KR20100119536A - 생물학적 물질의 프로그램 냉동을 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

생물학적 물질의 프로그램 냉동을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본 발명에 따른 시스템 및 방법은 냉각 유닛 내에 배치된 복수의 바이알에 근접하는 한제의 층류 및 균일 흐름을 이용하여 강제 대류 냉각을 통해 냉각 유닛 내의 바이알 또는 다른 용기에 들어있는 생물학적 물질을 급속하게 냉각하는 능력을 제공한다. 생물학적 물질의 급속 냉각은 시스템에 도입되는 한제의 온도를 시간의 함수로서 정밀하게 제어 및 조정함으로써 이루어진다.

Description

생물학적 물질의 프로그램 냉동을 위한 방법 및 시스템{METHOD AND SYSTEM FOR CONTROLLED RATE FREEZING OF BIOLOGICAL MATERIAL}
본 발명은 넓게는 냉동보존 공정에 관한 것으로서, 특히 냉동보존 공정 동안 발생하는 세포간 결빙 및 용질 효과에 기인하는 세포 손상을 최소화하는 생물학적 물질의 프로그램 냉동(controlled rate freezing)을 제공하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
냉동보존은 매우 낮은 온도에서 생물학적 물질을 안정시키는 데 이용하는 공정이다. 살아있는 세포와 같은 생물학적 물질을 냉동하는 이전 시도는 흔히 세포 생존성의 유의한 손실을 초래하는데, 몇몇 경우에서는 세포 활성 및 생존성의 80% 이상에 달하는 손실을 초래한다.
몇몇의 경우, 냉동보존 동안의 세포 손상은 일반적으로 냉동 단계 동안 또는 재결정화 동안 살아있는 세포 내의 세포내 결빙(intracellular ice formation)의 결과로서 발생한다. 급속 냉각은 물 분자가 급속 냉각 속도와 관련된 짧은 시간 동안 세포 밖으로 완전히 이동하지 않기 때문에 더 많은 세포내 결빙을 야기한다. 세포간 결빙(intercellular ice formation)은 가온 또는 해빙 주기 동안 발생하는 재결정화 중에 또한 발생할 수 있다. 살아있는 세포 내부에 너무 많은 물이 남아있는 경우, 급속 냉각 단계 동안의 초기 빙정 형성 및 후속하는 가온 단계 동안의 재결정화에 기인한 손상이 발생할 수 있고, 이러한 손상은 일반적으로 치명적이다.
한편, 냉동보존 동안의 저속 냉각 프로파일은 흔히 세포 밖으로 물이 과도하게 이동하는 용질 효과의 증가를 초래한다. 세포 밖으로의 물의 과도한 이동은 삼투 불균형의 증가 때문에 세포에 부정적인 영향을 미친다. 따라서, 세포 생존에 유해하여 궁극적으로는 세포 손상 및 세포 사멸을 야기할 수 있는 삼투 불균형의 결과로서 세포 손상이 발생한다.
현재의 냉동보존 기법은 냉선반(cold shelf) 또는 동결 건조기 타입 냉동기 유닛과 같은 전도성 기반 극저온 냉각 장비 혹은 프로그램(controlled rate) 냉동기 및 극저온 냉동기(cryo-cooler) 유닛과 같은 대류성 기반 극저온 냉각 장비의 사용을 수반한다. 그러나 이러한 장비는 비교적 작은 부피 용량에만 적합할 뿐이고, 치료용 세포주(cell line)와 같은 생물학적 물질의 상업 규모 생산 및 보존에는 적합하지 않다. 예를 들어, 생물학적 물질에 사용하기 적합한 상업적으로 입수가능한 가장 큰 프로그램 냉동기는 단지 약 8000개 또는 매우 조밀하게 패킹된 바이알(vial)을 수용한다. 이러한 기존의 프로그램 냉동기는 또한 부분적으로는 냉동기 내 한제(cryogen)의 불균일한 흐름 및 바이알을 냉동기 내에 조밀하게 패킹하기 위한 요건 때문에 바이알 간에 냉각의 불균일성 문제가 있다.
수많은 통상의 냉동 시스템은 내부 팬을 사용하여 유닛 주위에 한제를 분산시키고 대류를 통해 바이알에 냉동을 전달한다. 이러한 대류 기반 냉각 또는 냉동 시스템은, 흔히 바이알이 내부 팬으로부터 다양한 거리에 위치하거나 다른 바이알 또는 트레이의 음영 안에 패킹되기 때문에 온도 균일성을 달성할 수 없다. 한제의 고속 난류에 노출된 생물학적 물질의 바이알은 일반적으로 상이한 속도로 냉각되는데, 흔히 팬으로부터 멀리 위치한 바이알보다 훨씬 빠른 속도로 냉각된다.
많은 수의 바이알을 처리할 수 있지만 일반적으로는 바이알로의 동결 건조기 유닛 내의 냉선반들 간의 열 전도에 좌우될 수 있는 기존의 동결 건조기 타입의 프로그램 냉동기가 또한 존재한다. 그러나 대부분의 유리 바이알 바닥이 오목하므로 유리 바이알의 바닥을 균일한 전도성 표면적을 갖도록 만드는 것이 불가능하다. 그러므로 냉동 공정 동안 바이알 간의 온도 편차는 이러한 타입의 장비에서 가장 큰 결점이다. 또한, 냉선반과 접촉하는 바이알의 매우 작은 전도성 표면 때문에 냉각 속도는 극도로 느릴 수 있다.
세포 활성 및 생존성의 손실을 완화하려는 이전 시도는 DSMO 및 글리세롤과 같은 동결방지 첨가제(cryoprotective additive)의 사용을 수반하였다. 냉동보존 공정 동안의 이러한 동결방지제의 사용은 냉동 및 후속 해빙 주기에 기인한 세포 손실의 감소를 보여준다. 그러나 DSMO와 같은 수많은 동결방지제는 인간 세포에 유독성이고, 그 외에도 전체 세포 치료에 이용하기에는 적합하지 않다. 불리하게도, 동결방지제는 세포 생산 및 보존 공정에 어느 정도의 복잡도 및 관련 비용을 또한 부가한다. 또한, 동결방지제 단독으로는 세포 활성 및 생존성의 손실이라는 문제를 해결하지 못한다.
