KR20100118225A - 버들송이 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 버들송이 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 버들송이 균사체를 액체 배양하여 생산한 배양액을 활성성분으로 0.001 - 30.0중량%, 바람직하게는 0.01 - 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 슬리밍효과, 여드름 방지효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과가 우수한 기능성 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

버들송이 추출물, 항노화용 화장료, 주름 개선효과, 지방분화 저해효과, 슬리밍효과, 모발손상방지효과, 탈모방지 및 육모 효과, 여드름 방지효과, 피부 외용제

Description

버들송이 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물{A skin-care agent containing extract of Agrocybe cylindracea}

본 발명은 버들송이 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 또한, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화 는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응이 일어나고, 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부가 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 활성산소종 뿐만 아니라 MMP(Matrix metallopretease)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 노출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 MMP 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다.

다음은 비만세포 분화저해에 관한 내용이다. 인체 내에는 약 200억 개나 되는 지방세포가 존재하고 있으며, 이는 포유류의 생체 내에서 에너지를 축적하거나 방출하는 역할을 담당하고 있다. 이 세포 내에서는 에너지의 축적과 방출에 대한 복잡한 조절 원리가 존재하며, 에너지의 수요보다 공급이 월등히 많을 경우에는 지방세포 내에 중성지방으로 저장되었다가 에너지가 고갈되었을 때 다시 유리 지방산과 포도당으로 분해되어 사용된다. 비만은 이 과정의 불균형으로 인하여 과도한 에너지의 축적이 일어났을 때 발생하는 것으로, 지방세포의 크기가 커지거나 그 수가 증가하는 현상에 기인하는 것으로 보고 있다. 현대인의 약 30~40%가 비만으로 알려져 있으며 고혈압, 고지혈증, 동맥 경화증, 심장질환, 당뇨병 등의 다양한 성인병을 수반할 수 있으므로 비만은 사회적 관심의 대상으로 대두되고 있다. 그러나, 이는 비단 건강의 측면에서뿐만 아니라 여성의 사회적 지위 향상과 경제적 독립 등의 사회적인 환경 변화에 의해 삶의 질을 높이고자 하는 욕구가 증가하게 됨으로 미의 관점에서 아름다운 몸매에 대한 관심도 또한 급격히 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 이러한 건강 및 미적 관점에서 비만을 개선하기 위한 방법도 다각적인 측면에서 시도되고 있는데, 종래에 알려져 있는 비만 해소방법은 성형수술 외 에너지의 섭취를 저해하거나, 에너지 소비를 증대시킬 목적으로 식이요법, 운동요법, 수술요법, 약물요법 등의 다양한 방법들이 현재 비만 치료를 위해 사용되고 있다. 그러나, 이러한 방법들이 비만을 완전하게 해결할 수는 없을 뿐만 아니라 요요 현상이나 심각한 부작용들이 보고되고 있어 아직은 안전성에 대한 명확한 보장이 없는 실정이다. 또한, 미적 관점에서 비만 해소에는 지방 분해와 더불어 피부에 대한 효능이 부가적으로 요구되므로 상기 요법들의 적용이 모든 필요충분 조건을 충족하기에는 아직 미비한 부분이 많다고 할 수 있다. 현재 많은 여성들이 성형수술에 대한 심리적 부담감, 비용, 부작용 등으로 인해 상대적으로 안전하고 저렴한 제품인 슬 리밍(slimming) 및 안티 셀룰라이트(anti-celullite) 화장품에 대한 요구가 꾸준히 높아지고 있다. 하지만 기존의 슬리밍 바디 케어 제품들은 식욕억제 약물을 사용하거나 이뇨제를 사용하는 등의 일시적인 효과를 나타내고 어지러움, 구토, 불면증, 환각 증세 등의 부작용이 있는 단점이 있었다. 또한 종래에 알려진 카페인이나 테오필린 같은 메틸잔틴계 지방 분해 촉진 물질 역시 중독성 물질이라는 인식과 기관지 확장과 월경 전 증후군 현상 악화 등의 부작용이 보고되어 그 안전성에 대한 보장이 없다. 따라서 슬리밍제로서 효과가 우수하며 친자연적인 천연물 소재의 개발이 시급한 상황이다. 따라서, 종래의 물질과 동등하거나 그 이상의 효능을 나타내면서도 인체에 대해서는 좀더 안전한 새로운 물질을 개발해야 할 필요성이 대두되고 있다.

