KR20100100941A - 녹농균의 ⅲ형 분비 장치 구성 단백질 ｐａ1698 - Google Patents
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Abstract
녹농균에 의한 감염을 실질적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 녹농균에 의한 감염 환자로부터 유래된 임상적으로 단리된 다양한 녹농균의 균주에 적용할 수 있는 항체 및 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따라, 녹농균의 III-형 분비 시스템 구성 단백질인 PA1698 단백질에 대한 또는 상기 단백질의 펩티드에 대한 항체, 및 상기 단백질 또는 펩티드를 포함하는 백신 조성물이 제공된다.
Description
본 발명은 녹농균의 III형 분비 장치 구성 단백질 PA1698에 대한 항체, 뿐 아니라 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 녹농균 감염 진단시약, 녹농균 감염 치료제, 및 녹농균 검출 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 PA1698 단백질 또는 그것의 펩티드를 항원으로서 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 토양, 수중 등 자연환경 중에 널리 일반적으로 분포되어 있는 그램 음성 간균이고, 난치성 및 치사성 감염증을 일으킨다. 그 주된 표적은 열상, 장기이식 또는 암환자를 포함한 생체 방어기능이 쇠약해진 감염성 환자(숙주)이다. 이와 같은 환자는 일반적으로 타협숙주(compromised host)라 불리운다. 녹농균은 병원내 감염의 주요한 원인균이다. 더욱이 본 균에 의한 폐감염증은 낭포성 섬유증 환자에게는 치사성이다. 항녹농균 활성을 갖는 항균제가 주로 이들 환자에게 투여된다. 그러나, 많은 경우, 녹농균에 대한 약물 내성으로 인해 충분한 치료효과가 얻어지지 않는다. 선택적으로, 녹농균에 대한 백신 또는 항체는 수년 동안 연구되어 왔다. 그러나, 세균의 비활성화 형태를 직접 이용하는 방법은 녹농균의 각각의 혈청형에 대해 다양한 백신 또는 항체를 개별적으로 조제해야 하는 결점이 있다.
이와 같은 상황에서, 녹농균 감염증의 예방 또는 치료는 녹농균 균주 중의 공통적인 아미노산 서열을 갖는 단백질인, 녹농균 유래 단백질을 이용하여 얻은 능동면역 또는 수동면역을 통해 기대되고 있다. 녹농균 유래의 단백질을 백신에 응용하는 예로는, 외막 단백질 OprF 및 OprI의 일부분을 서로 융합시킨 재조합 단백질 (일본 특개평 8-245699 호 공보) IV형 필린 단백질(WO2004/099250) 등이 보고되어 있다.
또 녹농균 유래의 단백질을 표적으로 하는 치료적 항체에 관하여는 항-IV형 필린 항체(WO2004/099250), 항-PA1706 (또는 PcrV) 항체 (US 6309651, US 6827935); 항-PA5158 항체(WO 20007/049770); 항-PA0427 항체(WO2007/114340) 등이 보고되어 있다.
한편, 다양한 혈청형을 나타내는 녹농균의 임상분리주가 공통으로 보유하는 균체-유래 단백질은, 본 발명의 "녹농균 공통 항원"으로서 녹농균 감염증의 예방, 진단 또는 치료에 응용할 수 있다.
한편, PA1698 (또는 PopN) 유전자 (유전자은행 수탁번호 AF010150)에 의해 암호화되는 PA1698 단백질은 녹농균의 III형 분비장치를 구성하는 단백질이다 (Journal of Bacteriology, 2007, 189, 2599-2609). III형 분비 장치는 병원성 세균이 병원성 인자를 숙주 세포질로 직접 운반할 사용되는 장치이다. III형 분비 장치는 대략 30개의 다양한 유형의 단백질로 형성된다. 지금까지, 항-PA1706 (또는 PcrV) 항체가 감염증에 대한 보호 효과를 갖는다고 보고되어 있다 (US6309651, US6827935).