동결방지제를 사용하거나 사용하지 않고 냉동보존 공정 동안 결빙 또는 용질 효과 때문에 발생하는 세포 손상을 더욱 줄이거나 최소화하는 방법 및 시스템이 필요하다. 또한, 이 시스템 및 방법은 생물학적 물질의 상업 규모 생산 및 보존 처리에 효과적이면서 용이하게 규모선정가능하고, 이러한 생물학적 물질의 고속 및 균일 냉각을 제공해야 한다.
본 발명은 한제 소스, 한제 소스에 연결되고 차가운 한제 기체의 균일한 흐름을 냉각 챔버에 제공하도록 구성된 흡입 회로, 배기 회로 및 제어 시스템을 포함하는 극저온 냉각기 또는 냉동 시스템으로 분류될 수도 있다. 냉각 챔버는 흡입 플리넘, 배기 매니폴드, 및 인접한 평행 표면들 사이에 냉각 구역을 형성하는 둘 이상의 평행한 다공성 표면을 포함하고, 평행한 다공성 표면 중 하나는 흡입 플리넘에 인접하게 배치되어 흡입 플리넘과 유체 소통하고, 평행한 다공성 표면 중 또 다른 하나는 배기 매니폴드에 인접하게 배치되고, 평행한 다공성 표면들 및 냉각 구역은 복수의 생물학적 물질의 용기를 수용하도록 구성된다. 냉동 또는 냉각 시스템의 배기 회로는 냉각 챔버의 배기 매니폴드로부터 한제 기체를 제거하도록 구성되는 반면 제어 시스템은 생물학적 물질의 원하는 냉각 속도 및 냉각 챔버 내의 측정된 온도에 응답하여, 흡입 회로에서의 한제 소스의 흐름 속도 및 배기 회로에서의 임의의 한제 기체의 흐름 속도를 조정하여 냉각 챔버에 전달되는 차가운 한제 기체의 온도를 조정하도록 구성된다. 이러한 방식으로, 온도 조정된 극저온 냉각 기체의 균일한 단방향 층류 흐름이 평행한 다공성 표면들 사이의 냉각 구역 및 복수의 용기 각각으로 전달되어 생물학적 물질을 균일하게 냉각한다.
본 발명은 (ⅰ) 복수의 생물학적 물질의 용기를 냉각 챔버 내의 평행한 다공성 표면들 사이의 구역으로서 형성되는 냉각 구역에 위치시키는 단계; (ⅱ) 액체 한제를 더 따뜻한 기체와 혼합하여 극저온 냉각 기체를 용기 내 생물학적 물질의 원하는 냉각 속도에 대응하는 선택된 온도 프로파일로 제공하는 단계; (ⅲ) 온도 조정된 극저온 냉각 기체의 단방향 층류 흐름을 다공성 표면들 중 하나를 통해 평행한 다공성 표면들 사이의 냉각 구역 및 복수의 용기 각각으로 전달하여 생물학적 물질을 균일하게 냉각하는 단계; 및 (ⅳ) 냉각 구역 내 기체의 재순환을 방지하기 위하여 냉각 챔버로부터의 기체를 또 다른 평행한 다공성 표면을 통해 즉시 배기시키는 단계를 포함하는, 생물학적 물질의 프로그램(controlled rate) 냉동 또는 냉각 방법으로 분류될 수도 있다.
본 발명의 상술한 양상, 특징 및 장점 외 다른 양상, 특징 및 장점은 첨부한 도면과 함께 제공하는 이하의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 시스템 및 방법에 사용하도록 구성된 균일 흐름 극저온 냉각기 유닛의 한 실시양태의 개략적인 도면이다.
도 2는 도 1의 균일 흐름 극저온 냉각기 유닛의 절단 부분의 상세한 도면으로서, 생물학적 물질의 바이알에 근접한 한제 기체의 균일 흐름 특성을 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 시스템 및 방법의 특징과 장점을 포함하는 단일 배치 균일 흐름 극저온 냉각기 유닛의 한 실시양태의 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 시스템 및 방법의 특징과 장점을 포함하는 다중-배치 또는 큰 상업 규모 균일 흐름 냉각 챔버의 한 실시양태의 개략적인 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 시스템 및 방법의 특징과 장점을 포함하는 연속 타입 균일 흐름 냉각 유닛의 또 다른 실시양태의 개략적인 도면이다.
도 6 내지 8은 본 발명에 따른 시스템 및 방법의 초기 실험 동안 관측된, 한제 기체의 선택된 온도 프로파일 및 생물학적 물질의 냉각 속도에 대한 대응 관계를 도시한다.
도 9는 다중-배치 또는 상업 규모 균일 흐름 냉각 시스템을 도시하는데, 기체 흡입, 배기 및 재순환 회로의 공정 및 기기를 상세하게 도시한다.
생물학적 물질의 냉동보존은 일반적으로 40℃ 이상의 온도부터 약 -100℃ 이하의 온도까지 생물학적 시료의 급속 냉각을 수반한다. 특정 온도, 냉각 속도 및 물질의 온도를 시간의 함수로서 나타낸 냉각 프로파일은 냉동될 특정 생물학적 물질에 크게 좌우된다. 생물학적 물질의 대부분의 냉동보존에서 냉동 공정은 정밀하게 제어되어야 한다. 바이알 간 및 배치 간 온도, 냉각 속도 및 냉각 프로파일의 균일성은 생산 공정에서 매우 중요하다.
본 발명에 따른 방법 및 시스템은 생물학적 물질을 위한 현재 냉동보존 공정에 대한 개선을 제공한다. 본 발명에 따른 시스템 및 방법은, 냉각 유닛 내에 배치된 복수의 바이알 각각에 근접하는 한제의 층류(laminar) 및 균일 흐름을 이용하여, 주로 강제 대류 냉각을 통해 냉각 유닛 내 바이알 또는 다른 용기에 들어있는 생물학적 물질을 급속하게 냉각하는 능력을 제공한다. 이 외에, 본 발명에 따른 시스템 및 방법은 넓은 범위의 냉각 속도에 걸쳐 생물학적 물질의 급속 냉각을 제공할 수 있고, 특정되는 임의의 미리 정해진 온도로 생물학적 물질의 온도를 또한 유지할 수 있다.