또한, 남성형 탈모증은 남성호르몬 의존적이어서 남성호르몬의 양에 직접적인 관계가 있으며, 이에 따라 최근 남성호르몬 활성억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고되고 있다. 한편, 남성호르몬의 분비상승에 의해 피지선의 기능이 활발해지면 생성된 과잉 피지가 모낭벽의 과각화로 인하여 모낭 내에 정체되면서 생기는 면포가 여드름의 초기단계이다. 남성호르몬에 의한 탈모 및 여드름의 기전을 설명하면, 5-알파-리덕타아제(5-α-Reductase)는 피지선, 모낭, 전립선, 부고환 등의 남성 호르몬 반응성 조직에 존재하는 남성 호르몬들 중 하나로서, 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로 테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 대사시키는데 관여하는 효소이며, 그 전환에는 NADPH를 필요로 한다. 또한, 테스토스테론은 남성 성충동, 골격근 증가, 남성외부생식기, 음낭성장, 정자형성 등에 관여하고, 디하이드로테스토스테론은 여드름, 피지 증가, 탈모 및 전립선 비대증 등의 해당 조직에 관여한다. 특히, 사춘기 이후에 남성 호르몬의 과량 분비는 여드름과 탈모를 유발하는데, 5-알파-리덕타아제에 의하여 생성되는 남성 호르몬의 활성형태인 디하이드로테스토스테론의 과량 생성을 막기 위해 5-알파-리덕타아제 억제제를 사용하여 탈모방지 및 여드름 방지제를 개발하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

이러한 피부의 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.

본 발명은 고등균류인 버섯의 액체발효를 통해 생산된 배양액에 대해 피부 외용제의 원료로서의 효능을 확인하고, 그 사용 방법을 개발하고, 이 원료를 사용함으로써 우수한 기능성을 갖는 피부 외용제를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 화장료를 포함하는 피부 외용제에 적용 가능하고 피부 외용제에 함유시 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 버섯 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 화장료를 포함하는 피부 외용제에 적용 가능하고 지방세포 분화저해효과 및 슬리밍 효과가 탁월하며 장기간 사용해도 안전성이 높은 버섯 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 화장료를 포함하는 피부 외용제에 적용시 우수한 모발손상방지효과, 탈모 방지효과, 육모효과 및 여드름 방지효과를 갖는 버섯 추출물을 제공하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 고등균류인 버섯의 액체배양 추출액에 대하여 화장품 또는 피부 외용제로의 응용 가능성을 연구한 결과, 주름버섯목 소똥버섯과 볏집버섯속에 속하는 식용버섯인 버들송이를 선정하고 균사체 액 체 배양을 통해 생산한 배양여액을 제조하여, 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 지방분화 저해효과, 슬리밍효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 측정한 결과, 그 효과가 우수하여 화장료를 비롯한 피부 외용제로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

버들송이(Agrocybe cylindracea (Bring.) Sing)버섯은 분류학적으로 주름버섯 목(Agaricales), 소똥버섯과(Bolbitiacece), 볏짚버섯속(Agrocybe)에 속하며 활엽수의 고사목에서 봄부터 가을까지 자생하는 식용버섯이다. 버들송이 버섯의 형태적 특징을 보면 자실체의 갓직경은 3-10cm이고, 대의 길이는 5-15cm이다. 자실체의 표면은 성숙 후 주름이 생기며 갓의 끝부분이 간혹 갈라지기도 한다. 주름살(gills)은 처음에 흰색이나 자실체가 성숙하면서 포자가 비산할때는 주름살의 색택이 담황색이나 다갈색으로 되며 주름살의 간격은 약간 빽빽하고 턱받이가 있으며, 자실체의 구성은 갓, 대, 주름살, 턱받이로 구성되어 있다. 버들송이 버섯은 병재배를 통한 인공재배 방법이 개발되어 양산되고 있으며, 면역증강활성, 혈당저하 활성을 갖는 다당체, 또는 단백다당체등이 분리 및 보고되고 있다.

본 발명에 따른 버들송이 균사체 배양 추출물은 활성산소 소거효과와 MMP 저해 효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

또한, 버들송이 균사체 배양 추출물은 지방전구세포의 분화를 억제하고, 중 성지방을 분해하는 슬리밍 효과를 나타내었다.

