Pro Gln Ala Cys Pro Ala Gln Cys Ser Cys 1 5 10 15 Ser Gly Ser Thr Val Asp Cys His Gly Leu Ala Leu Arg Ser Val Pro 20 25 30 Arg Asn Ile Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Gly Asn Asn 35 40 45 Ile Thr Arg Ile Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His Leu Arg 50 55 60 Val Leu Gln Leu Met Glu Asn Lys Ile Ser Thr Ile Glu Arg Gly Ala 65 70 75 80 Phe Gln Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu Asn Arg Asn His 85 90 95 Leu Gln Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Gly Thr Ala Lys Leu Tyr 100 105 110 Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gln Ile Gln Ala Ile Pro Arg Lys Ala 115 120 125 Phe Arg Gly Ala Val Asp Ile Lys Asn Leu Gln Leu Asp Tyr Asn Gln 130 135 140 Ile Ser Cys Ile Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp Leu Glu 145 150 155 160 Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn Ile Thr Arg Leu Ser Val Ala Ser 165 170 175 Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser Asn Asn 180 185 190 Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu Arg Gln 195 200 205 Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gln Cys Met Gly Pro Ser His Leu 210 215 220 Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gln Lys Arg Glu Phe Val Cys Ser 225 230 235 240 Asp Glu Glu Glu Gly His Gln Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys Ser Val 245 250 255 Leu His Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys 260 265 270 Arg Gly Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile 275 280 285 Thr Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly 290 295 300 Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn 305 310 315 320 Gln Ile Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu 325 330 335 Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser 340 345 350 Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 355 360 365 Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu 370 375 380 Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly 385 390 395 400 Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala Gln Asn 405 410 415 Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His 420 425 430 Thr Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg 435 440 445 Leu Ala Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys 450 455 460 Ser Gly Thr Glu Asp Tyr Arg Ser Lys Leu Ser Gly Asp Cys Phe Ala 465 470 475 480 Asp Leu Ala Cys Pro Glu Lys Cys Arg Cys Glu Gly Thr Thr Val Asp 485 490 495 Cys Ser Asn Gln Lys Leu Asn Lys Ile Pro Glu His Ile Pro Gln Tyr 500 505 510 Thr Ala Glu Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu Phe Thr Val Leu Glu Ala 515 520 525 Thr Gly Ile Phe Lys Lys Leu Pro Gln Leu Arg Lys Ile Asn Phe Ser 530 535 540 Asn Asn Lys Ile Thr Asp Ile Glu Glu Gly Ala Phe Glu Gly Ala Ser 545 550 555 560 Gly Val Asn Glu Ile Leu Leu Thr Ser Asn Arg Leu Glu Asn Val Gln 565 570 575 His Lys Met Phe Lys Gly Leu Glu Ser Leu Lys Thr Leu Met Leu Arg 580 585 590 Ser Asn Arg Ile Thr Cys Val Gly Asn Asp Ser Phe Ile Gly Leu Ser 595 600 605 Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Gln Ile Thr Thr Val Ala 610 615 620 Pro Gly Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu Ser Thr Leu Asn Leu Leu 625 630 635 640 Ala Asn Pro Phe Asn Cys Asn Cys Tyr Leu Ala Trp Leu Gly Glu Trp 645 650 655 Leu Arg Lys Lys Arg Ile Val Thr Gly Asn Pro Arg Cys Gln Lys Pro 660 665 670 Tyr Phe Leu Lys Glu Ile Pro Ile Gln Asp Val Ala Ile Gln Asp Phe 675 680 685 Thr Cys Asp Asp Gly Asn Asp Asp Asn Ser Cys Ser Pro Leu Ser Arg 690 695 700 Cys Pro Thr Glu Cys Thr Cys Leu Asp Thr Val Val Arg Cys Ser Asn 705 710 715 720 Lys Gly Leu Lys Val Leu Pro Lys Gly Ile Pro Arg Asp Val Thr Glu 725 730 735 Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gln Phe Thr Leu Val Pro Lys Glu Leu Ser 740 745 750 Asn Tyr Lys His Leu Thr Leu Ile Asp Leu Ser Asn Asn Arg Ile Ser 755 760 765 Thr Leu Ser Asn Gln Ser Phe Ser Asn Met Thr Gln Leu Leu Thr Leu 770 775 780 Ile Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Arg Cys Ile Pro Pro Arg Thr Phe Asp 785 790 795 800 Gly Leu Lys Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu His Gly Asn Asp Ile Ser 805 810 815 Val Val Pro Glu Gly Ala Phe Asn Asp Leu Ser Ala Leu Ser His Leu 820 825 830 Ala Ile Gly Ala Asn Pro Leu Tyr Cys Asp Cys Asn Met Gln Trp Leu 835 840 845 Ser Asp Trp Val Lys Ser Glu Tyr Lys Glu Pro Gly Ile Ala Arg Cys 850 855 860 Ala Gly Pro Gly Glu Met Ala Asp Lys Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser 865 870 875 880 Lys Lys Phe Thr Cys Gln Gly Pro Val Asp Val Asn Ile Leu Ala Lys 885 890 895 Cys Asn Pro Cys Leu Ser Asn Pro Cys Lys Asn Asp Gly Thr Cys Asn 900 905 910 Ser Asp Pro Val Asp Phe Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Tyr Gly Phe Lys 915 920 925 Gly Gln Asp Cys Asp Val Pro Ile His Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys 930 935 940 Lys His Gly Gly Thr Cys His Leu Lys Glu Gly Glu Glu Asp Gly Phe 945 950 955 960 Trp Cys Ile Cys Ala Asp Gly Phe Glu Gly Glu Asn Cys Glu Val Asn 965 970 975 Val Asp Asp Cys Glu Asp Asn Asp Cys Glu Asn Asn Ser Thr Cys Val 980 985 990 Asp Gly Ile Asn Asn Tyr Thr Cys Leu Cys Pro Pro Glu Tyr Thr Gly 995 1000 1005 Glu Leu Cys Glu Glu Lys Leu Asp Phe Cys Ala Gln Asp Leu Asn Pro 1010 1015 1020 Cys Gln His Asp Ser Lys Cys Ile Leu Thr Pro Lys Gly Phe Lys Cys 1025 1030 1035 1040 Asp Cys Thr Pro Gly Tyr Val Gly Glu His Cys Asp Ile Asp Phe Asp 1045 1050 1055 Asp Cys Gln Asp Asn Lys Cys Lys Asn Gly Ala His Cys Thr Asp Ala 1060 1065 1070 Val Asn Gly Tyr Thr Cys Ile Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Leu Phe 1075 1080 1085 Cys Glu Phe Ser Pro Pro Met Val Leu Pro Arg Thr Ser Pro Cys Asp 1090 1095 1100 Asn Phe Asp Cys Gln Asn Gly Ala Gln Cys Ile Val Arg Ile Asn Glu 1105 1110 1115 1120 Pro Ile Cys Gln Cys Leu Pro Gly Tyr Gln Gly Glu Lys Cys Glu Lys 1125 1130 1135 Leu Val Ser Val Asn Phe Ile Asn Lys Glu Ser Tyr Leu Gln Ile Pro 1140 1145 1150 Ser Ala Lys Val Arg Pro Gln Thr Asn Ile Thr Leu Gln 1155 1160 1165

