KR20100128294A - 세포증식 억제 조성물 - Google Patents

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KR20100128294A
KR20100128294A KR1020107020107A KR20107020107A KR20100128294A KR 20100128294 A KR20100128294 A KR 20100128294A KR 1020107020107 A KR1020107020107 A KR 1020107020107A KR 20107020107 A KR20107020107 A KR 20107020107A KR 20100128294 A KR20100128294 A KR 20100128294A
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세르게이 티시킨
블라디슬라브 니콜라에비치 라스카비
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세르게이 티시킨
블라디슬라브 니콜라에비치 라스카비
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Abstract

약리학적 염 용액에 유효량의 알데히드를 함유하는 세포성장 억제 조성물은 수많은 암 세포주들의 성장을 억제하는데 효과적임을 보인다.

Description

세포증식 억제 조성물{CYTOSTATIC COMPOSITION}
본 출원은, 2008년 2월 9일에 출원되고 본 명세서에 전체로서 참고로 포함된 미국 가출원 특허 61/065,172의 우선권을 주장한다.
개시된 장치와 방법은 암세포 성장 억제에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 수많은 암세포주 성장 억제에 효과적인 것으로 보인 약리학적인 염 용액(pharmacological salt solution)에 유효량의 알데히드를 함유하는 세포증식 억제 조성물이 개시된다.
알데히드류는 종래 현미경 검사용 암 조직으로부터 표본 제조를 위해 그리고 병용 치료의 일부 경우에 있어서 사용되어 왔다.
예를 들면, PCT 출원 WO 02/28345는 특이적인 클래스의 화학요법제가 투여되는 경우에 DNA 부가물(DNA adducts)이 형성된다고 교지한다. 아드리아마이신은 주어진 일례이지만, '클래스'는 일반적으로 '안트라사이클린 또는 안트라세네디온'으로 칭해지며 이러한 부가물의 형성은 세포독성(cytotoxicity)과 연계되어 있으며 알데히드의 존재를 필요로 한다. 본 출원에서, 화학요법제의 역가가 다른 알데히드의 방출에 의하여 생체내에서 증가되도록 상기 화학요법제를 알데히드-방출제와 병용 투여하는 단계를 기술하고 있다. 일부 실시예에서, 상기 알데히드는 포름알데히드이다.
미국 특허 6,677,309는 안트라사이클린류와 알데히드 방출제의 결합체(conjugate)를 교지한다.
PCT 출원 WO 2005/120577은 향정신 약물인 제 1 모이어티와 포름알데히드 분자를 방출할 수 있는 제 2 모이어티를 함유하는 결합체를 교지한다.
PCT 출원 WO 2005/034856은 '화학적 촉발제(chemical trigger)'로 '보호'되는 알데히드에 결합된 치료제를 갖고 표적기(targeting group)를 더 포함할 수 있는 결합체를 교지한다. 달리 말해, 상기 화학적 촉발제는 상기 결합체가 소기의 부위에 이를 때까지 전구약물의 형태를 유지한다. 일부 경우에, 표적 분자는 상기 결합체를 소기의 치료 부위로 지향하는데 사용된다.
본 발명은 물에 녹인 약학적으로 허용가능한 염의 용액에 현탁된 알데히드를 함유하는 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이며, 나아가 이러한 약학적 조성물을 제조하는 방법 및 이러한 조성물의 용도를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제 1 태양에 따르면, 물에 녹인 약학적으로 허용가능한 염의 용액에 현탁된 알데히드를 함유하는 약학적 조성물이 제공된다. 즉, 약학적으로 허용가능한 염의 수용액에 현탁된 알데히드를 함유하는 약학적 조성물이 제공된다.
도 1은 대세포 폐암 LXFL 529에 집락 형성(colony formation) 억제의 도면들을 도시한다.
도 2는 도 1의 집락 형성을 더 높은 배율로 도시한다.
도 3은 세포증식 억제제의 평균-그래프 분석(Mean-graph analysis)을 도시한다.
도 4는 100 ㎕/생쥐의 투여량으로 하루 2 회 투여한 이후 세포증식 억제제의 생쥐 체중량에 미치는 영향을 도시한다. A: 시간에 따른 그룹 평균 상대 체중. B: 14 일에 개별 상대 체중.
도 5는 4개의 인간 종양 세포주에 대한 CC의 농도 효과 곡선들을 도시한다.
도 6은 CC로 3 일 치료한 이후 세포주 MAXF 401NL의 생체외 성장(in vitro growth)을 도시한다(1번째 사이클).
도 7은 CC로 3 일 치료한 이후 세포주 MAXF 401NL의 생체외 성장을 도시한다(2번째 사이클).
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의하여 평균적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질들이 기술된다. 이하 언급된 모든 발간물들은 본 명세서에 그대로 참고로 포함된다.
수용성 염 용액에 현탁된 알데히드를 함유하는 항암 또는 세포증식 억제 조성물이 본 명세서에 기술된다. 편의를 위해, 일부 경우에, 상기 조성물은 '세포증식 억제제'로 칭한다.
본 명세서에 사용된 '알데히드'는 말단 카르보닐기 또는 알데히드기를 함유하는 임의의 유기 화합물을 가리킨다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 알데히드는 천연 알데히드이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 천연 알데히드는 포름알데히드이다.
본 발명의 일 실시예에서, 세포증식 억제 조성물은 하기에 기술된 바와 같이 약학적으로 허용가능한 염 용액을 제공하여 제조된다. 이후, 상기 포름알데히드는 0.00004% 내지 1.1%의 농도의 용액에 현탁된다. 또한, 약리학적 식염수 용액에 현탁된 포름알데히드의 최종 농도는 0.00012% 내지 0.12%일 수 있다. 본 방법에 따라 제조된 세포증식 억제 조성물은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 암치료에 사용될 수 있다.
상기 조성물내의 포름알데히드의 농도는 0.00004% 내지 1.1%일 수 있다. 또한, 상기 농도는 0.00012% 내지 0.12%일 수 있다. 상기 조성물에서의 포름알데히드의 최대 농도는 1.1%이다. 본 발명자들은 이 비율을 초과하면 독성으로 인하여 내부 기관들의 기능 저하를 유발하여, 상기 조성물이 효과가 거의 없거나 전혀 효과가 없게 된다. 예를 들면, 포름알데히드를 더 높은 농도로 주사하면 주사 부위에 궤양을 일으킬 수 있다. 상기에서 기술된 바와 같이, 상기 범위의 최저점은 0.00004%이며, 이 지점 미만으로는 효과가 전혀 없는 것으로 여겨진다.