그러나, 균주들 중 PA1698 단백질 돌연변이의 정도는 알려져 있지 않다. 이 단백질 또는 그것의 펩티드 단편이 백신 성분으로 사용되고, 그리고 이 단백질 또는 그것의 펩티드 단편으로부터 생산된 항체가 감염증의 치료제 또는 진단제로 사용된 경우는 없다.
본 발명의 목적은 녹농균 감염증을 실질적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 녹농균으로 감염된 환자로부터 유래된 임상 분리주의 다양성에 대처할 수 있는, 항체 및 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 신규하고 유용한 "녹농균 공통항원"을 위해 녹농균-외막 단백질의 조사를 시도하여 왔다. 다양한 연구 결과, 본 발명자들은 GeneChip 분석에 의해 PA1698 (또는 PopN) 단백질을 암호화하는 유전자, 즉 녹농균의 III형 분비 장치 구성 단백질이 인간 혈청의 존재 또는 부재와 상관없이 일정하게 발현된다는 것을 발견하였다 (실시예 1). 더욱이, 녹농균의 93개 임상 분리주에 대한 유전자 분석을 수행함에 의해, 본 발명자들은 놀랍게도 임상 분리주의 대략 70%가 완전하게 보존된 PA1698 단백질의 아미노산 서열을 갖고, 나머지 대략 30%의 임상 분리주도 오직 1 또는 2개의 아미노산 돌연변이체를 갖는다는 것을 발견하였다(실시예 2). 더욱이, 본 발명자들은 PA1698 재조합 단백질에 의해 면역화된 항체가 PA1698 단백질 (실시예 7 내지 9)과 결합하고, 이 항체는 세포독성 억제 효과를 나타내고 (실시예 10), 그리고 항체는 녹농균-감염 모델 마우스에서 감염증에 대한 강력한 보호 효과를 나타낸다 (실시예 11 및 12)는 것을 확인하였다.
다시 말하면, 본 발명에 의해, PA1698 단백질, 즉 녹농균의 III형 분비 장치 구성 단백질이 녹농균 공통 항원으로서 유용하고, 이 항원에 대한 항체는 녹농균과 결합하여, 녹농균의 감염증에 대한 뛰어난 예방 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다. 이 방법으로, 본 발명을 완성하였다.
더욱 상세하기는, 본 발명은 다음의 발명에 관한 것이다.
<1> 녹농균으로부터 유래된 PA1698 단백질에 결합하는, 항체 또는 그것의 기능적 단편.
<2> <1>에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편으로, 여기서 녹농균 유래 PA1698 단백질은 하기 (ⅰ) 또는 (ⅱ) 중 어느 하나에 기재된 단백질이다.
(ⅰ) SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(ⅱ) SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가에 의해 얻어진 아미노산 서열을 포함하는 단백질로, SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 것인 단백질.
<3> 녹농균의 표면에 결합하는, <1>에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편.
<4> 인간 기도 상피세포에 대한 녹농균의 세포독성 활성을 억제하는 활성을 갖는, <1>에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편.
<5> 녹농균에 감염된 환자에게서 항균 활성을 갖는, <1>에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편.
<6> 호중구 수준이 감소된 환자에게서 녹농균 감염증에 대한 항균 활성을 갖는, <5>에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편.
<7> 수탁 번호 FERM BP-11055 및 FERM BP-11056 중 어느 하나로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 에피토프에 결합하는, <1>에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편.
<8> 수탁 번호 FERM BP-11055 및 FERM BP-11056 중 어느 하나로 기탁된 하이브리도마.
<9> 녹농균과 관련된 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 백신 조성물로, 상기 백신 조성물은 녹농균으로부터 유래된 PA1698 단백질에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있는 단백질 항원 및 펩티드 항원 중 어느 하나를 포함하는 항원 조성물을 포함하고, 그리고 임의로 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및/또는 애쥬번트를 포함한다.
<10> <9>에 따른 백신 조성물로, 녹농균으로부터 유래된 PA1698 단백질은 하기 (ⅰ) 및 (ⅱ) 중 어느 하나에 기재된 단백질이다:
(ⅰ) SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질
(ⅱ) SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가에 의해 얻어진 아미노산 서열을 포함하는 단백질로, SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 것인 단백질.
