CN108697073B - 冷冻保存多个细胞样品的设备和冷冻保存多个细胞样品的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种冷冻保存多个细胞样品(180)的设备(100)和方法。所述设备(100)包括冷却室(102)、冷却装置(104)和支撑件(106)，该冷却装置(104)包括构造成对冷却室(102)内部进行冷却的装置，其中，冷却装置(104)还包括冷却管(146)，该冷却管(104)与构造成对冷却室(102)内部进行冷却的装置分开，并且该冷却管(104)设置在冷却室(102)中，其中，冷却装置(104)构造成提供通过冷却管(146)的制冷剂流，该支撑件(106)用于支撑存储细胞样品(180)的多个瓶(168)，其中，支撑件(106)能够相对于冷却管(146)移动，使得多个瓶(168)能够与冷却管(146)接合。

Description

冷冻保存多个细胞样品的设备和冷冻保存多个细胞样品的 方法
技术领域
本发明涉及冷冻保存多个细胞样品的设备和方法。本文所使用的术语“冷冻保存(cryopreservation)”和“冷冻保存(cryopreserving)”分别是指通过冷却至低于大约-130℃的超低温并在该超低温下存储来保存细胞样品的过程。本文所使用的术语“细胞样品”是指真核细胞。通常，冷却和冷冻的过程通过诸如液氮的制冷剂执行。
背景技术
细胞的成功冷冻保存是生产生物药品的重要先决条件(Seth,G.：Freezingmammalian cells for production of biopharmaceuticals；Methods 56，P.424-431，2012)。然而，为了避免细胞质量的恶化，细胞样品的冷冻保存仍然是一个挑战。
当冷却含有悬浮液的细胞时，在达到细胞溶液的凝固点时该悬浮液不一定会结晶。相反，悬浮液将是过冷的。过冷被定义为将液体温度降低至其凝固点以下而液体不凝固或固化(Wilson,P.W.:Ice Nucleation innature:supercooling point(SCP)measurements and the role of heterogeneous nucleation，Cryobiology 46，第88-98页，2003)。在过冷溶液中，在一定的温度范围内自发地形成第一个冰晶(称为“引晶(seeding)”)或通过选择性地诱导(例如，通过冷却脉冲或通过在特定温度下摇动而机械地)而形成第一个冰晶(Mazur，Peter：Freezing of living cells:mechanisms andimplications，Am.J.Physiol.247，C125-C142，1984)。当冷冻多个细胞样品时，期望诱导引晶，以避免大规模的过冷并允许所有样品同时结晶(Morris,G.J.&Acton,E.：Controlledice nucleation in cryopreservation--a review，Cryobiology 66，p.85-92，2013)。
由于在引晶期间从液体到固体的相变，结晶焓(“潜热”)被释放，这导致在过冷介质中的温度升高到凝固点。如果在浓缩溶液中形成冰晶，则溶解的物质不会并入到冰中，而是积聚在冰晶之间的流体中，因此可能增加溶液的浓度。细胞组件不凝固且变得过冷。后续过程取决于冷却速度。如果冷却速度足够低，则细胞由于外渗而失水，使得细胞内的物质如糖类和盐类浓缩。由此防止细胞内的过冷。另外，细胞内的水的化学势与细胞外的水的化学势保持平衡。结果，细胞在没有细胞内凝固的情况下脱水(Mazur，Peter：Freezing ofliving cells:mechanisms and implications，Am.J.Physiol.247，C125-C142，1984)。
然而，如果冷却速度太低，则溶液效应和渗透作用可能损害细胞(Fowler,A.&Toner,M.:Cryo-injury and biopreservation，Ann.N.Y.Acad.Sci.1066，p.119-135，2005)。相反，如果冷却速度很高，细胞可能不会足够快地脱水以达到平衡。因此，细胞内液体逐渐过冷，直到发生从液体到固体的相变并在细胞内形成冰(Mazur，Peter：Freezing ofliving cells:mechanisms and implications，Am.J.Physiol.247，C125-C142，1984)。
总之，再活化后细胞的活力取决于数个因素，非常重要的是引晶步骤和冷却速度。冷却太快的细胞由于细胞内冰的形成和再活化时的重结晶效应而被破坏。冷却太慢的细胞经受溶液效应和渗透损害。
因此，用于冷冻保存细胞样品的设备必须构造成保证精确、同时和可再现的引晶以及随后的冷却，以避免太低或太高的冷却速度。
传统的设备不能充分地满足该挑战，因为这些设备不能在均匀的条件下冷冻保存大量细胞样品。特别地，在存储在瓶中的单个细胞样品之间的温度分布在冷冻期间是不均匀的，因为瓶在空间上一个接一个地设置。这是由于冷却室的立方体形状造成的，该形状导致注入的制冷剂的湍流、失速和不均匀分布。这些作用导致取决于瓶位置的不均匀的除热。因此，可能无法精确地控制细胞样品中的温度，这尤其对于诱导冰结晶有重大关系。因此，各个瓶的冷却速度之间以及与目标温度分布的偏差之间存在显著差异。进一步地，在许多传统的冷冻装置中，用于诱导冰结晶的引晶功能不适于同时诱导冰结晶，因为制冷剂不与每个瓶接触。因此，冰晶的形成自发地进行并且不受控制。进一步地，潜热的除去是困难的或有问题的，因为潜热可能不能有效地除去。因此，过冷直到在瓶中形成冰晶的过程的程度和进一步的过程各不相同。因此，不均匀的条件导致对于细胞库内和不同细胞库之间的产品质量的很大差异。
发明内容
本文公开了一种冷冻保存多个细胞样品的设备和方法，其允许以同时且可再现的方式冷冻瓶。