바람직한 일 실시예에서, 포름알데히드의 원천은 예를 들면, 의료용급 포르말린인 포르말린으로서, 예를 들면, 40% 포름알데히드 덩어리를 포함하는 40% 포르말린이다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 포름알데히드의 다른 약학적으로 허용가능한 원천들은 본 발명 내에서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 염 용액은 예를 들면, 0.1%-2.0% 또는 0.1%-1.9% 또는 0.1%-1.8% 또는 0.1-1.7% 또는 0.1%-1.6% 또는 0.1%-1.5% 또는 0.1%-1.4% 또는 0.1%-1.3% 또는 0.1%-1.2% 또는 0.1%-1.1% 또는 0.1%-1.0% 또는 0.1%-0.9% 또는 0.2%-2.0% 또는 0.3%-2.0% 또는 0.4%-2.0% 또는 0.5%-2.0% 또는 0.6%-2.0% 또는 0.7%-2.0% 또는 0.8%-2.0% 또는 0.9%-2.0% 또는 0.5-1.5% 또는 0.5%-1.3% 또는 0.6-1.4% 또는 0.6%-1.2% 또는 0.7%-1.3% 또는 0.7%-1.1% 또는 0.8%-1.2% 또는 0.8%-1.0% 또는 0.9% 염화 나트륨 용액 또는 링거 용액 또는 식염수 용액인 약학적으로 허용가능한 또는 생리학적 염 용액이다. 바람직하게는, 상기 생리학적 염 용액의 pH는 투여되는 개인의 생리학적 pH이거나 그와 유사한 pH이며, 즉, 상기 약학적으로 허용가능한 또는 생리학적 염 용액의 pH는 7.2 내지 7.6이다.
바람직한 일 실시예에서, 생리학적 염 용액에 현탁된 0.00004% 내지 1.1% 포름알데히드를 함유하는 세포증식 억제 조성물이 제공된다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 생리학적 염 용액에서의 포름알데히드의 농도는 0.00012% 내지 0.12% (v/v)이다. 일부 실시예에서, 상기 생리학적 염 용액은 NaCl 용액, 식염수 용액 또는 링거 용액이다. 일부 실시예에서, 상기 염 용액은 주사용의 0.1 내지 2.0% 또는 0.9% 염화 나트륨이다.
본 발명의 일 실시예에서, 세포증식 억제 조성물은 물에 염화 나트륨의 0.9% 용액을 제공하여 제조된다. 이후 포름알데히드가 0.00004% 내지 1.1%의 농도로 상기 용액에 현탁된다. 또한, 약리학적 식염수 용액에 현탁된 포름알데히드의 최종 농도는 0.00012% 내지 0.12%일 수 있다. 상기 세포증식 억제 조성물은 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 암치료에 사용될 수 있다.
하기에서 기술된 바와 같이, 상기 세포증식 억제 조성물은 혐기성 호흡을 하는 세포들을 호기성 호흡으로 '전환하여' 암 세포의 증식 또는 성장률을 감소시키거나 억제하는데 효과가 있다고 여겨지지만, 이미 호기성 호흡을 하는 세포에는 거의 효과가 없거나 전혀 효과가 없는 것으로 예상된다.
특이적인 이론에 의하여 구속되기를 원하지 않는 본 발명자들은 포름알데히드가 약학적으로 허용가능한 수용성 염 용액과 혼합되는 경우, 예를 들면, 0.9% NaCl 수용액으로 결코 한정되지 않는 경우, 포름알데히드는 상기 조성물이 신체 세포 구조 내에서 신진대사에 침투하여 종양내에서 결합된 포름알데히드류를 방출하거나 종양 성장을 중단하도록 유발하여 종양 그 자체를 감소시켜, 즉, 종양 그 자체의 크기를 감소시키는 것으로 생각하고 있다.
오토 와버그(Otto Warburg)는 암세포가 통상적으로 영양분으로서 젖산의 형성을 포함하는 혐기성 포도당 호흡을 이용한다는 것을 이전에 알게 되었다는 점은 주목할 만하다. 와버그에 의하면, 세포가 혐기성 호흡을 이용하여 암세포로 '재생'되면 세포가 자율적으로 존재한다고 한다. 세포의 재생으로 인하여 예를 들면, 산도, 에너지 소비, 호흡 등에의 변화에 한정되지 않는, 조직에서의 전암증상 변화를 유발한다. 따라서, 정상 또는 전암증상 암세포의 암세포로의 변환의 일 단계는 상기 세포의 혐기성 포도당 호흡으로의 헌신이다.
세포에서의 생물학적 호흡은 2 단계로 진행한다. 제 1 단계는 혐기성 단계(무산소)이며 제 2 단계는 호기성 단계(유산소)이다. 포도당 분해(호흡의 혐기성 단계)는 피루브산을 젖산으로 전환하는 것이다. 호흡의 혐기성 단계는 포도당 1 분자에 대하여 ATP 2 분자만을 제공한다. 생물학적 호흡의 제 2 단계(호기성)는 포도당 1 분자에 대하여 ATP가 38 분자 합성된다. 따라서, 산호 호흡 유기체는 혐기성 생물보다는 19 배 더 효과적으로 탄수화물의 에너지를 사용한다.
예를 들면, 면역 증가, 유기체의 산소 요법(oxygenation), 악성고열, 광역학 요법, 종양의 혈관 폐색(vascular blockage), 전통적인 요법, 방사선 요법(radial therapy), 특수 단백질의 생성, 종양유전자의 폐색, 나노기술의 이용 등과 같은 종양학적 조건의 현존 치료 방법에 대한 대안으로서, 본 발명자들은 종양학적 조건의 치료에 대한 다른 접근법은 종양세포 또는 암세포의 신진대사를 혐기성 호흡으로부터 호기성 호흡으로 변화시킬 수 있다고 생각한다.
이와 같은 견지에서, 본 발명자들은 모든 기관, 조직 및 액체 매질에서 최소량으로 함유되어 있는 천연 대사물질들 중 하나인 포름알데히드를 사용하였다. 포름알데히드는 통상적으로 대사 과정의 결과로서 세포 내에서 만들어지며 효소계에 의하여 용이하게 비활성화된다(L.V. Miretskaya, P.Ya. Shavartsman. Cytology. - 1982. - XXIV 권. - 9 번 - 1059 페이지). 특히, 포름알데히드는 리불로오스 모노-인산염 사이클의 핵심 효소인 헥술로스-인산염 합성효소(hexulose-phosphate synthase)의 합성을 촉진한다. 또한, 포름알데히드의 모노 탄소 라디칼은 다양한 화합물의 생합성에 활발히 관여하게 된다. 또한, 포름알데히드는 면역 조절 및 항바이러스 특성을 갖는다.
이와 같은 견지에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 포름알데히드-함유 작용제 및/또는 조성물의 세포에서의 대사 과정에 미치는 영향을 조사하였다.
예를 들면, 본 명세서에 기술된 세포증식 억제 조성물을 유효 투여량으로 토끼에게 주사하면 동물 유기체에서 예를 들면, 아스파르트산 아미노전이효소 및 알라닌 아미노전이효소와 같은 아미노산 대사와 관련된 효소 활성을 현저하게 증가시킨다. 이로써 단백질 합성에 있어서 알라닌과 아스파라긴의 활용이 더 감소하게 되는데, 피검자의 혈청에서 단백질 레벨의 감소로 증명된다.
예를 들면, 알라닌 아미노전이효소 활성 증가로 피루브산 레벨이 증가하게 되고, 이로부터 아세틸-CoA는 미토콘드리아에서 ATP의 산소 관련 합성을 위해 사용되는 수소화 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드류 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드류를 다량 생산하는 이 및 삼탄소 산류 사이클에서 "연소"된다.