또한, 버들송이 균사체 배양 추출물은 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화 및 아토피 개선효과를 나타내었다.

또한, 버들송이 균사체 배양 추출물은 우수한 모발손상 및 탈모방지 효과와 여드름방지 효과를 갖는 여드름균 항균활성과 5-알파-리덕타아제 억제 효과를 나타내었다.

따라서, 이러한 버들송이 균사체 배양 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과, 슬리밍, 보습, 모발손상 방지, 탈모 방지, 여드름방지, 아토피 개선효과, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 가짐을 알 수 있다.

본 발명은 고등균류인 버들송이 균사체를 특정 배지조건(포도당 3%, 효모 추출물 1.0%, pH 5.5, 온도 25℃, 회전수 150rpm, 통기량 2vvm)에서 액체배양하여 얻어진 발효 여액을 특징으로 하는 버들송이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 버들송이 추출물의 함량이 피부 외용제 조성물 전체에 대해서 0.001-30.0중량%인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0 중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 피부 외용제 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 연고, 에센스, 샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어무스, 립스틱, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 버들송이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 피부 외용제 조성물이 화장료 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 한다.

버들송이 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 캡슐제, 액상제, 연고제, 도포제, 첩부제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 이용한 서방화 제제 등의 약학 조성물로 제제화할 수 있으며, 약리학적으로 허용되는 기제, 운반제, 부형제, 결합제(예: 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스), 분쇄제(예: 한천, 전분, 벨라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨), 윤활제(예: 스테아린산 마그네슘, 활석, 수첨 식물유) 및 착색제 등을 포함한다. 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등을 사용한다.

상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.

이와 같이 제조되는 약학 조성물은 증상에 따라 일일 1회 내지 수회 피부에 적용할 수 있으며 증상의 호전 정도에 따라 적용을 조절할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~10㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 버들송이를 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 버들송이 추출물을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 버들송이 추출물은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 로션, 크림, 에센스, 샴푸, 클렌저, 린스, 헤어컨디셔너 등으로 제형화할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 버들송이 추출물 제조

실험에 사용된 버들송이(Agrocybe cylindracea) 균주는 신선한 자실체로부터 직접 분리하였으며, 버들송이 균사체를 효모-맥아즙 한천배지(효모 추출물 3g, 맥아즙 3g, 포도당 10g, 펩톤 5g, 한천 20g, 증류수 1ℓ)가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 자란 균사체를 무균적으로 균질화하여 이를 포도당 3%, 효모 추출물 1.0%를 함유한 단순 복합배지로 하며 pH 5.5로 조정한 액체배지에 5%(v/v)되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 25℃, 회전수 150rpm, 통기량 2vvm의 조건으로 8일간 배양하였다.

배양완료 후, 균사체를 원심분리를 통해 제거한 배양여액을 종이필터 (watman no.4)로 여과하여 여액을 본 발명의 버들송이 추출물로 사용하였다.

실시예 2: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교시료로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가하였다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소가 생성된다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560㎚에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정하였다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------- 2.4㎖

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1㎖

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1㎖

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1㎖

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1㎖

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1㎖

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1㎖

① 바이엘병에 상기 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1㎖을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치하였다.

② 상기 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간 배양하였다.

③ 그 후 상기 7을 가하여 반응을 정지시키고 560㎚에서의 흡광도 St를 측정하였다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정하였다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 상기 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정하였다.

효과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 1에 나타내었다.

활성산소 소거율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액 효소 반응 후 560㎚ 흡광도

Bt : 공시험용액 효소 반응 후 560㎚ 흡광도

So : 시료용액 효소 무첨가시 반응 전 560㎚ 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응 전 560㎚ 흡광도

표 1과 같이, 버들송이 추출물은 고농도에서 BHT(Butylated hydroxytoluene)와 유사한 항산화력을 나타냄을 확인하였다.

시료명	활성산소 소거율(%)
버들송이 추출물 5중량%	78%
버들송이 추출물 2.5중량%	65%
버들송이 추출물 1중량%	58%
버들송이 추출물 0.1중량%	35%
BHT(Butylated hydroxytoluene) 0.1중량%	77%

실시예 3: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT(Butylated hydroxytoluene)와 같은 항산화제를 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 것이다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560㎚에서 자유라디칼 소거율을 측정하였다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 각각 5중량%, 2.5중량%, 1중량%, 0.1중량% 농도의 버들송이 추출물을 준비하였다. 상기 농도의 추출물을 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560㎚에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 수학식 2로 산출하였다.

