CN101925351B

CN101925351B - 细胞抑制组合物

Info

Publication number: CN101925351B
Application number: CN2009801031095A
Authority: CN
Inventors: 谢尔盖·季什金; 弗拉季斯拉夫·尼古拉耶维奇·拉斯卡维耶
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-02-09
Filing date: 2009-02-09
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2029-02-09
Also published as: MX2010008639A; CA2710716A1; IL207312A0; WO2010032093A3; ZA201005416B; CN101925351A; SG188130A1; JP2011524334A; EP2240169A4; KR20100128294A; WO2010032093A2; EP2240169A2; US20090203800A1; AU2009294344A1; BRPI0905875A2

Abstract

显示了包含在药理盐溶液中有效量的醛的细胞抑制组合物有效地抑制大量癌细胞系的生长。

Description

细胞抑制组合物

发明领域

本申请要求2008年2月9日提交的并且通过引用整体并入本文的美国临时专利申请61/065,172的权益。

所公开的装置和方法涉及抑制癌细胞生长。更具体地，公开了包含在药物盐溶液中的有效量的醛的细胞抑制组合物，据显示该细胞抑制组合物有效地抑制大量癌细胞系的生长。

发明背景

先前醛已被用于制备用于显微镜检查的癌组织样品并且在一些情况下作为联合治疗(co-treatment)。

例如，PCT申请WO 02/28345教导了在施用特定种类的化疗剂时形成DNA加合物。阿霉素是给出的一个实例，但是“种类”在别处一般是指“蒽环类或蒽二酮类”并且这些加合物的形成与细胞毒性有关且需要醛的存在。在这个申请中，他们描述了与醛释放剂共同施用化疗剂以便通过释放额外的醛来增加体内化疗剂的效价。在一些实施方式中，醛是甲醛。

美国专利6,677,309教导了蒽环类和醛释放剂的轭合物。

PCT申请WO 2005/120577教导了包含不为精神药物的第一部分和能够释放甲醛分子的第二部分的轭合物。

PCT申请WO 2005/034856教导了具有与被“化学触发物”“保护”的醛键合的治疗剂的轭合物，该轭合物还可以包含寻靶基团。换言之，化学触发物保持轭合物为前体药物形式直到轭合物到达所需位置。在一些情况下，寻靶分子用于指导轭合物至所需的治疗位置。

发明概述

根据本发明的第一个方面，提供了包含以下物质的药物组合物：悬浮在药学可接受的盐的水溶液中的醛。也即是说，提供了包含以下物质的药物组合物：悬浮在药学可接受的盐的水溶液中的醛。

附图简述

图1是抑制大细胞肺癌LXFL 529中的集落形成的图片。

图2描绘在较高的放大倍数下的图1的集落形成。

图3显示细胞抑制剂的均值-图(Mean-graph)分析。

图4描绘细胞抑制剂在以100μl/小鼠每天两次肌内给药后对小鼠体重的影响。A：随时间改变的组中值相对体重。B：第14天个体的相对体重。

图5描绘CC对4种人肿瘤细胞系的浓度效应曲线。

图6描绘用CC处理3天后(第1个周期)细胞系MAXF 401 NL的体外生长。

图7描绘用CC处理3天后(第2个周期)细胞系MAXF 401 NL的体外生长。

优选实施方案的描述

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然相似于或者等同于本文描述的那些的任何方法和材料可以在本发明的实践或试验中使用，现在对优选的方法和材料予以描述。下面所提到的所有公开物均通过引用并入本文。

本文所述的是包含悬浮在含水盐溶液中的醛的抗癌组合物或细胞抑制组合物。为方便起见，在一些情况下，所述组合物被称为“细胞抑制剂”。

如本文所用的“醛”是指含有末端羰基或醛基的任何有机化合物。在优选的实施方式中，醛为天然的醛。在又一些优选实施方式中，天然的醛为甲醛。

在本发明的一个实施方式中，细胞抑制组合物通过提供如下所述的药学可接受的盐溶液而制备。然后将甲醛以0.00004％至1.1％之间的浓度悬浮在溶液中，可选择地，悬浮在药理盐水溶液中的甲醛的终浓度可以在0.00012％至0.12％之间。如本文所讨论的，根据这种方法制备的细胞抑制组合物可以用于治疗癌症。

组合物中的甲醛的浓度可以在0.00004％至1.1％之间。可选择地，该浓度可以在0.00012％至0.12％之间。组合物中甲醛的最大浓度为1.1％。本发明人注意到高于此比率，毒性会引起内脏器官抑制，从而导致组合物具有很小的效果或没有效果。例如，较高的甲醛水平的注射可能在注射部位导致溃疡。如上面所讨论的，范围的最低点为0.00004％并且相信低于这个点没有效果。

在优选的实施方式中，甲醛的来源是福尔马林，例如医用级别的福尔马林，如包含40％甲醛质量的40％福尔马林。本领域的技术人员理解其他药学可接受的甲醛来源可用于本发明中。

