KR20100115301A - 생체 분자 표지를 위한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조방법 - Google Patents

생체 분자 표지를 위한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 분자 표지를 위한 다음 화학식 1로 표시되는 신규 시아닌 화합물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00123

식 중에서, R1, R2, R3, R4, B, m 및 n은 각각 명세서에 정의한 바와 같다.

Description

생체 분자 표지를 위한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조방법{NOVEL CYANINE COMPOUND FOR LABELING BIOMOLECULE AND PREPARATION METHOD THEREOF}
본 발명은 다양한 생체분자에 형광 표지가 가능한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
염료의 반응기와 결합할 수 있는 단백질 구조 내의 치환기는 기본 구조가 되는 아미노산 (amino acid)의 구조로부터 유추할 수 있다. 그 예로는 아미노산 잔기를 들 수 있는데, 구체적으로는 라이신 (lysine)의 아미노기 (-CH2CH2CH2CH2NH2), 시스테인 (cystein)의 티올기 (-CH2SH), 히스티딘 (histidine)의 이미다졸 아민기 (
Figure pat00001
), 트레오닌 (threonine)의 2차 지방족 히드록시기 (-CH2CH(OH)CH3), 세린 (serine)의 1차 지방족 히드록시기 (-CH2OH), 티로신 (tyrosine)의 페놀 히드록시기 (
Figure pat00002
) 등이 있다. 아미노산의 N-말단 아미노기 (-COCHRNH2)와의 결합도 가능하다. 또한, 염료의 반응기는 당 (sugar), 당단백 (glycoprotein), 항체 (antibody) 등의 생체 분자와 결합할 수도 있다.
현재까지 알려진 생체 분자 표지용 염료나 물질에 사용되는 반응기들은 생체 분자와 결합되는 치환기에 따라 분류할 수 있고, 각각의 관용명으로도 통용된다.
단백질 분자의 아민기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 숙신이미딜 에스터와 이소티오시아네이트이고, 단백질 분자의 티올기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 말레이미드이며, 단백질 분자의 히드록시기와 결합을 목적으로 하는 반응기로는 아래와 같은 것들이 있다.
Figure pat00003
위와 같은 반응기 이외에도 많은 연구자들과 기업에서는 성능이 더 우수한 반응기 중간체를 설계하고 있다. 대부분 생체 분자와의 반응 시간이 빠르고 결합 성능이 우수하지만 수용액 상태에서 안정하지 않고, 열에 취약하거나 반응 후에 이탈기가 떨어져 나가면서 부산물이 발생하는 것이 일반적이다.
수용성 형광 염료는 최근에는 바이오 분야에서의 응용이 활발하게 이루어지고 있다. 수용성 형광 염료를 생체 분자에 도입하기 위해서는 수용액이나 친수성 조건에서 광표백 (photobleaching) 및 소광 (quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수 (molecular extinction coefficient)가 커야하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 한다. 그러나, 이와 같은 여러 가지 요구 조건들로 인하여 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다.
모든 염료가 형광을 나타내는 것은 아니다. 다양한 분야의 연구자들이 형광을 나타낼 수 있는 발색단 (chromophore)을 가진 염료를 개발하였다. 지금까지 알려진 형광 물질 (fluorophore)의 대표적인 예로는 안트라닐레이트 (anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌 (1-alkylthic isoindoles), 피롤리논 (pyrrolinones), 비메인 (bimanes), 벤즈옥사졸 (benzoxazole), 벤즈이미다졸 (benzimidazole), 벤조퓨란 (benzofurazan), 나프탈렌 (naphthalenes), 쿠마린 (coumarins), 스틸벤 (stilbenes), 카바졸 (carbazoles), 페난트리딘 (phenanthridine), 안트라센 (anthracenes), 아크리딘 (acridines), 플로세인 (fluoresceins), 에오신 (eosins), 로다민 (rhodamines), 피렌 (pyrenes), 크리센 (chrysenes) 등을 들 수 있고, 이들과 유사한 구조의 유도체들도 연구되고 있다. 이러한 형광 물질들은 앞에서 기술한 다양한 생체 분자 결합용 반응기에 도입되어 다양한 상품으로 시판되고 있다.
상기와 같은 다수의 형광 염료 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광을 나타내도록 하기 위해서는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것이 중요하다. 이러한 목적으로 가장 많이 사용되는 형광 염료로는 잔텐 (xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴 (polymethine) 계열의 시아닌을 들 수 있다.
시아닌 염료를 생체 분자의 표지용으로 처음 도입한 것은 1980년대 말 카네기 멜론 (Carnegie-Mellon) 대학의 와고너 (Waggoner) 교수팀으로, 섬유 염색이나 광 기록 매체에 주로 사용되던 시아닌계 염료에 단백질과 결합할 수 있는 반응기를 도입하여 단백질에 결합시키는 경우에 형광이 발현될 수 있음을 보였고, 그 이후에도 하기와 같은 몇 편의 논문을 발표하였다.
[문헌 1] Ernst, L. A., Gupta, R. K., Mujumdar, R. B., and Waggoner, A. S. (1989) Cyanine Dye Labeling Reagents for Sulfhydryl groups. Cytometry 10, 3-10.
[문헌 2] Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., and Waggoner, A. S. (1989) Cyanine Dye Labeling Reagents containing Isothiocyanate groups. Cytometry 10, 11-19.
[문헌 3] Southwick, P. L., Ernst, L. A., Tauriello, E. W., Stephen, R. P., Mujumdar, R. B., Mujumdar, S. R., Clever, H. A., and Waggoner, A. S. (1990) Cyanine Dye Labeling reagents - Carboxymethylindocyanine Succinimidyl Esters. Cytometry 11, 418-430.
[문헌 4] Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., Lewis, C. J., and Waggoner, A. S. (1993) Cyanine Dye Labeling Reagents: Sulfoindocyanine Succinimidyl Esters. Bioconjugate Chem. 4, 105-111.
[문헌 5] Mujumdar, S. R., Mujumdar, R. B., Grant, C. M., and Waggoner, A. S. (1996) Cyanine-Labeling Reagents: Sulfobenzindocyanine Succinimidyl Esters. Bioconjugate Chem. 7, 356-36.
이후 여러 연구자들의 의하여 실험자의 목적에 따라 단백질의 친핵체, 즉, 아민기, 티올기, 히드록시기, 그리고 친전자체인 알데하이드기, 케톤기, 카르복실산기 등에 결합할 수 있는 반응기를 도입한 생체 분자 표지용 색소 및 형광 염료가 소개되었다.
시아닌 염료는 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수 (absorption) 및 발광 (emission) 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광계수를 나타내는 등 많은 장점이 있다. 하기 화학식은 문헌에 나와 있는 시아닌 염료의 일반 구조와, 유도체로 알려져 있는 헤테로 화합물의 기본 구조이다.
Figure pat00004
시아닌 염료로서 상업적으로 가장 많이 활용되고 있는 것은 헤테로 고리로서 인돌 (indole) 구조를 포함하고, 반응기로서 숙신이미딜 에스터기를 갖는 것이다. 하기 화학식은 상품화되어 있는 대표적인 구조로서, 지이 헬스케어 (GE Healthcare)에서 Cy3, Cy5 및 Cy7이라는 상품명으로 시판되는 것들이다.
Figure pat00005
다양한 색상을 요구하는 섬유용 염료와는 달리, 생체 분자 표지용 형광 염료는 형광을 나타내는 파장 범위가 넓다고 하여 반드시 좋다고 할 수는 없는데, 이는 형광을 이용하거나 형광을 측정하는 장비의 파장이 한정되어 있기 때문이다. 신규의 형광 분석 방법 또는 기기가 개발되거나, 광학 장비가 개선되거나, 또는 그 성능이 염료에 맞도록 뒷받침되지 않으면 흡수 파장이나 발광 파장 범위를 바꾸는 색원체 변경이나 구조 변경은 생체 표지용 염료 분야에서는 상업적인 관점에서 큰 의미가 없다.
다른 색원체를 가진 염료들도 마찬가지이지만, 시아닌 염료에서도 반응기의 도입 여부에 무관하게 색원체가 폴리메틴인 것은 변함이 없으므로, 형광 특성이 거의 동일하여 흡수 및 발광 파장이 거의 변하지 않는다고 알려져 있다.
생체 분자의 표지에 사용되는 숙신이미딜 에스터를 가진 시아닌 표지 염료는 카보네이트 (carbonate) 완충액(buffer) 또는 포스페이트 (phosphate) 완충액 상에서 염색이 이루어진다. 이때 완충액의 농도는 주로 0.1M이고, 반응 온도는 다양하지만 상온의 경우가 일반적이다.
염료를 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 또는 N,N-디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해시켜 사용하는데, 염료 1 mg을 용매 100 μl에 용해시킨 후 분취하여 사용하는 경우가 많다. 염료의 사용량은 일반적으로 염색 대상이 되는 생체 분자에 대하여 당량비로 5 내지 100배 정도의 과량으로 사용되는데, 이는 단백질 분자는 1 당량이라도 주로 반응의 목표가 되는 아미노기, 히드록시기 또는 티올기의 개수가 훨씬 많기 때문이다. 복잡한 단백질 구조 내에 침투하여 반응하려면 상대적으로 더 높은 수용액 안정성이 요구된다. 그러나, 숙신이미딜 에스터의 경우는 오랜 반응 시간 동안 안정한 상태로 유지할 수 없는 것이 단점이다.
본 발명의 목적은 프로테오믹스 (proteomics), 광학 분자 영상 등의 분야에서 단백질, 지방, 탄수화물 등의 생체 분자의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있는 신규 시아닌 화합물 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적은 다음 화학식 1로 표시되는 신규 시아닌 화합물 및 그 제조 방법을 제공하는 것에 의하여 달성된다.
Figure pat00006
식 중에서,
R1, R1'은 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이고,
R2, R2', R3 및 R3'은 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고,
R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, -CONH(CH2)LSO2CH=CH2, -CONH-para-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-meta-(C6H4)SO2CH=CH2이고,
B는 (CH2)l, para-(C6H4) 또는 meta-(C6H4)이고,
m, m'은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고,
L, l 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
또한, 본 발명에서는 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법 및 이를 이용한 다양한 용매, 예를 들면 완충액 (buffer solution) 내에서 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 상기 화학식 1의 화합물로 표지하는 방법 (binding protocol)이 제공된다.
본 발명품은 생체분자 연구자들이 표지 실험 수행 시 보다 안정적으로 염료를 다룰 수 있도록 하며 특히 생체분자와 염료의 결합 후 부산물이 발생하지 않아 부수적인 정제 작업을 피할 수 있게 된다. 또한 높은 안정성으로 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 고분자 생체 분자의 장시간 염색이나 보다 복잡한 생체 분자를 다루는 사용자들에게도 보다 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 실시예 22에서 확인한 화합물 1-16의 파장 550 nm에서의 흡수값을 도시한 것이다.
도 2a는 실시예 23에서 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 육안으로 관찰되는 사진이고, 도 2b는 형광사진을 나타낸 것이다.
도 3a는 실시에 24에서 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 육안으로 관찰되는 사진이고, 도 3b는 형광사진을 나타낸 것이다.
도 4a는 실시에 25에서 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 육안으로 관찰되는 사진이고, 도 4b는 형광사진을 나타낸 것이다.
도 5a는 비교 실험 (1)에서 벤질 아민을 GE Cy5 염료 및 화합물 1-2와 각각 반응시켰을 때의 생성물의 파장 650 nm에서의 흡수값을 도시한 것이고, 도 5b는 벤질 알코올과의 반응 생성물, 도 5c는 벤질 메르캅탄과의 반응 생성물의 동일한 파장에서의 흡수값을 각각 나타낸 것이다.
도 6a는 비교 실험 (2)에서 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 육안으로 관찰되는 사진이고, 도 6b는 형광사진을 나타낸 것이다.
도 7a는 비교 실험 (2)에서 표지시킨 미오신을 겔 전기영동으로 전개한 것의 형광 강도를 도시한 것이고, 도 7b는 β-갈락토시다아제, 도 7c는 포스포릴라아제 B, 도 7d는 혈청 알부민, 도 7e는 오발부민, 도 7f는 카보닉 안하이드라아제, 도 7g는 티롭신 억제제, 도 7h는 리소자임, 도 7i는 아프로티닌과의 형광 강도를 각각 도시한 것이다.
도 8a는 비교 실험 (3)에서 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 육안으로 관찰되는 사진이고, 도 8b는 형광 사진을 나타낸 것이다.
단백질 염색에서 가장 보편적으로 사용되는 염료의 반응기는 아미노산의 아미노기에 결합할 수 있는 숙신이미딜 에스터기이다. 그 예로서 지이 헬스케어의 미국 특허 제5268486호, 제6043025호, 제6127134호와, 국제 공개 공보 제9633406호에서는 숙신이미딜 에스터를 다양한 시아닌 염료 구조에 도입하고, 항체, 펩타이드 등 결합 가능한 생체 분자에 대한 염색 방법도 예시하고 있다. 그러나, 이 숙신이미딜 에스터는 수용액 중에서 안정하지 않고, 염색 반응 시에 필수적으로 N-히드록시 숙신이미드가 부산물로서 생성된다.
이에 따라, 본 발명에서는 생체 분자와 염색 후에 부산물이 생성되지 않는 제품을 개발하고자 하였다. 또한, 종래에 숙신이미딜 에스터를 이용하는 생체 표지 방법이 잘 알려져 있는 점을 고려하여, 종래와 같은 방법으로 쉽게 단백질에 표지될 수 있는 염색 방법을 개발하여, 더욱 좋은 성능을 낼 수 있도록 하였으며, 다양한 완충액에서 염색이 가능한 방법을 제시하였다.