자유라디칼 소거활성(%)= {100-(B/A)}X100

A: 본 발명의 버들송이 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 본 발명의 버들송이 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도

표 2와 같이, 버들송이 추출물은 고농도에서 항산화제로 많이 이용되고 있는 BHT(Butylated hydroxytoluene)와 유사한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

시료명	자유라디칼 소거활성(%)
버들송이 추출물 5중량%	78%
버들송이 추출물 2.5중량%	71%
버들송이 추출물 1중량%	66%
버들송이 추출물 0.1중량%	44%
BHT(Butylated hydroxytoluene) 0.1중량%	81%

실시예 4: 세포내 활성산소 소거효과

실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물의 자외선에 의해 세포 내에서 생성되는 활성산소 생성 억제효과 즉, 활성산소 소거효과를 알아보기 위하여 비교샘플로 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 선정하고, 형광물질을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서, 이를 형광측정용 96웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 × 10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후, 각각 1, 0.5, 0.25% 농도로 버들송이 추출물을 처리하였다.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후 HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이 후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후 초기에 활성산소로 산화된 DCF (dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 판독기(Ex;485㎚, Em;530㎚)로 측정하였다. 이후 UVB(20mJ/cm²)를 조사하고 버들송이 추출물 처리 후 형광도를 형광플레이트 판독기(Ex;485㎚, Em;530㎚)로 측정하였다.

표 3과 같이, 버들송이 추출물은 활성산소 소거효과에 비교 시료로 많이 이용되고 있는 EGCG(Epigallocatechin gallate)보다 우수한 활성산소 소거 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

시료명	활성산소 소거효과(%)
버들송이 추출물 1중량%	55
버들송이 추출물 0.5중량%	45
버들송이 추출물 0.25중량%	27
EGCG(Epigallocatechin gallate) 0.01중량%	43

실시예 5: 인비트로 MMP-1 활성저해 실험

MMP-1 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ^TM-콜라겐, 효소(collagenase)는 Molecular probe사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5M Tris-HCl, 1.5M NaCl, 50mM CaCl₂, 2mM 소듐 아자이드, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100㎕에 0.25㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ^TM-콜라겐 20㎕와 버들송이 추출물(1, 0.5, 0.25중량%) 40㎕을 첨가하고 0.5단위(unit)로 희석한 콜라게나제 40㎕을 첨가한다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495㎚, 방출파장 515㎚로 형광값을 측정하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

결과는 표 4에 나타내었으며, 버들송이 추출물 1중량% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성을 69% 억제하였으며, 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수한 것이다.

시료명	인비트로 MMP-1 저해율(%)
버들송이 추출물 1중량%	69
버들송이 추출물 0.5중량%	65
버들송이 추출물 0.25중량%	49
녹차추출물 0.2중량%	66

실시예 6: 자외선 조사 후 버들송이 추출물에 의한 MMP-1 발현억제 평가

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 알칼라인 포스파타제 결합된 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(다이에탄올아민 완충용액 내에 1㎎/㎖ ρ-나이트로페닐인산 함유)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 버들송이 추출물은 1중량%에서 52% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율에 비해 상당히 우수한 결과이다.

시험군	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-
버들송이 추출물 1중량%	52
버들송이 추출물 0.5중량%	39
버들송이 추출물 0.25중량%	26
레티놀	38

실시예 7: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

본 실실예는 실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물 첨가 후 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1)배지에 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 첨가하여 1× 10⁴cell/cm²농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48웰 플레이트에 90% 이상 배양한 후 버들송이 추출물을 1중량%, 0.5중량%, 0.25중량% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과는 표 6과 같이, 버들송이 추출물을 1중량% 처리시 프로콜라겐의 생합성이 24% 촉진되었으며, 이는 세포신호전달 물질인 TGF(Tissue Growth Factor)-β와 유사한 효과였다.