<11> <9>에 따른 백신 조성물로, 여기서 녹농균과 관련된 질병은 녹농균 감염에 의한 전신성 감염 질병이다.
<12> 녹농균과 관련된 질병의 예방 및 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물로, 상기 약제학적 조성물은 <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하고, 임의로 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함한다.
<13> <12>에 따른 약제학적 조성물로, 여기서 녹농균 관련 질병은 녹농균 감염에 의해 야기되는 전신성 감염성 질병이다.
<14> <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는, 녹농균 감염증에 대한 진단 시약.
<15> <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는, 녹농균 검출 키트.
항체
본 발명에 따라, 녹농균으로부터 유래된 PA1698 단백질 또는 그것의 일부를 인식하는 항체 또는 그것의 기능적 단편이 제공된다. 본 발명에 따른 항체가 결합하는 녹농균의 PA1698 단백질의 아미노산 서열은 혈청형 등과 무관하게 균주들 중에서 극히 높게 보존적이라는 것을 발견하였다 (실시예 2). 그러므로, 본 발명에 따른 항체에 의해 표적화되는 녹농균의 PA1698 단백질은 바람직하기는 SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 PA01 균주로부터 유래된 단백질, 또는 SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된, SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질이고, 상기 단백질은 SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등하다. 일반적으로, 아미노산 서열에서 1 내지 2개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된다. 통상적으로, 1 내지 2개의 아미노산이 치환된다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하기는 실험 동물을 면역화시켜 항체를 유도할 수 있는 양으로 항원 조성물을 실험 동물에 투여함에 의해 (실험 동물을 면역화시킴에 의해) 얻어지고, 상기 항원 조성물은 항원으로서 순수한 PA1698 단백질을 함유한다. 항체는 심장 또는 동맥으로부터 혈액을 수집하고, 그로부터 면역혈청을 분리하고, 그리고 얻어진 면역혈청을 정제하여 순수한 항체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는: 마우스와 같은 포유동물을 (본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체를 포함하는) 항원으로서 작용하는 PA1698 단백질로 면역화시켜 얻는, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체; 유전적 재조합기술을 사용하여 제조된, 키메릭 항체 및 인간화 항체; 및 인간 항체-생산 유전자도입 동물 등을 사용하여 제조된 인간 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 항체가 의약으로서 인간에게 투여될 때, 인간 항체가 감소된 부작용의 면에서 바람직하다.
"인간항체"는 모든 영역이 인간으로부터 유래된 항체이다. 본 발명의 인간항체는, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 만들 수 있다 (예를 들면, Intern. Rev. Immunol, 1995, 13, 65-93, J. Mol. Biol, 1991, 222, 581-597, 일본 특개평 10-146194호 공보, 일본 특개평 10-155492호 공보, 일본 특허 제2938569호 공보, 일본 특개평 11-206387호 공보, 일본 특표평 8-509612호 공보, 일본 특표평 11-505107호 공보 등을 참조할 수가 있다).
"인간화 항체"는 마우스항체의 항원-결합부위 (CDR; 상보성 결정 영역)의 유전자 서열만을 인간항체 유전자에 이식하여 제조된 (CDR 그라프팅) 항체이다. 본 발명의 인간화 항체는, 당업자에게 주지된 방법을 이용해서 만들 수 있다(예를 들면, EP239400, WO90/07861호 공보 등을 참조할 수가 있다).
"키메릭 항체"는 어떤 종류의 항체의 가변영역과 그것과는 이종인 항체의 정상영역을 결찰하여 제조된 항체이다. 구체적으로는, 마우스를 항원으로 면역시키고, 마우스 모노클로날 항체의 유전자로부터 항원과 결합하는 항체 가변부(V 영역)를 잘라낸다. 그리고 나서, 이와 같이 얻은 V 영역을 인간 골수 유래의 항체 정상부(C 영역) 유전자에 결합시킨다. 이 방법으로 키메릭 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 키메라 항체는 당업자에게 주지된 방법을 이용해서 만들 수 있다 (예를 들면, 일본 특개평 8-280387호 공보, 미국특허 제4816397호 공보, 미국특허 제4816567호 공보, 미국특허 제5807715호 공보 등을 참조할 수 있다).