所公开的冷冻保存多个细胞样品的设备和方法的实施例具有独立权利要求的特征。在从属权利要求中列出了可以以单独的方式或以任何任意的组合实现的具体实施例。
如下文所使用的那样，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任意语法变体以非排他性的方式使用。因此，这些术语既可以指代除了由这些术语引出的特征之外，在本文所描述的实体中不存在其它特征的情况，也可以指代存在一个或更多个其它特征的情况。作为示例，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”既可以指除了B之外，A中不存在其它元素的情况(即，A唯一且排他地由B构成的情况)，也可以指除了B之外，在实体A中存在一个或更多个诸如元素C、元素C和D或甚至其它元素的情况。
另外，应当注意，表示可以存在一个或更多个特征部或元素的术语“至少一个”、“一个或更多个”或类似表述通常仅在介绍相应的特征部或元素时使用一次。在之后的下文中，在大多数情况下，当涉及相应的特征部或元素时，表述“至少一个”或“一个或更多个”将不再重复，而不排除可以存在一个或多于一个的相应的特征部或元素的事实。
另外，如下文所使用的那样，术语“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与可选的特征结合使用，而不限制替代的可能性。因此，由这些术语引入的特征是可选的特征，不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到的那样，本发明可以通过使用替代特征来实现。类似地，由“在本发明的一个实施例中”或类似表述引入的特征旨在是可选的特征，而对本发明的替代实施例没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对将以这种方式引入的特征与本发明的其它可选或非可选特征相结合的可能性没有任何限制。
根据所公开的用于冷冻保存多个细胞样品的设备，该设备包括冷却室、冷却装置和支撑件，该冷却装置包括构造成对冷却室的内部进行冷却的装置，其中，冷却装置还包括冷却管，该冷却管与构造成对冷却室的内部的进行冷却的装置分开，并且该冷却管设置在冷却室中，其中，所述冷却装置构造成提供通过冷却管的制冷剂流，该支撑件用于支撑存储细胞样品的多个瓶，其中，支撑件可以相对于冷却管移动，使得多个瓶能够与冷却管接合。
本文使用的术语“冷却管”是指制冷剂可以流过的管或管道。特别地，冷却管是所谓的封闭式冷却系统的一部分，使得制冷剂不通过冷却管供应到冷却室中，即冷却管不包括与冷却室连通的开口或孔。冷却室及其内部可以通过冷却装置单独冷却，如下面更详细说明的那样。
根据该设备，支撑件可以接收多个瓶或可以装载有多个瓶。当装载有瓶时，支撑件可以被移动，以使多个瓶与冷却管接触。因此，瓶可以在目标时间点和/或在目标温度下与冷却管接合。换句话说，支撑件可以相对于冷却管移动一定程度，或支撑件可以相对于冷却管以一定方式移动到允许多个瓶由冷却管接合的位置。因此，可通过瓶与冷却管的接合而在瓶中启动或诱导结晶过程。特别地，细胞样品的结晶可以局部诱导而不完全跨越细胞样品的外表面。
支撑件可以是可移动的，使得多个瓶可以在瓶的预定的可调节高度处与冷却管接合。可以调节支撑件以改变瓶处的接合点的高度。所述高度可以对应于细胞样品的液面或瓶处的任何其它期望点。本文使用的术语“瓶的高度”是指在瓶通常沿着其延伸的纵向方向上的瓶处的特定位置。特别地，该高度被确定为在从瓶的底部到顶部的方向上的位置。因此，可以通过瓶中的细胞样品的液位的位置来确定预定高度处的接触位置。因此，防止过多的冷辐射进入瓶中。另外，可以局部限制冷却脉冲。特别地，由冷却脉冲产生的非均匀温度分布可能仅以局部受限的方式发生，并且应该在技术上尽可能小地在所述小管内延伸。
冷却管可以彼此平行地设置。因此，提供了冷却管的均匀分布。这在冷却管彼此均匀地分隔开时尤其可以实现。
支撑件可以包括用于接收多个瓶的多个隔室。隔室可以设置成使得多个瓶能够设置在冷却管之间。例如，隔室设置成彼此平行地延伸的线。
有利地，冷却管和隔室彼此平行地设置。因此，对于每个瓶，隔室与冷却管的距离以及支撑件必须移动以使瓶与冷却管接合的距离是相同的。
隔室可以相对于支撑件移动。因此，提供了一种对于瓶相对于冷却管的定位的微调，其允许各瓶以相同的方式单独地与冷却管接合。这在例如隔室可以在支撑件中移动时可以实现。
隔室可以适于固定多个瓶。因此，瓶被隔室牢固地接收。
隔室可以构成为使得多个瓶可以与冷却管直接接合。因此，冷却管的冷可以直接引入瓶中，而在冷却管和瓶之间没有任何结构构件。
支撑件可以在轨道上移动。因此，可以使用相当简单的结构来移动支撑件。
冷却装置可以适于提供通过冷却管的足够的制冷剂流，使得冷却管在预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。本文使用的术语“预冷却时间”是指相对于冷却室可以冷却到引晶温度的时间的相对地定义的时间。特别地，预冷却时间比冷却室可以冷却到引晶温度的时间短。换句话说，冷却管在预冷却时间内并且在达到冷却室的引晶温度之前达到冷却管外表面引晶温度。因此，保证了可以在期望的时间内启动引晶过程，以保持细胞样品的质量。
冷却装置可以包括环形管部分。冷却管可以连接到该环形管部分。因此，提供将足够的制冷剂供应到冷却管中，以在预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。本文使用的术语“冷却管外表面引晶温度”是指在冷却管的外表面处定义的温度，其适于诱导细胞样品的引晶过程。换句话说，冷却管在其外表面处的温度必须足够低，以在瓶与冷却管接合时允许诱导细胞样品的引晶过程。可以借助于设置在冷却管的外表面处的温度传感器来检测冷却管的外表面处的温度。