시료명	프로콜라겐 생합성촉진효과(%)
버들송이 추출물 1중량%	24%
버들송이 추출물 0.5중량%	18%
버들송이 추출물 0.25중량%	15%
TGF(Tissue Growth Factor)-β 0.001중량%	26%

실시예 8: 버들송이 추출물의 엘라스틴 생성 촉진 효과

버들송이 추출물의 엘라스틴 생성 촉진 효과를 알아보기 위하여, 사람으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 사람의 섬유 아세포에 상기 실시예 1의 버들송이 추출물을 처리하여 엘라스타제(elastase) 활성 억제효과를 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 사람의 섬유 아세포를 배양용 플라스크에 넣고 약 70~80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이후 버들송이 균사체 배양 추출물을 1일간 처리한 후 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성 정도를 측정하였다[Bieth J: Biochem med., 11, 350-357(1974), Schwartz DE: J.Invest Dermatol., 86, 63-68(1986)]. 즉, 엘라스타제의 기질인 Suc-(Ala)3 NA(N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide)를 이용하여, NA가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여, 엘라스타제의 활성도를 측정하였다. 이때 버들송이 추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.

하기 표 7과 같이, 버들송이 추출물은 대조군에 비하여 엘라스타제의 활성을 뛰어나게 억제함을 알 수 있으며, 활성 억제율은 버들송이 추출물의 농도가 증가할수록 높아짐을 확인하였다. 이를 통하여 버들송이 추출물이 우수한 노화 방지 및 탄력 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.

시료명	엘라스타제 활성 억제율 (%)
버들송이 추출물 1중량%	24%
버들송이 추출물 0.5중량%	18%
버들송이 추출물 0.25중량%	11%
대조군	0%

실시예 9: 지방세포 분화 억제 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물의 지방세포 분화저해 효과는 쥐 세포주 3T3-L1으로 연구하였다. 10 %의 송아지 태아 혈청이 풍부한 DMEM 배지에서 통상적으로 배양한 이 전지방세포주는 인슐린 및 인도메타신(indomethacin)과 같은 유도물질의 존재시 성숙한 지방세포로 분화하는 성질이 있다[Slieker L. J. Biochem. Biophys.Res. Com. 1998, 251, 225-229]. 분화가 유도되고 8 내지 10일째에, 3T3-L1 세포는 성숙한 지방세포의 특징을 나타낸다.

배양 중인 3T3-L1 세포를 10% BS를 첨가한 DMEM 배양액으로 48웰 플레이트에 접종하였다. 세포가 포화상태(confluency)가 된 후 2일 동안 더 배양하여 과포화(postconfluency) 상태가 되면 배양액에 분화유도물질인 MDI(1mg/ℓ 인슐린, 0.5mmol/ℓ IBMX, 0.25umol/ℓ DEX)를 첨가하여 2일간 배양하였다. 그 후에는 지방분화를 촉진하기 위해 인슐린만을 첨가한 배지로 2일간 배양한 후 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 교환하여 분화유도가 80% 이상 될 때까지 배양하였다. 버들송이 균사체 배양 추출물은 MDI 처리시 농도별로 처리하여 그 저해효과를 확인하였다. 또한 지방세포의 분화유도 정도는 오일레드 O(Oil red O)로 염색하여 측정하였다. 먼저 분화가 끝난 세포를 PBS로 2회 세척 후 4℃에서 10% 포르말린으로 고정한 후 다시 PBS로 2회 세척하고, 오일레드 O 워킹용액을 이용하여 염색시킨 후 염색액을 제거하였다. 증류수로 4회 정도 세척한 후 염색된 세포 내 지방을 현미경하에서 관찰하고 사진을 촬영하였다. 염색된 지방에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 15-20분간 교반하여 지방을 용해시킨 후 520nm에서 마이크로플레이트 판독기(Model ELX 800, BIO-TEK Instruments Inc, USA)로 흡광도를 측정하였다.

지방분화 저해효과를 시험한 결과, 버들송이 추출물은 1중량%에서 76%의 지방분화 저해효과를 나타내었다(표 8, 도 1).

시료명	지방분화 저해효과(%)
대조군	-
버들송이 추출물 1중량%	76%
버들송이 추출물 0.5중량%	63%
버들송이 추출물 0.25중량%	32%

실시예 10: 중성지방 분해 촉진 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물의 지방세포 내 중성지방 분해 촉진 효능을 평가하기 위하여 상기 방법으로 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 실험을 실시하였다.