본 발명에 따른 화학식 1의 시아닌 화합물에는 비닐 설폰기가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 비닐 설폰기의 비닐기는 생체 분자의 친핵체와 아래와 같은 반응으로 결합하므로, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 생체 분자와의 반응 후에 부산물을 생성시키지 않는다.
Figure pat00007
본 발명에 따른 시아닌 염료 화합물은 대부분의 생체 분자에 적용 시의 매질인 물을 대상으로 하고 열에 대해서도 안정하도록 설계되었다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 시아닌 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
이하에서는 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법을 설명한다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법에서는 다음 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응식 1a에 예시된 바와 같이 반응시켜 화학식 4a의 화합물을 얻고, 이를 출발 물질로서 사용한다.
Figure pat00008
Figure pat00009
[화학식 4a]
Figure pat00010
[반응식 1a]
Figure pat00011
상기 화학식 2 내지 4 및 반응식 1a에 있어서, R1, R2 및 R3은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.
상기 화학식 4a의 R1이 설폰산기인 경우, 화학식 4a의 화합물을 반응식 1b에 예시된 바와 같이 일반식 MOH로 표시되는 무기 염기, 바람직하게는 수산화칼륨 또는 수산화나트륨, 가장 바람직하게는 수산화칼륨으로 처리하여 R1이 설폰산염기인 화학식 4b의 화합물을 얻고, 이를 출발 물질로서 사용할 수도 있다.
[화학식 4b]
Figure pat00012
[반응식 1b]
Figure pat00013
반응식 1b에 있어서, M은 칼륨 또는 나트륨이고, R2 및 R3은 각각 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같은 것이며, 화학식 4a의 R1은 설폰산기이고, 화학식 4b의 R1은 설폰산염기이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1 화합물을 제조함에 있어서는 먼저 상기 화학식 4a 또는 4b의 화합물을 반응식 2 및 3에 예시된 바와 같이 다음 화학식 5 및 7의 화합물과 각각 반응시켜, 화학식 6a 및 6b의 화합물을 얻는다.
Figure pat00014
[화학식 6a]
Figure pat00015
[화학식 6b]
Figure pat00016
Figure pat00017
[반응식 2]
Figure pat00018
[반응식 3]
Figure pat00019
상기 화학식 5 내지 7과, 반응식 2 및 3에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 m은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이다.
상기 반응식 2는 R4가 수소 또는 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기인 화학식 6a의 화합물을 제조하는 방법을, 반응식 3은 R4가 카르복시기인 화학식 6b의 화합물을 제조하는 방법을 각각 예시한 것이다.
다음으로, 상기 화학식 6a 또는 6b의 화합물을 반응식 4에 예시된 바와 같이 다음 화학식 8의 화합물과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 얻는다.
Figure pat00020
Figure pat00021
[반응식 4]
Figure pat00022
상기 화학식 8 및 9와, 반응식 4에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, A는 수소 또는 아세틸기이다.
상기 화학식 8의 화합물은 n이 1인 경우 N,N-디페닐 포름아미딘 (DPF)이고, n이 2인 경우 말론알데히드 디아닐 히드로클로라이드 (MDH)이고, n이 3인 경우 글루타콘알데히드 디아닐 히드로클로라이드 (GDH)이다.
다음으로, 상기 화학식 9의 화합물을 반응식 5에 예시된 바와 같이 상기 화학식 6b의 화합물과 반응시켜 화학식 10으로 표시되는 화합물을 얻는다.
Figure pat00023
[반응식 5]
Figure pat00024
상기 화학식 10 및 반응식 5에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다. 다만, 상기 2개의 R1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 상기 2개의 R2 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 마찬가지로 상기 2개의 R3 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 상기 2개의 m 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다음으로, 상기 화학식 10의 화합물을 반응식 6에 예시된 바와 같이 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI) 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트 (DSC)와 반응시켜 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 얻는다.
[화학식 11a]
Figure pat00025
[화학식 11b]
Figure pat00026
상기 화학식 11a 및 11b에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다. 다만, 상기 2개의 R1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 상기 2개의 R2 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 마찬가지로 상기 2개의 R3 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 상기 2개의 m 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
[반응식 6]
Figure pat00027
상기 반응식 6에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, R6은 화학식 11a에서는 이미다졸기이고, 화학식 11b에서는 숙신이미딜옥시기이다. 다만, 상기 2개의 R1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 상기 2개의 R2 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 마찬가지로 상기 2개의 R3 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 상기 2개의 m 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다음으로, 상기 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 반응식 7에 예시된 바와 같이 휘니그 염기 (Hunig's base) 존재 하에서 하기 화학식 12로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는다.
Figure pat00028
[반응식 7]
Figure pat00029
상기 화학식 12 및 반응식 7에 있어서, R1, R2, R3, R4, m 및 n은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, R5는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자, 또는 설파토기 (-OSO3H)이고, B는 (CH2)l, p-(C6H4) 또는 m-(C6H4)이고, l은 1 내지 5의 정수이다. 다만, 상기 2개의 R1은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 상기 2개의 R2 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 마찬가지로 상기 2개의 R3 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 상기 2개의 m 역시 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 신규 시아닌 화합물을 이용하여 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 표지하는 방법 (binding protocol)에 관한 것이다.
상기 생체 분자는 바람직하게는 단백질, 펩타이드 (peptide), 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸 (proteoglycan), 글라이코프로틴 (glycoprotein) 및 siRNA로 구성된 군에서 선택된다.
상기 표지는 화학식 1 화합물에 존재하는 비닐 설폰기와 상기 아민기, 수산화기 또는 티올기의 반응에 의하여 상기 화학식 1 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물, 구체적으로는 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물에 존재하는 아민기, 수산화기 또는 티올기의 결합에 의하여 이루어지는 것이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 기존의 숙신이미딜 에스터를 가진 시아닌 염료의 경우와 마찬가지로 단백질과 화학식 1의 화합물과의 반응에 의하여 단백질에 쉽게 염색될 수 있다.
따라서, 상기 표지는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 화학식 1의 화합물과 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물로 표지되어 있는 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물로 구성된 군에서 선택되는 물질에 관한 것이다.
생체 분자의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체 분자의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체 분자 표지용으로 사용하기에 적합하다.
실시예
이하에서는 실시예 및 비교 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.
먼저, 실시예 및 비교 실험에서 사용된 실험 장치, 분석 장비 및 시약에 대하여 설명한다.
FT-NMR 분광 분석을 위한 기기로는 Bruker사의 Avance 300 및 400을 사용하였고, LC/MS에는 Varian사의 1200L Quadrupole을 사용하여, ESI (electrospray ionization) 방식으로 측정되었다. MALDI-TOF M/S는 Voyager MALDI-TOF DE 질량분석기(mass spectrometer)를 사용하였다.
합성된 염료의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수값은 Hewlett-Packard사의 HP 8452 배열 분광 광도계 (diode array spectrophotometer)로 측정되었고, 발광 파장 및 최대 발광 파장에서의 발광값은 Perkin Elmer사의 LS-55를 사용하여 얻었다.
유기 화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 정상 (normal phase)의 경우, 실리카겔 (silica gel)로서 Merck사의 kieselgel 60 (230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피 (TLC)에는 실리카겔 60 GF254 (0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하고, TLC 상의 화합물 확인은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 이용하거나, 발색제로서 인몰리브덴산 (phosphomolybdic acid) (PMA) 20 내지 30% 에탄올 용액 또는 KMnO4를 사용하였다. 역상 (reverse phase)의 경우, TLC는 실리카겔 60 RP-18 F254S (0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였고, 칼럼 크로마토그래피의 경우는 Buchi사의 MPLC (medium pressure liquid chromatography) 장비인 Fraction Collector R-660에 역상 칼럼 Lichroprep RP-18 (40 내지 63 μm, Merck사 제품)를 연결하여 사용하였다. HPLC는 Agilent사의 1100 시리즈에 Waters사의 Bondapak C18 10 μm 125A를 장착하여 사용하였다.
겔 전기영동 실험을 위한 전기영동장치는 Amershame Biosciences사의 SE260, 소형 수직 겔 전기영동 장치 (mini-vertical gel electrophoresis unit)에 BIO-RAD사의 PowerPac Basic Power Supply (Catalog No. 164-5050)를 연결하여 사용하였다. 겔로는 Lonza사의 PAGEr Gold Precast Gels (Polyacrylamide gels for protein electrophoresis, 10 내지 20% Tris-Glycine gels, Catalog No. 59506)을 사용하였다. SDS-PAGE 실험을 위한 러닝 완충액 (running buffer) 및 로딩 완충액 (loading buffer)는 아래와 같이 직접 제조하여 사용하였다.
- 5 x running buffer 제조
· 3 g Tris (Trizma base, Sigma)
· 14.4 g Glycine (Sigma)
· 증류수 100 mL, 제조 후 냉장 보관
- 5 x loading buffer 제조
· 0.6 mL의 1 M Tris (Trizma base, Sigma)
· 5 mL의 50% 글리세롤 (glycerol)
· 2 mL의 10% SDS
· 0.5 mL의 2-메르캅토 에탄올 (mercaptanethanol)
· 1.9 mL의 10% 증류수 (bromophenol blue를 넣지 않고 증류수로 대체)
단백질은 GE Healthcare사와 Takara에서 시판 중인 Size Marker들을 사용하였다. 표지된 생체 분자의 관찰 및 형광 강도 (intensity)의 측정에는 Perkin Elmer사의 Geliance 600 장비를 이용하였고, 광원은 Geliance UV Epi (Catalog No. L7110026), Geliance Blue Epi (Catalog No. L7110027)이었고, 필터는 UV Filter, Geliance Short Pass Filter (500∼600 nm), Geliance Long Pass Filter (580 내지 660 nm), Geliance Blue Light Filter (550∼600 nm)를 형광 파장에 맞게 바꾸어 가면서 측정하였다.
시약은 주로 Aldrich사와 TCI사의 것을 사용하였다. 정제가 필요한 용매는 알려져 있는 방법에 따라 정제하여 사용하였고, 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 질소 기류 하에서 실시하였다. NMR 용매는 Aldrich사와 Cambridge Isotope Laboratories Inc사의 DMSO-d 6 또는 D2O를 사용하였다. 시그날의 상대적인 위치는 용매 내에 들어있는 테트라메틸실란 (tetramethylsilane, TMS)을 기준으로 하거나 NMR 용매를 기준으로 하였다. 화학전이 (chemical shift)는 표준 물질로부터 ppm 단위로 표시하였고, 데이터는 화학전이 다중도 (chemical shift multiplicity) (s=singlet, d=doublet, t=triplet, m=multiplet), intergration, coupling constant (Hz)의 순으로 기록하였다.
실시예 1: 화합물 1-1의 제조
(1) 화합물 4-1의 합성