또한, 크레아틴 인산효소 활성의 증가는 세포의 에너지 제공에 있어서 증가를 가리킨다. 동시에, 젖산 탈수소효소 활성 감소가 발생하는데, 이는 혐기성 호흡에 대한 호기성 호흡 과정의 우세를 가리키는 것이다. 이는 포도당분해에서 형성된 피루브산의 주 덩어리가 산화 카르복실화를 거쳐 세포에서 유기 요소들의 산화 호기 단계에서 사용되는 아세틸-CoA의 대량 산출을 의미하는 것이다. 여분의 아세틸-CoA가 다양한 유지질류의 합성, 특히 피검자의 혈액에서 총 콜레스테롤 레벨의 현저한 증가로 검출될 수 있는 콜레스테롤 합성을 위해 사용된다.
따라서, 본 명세서에 기술된 세포증식 억제 조성물은 세포에서의 호기성 호흡을 활성화시켜, 다양한 종양 세포주들에 미치는 이의 세포증식 억제 효과를 설명하게 된다. 즉, 상기에서 기술된 바와 같이, 암세포들은 통상적으로 혐기성 호흡을 하는 반면에 정상 또는 비-암세포들은 호기성 호흡을 하게 된다. 그러나, 세포증식 억제 화합물을 유효량 투여하게 되면 이러한 세포들이 혐기성 호흡에서 호기성 호흡으로 전환하게 된다. 또한, 상기 세포증식 억제 화합물은 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 호기성 호흡을 하는 정상 세포들에 영향이 거의 없거나 전혀 영향을 주지 않는 것으로 예상된다.
또한, 본 발명자들은 포름알데히드가 자유 라이신 및 아르기닌 아미도겐과 용이하게 반응하여 이 과정이 일어나는 동안에 카르보닐기가 옥시기로 전환하고 아미도겐이 이미노기로 전환하게 되는 것을 주목한다. 이미노기 수소 및 히드록실 산소뿐만 아니라 히드록실기 수소 및 이미노기 질소는 분자내 수소 결합을 생성할 수 있다. 반면에, 이민(쉬프 염기(Schiff's base))는 메틸카르비노아민 중간물질 단계를 거쳐 생성된다:
HCOH + NH 2 - CH (R)- CO - → H 2 C ( OH )- NH - CH (R)- CO - → HCH =N- CH (R)- CO - + H 2 O
(여기서, NH2-CH(R)-CO는 단백질 분자의 단편이다.)
자유 아미도겐들을 결합하면 수소 이온들을 수용하는 능력을 상실하게 된다. 세포내 함량에서의 수소 자유 이온들의 농도는 약간 증가하게 되는데, 즉, pH는 산성 방향으로 바뀌게 된다. 대부분의 포도당분해 효소들의 최적 pH가 알칼리 환경에서 발생하기 때문에, 탄수화물의 옥시바이오틱(oxybiotic) 산화의 비율이 증가하게 된다.
또한, 이후 이미노기의 양성자화(protonation)는 수소 결합의 개시에 대한 조건을 발생하게 된다. 라이신 아미노산 화학기의 부분으로서 아미도겐은 동일하게 상호작용한다. 본 발명자들의 의견에 의하면, 자유 아르기닌 아미도겐은 그 기능적 활성에 있어서 N-말단 단백질 아미도겐류 및 라디칼 라이신 아미도겐과 상이하지 않으며 상동 반응(homotypic reaction)을 갖는다. 그러한 상호작용은 단백질 분자들의 배좌에 있어서 변화로 이어지고, 그럼으로써 그 물리/화학적 성질에의 변화로 이어진다. 핵단백질로서 염색체의 부분인 단백질-히스톤은 라이신 및 아르기닌의 디아미노모노카르복실산류를 다량 함유한다. 포름알데히드 첨가 반응 이후 수소 결합의 형성으로 인하여 히스톤들의 카르복실 DNA기들과 자유 아미도겐들 사이에 분자내 반데르 발스 상호작용을 차단하게 된다. 그 결과, 이전 전사 구역들은 사라질 수 있으며 새로운 구역들이 나타나는데(유전자들의 RNA-복제체들의 형성), 이로 인해 세포 단백질들의 양과 질에 변화가 일어나게 된다. 요약하면, 불변 유전자형하에서 표현형 돌연변이를 달성할 가능성이 있다.
본 명세서에 사용된 '유효량'은 하나 이상의 하기 사항을 달성하는데 충분한 세포증식 억제 조성물의 양이다: 유사한 연령 및 조건의 세포들의 무처리 또는 대조 또는 허위 처리된 개체군과 비교하여 암세포들의 개체군, 예를 들면, 종양 내에서 호기성 호흡 증가; 유사한 연령 및 조건의 세포들의 무처리 또는 대조 또는 허위 처리된 개체군과 비교하여 암세포들의 개체군, 예를 들면, 종양의 성장 속도 또는 증식 감소 또는 억제; 유사한 연령 및 조건의 세포들의 무처리 또는 대조 또는 허위 처리된 개체군과 비교하여 종양 체적 성장 속도 감소; 유사한 연령 및 조건의 세포들의 무처리 또는 대조 또는 허위 처리된 개체군과 비교하여 더 긴 기간의 완화(remission); 및 유사한 연령 및 조건의 세포들의 무처리 또는 대조 또는 허위 처리된 개체군과 비교하여 암과 관련된 하나 이상의 증후군들의 중증도 감소.
이하 제시된 실시예에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 세포증식 억제 조성물은 대세포 폐암, 신장암, 결장암, 방광암, 위암, 두경부암, 간암, 아데노 폐암, 소세포 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암 뿐만 아니라 흑색종, 흉막 중피종 및 육종에 대한 생체외 시험에서 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, 하기에서 기술되는 바와 같이, 당해 발명의 세포증식 억제 조성물은 광범위한 암 유형에 적합한 치료로 보이며 세포들의 개체군의 혐기성 호흡 성장으로 특징되는 임의의 질병 또는 질환에 대한 치료로 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 세포증식 억제 조성물은 상기 치료를 필요로 하는 개인, 즉, 암진단 받고, 암을 가진 것으로 의심되거나 암을 발전시킬 위험이 있는 개인에게 암 또는 암 성장을 치료하거나 방지하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 이에 적절한 암은 대세포 폐암, 신장암, 결장암, 방광암, 위암, 두경부암, 간암, 아데노 폐암, 소세포 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암뿐만 아니라 흑색종, 흉막 중피종 및 육종을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 따라서, 하기에서 기술되는 바와 같이, 당해 발명의 세포증식 억제 조성물은 광범위한 암 유형에 적합한 치료로 보이며 세포들의 개체군의 혐기성 호흡 성장으로 특징되는 임의의 질병 또는 질환에 대한 치료로 이용될 수 있다.
본 발명은 실시예에 의하여 더 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
약어
본 명세서에 사용된 약어들은 하기를 포함한다: 체중량 손실(BWL), 사이클린 의존성 키나아제(CDK), 이산화탄소(CO2), 일(들)(d), 디메틸 설폭시드(DMSO), 우태혈청(FCS), 5-플루오로우라실(5-FU), 그램(gm), 면역조직화학(IHC), T/C-수치 = 100-x가 도달된 억제 농도(ICx), 근육내(im), 면역 조절 화합물(본 연구의 시험 화합물, 즉, 세포증식 억제 화합물)(CC), 이스코베 변형 Dulbecco 배지(IMDM), 침윤성(inf.), 킬로그램(㎏), 리터(L), 밀리그램(㎎), 밀리리터(mL), 중등도 분화(moderately differentiated)(md), 밀리그램(㎎), 마이크로그램(㎍), 밀리리터(㎖), 마이크로리터(㎕), 마이크로미터(㎛), 이용불가(not available)(n.a.), 미정(not determined)(n.d.), 미 해군 의학 연구소(NMRI), 비소세포(NSC), 유두(pap), 인산염 완충 식염수(PBS), 저등도 분화(poorly differentiated)(pd), 루즈벨트 파크 기념 연구소(RPMI), 시험 대 대조 수치(T/C-수치), 단위(U), 미분화(ud), 부피당 부피(v/v), 고등도 분화(well differentiated)(wd), 부재(w/o), 부피당 중량(w/v).