所述环形管部分围绕冷却管。冷却管可以包括与环形管部分连接的端部。因此，可以从环形管部分向各冷却管供应制冷剂，以在预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。
环形管部分可以包括用于供应制冷剂的入口。因此，可以在多个位置处将制冷剂供应到环形管部分，这将制冷剂更好地分配到环形管部分中。
环形管部分可以分成区段，其中，每个区段与至少一个入口相关联。因此，可以向每个区段供应制冷剂。
环形管部分可以通过分隔壁分隔成所述区段。因此，每个区段独立于另一区段，并且可以被单独地供应制冷剂。
所述入口可以彼此均匀地间隔开。因此，提供了足够的制冷剂供应。这也导致足够的通过冷却管的制冷剂流，从而在预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。
环形管部分的内径可以大于冷却管的内径。因此，保证可以从环形管部分向冷却管供应足够量的制冷剂。
冷却装置可以适于从冷却管的底部到顶部提供制冷剂流，直到在预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。本文使用的术语“底部”和“顶部”是指相对于冷却室的取向。由于冷却室基本上分别沿着竖直方向和重力方向取向，尽管冷却管可以分别沿着水平方向和垂直于重力方向的方向设置，制冷剂在冷却管的下侧或冷却管下方的位置处供应到冷却管中，并在冷却管的顶侧或冷却管上方的位置处从冷却管排出。因此，在制冷剂已被使用并且包括更高的温度和/或从液体到气体的相变之后，制冷剂可以使用传统的对流效应从冷却管中离开。由此防止气态制冷剂在冷却管内积聚。
冷却室可以为圆筒形。因此，提供了对称设置，其改善了制冷剂在冷却室中的温度层流和推流(plug-flow)。
该设备还可以包括内部壳体和容纳该内部壳体的外部壳体，冷却室位于在该内部壳体中。因此，冷却室可以是隔热的。
构造成对冷却室内部进行冷却的装置可以是或可以包括用于喷射对冷却室内部进行冷却的制冷剂的喷嘴。因此，制冷剂可以在冷却室中分布，以均匀地降低温度。
喷嘴可以设置在内部壳体和外部壳体之间的空间中。因此，喷嘴可以以紧凑的方式设置。
内部壳体可以包括下侧部和顶侧部，其中，下侧部和顶侧部可以包括孔。例如，下侧部和顶侧部可以包括穿孔板，其中，穿孔板包括孔。穿孔板可以包括5％至15％的穿孔率。穿孔率可以在板半径上变化。换句话说，穿孔板的径向外部的穿孔率可以与径向中部的穿孔率和/或径向内部的穿孔率不同。另外，下侧部的穿孔板的穿孔率可以与顶侧部的穿孔板的穿孔率不同。本文使用的术语“穿孔率”是指孔的横截面积或开口面积与其中形成有孔的穿孔板的表面积之比或相对于该表面积的比率。因此，制冷剂可以均匀分布。特别地，穿孔板导致制冷剂的积载(stow)或拥塞(jam)以及制冷剂在内部壳体和外部壳体之间的空间中的均匀的层流流动。
该设备还可以包括设置在内部壳体的顶侧部和外部壳体之间的风扇。因此，可以产生制冷剂流动。
冷却装置可以包括入口和分配管，该入口位于内部壳体和外部壳体之间的空间中，该分配管将入口连接到喷嘴。因此，制冷剂可以分布在冷却室的整个横截面中。这特别地通过喷嘴在内部壳体和外部壳体之间的空间中的均匀分布来实现。
所述喷嘴可以位于公共平面内。因此，所述喷嘴具有与支撑件的预定的相同距离。
入口可以位于冷却室的中心轴线上。因此，提供了从入口到喷嘴的相同的制冷剂的流动。
入口和分配管可以定位成使得在分配管与内部壳体和外部壳体中的制冷剂流之间具有最小的接触面积。因此，入口的分配管对沿着管的制冷剂流产生最小的对流冷却。只有出去的制冷剂对所述制冷剂流进行冷却。
该设备还可以包括设置在内部壳体和外部壳体之间的中间壳体。中间壳体可以包括制冷剂的出口。外部壳体可以包括制冷剂的出口。中间壳体的出口和外部壳体的出口彼此连接。因此，提供了制冷剂的预定流动。
中间壳体可以包括下侧部和顶侧部。中间壳体的出口可以位于下侧部，其中，外部壳体可以包括下侧部和顶侧部，其中，外部壳体的出口可以位于顶侧部。因此，提供了使用过的制冷剂从壳体的底部到顶部的流动。
支撑件可以适于将多个瓶支撑在公共平面上。因此，制冷剂的层流推流在各瓶处除去相等的热量。
冷却装置可以适于向冷却管供应液态制冷剂，使得通过瓶与冷却管的接合来启动瓶中的细胞样品的引晶过程。因此，细胞样品可以在限定的条件下冷冻。
根据所公开的用于冷冻保存多个细胞样品的方法，使用如上所述的设备。该方法包括以下步骤：
-将冷却室冷却到温度保持点，
-在多个瓶中提供液态的细胞样品，
-用多个瓶装载支撑件，
-为了多个瓶中的温度同步性，将冷却室保持在温度保持点，
-将冷却室冷却到瓶中的引晶温度，
-供应制冷剂通过冷却管达预冷却时间，使得在达到引晶温度之前所述冷却管达到冷却管外表面引晶温度，
-当满足冷却管外表面引晶温度和引晶温度时，使支撑件相对于冷却管移动，使得多个瓶与冷却管接合达预定时间，以在细胞样品中启动引晶过程，
-将冷却室冷却到最终温度，和
-在达到最终温度的时间内受控地除去潜热。
因此，可以在限定的条件下冷冻保存细胞样品，而不对细胞样品的活性产生负面影响。特别地，通过瓶与冷却管的接合，提供了对于细胞样品的局部且及时的受限的过冷。
由于冷却室在支撑件装载多个瓶之前被预冷却到温度保持点，因此当瓶装载到冷却室中时，瓶的第一冷却步骤被加快或花费更少的时间，因为冷却室和瓶不必一起预冷却。另外，由于冷却室内的温度保持在温度保持点，保证了各瓶在被进一步处理和冷却到引晶温度之前分别具有相同的温度。因此，可以在适中的条件下在短时间内将瓶冷却到引晶温度。
温度保持点可以是-2℃至10℃。根据另一实施例，温度保持点可以为并且优选地可以为0℃至5℃，例如4℃。
引晶温度可以是从细胞样品的凝固点至-15℃。
温度保持点和/或引晶温度可以定义为细胞样品中的温度。