Figure pat00030
p-히드라지노벤젠설폰산 (p-hydrazinobenzenesulfonic acid) (10 g, 53 mmol, 1 eq, Aldrich)과 3-메틸-2-부탄온 (3-methyl-2-butanone) (17.18 mL, 160 mmol, 3.02 eq, TCI)을 아세트산 30 mL에 가한 후, 4 시간 동안 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 2, 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. (11.34 g, 89%)
Rf = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
수산화칼륨 (1.427 g, 25.4 mmol, 1.2 eq)을 프로판올 35 mL에 용해시키고, 앞에서 얻은 고체 물질 (5.073 g, 21.2 mmol, 1 eq)을 메탄올 35 mL에 용해시키고 적가한 후, 상온에서 24 시간 교반하고, 여과하여 노란색의 고체 입자를 얻었다. (5.35 g, 90%)
Rf = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
1H NMR (300 MHz, D2O) : δ 7.60 (s, 1H), 7.58 (d, 1H, J = 8.32 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 7.99 Hz), 2.08 (s, 3H), 1.06 (s, 6H)
(2) 화합물 6a-1의 합성
Figure pat00031
화합물 4-1 (20 g, 72.1 mmol, 1 eq)과 에틸 아이오다이드 (ethyl iodide) (110 mL, 1,375 mmol, 19 eq, TCI)를 가한 후 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후, 에틸 아이오다이드를 제거하고, 50 mL의 아세톤으로 3, 4회 세정하고, 여과한 후, 40℃에서 감압 건조시켜, 분홍색의 고체를 얻었다. (18.37 g, 95%)
Rf = 0.18 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
1H NMR (400 MHz, D2O) : δ 7.99 (s, 1H), 7.88 (d, 1H, J = 8.23 Hz), 7.80 (d, 1H, J = 8.46 Hz), 4.43 (m, 2H), 1.52-1.40 (m, 12H)
LC/MS, 계산치 C13H18NO3S+ 268.1, 측정치 268.16
(3) 화합물 6b-1의 합성
Figure pat00032
화합물 4-1 (2.774 g, 10 mmol, 1 eq)과 6-브로모-n-헥산산(6-bromo-n-hexanoic acid) (2.34 g, 12 mmol, 1.2 eq, Aldrich)을 15 mL의 1,2-디클로로벤젠 (1,2-dichlorobenzene)과 12시간 동안 가열 환류시켰다. 상온 냉각 후 용매를 제거하고, 이소프로필 알콜 (isopropyl alcohol)을 가하고, 여과하여 감압 건조시켜 분홍색의 고체를 얻었다. (2.653 g, 75%)
Rf = 0.08 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
1H NMR (400 MHz, D2O) : δ 8.00 (s, 1H), 7.90 (d, 1H, J = 8.86 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 8.43 Hz), 4.37 (t, 2H, J = 7.46 Hz), 2.25 (t, 2H, J = 7.01 Hz), 1.85 (m, 2H), 1.57-1.26 (m, 13H)
LC/MS, 계산치 C17H24NO5S+ 354.14, 측정치 354.18
(4) 화합물 9-1의 합성
Figure pat00033
화합물 6a-1 (16 g, 59.8 mmol, 1 eq)과 DPF (13.2 g, 67.3 mmol, 1.125 eq, TCI)를 40 mL의 아세트산과 40 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고, 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 용액을 제거한 후, 에틸 아세테이트를 가하여 고체를 생성시키고, 여과하여 감압 건조시켰다. (12.97 g, 57%)
Rf = 0.25 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.85 (s, 1H), 7.70 (dd, 1H, J = 1.35 Hz, 1.32 Hz), 7.53-7.45 (m, 7H), 7.29 (dd, 1H, J = 1.92 Hz, 6.66 Hz), 4.13 (m, 2H), 1.70 (s, 6H), 1.32 (t, 3H, J = 7.05 Hz)
LC/MS, 계산치 C20H23N2O3S+ 371.14, 측정치 370.98
(5) 화합물 10-1의 합성
Figure pat00034
화합물 9-1 (1.01 g, 2.429 mmol, 1 eq)과 화합물 6b-1 (0.86 g, 2.429 mmol, 1 eq)을 5 mL의 무수 아세트산과 5 mL의 피리딘 혼합 용액에 넣은 후 110℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 고체를 생성시키고, 여과하여, 감압 건조시켰다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-1을 얻었다. (0.37 g, 24%)
Rf = 0.70 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, D2O) : δ 8.38 (t, 1H, J = 13.5 Hz), 7.78 (s, 2H), 7.73 (t, 2H, J = 7.42 Hz), 7.23 (dd, 2H, J = 5.25 Hz, 7.97 Hz), 6.24 (dd, 2H, J = 4.79 Hz, 4.56 Hz), 3.97 (m, 4H), 2.23 (t, 2H, J = 7.26 Hz), 1.73-1.20 (m, 21H)
LC/MS, 계산치 C31H39N2O8S2 + 631.21, 측정치 631.31
λabs (물) : 549 nm, λfl (물) : 573 nm
(6) 화합물 1-1의 합성
Figure pat00035
화합물 10-1 (110 mg, 0.174 mmol, 1eq)을 DMF 22 mL에 용해시키고 55℃로 승온하였다. 0.11 mL의 피리딘을 가하고 DSC (135 mg, 0.527 mmol, 3.02 eq, Aldrich)를 DMF 2.5 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1 시간 동안 교반하고, 에틸아세테이트를 가하여 적색의 고체를 얻고, 에틸아세테이트, 에테르 (ether)로 여러 번 세정하여 여과하였다. 이것을 DMF 20 mL에 녹이고, 0.302 mL의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 (36 mg, 0.174 mmol, 1 eq)을 1 mL의 DMF에 녹여서 적가하고, 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 메틸렌클로라이드 (methylene chloride, 디클로로메탄)를 사용하여 추출하고, 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-1을 얻었다. (106.4 mg, 82%)
Rf = 0.65 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.32 (t, 1H, J = 13.4 Hz), 8.02 (t, 1H, J = 4.9 Hz), 7.80 (s, 2H), 7.67 (m, 2H), 7.39 (dd, 2H, J = 2.88 Hz, 3 Hz), 6.96 (dd, 1H, J = 9.92 Hz, 9.92 Hz), 6.53 (dd, 2H, J = 4.24 Hz, 4.32 Hz), 6.23 (m, 2H), 4.17-4.09 (m, 4H), 3.21 (m, 2H), 2.04 (t, 2H, J = 6.96 Hz), 1.69-1.28 (m, 23H)
LC/MS, 계산치 C35H44N3O9S3 - 746.22, 측정치 746.27
λabs (물) : 549 nm (ε = 1.222 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 574 nm
실시예 2: 화합물 1-2의 제조
(1) 화합물 9-2의 합성
Figure pat00036
화합물 6a-1 (2.2 g, 8.23 mmol, 1 eq)과 MDH (2.55 g, 9.88 mmol, 1.2 eq, TCI)를 10 mL의 아세트산과 10 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 반응액을 제거한 후 에틸아세테이트로 고체를 생성시켜 여과하고 감압 건조시켰다. (3.47 g, 96%)
Rf = 0.20 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 10-2 합성
Figure pat00037
화합물 9-2 (6.40 g, 14.6 mmol, 1 eq)와 화합물 6b-1 (5.12 g, 14.6 mmol, 1 eq)을 80 mL의 피리딘에 넣은 후 60℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트를 가하여 청색의 고체를 생성시킨 후, 여과하고 감압 건조시켰다. 25% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-2를 얻었다. (2.09 g, 22%)
Rf = 0.58 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34 (t, 2H, J = 13.2 Hz), 7.80 (s, 2H), 7.63 (d, 2H, J = 8.16 Hz), 7.30 (dd, 2H, J = 2.80 Hz, 2.76 Hz), 6.58 (t, 1H, J = 12.2 Hz), 6.30 (dd, 2H, J = 8.64 Hz, 8.56 Hz), 4.13-4.06 (m, 4H), 1.98 (t, 2H, J = 6.84 Hz), 1.72-1.18 (m, 21H)
LC/MS, 계산치 C33H39N2O8S2 - 655.22, 측정치 655.24
λabs (물) : 647 nm, λfl (물) : 678 nm
(3) 화합물 1-2의 합성
Figure pat00038
화합물 10-2 (20 mg, 0.0305 mmol, 1 eq)를 DMF 4 mL에 녹이고 55℃로 승온하였다. 0.02 mL의 피리딘을 넣은 후 DSC (40 mg, 0.156 mmol, 5.13 eq)를 DMF 0.35 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1시간 동안 교반하고, 에틸아세테이트를 가하여 고체를 석출시키고, 석출된 청색 고체를 에틸아세테이트와 에테르로 여러 번 세정하면서 여과하였다. 이것을 DMF 4 mL에 용해 시키고, 40 mg의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 (6.5 mg, 0.0312 mmol, 1.03 eq)을 0.1 mL의 DMF에 녹여서 적가하고, 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-2를 얻었다. (18.5 mg, 79%)
Rf = 0.58 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 2H, J = 13.0 Hz), 8.00 (t, 1H, J = 5.21 Hz), 7.81 (s, 2H), 7.62 (d, 2H, J = 10.3 Hz), 7.31 (d, 2H, J = 7.50 Hz), 6.98 (dd, 1H, J = 9.91 Hz, 9.92 Hz), 6.62 (t, 1H, J = 12.3 Hz), 6.32-6.21 (m, 4H), 4.13-4.07 (m, 4H), 3.25 (m, 2H), 2.03 (t, 2H, J = 7.13 Hz), 1.68-1.23 (m, 23H)
LC/MS, 계산치 C37H48N3O9S3 + 774.25, 측정치 774.29
λabs (물) : 648 nm (ε = 2.012 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 679 nm
실시예 3: 화합물 1-3의 제조
(1) 화합물 9-3의 합성
Figure pat00039
화합물 6a-1 (2.2 g, 8.23 mmol, 1 eq)과 GDH (2.812 g, 9.87 mmol, 1.2 eq, TCI)를 10 mL의 무수 아세트산에 넣고 100℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트를 이용하여 고체를 생성시키고, 여과하여 감압 건조시켰다. (2.92 g, 76%)
Rf = 0.80 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
(2) 화합물 10-3의 합성
Figure pat00040
화합물 9-3 (7.2 g, 17.5 mmol, 1 eq)과 화합물 6b-1 (5.94 g, 17.5 mmol, 1 eq)을 108 mL의 피리딘에 용해시킨 후 40℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트를 가하여 녹색의 고체를 생성시킨 후, 여과하고 감압 건조시켰다. 30% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-3을 얻었다. (2.59 g, 23%)
Rf = 0.38 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.87 (t, 2H, J = 12.8 Hz), 7.72 (m, 3H), 7.50 (d, 2H, J = 11.9 Hz), 7.28 (d, 2H, J = 8.24 Hz), 6.58-6.49 (m, 2H), 6.36 (d, 2H, J = 13.7 Hz), 4.10-4.03 (m, 4H), 1.98 (t, 2H), 1.70-1.22 (m, 21H)
LC/MS, 계산치 C35H41N2O8S2 - 681.23, 측정치 681.28
λabs (물) : 748 nm, λfl (물) : 786 nm
(3) 화합물 1-3의 합성
Figure pat00041
화합물 10-3 (20.8 mg, 0.0305 mmol, 1 eq)을 DMF 4 mL에 녹이고 55℃로 승온하였다. 0.02 mL의 피리딘에 용해시킨 후 DSC (23.6 mg, 0.0921 mmol, 3.02 eq)를 DMF 0.3 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 1시간 동안 교반하고 에틸 아세테이르를 가하여 고체를 석출시키고, 석출된 녹색 고체를 에틸아세테이트와 에테르로 여러 번 세정하면서 여과하였다. 이것을 DMF 4 mL에 녹이고, 40 mg의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 (6.5 mg, 0.0312 mmol, 1.03 eq)을 0.1 mL의 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 12 시간 이상 교반하였다. 물과 디클로로메탄을 사용하여 추출하고 35 내지 40℃에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 20% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-3을 얻었다. (17.9 mg, 73%)
Rf = 0.50 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.03 (t, 1H), 7.88-7.60 (m, 7H), 7.29 (dd, 2H, J = 3.24 Hz, 3.23 Hz), 6.97 (m, 1H), 6.54 (m, 2H), 6.39-6.22 (m, 4H), 4.10-4.03 (m, 4H), 3.23 (m, 2H), 2.03 (t, 2H, J = 7.08 Hz), 1.62-1.12 (m, 23H)
LC/MS, 계산치 C39H50N3O9S3 + 800.27, 측정치 800.32
λabs (물) : 748 nm (ε = 1.464 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 790 nm
실시예 4 내지 15
상기 실시예 1 내지 3에 설명된 것과 유사한 방법으로 이하의 실시예 4 내지 15의 화합물 (화합물 1-4 내지 1-15)을 제조하였다. 이들 화합물의 구조 확인 데이터는 다음과 같다.