본 발명의 모노클로날 항체는 당업자에게 주지된 방법을 이용해서 만들 수가 있다 (예를 들면, Antibodies A LABORATORY MANUAL, Ed Harlow 및 David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory 1988; Experimental Manual for Monoclonal Antibody (1987) Kodansha, Sakuji Toyama et al.; Monoclonal Antibody-Hybridoma and ELISA (1987) Kodansha, Tatsuo Iwasaki et al. 등을 참조할 수 있다). 본 발명의 폴리크로날 항체는 당업자에게 주지된 방법을 이용해서 만들 수 있다.
본 발명의 "기능적 단편"은 항체의 일부분(부분 단편)을 의미하고, 이것은 본 발명의 단백질을 특이적으로 인식한다. 이것의 구체예는 Fab, Fab', F(ab')2, 가변영역 단편(Fv), 다이설파이드-결합 Fv, 1본쇄 항체(scFv), 및 이들의 중합체 등을 포함한다.
본 발명의 항체는 녹농균 감염증의 치료 또는 진단에, 또는 연구소의 시약으로서 사용될 수 있다. 이와 같은 항체는 PA1698 단백질을 인식하고 그리고 녹농균의 표면에 결합하는 항체를 포함한다. 실시예 8에 기재된 전세포 ELISA 시험을 수행할 때, 녹농균의 표면에 결합하는 바람직한 항체는 대조군과 비교하여 상당히 높은 흡광도를 갖는다. 정제된 IgG 분획의 경우, 흡광도는 바람직하기는 0.3 이상, 더욱 바람직하기는 0.5 이상, 더욱 바람직하기는 0.8 이상, 그리고 여전히 더욱 바람직하기는 1.0 이상 (예를 들면, 1.2 이상, 1.4 이상)이다.
녹농균 감염에 관한 본 발명의 항체의 적용가능한 형태에서, 녹농균에 감염된 환자에게서 항균 활성을 갖는 항체 또는 그것의 기능적 단편이 제공된다. 이 형태에서, 특히 바람직한 항체는 SEQ ID NO.:2로 표시되는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보수적인 치환을 포함하는 SEQ ID NO.:2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대한 항체 또는 그것의 기능적 단편을 포함한다.
녹농균에 대한 항균활성을 갖는 항체가 일단 특정되면, 본 분야의 당업자는 항체를 인식하는 펩티드 영역을 특정하고 그 영역에 결합하고 동일한 활성을 보이는 다양한 항체를 제공할 수 있다. 이와 같은 항체의 다양한 예는 FERM BP-11055 및 FERM BP-11056 중 어느 하나로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
녹농균에 감염된 환자는 예를 들면, 다양한 약물의 투여, 방사선치료 등으로 인해 호중구 수준이 감소된 환자일 수 있다. 본 발명의 항체는 심각한 감염이 전개될 것 같은 환자에게 효과를 나타낼 수 있는 이점이 있다. 한편, 환자가 감염된 녹농균은 다약제 내성 녹농균일 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 일반적으로 사용되는 항생물질로 치료될 수 없는 다약제 내성 녹농균으로 감염된 환자에게도 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 미만성 범세기관지염 (DPB) 및 낭포성 섬유증(CF)과 같은 만성 호흡관 감염에서, 기도 상피세포로부터의 점액 과다 분비 (뮤신)는 불량한 예후의 주요 인자로 작용하는 기도 폐색을 일으킨다. 녹농균은 만성 기관지 감염의 주요 원인 박테리아이다. 본 발명의 항체는 인간 기도 상피 세포를 향한 녹농균의 세포독성 활성을 억제할 수 있고, 그러므로 또한 만성 호흡기 감염의 치료에 효과를 나타낼 수 있다. 실시예 10에 기재된 실험을 수행할 때, 바람직한 항체는 인간 기도 상피세포의 세포 사멸을 10% 이상, 더욱 바람직하기는 15% 이상, 그리고 더욱 바람직하기는 20% 이상 억제한다. 이와 같은 항체의 예는 FERM BP-11055 및 FERM BP-11056으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체들을 포함한다.