冷却管外表面引晶温度可以定义为冷却管外表面上的温度，该温度允许诱导细胞样品的引晶过程。换句话说，冷却管外表面上的温度被确定为足够低以允许在瓶与冷却管接合时诱导细胞样品的引晶过程的温度。
所述最终温度可以是-120℃至-190℃，例如-185℃。
所述预定时间可以是0.5分钟至3.0分钟。根据另一实施例，预定时间可以是1.5分钟至2.5分钟，例如2.0分钟。因此，可以在相对短的时间内启动引晶过程。
预冷却时间可以是0.1分钟至5.0分钟。由于在预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度，因此在相对短的时间内达到冷却管外表面引晶温度。
由于多个瓶可以与冷却管接合达所述预定时间，因此引晶以及时的受控的方式进行。
特别地，可以通过多个瓶与冷却管的局部接合来启动引晶过程，从而局部诱导细胞样品的结晶。
可以将制冷剂供应给冷却管，直到达到冷却管外表面引晶温度，从而使得在多个瓶与冷却管接合的预定时间期间，在细胞样品处形成局部结晶晶种。
换句话说，可以通过使多个瓶与冷却管局部接合达预定时间，直到达到冷却管外表面引晶温度，来启动引晶过程，使得通过细胞样品中的临时的、局部且强烈或集中的冷却点来实现细胞样品的结晶。
可以向具有冷却管外表面引晶温度的冷却管供应制冷剂，使得所有细胞样品基本上同时结晶。
冷却管外表面引晶温度可以是-130℃至-200℃。根据另一实施例，冷却管外表面引晶温度可以是-140℃至-190℃，例如-180℃。
多个瓶可以相对于支撑件移动，以与冷却管接合。
引晶温度可以接近细胞样品的凝固温度。本文所使用的术语“接近凝固温度”是指在凝固温度之下偏差不超过4K的温度。
当将冷却室冷却到引晶温度时，瓶可以与冷却管脱离接合。
当在多个瓶中引晶被诱导时，瓶与冷却管脱离接合。
随后，将冷却管冷却至最终温度，从而可以除去细胞样品的潜热。
可以通过耗散来除去潜热。特别地，通过控制冷却室内的气态制冷剂流的速度和温度来除去潜热。
最终温度可以是-120℃至-190℃。根据另一实施例，最终温度可以是-125℃至-190℃，例如-180℃。
总结本发明的发现，下列实施例是优选的：
实施例1：用于冷冻保存多个细胞样品的设备，包括：
冷却室，
冷却装置，冷却装置包括构造成对所述冷却室内部进行冷却的装置，其中，所述冷却装置还包括冷却管，所述冷却管与所述构造成对所述冷却室内部进行冷却的装置分开，并且所述冷却管设置在所述冷却室中，其中，所述冷却装置构造成提供通过所述冷却管的制冷剂流，和
用于支撑用于存储细胞样品的多个瓶的支撑件，其中，所述支撑件能够相对于所述冷却管移动，使得所述多个瓶能够与所述冷却管接合。
实施例2：根据实施例1所述的设备，其中，所述支撑件能够移动，使得所述多个瓶可以在所述瓶的预定且可调节的高度处与所述冷却管接合。
实施例3：根据实施例2所述的设备，其中，所述高度对应于所述细胞样品的液面。
实施例4：根据实施例1至3中任一项所述的设备，其中，所述冷却管彼此平行地设置。
实施例5：根据实施例1至4中任一项所述的设备，其中，所述冷却管彼此均匀地间隔开。
实施例6：根据实施例4或5所述的设备，其中，所述支撑件包括用于接收所述多个瓶的多个隔室，其中，所述隔室设置成使得所述多个瓶可以设置在所述冷却管之间。
实施例7：根据实施例6所述的设备，其中，所述隔室设置成彼此平行地延伸的线。
实施例8：根据实施例6或7所述的设备，其中，所述冷却管和所述隔室彼此平行设置。
实施例9：根据实施例6至8中任一项所述的设备，其中，所述隔室可以相对于所述支撑件移动，使得所述多个瓶中的每个可以与所述冷却管的至少一个单独接合。
实施例10：根据实施例9所述的设备，其中，所述隔室可以在所述支撑件中移动。
实施例11：根据实施例6至10中任一项所述的设备，其中，所述隔室适于固定所述多个瓶。
实施例12：根据实施例6至11中任一项所述的设备，其中，所述隔室形成为使得所述多个瓶可以与所述冷却管直接接合。
实施例13：根据实施例1至12中任一项所述的设备，其中，所述支撑件可以在轨道上移动。
实施例14：根据实施例1至13中任一项所述的设备，其中，所述冷却装置包括环形管部分，其中，所述冷却管连接到所述环形管部分。
实施例15：根据实施例14所述的设备，其中，所述环形管部分围绕所述冷却管，其中，所述冷却管包括连接到所述环形管部分的端部。
实施例16：根据实施例14或15所述的设备，其中，所述环形管部分包括用于供应制冷剂的入口。
实施例17：根据实施例16所述的设备，其中，所述环形管部分被分成区段，其中，每个区段与至少一个入口相关联。
实施例18：根据实施例17所述的设备，其中，所述环形管部分通过分隔壁分隔成所述区段。
实施例19：根据实施例17或18所述的设备，其中，所述区段适于允许通过冷却管的基本上相同的制冷剂流。
实施例20：根据实施例16至19中任一项所述的设备，其中，所述入口彼此均匀地间隔开。
实施例21：根据实施例14至20中任一项所述的设备，其中，所述环形管部分的内径大于所述冷却管的内径。
实施例22：根据实施例1至21中任一项所述的设备，其中，所述冷却装置适于提供通过所述冷却管的足够的制冷剂流，使得所述冷却管在预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。
实施例23：根据实施例22所述的设备，其中，所述冷却装置适于提供从所述冷却管的底部到顶部的制冷剂流，直到在所述预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。
实施例24：根据实施例1至23中任一项所述的设备，其中，所述冷却室是圆筒形的。
实施例25：根据实施例1至24中任一项所述的设备，还包括内部壳体和容纳所述内部壳体的外部壳体，所述冷却室位于所述内部壳体中。
实施例26：根据实施例25所述的设备，其中，所述构造成对所述冷却室内部进行冷却的装置为用于喷射对所述冷却室内部进行冷却的制冷剂的喷嘴或包括用于喷射对所述冷却室内部进行冷却的制冷剂的喷嘴。