실시예 4: 화합물 1-4의 제조
(1) 화합물 6a-2
Figure pat00042
(19.81 g, 98%)
Rf = 0.45 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 9-4
Figure pat00043
(10.28 g, 85%)
Rf = 0.10 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(3) 화합물 10-4
Figure pat00044
(3.06 g, 20.6%)
Rf = 0.49 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34 (t, 1H, J = 13.2 Hz), 7.78 (s, 2H), 7.65 (d, 2H, J = 8.04 Hz), 7.39 (m, 2H), 6.56 (dd, 2H, J = 13.16 Hz, 13.44 Hz), 4.10 (m, 4H), 1.88 (t, 2H, J = 6.88 Hz), 1.77-1.38 (m, 21H), 0.96 (t, 3H, J = 7.24 Hz)
LC/MS, 계산치 C32H39N2O8S2 - 643.22, 측정치 643.29
λabs (물) : 550 nm, λfl (물) : 574 nm
(4) 화합물 1-4
Figure pat00045
(39.5 mg, 84%)
Rf = 0.55 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 1H, J = 13.4 Hz), 7.99 (m, 1H), 7.79 (s, 2H), 7.66 (d, 2H, J = 7.86 Hz), 7.39 (dd, 2H, J = 8.68 Hz, 8.60 Hz), 6.96 (dd, 1H, J = 9.90 Hz, 9.96 Hz), 6.51 (t, 2H, J = 9.25 Hz), 6.23 (m, 2H), 4.09 (m, 4H), 3.21 (m, 2H), 2.05 (m, 2H), 1.76-1.24 (m, 23H), 0.96 (t, 3H, J = 6.99 Hz)
LC/MS, 계산치 C36H46N3O9S3 - 760.24, 측정치 760.30
*λabs (물) : 551 nm , λfl (물) : 576 nm
실시예 5: 화합물 1-5의 제조
(1) 화합물 9-5
Figure pat00046
(9.12 g, 71%)
Rf = 0.13 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 10-5
Figure pat00047
(2.17 g, 16%)
Rf = 0.49 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34 (t, 2H, J = 12.8 Hz), 7.79 (s, 2H), 7.61 (d, 2H, J = 7.80 Hz), 7.31 (t, 2H, J = 9.2 Hz), 6.59 (t, 1H, J = 12.1 Hz), 6.30 (dd, 2H, J = 3.53 Hz, 3.47 Hz), 4.05 (m, 4H), 1.97 (t, 2H, J = 6.96 Hz), 1.72-1.22 (m, 21H), 0.92 (t, 3H, J = 7.24 Hz)
LC/MS, 계산치 C34H41N2O8S2 - 669.23, 측정치 669.30
λabs (물) : 649 nm , λfl (물) : 668 nm
(3) 화합물 1-5
Figure pat00048
(43.1 mg, 88.3%)
Rf = 0.55 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34 (t, 2H, J = 12.6 Hz), 7.97 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.62 (d, 2H, J = 7.8 Hz), 7.31 (t, 2H), 6.95 (dd, 1H, J = 9.88 Hz, 9.96 Hz), 6.58 (t, 1H, J = 11.9 Hz), 6.33-6.21 (m, 4H), 4.06 (m, 4H), 3.21 (t, 2H, J = 6.88 Hz), 2.03 (t, 2H, J = 6.96 Hz), 1.74-1.24 (m, 23H), 0.93 (t, 3H, J = 7.24 Hz)
LC/MS, 계산치 C38H48N3O9S3 - 786.26, 측정치 786.34
λabs (물) : 649 nm, λfl (물) : 672 nm
실시예 6: 화합물 1-6의 제조
(1) 화합물 9-6
Figure pat00049
(5.49 g, 65%)
Rf = 0.55 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
(2) 화합물 10-6
Figure pat00050
(2.60 g, 20%)
Rf = 0.37 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.92-7.73 (m, 5H), 7.62 (d, 2H, J = 8.13 Hz), 7.30 (t, 2H, J = 7.62 Hz), 6.50 (t, 2H), 6.38 (dd, 2H, J = 3.84 Hz, 4.05 Hz), 4.04 (m, 4H), 2.01 (t, 2H, J = 6.96 Hz), 1.75-1.23 (m, 21H), 0.94 (t, 3H, J = 7.29 Hz)
LC/MS, 계산치 C36H43N2O8S2 - 695.25, 측정치 695.29
λabs (물) : 749 nm, λfl (물) : 790 nm
(3) 화합물 1-6
Figure pat00051
(35.5 mg, 70%)
Rf = 0.48 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.98 (m, 1H), 7.87 (t, 2H, J = 10.6 Hz), 7.73 (m, 3H), 7.61 (d, 2H, J = 8.08 Hz), 7.29 (dd, 2H, J = 8.21 Hz, 8.40 Hz), 6.96 (dd, 1H, J = 10.1 Hz, 10.1 Hz), 6.54 (t, 2H, J = 12.1 Hz), 6.36 (t, 2H, J = 14.1 Hz), 6.23 (m, 2H), 4.03 (m, 4H), 3.22 (m, 2H), 2.03 (t, 2H, J = 7.26 Hz), 1.74-1.22 (m, 23H), 0.93 (t, 3H, J = 7.22 Hz)
LC/MS, 계산치 C40H50N3O9S3 - 812.27, 측정치 812.35
λabs (물) : 749 nm, λfl (물) : 789 nm
실시예 7: 화합물 1-7의 제조
(1) 화합물 6a-3
Figure pat00052
(13.45 g, 82%)
Rf = 0.13 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 9-7
Figure pat00053
(6.48 g, 52%)
Rf = 0.33 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(3) 화합물 10-7
Figure pat00054
(0.94 g, 27%)
Rf = 0.80 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, D2O) : δ 7.95 (m, 1H), 7.84-7.62 (m, 4H), 7.46 (d, 2H, J = 7.89 Hz), 6.51 (d, 2H, J = 8.22 Hz), 4.41 (t, 2H, J = 8.07 Hz), 3.56 (s, 3H), 1.90 (m, 2H), 1.70-1.24 (m, 18H)
MALDI-TOF M/S, 계산치 C30H37N2O8S2 + 617.2, 측정치 617.53
λabs (물) : 546 nm, λfl (물) : 570 nm
(4) 화합물 1-7
Figure pat00055
(37.2 mg, 82%).
Rf = 0.71 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.31 (t, 1H), 8.06 (t, 1H, J = 5.86 Hz), 7.64 (s, 2H), 7.65 (m, 2H), 7.38 (dd, 2H, J = 4.32 Hz, 4.36 Hz), 6.97 (dd, 1H, J = 9.36 Hz, 9.96 Hz), 6.46 (dd, 2H, J = 5.24 Hz, 5.36 Hz), 6.23 (m, 2H), 4.08 (m, 4H), 3.64 (s, 3H), 3.21 (t, 2H, J = 6.72 Hz), 2.04 (t, 2H, J = 6.84 Hz), 1.68-1.23 (m, 20H)
LC/MS, 계산치 C34H42N3O9S3 - 732.21, 측정치 732.47
λabs (물) : 549 nm, λfl (물) : 568 nm
실시예 8: 화합물 1-8의 제조
(1) 화합물 9-8
Figure pat00056
(2.05 g, 74%)
Rf = 0.25 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 10-8
Figure pat00057
(0.88 g, 15%)
Rf = 0.63 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.91 (t, 2H, J = 13.7 Hz), 7.74-7.69 (m, 4H), 7.24 (t, 2H, J = 8.43 Hz), 6.45 (t, 1H, J = 12.5 Hz), 6.16-6.11 (m, 2H), 3.98 (t, 2H, J = 5.95 Hz), 3.49 (s, 3H), 2.11 (t, 2H, J = 7.06 Hz), 1.73-1.34 (m, 18H)
LC/MS, 계산치 C32H37N2O8S2 - 641.20, 측정치 641.27
λabs (물) : 646 nm , λfl (물) : 666 nm
(3) 화합물 1-8
Figure pat00058
(38.1 mg, 81%)
Rf = 0.63 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34 (t, 2H, J = 13.5 Hz), 8.00-7.94 (m, 3H), 7.79 (s, 2H), 7.61 (t, 2H, J = 8.04 Hz), 7.30 (dd, 2H, J = 3.04 Hz, 3.00 Hz), 6.97 (dd, 1H, J = 10.5 Hz, 10.2 Hz), 6.57 (t, 1H, J = 12.2 Hz), 6.31-6.21 (m, 4H), 4.06 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 3.21 (t, 2H, J = 6.64 Hz), 2.02 (t, 2H, J = 7.08 Hz), 1.67-1.24 (m, 20H)
LC/MS, 계산치 C36H44N3O9S3 - 758.22, 측정치 758.47
λabs (물) : 646 nm, λfl (물) : 674 nm
실시예 9: 화합물 1-9의 제조
(1) 화합물 9-9
Figure pat00059
(11.49 g, 80.9%)
Rf = 0.83 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
(2) 화합물 10-9
Figure pat00060
(1.33 g, 16%)
*Rf = 0.43 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.80-7.62 (m, 5H), 7.33 (t, 2H, J = 13.2 Hz), 7.17 (t, 2H, J = 7.32 Hz), 6.34 (t, 2H, 12.2 Hz), 6.06 (dd, 2H, J = 5.26 Hz, 5.05 Hz), 3.92 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 2.10 (t, 2H, J = 7.45 Hz), 1.90-1.20 (m, 18H)
LC/MS, 계산치 C34H39N2O8S2 - 667.22, 측정치 667.33
λabs (물) : 746 nm, λfl (물) : 783 nm
(3) 화합물 1-9
Figure pat00061
(40.6 mg, 84%)
Rf = 0.57 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.00 (m, 1H), 7.88-7.86 (m, 2H), 7.73 (m, 3H), 7.61 (t, 2H, J = 6.64 Hz), 7.28 (dd, 2H, J = 8.12 Hz, 8.00 Hz), 7.10-6.90 (m, 1H), 6.53-6.49 (m, 2H), 6.34-6.22 (m, 4H), 4.02 (m, 2H), 3.57 (s, 3H), 3.22 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 1.74-1.22 (m, 20H)
LC/MS, 계산치 C38H46N3O9S3 - 784.24, 측정치 784.47
λabs (물) : 746 nm, λfl (물) : 792 nm
실시예 10: 화합물 1-10의 제조
(1) 화합물 6a-4
Figure pat00062
(5.65 g, 96%)
Rf = 0.58 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 9-10
Figure pat00063
(1.75 g, 56.1%)
Rf = 0.08 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(3) 화합물 10-10
Figure pat00064
(1.09 g, 23.3%)
Rf = 0.61 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34 (t, 1H, J = 13.4 Hz), 7.86 (s, 2H), 7.79 (d, 2H, J = 7.72 Hz), 7.38 (d, 2H, J = 6.16 Hz), 6.56 (dd, 2H, J = 13.6 Hz, 13.5 Hz), 4.11 (m, 4H), 1.92 (t, 2H, J = 6.96 Hz), 1.76-1.22 (m, 25H), 0.92 (t, 3H, J = 7.2 Hz)
L/C M/S, 계산치 C33H41N2O8S2 - 657.23, 측정치 657.28
λabs (물) : 551 nm, λfl (물) : 567 nm
(4) 화합물 1-10
Figure pat00065
(187.4 mg, 81.9%)
Rf = 0.60 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.36 (t, 1H), 8.02 (t, 1H), 7.81 (s, 2H), 7.68 (d, 2H), 7.40 (dd, 2H), 6.97 (dd, 1H), 6.53 (dd, 2H), 6.23 (m, 2H), 4.12 (m, 4H), 3.22 (t, 2H), 2.05 (t, 2H), 1.75-1.18 (m, 27H), 0.93 (t, 3H)
LC/MS, 계산치 C37H48N3O9S3 - 774.26, 측정치 774.53
λabs (물) : 551 nm (ε = 1.738 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 568 nm
실시예 11: 화합물 1-11의 제조
(1) 화합물 9-11
Figure pat00066
(2.92 g, 88%)
Rf = 0.08 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 10-11
Figure pat00067
(1.15 g, 23.6%)
Rf = 0.42 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34 (t, 2H, J = 12.0 Hz), 7.80 (s, 2H), 7.62 (d, 2H, J = 7.20 Hz), 7.32 (m, 2H), 6.59 (t, 1H, J = 11.5 Hz), 6.31 (m, 2H), 4.08 (m, 4H), 2.04 (t, 2H), 1.77-1.21 (m, 25H), 0.90-0.79 (m, 3H)
LC/MS, 계산치 C35H43N2O8S2 - 683.25, 측정치 683.33
λabs (물) : 649 nm , λfl (물) : 668 nm
(3) 화합물 1-11
Figure pat00068
(185 mg, 76.9%)
Rf = 0.51 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 2H, J = 12.4 Hz), 8.00 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.61 (d, 2H, J = 8.32 Hz), 7.30 (dd, 2H, J = 4.00 Hz, 4.20 Hz), 6.96 (m, 1H), 6.58 (t, 1H), 6.31-6.21 (m, 4H), 4.07 (m, 4H), 3.22 (t, 2H, J = 6.60 Hz), 2.03 (t, 2H, J = 7.04 Hz), 1.53-1.22 (m, 27H), 0.91 (t, 3H, J = 7.28 Hz)