더욱 구체적으로, 생물학적 물질의 급속 냉각은 시스템에 도입되는 한제의 온도를 시간의 함수로서 정밀하게 제어 및 조정함으로써 이루어진다. 한 양상에서, 본 발명에 따른 시스템의 실시양태는 한제 온도의 계단식 또는 신속 강하(102)(도 6 참조)를 제공하여 샘플 물질 내에 더 높은 정도의 서브-냉각(100)을 발생시킴으로써 바이알에서의 상 전이(예컨대, 물 대 얼음 변환)의 발열 효과를 최소화하도록 구성된다. 또 다른 양상에서, 본 발명에 따른 프로그램 냉동 또는 극저온 냉각 시스템 및 방법의 실시양태는 분당 약 -4.5℃(112)(도 7 참조) 및 분당 약 -5.0℃(도 8 참조)의 차가운 한제 기체 온도의 기울기를 제공하여 샘플 생물학적 물질의 급속 냉각(110,120)을 제공하지만 바이알 간의 온도 편차를 최소화하도록 구성된다.
냉각 챔버 또는 유닛에 도입되는 차가운 한제 기체의 온도는 차가운 한제 기체를 냉각 유닛에 도입하기 바로 전에 액체 질소 소스를 더 따뜻한 질소 기체 소스와 혼합함으로써 조정 또는 제어한다. 이어서, 혼합된 흐름은 본원에서 기술하는 적합한 한제 흡입 회로에 의해 냉각 유닛 전체에 도입 및 분산된다. 더 따뜻한 질소 기체는 바람직하게는 공급원으로부터의 실온 질소 기체 또는 냉각 유닛으로부터 나와 한제 흡입 회로로 재순환되는 질소 기체이다. 차가운 질소 액체 또는 기체와 혼합된 더 따뜻한 질소 기체는 모티브 기체(motive gas)로서 또한 작용하고, 바람직하게는 액체 질소 또는 차가운 질소의 부피 유량의 수 배인 부피 유량을 갖는다. 더 따뜻한 질소 기체를 더 차가운 질소 흐름과 적절하게 혼합함으로써, 본 발명에 따른 시스템은 차가운 한제 기체가 표적으로 삼은 전체 냉각 구역에 걸쳐 한제의 층류 및 균일 흐름을 발생시킨다. 냉각 유닛(들)으로부터 나오는 질소 기체를 재순환시킴으로써, 본 발명에 따른 시스템 및 방법은 기존의 프로그램 냉동기보다 한제(예컨대, 질소)의 더 높은 이용 효율을 또한 제공한다.
생물학적 물질의 모든 샘플 또는 바이알에 걸쳐 차가운 한제 기체의 균일한 흐름을 제공하면, 주어진 생물학적 물질에 대하여, 차가운 한제 기체 온도 및 한제 온도 구배의 정밀한 제어는 냉각 유닛 내 생물학적 물질의 관측된 냉각 속도에 대하여 직접적인 상관관계를 갖는다는 점을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명에 따른 냉각 유닛에 제공되는 차가운 한제 기체 온도가 약 -4.5℃/분 내지 약 -5.0℃/분으로 변하거나 감소되는 경우, 대략 -2.5℃/분의 생물학적 물질의 평균 냉각 속도가 최소 바이알 간 온도 편차로 달성된다. (도 7 및 8 참조)
이제, 도 1 및 2를 참조하면, 균일 흐름 극저온 냉각기(10)로서 지칭하는 냉각 유닛의 선택된 도면이 도시되어 있다. 도면에서 보는 바와 같이, 균일 흐름 극저온 냉각기(10)는 한제의 소스(도시하지 않음)에 연결된 한제 흡입 회로(12) 또는 도관을 포함한다. 균일 흐름 극저온 냉각기(10)는 베이스 기체 주입 박스(14), 기체 주입 박스(14)의 상면(17)에 또는 그 근처에 배치되거나 있는 다공성 금속 플레이트(16), 베이스 기체 주입 박스(14) 바로 위에 위치하는 대응 기체 제거 박스(18), 및 이에 배치된 다공성 금속 플레이트(19)를 더 포함한다. 대안으로, 극저온 온도를 견디는 데 적합한 지지된 중합체막 또는 기계적으로 천공되거나 화학적으로 에칭된 구멍이 있는 다른 천공 플레이트의 다양한 배열을 다공성 금속 플레이트 대신 사용할 수 있다.
기체 주입 박스(14)와 연관된 다공성 금속 플레이트(16)는 생물학적 물질을 함유하는 복수의 바이알(20)을 수용 및 유지하도록 구성된다. 또한, 바이알(20)에 또는 그 근처에는 시스템 컨트롤러(도시하지 않음)에 대한 입력부로서 사용하는 복수의 온도 센서(25)가 배치된다. 한제 흡입 회로(12) 또는 도관은, 한제 흡입 흐름을 수용하고 다공성 금속 플레이트(16)에 걸쳐 한제를 균일하게 분배하도록 구성된 기체 주입 박스(14)에 또한 연결된다. 차가운 한제 기체는 기체 주입 박스(14)에 있는 흡입 플리넘(intake plenum)(32)으로 흐르고 바이알(20)을 유지하는 하부 다공성 금속 플레이트(16)를 통해 냉각 공간(30)으로 이어서 상부 다공성 금속 플레이트(19)와 배기 매니폴드(exhaust manifold)(34)를 또한 포함하는 기체 제거 박스(18)로 균일한 방식으로 흐른다. 배기 매니폴드(34)로부터, 사용된 질소 기체는 기체 배기 회로(28) 또는 도관을 통해 나간다.
상술한 바와 같이, 바이알(20)의 냉각은 바이알(20)과 냉각 구역(30)을 통해 흐르는 극저온 냉각 기체(27) 간의 열 전달로 인해 이루어진다. 극저온 냉각 기체(27)는 적절한 혼합 장치 또는 밸브(36)로 액체 질소를 더 따뜻한 질소 기체 또는 기체 배기 회로(28)로부터의 사용된 재순환 질소 기체와 혼합함으로써 한제 흡입 회로(12)에서 생성된다. 바이알(20)은 일반적으로 극저온 냉각 기체보다 약간 느린 속도로 냉각된다. 바이알(20)과 극저온 냉각 기체(27) 간의 온도 차이가 바이알(20)을 냉각시키는 열 구동력(thermal driving force)이다. 그러므로 극저온 냉각 기체(27)의 온도를 특정 온도 프로파일에서 정밀하게 제어함으로써 임의의 온도 프로파일을 갖는 바이알(20)을 냉동시킬 수 있다.