实施例27：根据实施例26所述的设备，其中，所述喷嘴设置在所述内部壳体和所述外部壳体之间的空间中。
实施例28：根据实施例27所述的设备，其中，所述内部壳体包括下侧部和顶侧部，其中，所述下侧部和所述顶侧部包括孔。
实施例29：根据实施例28所述的设备，其中，所述下侧部和所述顶侧部包括穿孔板，其中，所述穿孔板包括所述孔。
实施例30：根据实施例29所述的设备，其中，所述穿孔板具有5％至15％的穿孔率。
实施例30：根据实施例28至30中任一项所述的设备，还包括设置在所述内部壳体的所述顶侧部和所述外部壳体之间的风扇。
实施例32：根据实施例27至31中任一项所述的设备，其中，所述冷却装置包括入口和分配管，所述入口位于所述内部壳体和所述外部壳体之间的空间中，所述分配管将所述入口连接到所述喷嘴。
实施例32：根据实施例32所述的设备，其中，所述喷嘴均匀地分布在所述内部壳体和所述外部壳体之间的空间中。
实施例34：根据实施例33所述的设备，其中，所述喷嘴位于公共平面内。
实施例35：根据实施例33或34所述的设备，其中，所述入口位于所述冷却室的中心轴线上。
实施例36：根据实施例25至35中任一项所述的设备，还包括设置在所述内部壳体和所述外部壳体之间的中间壳体，其中，所述中间壳体包括制冷剂的出口，其中，所述外部壳体包括制冷剂的出口，其中，所述中间壳体的所述出口和所述外部壳体的所述出口彼此连接。
实施例37：根据实施例36所述的设备，其中，所述中间壳体包括下侧部和顶侧部，其中，所述中间壳体的所述出口位于中间壳体的下侧部，其中，所述外部壳体包括下侧部和顶侧部，其中，所述外部壳体的所述出口位于外部壳体的顶侧部。
实施例38：根据实施例1至37中任一项所述的设备，其中，所述支撑件适于将所述多个瓶支撑在公共平面上。
实施例39：根据实施例38所述的设备，其中，所述冷却室适于设置成使得公共平面垂直于重力方向。
实施例40：根据实施例1至39中任一项所述的设备，其中，所述冷却装置适于向所述冷却管供应液态制冷剂，使得通过所述瓶与所述冷却管的接合来启动所述瓶中的所述细胞样品的引晶过程。
实施例41：根据实施例1至39中任一项所述的设备，其中，所述支撑件适于接收至少100个瓶。
实施例42：根据实施例1至41中任一项所述的设备，其中，所述支撑件适于接收瓶，每个瓶适于存储具有10ml至250ml体积的细胞样品。
实施例43：使用根据实施例1至42中任一项所述的设备冷冻保存多个细胞样品的方法，包括以下步骤：
-将冷却室冷却到温度保持点，
-在多个瓶中提供液态的细胞样品，
-用所述多个瓶装载支撑件，
-为了多个瓶中的温度同步性，将冷却室保持在温度保持点，
-将冷却室冷却到瓶中的引晶温度，
-供应制冷剂通过冷却管达预冷却时间，使得在达到引晶温度之前所述冷却管达到冷却管外表面引晶温度，
-当满足冷却管外表面引晶温度和引晶温度时，使支撑件相对于冷却管移动，使得多个瓶与冷却管接合达预定时间，以在细胞样品中启动引晶过程，
-将冷却室冷却到最终温度，和
-在达到最终温度的时间内受控地除去潜热。
实施例44：根据实施例43所述的方法，其中，通过所述多个瓶与所述冷却管局部接合达预定时间来启动所述引晶过程，从而局部诱导所述细胞样品的结晶。
实施例45：根据实施例43或44所述的方法，其中，将所述制冷剂供应通过所述冷却管，直到达到所述冷却管外表面引晶温度，使得在所述多个瓶与所述冷却管接合的所述预定时间期间，在所述细胞样品处形成局部结晶晶种。
实施例46：根据实施例43至45中任一项所述的方法，其中，将所述引晶温度和/或最终温度定义为所述细胞样品中的温度。
实施例47：根据实施例43至46中任一项所述的方法，其中，所述预定时间是0.5分钟至3.0分钟，特别地是1.5分钟至2.5分钟，其中，所述预冷却时间是0.1分钟至5.0分钟。
实施例48：根据实施例43至47中任一项所述的方法，其中，供应制冷剂通过具有冷却管外表面引晶温度的所述冷却管，使得所有细胞样品基本上同时结晶。
实施例49：根据实施例43或48中任一项所述的方法，其中，通过所述多个瓶与所述冷却管的局部接合来启动引晶过程，使得局部诱导所述细胞样品的结晶。
实施例50：根据实施例43至49中任一项所述的方法，其中，所述温度保持点是-2℃至10℃，特别地是0℃至5℃，其中，所述引晶温度是从所述细胞样品的凝固点至-15℃，其中，所述最终温度是-120℃至-190℃，其中，所述冷却管外表面引晶温度是-130℃至-200℃，特别地是-140℃至-190℃。
实施例51：根据实施例43至50中任一项所述的方法，其中，所述冷却管外表面引晶温度被确定为使得所述制冷剂在被供应通过所述冷却管之后呈液态。
实施例52：根据实施例43至51中任一项所述的方法，其中，所述多个瓶相对于所述支撑件移动，以与所述冷却管接合。
实施例53：根据实施例43至52中任一项所述的方法，其中，当在所述多个瓶中引晶被诱导时，所述瓶与所述冷却管脱离接合。
实施例54：根据实施例43至53中任一项所述的方法，其中，通过耗散除去所述潜热。
实施例55：根据实施例43至54中任一项所述的方法，其中，通过控制所述冷却室中的气态制冷剂流的速度和温度来除去所述潜热。
附图说明
本发明的其它特征和实施例将在随后对实施例的描述中(特别地结合从属权利要求)更详细地公开。其中，如技术人员将认识到的那样，各特征可以以孤立的方式实现和以任意可行的组合来实现。本发明的范围不受实施例限制。实施例在附图中示意性地描绘。其中，在这些附图中相同的附图标记表示相同或功能可比的元件。
图中：
图1示出用于冷冻保存多个细胞样品的设备，
图2示出该设备的剖视图，
图3示出冷却管的平面图，
图4示出支撑件的操作，以及
图5示出支撑件的另一操作。
具体实施方式