LC/MS, 계산치 C39H50N3O9S3 - 800.27, 측정치 800.36
λabs (물) : 649 nm (ε = 2.024 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 670 nm
실시예 12: 화합물 1-12의 제조
(1) 화합물 9-12
Figure pat00069
(2.52 g, 71.8%)
Rf = 0.42 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
(2) 화합물 10-12
Figure pat00070
(1.26 g, 25.0%)
Rf = 0.35 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.79-7.73 (m, 5H), 7.61 (d, 2H, J = 6.84 Hz), 7.29 (dd, 2H, J = 3.48 Hz, 3.16 Hz), 6.56 (t, 2H, J = 12.1 Hz), 6.36 (d, 2H, J = 13.6 Hz), 4.04 (m, 4H), 2.01 (t, 2H), 1.50-1.33 (m, 25H), 0.90 (t, 3H, J = 7.16 Hz)
LC/MS, 계산치 C37H45N2O8S2 - 709.26, 측정치 709.34
λabs (물) : 749 nm, λfl (물) : 778 nm
(3) 화합물 1-12
Figure pat00071
(171.7 mg, 69.1%)
Rf = 0.44 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.02-7.72 (m, 6H), 7.63 (d, 2H), 7.28 (m, 2H), 6.98 (dd, 1H), 6.55 (t, 2H), 6.36 (dd, 2H), 6.28-6.22 (m, 2H), 4.05 (m, 4H), 3.23 (m, 2H), 2.02 (t, 2H), 1.70-1.21 (m, 23H), 0.92 (t, 3H)
LC/MS, 계산치 C41H52N3O9S3 - 826.29, 측정치 826.80
λabs (물) : 749 nm (ε = 1.817 x 105 M-1cm-1), λfl (물) : 779 nm
실시예 13: 화합물 1-13의 제조
(1) 화합물 6b-2
Figure pat00072
(10.18 g, 64%)
Rf = 0.13 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 10-13
Figure pat00073
(1.47 g, 24%)
Rf = 0.71 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 1H, J = 13.5 Hz), 7.79 (s, 2H), 7.68 (d, 2H, J = 8.22 Hz), 7.41 (m, 2H), 6.57 (dd, 2H, J = 5.00 Hz, 4.78 Hz), 4.18-4.11 (m, 4H), 2.05 (t, 2H), 1.69-0.83 (m, 19H)
LC/MS, 계산치 C30H35N2O8S2 - 615.18, 측정치 615.28
λabs (물) : 549 nm, λfl (물) : 572 nm
(3) 화합물 1-13
Figure pat00074
(96.8 mg, 75.8%)
Rf = 0.70 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34 (t, 1H, J = 13.7 Hz), 8.07 (m, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.67 (d, 2H, J = 7.60 Hz), 7.39 (dd, 2H, J = 3.80 Hz, 3.92 Hz), 6.94 (dd, 1H, J = 9.96 Hz, 10.1 Hz), 6.51 (d, 2H, J = 13.3 Hz), 6.21 (m, 2H), 4.08 (m, 4H), 3.21 (t, 2H, J = 6.72 Hz), 2.04 (t, 2H, J = 6.84 Hz), 1.68-1.23 (m, 20H)
LC/MS, 계산치 C34H44N3O9S3 + 734.22, 측정치 734.07
λabs (물) : 549 nm, λfl (물) : 566 nm
실시예 14: 화합물 1-14의 제조
(1) 화합물 10-14
*
Figure pat00075
(1.66 g, 25.8%)
Rf = 0.63 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.90 (t, 2H, J = 13.1 Hz), 7.74-7.68 (m, 4H), 7.24 (d, 2H, J = 8.29 Hz), 6.46 (t, 1H, J = 12.8 Hz), 6.17 (dd, 2H, J = 10.5 Hz, 10.7 Hz), 3.98 (dd, 4H, J = 7.05 Hz, 6.86 Hz), 2.16 (t, 2H, J = 7.15 Hz), 1.83-1.23 (m, 18H)
LC/MS, 계산치 C32H37N2O8S2 - 641.2, 측정치 641.0
λabs (물) : 647 nm , λfl (물) : 675 nm
(2) 화합물 1-14
Figure pat00076
(16.0 mg, 70%)
Rf = 0.60 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.32 (t, 2H, J = 12.9 Hz), 8.04 (t, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.62 (t, 2H, J = 6.84 Hz), 7.30 (dd, 2H, J = 3.56 Hz, 3.52 Hz), 7.00-6.90 (m, 1H), 6.56 (t, 1H), 6.31-6.19 (m, 4H), 4.10 (m, 4H), 3.20 (m, 2H), 2.11 (t, 2H), 1.67-0.95 (m, 21H)
LC/MS, 계산치 C36H44N3O9S3 - 758.22, 측정치 758.33
λabs (물) : 647 nm, λfl (물) : 671 nm
실시예 15: 화합물 1-15의 제조
(1) 화합물 10-15
Figure pat00077
(1.32 g, 20%)
Rf = 0.52 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.79-7.66 (m, 5H), 7.36 (t, 2H, J = 12.1 Hz), 7.21 (d, 2H, J = 7.89 Hz), 6.40 (t, 2H, J = 12.8 Hz), 6.14 (dd, 2H, J = 3.09 Hz, 4.58 Hz), 3.99-3.97 (m, 4H), 2.17 (t, 2H, J = 6.23 Hz), 1.83-1.24 (m, 19H)
LC/MS, 계산치 C34H39N2O8S2 - 667.22, 측정치 667.46
λabs (물) : 747 nm, λfl (물) : 784 nm
(2) 화합물 1-15
Figure pat00078
(15.9 mg, 67.3%)
Rf = 0.52 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.08-7.61 (m, 8H), 7.28 (m, 2H), 7.00-6.90 (m, 1H), 6.54 (t, 2H, J = 12.9 Hz), 6.36 (dd, 2H, J = 5.64 Hz, 3.81 Hz), 6.25-6.19 (m, 2H), 4.10 (m, 4H), 3.22 (m, 2H), 2.13 (m, 2H, J = 7.26 Hz), 1.75-1.20 (m, 21H)
LC/MS, 계산치 C38H46N3O9S3 - 784.24, 측정치 784.34
λabs (물) : 747 nm, λfl (물) : 786 nm
실시예 16: 화합물 1-16의 제조
(1) 화합물 6b-3의 합성
Figure pat00079
2,3,3-트리메틸인돌레닌 (2,3,3-trimethylindolenine) (7.96 g, 50 mmol, 1 eq, Aldrich)과 6-브로모-n-헥산산 (11.7 g, 60 mmol, 1.2 eq, Aldrich)을 50 mL의 1,2-디클로로벤젠과 함께 12시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각 후 용매를 제거한 후 에틸아세테이트를 가하여 고체를 생성시켜 여과하고 감압 건조시켜 분홍색의 고체 입자를 얻었다. (13.1 g, 73.9%)
Rf = 0.8 (normal phase, methylene chloride/hexane/methanol 5:1:1 v/v)
1H NMR (300 MHz, CD3OD) : δ 7.91-7.87 (m, 1H), 7.80-7.79 (m, 1H), 7.67-7.69 (m, 2H), 4.56-4.51 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.38-2.33 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.03-1.98 (m, 2H), 1.80-1.52 (m, 10H)
(2) 화합물 9-13의 합성
Figure pat00080
1,2,3,3-테트라메틸-3H-인돌리움아이오다이드(1,2,3,3-tetramethyl-3H- indoliumiodide) (2.00 g, 6.65 mmol, 1 eq, Aldrich)와 DPF (1.34 g, 6.863 mmol, 1.03 eq, TCI)를 25 mL의 아세트산에 용해시키고 1시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 여과하고 에탄올과 에테르의 혼합 용액으로 2, 3번 재결정한다. 재결정된 주황색 입자를 여과하고 감압 건조시켰다. (2.31 g, 78%)
Rf = 0.55 (normal phase, methylene chloride/hexane/methanol 5:1:1 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 9.27-9.22 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 7.75-7.49 (m, 9H), 5.62-5.59 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 1.83 (s, 6H), 1.71 (s, 3H)
(3) 화합물 10-16의 합성
Figure pat00081
화합물 9-13 (2.97 g, 8.4 mmol, 1 eq)과 화합물 6b-3 (3.75 g, 8.4 mmol, 1 eq)을 300 mL의 에탄올과 3 mL의 트리에틸아민 (triethylamine) 혼합 용액에 용해시킨 후 30분 동안 가열 환류시킨다. 상온으로 냉각시키고, 감압 증류 후 건조시켰다. 디클로로메탄, 메탄올, 헥산 (hexane)의 5:1:1 혼합 전개액으로 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-16을 얻었다. (2.36 g, 48%)
Rf = 0.67 (normal phase, methylene chloride/hexane/methanol 5:1:1 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.37-8.30 (dd, J = 11.8 Hz, 14.5 Hz, 1H), 7.65-7.63 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 7.46-7.36 (m, 4H), 7.29-7.24 (m, 2H), 6.54-6.51 (d, J = 13.3 Hz, 2H), 4.09 (m, 2H), 3.64 (s, 3H), 2.32-2.28 (t, 2H), 1.69-1.42 (m, 18H)
LC/MS, 계산치 C30H37N2O2 + 457.28, 측정치 457.8
λabs (methanol) : 546 nm, λfl (methanol) : 564 nm
(4) 화합물 1-16의 합성
Figure pat00082
화합물 10-16 (460 mg, 1 mmol, 1 eq)을 DMF 5 mL에 녹이고 CDI (240 mg, 1.5 mmol, 1.5 eq)를 DMF 2.5 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 30분 동안 교반하고, 160 mg의 휘니그 베이스를 넣은 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 (210 mg, 1 mmol, 1 eq)을 2.5 mL의 DMF에 용해시킨 후 적가하고, 상온에서 24 시간 이상 교반하였다. 에테르를 가하고 고체를 생성 여과한 후 디클로로메탄, 메탄올, 헥산의 5:1:1 혼합 전개액으로 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-16을 얻었다. (0.37 g, 52%)
Rf = 0.68 (normal phase, methylene chloride/hexane/methanol 5:1:1 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.31 (t, 1H), 8.06 (t, J = 5.86 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.36 Hz, 2H), 7.44 (m, 4H), 7.30 (m, 2H), 6.97 (dd, J = 9.93 Hz, 9.91 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 6.25 (m, 2H), 4.11-4.07 (m, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.22 (t, J = 6.58 Hz, 2H), 2.06 (t, J = 7.04 Hz, 2H), 1.69-1.42 (m, 20H)
LC/MS, 계산치 C34H44N3O3S+ 574.31, 측정치 574.22
λabs (methanol) : 546 nm, λfl (methanol) : 564 nm
실시예 17: 화합물 1-17의 제조
(1) 화합물 9-14의 합성
Figure pat00083
1,2,3,3-테트라메틸-3H-인돌리움아이오다이드 (1 g, 3.865 mmol, 1 eq)와 MDH (1.106 g, 3.672 mmol, 0.95 eq, TCI)를 5 mL의 아세트산과 5 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 용해시키고 4시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 반응액을 제거 후 에틸아세테이트로 고체를 생성 여과하고 n-부탄올 (n-butanol)로 수차례 세정한 후 감압 건조시켰다. (1.56 g, 90%)
Rf = 0.60 (normal phase, methylene chloride/methanol 5:1 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.87-8.83 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 8.47-8.44 (t, J = 14.9, 1H), 7.75-7.49 (m, 9H), 6.83-6.79 (d, J = 14.9, 1H), 5.62-5.59 (dt, J = 12.9 Hz, 11.5 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 1.97 (s, 6H), 1.66 (s, 3H)
(2) 화합물 10-17의 합성
Figure pat00084
화합물 9-14 (1 g, 4.49 mmol, 1 eq)와 화합물 6b-3 (1.23 g, 10 mmol, 1.35 eq)을 15 mL의 무수 아세트산과 15 mL의 피리딘 혼합 용매에 넣은 후 110℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트를 가하여 청색의 고체를 생성시킨 후, 여과하고 감압 건조시켰다. 디클로로메탄, 메탄올, 헥산의 5:1:1 혼합 전개액으로 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-17을 얻었다. (0.35 g, 13%)
Rf = 0.70 (normal phase, methylene chloride/hexane/methanol 5:1:1 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34-8.27 (t, J = 14 Hz, 2H), 7.60-7.58 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.37-7.36 (m, 4H), 7.23 (m, 2H), 6.57-6.51 (t, J = 12 Hz, 1H), 6.30-6.22 (dd, J = 12 Hz, 14 Hz, 2H), 4.07 (bt, 2H), 3.65 (s, 3H), 2.18-2.15 (t, J = 12 Hz, 2H), 1.95-1.91 (m, 2H), 1.66-1.30 (m, 16H)