실시예 1
상술한 세포증식 억제 조성물의 항종양 효능은 집락형성 분석법을 이용하여 생체외에서 27 개 인간 종양 이종이식체에서 평가되었다. 상기 종양 시험 패널은 방광암, 결장, 위, 두경부(head and neck), 간, 비소세포 폐(아데노 및 대세포), 소세포 폐, 유방, 난소, 췌장, 전립선 및 신장암뿐만 아니라 흑색종, 흉막 중피종 및 육종인 15 개의 다양한 인간 종양 유형들 중 1 내지 4 개 모델들을 포함하였다. 상기 세포증식 억제 조성물은 0.001% 내지 100.0%에 이르는 6 개의 농도에서 연구되었다. 항종양 효과는 미처리 대조와 관련하여 집락 형성의 억제로 기록되었다(T/C-수치).
본 명세서에서 '세포증식 억제제'로도 불리는 세포증식 억제 조성물은 농도-의존성 방식으로 종양 집락 형성을 억제하였다. 평균 IC70-수치는 0.462%로 측정되고, 평균 IC50-수치는 0.195%로 측정되었다. 세포증식 억제제의 평균 이상의 활성은 대세포 폐암(LXFL 529), 소세포 폐암(LXFS 615, LXFS 650), 유방암(MAXF 401), 흑색종(MEXF 989) 및 전립선암(PRXFMRIH 1579)의 종양 모델들에 대하여 관찰되었다. 가장 민감한 종양들은 소세포 종양암 LXFS 650 및 흑색종 MEXF 989였다. 이 종양 모델들에 있어서 IC70-수치들은 평균 IC70-수치에 비하여 100배 이상 더 낮았다.
목적
본 연구에서, 세포증식 억제제는 27 개 종양 이종이식체들에서 생체외 항암 활성에 대하여 조사되었다. 집락형성 분석법은 가능한 종양 유형 선택도를 조사하기 위하여 이용되었다.
집락 형성 분석법(= 종양 집락 분석법, TCA)에서, 연질 한천에서 성장하는 종양 줄기 세포들의 집락 형성의 억제가 조사된다. 종양의 성장, 전이 및 침윤 포텐셜을 담당하는 종양 줄기 세포는 누드 생쥐들에서 성장하는 인간 종양 이종이식체들로부터 직접 제조된다. 따라서, 집락형성 분석법은 영구 종양 세포주를 사용하는 생체외 분석보다 생체내 상황을 더 잘 반영하며 항종양 약물의 심도깊은 생체내 평가를 위한 고도로 예언적인 시험인 것으로 밝혀졌다.
운반체 및 농도
세포증식 억제제는 6 개 농도들로 시험되었다. 시험된 최고 농도는 하기에 제시된 바와 같이 0.004%였는데, 이는 세포증식 억제제 100%로 설정된 시험에서 운반체에 허용된 최고 농도였다. 또한, 10% v/v 식염수 용액으로 보충된 IMDM은 대조 운반체로 사용되었다.
시험에서 표시된 상대 농도 세포증식 억제제에서의 포름알데히드 농도
100% 0.004%
10% 0.0004%
1% 0.00004%
0.1% 4x10-6
0.01% 4x10-7
0.001% 4x10-8
종양 모델
상기 이종이식체들의 기원은 이전에 기술되어 왔다(Berger et al, 1990, Ann. Oncol. 1: 333-341; Scholz et al., 1990, Eur . J. Cancer 26: 901-905; Fiebig et al, Eur . J. Cancer 40: 802-820). 세포증식 억제제는 총 27 개 인간 종양 이종이식체들에서 시험되었다. 종양 시험 패널은 방광암, 결장, 위, 두경부, 간, 비소세포 폐(아데노 및 대세포), 소세포 폐, 유방, 난소, 췌장, 전립선 및 신장암뿐만 아니라 흑색종, 흉막 중피종 및 육종인 15 개의 다양한 인간 종양 유형들 중 1 내지 4 개 모델들을 포함하였다.
종양- 집락 -분석법
인간 종양 이종이식체들로부터 단일 세포 현탁액의 제조
흉선 무형성 누드 생쥐(NMRI nu/nu 균주)에서 계대 배양으로 피하 성장하는 고형 인간 종양 이종이식체들은 멸균 조건하에서 제거되고, 기계적으로 해체되며 이후, 교원질 분해 효소 유형 IV(41 U/㎖)(시그마), DNase I(125 U/㎖)(로체), 히알루로니다아제 유형 III(100 U/㎖)(시그마) 및 디스파제(dispase) II(1.0 U/㎖)(로체)로 이루어진 효소 칵테일과 함께 RPMI 1640-배지(Life Technologies)에서 37℃로 45 분간 배양되었다. 세포들은 200 ㎛ 및 50 ㎛ 메쉬 크기의 체를 통과하였으며 멸균 PBS-완충액으로 2회 세척되었다. 생존가능한 세포들의 백분율은 트리판 블루 배제 검사를 이용한 뉴바우어-혈구 계산기(Neubauer-hemocytometer)에서 측정되었다.
인간 종양 이종이식체로부터 세포를 배양하는 배양법
집락 형성 분석은 햄버거 & 새몬(Hamburger & Salmon)이 도입한 변형된 2-층 연질 한천 분석법에 따라 24-웰 포멧에서 수행되었다. 바닥층은 0.2 ㎖/웰 IMDM(Life Technologies)(20%(v/v) 우태혈청(시그마), 0.01%(w/v) 겐타마이신(Life Technologies) 및 0.75(w/v) 한천으로 보충됨)으로 구성되었다. 2x104 내지 4x104 세포들이 0.4%(w/v) 한천으로 보충된 동일한 배양 배지 0.2 ㎖에 첨가되었으며 24-멀티웰 접시에서 바닥층 상으로 평판 배양되었다. 시험 화합물은 0.2 ㎖ 배양 배지에서 연속 노출(약물 오버레이(overlay))로 도포되었다. 모든 접시는 6 개의 미처리 대조 웰들과 6 개 농도의 3 벌의 약물-처리 군들을 포함하였다. 배양물은 37℃의 가습 대기의 7.5% CO2에서 6 내지 18 일 동안 배양되고 도립 현미경을 사용하여 집락 성장 여부에 대하여 세밀하게 모니터링 하였다. 이 기간 동안에, 생체외 종양 성장으로 인하여 50 ㎛를 초과하는 지름을 갖는 집락들이 형성되었다. 최대 집락 형성시에, 계수측정은 자동 이미지 분석 시스템(OMNICON 3600, Biosys GmbH)을 이용하여 수행되었다. 평가 전 24 시에 중심 집락들은 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐테트라졸리움 클로라이드(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride)(1 ㎎/㎖, 100 ㎕/웰)(시그마)의 멸균 수용액으로 염색되었다.