优选地，盐溶液为药学可接受的盐溶液或生理盐溶液，例如，0.1％-2.0％或0.1％-1.9％或0.1％-1.8％或0.1-1.7％或0.1％-1.6％或0.1％-1.5％或0.1％-1.4％或0.1％-1.3％或0.1％-1.2％或0.1％-1.1％或0.1％-1.0％或0.1％-0.9％或0.2％-2.0％或0.3％-2.0％或0.4％-2.0％或0.5％-2.0％或0.6％-2.0％或0.7％-2.0％或0.8％-2.0％或0.9％-2.0％或0.5-1.5％或0.5％-1.3％或0.6-1.4％或0.6％-1.2％或0.7％-1.3％或0.7％-1.1％或0.8％-1.2％或0.8％-1.0％或0.9％的氯化钠溶液或林格溶液或盐水溶液。优选地，生理盐溶液在其要施用的个体的生理pH或接近该生理pH值，也就是说，药学可接受的盐或生理盐溶液的pH在7.2与7.6之间。

在优选的实施方式中，提供了包含悬浮在生理盐溶液中的0.00004％至1.1％甲醛的细胞抑制组合物。在优选的实施方式中，甲醛在生理盐溶液中的浓度为0.00012％至0.12％(v/v)之间。在一些实施方式中，生理盐溶液为NaCl溶液、盐水溶液或林格溶液。在一些实施方式中，盐溶液为用于注射的0.1-2.0％氯化钠或0.9％氯化钠。

在本发明的一个实施方式中，细胞抑制组合物是如下制备的：提供在水中0.9％的氯化钠溶液。然后将甲醛以0.00004％至1.1％之间的浓度悬浮在溶液中，可选择地，悬浮在药理盐水溶液中的甲醛的终浓度可以在0.00012％至0.12％之间。如本文所讨论的，细胞抑制组合物可用于治疗癌症。

如下面所讨论的，相信细胞抑制组合物有效地将进行厌氧呼吸的细胞“转化”为进行需氧呼吸，这继而降低或抑制癌细胞的增殖和生长速率，但是预计对已经进行需氧呼吸的细胞具有很小的影响或没有影响。

尽管不希望受具体理论的束缚，本发明人相信甲醛在与药学可接受的含水盐溶液(例如但绝不限于0.9％的NaCl水溶液)混合时进行了转变，该转变使得组合物进入身体中细胞结构内的代谢中从而在肿瘤内释放结合的甲醛并引起肿瘤生长停止，然后减少肿瘤本身，即，减少肿瘤自身的大小。

注意到Otto Warburg先前发现癌细胞通常使用厌氧葡萄糖呼吸，该厌氧葡萄糖呼吸包括形成作为营养物质的乳酸。根据Warburg，细胞“更新”为使用厌氧呼吸的癌细胞会导致细胞自主的存在。细胞的更新引起组织中的癌前变化，例如但绝不限于酸性变化、能量消耗变化、呼吸变化等。因此，正常细胞或癌前细胞转化为癌细胞的一个阶段是细胞专用于厌氧葡萄糖呼吸。

细胞中的生物呼吸分两个阶段进行。第一阶段是厌氧呼吸(无氧)并且第二阶段是需氧呼吸(有氧)。糖酵解(呼吸的厌氧阶段)结束时丙酮酸被转化为乳酸。呼吸的厌氧阶段一个葡萄糖分子只提供两个ATP分子。生物呼吸的第二阶段(有氧)的结果是一个葡萄糖分子合成38个ATP分子。因此，呼吸氧的生物体比厌氧生物利用碳水化合物的能量的效率高19倍。

作为如下的肿瘤病症治疗的现有方法的代替，本发明人相信治疗肿瘤病症的另一种方法可以是将瘤细胞(oncocell)或癌细胞的代谢由厌氧呼吸改变为需氧呼吸：例如增加免疫性、生物体的氧合、过热疗法、阻断肿瘤血管、传统疗法、放射疗法、产生专用蛋白、阻断致癌基因、使用纳米技术以及类似方法。

由于这点，本发明人使用了甲醛，一种在所有的器官、组织和液体介质中最小量含有的天然代谢物。甲醛通常作为代谢过程的结果在细胞内产生，并且其容易被酶系统灭活(L.V.Miretskaya，P.Ya.Shvartsman.Cytology.-1982.-第XXIV.卷-第9期-第1059页)。具体地，甲醛刺激己酮糖磷酸合酶合成，己酮糖磷酸合酶是核酮糖一磷酸循环的关键酶。此外，甲醛的一碳基团以活性形式参与多种化合物的生物合成。甲醛还具有免疫调节和抗病毒性质。

由于这点，如本文所讨论的，本发明人研究了含甲醛的药剂和/或组合物对细胞中代谢过程的影响。

例如，如本文所述的细胞抑制组合物以有效剂量注射到兔中显著增加动物生物体中与氨基酸代谢相关的酶活性，例如天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶。这转而导致蛋白合成中丙氨酸和天冬酰胺的利用降低，这由受试者血清中蛋白水平的降低来证明。