LC/MS, 계산치 C32H39N2O2 + 483.3, 측정치 483.11
λabs (methanol) : 641 nm, λem (methanol) : 678 nm
(3) 화합물 1-17의 합성
Figure pat00085
화합물 10-17 (150 mg, 0.3 mmol, 1 eq)을 DMF 3.5 mL에 용해시키고 CDI (73 mg, 0.45 mmol, 1.5 eq)를 DMF 0.8 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 30분 동안 교반하고 49 mg의 휘니그 베이스를 적가한 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 (63 mg, 0.3 mmol, 1 eq)을 0.8 mL의 DMF에 녹여서 적가하고 상온에서 24 시간 이상 교반하였다. 에테르를 가하여 고체를 생성 여과한 후 디클로로메탄, 메탄올, 헥산의 5:1:1 혼합 전개액으로 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-17을 얻었다. (0.106 g, 49%)
Rf = 0.67 (normal phase, methylene chloride/hexane/methanol 5:1:1 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.31 (t, J = 13 Hz, 2H), 8.02 (m, 1H), 7.60 (d, J = 7.28 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 4.48 Hz, 4H), 7.22 (m, 2H), 6.96 (dd, J = 10.0 Hz, 9.96 Hz, 1H), 6.55 (t, J = 12.2 Hz, 1H), 6.24 (m, 4H), 4.06 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.20 (t, J = 6.68 Hz, 2H), 2.03 (t, J = 7.24 Hz, 2H), 1.66-1.20 (m, 20H)
LC/MS, 계산치 C36H46N3O3S+ 600.33, 측정치 600.12.
λabs (물) : 641 nm, λfl (물) : 678 nm
실시예 18: 화합물 1-18의 제조
(1) 화합물 9-15의 합성
Figure pat00086
1,2,3,3-테트라메틸-3H-인돌리움아이오다이드 (6.626 g, 22 mmol, 1 eq)과 GDH (6.265 g, 22 mmol, 1 eq, TCI)을 16 mL의 무수 아세트산에 용해시키고 1 시간 동안 100℃에서 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 증류수를 가하여 고체를 생성 여과하고, 수차례 증류수로 세정한 후 감압 건조시켰다. (5.88 g, 54%)
Rf = 0.7 (normal phase, methylene chloride/methanol 5:1 v/v)
1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 8.19-8.15 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 7.84-6.89 (m, 13H), 5.45-5.39 (dt, J = 13.4 Hz, 11.7 Hz, 1H), 4.2 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.72 (s, 6H), 1.64 (s, 3H)
(2) 화합물 10-18의 합성
Figure pat00087
화합물 9-15 (0.5 g, 1 mmol, 1 eq)와 화합물 6b-3 (3.54 g, 1 mmol, 1 eq)을 7 mL의 피리딘에 용해시킨 후 40℃에서 30분 동안 교반시켰다. 상온으로 냉각시키고, 용매를 감압 증류하여 제거하였다. 디클로로메탄, 메탄올, 헥산의 5:1:1 혼합 전개액으로 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 10-18을 얻었다. (0.175 g, 28%)
Rf = 0.88 (normal phase, methylene chloride/methanol 5:1 v/v)
1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 7.87-7.74 (m, 3H), 7.58-7.55 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.40-7.33 (m, 4H), 7.25-7.21 (m, 2H), 6.55-6.49 (m, 2H), 6.35-6.30 (d, J = 13.9 Hz, 2H), 4.04-4.02 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 2.22-2.17 (t, J = 15 Hz, 2H), 1.67-1.26 (m, 18H)
LC/MS, 계산치 C34H41N2O2 + 509.32, 측정치 509.25
λabs (methanol) : 740 nm, λfl (methanol) : 775 nm
(3) 화합물 1-18의 합성
Figure pat00088
화합물 10-18 (153 mg, 0.3 mmol, 1 eq)을 DMF 3.5 mL에 녹이고 CDI (73 mg, 0.45 mmol, 1.5 eq)를 DMF 0.8 mL에 용해시킨 후 적가하였다. 30분 동안 교반하고 49 mg의 휘니그 베이스를 적가한 후, 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염 (63 mg, 0.3 mmol, 1 eq)을 0.8 mL의 DMF에 용해시킨 후 적가하고 상온에서 24 시간 이상 교반하였다. 에테르를 가하고 고체를 생성 여과한 후 디클로로메탄, 메탄올, 헥산의 5:1:1 혼합 전개액으로 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 1-18을 얻었다 (0.114 g, 52%).
Rf = 0.81 (normal phase, methylene chloride/methanol 5:1 v/v)
1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 8.03 (t, 1H), 7.87-7.75 (m, 3H), 7.57 (dd, J = 2.19 Hz, 2.31 Hz, 2H), 7.38 (m, 4H), 7.22 (m, 2H), 6.97 (dd, J = 9.9 Hz, 9.9 Hz, 1H), 6.52 (m, 2H), 6.35-6.22 (m, 4H), 4.03 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 3.21 (m, 2H), 2.05 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.67-1.26 (m, 20H)
LC/MS, 계산치 C38H48N3O3S+ 626.34, 측정치 626.38
λabs (methanol) : 741 nm, λfl (methanol) : 773 nm
실시예 19 내지 21
상기 실시예 1 내지 3에 설명된 것과 유사한 방법으로 이하의 실시예 19 내지 21의 화합물 (화합물 1-19 내지 21)을 제조하였다. 이들 화합물의 구조 확인 데이터는 다음과 같다.
실시예 19: 화합물 1-19의 제조
(1) 화합물 9-16
Figure pat00089
(1.83 g, 73.3%)
Rf = 0.05 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 10-19
Figure pat00090
(0.63 g, 17.5%)
Rf = 0.40 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 1H, J = 12.2 Hz), 7.79 (s, 2H), 7.65 (d, 2H, J = 8.37 Hz), 7.39 (d, 2H, J = 8.27 Hz), 6.50 (d, 2H, J = 13.1 Hz), 4.10 (m, 4H), 2.08 (t, 4H), 1.80-1.20 (m, 24H)
LC/MS, 계산치 C35H43N2O10S2 - 715.24, 측정치 715.18
λabs (물) : 551 nm, λfl (물) : 569 nm
(3) 화합물 1-19
Figure pat00091
(98.7 mg, 51.9%)
Rf = 0.45 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.30 (t, 1H, J = 13.5 Hz), 8.06-8.00 (m, 2H), 7.80 (s, 2H), 7.66 (d, 2H, J = 8.22 Hz), 7.39 (d, 2H, J = 8.19 Hz), 6.97 (dd, 2H, J = 9.87 Hz, 9.84 Hz), 6.50 (d, 2H, J = 13.3 Hz), 6.24 (m, 4H), 4.11 (m, 4H), 3.22 (t, 2H, J = 6.42 Hz), 3.09 (m, 2H), 2.06 (m, 4H), 1.70-1.14 (m, 28H)
LC/MS, 계산치 C43H57N4O12S4 - 949.29, 측정치 949.32
λabs (물) : 551 nm, λfl (물) : 571 nm
실시예 20: 화합물 1-20의 제조
(1) 화합물 9-17
Figure pat00092
(3.96 g, 75.4%)
Rf = 0.05 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
(2) 화합물 10-20의 합성
Figure pat00093
(1.15 g, 20.6%)
Rf = 0.35 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.34 (t, 2H, J = 12.9 Hz), 7.79 (s, 2H), 7.61 (d, 2H, J = 8.13 Hz), 7.30 (d, 2H, J = 8.28 Hz), 6.64 (t, 1H, J = 11.9 Hz), 6.27 (d, 2H, J = 13.8 Hz), 4.06 (m, 4H), 1.99 (t, 4H, J = 6.81 Hz), 1.80-1.23 (m, 24H)
LC/MS, 계산치 C37H45N2O10S2 - 741.25, 측정치 741.36
λabs (물) : 649 nm, λfl (물) : 674 nm
(3) 화합물 1-20
Figure pat00094
(47.1 mg, 48.2%)
Rf = 0.42 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.35 (t, 2H, J = 13.1 Hz), 8.19-7.99 (m, 2H), 7.80 (s, 2H), 7.61 (d, 2H, J = 8.20 Hz), 7.31 (d, 2H, J = 8.28 Hz), 6.97 (dd, 2H, J = 10.0 Hz, 9.96 Hz), 6.61 (t, 1H, J = 12.4 Hz), 6.31-6.21 (m, 4H), 4.07 (m, 4H), 3.22 (m, 2H), 3.13 (m, 2H), 2.18 (t, 2H, J = 7.20 Hz), 2.03 (t, 2H, J = 7.28 Hz), 1.67-1.20 (m, 28H)
LC/MS, 계산치 C45H59N4O12S4 - 975.3, 측정치 975.47
λabs (물) : 649 nm, λfl (물) : 675 nm
실시예 21: 화합물 1-21의 제조
(1) 화합물 9-18
Figure pat00095
(5.82 g, 99%)
Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)
(2) 화합물 10-21
Figure pat00096
(1.26 g, 33%)
Rf = 0.32 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
*1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 7.70-7.62 (m, 6H), 7.28 (t, 1H, J = 12.8 Hz), 7.14 (d, 2H, J = 8.38 Hz), 6.28 (t, 2H, J = 12.6 Hz), 6.02 (d, 2H, J = 13.6 Hz), 3.90 (m, 4H), 2.12 (t, 4H, J = 7.28 Hz), 1.69-1.31 (m, 24H)
LC/MS, 계산치 C39H47N2O10S2 - 767.27, 측정치 767.44
λabs (물) : 749 nm, λfl (물) : 786 nm
(3) 화합물 1-21
Figure pat00097
(42.3 mg, 42.2%)
Rf = 0.38 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) : δ 8.01 (t, 2H, J = 5.68 Hz), 7.86 (t, 2H, J = 13.1 Hz), 7.75-7.73 (m, 3H), 7.61 (d, 2H, J = 8.20 Hz), 7.28 (d, 2H, J = 8.48 Hz), 6.97 (dd, 2H, J = 9.96 Hz, 9.92 Hz), 6.54 (t, 2H, J = 11.9 Hz), 6.34 (d, 2H, J = 13.6 Hz), 6.26-6.22 (m, 4H), 4.11 (m, 4H), 3.21 (t, 4H, J = 6.80 Hz), 2.03 (t, 4H, J = 7.24 Hz), 1.62-1.23 (m, 28H)
LC/MS, 계산치 C47H61N4O12S4 - 1001.32, 측정치 1001.50
λabs (물) : 750 nm, λfl (물) : 792 nm
실시예 22: 아민 화합물과의 결합력 시험
벤질 아민 (benzyl amine, 분자량: 107.16, Aldrich) 0.1306 μmol을 10 μl의 DMF에 희석한 것을 pH 5의 0.1M 포스페이트 완충액 (phosphate buffer solution) 20 μl에 넣고, 화합물 1-16 1 mg을 DMF에 녹인 용액에서 1 μl를 분취하여 혼합하였다. 같은 방식으로 pH 6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 및 10의 포스페이트 완충액을 각각 사용하여, 벤질 아민과 화합물 1-16의 혼합 용액을 만든 후, 40℃에서 30분 동안 반응시켰다. 벤질 아민과 화합물 1-16이 반응하는 경우 하기 화학식 13에 나타낸 구조를 갖는 화합물이 생성될 것으로 예측된다.
Figure pat00098
반응 종료 후 HPLC로 벤질 아민, 화합물 1-16 및 생성물 (화합물 13)의 머무름 시간 (retention time, RT)을 확인하여 반응 수율을 얻었다. 이때 이동상으로는 메탄올을 사용하고, 이동 속도는 2.5 mL/min, 분석 시간은 80분이었으며, 254, 365, 450, 550 및 650 nm의 파장에서 다중 스캔 (multi-scan)하였다. 도 1은 파장 550 nm에서의 흡수값을 나타낸 것이다. 도 1에 있어서 "■"로 표시한 것은 위와 같이 반응시킨 다음 하루 동안 4℃에서 보관하였다가 분석한 것이고, "●"로 표시한 것은 앞서 분석 후 다시 7일이 경과한 후에 재분석한 것이다. 도 1에 의하면, pH 8.5 내지 9.0 구간에서 반응 수율이 60% 이상이었고, 저온에서 장기간 보관하였음에도 반응이 조금씩 진행되어 pH 8.5 내지 9.0 구간에서 반응 수율이 80% 이상인 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물 1-16은 안정성이 우수하고, 아민기를 가진 화합물에 대한 결합력도 매우 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 23: 단백질에 대한 염색 실험 (1)
지이 헬스케어사에서 시판 중인 SDS 전기영동을 위한 AmershameTM LMW Calibration 키트 (17-0446-01)의 1개의 팩 (pack) 중 1개의 바이알 (vial)에는 576 μg의 마커용 단백질로서, 포스포릴라아제 b (phosphorylase b) (97 kD, 67 μg), 알부민 (albumin) (66 kD, 83 μg), 오발부민 (ovalbumin) (45 kD, 147 μg), 카보닉 안하이드라이즈 (carbonic anhydrase) (30 kD, 83 μg), 티롭신 인히비터 (trypsin inhibitor) (20.1 kD, 80 μg), α-락탈부민 (α-lactalbumin) (14.4 kD, 116 μg)의 6종이 포함되어 있다.