자료 평가
하기와 같은 품질 조절 기준이 충족된다면 분석법이 충분히 평가될만하다고 간주되었다:
- 24-멀티웰 플레이트들의 대조 웰들에 있어서 평균 집락 수 ≥ 50 ㎛를 초과하는 집락 지름을 갖는 20 개 집락
- 각각의 플레이트의 대조 웰들에 있어서 변동 계수 ≤ 50%
- 양성 참조 화합물(positive reference compound) 5-플루오로우라실(5-FU, 1.0 ㎎/㎖의 세포독성 농도)은 집락수 감소를 대조군의 30% 미만으로 달성하여야 하거나 0 또는 2일에 초기 플레이트 계수는 최종 대조 계수의 20% 미만이어야 한다.
약물 효과는 처리된 웰들의 평균 집락수와 미처리 대조군의 평균 집락 계수를 비교하여 얻은 집락 형성의 백분율로 표시된다(상기 시험-대-대조 수치로 표시되는 상대 집락 계수, T/C-수치[%]):
Figure pct00001
집락 형성을 각각 50%(T/C = 50%) 및 70%(T/C = 30%)만큼 억제하는데 필요한 약물 농도들인 IC50 - 및 IC70-수치들은 화합물 농도 대 상대 집락 계수를 플로팅하여 측정되었다. 평균 IC50- 및 IC70-수치들은 x가 특이적인 종양 모델이고, n이 연구되는 종양 모델들의 총 숫자인 하기 식에 따라 계산되었다
Figure pct00002
.
IC50 - 또는 IC70- 수치가 (화합물이 너무 활성이거나 활성이 부족한 이유로 인하여) 검사 용량 범위 내에서 측정될 수 없다면, 조사되는 최저 또는 최고 농도가 계산을 위해 이용되었다.
평균 그래프 분석에서, 개별 종양 유형에 있어서 시험 화합물에 대하여 얻어진 IC50-(IC70-) 수치들의 분포는 시험된 모든 종양들(도 2에 도시)에 대하여 얻어진 평균 IC50-(IC70-) 수치에 대하여 주어져 있다. 개별 IC50-(IC70-) 수치들은 로그 스케일 축상에 막대로 표시된다. 왼쪽 막대들은 IC50-(IC70-) 수치들이 평균 수치보다 더 낮다는 것을 보여주며(더 민감한 종양 모델들을 표시), 오른쪽 막대들은 더 높은 수치들(다소간 내성이 있는 종양 모델들을 표시)을 보여준다. 따라서, 평균 그래프 분석은 화합물의 항증식 효능의 증거가 된다.
결과
세포증식 억제제가 종양 줄기 세포의 집락으로의 성장을 억제하는 능력은 다양한 종양 유형들의 고형 인간 종양 이종이식체들로부터 유래된 27 개의 세포 현탁액에서 검사되었다. 세포 제제들은 표 1에 기술된 바와 같이 세포 유형에 따라 6 내지 20 일 이내에 미처리 대조 웰들에서 123 개 내지 860 개 집락들을 형성하였다.
미처리 대조군들의 자료 결과는 예상 범위 내에 있었다. 성장 억제의 양성 대조로 사용된 5-플루오로우라실은 양호한 항종양 활성을 보였다. 세포증식 억제제의 생체외 시험의 결과들은 표 2 및 도 1에 요약되어 있다. 표 2는 전체 생체외 반응 속도, 즉, 각각의 시험 농도에서의 세포증식 억제제의 활성을 억제하는 성장을 여준다. 항종양 활성은 집락 형성이 미처리 대조군들의 30% 미만으로 억제되는 것으로 정의된다.
종양 집락 형성의 농도 의존성 억제가 관찰되었다. 농도-반응 관계는 0.1에서 1.0% 사이의 범위에서 부분적으로 매우 급격했다. 세포증식 억제제는 0.001%의 농도에서 27 개 종양 모델들 중 1 개(4%)에서 70%를 초과하는 집락 형성 억제가 이루어졌다. 0.01% 및 0.1%에서 세포증식 억제제는 27 개 종양들 중 2 개(7%)에서 활성이었고, 1.0%에서는 27 개 종양들 중 23 개(85%)에서, 10.0%에서는 27 개 종양들 중 25 개(93%) 및 100.0%에서는 27 개 종양들 중 27 개(100%)에서 활성이 있었다(표 3). 평균 IC50은 0.195%로 측정되었으며, 평균 IC70은 0.462%로 측정되었다(도 2).
세포증식 억제제의 항종양 선택도 프로파일은 평균 그래프 분석(도 2)으로부터 수득되었다. 본 연구에서 가장 민감한 종양들은 소세포 폐암 LXFS 650(IC70 < 0.001%) 및 흑색종 MEXF 989(IC70 = 0.004%)이었다. 또한, 세포증식 억제제의 평균 이상 활성은 대세포 폐암 LXFL 529(IC70 = 0.162%), 소세포 폐암 LXFS 615(IC70 = 0.31%), 유방암 MAXF 401(IC70 = 0.243%) 및 전립선암 PRXF MRIH1579(IC70 = 0.234%)에 대하여 관찰되었다(도 1). 따라서, 전체 항종양 효능은 2개의 소세포 폐암들 중 2개에서, 1/3 흑색종, 1/3 유방암, 1/4 비-소세포 폐암(non small cell lung cancers) 및 1/2 전립선암에서 관찰되었다.
토의 및 결론
본 연구에서, 세포증식 억제제는 종양 줄기 세포들이 50 ㎛를 초과하는 지름을 갖는 집락들로 생체외 성장을 억제시키는 능력으로 인하여 특징되었다.
일반적으로, 상기 화합물은 이러한 종양들에서 집락 형성의 농도-의존성 억제로부터 명백한 바와 같이, 다양한 종양들에서 활성을 보였다. 개별 종양들에 대한 선택도는 양호하게 표명되었다. 가장 민감한 종양 모델들에서 IC70 수치들은 평균 IC70 수치와 비교하여 100 배 더 낮았다.
실시예 2.무종양(tumor-free) 누드 생쥐에서 세포증식 억제 조성물의 내약성(tolerability) 평가
세포증식 억제 조성물(세포증식 억제제)의 내약성은 2 주 동안 100 ㎕/생쥐로 매일 2회씩 근육내 투여한 이후에 숫컷 NMRI nu/nu 생쥐들에서 조사되었다. 사망률 및 체중 변화는 기록되고 0.9% NaCl 용액을 받은 운반체 대조 생쥐에 대하여 얻은 해당 자료와 비교되었다. 그룹 크기는 세포증식 억제제 처리 생쥐 4 마리 및 운반체 대조 생쥐 3 마리였다. 2 주후 생쥐들은 부검되었으며 혈액 세포 계수 측정이 있었다.
세포증식 억제제는 매우 양호하게 내약성이 있었다. 사망한 생쥐는 없었으며 최대 중간 체중 손실은 14일째 되는 날에 1.7%로 기록되었다. 이 지점에서 운반체 대조 생쥐들의 중간 상대 체중은 6% 만큼 증가하였다. 부검 및 혈액 세포 분석으로는 총 비정상을 밝혀내지 않았다.
결론적으로, 100 ㎕/생쥐로 매일 2 회 세포증식 억제제를 근육내로 주어서는 심각한 부작용이 예상되지 않는다.