例如，丙氨酸转氨酶活性的增加导致丙酮酸水平增加，丙酮酸在线粒体中通过氧化脱羧产生乙酰辅酶A。大量的乙酰辅酶A在二碳酸和三碳酸循环中“耗尽”产生大量的氢化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸，它们在线粒体中用于氧化相关性ATP合成。

而且，肌酸磷酸激酶活性的增加指示了细胞能量供应的增加。同时，出现乳酸脱氢酶活性的降低，这指示需氧呼吸过程比厌氧呼吸过程占优势。这意味着，在糖酵解中形成的大部分丙酮酸进行氧化脱羧并输出大量的乙酰辅酶A，乙酰辅酶A用于细胞中有机元素氧化的有氧阶段。过量的乙酰辅酶A用于合成多种脂类，尤其用于胆固醇合成，它可以受试者血液中总胆固醇水平的显著增加来检测。

因此，相信本文所述的细胞抑制组合物激活了细胞中的需氧呼吸，转而解释了其对多种肿瘤细胞系的细胞抑制作用。也就是说，如上面所讨论的，癌细胞通常进行厌氧呼吸，而正常细胞或非癌细胞进行需氧呼吸。然后，有效量的细胞抑制化合物的施用将这些细胞由厌氧呼吸转化为需氧呼吸。此外，如本文所讨论的，预计细胞抑制组合物对进行需氧呼吸的正常细胞具有很小的影响或没有影响。

可选择地，本发明人注意到甲醛易于与游离的赖氨酸和精氨酸氨基反应并且在此过程期间，羰基转变为氧基并且氨基转变为亚胺基。亚氨基氢和羟基氧以及羟基氢和亚氨基氮可以产生分子内氢键。同时，通过甲基甲醇胺中间体阶段产生亚胺(席夫碱)：

HCOH+NH₂-CH(R)-CO^-→H₂C(OH)-NH-CH(R)-CO^-→HCH＝N-CH(R)-CO^-+H₂O

其中NH₂-CH(R)-CO是蛋白分子的片段。

游离氨基的结合导致它们接受氢离子的能力受损。细胞内容物中游离氢离子的浓度略微增加，也就是说，pH向酸性方向改变。由于大多数糖酵解酶的最佳pH产生在碱性环境下，所以碳水化合物的需氧氧化比例增加。

此外，随后亚胺基的质子化产生了启动氢键的条件。作为赖氨酸氨基酸化学基团的一部分的氨基以基本相同的方式相互作用。以本发明人的观点，游离的精氨酸氨基与N末端蛋白氨基和基团赖氨酸氨基在其机能活性方面没有不同，并且具有同型反应。这种相互作用导致了蛋白分子构象的改变，并且由此改变了它们的物理/化学性质。为染色体的一部分的蛋白-组蛋白(Proteine-histone)作为核蛋白含有大量赖氨酸和精氨酸的二氨基一羧酸。甲醛加合的反应之后氢键的形成阻断了羧酸DNA基团与组蛋白的游离氨基之间的分子间范德瓦尔斯相互作用。结果，之前的转录区可能消失并出现新的转录区(形成基因的RNA拷贝)，这导致细胞蛋白的数量和品质改变。总之，有可能在不改变基因型的条件下实现表型突变。

如本文所用“有效量”是足以完成下列的一个或多个的细胞抑制组合物的量：与类似年龄和状态的未处理细胞群体或对照细胞群体或模拟处理的细胞群体相比，增加癌细胞群体如肿瘤中的需氧呼吸；与类似年龄和状态的未处理细胞群体或对照细胞群体或模拟处理的细胞群体相比，降低或抑制癌细胞群体如肿瘤的生长速率或增殖；与类似年龄和状态的未处理细胞群体或对照细胞群体或模拟处理的细胞群体相比，降低肿瘤体积生长速率；与类似年龄和状态的未处理细胞群体或对照细胞群体或模拟处理的细胞群体相比，导致较长时间的消退；并且与类似年龄和状态的未处理细胞群体或对照细胞群体或模拟处理的细胞群体相比，降低与癌症相关的一种或多种症状的严重程度。

如在下面所显示的实施例中所提到的，已显示本发明的细胞抑制组合物在体外测试中对于下列病症有效：大细胞肺癌、肾癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肺腺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌以及黑素瘤、胸膜间皮瘤(pleuramesothelioma)和肉瘤。因此并且如下文所讨论的，已显示本发明的细胞抑制组合物适合治疗广泛的癌症类型并且可用作特征为细胞群体厌氧呼吸生长的任何疾病或病患的治疗。