바람직하게는, 극저온 냉각 기체 온도, 특히 온도 프로파일은 바이알(20)에 또는 그 근처에 배치된 온도 또는 열 센서(25)가 나타내는 평균 온도에 응답하여 능동적으로 제어된다. 본 실시양태에서 복수의 바이알(20)에서의 평균 온도는 시스템의 능동 제어를 위한 입력으로서 이용한다. 바람직하게는, 1차 시스템 컨트롤러가 바이알 온도를 비롯한 시스템 온도를 모니터 및 제어하는 케스케이드 기반 제어 방법론은 설정 포인트 신호 및 다른 명령을 흡입 회로에서의 극저온 냉각 기체 온도를 조절할 책임이 있는 슬레이브 컨트롤러에 전달한다. 상세하게 후술하는 바와 같이, 극저온 냉각 기체 온도 프로파일은 특정 부피의 차가운 액체 질소를 특정 부피의 더 따뜻한 질소 기체와 블렌딩하는 혼합 밸브의 가동 제어(operative control)를 통해 생성된다. 블렌딩 또는 혼합은 바람직하게는 미리 정해진 온도 프로파일에서의 온도(즉, 시간의 함수로서 변하는 온도)를 갖는 극저온 냉각 기체를 제공하도록 시간의 함수로서 변하는 연속적인 공정이다. 요약하면, 균일 흐름 극저온 냉각기의 가동 온도 제어는 흡입 회로에서의 극저온 냉각 기체의 온도 프로파일을 제어함으로써 이루어진다. 상술한 바와 같이, 극저온 냉각 기체 온도와 온도 구배의 정밀한 제어는 주어진 생물학적 물질의 관측되는 냉각 속도에 대하여 직접적인 상관관계를 갖는다는 점을 발견하였다.
극저온 냉각 기체가 하부 기체 주입 박스(14)에 유입됨에 따라, 극저온 냉각 기체(27)는 기체 주입 박스 내 일련의 하향 배향된 살포기 파이프 또는 채널(도시하지 않음)을 통해 흡입 플리넘(32)으로 분산된다. 흡입 플리넘(32)에서의 이러한 분산은 다공성 금속 플레이트(16)의 전체 표면에 걸쳐 극저온 냉각 기체(27)의 균일한 분배를 촉진한다. 흡입 플리넘(32)에서의 극저온 냉각 기체(27)의 하향 배향된 분배는 냉각 불균일 지점 및 불균일한 냉각을 초래하는, 다공성 금속 플레이트(16)에 대한 극저온 냉각 기체(27)의 직접적인 충돌을 방지한다. 기체 주입 박스(14)에 있는 다공성 금속 플레이트(16)는 극저온 냉각 기체(27)를 생물학적 물질의 바이알 또는 다른 용기가 유지되는 균일 흐름 극저온 냉각기(10)의 전체 냉각 구역(30)에 걸쳐 균일하게 분배한다. 사용된 질소는 기체 제거 박스(18)에 있는 다공성 플레이트(19) 위에 배치된 배기 매니폴드(34)에 수집된다. 예시한 바와 같이, 극저온 냉각 기체(27)는 흡입 플리넘(32)으로부터 다공성 플레이트(16)를 통해 냉각 구역(30)으로 상향으로 그리고 상부 다공성 플레이트(19)를 통해 배기 매니폴드(34)로 횡단하는 짧은 경로만을 갖는다. 극저온 냉각 기체 흐름의 균일한 방향과 짧은 거리는 극저온 냉각기(10) 내 바이알(20)의 높은 수준의 냉각 균일성을 야기한다. 다공성 금속 플레이트(16,19)의 구멍 크기는 바람직하게는 직경이 약 2 내지 50 마이크로미터인데, 작은 구멍일수록 분산 및 냉각 균일성을 향상시킨다. 생물학적 물질을 최적의 속도로 냉각 또는 냉동시킴으로써, 세포의 생존률을 향상시키고 잠재적으로는 더 높은 약 효능을 제공한다.
용액의 빙점에서, 결정화열은 용액 온도가 떨어지는 것을 막고, 때로는 바이알 내의 온도가 또한 상승할 수 있다. 선택된 대조 바이알에 또는 그 근처에 내장되는 하나 이상의 열 또는 온도 센서(25)를 사용하여, 필요하다면 최적 냉각 속도로부터의 온도 편차를 최소화하도록 극저온 냉각 기체의 온도를 조정할 수 있다. 즉, 시스템의 제어는 미리 프로그램될 수 있거나 실시간 피드백 기반 동작일 수 있다.
냉동보존용 바이알 또는 용기에 들어있는 약제액, 생물약제액 또는 생체액은 본 발명에 따른 시스템 및 방법으로부터 이득을 본다. 이러한 생물학적 물질 또는 생물약제학적 물질은 미생물, 조직, 장기, 줄기 세포, 일차 세포, 수립된 세포주, 작은 다세포 유기체, 배아와 같은 복잡한 세포 구조, 또는 생바이러스 혹은 독성약화 바이러스; 핵산; 단일클론항체; 다클론항체; 생체분자; 비펩티드 유사체; 펩티드, 융합 및 변성 단백질을 비롯한 단백질; RNA, DNA 및 그 서브클래스; 올리고뉴클레오티드; 바이러스 입자; 및 이와 유사한 물질 혹은 성분을 포함하는 용액 또는 혼합물을 포함할 수도 있다. 또한, 생물학적 물질을 수용하기 위하여 사용하는 용기는 바이알, 스트로(straw), 중합체 백, 또는 다른 형태의 적합한 용기를 포함할 수도 있다.
도 3, 4 및 5는 균일 흐름 접근법 또는 개념을 포함하는 본 발명에 따른 프로그램 냉동기 또는 극저온 냉각기의 다양한 실시양태를 도시한다. 더욱 구체적으로, 도 3은 균일 흐름 극저온 냉각기 중 하나를 수용하도록 구성된 프로그램 냉동기의 단일 모듈식 유닛(40)의 도면이다. 도 3에 도시한 유닛(40)을 위한 외부 하우징은 흡입 도관(42), 플리넘 및 다공성 플레이트(46)가 있는 기체 주입 박스(44)뿐만 아니라 다공성 플레이트, 배기 매니폴드 및 배기 도관이 있는 기체 제거 박스(48)를 구비한 고체 스테인리스강 하우징이다. 도시한 유닛은 도 1 및 2를 참조하여 상술한 바와 같은 단일 층류 및 균일 흐름 극저온 냉각기를 수용하도록 치수선정된다.