글리세롤 정량은 미국 시그마 社(St. Louis, MO, U.S.A.)로부터 구입한 GPO-트린더 키트를 이용한 발색반응법으로 하였으며, ELISA 판독기를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군은 시험물질을 첨가하지 않은 배지만을 사용한 것이고, 그 결과 값을 100%로 하였을 때 기타 값을 환산하여 나타내었다. 지방 분해 정도는 지방세포로부터 배양액 중으로 유리된 글리세롤 농도를 측정함으로써 판단하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다. 하기 표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 버들송이 추출물을 처리한군은 대조군과 비교했을 때 지방세포로부터 배양액 중으로 유리되는 글리세롤의 농도가 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다.

시료명	유리지방산 양(%)
대조군	100%
버들송이 추출물 1중량%	320%
버들송이 추출물 0.5중량%	250%
버들송이 추출물 0.25중량%	170%

실시예 11: 여드름균에 대한 항균력 시험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)에 관한 것이다. 먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화하기 위하여 BHI(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%) 액체 배지에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%; 한천 1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후 건조시켰다. 실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물을 95% 에탄올 수용액에 12%(w/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려놓고 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다. 그 결과, 버들송이 추출물의 균 성장 저지환의 크기는 22㎜인 것으로 나타났다.

실시예 12: 5-알파-리덕타아제 활성 억제력 평가실험

5-알파-리덕타아제 활성억제 실험에 사용된 5-알파-리덕타아제는 포피 유래 섬유아세포가 생성하는 효소를 사용하였다.

섬유아세포를 마이크로플레이트 홀마다 1x10⁴개의 세포가 들어가도록 접종한 후 배양하였다. 각 홀마다 ³H(트리튬)으로 방사선 표지된 테스토스테론을 0.1.mμ.Ci 첨가한 후에 배양하여 섬유아세포가 이를 이용하는지 측정하였다. 버들송이 추출물이 들어가지 않은 것을 대조군으로 삼았다. 24시간 배양 후 상등액을 얻고 에틸아세테이트-사이클로헥산 (1:1) 추출용매 1㎖로 스테로이드를 얻었다. 이렇게 얻어진 스테로이드를 박막 크로마토그래피 판에 올려놓고 클로로포름/메탄올 혼합액(98/2 (v/v))로 전개시켰다. 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론에 해당하는 점의 방사활성을 덴시토미터를 이용하여 측정하여 전환율을 계산하고, 그 결과를 대조군(추출물을 첨가하지 않았을 때의 전환율)과 비교하여 하기 수학식 3에 의해 5-알파-리덕타아제 저해율을 평가하였다.

저해율(%)=[A-B]/[A] × 100

A=테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로 전환율(추출물 미첨가시)

B=테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로 전환율(추출물 첨가시)

실험 결과, 버들송이 추출물은 5-알파-리덕타아제 저해효과가 있음을 알 수 있다(표 10).

버들송이 추출물 농도(중량%)	0.5	0.25	0.1
5-알파-리덕타아제 저해율(%)	67.0	54.0	33.4

실시예 13: 버들송이 추출물과 사람 모발 단백질의 결합 효과

사람 모발 케라틴 단백질 50㎍에 실시예 1의 버들송이 추출물을 각각 0.5, 0.25, 0.1중량%의 시험 농도로 첨가하고 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 6% 과산화수소와 0.5% 암모니아 1:1 혼합 용액으로 처리하여 30분 동안 반응시켰다. 반응액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 램리(Laemmli)의 방법에 따라 전기영동하고, 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 1시간 동안 염색한 후 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합용액에서 탈색시키고 케라틴 단백질 띠를 확인하였다. 이미지 마스터(Amersham Pharmacia Biotech.) 소프트웨어를 사용하여 50㎍의 사람 모발 케라틴 단백질만 전기영동했을 때 나타나는 케라틴 단백질 띠를 100%로 하고, 버들송이 추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 비교하여 케라틴 결합 효과를 %로 표시하였다.

표 11과 같이, 버들송이 추출물 함량이 증가함에 따라 모발 단백질 케라틴과의 결합 능력도 증가하는 것을 알 수 있다.