因此，本发明的细胞抑制组合物可用于治疗或预防需要此治疗的个体(即，被诊断患癌症、疑似患癌症或具有发展癌症的风险的个体)中的癌症或癌生长。如本文所讨论的，合适的癌症包括但绝不限于：大细胞肺癌、肾癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肺腺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌以及黑素瘤、胸膜间皮瘤和肉瘤。因此并且如下文所讨论的，已显示本发明的细胞抑制组合物适合治疗广泛的癌症类型并且可用作特征为细胞群体厌氧呼吸生长的任何疾病或病患的治疗。

现在将通过实施例的方式进一步说明本发明。然而，本发明并不必然受实施例的限制。

缩写

本文所用的缩写包括：体重减轻(BWL)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、二氧化碳(CO₂)、天(d)、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清(FCS)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、克(gm)、免疫组织化学(IHC)、达到T/C值＝100-X时的抑制浓度(IC_x)、肌内(im)、免疫调节化合物(本研究的测试化合物，即细胞抑制化合物)(CC)、Iscove改良的Dulbecco′s培养基(IMDM)、浸润的(inf.)、千克(kg)、升(L)、毫克(mg)、毫升(mL)、中度分化的(md)、毫克(mg)、微克(μg)、毫升(ml)、微升(μl)、微米(μm)、不可用(n.a)、未检测出(n.d.)、海军医学研究所(Naval Medical Research Institute，USA，NMRI)、非小细胞(NSC)、乳头状(pap)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、分化不良的(pd)、罗斯福公园纪念学会(Roosevelt Park Memorial Institute，RPMI)、相对于对照的测试值(T/C值)、单位(U)、未分化的(ud)、体积/体积(v/v)、分化良好的(wd)、没有(w/o)、体重/体积(w/v)。

实施例1

使用产克隆测定(clonogenic assay)在27个人肿瘤异种移植物中体外评估如上文所述的细胞抑制组合物的抗肿瘤功效。肿瘤测试组包括15种不同的人肿瘤类型的1至4个模型，所述人肿瘤类型为：膀胱癌、结肠癌、胃癌、头颈癌、肝癌、非小细胞肺癌(肺腺癌和大细胞肺癌)、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾癌以及黑素瘤、胸膜间皮瘤(pleuramesothelioma)和肉瘤。研究了介于0.001％至100.0％之间的6个浓度的细胞抑制组合物。抗肿瘤作用记录为相对于未处理对照的集落形成抑制(T/C值)。

在本文中也称为“细胞抑制剂”的细胞抑制组合物以浓度依赖性方式抑制肿瘤集落形成。测得平均IC70值为0.462％，测得平均IC50值为0.195％。上面的平均细胞抑制剂活性是针对以下肿瘤模型看到的：大细胞肺癌(LXFL 529)、小细胞肺癌(LXFS 615、LXFS 650)、乳腺癌(MAXF 401)、黑素瘤(MEXF 989)和前列腺癌(PRXF MRIH1579)。最敏感的肿瘤是小细胞肺癌LXFS 650和黑素瘤MEXF 989。这些肿瘤模型中的IC70值与平均IC70值相比低100多倍。

目的

在本研究中，在27个肿瘤异种移植物中研究了细胞抑制剂的体外抗癌活性。使用产克隆测定以研究可能的肿瘤类型选择性。

在产克隆测定(＝肿瘤集落测定，TCA)中，检测了在软琼脂上生长的肿瘤干细胞的集落形成抑制。肿瘤干细胞负责肿瘤的生长、转移和浸润潜能，它是由在裸小鼠中生长的人肿瘤异种移植物直接制备的。因此，产克隆测定比使用永生肿瘤细胞系的体外测定更好地反映了体内情况，并且发现其是用于抗癌药物的进一步体内评估的高度预测性测试。

媒介物和浓度

测试了6种浓度的细胞抑制剂。所测试的最高浓度为0.004％，如下文所示，该浓度是测试中媒介物的最大容许浓度，其被设置为100％细胞抑制剂。还使用补充有10％v/v盐水溶液的IMDM作为对照媒介物。

测试中所指示的相关浓度细胞抑制剂中的甲醛浓度

100％ 0.004％

10％ 0.0004％

1％ 0.00004％

0.1％ 4×10^-6

0.01％ 4×10^-7

0.001％ 4×10^-8

肿瘤模型

异种移植物的来源先前已有描述(Berger等人，1990，Ann.Oncol.1：333-341；Scholz等人，1990，Eur.J.Cancer 26：901-905；Fiebig等人，Eur.J.Cancer 40：802-820)。在共27个人肿瘤异种移植物中测试了细胞抑制剂。肿瘤测试组包括15种不同的人肿瘤类型的1至4个模型，所述人肿瘤类型为：膀胱癌、结肠癌、胃癌、头颈癌、肝癌、非小细胞肺癌(肺腺癌和大细胞肺癌)、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾癌以及黑素瘤、胸膜间皮瘤和肉瘤。