연구 목적은 100 ㎕/생쥐로 매일 2 회 근육내 투여한 이후에 무종양 NMRI nu/nu 생쥐들에서 세포증식 억제제의 내약성을 분석하는데 있었다. 본 연구는 하기 사항을 포함하였다: 사망률 및 체중 감소로 측정된 내약성의 평가; 종료(termination)시의 부검; 및 투여 기간 말미에 혈액 세포들의 분석.
동물 정보
특이적인 정보
생쥐 균주: NMRI nu/nu
생쥐 총 숫자
무작위 숫컷 7 마리
무작위시 체중 범위 26.6 내지 32.8 g
무작위시 대략적인 연령: 4 내지 8 주
동물 건강
모든 실험은 독일 동물 건강 및 복지법령(Tierschutzgesetz)의 지침에 따라 수행되었다.
동물 건강은 무작위화 이전에 검사되어 양호한 건강의 동물들만이 시험 절차에 들어가도록 선택되게 하였다.
실험: 동물들의 그룹화 및 무작위화
본 연구는 세포증식 억제제를 받는 시험군 및 운반체 대조군을 포함하는 1 실험으로 구성되었다. 그룹 크기는 생쥐 4 마리(시험군) 또는 3 마리(운반체 대조군)이었다. 생쥐들은 15 일 연속으로 투여되었으며 최종 투약 투여후 1 일에 살처분되었다. 관찰 기간 동안, 생쥐들은 사망률 및 임상 징후에 대하여 모니터링되었으며 매주 2 회 체중을 측정하였다. 종료시에 생쥐들은 부검되었으며 혈액 표본(혈액 세포 분석용) 및 기관 표본(고정용)이 채집되었다. 혈액 세포 분석은 Vetmedlab에서 수행되었다. 혈액 세포 분석은 29 주에 수행되었다. 무작위화 자료에 대한 개요는 하기 표 3에 주어져 있다. 무작위화 날짜는 0일로 지정되었다. 0 일은 또한 투여의 첫 날이었다.
동물 확인
동물들은 이어 클립을 사용하여 무작위로 숫자가 부여되었다. 실험 초기에 각각의 우리에는 기록 카드로 라벨링되었는데, 이는 실험 횟수, 무작위화 일자, 생쥐 균주, 성별 및 개별 생쥐 숫자를 나타내는 것이다. 무작위화 그룹 신원확인 후에, 시험 화합물, 1회 투여량, 일정 및 투여 경로가 첨가되었다.
하우징 조건
관리
동물들은 테크니플라스트(Tecniplast) R 개별 통풍 우리들에 수용되었다. 그룹 크기에 따라 동물들은 마크로론M(MacrolonM) 유형 III 우리(최대 8 생쥐/우리) 또는 유형 II 장 우리(최대 5 생쥐/우리) 중 어느 하나에 수용되었다. 상기 우리들은 사용하기 전에 121℃에서 멸균되었으며 주당 2 회 교체되었다. 우리 안의 온도는 25±1℃에서 유지되었으며 상대 습도는 60±10%로 유지되었다. 동물들은 자연 일광 주기하에 관리되었다.
사료 및 물 공급
동물들에게 Altromin Extrudat 1439 래트/생쥐 사료가 공급되었다. 상기 사료는 Altromin GmbH(Lage, 독일)로부터 구입하였다.
물은 121℃에서 30 분 동안 멸균되었다. 멸균 이후에 0.9 g/ℓ의 소르브산칼륨이 첨가되었으며, pH는 1N HCl을 사용하여 2로 조절되었다. 물 소비는 매일 시각적으로 모니터링되었으며, 병들은 주당 2 회 교체되었다. 음식과 물은 자유롭게 공급되었다.
베딩( Bedding )
Rettenmaier & Soehne Faserstonffwerke(Ellwangen-Holzmuehle, 독일)이 생산한 먼지가 제거된 동물 베딩 Lignocel FS 14는 ssniff Sperzialdiaeten GmbH(Soest, 독일)로부터 구입하였다. 상기 베딩은 매주 2회 갱신되었다.
생산자는 생물학적/진균 오염 및 인산염 에스테르류, 비소, 카드뮴, 납 및 수은 함량에 대하여 3 개월마다 상기 먼지 제거 베딩을 분석한다. 이와 같은 분석은 독일 Kiel주 농무부 농업 분석 및 조사 연구소(Agriculture Analyses and Research Institute)에서 수행된다. 품질 증명서는 Rettenmaier & Soehne Faserstonffwerke(Ellwangen-Holzmuehle, 독일)에 기탁된다.
처리 절차
투여 경로
모든 처치는 근육내로 주어졌다.
약물 복용량 및 치료 계획
0.12% 포름알데히드 농도의 세포증식 억제제 및 운반체가 100 ㎕/생쥐로 매일 2 회씩 주어졌다. 월요일부터 금요일까지 매일 2 회 용량 사이의 시간 간격은 약 6 시간이었다. 토요일과 일요일에, 이 시간 간격은 더 단축되었다. 매일 2 회 용량 중 한 번은 오른쪽 옆구리에 주사되고 다른 한 번은 왼쪽 옆구리에 주사되었다.
관찰
사망률
사망률 점검은 매일 수행되었다.
체중
생쥐들은 매주 2 회 체중을 측정하였다. 개별 생쥐의 상대 체중은 X 일의 개별 체중을 0 일의 개별 체중으로 나눈 후 100%를 곱하여 계산되었다.
Figure pct00003
대상 일자에 생존한 생쥐들의 체중만 고려하여 그룹 중간 상대 체중도 계산되었다.
종료 절차, 부검 및 혈액 표본 채집
15 일, 즉, 최종 투약 후 1 일에, 혈액은 설하 출혈에 의하여 EDTA 튜브들로 채집되었다. 또한, 현미경 슬라이드상에 혈액 한 방울을 뽑아내어 생쥐 한 마리당 2 개의 혈액 도말들이 제조되었다.
이후, 생쥐들은 경추 탈골에 의하여 살처분되고 표준 프로토콜들에 따라 부검되었다. 기간들은 10% 완충 포르말린에서 24 시간 미만 동안 채집되어 70% 에탄올로 옮겨지고 저장되었다. 분석용으로, 혈액 및 혈액 포말이 동일자에 주변 온도(<20℃)에서 (독일) D-71636 Ludwigsburg, Moericke-strasse 28/3, Vet Med Labor GmbH로 선적되었다. 이후 혈액 세포 계수는 하루 뒤 수행되었다.
결과 및 토의
사망률 및 체중 변화
결과들은 표 4 및 도 3에 요약되어 있다.
세포증식 억제제로 처리는 매우 양호하게 내약되었다. 모든 세포증식 억제제-처리 생쥐들은 모든 운반체 대조 생쥐들과 같이 생존하였다. 최대 중간 체중 손실은 최소한이었다(14 일에 기록된 1.7%). 비교를 위해, 운반체 대조군에 대하여 관찰된 최종 중간 체중 손실은 0.7%(3 일)이었다. 14 일, 즉, 2-주-투약 기간의 말미에 세포증식 억제제-처리 생쥐들 4 마리 중 1 마리는 체중이 증가한 반면에(생쥐# 6946, 체중 증가 약 9.5%) 나머지 3 마리는 그들 초기 체중의 1 내지 7.5%를 잃었다. 비교를 위해, 상기 지점에서 3 마리의 운반체 대조 생쥐들은 그들 초기 체중의 2.5 내지 7.5%를 잃었다. 소 그룹 크기로 인하여, 체중 변화에서 이러한 차이들은 통계학적으로 현저한 것은 아니다(p.0.05, Mann-Whiteny-Wilcoxon에 의한 2면 U-rank 시험). 또한, 세포증식 억제제를 2 주 동안 근육내로 매일 2 회 투약한 이후에, 주사 부위에 염증이 진행되지 않았다는 것을 유의하여야 한다.