버들송이 추출물	대조군	0.5중량%	0.25중량%	0.1중량%
모발단백질 결합효과	0	75%	60%	50%

실시예 14: 알칼리와 과산화수소 처리에 의한 케라틴 용출에 대한 보호 효과

3g의 모발을 10㎖의 과산화수소(6%)와 암모니아(1.68%)의 1:1 혼합용액에 넣고 버들송이 추출물을 각각 0.5, 0.25, 0.1중량%의 시험 농도로 첨가한 후에 상온에서 30분 동안 처리하였다. 반응액 0.5㎖를 Rapid-Con protein concentration kit(Elpis Biotech.)를 사용하여 농축시키고 농축액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 램리(Laemmli)의 방법에 따라 전기영동한 후 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 1시간 동안 염색하고 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 탈색시켜 케라틴 단백질 띠를 확인하였다. 이미지 마스터 소프트웨어(Amersham Pharmacia Biotech.)를 사용하여 50㎍의 사람 모발 케라틴 단백질만 전기영동했을 때 나타나는 케라틴 밴드를 100%로 하고, 버들송이 추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 비교하여 케라틴 단백질의 결합 효과를 %로 표시하였다.

표 12와 같이, 버들송이 추출물 함량이 증가함에 따라 모발로부터 용출되는 케라틴 단백질 함량이 감소하는 것을 알 수 있었다.

버들송이 추출물	대조군	0.5중량%	0.25중량%	0.1중량%
모발 용출 케라틴 단백질	100%	35%	60%	84%

실시예 15: 알칼리와 과산화수소 처리에 의한 모발 인장 강도와 신도에 대한 버들송이 추출물의 효과

3g의 모발을 10㎖의 과산화수소(6%)와 암모니아(1.68%)의 1:1 혼합 용액에 넣고 버들송이 추출물을 각각 0.5, 0.25, 0.1중량%의 시험 농도로 첨가하여 상온에서 30분 동안 처리한 후, 물로 씻고 바람에 건조시켜 Autograph 시험기에서 인장 강도(gf)및 신도(%)를 측정하였다. 다음 표 13은 이와 같이 처리한 모발의 인장 강도 및 신도를 나타낸 것이다.

표 13과 같이, 탈색제(상기 과산화수소와 암모니아 혼합 용액)를 30분간 처리한 경우 버들송이 추출물의 첨가량이 증가함에 따라서 모발의 강도 저하가 억제된 것을 볼 수 있다. 이에 따라 탈색제를 처리한 경우 버들송이 추출물에 의한 모발 보호 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

버들송이 추출물	정제수	0.5중량%	0.25중량%	0.1중량%
인장 강도(gf)	113	123	119	116
신도(%)	45	48	47	45

실시예 16: 모발성장효과 시험

실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물 2중량%를 함유하는 30% 함수 에탄올 용액을 제조하여 모발성장효과 시험에 사용하였다. 모발성장효과 시험은 마우스(ICR), 생후 47~53일 것을 사용하여 등 부위 털을 제거하고, 등 부위가 깨끗한 것을 골라 물질군마다 10마리를 사용하여 다음날부터 매일 시험물질을 개체당 100㎖씩 도포하였다. 시간 경과에 따른 모발의 길이 및 모발 성장 정도를 모 제거 후 복원 정도에 따라 점수를 0에서 2까지 부가하여 각각 비교하였다. 모발성장 정도를 비교하기 위하여, 대조군으로는 30% 알코올 용액을 각 개체에 도포하여 성장 상태를 관찰하였다.

실험 결과, 버들송이 추출물이 우수한 모발성장 촉진 효과가 있음을 알 수 있다(표 14).

경과일수/시료	5	10	15
버들송이 추출물 2중량%	0.14	0.61	1.39±0.19
대조군	0.06	0.12	0.79±0.24

주)단위: 0 (전혀 자라지 않음), 1 (약간자람), 2 (많이자람)

실시예 17 및 비교예 1

실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 15와 같다. 우선 표 15에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 17, 비교예 1)을 제조하였다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 17에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험 완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험 결과는 하기 표 16에 피부탄력측정기의 △R7값으로 기재하였는데 △R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 16과 같이 버들송이 균사체 배양 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 17	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	버들송이 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	잔량	잔량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R7)
실시예 17	035
비교예 1	0.11

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 17에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 17에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서, 표 17과 같이 버들송이 추출물을 함유한 실시예 17의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 17	-0.23	-0.17	-0.11	-0.08	-0.06
비교예 1	-0.11	-0.07	-0.06	-0.04	-0.02
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

실시예 18 및 비교예 2

실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 슬리밍/안티 셀룰라이트효과를 비교예 2와 비교실험을 행하여 평가하였다. 비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 18과 같다. 우선 표 18에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 18, 비교예 2)을 제조하였다.