肿瘤-集落-测定

由人肿瘤异种移植物制备单细胞悬液

在无菌条件下将在胸腺发育不全的裸小鼠(NMRI nu/nu品系)中皮下连续传代生长的人实体瘤异种移植物取出，机械解聚，随后在37℃下与由下列组成的酶混合物一起在RPMI 1640-培养基(Life Technologies)中孵育45分钟：IV型胶原酶(41U/ml)(Sigma)、DNA酶I(125U/ml)(Roche)、III型透明质酸酶(100U/ml)(Sigma)和分散酶I1(1.0U/ml)(Roche)。将细胞通过200μm和50μm目大小的筛子，并用无菌PBS缓冲液洗涤两次。使用台盼兰排除法在Neubauer-血细胞计数器中测定活细胞百分比。

人肿瘤异种移植物细胞的培养方法

根据由Hamburger和Salmon介绍的改良的两层软琼脂测定以24孔形式进行产克隆测定。底层由下列组成：0.2ml/孔IMDM(Life Technologies)(补充有20％(v/v)胎牛血清(Sigma)、0.01％(w/v)庆大霉素(Life Technologies)和0.75％(w/v)琼脂)。将2×10⁴至4×10⁴个细胞添加到0.2ml补充有0.4％(w/v)琼脂的相同培养基中并将其涂覆24孔多孔皿中的底层上。通过在0.2ml培养基中连续暴露(药物覆盖)来施用测试化合物。每个皿包括6个未处理的对照孔和3次重复的6个浓度的药物处理组。在37℃和7.5％CO₂下加湿的气氛中孵育培养物6-18天并使用倒置显微镜密切监测集落生长。在此阶段中，体外肿瘤生长导致直径大于50μm的集落形成。在最大集落形成时，使用自动成像分析系统(OMNICON 3600，Biosys GmbH)进行计数。评估前24小时，用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基氯化四唑的无菌水溶液(1mg/ml，100μl/孔)(Sigma)对活的集落染色。

数据评估

如果满足下列的质量控制标准，则认为测定是完全可评估的：

-24孔多孔板的对照孔中集落平均数≥20个直径大于50μm的集落

-每个板的对照孔的变异系数≤50％

-阳性参考化合物5-氟尿嘧啶(5-FU，在1.0mg/ml的细胞毒性浓度)必须导致集落数减少至＜对照的30％

或者在第0天或第2天的初始板计数必须＜最终对照计数的20％。

药物作用由集落形成的百分比表示，通过比较处理孔中的平均集落数与未处理对照的平均集落数来获得(由测试/对照值，T/C值[％]表示的相对集落计数)：

IC₅₀值和IC₇₀值分别是抑制集落形成50％(T/C＝50％)和70％(T/C＝30％)所需的药物浓度，其通过绘制化合物浓度与相对集落计数的图来确定。平均IC₅₀值和IC₇₀值根据下式计算：

其中x为具体的肿瘤模型，并且n为所研究的肿瘤模型的总数。如果在所检测的剂量范围内不能测定出IC₅₀值或IC₇₀值(由于化合物活性过高或缺乏活性)，则使用最低浓度或最高的研究浓度来计算。

在均值图分析中，在单个肿瘤类型中获得的测试化合物的IC50值(IC70值)分布是相对于测试的所有肿瘤所获得的平均IC50值(IC70值)给出的(显示在图2中)。个体IC50值(IC70值)表达为在对数刻度轴上的条柱。左侧的条柱表明IC50值(IC70值)低于平均值(指示更敏感的肿瘤模型)，右侧的条柱表明较高的值(指明相当耐受的肿瘤模型)。因此，均值图分析代表了化合物抗增殖效力的指纹。

结果

在源自多种肿瘤类型的人实体瘤异种移植物的27种细胞悬浮液中检测细胞抑制剂抑制肿瘤干细胞生长为集落的能力。依据如表1中所描述的细胞类型，细胞制剂在未处理的对照孔中在6至20天内形成了123至860个集落。

未处理对照的数据结果在预计的范围内。用作生长抑制的阳性对照的5-氟尿嘧啶显示出良好的抗肿瘤活性。细胞抑制剂的体外测试结果总结在表2和图1中。表2显示了总体的体外应答率，即，细胞抑制剂在各测试浓度的生长抑制活性。将抗肿瘤活性定义为将集落形成抑制为＜未处理对照的30％。

观察到了肿瘤集落形成的浓度依赖性抑制作用。浓度-应答关系在0.1％至1.0％的范围内局部十分陡。细胞抑制剂在0.001％的浓度在27个肿瘤模型中的一个中(4％)实现了超过70％的集落形成抑制。0.01％和0.1％的细胞抑制剂在2/27(7％)个肿瘤中是活性的，1.0％的细胞抑制剂在23/27个肿瘤(85％)中是活性的，10.0％的细胞抑制剂在25/27个肿瘤(93％)中是活性的，并且100.0％的细胞抑制剂在27/27个肿瘤(100％)中是活性的(表3)。测得平均IC₅₀为0.195％，测得平均IC₇₀为0.462％(图2)。