도 4는 다중 균일 흐름 극저온 냉각기 조립체를 수용하도록 구성된 복수의 선반 또는 레일(54)을 구비하는 냉각 챔버(52)를 포함하는 다중 배치 또는 상업 규모 유닛(50)을 도시한다. 이와 같은 다중-배치 또는 상업 규모 유닛(50)은 생산 공정당 50,000개 이상의 바이알 또는 기타 다른 용기를 냉동보존할 수 있는 것이 바람직하다. 도 4에서 보는 바와 같이, 한제 흡입 회로(56) 및 사용된 기체 배기 회로(58)는 충분한 한제를 다중 개별 극저온 냉각기(60)에 순환시키도록 설계 및 크기 선정된다. 제어 시스템(70)은 시스템 내에 배치된 열 센서로부터의 입력에 따라 각 선반(54) 또는 각 극저온 냉각기 조립체(60)에 제공되는 차가운 한제 기체의 온도 프로파일을 동작가능하게 제어하는 데 사용한다.
도 5는 연속 방식 또는 컨베이어화된 방식으로 동작하는 프로그램 냉동기 또는 냉각기 시스템(80)의 또 다른 가능한 상업 규모 실시양태를 도시한다. 다시, 유닛(80) 및 차가운 한제 기체 흡입 회로(90) 및 기체 배기 회로(92)는 충분한 극저온 냉각 기체를, 입구 및 출구 수단(84)이 있는 터널 타입 냉동기 챔버(82) 내의 컨베이어(86)를 따라 배치되는 개별화된 용기 또는 트레이 조립체(88)에 순환시키도록 설계 및 크기 선정된다. 이러한 연속 공정에서, 상이한 용기, 바이알 또는 트레이의 냉각 프로파일은 배치 시스템에 관하여 상술한 바와 같은 시간 기반, 또는 공간 기반(예컨대, 챔버 내 공간적 위치)일 수 있다.
생물학적 물질의 냉각 속도를 정밀하게 제어하는 능력은 많은 장점을 제공한다. 예를 들어, 수용액 내 냉동된 생물학적 물질은 물질의 기능 또는 활성을 악화시킬 수도 있는, 냉동 및 후속 해빙 공정 동안의 다양한 스트레스를 경험할 수도 있다. 결빙은 물질을 물리적으로 파괴하거나, 물질이 경험하는 계면 결합, 삼투력, 용질 농도 등에서의 심각한 변화를 발생시킬 수도 있다. 냉동 공정의 적당한 설계는 이와 같은 스트레스를 완화할 수 있고, 본 발명에 따른 시스템 및 방법은 냉동 공정의 정밀한 제어를 허용하여 설계된 냉동 프로파일에 따라 모든 바이알 내 냉동된 물질에서의 균일성을 달성하게 한다.
도 9를 참조하면, 예시된 극저온 냉각기 시스템(210)은 극저온 냉각 기체 회로(262)로부터의 극저온 냉각 기체(260)를 수용하도록 구성된 냉각 챔버(220), 액제 질소 소스(230), 상 분리기(234)를 구비한 액체 공급 회로(232), 기체 질소 소스(240), 기체 공급 회로(242), 재순환 극저온 기체(250) 및 기체 재순환 회로(252)를 구비한다. 극저온 냉각기 시스템(210)은, 측정된 온도와 압력뿐만 아니라 원하는 냉각 프로파일을 포함하는 특정 사용자 정의 파라미터에 응답하여 유체 회로를 동작가능하게 제어하는 프로그램가능 로직 컨트롤러(PLC) 기반의 제어 시스템(270)을 또한 구비한다.
예시된 냉각 챔버(220)는 제약 활성 성분 또는 활성 생물 분자를 함유하는 수많은 바이알을 냉각하는 데 사용하는 복수의 냉각 선반(222)을 구비한다. 극저온 냉각 기체(260)는, 액체 질소 소스(230)로부터 액체 공급 회로(232)를 경유하는 액제 질소를 기체 공급 회로(242)로부터의 정밀하게 계량된 기체 질소 스트림 및 기체 재순환 회로(252)로부터의 재순환 극저온 기체(250)와 혼합하는 고정식 인-라인 혼합기(263)로부터 냉각 챔버(220)에 공급된다.
극저온 냉각 기체(260)의 온도는 바람직하게는 고정식 인-라인 혼합기(263)의 하류에 배치된 온도 센서(264)로 측정한다. 액체 공급 회로(232)로부터의 질소와 기체 공급 회로(242) 및 기체 재순환 회로(252)로부터의 질소 기체의 흐름을 정밀하게 조정함으로써, 넓은 범위의 냉각 프로파일을 갖는 냉각 챔버(220) 내 바이알의 냉각을 가능하게 하는 극저온 냉각 기체(260)의 온도를 신속하게 바꿔 공정 조건을 최적화하고 세포 생존 능력, 약 균일성뿐만 아니라 약 효능을 최대화할 수 있다.
질소 기체를 액체 질소와 혼합함으로써 극저온 냉각 기체(260)가 형성되면, 극저온 냉각 기체는 단일 냉각 챔버(220) 내 복수의 레벨의 냉각 선반(222)으로 분할된다. 복수의 냉각 선반(222)으로의 정확한 극저온 냉각 기체(260) 분할을 제공하기 위하여, 복수의 임계 흐름 오리피스(265)를 사용하여 극저온 냉각 기체(260)를 다중 기체 스트림으로 분할한다. 임계 초크(choke) 흐름 상태하에서, 냉각 선반(222)으로의 극저온 냉각 기체 흐름은 하류 압력과 무관하게 유지된다. 대형 극저온 냉각 기체 매니폴드(266)는 임계 흐름 오리피스(265)의 상류에서 압력 차이를 제거 또는 최소화하는 데 사용하는 반면 하류 기체 흐름 저항은 임계 흐름 오리피스(265)를 통과하는 기체 흐름에 영향을 주지 않는다. 이러한 방식으로 냉각 챔버(220) 내 각각의 냉각 선반(222)으로의 극저온 냉각 기체 흐름은 거의 동일하다.