[허벅지에 대한 슬리밍 효과 평가방법]

국소 비만이나 셀룰라이트가 있는 여성 중 BMI(Body Mass Index, 체중(kg)/신장(m)2)가 21~27인 20세 이상의 성인 여성 30명을 대상으로 10주 동안 아침과 저녁에 각 1회, 1회당 5분, 15명은 왼쪽 허벅지에 다른 15명은 오른쪽 허벅지에 실시예 18의 마사지크림을 적용하도록 하였고 왼쪽 허벅지는 비교예 2의 마사지크림을 적용하였다. 슬리밍 효과의 평가는 마사지크림 사용 10주 후, 사용 전과 후의 허벅지 중간의 둘레를 줄자(mm)를 이용하여 측정하고 허벅지 둘레의 차이를 계산하여 평가하였다.

[허벅지에 대한 슬리밍 결과]

실시예 18 및 비교예 2를 사용한지 10주 뒤 허벅지 둘레를 측정 및 비교한 결과, 비교예 2를 사용한 평가자 집단의 허벅지 둘레는 초기대비 평균 6mm 줄어든 것으로 평가된 반면, 실시예 18을 사용한 집단의 허벅지 둘레는 초기대비 평균 24mm 줄어들었다. 이의 임상실험 결과에 비추어 보면 버들송이 추출물 함유 마사지 크림(실시예 18)은 비교예 2에 대비하여 400%의 슬리밍 효과가 있어 버들송이 추출물을 함유하지 않은 비교예 2에 비하여 추출물을 함유한 실시예 18은 슬리밍에 탁월한 효과가 있는 놀라운 사실을 발견하였다. 마사지 크림 사용 전후의 허벅지 둘레 감소 차이(mm)는 표 19에 나타내었다.

원료		실시예 18	비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	버들송이 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	잔량	잔량

주)단위: 중량%

	감소한 허벅지 둘레 (mm)
비교예 2	6
실시예 18	24

[복부에 대한 슬리밍 효과 평가]

국소 비만이나 셀룰라이트가 있는 여성 중 BMI(Body Mass Index, 체중(kg)/신장(m)²)가 21~27인 20세 이상의 성인 여성 30명을 대상으로 5주 동안 아침과 저녁에 각 1회, 10분씩 복부에 팥 추출물이 함유된 마사지 크림(실시예18)을 마사지하도록 했다. 평가는 5주 후, 사용 전과 후의 복부 지방율과 신체 지방율을 체내 체성분 측정기를 이용하여 평가하였다.

[복부에 대한 슬리밍 결과]

체지방, 체지방율, 복부지방율 분석 결과 버들송이 추출물 함유 마사지 크림(실시예 18)을 바른 뒤 유의적으로(P(0.05))감소하였다. 체지방은 15.2kg에서 13.1kg으로 약 2.1kg정도 감소하였고 체지방율은 25.1 %에서 21.8kg으로 감소하였다. 복부지방율(WHR)은 0.76에서 0.72로 감소하였다. 복부 지방율은 배꼽선에서 최대 허리둘레를 측정한 뒤 엉덩이 둘레로 나눠주어 값을 계산하였다.

	바르기 전 (n=30)	바른 후 (n=30)
지방(kg)	15.2±0.60	13.1±0.59
체지방(%)	25.1±0.10	21.8±0.25
WHR(복부지방율)	0.76±0.01	0.72±0.01

실시예 19: 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물 1g, 글리세린 5g을 정제수 85.35g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 20: 유액 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 21: 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 버들송이 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

도 1은 버들송이 추출물이 지방세포 분화에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.

A: 음성 대조군,

B: 1중량% 버들송이 추출물을 가한 것,

C: 0.5중량% 버들송이 추출물을 가한 것,

D: 0.25중량% 버들송이 추출물을 가한 것.

Claims (4)

1. 버들송이 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화, 슬리밍, 여드름 예방 및 치료, 모발손상 방지, 탈모 방지 및 육모 기능성 피부 외용제 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
3. 청구항 1에 있어서,

   상기 버들송이 추출물은 버들송이 균사체 배양액으로부터 추출한 것임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 연고, 에센스, 샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어무스, 립스틱, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.

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