이에 더하여, 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마가 제공된다. 바람직한 하이브리도마는 일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, postal code 305-8566, Japan))에 FERM BP-11055 (1698-1) 및 FERM BP-11056 (1698-2)으로 2008년 10월 31일에 기탁된 하이브리도마를 포함한다.
[백신 조성물]
녹농균으로부터 유래된 PA1698 단백질은 단백질 항원으로 사용될 수 있다. 따라서, 이와 같은 항원을 포함하는 항원 조성물은 녹농균과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 백신으로 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따르면, 녹농균으로부터 유래된 PA1698 단백질에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있는 항원 조성물을 포함하는 백신 조성물이 제공된다. 여기서, "항원 조성물"은 구성성분으로서 오직 단백질 항원만으로 구성된 조성물일 수 있고, 또는 다른 조성물을 부가적으로 포함하는 조성물일 수 있다.
본 발명에 따라, 녹농균과 관련된 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 백신 조성물이 제조될 수 있고, 상기 백신 조성물은 상기 항원 조성물을 포함하고, 및 부가적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및/또는 애쥬번트를 포함한다.
본 발명에 따른 백신 조성물에 사용되는 담체는 투여 양식 및 경로, 및 표준적인 제약 실무를 기준으로 선택된다. 담체는 캐리어 단백질 (예를 들면, 소 혈청 알부민(BSA), 난백 알부민 (OVA), 인간 혈청 알부민 (HSA), 그랜드 키홀 램펫 유래의 헤모시아닌 (KLH:Keyhole limpet hemocyanin) 등), 용해제 (예를 들면, 에탄올, 폴리솔베이트, Cremophor EL (등록상표) 등), 등장화제, 보존제, 항산화제, 부형제(예를 들면, 락토스, 전분, 결정성 셀룰로스, 만니톨, 말토스, 인산수소칼슘, 경무수규산, 탄산칼슘 등), 결합제 (예를 들면, 전분, 폴리비닐필롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로스, 에틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 아라비아 고무 등), 활택제 (예를 들면, 스테아린산 마그네슘, 탈크, 경화유 등), 안정화제 (예를 들면, 락토스, 만니톨, 말토스, 폴리솔베이트, 마크로골, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등) 등이 있다. 필요에 따라, 글리세린, 디메틸아세트아미드, 70% 유산 나트륨, 계면활성제, 또는 염기성 물질(예를 들면, 수산화나트륨, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 중탄산 나트륨, 알기닌, 메글루민, 트리스아미노메탄 등) 등을 첨가할 수 있다.
담체 단백질의 구체적인 예로서, 본 발명의 백신 조성물의 항원성을 높이기 위해, 본 발명의 펩티드룰 공지의 KLH 용액 (Calbiotec Inc. 제품, 50% 글리세롤 용액에 1ml 당 125mg을 용해시킨다)과 커플링 시킬 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 사용되는 희석제는 투여 양식 및 경로, 그리고 표준적인 제약 실무를 기준으로 선택된다. 희석제의 예는 물 또는 생리식염수, 인산염 완충 생리식염수, 중탄산염 용액 등을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물에 사용되는 애쥬번트는 투여 양식 및 경로, 그리고 표준적인 제약 실무를 기준으로 선택된다. 애쥬번트의 예는 콜레라 독소, 대장균의 열-민감 장독소 (LH), 리포솜, 또는 면역자극성 복합체 (ISCOM: immunostimulating complex) 등을 포함한다.