극저온 냉각기 시스템(210)은 각 바이알에 대하여 동일한 방향으로 그리고 바람직하게는 바이알의 종축을 따라 흐르는 극저온 냉각 기체(260)와 직접 접촉하는 냉각 시스템이고, 따라서 모든 바이알에 대하여 매우 균일한 냉각 프로파일을 발생시킨다. 다공성 금속 멤브레인(도 1 및 2 참조)은 모든 냉각 표면에 걸쳐 균일한 저항을 제공하고, 따라서 개별 바이알은 동일하거나 균일한 냉동량을 수용할 수 있다.
질소 기체 공급원(240)은 바람직하게는 벌크 저장 탱크로부터 수용되고, 필터(244)를 통과하여 입자성 물질이 제거된다. 이어서, 질소 기체 공급원(240)은 방출 압력 조절기(245)를 통해 원하는 압력으로 하향 조절된다. 압력 조절기(245) 전 및 후의 라인 압력은 바람직하게는 하나 이상의 압력 표시기(246)를 사용하여 모니터한다. 질량 흐름 센서(248)와 전기-공압식 제어 밸브(249)를 구비하는 질량 흐름 컨트롤러(247)는 바람직하게는 기체 공급 회로(242)를 통해 고정식 인-라인 혼합기(263)로의 정밀하게 계량된 질소 기체 흐름 속도를 제어 및 유지하는 데 사용한다. 전기 솔레노이드 밸브(243)가 기체 공급 회로(242)에 또한 포함되어 극저온 냉각기 시스템(210)이 동작하지 않는 경우 포지티브 차단 능력을 제공한다. 극저온 냉각기 시스템(210)의 긴급 폐쇄가 요구되는 경우 이 솔레노이드 밸브(243)를 불활성화시키도록 제어 시스템(270)에 경보를 설정할 수 있다.
예시된 시스템은 다양한 제어 밸브를 작동시키는 데 사용하는 추가 기체, 즉 공기의 소스를 도시한다. 예시된 공기 공급 회로(215)는 라인으로부터 임의의 입자를 제거하도록 구성된 필터(216), 안전한 동작을 위하여 공기압을 약 25psig로 낮추도록 구성되는 압력 조절기(218), 및 공기 공급 회로(215)에서의 압력을 모니터하는 데 사용하는 하나 이상의 압력 표시기(219)를 구비한다.
액체 질소 공급 회로(232)는 액체 질소 소스(230), 상 분리기(234), 하나 이상의 온도 및 압력 센서(233), 액체 질소 매니폴드(235), 하나 이상의 안전/릴리프 밸브(236), 여과기(237), 및 1차 극저온 흐름 제어 밸브(238)를 구비한다. 모든 액체 질소 배관은 바람직하게는 액체 질소의 질소 기체로의 임의의 상 변화 및 그 결과로서 생기는 액체 질소 공급 회로(232) 내 임의의 파이프에서의 2-상 흐름을 최소화하기 위하여 절연되어 있다.
액체 질소 상 분리기(234)는 열 누설 또는 파이프라인 압력의 변화에 기인하여 액체 질소 공급 회로(232)에 형성되는 임의의 질소 기체를 제거하도록 설계된다. 예시된 상 분리기(234)는 이중-벽의 수직으로 장착된 원통형 탱크이다. 내부 액체 용기는 250psig의 최고사용압력(MAWP) 등급을 갖고, 외부 용기는 진공 절연을 제공한다. 기체 상 통기 밸브(239)는 상 분리기(234)를 액체 질소 소스(230)로부터의 액체 질소로 충전하는 것을 동작가능하게 제어한다. 낮은 액체 수준에서, 기체 상 통기 밸브(239)는 상 분리기(234)로부터의 증기압을 통기구(280)로 개방하여 액체 질소를 액체 질소 소스(230)로부터 전달한다. 액체 질소 수준이 상 분리기(234)에서 증가함에 따라, 기체 상 통기 밸브(239)는 닫히기 시작하고, 밸브(239)가 완전히 닫히고 상 분리기(234)가 액체 질소로 충전되는 것이 중지될 때까지 충전 속도가 감소한다.
여과기(237)는 블로-다운 릴리프 밸브(236A)에 연결되는데, 블로-다운 릴리프 밸브는 여과기(237)의 세정 또는 액체 질소 공급 회로(232)로부터의 임의의 기화된 질소 기체의 제거가 요구될 때 동작한다. 여과기(237)는 1차 극저온 제어 밸브 또는 릴리프 밸브에 대한 부정적인 성능 또는 손상을 방지하기 위하여 액체 질소 내 임의의 입자를 걸러내는 역할을 또한 수행한다.
예시된 안전 밸브 중 하나는 액체 질소 공급의 포지티브 차단을 제공하는 극저온 전기 솔레노이드 밸브(236B)이다. 전기 솔레노이드 밸브(236B)의 불활성화는 액체 질소 공급 회로를 통해 고정식 인-라인 혼합기(263)로의 모든 액체 질소 흐름을 차단한다. 전기 솔레노이드 밸브(236B)는, 전원이 차단되면 액체 질소 공급 회로(232) 및 통기구(280)를 통하는 액체 질소 흐름 및 액체 질소 공급 회로로부터의 임의의 포획된 액체 질소를 즉시 정지시키도록 구성된다. 또한, 제어 시스템(270) 내의 다른 공정 폐쇄 및 긴급 차단 절차는 하나 이상의 안전 밸브(236)에 대한 명령 신호를 생성한다. 예를 들어, 극저온 냉각기 시스템(210)은 냉동 주기의 말미에 또는 미리 설정된 경보 상황을 포함하는 다른 원인으로 인해 동작을 멈추는 경우가 있다. 제어 시스템(270)은 안전 밸브(236) 중 하나 이상을 차단함으로써 액체 질소 공급 회로(232)에서의 액체 질소 흐름을 정지시킨다.
1차 극저온 흐름 제어 밸브(238)는, 극저온 냉각 시스템(210) 내 측정된 온도와 압력뿐만 아니라 원하는 냉각 프로파일을 포함하는 특정 사용자 정의 파라미터에 응답하여, 제어 시스템(270)으로부터 신호를 수신하여 극저온 냉각 기체 회로(262)에 공급되는 액체 질소의 양을 제어한다.