상온 (20℃)에서 상기 마커용 단백질이 들어있는 1개의 바이알에 250 μl의 0.1 M 포스페이트 완충액을 가하여 용해시키고, 4개의 e-튜브에 25 μl씩 분취하였다 (25 μg protein / 25 μl buffer, 6.9x10-5 μmol in 25 μl buffer solution). 화합물 1-1 1 mg을 100 μl의 DMF에 용해시키고, 1 μl를 분취하여 앞서의 e-튜브에 넣은 후, 볼텍스 (vortex)와 원심분리기를 사용하여 균일하게 혼합하였다. 30℃로 맞춰 놓은 히팅 블럭 (heating block)에 각각의 e-튜브를 넣고 반응시켰다. 1시간이 지난 후에 1개의 e-튜브를 다시 뽑아서 -20℃에 보관하고, 다시 1시간, 2시간 및 16시간 경과 후에 각각 1개의 e-튜브의 반응을 종결시켜, 결과적으로 반응 시간이 1시간, 2시간, 4시간 및 20시간이 되도록 하였다.
또한, 상기 화합물 1-1의 용액을 0.25 μl 분취하고, 1 μl를 분취하여 반응시킨 것과 동일한 방법으로 반응시켰다.
상기 화합물 1-1의 용액을 1 μl를 분취하여 반응시킨 것과, 0.25 μl를 분취하여 반응시킨 것을 각각 15 μl씩 로딩 (loading)하여 겔 전기영동으로 전개한 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다. 전기영동은 125V에서 2시간 동안 진행하였다. 도 2a는 육안으로 관찰되는 사진이고, 도 2b는 형광 사진이다. 도 2에 있어서 ① 내지 ④는 1 μl의 염료 용액을 사용한 것이고, ⑤ 내지 ⑧은 0.25 μl의 염료 용액을 사용한 것이다. 도 2에 의하면, 화합물의 사용량이 많은 경우에 단백질 띠가 더 선명하게 보이며, 시간을 오래 두는 경우에 염색이 더 잘되고, 여러 단백질에 고루 염색이 된 것을 확인할 수 있다.
실시예 24: 단백질에 대한 염색 실험 (2)
pH 5, 6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9 및 10의 포스페이트 완충액을 준비하고, 실시예 23에서 사용한 것과 동일한 마커용 단백질 및 동일한 화합물 (화합물 1-1)을 사용하여 동일한 온도에서 반응을 진행하되, 염료 화합물 용액의 사용량을 모두 0.5 μl로 하여 2시간 동안 반응시켰다.
실시예 23의 방법과 동일하게 겔 전기영동 시키고, 육안으로 확인된 모습의 사진 (도 3a)과, Geliance 600 장비를 사용하여 촬영한 형광 사진 (도 3b)을 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, pH 5에서는 거의 염색이 되지 않았으나, 대체적으로 전 pH 범위에서 육안 및 형광 판독 양쪽 모두에서 단백질에 염색이 잘 된 것을 확인할 수 있고, 특히 pH 8.5 내지 10의 완충액에서 반응시킨 것이 가장 강한 형광을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 25: 단백질에 대한 염색 실험 (3)
지이 헬스케어사의 Native 전기영동을 위한 AmershameTM HMW Calibration 키트 (17-0445-01)의 1개의 팩 중 1개의 바이알에는 250 μg의 마커용 단백질 5종, 즉 티로글로블린 (thyroglobulin) (665 kD, 76 μg (30.4%)), 페리틴 (ferritin) (440 kD, 50 μg (20%)), 카탈라아제 (catalase) (232 kD, 36 μg (14.4%)), 락테이트 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase) (140 kD, 48 μg (19.2%)), 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin) (67 kD, 40 μg (16%))이 포함되어 있다. 1개의 바이알에 500 μl의 물을 넣어 용해시킨 후, Sartorius사의 VIVASPIN 500 (10kD)으로 여과하고, 반복적으로 물을 채워서 여러 번 여과하여 단백질 이외의 물질들을 완전히 제거하였다. 이것에서 1 μl씩을 분취하여 e-튜브에 넣은 것을 10개 만들었다.
포스페이트 완충액, 카보네이트 (carbonate) 완충액, 트리스 (tris) 완충액을 각각 0.1 M, 0.01 M 및 0.001 M의 농도로 준비하고, 앞서 준비한 e-튜브에 각각의 완충액과 농도별로 총 9개의 용액을 18 μl씩 넣고, 나머지 1개의 e-튜브에는 같은 부피의 증류수를 넣었다.
화합물 1-1 1 mg을 100 μl의 DMF에 용해시키고, 1 μl를 분취하여 앞에서 준비한 10개의 e-튜브에 각각 넣어 주고, 볼텍스와 원심분리기로 균일하게 혼합하였다.
36.5℃로 맞춘 히팅 블럭에 각각의 e-튜브를 넣고 4 시간 동안 반응시켰다. 실시예 23의 방법과 동일하게 겔 전기영동시켰다. 육안으로 확인된 모습의 사진 (도 4a)과, Geliance 600 장비를 사용하여 촬영한 형광 사진 (도 4b)을 도 4에 나타내었다. 여기서 사용된 지이 헬스케어의 마커용 단백질은 SDS-PAGE 용으로 나온 것은 아니어서 정확한 크기별로 분리는 어렵지만, 적어도 각 단백질들이 염색이 잘 되었는지는 확인이 가능하다. 각 사진에는 10개의 레인 (lane)이 있는데, 왼쪽부터 차례로 포스페이트 완충액 0.1 M, 0.01M, 0.001M, 카보네이트 완충액 0.1 M, 0.01M, 0.001M, 트리스 완충액 0.1 M, 0.01M, 0.001M이며, 맨 오른쪽의 레인은 물에서 반응시킨 것이다. 물에서 반응시킨 것을 포함하여 전체적으로 염색이 잘 되었고, 형광 사진으로 볼 때, 0.01M 농도에서 포스페이트 및 카보네이트 완충액 모두 가장 발현이 잘 되었으며, 특히 포스페이트 완충액 0.01 M에서 가장 우수한 형광을 나타내었다.
비교 실험 (1)
지이 헬스케어에서 시판 중인 AmershameTM CyTM5 Mono NHS Ester (PA15101, GE Cy5)와 화합물 1-2 각각 1 mg씩을 100 μl DMF에 용해시켜서 실시예 22에서와 같은 절차에 따라 실험하였다. GE Cy5와 화합물 1-2의 분자량이 다르기 때문에 1 μl를 분취할 경우 GE의 염료는 0.01376 μmol, 화합물 1-2는 0.01339 μmol에 해당한다. 동일한 몰수의 벤질 아민, 벤질 알코올 (분자량: 108.14, Aldrich), 벤질 메르캅탄 (분자량: 124.20, Aldrich)을 각각 20 μl의 DMF로 희석하여 준비하였다.
0.1 M 포스페이트 완충액을 준비하되, pH 5, 6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 11.5 및 12로 제조하여, 229 μl씩 pH 변수 12개를 1개의 세트로 하여 6개의 세트를 준비하였다. 1개의 세트에 GE Cy5 염료 용액 1 μl와 벤질 아민 희석액 20 μl를 넣었다. 동일한 방법으로 벤질 알코올 및 벤질 메르캅탄을 각각 GE Cy5 염료 용액과 혼합하였다. 동일한 방법으로 3개의 세트에 화합물 1-2의 용액과 3종의 벤질 화합물을 혼합하였다. 이렇게 준비한 64개의 e-튜브를 36.5℃로 맞춘 히팅 블럭에 넣고 4시간 동안 반응시켰다.
하기 화학식 14는 GE Cy5의 염료가 벤질 아민과 결합하는 경우에 예측되는 생성물의 구조이다.
Figure pat00099
LC/MS, 계산치 C40H46N3O7S2 - 744.28, 측정치 744.37
한편, 하기 화학식 15 내지 17은 본 발명의 화합물 1-2가 벤질 아민, 벤질 알코올 및 벤질 메르캅탄과 각각 결합하는 경우에 예측되는 생성물의 구조이다.
Figure pat00100
LC/MS, 계산치 C44H55N4O9S3 - 879.31, 측정치 879.57
Figure pat00101
LC/MS, 계산치 C44H54N3O10S3 - 880.3, 측정치 880.53
Figure pat00102
LC/MS, 계산치 C44H55N3O9S4 897.28, 측정치 897.03
반응 종료 후, HPLC로 벤질 아민, 벤질 알코올, 벤질 메르캅탄, GE Cy5 염료 및 화합물 1-2의 머무름 시간을 각각 확인하여 반응 수율을 계산하였다. 이동상으로는 20% 아세토니트릴 용액을 사용하고, 이동 속도는 1 mL/min, 분석 시간은 30분으로 하여 254, 365, 600, 650 및 700 nm의 파장에서 다중 스캔하였다. 650 nm의 파장의 흡수값을 바탕으로 계산한 반응 수율을 도 5a 내지 도 5c에 나타내었다.
도 5a 내지 도 5c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 1-2는 벤질 아민, 벤질 알코올 및 벤질 메르캅탄과 각각 모두 높은 수율로 반응하였고, 특히 pH 9 내지 11의 범위에서 90% 내외의 반응 수율을 보여주었다. GE Cy5 염료는 벤질 아민과만 반응하였고, pH 9 내지 11의 범위에서 50% 정도의 반응 수율을 나타내었으며, 벤질 알코올, 벤질 메르캅탄과는 반응하지 않았다. 이러한 결과는 LC/MS로 분자량을 측정하였을 때 GE Cy5의 염료가 벤질 알코올이나 벤질 메르캅탄과 결합한 구조의 분자량이 나오지 않은 것에 의해서도 확인되었다. 이러한 실험 결과로부터, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 아민기, 히드록시기 및 티올기가 있는 화합물과의 결합력이 우수하다는 것이 확인되었다.
비교 실험 (2)
다카라 (Takara Bio Inc.)사에서 시판되는 Protein Molecular Weight Marker (Broad) (Code No.3452)의 튜브 1개에는 단백질이 18 μg/μl 농도로 (총 50 μl 부피) 들어 있고, 트리스 완충액, EDTA, NaCl, 글리세롤 (glycerol) 등이 함께 포함되어 있다. 상기 단백질은 미오신 (200 kD), β-갈락토시다아제 (β-galactosidase) (116 kD), 포스포릴라아제 B (phosphorylase B) (97.2 kD), 혈청 알부민 (66.4 kD), 오발부민 (ovalbumin) (44.3 kD), 카보닉 안하이드라아제 (carbonic anhydrase) (29 kD), 티롭신 억제제 (trypsin inhibitor) (20.1 kD), 리소자임 (lysozyme) (14.3 kD), 아프로티닌 (aprotinin) (6.5 kD)의 9종으로 구성되어 있다. 다카라에서 구입한 상기 단백질 수용액을 Sartorius사의 VIVASPIN 500 (5kD)을 사용하여 여과하고, 여액으로부터 1 μl씩을 분취하여 e-튜브에 넣은 것을 10개 만들었다.
pH 8.5 0.1 M 포스페이트 완충액을 앞서 만든 10개의 e-튜브에 18 μl씩 동일하게 넣었다. 5개의 e-튜브에는 지이 헬스케어에서 시판되는 AmershameTM CyTM3 Mono NHS Ester (PA13101, 이하 GE Cy3) 1 mg과 화합물 1-1 1 mg을 각각 100 μl DMF에 용해시켰다. GE Cy3과 화합물 1-1의 용액을 각각 0.25 μl, 0.125 μl, 0.0625 μl, 0.025 μl 및 0.0025 μl씩 5개로 분취하되, 부피를 동일하게 맞추기 위하여 모두 DMF를 가하여 최종 부피가 1 μl가 되도록 하였다. 준비한 5개의 염료 용액 각각을 앞에서 준비한 단백질이 들어있는 10 개의 e-튜브에 넣고, 볼텍스와 원심분리기로 균일하게 혼합하였다. 36.5℃로 맞춰 놓은 히팅 블럭에 각각의 e-튜브를 넣고 4 시간 동안 반응시켰다.
실시예 23에서와 동일한 방법으로 겔 전기영동 시킨 후, 육안으로 확인된 모습의 사진 (도 6a)과, Geliance 600 장비를 사용하여 촬영한 형광 사진 (도 6b)을 도 6에 각각 나타내었다. 사진 상의 기호로 GA 내지 GE는 GE Cy3의 염료에 대한 것이고, A 내지 E는 본 발명의 화합물 1-1에 대한 것이며, 겔 사진의 6번째 및 12번째 레인은 칼라 사이즈 마커 (Takara, Prosieve Color Protein Marker, Cat. No. 50550)이다. 도 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물 1-1이 전체 9개의 단백질에서 GE Cy3의 염료에 비하여 우월하거나 비슷한 정도의 육안 판독 색깔 및 형광 강도를 나타내었다. 또한 낮은 염료 농도에서도 GE의 염료에 비하여 더 확연한 형광 성능을 나타내었다.
보다 구체적인 비교를 위하여, Geliance 600 기기 내에 내장되어 있는 GelTools (ver.3.07.14) 프로그램을 사용하여 형광 강도 (intensity)를 9개의 단백질 별로 비교하여, 도 7a 내지 도 7i에 나타내었다. 도 7a 내지 도 7i에 있어서, "GE"는 GE의 염료를 사용한 것이고, "KIST"는 본 발명의 화합물 1-1을 사용한 것이다. 도 7a 내지 도 7i에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물 1-1은 9개의 단백질에서 GE의 염료 표지 단백질에 비하여 형광 성능이 우월하였고, 특히 분자량이 50 kD 이상으로 갈수록 그 차이가 증가하고 있어서, 본 발명의 화합물이 고분자 염색에 더욱 탁월한 성능을 가지고 있다는 것이 확인되었다.
비교 실험 (3)
다카라 (Takara Bio Inc.)사에서 시판되는 Prosieve Protein Markers (Code No.50547) 튜브 1개에는 550 μg/500 μl 농도로 (총 500 μl 부피) 단백질이 포함되어 있고, 트리스 완충액, EDTA, NaCl, 글리세롤 등이 함께 포함되어 있다. 구성 단백질의 종류는 구체적으로 밝히고 있지 않으나, 분자량이 각각 225 kD, 150 kD, 100 kD, 75 kD, 50 kD, 35 kD, 25 kD, 15 kD, 10 kD 및 5 kD인 10종의 단백질이 들어 있는데, 분자량이 50 kD인 것은 100 μg이 들어있고, 나머지는 모두 50 μg씩 들어있다고 밝히고 있다. 이 단백질 용액을 Sartorius사의 VIVASPIN 500 (10kD)으로 여과한 후 물을 500 μl씩 채우고, 수차례 반복 여과하여 단백질 이외의 물질을 모두 제거하였다. 이것에서 2 μl씩을 분취하여 e-튜브에 넣은 것을 12개 만들었다.
지이 헬스케어의 염료로서 비교예 2에서 사용한 제품 (이하 GE Cy3), 비교예 1에서 사용한 제품 (이하 GE Cy5), 그리고 AmershameTM CyTM7 Mono NHS Ester (PA17101, 이하 GE Cy7) 1 mg 제품을 각각 100 μl의 DMF에 용해시켜 준비하였다.
한편, 본 발명의 화합물 1-7, 화합물 1-1, 화합물 1-4, 화합물 1-10, 화합물 1-13, 화합물 1-19, 화합물 1-16, 화합물 1-2 및 화합물 1-3을 1 mg씩 취하여 각각 100 μl의 DMF에 용해시켜, 화합물 1-7의 용액 (이하 3-1), 화합물 1-1의 용액 (이하 3-2), 화합물 1-4의 용액 (이하 3-3), 화합물 1-10의 용액 (이하 3-4), 화합물 1-13 의 용액 (이하 3-5), 화합물 1-19의 용액 (이하 3-6), 화합물 1-16의 용액 (이하 3-7), 화합물 1-2의 용액 (이하 5-1) 및 화합물 1-3의 용액 (이하 7-1)을 준비하였다.
pH 9.5 0.1 M 포스페이트 완충액을 앞서 준비해 놓은 12개의 e-튜브에 동일하게 18 μl씩 넣고, GE Cy3, 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, GE Cy5, 5-1, GE Cy7 및 7-1을 각 1 μl씩 분취하여 각각의 e-튜브에 넣은 후 볼텍스와 원심분리기로 균일하게 혼합하였다. 36.5℃로 맞춘 히팅 블럭에 각각의 e-튜브를 넣고 6시간 동안 반응시켰다.
실시예 23에서와 동일하게 겔 전기영동 시킨 후, 육안으로 확인된 모습의 사진 (도 8a)과, Geliance 600 장비를 사용하여 측정한 형광 사진 (도 8b)을 도 8에 나타내었다. 도 8a 및 8b에서 모두 왼쪽부터 오른쪽으로 GE Cy3, 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, GE Cy5, 5-1, GE Cy7 및 7-1이 표지된 단백질의 색상과 형광을 나타낸다. 3-2, 3-3 및 3-4는 확연히 형광 발현이 우수하여, GE Cy3에 비하여 더 많은 양의 염료가 단백질에 표지되었음을 알 수 있다. GE Cy5 및 5-1은 거의 동일한 정도의 형광을 나타내고 있고, GE Cy7 및 7-1은 흡수나 형광 파장 모두 근적외선 영역에 걸쳐 있어서 육안으로는 확인되지 않지만, 형광 성능은 거의 동일하였다.