Claims

하기를 포함하는 대상 내 혈관 장벽 기능을 촉진하는 방법: 대상에게 치료적 유효량의 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하고, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드의 투여는 내피 장벽 기능의 촉진을 초래함.
제 1 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드가 Robo4 의 리간드인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드가 하나 이상의 Slit2 폴리펩티드인 방법.
제 3 항에 있어서, 하나 이상의 Slit2 폴리펩티드가 Slit2N (SEQ ID NO: 4) 인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 그의 조합, 유도체, 상동체 및 유사체 중 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 장벽 기능의 촉진이 지질다당류, TNF-α, IL-1β 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 발생하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 장벽 기능의 촉진이 혈관 내피 세포의 표면에서 혈관 내피 카드헤린 (VE-카드헤린) 의 존재를 촉진하는 것 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진하는 것 중 하나 이상을 포함하는 방법.
하기를 포함하는 대상 내 혈관 장벽 기능을 촉진하는 방법: 대상에게 하나 이상의 ARF GTP 교환 인자 (ARF-GEF) 의 하나 이상의 억제제의 치료적 유효량을 투여하고, 하나 이상의 ARF-GEF 를 조정하는 것이 대상 내 혈관 투과성의 억제를 초래함.
제 8 항에 있어서, 하나 이상의 ARF-GEF 를 억제하는 것이 하나 이상의 ADP 리보실화 인자 (ARF) 의 억제를 초래하는 방법.
제 9 항에 있어서, 하나 이상의 ARF 가 ARF6, ARF1 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 억제제가 하나 이상의 ARF-GEF 의 이용가능성, 하나 이상의 ARF-GEF 의 활성화 및 하나 이상의 ARF-GEF 의 활성 중 하나 이상을 억제하는 소형 분자 화합물인 방법.
제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 ARF-GEF 의 하나 이상의 억제제가 SecinH3 을 포함하는 방법.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 ARF-GEF 의 하나 이상의 억제제가 화학식 1 에 따른 화합물 및 화학식 2 에 따른 화합물 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 ARF-GEF 의 하나 이상의 억제제가 하기 화합물, 및 그의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화합물 또는 수화물 중 하나로부터 선택되는 방법:

.
제 8 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 ARF-GEF 의 하나 이상의 억제제가 사이토헤신의 ARNO 패밀리로부터 선택되는 사이토헤신을 억제하는 방법.
제 15 항에 있어서, 사이토헤신이 ARNO 인 방법.
제 8 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상 내 혈관 투과성의 억제가 지질다당류, TNF-α, IL-1β 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 발생하는 방법.
제 8 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상 내 혈관 투과성의 억제가 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 것 및 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진하는 것 중 하나 이상을 포함하는 방법.
하기를 포함하는 대상 내 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 방법: 대상에게 치료적 유효량의 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하고; 대상에게 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하는 것이 대상 내 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진함.
제 19 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 그의 조합, 유도체, 상동체 및 유사체 중 하나 이상으로부터 선택되는 방법.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 대상 내 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 것이 지질다당류, TNF-α, IL-1β 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 발생하는 방법.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하는 것이 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진하는 방법.
하기를 포함하는 폐 혈관 염증을 갖는 대상을 치료하는 방법: 대상에게 치료적 유효량의 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하고, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하는 것이 대상 내 폐 혈관 염증의 감소를 초래함.
제 23 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드가 하나 이상의 Slit2 폴리펩티드인 방법.
제 24 항에 있어서, 하나 이상의 Slit2 폴리펩티드가 Slit2N (SEQ ID NO: 4) 인 방법.
제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 그의 조합, 유도체, 상동체 및 유사체 중 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는 방법.
제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 염증의 감소가 지질다당류, TNF-α, IL-1β 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 발생하는 방법.
제 23 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하는 것이 대상 내 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 방법.
제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하는 것이 대상 내 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진하는 방법.
제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 염증을 치료하는 것이 대상 내 혈관 내피 세포의 표면에서 p120-카테닌의 발현을 촉진하는 것을 추가로 포함하는 것 중 하나 이상을 치료하는 것을 포함하는 방법.
하기를 포함하는 급성 폐 혈관 부종, 만성 폐 혈관 부종, 급성 폐 혈관 염증, 만성 폐 혈관 염증, 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증, 세균성 패혈증 또는 인플루엔자 감염 중 임의의 하나와 연관된 혈관 투과성을 감소시키는 방법: 대상에게 치료적 유효량의 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하고, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하는 것이 대상 내 병리적 상태와 연관된 혈관 투과성을 감소시킴.
제 31 항에 있어서, 병리적 상태가 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증인 방법.
제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드가 지질다당류, TNF-α, IL-1β 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염증 매개체의 존재 하에 대상에게 투여되는 방법.
제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Slit 폴리펩티드를 투여하는 것이 혈관 내피 세포의 표면에서 VE-카드헤린의 존재를 촉진하는 방법.
하기를 포함하는 폐 섬유증을 앓는 대상을 치료하는 방법:
대상에게 화학식 1 에 따른 화합물 및 화학식 2 에 따른 화합물로부터 선택되는 화합물의 치료적 유효량을 투여함.
제 35 항에 있어서, 대상에게 SecinH3 및 그의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화합물 또는 수화물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 35 항에 있어서, 대상에게 하기 화합물, 및 그의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화합물 또는 수화물 중 하나로부터 선택되는 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법:

.
하기를 포함하는 대상 내 폐 섬유증의 발생을 억제하는 방법: 대상에게 화학식 1 에 따른 화합물 및 화학식 2 에 따른 화합물로부터 선택되는 화합물의 치료적 유효량을 투여함.
제 38 항에 있어서, 대상에게 SecinH3 및 그의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화합물 또는 수화물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 38 항에 있어서, 대상에게 하기 화합물, 및 그의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화합물 또는 수화물 중 하나로부터 선택되는 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법:

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하기를 포함하는 폐 섬유증을 앓는 대상을 치료하는 방법:
대상에게 치료적 유효량의 Slit 폴리펩티드를 투여함.
제 41 항에 있어서, 대상에게 치료적 유효량의 Slit2 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 42 항에 있어서, Slit2 폴리펩티드가 Slit2N (SEQ ID NO: 4) 인 방법.
제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, Slit 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 로 나타내는 폴리펩티드, 및 그의 조합, 유도체, 상동체 및 유사체 중 하나로부터 선택되는 방법.
하기를 포함하는 대상 내 폐 섬유증의 발생을 억제하는 방법:
대상에게 치료적 유효량의 Slit 폴리펩티드를 투여함.
제 45 항에 있어서, 대상에게 치료적 유효량의 Slit2 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, Slit 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 로 나타내는 폴리펩티드, 및 그의 조합, 유도체, 상동체 및 유사체 중 하나로부터 선택되는 방법.