액체 질소 공급 회로(232)로부터의 액체 질소는 고정식 인-라인 혼합기(263)로 향한다. 액체 질소는 기체 공급 회로(242)와 기체 재순환 회로(252)로부터 유도되는 질소 기체와 혼합함으로써 극저온 냉각 기체(260)로 증발한다. 고정식 인-라인 혼합기(263)는 증발되지 않은 액체 질소는 냉각 챔버(220)에 조금도 들어가지 않음을 보장하는 데 사용한다. 극저온 냉각 기체 회로(262)에서의 온도는 고정식 인-라인 혼합기(263)의 출구에 또는 그 근처에 배치된 온도 센서(264)로 모니터한다. 제어 시스템(270)은 이 측정된 온도를 수신하고, 수신된 온도에 응답하여 프로그램된 온도 프로파일과 미리 설정된 파라미터에 기초하여 고정식 인-라인 혼합기(263)로의 액체 질소 흐름 속도와 기체 흐름 속도를 조절한다.
고정식 인-라인 혼합기(263)의 하류에서, 극저온 냉각 기체(260)는 대형 극저온 냉각 기체 매니폴드(266)로 향하고, 이어서 복수의 임계 흐름 오리피스(265)를 통해 냉각 챔버(220) 내 다중 냉각 선반(222)으로 향한다. 대형 극저온 냉각 기체 매니폴드(266)는 기체 분배 포인트 모두는 동일하거나 유사한 압력을 실현함을 보장하는 데 사용한다. 냉각 챔버(220)의 냉각 선반(222) 각각에 전달되는 실제 극저온 냉각 기체 흐름 속도는 각 냉각 선반(222)과 연관된 임계 흐름 오리피스(265)의 크기에 따라 결정된다.
냉각 챔버(220) 내부 각각의 레벨에는 하향 배향된 노즐을 구비한 일련의 기체 분배 파이프가 존재한다. 냉각 챔버 내부의 추가적인 기체 분배 파이프의 목적은 임의의 대형 다공성 금속 멤브레인에 걸쳐 극저온 냉각 기체 분배에 영향을 줄 수도 있는 속도 발생 국소 압력 구배를 방지 또는 최소화하는 데 있다. 임계 흐름 오리피스(265)와 기체 분배 네트워크를 구비하면, 대형 냉각 챔버는 수천 개의 바이알 또는 패키지를 매우 높은 정도의 냉각 균일성으로 유지하는 데 사용할 수 있다.
냉각 챔버(220)의 복수의 레벨 내 냉각 표면은 복수의 바이알에 걸쳐 균일한 기체 흐름을 발생시키도록 구성된 다공성 금속 멤브레인(227)으로 만든다. 금속 멤브레인(227)에 있는 작은 구멍 크기와 높은 플럭스로 인하여 전체 냉각 표면으로부터 상승하는 층류 흐름이 발생한다. 냉각 표면으로부터의 층류 흐름이 바람직하지만, 흐름이 바이알에 평행하게 유지되고 기체의 거시적 재순환이 냉각 챔버(220) 내부에서 발생하지 않는 한, 기체 난류도 괜찮다.
냉각 챔버(220) 내 각 레벨에 있는 다공성 금속 멤브레인 위에는 다공성 금속 메브레인(227)과 평행한 방향으로 배치되는 천공 플레이트를 구비한 배기 매니폴드(225)가 있어 바이알의 냉각 동안 극저온 냉각 기체(260)의 균일한 흐름을 유지한다. 배기 매니폴드(225)에 수용되는 기체는 사용된 질소 기체의 임의의 내부 재순환 흐름을 방지 또는 최소화하기 위하여 냉각 챔버(220)로부터 즉시 제거된다. 이와 같이 재순환되는 기체는 일반적으로 냉각 챔버(220)에 공급되는 극저온 냉각 기체(260)보다 더 따뜻한 온도이기 때문에 질소 기체의 내부 재순환을 방지하는 것이 중요하다. 이와 같은 내부 재순환 흐름은 종래기술 또는 통상적인 층류 냉각 장치에서의 에지 효과와 함께 온도 불균일성의 중요한 원인이다.
냉각 챔버(220)로부터 제거되는 배기 기체는 바람직하게는 기체 재순환 회로(252)로 방향을 바꾼다. 예시된 기체 재순환 회로(252)는 냉각 챔버(220) 내 배기 매니폴드(225)와 냉동 주기의 후반부 동안 자동으로 시작하는 재순환 송풍기(254) 사이에 배치되는 재순환 기체 매니폴드(253)를 구비한다. 기체 재순환 회로(252)는, 기체 공급 회로(242)로부터의 구성 기체 흐름 속도를 조정하여 극저온 냉각 기체 회로(262) 내 극저온 냉각 기체(260) 흐름의 원하는 수준을 유지하기 위하여 기체 재순환 회로(252)를 통과하는 흐름을 측정하는, 제어 시스템(270)에 연결된 질량 흐름 계량기(255)를 구비한다. 배압 조절기(256)는 재순환 송풍기(254)로부터의 압력을 유지하는 반면 체크 밸브(258)는 재순환 송풍기(254)가 동작하지 않는 경우 기체 공급 회로(242)로부터의 구성 질소 기체가 기체 재순환 회로(252)에 들어가지 않게 한다. 안전 릴리프 밸브(259)는 기체 재순환 회로(252)에 장애물이 있는 경우 냉각 챔버(220)를 위하여 초과-가압 보호를 제공한다.
냉각 챔버(220) 내부의 압력과 온도는 냉각 챔버(220) 내에서 몇몇 바이알에 근접하게 배치되는 압력계(228) 및 온도 센서(229) 또는 열전쌍으로 모니터한다. 압력계(228), 온도 센서(229)뿐만 아니라 열전쌍은 제어 시스템(270)에 연결되고, 제어 시스템(270)에 입력을 제공한다.
본 발명에 따른 시스템 및 방법은 상업 타입 또는 대규모 생물학적 생산 작업에 특히 적합한데, 이는 넓은 범위의 생물학적 제품을 제조하도록 용이하게 규모선정되거나 구성되는 동일한 장비 및 공정 파라미터를 이용하여 공정을 수행하기 때문이다. 본 발명에 따른 공정은 샘플 간에, 바이알 간에, 용기 간에, 및 배치 간에 생물학적 물질의 높은 정도의 냉각 또는 냉동 균일성을 달성하는 공정을 이용하여 생물학적 물질의 프로그램 냉동을 제공한다.