图1示出用于冷冻保存多个细胞样品的设备。该设备100包括冷却室102、冷却装置104和支撑件106。冷却室102为筒形。特别地，冷却室102是圆筒形的。设备100还包括内部壳体108、容纳该内部壳体108的外部壳体110以及设置在内部壳体108和外部壳体110之间的中间壳体112，其中冷却室102位于内部壳体108中，或内部壳体108限定所述冷却室102。内部壳体108、外部壳体110和中间壳体112可以构造成形成包括上部116和下部118的模块化壳体组件114。换句话说，内部壳体108、外部壳体110和中间壳体112中的每一个被分成构成上部116和下部118的两个部分，如下面将更详细地说明的那样。上部116设置在下部118的顶部上。外部壳体110容纳内部壳体108，使得在内部壳体108和外部壳体110之间形成空间120。更具体地，在内部壳体108和中间壳体112之间形成空间120。
内部壳体108包括下侧部122和顶侧部124。下侧部122和顶侧部124包括孔口126。更具体地，下侧部122和顶侧部124包括穿孔板128。所述穿孔板128包括所述孔口126。自不待言，下侧部122和顶侧部124可以设计成穿孔板128。穿孔板128的穿孔率为5％至15％，例如为10％。穿孔率可以在板半径上变化。另外，在下侧部122处的穿孔板128的穿孔率可以与顶侧部124处的穿孔板128的穿孔率不同。孔口126可以包括圆形横截面积。通过所述孔口126，空间120与冷却室102流体连通。中间壳体112包括下侧部130和顶侧部132。中间壳体还包括出口134。中间壳体112的出口134位于下侧部130中。外部壳体110包括下侧部136和顶侧部138。外部壳体110还包括出口140。外部壳体110的出口140位于顶侧部138中。中间壳体112的出口134和外部壳体110的出口140彼此连接。例如，出口134和出口140通过在外部壳体110和中间壳体112之间形成的通道142、空间等彼此连接。设备100还包括风扇144。风扇144设置在内部壳体108的顶侧部124和外部壳体110之间。
图2示出设备100的剖视图。冷却装置104适于对冷却室102的内部进行冷却。因此，冷却装置104包括构造成对冷却室102内部进行冷却的装置，如将在下面更加详细说明的那样。冷却装置104还包括冷却管146，冷却管146与构造成对冷却室102内部进行冷却的装置分开。冷却管146设置在冷却室102中。冷却装置104构造成提供通过冷却管146的制冷剂流。冷却管146彼此平行设置。另外，冷却管146彼此均匀地间隔开。冷却装置104还包括环形管部分148。冷却管146连接到环形管部分148。特别地，环形管部分148围绕冷却管146。冷却装置104还包括喷嘴150，该喷嘴150用于将制冷剂注入冷却室中，以冷却冷却室102的内部。因此，喷嘴150用作对冷却室102内部进行冷却的装置。因此，喷嘴150设置在内部壳体108和外部壳体110之间的空间120中。冷却装置104还包括位于壳体组件114外部的入口152和将入口152连接到喷嘴150的分配管154。如图2所示，喷嘴150均匀地分布在内部壳体108和外部壳体110之间的空间120中。例如，分配管154从入口152径向向外延伸，并且主要在壳体组件114下方延伸。例如，分配管154以星形的方式围绕入口152设置。另外，分配管154在壳体组件114外侧侧向地向上延伸，并且穿过下部118延伸到空间120中，以连接到喷嘴150。应当注意，分配管154的长度相等，使得从喷嘴150到入口152的距离相等。仅作为示例，图2示出10个喷嘴150，其以均匀的角位置围绕入口152设置。自不待言，根据设备100的相应的几何形状，可以设置多于或少于10个喷嘴150，例如8个、12个、20个。喷嘴150位于公共平面156上。入口152位于冷却室102的中心轴线158上。中心轴线158对应于圆筒形冷却室102的圆筒轴线。
图3示出冷却装置104的一部分的平面图。特别地，图3示出冷却管146和环形管部分148。如图3所示，冷却管146包括连接到环形管部分148的端部160。另外，环形管部分148包括用于将制冷剂供应到环形管部分148中的入口162。环形管部分148被分成区段164。各区段164与入口162的至少一个相关联。特别地，环形管部分148通过分隔壁166分隔成区段164。区段164适于允许通过冷却管146的基本上足够的制冷剂流。入口162彼此均匀地间隔开。另外，环形管部分148的内径大于冷却管146的内径。利用这种结构，冷却装置104适于提供从底部到顶部的制冷剂流，如下面更加详细说明的那样。特别地，图3示出20个冷却管146和通过三个分隔壁166彼此分隔开的四个区段164。通过这些区段164，制冷剂均匀地分布通过冷却管146。更特别地，相对于图3的图示来说在左侧和右侧示出的区段164向5个冷却管146供应制冷剂，而内部区段164向4个冷却管供应制冷剂。
如图1和2所示，支撑件106适于支撑用于存储细胞样品的多个瓶168。支撑件106包括用于接收多个瓶168的多个隔室170。例如，支撑件106包括用于接收100个、200个甚至更多瓶168的100个、200个甚至更多隔室170。换句话说，每个隔室170适于接收一个瓶168。隔室170设置成使得多个瓶168可以设置在冷却管146之间。如图1和2所示，隔室170设置成彼此平行地延伸的线172。另外，冷却管146和隔室170彼此平行设置。另外，隔室170可以相对于支撑件106移动。特别地，隔室170可以在支撑件106中移动，如下面将更加详细描述的那样。隔室170适于固定多个瓶168。例如，隔室170包括构造成将瓶168牢固地保持在其位置的弹性夹具等。