부검 및 혈액 세포 분석
결과들은 표 4 및 5에 요약되어 있다. 2 주 동안 매일 2 회 세포증식 억제제 처리를 한 이후 종료시에 모든 주요 기관들을 거시적으로 검사한 결과 세포증식 억제제-처리한 4 마리 중 3 마리가 비만으로 등급되지만 운반체 대조 생쥐들 3 마리 중 어느 한 마리도 비만으로 등급되지 않았다는 것을 제외하고는 어떠한 일관된 비정상도 드러나지 않았다. 마찬가지로, 혈액 세포 분석 이후 전체 비정상도 검출되지 않았다. 소량의 분석 표본들로 인하여, 단편 호중구 숫자가 세포증식 억제제-유도 가능한 증가 및 림프구 숫자의 가능한 감소는 독립된 실험에서 확인될 필요가 있다. 이 지점에서, 가용한 혈액 세포 계수로 인하여 세포증식 억제제는 처리된 생쥐의 면역 상태에 명백한 영향을 갖지 않는다는 것을 암시한다.
결론
매일 2 회씩 생쥐 한 마리당 100 ㎕으로 근육내로 주어진 세포성장 억제제는 매우 양호하게 내약되었다. 이 용량 수준에서 주어진 세포성장 억제제는 부작용이 예상되지 않는다.
실시예 3 - 인간 종양 세포주에서 세포성장 억제 화합물(CC)의 항종양 활성의 평가
CC의 항종양 활성은 단일층 증식 및 세포독성 분석법에서 독점 세포 패널의 4 개 인간 종양 세포주들(LXF 529L, MAXF 401NL, LXFA 289L, OVXF 899L)을 이용하여 측정되었다.
표 6에 제시된 바와 같이, 유방암 세포주 MAXF 401NL은 가장 민감한 세포주 인것으로 밝혀졌는데, 0.127% (v/v)의 IC50 수치를 나타내었다.
2번째 단계에서, MAXF 401NL 세포들은 3 일 동안 0.3% CC(세포독성 농도가 더 강함) 및 0.1% CC(독성미만 농도)로 연속적으로 처리되었다. 처리 이후에, 세포들은 PBS로 2 회 세척되었으며 24 웰 세포 배양 플레이트들(CC 없음)에서 71,000 세포/웰의 세포 밀도로 살포되었다. 세포들은 매일 계수되어 CC로 예비 처리한 것이 세포주 성장률에 미치는 영향을 조사하였다(성장 속도론의 1차 사이클). 예비처리된 세포들이 병렬적으로 표준 세포 배양 조건하에서 계대되고 1 주일 후에 성장 속도가 제 2 사이클에서 측정되었다.
도 5에서 명백한 바와 같이, CC로 0.1% 예비 처리하면 세포주 MAXF 401NL의 성장률이 약간 감소한다. 4 일후에, 미처리군의 활물 세포들의 수는 71,000에서 최대 369,500 세포로 증가하였고, 0.1% 예비 처리군에서는 71,000에서 최대 277,000(25% 감소) 세포로 증가하였다. 0.3% 예비 처리군에서 활물 세포들의 뚜렷한 감소가 관찰되었다. 그러나, 세포 대부분이 살포 이후에 플레이트 바닥에 부착하지 않았는데, 아마도 0.3% CC로 이전에 처리한 이후 손상이 증가한 이유 때문일 것이다. 또한, 세포들이 더이상 플레이트 바닥에 부착되지 않기 때문에 본 그룹의 계대는 불가능하다. 따라서, 상기 0.3% CC 그룹은 성장 속도론의 2차 사이클에 대하여 가용하지 않다. 세포 계수의 제 1 사이클과 유사하게, 제 2 사이클에서 4 일 이후에 세포 성장의 30% 감소를 보였다(미처리 대조군에서 264,500 세포 대 0.1% 처리군에서 186,000 세포).
결론적으로, CC는 0.127%(v/v) 내지 0.657%(v/v)에 이르는 범위의 IC50 수치들로 시험된 바와 같이 4 개의 인간 종양 세포주에서 농도-의존성 활성을 보였다. 유방암 세포주 MAXF 401NL을 조사하면 0.1% CC로 예비 처리한 이후에 세포 성장이 조금 감소하였다는 것을 나타내는 것이다.
상기 세포성장 억제 화합물로 예비 처리된 MAXF 401NL 세포에 관한 시험은 성장률이 약간 감소됨을 보여준다: 미처리 대조군과 비교하여 제 1 계대에서 25% 감소 및 제 2 계대에서 30% 감소. 이는 상기 세포증식 억제 화합물에 의하여 최초로 유도된 암세포에서 신진대사 변화의 증거이자 상기 세포들의 정상 세포 조건(비-종양유전성)으로 명백한 변환이다.
따라서, 상기 토의된 바와 같이, 세포증식 억제 조성물은 가능하다면 혐기성에서 호기성으로 포도당 산화/분해 균형의 운동을 통한 신진대사 변화에 의하여 암세포를 비-암/정상 세포로 변환시킨다.
본 발명의 바람직한 실시예가 상술된 반면에, 다양한 변형이 본 명세서 내에서 이루어질 수 있으며, 첨부한 청구의 범위들은 본 발명의 사상 및 범위 내에 속할 수 있는 모든 변형들을 포함하는 의도라는 것을 인식하고 이해할 것이다.
하기 표 1은 집락형성 분석법에서 검사된 인간 종양 이종이식체들(xenografts)에 관한 것이다:

종양 유형
종양 번호
조직학(Histology)		 배양 시간[일]a 집락 수a 5-FU 대조 T/C [%]b)
방광 BXF 1218 전이 세포 암종 6 653 2 +++
결장 CXF 1103
CXF 280		 아데노 암종, pd
암종, ud		 20
19		 280
458		 10 +++
21 ++
위장 GXF 1172 반지세포암종, pd 11 598 15 ++
두경부(Head & ncek) HNXF 536 편평 상피세포 암종, wd 20 229 9 +++
간 LIXF 575 간세포 암종 20 256 4 +++
폐, NSC LXFA 289
LXFA 526
LXFL 1647
LXFL 529		 아데노 암종, md
아데노 암종, pd
대세포 폐 암종
대세포 폐 암종, ud		 18
9
7
15		 326
860
604
456		 12 ++
2 +++
5 +++
0 +++
폐, SC LXFS 615
LXFS 650		 소세포 폐 암종
소세포 폐 암종, md		 19
11		 307
334		 14 ++
0 +++
유방 MAXF 1322
MAXF 1384
MAXF 401		 pap. 아데노 암종, pd
아데노 암종, pd
pap. 아데노 암종, wd		 13
20
11		 323
448
499		 0 +++
4 +++
4 +++
흑색종 MEXF 1539
MEXF 514
MEXF 989		 흑색종
멜라노틱 흑색종(melanotic melanoma)
아멜라노틱 흑색종(amelanotic melanoma)		 14
18
18		 645
573
591		 0 +++
4 +++
0 +++
난소 OVXF 550
OVXF 899		 암종
pap. 장액성 아데노 암종(serous adeno carcinoma), md		 20
18		 123
596		 33 +
31 +
췌장 PAXF 736 아데노 암종, pd 18 351 5 +++
전립선 PRXF DU145
PRXF MRIH1579		 아데노 암종, ud
아데노 암종		 13
14		 806
495		 1 +++
7 +++
흉막 중피종 PXF 1118 2상 흉막 중피종 20 387 2 +++
신장 RXF 631
RXF 944LX		 부신모양 아데노 암종, wd
부신모양 암종, 청정 세포		 8
7		 166
650		 4 +++
1 +++
육종 SXF 627 다형태 횡문근육종 17 779 2 +++
a) 각 실험의 평균값.