细胞抑制剂的抗肿瘤选择性谱由均值图分析获得(图2)。在本研究中最敏感的肿瘤为小细胞肺癌LXFS 650(IC₇₀＜0.001％)和黑素瘤MEXF989(IC₇₀＝0.004％)。还观察到了细胞抑制剂抗下列细胞的上述平均活性：大细胞肺癌LXFL 529(IC₇₀＝0.162％)、小细胞肺癌LXFS 615(IC₇₀＝0.31％)、乳腺癌MAXF 401(IC₇₀＝0.243％)和前列腺癌PRXF MRIH1579(IC₇₀＝0.234％)(图1)。因此，在2/2的小细胞肺癌、1/3黑素瘤、1/3乳腺癌、1/4非小细胞肺癌和1/2前列腺癌中观察到了总体抗肿瘤功效。

讨论和结论

在本研究中，细胞抑制剂表征为其抑制肿瘤干细胞体外生长为直径大于50μm的集落的能力。

总体上，如由这些肿瘤中集落形成的浓度依赖性抑制所证明的，化合物在多种不同的肿瘤中显示出活性。个体肿瘤的选择性是非常明显的。在最敏感的肿瘤模型中IC₇₀值比平均IC₇₀值低100多倍。

实施例2细胞抑制组合物(细胞抑制剂)在无肿瘤的裸小鼠中的耐受性的评估

在每天两次以100μl/小鼠i.m.给药2周后，在雄性NMRI nu/nu小鼠中研究细胞抑制组合物(细胞抑制剂)的耐受性。记录死亡率和体重改变，并将其与获得的接受0.9％NaCl溶液的媒介物对照小鼠的相应数据比较。组的大小为4只细胞抑制剂处理的小鼠和3只媒介物对照小鼠。2周后，对小鼠进行尸体剖检并进行血细胞计数。

细胞抑制剂被很好地耐受。没有死亡率，并且在第14天记录的最大中值体重减轻为1.7％。此时媒介物对照小鼠的中值相对体重增加了6％。尸体剖检和血细胞分析未揭示任何较大的异常。

总之，以100μl/小鼠每天两次i.m.给予细胞抑制剂时预计没有严重的不利影响。

研究目的是分析细胞抑制剂在以100μl/小鼠每天两次im.给药后在无肿瘤的NMRI nu/nu小鼠中的耐受性。此研究包括：以死亡率和体重减轻测定耐受性的评估；终止时的尸体剖检；和在给药阶段末期的血细胞分析。

动物信息

具体信息

小鼠品系：NMRI nu/nu

小鼠总数

随机的7只雄性小鼠

随机化的体重范围 26.6-32.8g

随机化的大约年龄 4-6周

动物健康

所有实验都是根据德国动物卫生与福利法(Tierschutzgesetz)的指导进行的。

在随机化之前检查动物健康情况以确保仅选择健康状况良好的动物进入测试程序。

动物的实验、分组和随机化

此研究由一个实验构成，该实验包括接受细胞抑制剂的测试组和媒介物对照组。组大小为4只小鼠(测试组)或3只小鼠(媒介物对照组)。连续15天对小鼠给药并在最后剂量施用后一天将小鼠处死。在观察期间，监测小鼠的死亡率和临床病征并每周称重两次。结束时对小鼠进行尸体剖检并收集血样(用于血细胞分析)和器官样品(用于固定)。在Vetmedlab进行血细胞分析。在第29周进行血细胞分析。随机化数据的概括在下面的表3中给出。随机化的日子称为第0天。第0天也是给药的第一天。

动物识别

使用耳夹对动物任意编号。在实验开始时，每个笼子都用记录卡标记，指明实验编号、随机化日期、小鼠品系、性别和单个小鼠编号。随机化后，加上组身份、测试化合物、剂量、方案和施用途径。

圈养条件

管理

动物被圈养在Tecniplast R单个通风的笼中。根据组大小，将动物圈养在III型MacrolonM笼(最多8只小鼠/笼)或II型长笼(最多5只小鼠/笼)中。使用之前将笼在121℃灭菌，并每周更换两次。笼内温度保持在25±1℃并且相对湿度保持在60±10％。将动物保持在自然日光周期下。

饮食和水供应

给动物喂养Altromin Extrudat 1439大鼠/小鼠食物。该食物购自Altromin GmbH(Lage，Germany)。

水在121℃灭菌30分钟。灭菌后添加0.9g/l 山梨酸钾，用1N HCl将pH调节为2。每天视觉监测水消耗，每周更换两次瓶子。随意提供食物和水。

寝具

由Rettenmaier & Sóhne Faserstoffwerke(

Germany)制造的无尘动物寝具Lignocel FS 14购自ssniff Spezialdiaten GmbH(Soest，Germany)。每周更新两次寝具。

制造商每3个月分析一次无尘寝具的生物污染/真菌污染以及磷酸酯、砷、镉、铅和汞的含量。这些分析在德国基尔的农业部农业分析研究所(Agriculture Analyses and Research Institute)进行。质量证明存放在Rettenmaier & Sóhne Faserstoffwerke(