图4示出处于第一操作状态的支撑件106，图5示出处于第二操作状态的支撑件106。如图4和5所示，支撑件106可以相对于冷却管146移动，使得多个瓶168可以与冷却管146接合，如图5所示。例如，支撑件106可以在轨道174上移动。隔室170形成为使得多个瓶168可以与冷却管146直接接合。换句话说，隔室170形成为使得冷却管146可以与瓶168直接接合，而在接合期间，在冷却管146和瓶168之间没有任何其它结构构件。特别地，支撑件106可以移动，使得多个瓶168可以在瓶168的预定高度176处与冷却管146接合。高度176对应于存储在瓶168中的细胞样品180的液面178，并且定义为沿着瓶168沿其延伸的纵向方向的位置。支撑件106可被调节以改变在瓶168的高度176上的接合点。支撑件106适于将多个瓶168支撑在公共平面182上。冷却室102适于被设置成使得公共平面182垂直于重力方向。冷却装置104适于向冷却管146供应液态制冷剂，使得通过瓶与冷却管146的接合来启动细胞样品和瓶168的引晶过程。
在下文中，将描述使用设备100冷冻保存多个细胞样品180的方法。基本上，在该方法开始时，在多个瓶168中提供液态的细胞样品180。冷却室102被冷却到温度保持点。温度保持点接近但高于细胞样品180的凝固温度。为了将冷却室102冷却到温度保持点，冷却装置104从入口152通过分配管154向喷嘴150供应诸如液氮的制冷剂。喷嘴150构造成将制冷剂喷射或注射到空间120中。另外，风扇144工作。从喷嘴150排出的制冷剂沿着内部壳体108的下侧部122流动(如图1中的箭头184所示)，并且可以通过内部壳体108的下侧部122处的穿孔板128的孔口126进入冷却室102的内部。
然后，以多个瓶168装载支撑件106。在冷却室102的内部，制冷剂从设置在支撑件106中的瓶168和细胞样品180除去热量。由此，制冷剂被加热，并且由于对流效应和以及被风扇144的抽吸，而从冷却室102的底部流到顶部，如箭头186所示。被加热的制冷剂通过在内部壳体108的顶侧部124处的穿孔板128的孔口126离开冷却室102并再次进入空间120。风扇144沿着侧向和向下的方向将加热的制冷剂吹向中间壳体112的出口134，如箭头188、190所示。制冷剂然后从中间壳体112的出口134在通道142中流到外部壳体110的出口140，如箭头192所示，并通过外部壳体110的出口140从外部壳体110排出。
冷却室102保持在温度保持点，以允许多个瓶168中的温度同步。换句话说，冷却室102保持在温度保持点，直到所有瓶168具有相同的温度。温度保持点是0℃至5℃，例如2℃。然后，冷却室102被冷却到瓶168中的引晶温度。冷却室102通过冷却装置104向喷嘴150和冷却室102的内部供应更多的制冷剂而进一步冷却到引晶温度。引晶温度是从细胞样品的凝固点到-15℃，例如-5℃。同时，将制冷剂供应通过冷却管146达预冷却时间，使得在达到引晶温度之前冷却管146达到冷却管外表面引晶温度。制冷剂从环形管148供给到冷却管146，而环形管148又通过入口162供给制冷剂。预冷却时间是0.1分钟至5.0分钟，例如3.0分钟。冷却管外表面引晶温度是-130℃至-200℃，特别地是-140℃至-190℃，例如-150℃。冷却装置提供通过冷却管146从底部到顶部的制冷剂流，直到在预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。
当满足冷却管外表面引晶温度和引晶温度，即冷却管外表面引晶温度对应于引晶温度时，支撑件106相对于冷却管146移动，使得多个瓶168与冷却管146接合达预定时间，以在细胞样品180中启动引晶过程。特别地，支撑件106可以移动，使得多个瓶168可以在瓶168的对应于细胞样品180的液面178的预定高度176处与冷却管146接合。该预定时间是0.5分钟至3.0分钟，特别地是1.5分钟至2.5分钟，例如2.0分钟。多个瓶168相对于支撑件106移动，以与冷却管146接合。更具体地，其中设置有瓶168的隔室170在支撑件106中移动，以允许一种微调，并使每个瓶168与冷却管146单独接合。通过多个瓶168与冷却管146局部接合达预定时间来启动引晶过程，从而局部诱导细胞样品180的结晶。换句话说，通过多个瓶168与冷却管146局部接合达预定时间，直到达到冷却管外表面引晶温度，来启动引晶过程，从而使得通过细胞样品中的临时的、局部的且强烈或集中的冷却点来实现细胞样品180的结晶。将制冷剂供应通过冷却管146直到达到冷却管外表面引晶温度，使得在多个瓶168与冷却管146接合的预定时间期间，在细胞样品180处形成局部结晶晶种。特别地，将制冷剂供应通过具有冷却管外表面引晶温度的冷却管146，使得所有细胞样品180基本上同时结晶。
当在多个瓶168中引晶已经被诱导时，瓶168与冷却管146脱离接合。进一步地，将冷却室102冷却到最终温度。最终温度是-120℃至-190℃，例如-185℃。从细胞样品180中受控地除去潜热，直到达到最终温度。通过控制冷却室102中的气态制冷剂流的速度和温度来除去潜热。通过风扇144的操作产生该气态制冷剂流。通过耗散除去潜热。
附图标记列表
100 设备
102 冷却室
104 冷却装置
106 支撑件
108 内部壳体
110 外部壳体
112 中间壳体
114 壳体组件
116 上部
118 下部
120 空间
122 下侧部
124 顶侧部
126 孔口
128 穿孔板
130 下侧部
132 顶侧部
134 出口
136 下侧部
138 顶侧部
140 出口
142 通道
144 风扇
146 冷却管
148 环形管部分
150 喷嘴
152 入口
154 分配管
156 公共平面
158 中心轴线
160 端部
162 入口
164 区段
166 分隔壁
168 瓶
170 隔室
172 线
174 轨道
176 高度
178 液面
180 细胞样品
182 公共平面
184 箭头
186 箭头
188 箭头
190 箭头
192 箭头

Claims (19)

1.一种用于冷冻保存多个细胞样品(180)的设备(100)，所述设备包括：