b) 1.0 ㎎/㎖ - (T/C > 50), + (30 ≤ T/C ≤ 50), ++ (10 < T/C < 30), +++ (T/C ≤ 10).의 농도에서 5-FU.
하기 표 2는 세포성장 억제제에 대한 생체외(in vitro) 반응 속도에 관한 것이다.
Figure pct00004
AHS 조혈 줄기 세포; 동물 종양에서; BXF 방광암 이종이식체;
CEXF 경부; CNXF 중추 신경계
CXF 결장; GXF 위장; HNXF 두경부; LEXF 백혈병; LXF 폐 A 아데노, L 대세포, E 표피모양, S 소세포
LYXF 림프종; MAXF 유방; MEXF 흑색종; OVXF 난소; PAXF 췌장; PRXF 전립선; PXF 흉막 중피종; RXF 신장
SXF 육종; TXF 고환; UXF 자궁체; XF 기타 -, (T/C > 50); +, (30 <= T/C <= 50); ++, (10 < T/C < 30); +++, (T/C <= 10); s, 단일 플레이트 결과
B 2/ 평가가능한 실험들.
하기 표 3은 NMRI nu/nu 생쥐들에서의 근육내 투여된 세포성장 억제제의 효과에 관한 것이다:
Figure pct00005
n. r. = 적절치 않음(체중 손실이 관찰되지 않음)
1, 총 생쥐 수에 대한 죽은 생쥐의 수(생쥐가 죽은 날에)
2, 최소 중간 체중이 기록된 날.
하기 표 4는 부검 자료에 관한 것이다.
운반체 대조군
생쥐 # #8740 #7775 #8490
일반 조건 양호 양호 양호
흉부 심장 비정상 없음 종격에서 심장의 기저 위 심부-적색 바디들과 심장/폐 복합체(Heart/lung complex with deep-red bodies above base of heart in mediastinum) 비정상 없음
폐 비정상 없음 비정상 없음
흉막 비정상 없음 비정상 없음
복부 장(intestine) 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
간 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
비장 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
신장 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
고환 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
복막 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
기타 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
세포증식 억제제-처리군
생쥐 # #6946 #6957 #6959 #6960
일반 조건 양호 양호 양호 양호
흉부 심장 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
폐 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
흉막 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
복부 장 비정상 없음 소장 공허(small
intestine empty)		 비정상 없음 비정상 없음
간 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
비장 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음 약간 확장됨
(marginally enlarged)
신장 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
고환 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
복막 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음 비정상 없음
기타 비정상 없음 지방질(adipose) 지방질 지방질
하기 표 5는 혈액 세포 분석(대 혈액 계수)에 관한 것이다:
Figure pct00006
절대 세포수들은 혈액 세포 계수기를 사용하여 측정되었다.
백분율들은 염색된 혈액 도말들의 현미경적 평가에 의하여 측정되었다.
x: 절대수들은 혈액 응고로 인하여 측정될 수 없었다.
#8490: 3 개의 대 비정형 세포들, 대부분이 대형 호염기성 혈장 경계에 의하여 에둘러진 원형 중심핵.
하기 표 6은 4 개의 인간 종양 세포주들에 대한 CC의 생체외 활성(IC50 수치들)에 관한 것이다:
Figure pct00007
IC50 수치들은 분석 소프트웨어를 이용한 비선형 회귀법에 따라 계산되었다.
GraphPad Prism
Figure pct00008
, 윈도우용 Prism 5, 5.01 버전(GraphPad Software 사, 캘리포니아)
*최상 및 바닥(bot)는 T/C(%)로 주어진 평탄역으로서, 최대 반응(최상) 또는 억제의 최대 수준(바닥)을 반영한다
본 발명의 모든 기본적인 특징들과 특성들이 그 특정 실시예에 의하여 본 명세서에 기술된 반면에, 다양한 변형, 다양한 변동 및 치환은 선행 개시물에 의도되어 있으며 일부 경우에, 본 발명의 일부 특성들은 기술된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 해당 기타 특성들을 이용하지 않고 채용될 것이다. 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 통상의 기술자에 의하여 상기 치환, 변형 및 변동이 이뤄질 수 있음을 알아야 할 것이다. 따라서, 그러한 모든 변형 및 변동은 하기 청구의 범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 포함된다.

Claims (22)

  1. 물에 녹인 약학적으로 허용가능한 염의 용액에 현탁된 알데히드를 함유하는 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 알데히드는 포름알데히드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 염은 염화나트륨인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 포름알데히드는 0.00004% 내지 1.1%(v/v)의 농도로 용액에 현탁된 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 포름알데히드는 0.00012% 내지 0.12%(v/v)의 농도로 용액에 현탁된 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 포름알데히드는 0.00004% 내지 0.069%(v/v)의 농도로 용액에 현탁된 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 염화나트륨은 0.9%의 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 3 항에 있어서,
    상기 염화나트륨은 0.1% 및 2.0%의 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 물에 녹인 약학적으로 허용가능한 염의 용액에 알데히드를 현탁시키는 단계를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 알데히드는 포름알데히드인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 염은 염화나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 포름알데히드는 0.00004% 내지 1.1%의 농도로 용액에 현탁된 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 염화나트륨은 0.9%인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 암 또는 암적 성장의 치료용인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 물에 녹인 약학적으로 허용가능한 염의 용액에 알데히드를 함유하는 조성물을 암 또는 암적 성장 치료용으로 사용하는 용도.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 알데히드는 포름알데히드인 것을 특징으로 하는 용도.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 염은 염화나트륨인 것을 특징으로 하는 용도.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 포름알데히드는 0.00004% 내지 1.1%(v/v)의 농도로 용액에 현탁된 것을 특징으로 하는 용도.
  19. 제 16 항에 있어서,
    상기 포름알데히드는 0.00012% 내지 0.12%(v/v)의 농도로 용액에 현탁된 것을 특징으로 하는 용도.
  20. 제 16 항에 있어서,
    상기 포름알데히드는 0.00004% 내지 0.069%(v/v)의 농도로 용액에 현탁된 것을 특징으로 하는 용도.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 염화나트륨은 0.9%의 농도인 것을 특징으로 하는 용도.
  22. 제 17 항에 있어서,
    상기 염화나트륨은 0.1% 및 2.0%의 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
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