또한, 도 5 내지 8의 더욱 철저한 조사는 본 발명에 따른 냉동 또는 냉각 공정은 생물학적 물질에서의 냉동 빙정 형성을 개시하고 제어하는 수단으로서 이용할 수 있음을 예시한다. 도 5 내지 8에서 예시하는 바와 같이, 모니터한 모든 바이알에서 생물학적 물질의 냉동 빙정 형성은 거의 동일한 시간과 동일한 온도에서 발생하였다. 냉동 빙정 형성은 샘플에서 발생하는 상 변화 동안 발생하는 발열 공정의 결과로서 샘플 온도에서의 동시에 발생하는 짧은 스파이크(100, 110, 120 참조)에 의해 표시된다. 따라서, 빙정 형성 제어는 상술한 제어형 냉동 시스템 및 방법을 이용하여 급격하거나 빠른 온도 냉각(temperature quench)의 타이밍과 규모를 정밀하게 제어함으로써 가능하다. 통상적인 프로그램 냉동기의 사용으로부터 발생하는 냉동 빙정 형성에서의 넓은 시간과 온도의 스펙트럼과 비교하면, 본 발명에 따른 시스템과 방법은 보존되는 생물학적 물질의 다른 성능 양상과 특성에 아마도 영향을 미치는 더 큰 정도의 제어를 제공한다. 또한, 고려되는 빙정 형성 개시와 제어가 온도로 유도되기 때문에 개방 또는 폐쇄 용기 또는 바이알에 동일하게 작용한다.
바람직하게는, 도 3, 4, 5 및 9에서의 유닛을 위한 하우징은 압력 정격 하우징이어서 본 발명에 따른 프로그램 냉동 방법이 일반적으로 미국특허출원번호 11/702,472에 기술되어 있는 제어형 빙정 형성 시스템 및 공정의 양상에 결합 또는 포함될 수 있다.
상술한 바로부터, 본 발명은 생물학적 물질의 프로그램 냉동 시스템 및 방법을 제공함을 인식해야 한다. 본 방법의 다양한 수정, 변경 및 변화는 본 기술분야의 숙련자라면 알 수 있을 것이고, 이와 같은 수정, 변경 및 변화는 본원의 범위 및 특허청구범위의 사상과 범위에 포함됨을 이해하게 될 것이다.

Claims (9)

  1. 생물학적 물질을 위한 극저온 냉각기 또는 냉동 시스템으로서,
    한제(cryogen) 소스;
    한제 소스에 연결되고, 차가운 한제 기체의 균일한 흐름을 냉각 챔버에 제공하도록 구성된 흡입 회로 - 냉각 챔버는 흡입 플리넘(plenum), 배기 매니폴드, 및 인접한 평행 표면들 사이에 냉각 구역을 형성하는 둘 이상의 평행한 다공성 표면을 포함하고, 평행한 다공성 표면 중 하나는 흡입 플리넘에 인접하게 배치되어 흡입 플리넘과 유체 소통하고, 평행한 다공성 표면 중 또 다른 하나는 배기 매니폴드에 인접하게 배치되고, 평행한 다공성 표면들 및 냉각 구역은 복수의 생물학적 물질의 용기를 수용하도록 구성됨 - ;
    냉각 챔버의 배기 매니폴드로부터 한제 기체를 제거하도록 구성된 배기 회로; 및
    생물학적 물질의 원하는 냉각 속도 및 냉각 챔버 내의 측정된 온도에 응답하여, 흡입 회로에서의 한제 소스의 흐름 속도 및 배기 회로에서의 임의의 한제 기체의 흐름 속도를 조정하여 냉각 챔버에 전달되는 차가운 한제 기체의 온도를 조정하도록 구성된 제어 시스템
    을 포함하고,
    온도 조정된 극저온 냉각 기체의 균일한 단방향 및 층류 흐름이 평행한 다공성 표면들 사이의 냉각 구역 및 복수의 용기 각각으로 전달되어 생물학적 물질을 균일하게 냉각하는 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    한제 소스는 액체 한제 및 더 따뜻한 기체를 더 포함하는 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    흡입 회로는 액체 한제를 더 따뜻한 기체와 혼합하여 극저온 냉각 기체를 생성하도록 구성된 인-라인 혼합기를 더 포함하는 시스템.
  4. 제3항에 있어서,
    배기 회로는 배기 매니폴드로부터의 기체를 다시 흡입 회로로 재순환시키는 재순환 회로를 더 포함하는 시스템.
  5. 제4항에 있어서,
    제어 시스템은 흡입 회로와 재순환 회로에서의 액체 한제의 흐름 속도 및 더 따뜻한 기체의 흐름 속도를 동작가능하게 조정하여 냉각 챔버에 전달되는 차가운 한제 기체의 온도를 조정하는 시스템.
  6. 제1항에 있어서,
    흡입 회로는 냉각 챔버로의 극저온 냉각 기체의 흐름을 초크(choke)하도록 흡입 플리넘의 상류에 배치되는 하나 이상의 임계 흐름 오리피스를 더 포함하는 시스템.
  7. 생물학적 물질의 프로그램(controlled rate) 냉동 또는 냉각 방법으로서,
    복수의 생물학적 물질의 용기를 냉각 챔버 내의 평행한 다공성 표면들 사이의 구역으로서 정의되는 냉각 구역에 위치시키는 단계;
    액체 한제를 더 따뜻한 기체와 혼합하여 극저온 냉각 기체를 용기 내 생물학적 물질의 원하는 냉각 속도에 대응하는 선택된 온도 프로파일로 제공하는 단계;
    온도 조정된 극저온 냉각 기체의 단방향 층류 흐름을 다공성 표면들 중 하나를 통해 평행한 다공성 표면들 사이의 냉각 구역 및 복수의 용기 각각으로 전달하여 생물학적 물질을 균일하게 냉각하는 단계; 및
    냉각 구역 내 기체의 재순환을 방지하기 위하여 냉각 챔버로부터의 기체를 또 다른 평행한 다공성 표면을 통해 즉시 배기시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    배기된 기체를 재순환시켜 더 따뜻한 기체와 혼합하는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    단방향 층류 흐름을 다공성 표면들을 통해 냉각 구역으로 전달하기 전에 온도 조정된 극저온 냉각 기체의 압력 및 흐름 속도를 조절하는 단계를 더 포함하는 방법.
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