Claims (16)

  1. 다음 화학식 1로 표시되는 시아닌 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00103

    식 중에서,
    R1, R1'은 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이고,
    R2, R2', R3 및 R3'은 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고,
    R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, -CONH(CH2)LSO2CH=CH2, -CONH-para-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-meta-(C6H4)SO2CH=CH2이고,
    B는 (CH2)l, para-(C6H4) 또는 meta-(C6H4)이고,
    m, m'은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고,
    L, l 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 다음 화학식으로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 화합물:
    Figure pat00104

    Figure pat00105

    Figure pat00106
  3. 제1항에 있어서, 500 내지 800 nm의 파장에서 형광을 나타내는 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물에 표지되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA로 구성된 군에서 선택되는 것인 화합물.
  6. 제1항에 따른 화학식 1의 화합물을 사용하여, 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 표지하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 표지는 화학식 1의 화합물의 비닐 설폰기와 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물의 아민기, 수산화기 또는 티올기의 반응에 의하여 상기 화학식 1의 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물이 결합하는 것에 의하여 이루어지는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 표지를 위한 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하는 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 표지는 pH 5 내지 12에서 이루어지는 것인 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 표지는 상기 화학식 1의 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안 반응시키는 것에 의하여 이루어지는 것인 방법.
  12. 제1항에 따른 화학식 1의 화합물로 표지되어 있는 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물로 구성된 군에서 선택되는 물질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA로 구성된 군에서 선택되는 것인 물질.
  14. 제1항에 따른 화학식 1의 화합물의 제조 중간체인 다음 화학식 10의 화합물:
    [화학식 10]
    Figure pat00107

    식 중에서,
    R1, R1'은 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이고,
    R2, R2', R3 및 R3'은 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고,
    R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기이고,
    m, m', n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
  15. 제14항에 있어서, 다음 화학식으로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 화합물:
    Figure pat00108

    Figure pat00109

    Figure pat00110
  16. (1) 다음 화학식 4의 화합물을 화학식 5 또는 7의 화합물과 반응시켜 화학식 6a의 화합물을 얻는 단계,
    [화학식 4]
    Figure pat00111

    [화학식 5]
    Figure pat00112

    [화학식 6a]
    Figure pat00113

    [화학식 7]
    Figure pat00114

    (2) 상기 화학식 6a의 화합물을 다음 화학식 8의 화합물과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 얻는 단계,
    [화학식 8]
    Figure pat00115

    [화학식 9]
    Figure pat00116

    (3) 상기 화학식 9의 화합물을 화학식 6b의 화합물과 반응시켜 화학식 10으로 표시되는 화합물을 얻는 단계,
    [화학식 6b]
    Figure pat00117

    [화학식 10]
    Figure pat00118

    (4) 상기 화학식 10의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시켜 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 얻는 단계, 및
    [화학식 11a]
    Figure pat00119

    [화학식 11b]
    Figure pat00120

    (5) 상기 화학식 11a 또는 11b의 화합물을 휘니그 염기 존재 하에서 하기 화학식 12로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
    [화학식 12]
    Figure pat00121

    [화학식 1]
    Figure pat00122

    식 중에서,
    R1, R1'은 각각 독립적으로 수소, 설폰산기 또는 설폰산염기이고,
    R2, R2', R3 및 R3'은 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이고,
    R4는 수소, 탄소 수 1 내지 6개의 알킬기, 카르복시기, -CONH(CH2)LSO2CH=CH2, -CONH-para-(C6H4)SO2CH=CH2 또는 -CONH-meta-(C6H4)SO2CH=CH2이고,
    R5는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자, 또는 설파토기 (-OSO3H)이고,
    A는 수소 또는 아세틸기이고,
    B는 (CH2)l, para-(C6H4) 또는 meta-(C6H4)이고,
    X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자이고,
    m, m'은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고,
    L, l 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
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