Germany)。

处理程序

施用途径

所有处理都i.m.给予。

药物剂量和处理方案

每天两次以100μL/小鼠给予浓度为0.12％甲醛的细胞抑制剂和媒介物。周一至周五，2个日剂量之间的时间间隔为约6h。在周六和周日，此时间间隔较短。2个日剂量的一个注射到右胁腹，另一个注射到左胁腹。

观察

死亡率

每日进行死亡率检查。

体重

每周两次称重小鼠。单个小鼠的相对体重通过第X天的个体体重(BW_x)除以第0天的个体体重(BW₀)乘以100％来计算。

还计算了组的中值相对体重，其只考虑在所讨论的日期活着的小鼠的体重。

终止程序、尸体剖检和血样收集

在第15天，即最后给药日后一天，通过舌下采血将血液收集到EDTA管中。此外，每只小鼠通过在显微载玻片上拉开血滴制备两个血涂片。

随后，通过颈脱位法处死小鼠并根据标准方案进行尸体剖检。器官收集在10％缓冲的福尔马林中＜24小时，然后转移并储存在70％乙醇中。为了分析，在同一天将血液和血涂片在环境温度下(＜20℃)运输至Vet Med Labor GmbH，Moericke-strasse 28/3，D-71636 Ludwigsburg(Germany)。然后在一天后进行血细胞计数。

结果与讨论

死亡率和体重改变

结果总结在表4和图3中。

用细胞抑制剂的处理得到了极好地耐受。所有经细胞抑制剂处理的小鼠都与媒介物对照小鼠一样存活下来。最大的中值体重减轻很小(在第14天记录为1.7％)。为了比较，观察到的媒介物对照的最大中值体重减轻为0.7％(第3天)。在第14天，即2周给药阶段的最后，4只细胞抑制剂处理的小鼠中的1只体重增加(小鼠编号6946，体重增加约9.5％)，而剩余3只小鼠则减少它们初始体重的1％至7.5％。为了比较，在此时3只媒介物对照小鼠得到初始体重的2.5％至7.5％的增加。由于组规模小，所以这些体重改变的差异是统计学上不显著的(p＞0.05，Mann-Whitney-Wilcoxon的双侧U级检验(two-sided U-rank test))。还应注意的是，在每日两次im给药细胞抑制剂两周后，在注射部位没有发展炎症。

尸体剖检和血细胞分析

结果总结在表4和表5中。在每日两次的细胞抑制剂处理2周后终止时肉眼检查所有的主要器官，没有显示任何一致的异常，除了4只细胞抑制剂处理的小鼠中3只被评估为是肥胖的，而媒介物对照小鼠没有被评估为是肥胖的。类似地，在血细胞分析后没有检测到较大的异常。由于所分析的样品数目少，所以需要在独立的实验中确定细胞抑制剂诱导的分叶核嗜中性粒细胞(segmented neutrophil)数目增加的可能性和淋巴细胞数目降低的可能性。在这一点，可用的血细胞计数表明细胞抑制剂对所处理小鼠的免疫状态没有显著影响。

结论

每日两次以100μl/小鼠i.m.给予细胞抑制剂得到了极好的耐受。预计在此剂量水平给予细胞抑制剂没有不利影响。

实施例3-细胞抑制化合物(CC)在人肿瘤细胞系中的抗肿瘤活性评估。

在单层增殖测定和毒性测定中使用专有的细胞系组(LXF 529L、MAXF 401NL、LXFA 289L、OVXF 899L)检测CC的抗肿瘤活性。

如表6中所显示的，发现乳腺癌细胞系MAXF 401 NL是最敏感的细胞系，其表现出0.127％(v/v)的IC50值。

在第二步中，用0.3％CC(更具细胞毒性的浓度)和0.1％CC(亚毒性浓度)连续处理MAXF 401 NL细胞3天。处理后，用PBS洗涤细胞两次，并将细胞以71,000个细胞/孔的细胞密度接种在24孔细胞培养板中(没有CC)。每天对细胞计数以考察用CC预处理对细胞系生长速率的影响(第一生长动力学周期)。同时，将预处理的细胞在标准细胞培养条件下传代，一周后在第二周期中测定生长速率。

如从图5明显可见，用0.1％CC预处理导致细胞系MAXF 401 NL生长速率略微降低。4天后，未处理组中的活细胞数由71,000增加至369,500个细胞，在0.1％预处理组活细胞数由71,000增加至277,000个细胞(降低25％)。在0.3％预处理组，发现了活细胞的明显降低。然而，大部分的细胞在接种后不附着到板底，推测是由于之前用0.3％CC处理后的严重损伤(advanced damage)所引起的。此外，传代这组细胞是不可能的，因为细胞不再附着到板底。因此，0.3％CC组不可用于第2生长动力学周期。有趣的是，与第1周期细胞计数类似，在第2周期中，在第4天后发现30％的细胞生长降低(未处理对照组中264,500个细胞vs 0.1％处理组中186,000个细胞)。