冷却室(102)，
冷却装置(104)，所述冷却装置包括构造成对冷却室(102)内部进行冷却的装置，其中，所述冷却装置(104)还包括冷却管(146)，所述冷却管(146)与构造成对所述冷却室(102)内部进行冷却的装置分开，并且所述冷却管设置在所述冷却室(102)中，其中，所述冷却装置(104)构造成提供通过所述冷却管(146)的制冷剂流，以及
支撑件(106)，所述支撑件(106)用于支撑用于存储细胞样品(180)的多个瓶(168)，其中，所述支撑件(106)能够相对于所述冷却管(146)移动，使得所述多个瓶(168)能够与所述冷却管(146)接合。
2.根据权利要求1所述的设备(100)，其中，所述支撑件(106)能够移动，使得所述多个瓶(168)能够在所述瓶(168)的预定的且可调节的高度(176)处与所述冷却管(146)接合，其中，所述高度(176)对应于所述细胞样品(180)的液面(178)。
3.根据权利要求1或2所述的设备(100)，其中，所述冷却管(146)彼此平行地设置。
4.根据权利要求1或2所述的设备(100)，其中，所述支撑件(106)包括用于接收所述多个瓶(168)的多个隔室(170)，其中，所述冷却管(146)和所述隔室(170)彼此平行地设置，其中，所述隔室(170)设置成使得所述多个瓶(168)能够设置在所述冷却管(146)之间，其中，所述隔室(170)能够相对于所述支撑件(106)移动，使得所述多个瓶(168)中的每个能够与所述冷却管(146)中的至少一个单独接合。
5.根据权利要求1或2所述的设备(100)，其中，所述冷却装置(104)适于提供通过所述冷却管(146)的足够的制冷剂流，使得所述冷却管(146)在预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。
6.根据权利要求5所述的设备(100)，其中，所述冷却装置(104)适于提供从所述冷却管(146)的底部到顶部的制冷剂流，直到在所述预冷却时间内达到冷却管外表面引晶温度。
7.根据权利要求1或2所述的设备(100)，还包括内部壳体(108)和容纳所述内部壳体(108)的外部壳体(110)，所述冷却室(102)位于所述内部壳体(108)中，其中，所述内部壳体(108)包括下侧部(122)和顶侧部(124)，其中，所述下侧部(122)和所述顶侧部(124)包括孔口(126)，其中，所述下侧部(122)和所述顶侧部(124)包括穿孔板(128)，其中，所述穿孔板(128)包括所述孔口(126)。
8.根据权利要求7所述的设备(100)，其中，所述穿孔板(128)的穿孔率为5％至15％。
9.根据权利要求1或2所述的设备(100)，其中，所述支撑件(106)适于将所述多个瓶(168)支撑在公共平面(182)中。
10.使用根据权利要求1或2所述的设备(100)冷冻保存多个细胞样品(180)的方法，包括以下步骤：
-将所述冷却室冷却到温度保持点，
-在多个瓶(168)中提供液态的细胞样品(180)，
-用所述多个瓶(168)装载支撑件(106)，
-将所述冷却室(102)保持在温度保持点，以允许所述多个瓶(168)中的温度同步，
-将所述冷却室冷却到所述瓶(168)中的引晶温度，
-供应制冷剂通过所述冷却管(146)达预冷却时间，使得在达到所述引晶温度之前所述冷却管(146)达到冷却管外表面引晶温度，
-当满足所述冷却管外表面引晶温度和所述引晶温度时，使所述支撑件(106)相对于所述冷却管(146)移动，使得所述多个瓶(168)与所述冷却管(146)接合达预定时间，以在所述细胞样品(180)中启动引晶过程，
-将所述冷却室(102)冷却到最终温度，和
-受控地除去潜热，直到达到所述最终温度。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，通过所述多个瓶(168)与所述冷却管(146)局部接合达预定时间来启动所述引晶过程，从而局部诱导所述细胞样品(180)的结晶。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，供应所述制冷剂通过所述冷却管(146)，直到达到所述冷却管外表面引晶温度，使得在所述多个瓶(168)与所述冷却管(146)接合的所述预定时间期间，在所述细胞样品处形成局部结晶晶种。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述预定时间是0.5分钟至3.0分钟，其中，所述预冷却时间是0.1分钟至5.0分钟。
14.根据权利要求10或11所述的方法，其中，供应制冷剂通过具有所述冷却管外表面引晶温度的所述冷却管(146)，使得所有所述细胞样品(180)基本上同时结晶。
15.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述引晶温度为所述细胞样品的凝固点至-15℃，其中，所述最终温度为-120℃至-190℃，其中，所述冷却管外表面引晶温度是-130℃至-200℃。
16.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述多个瓶(168)相对于所述支撑件移动，以与所述冷却管(146)接合。
17.根据权利要求10或11所述的方法，其中，当在多个瓶(168)中的引晶被诱导时，所述瓶(168)与所述冷却管(146)脱离接合。
18.根据权利要求10或11所述的方法，其中，通过控制所述冷却室(102)中的气态制冷剂流的速度和温度来除去所述潜热。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述温度保持点为0℃至5℃。
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