总之，CC在所测试的4种人肿瘤细胞系中显示出浓度依赖性活性，其中IC₅₀值在0.127％(v/v)至0.657％(v/v)的范围内。乳腺癌细胞系MAXF401NL的研究表明在用0.1％CC预处理后细胞生长略微降低。

用细胞抑制化合物预处理MAXF 401 NL细胞的测试显示出略微降低的生长速率：与未处理的对照相比，第一代降低25％，第二代降低30％。这证明了细胞抑制化合物最初诱导的癌细胞代谢改变以及那些细胞明显转化为正常细胞状态(非致癌的)。

因此，如上文所讨论的，细胞抑制组合物可能通过改变代谢-通过将葡萄糖氧化/降解的平衡从厌氧移向需氧而将癌细胞转化为非癌/正常细胞。

尽管上文描述了本发明的优选实施方式，但应认识和理解可以在其中进行多种改变，并且所附权利要求旨在涵盖落入本发明的精神和范围内的所有这些改变。

表1：在产克隆测定中检测的人肿瘤异种移植物

^a)各实验的平均值

^b)1.0mg/ml浓度的5-FU

-(T/C＞50)；+(30≤T/C≤50)；++(10≤T/C≤30)；+++(T/C≤10)。

表2：细胞抑制剂的体外应答率

细胞抑制剂在人肿瘤异种移植物中的体外作用

04.04.2006

AHS，造血干细胞；AT，动物肿瘤；BXF，膀胱癌异种移植物；CEXF，颈；CNXF，中枢神经系统

CXF，结肠直肠；GXF，胃；HNXF，头颈；LEXF，白血病；LXF，肺腺A(LungA adeno)；L，大细胞；；E，表皮样的；S，小细胞

LYXF，淋巴瘤；MAXF，乳腺；MEXF，黑素瘤；OVXF，卵巢；FAXF，胰腺；PRXF，前列腺；PXF，胸膜间皮瘤；RXF，肾

SXF，肉瘤；TXF，睾丸；OXF，子宫体；XF，混杂的

-，(T/C＞50)；+，(30＜＝T/C＜＝50)；++，(10＜T/C＜30)；+++，(T/C＜＝10)；s，单个板的结果

B 2/可评估实验

表3

在NMRI nu/nu小鼠中肌内施用细胞抑制剂的影响

n.r.＝不相关(没有观察到体重减轻)

¹，死亡小鼠数目/小鼠总数目(小鼠死亡的日期)；

²，记录最小中值体重的日期

表4尸体剖检数据

媒介物对照组

细胞抑制剂处理组

肾	无异常	无异常	无异常	无异常
					睾丸	无异常	无异常	无异常	无异常
腹膜	无异常	无异常	无异常	无异常
					其他	无异常	肥胖的	肥胖的	肥胖的

表5血细胞分析(大血计数)

使用血细胞计数测定绝对细胞数。

百分比通过染色血涂片的显微镜评估测定。

X：绝对细胞数由于血液凝固而不能测定。

#8490：3种大的非典型性细胞，几乎为圆形的中心核由大的嗜碱性原生质屏障环绕。

表6：CC对4种人肿瘤细胞系的体外活性(IC₅₀值)

IC50值根据非线性回归使用分析软件用于windows 5.01的GraphPad Prism

，Prism 5(GraphPad Software Inc.，CA)计算。

^*顶和底(bot)是T/C(％)中反映最大应答(顶)或最大抑制水平(底)的平台部分

尽管本文参考其具体实施方式描述了本发明的所有基础特征和特点，但是前述公开内容也包括一定范围的修改、各种改变和替代，并且明显的是在一些情况下，将在不背离所列的本发明范围的情况下采用本发明的一些特征而不相应地使用其他特征。应了解，本领域技术人员可以在不背离本发明的精神或范围的条件下进行这些代替、修改和变化。因此，所有这些修改和变化都包括在下列权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims

1.一种组合物，所述组合物由悬浮在0.1％-2％之间的氯化钠的水溶液中的甲醛组成，所述组合物用于治疗癌症的方法，其中所述甲醛以0.00004％至0.069％(v/v)之间的浓度悬浮在所述溶液中。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述氯化钠的浓度为0.9％。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述癌症选自由下列组成的组：大细胞肺癌、肾癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肺腺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤、胸膜间皮瘤和肉瘤。

4.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括：

将甲醛悬浮在0.1％-2.0％氯化钠的水溶液中，其中所述甲醛以0.00004％至0.069％(v/v)之间的浓度悬浮在所述溶液中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述氯化钠的浓度为0.9％。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述药物组合物用于治疗癌症或癌生长。

7.由悬浮在0.1％-2.0％之间的氯化钠的水溶液中的甲醛组成的组合物在制备用于治疗癌症或癌生长的药物中的用途，其中所述甲醛以0.00004％至0.069％(v/v)之间的浓度悬浮在所述溶液中。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述氯化钠的浓度为0.9％。