투여는 녹농균에 의한 감염 우려가 있는 투여 대상의 연령, 체중, 성별, 일반적인 건강 상태에 따라 다를 수 있다. 투여는 경구 투여 및 비경구 투여 (예를 들면, 정맥 투여, 동맥 투여, 및 국소 투여) 중 어느 투여 경로로 수행될 수 있다. 그러나, 비경구 투여가 바람직하다. 경구 및 비경구 투여용 제형 및 그것의 제조방법은 본 발명의 당업자에게 알려져 있다. 제형은 통상의 방법으로, 예를 들면, 본 발명의 항원 조성물을 상기 약제학적으로 허용가능한 담체 등과 혼합하여 제조될 수 있다. 경구 투여용 제형의 예는 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로 용제, 정제, 과립제, 산제 및 캡슐제를 포함한다. 비경구 투여용 제형의 예는 용제, 현탁제, 연고제, 크림제, 좌제, 안제, 점비제, 점이제를 포함한다. 경구 투여의 경우, 풍미제 및 착색제를 또한 첨가할 수 있다.
본 발명의 지속 방출이 바람직한 경우, 생분해성 중합체 (예를 들면, 폴리-D,L-락티드-코-글리코리드, 폴리글리코리드 등)을 증량 매트릭스로서 첨가할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제 5,417,986호, 미국 특허 제4,675,381호, 및 미국 특허 제 4,450,150호를 참조할 수 있다).
적절한 약제학적 담체, 희석제 등, 뿐 아니라 이들의 사용을 위해 의약상 필요물은 Remington's Pharmaceutical Sciences에 기재되어 있다.
본 발명의 백신 조성물의 투여량은 예를 들면, 백신 항원의 종류, 본 항원과 함께 애쥬번트를 투여할 수 있는지 여부, 함께 투여되는 애쥬번트의 종류, 투여 양식과 빈도, 및 희망 효과 (예를 들면, 예방 또는 치료 효과)에 따라 본 발명자들에 의해 결정된다. 일반적으로, 본 발명의 백신 조성물은 성인에게 투여 당 1㎍ 내지 100mg의 양으로 투여된다. 애쥬번트가 본 백신과 함께 투여되는 경우, 일반적으로 성인에게 투여 당 1 ng 내지 1mg의 양으로 투여된다. 본 발명자들의 결정에 따라, 필요한 경우 투여를 반복한다. 예를 들면, 초기 투여 후, 1주당 3회의 증강 투여가 수행될 수 있다. 선택적으로, 동일한 조합제를 사용하여, 증강 투여는 첫 번째 주입 후 제8주 내지 제12주에 수행되고 그리고 두 번째 증강 투여는 첫 번째 주입 후 제16주 내지 제20주에 수행될 수 있다.
[항체의 용도 및 약제학적 조성물]
녹농균 관련 질환
녹농균은 숙주의 저항력 저하에 의해 치명적 결과를 야기하는 면역체계가 약해졌을 때 발생하는 감염의 병원균이다. 더욱이, 항생물질에 내성이므로, 녹농균은 원내 감염의 주요 원인균이다. 아래 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체가 뮤신 투여에 의해 마크로파지 기능이 감소된 녹농균 감염-취약 뮤린 모델에서 실제로 감염 방어 효과를 갖고 (실시예 11), 본 발명의 항체가 시클로포스파미드 모노하이드레이트 투여에 의해 호중구 수준이 감소된 농균 감염-취약 뮤린 모델에서 실제로 감염 방어 효과를 갖는다 (실시예 12)는 것을 확인하였다. 더욱이, 본 발명의 항체가 감염에 대한 방어 효과를 갖는 이유는 녹농균의 세포독성 활성을 억제하는 능력을 포함한다 (실시예 10). 그러므로, 본 발명의 항체는 녹농균 관련 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
녹농균 관련 질환의 예는 다제 내성 녹농균 감염을 포함한 녹농균 감염에 기인하는 전신 감염성 질환, 예를 들면, 패혈증, 수막염, 심내막염을 포함한다. 다른 예는: 이비과 영역에서 중이염 및 부비강염; 호흡기과 영역에서 폐렴, 만성 기도 감염증 및 카테터 감염증; 외과 영역에서 술후 복막염, 담관 등의 술후 감염증; 안과 영역에서 안검 농양, 비루관 농양, 결막염, 각막 궤양, 각막 농양, 전안구염 및 안와 감염; 비뇨기과 영역에서, 복잡성 요로감염증을 포함하는 요로감염증, 카테터 감염증, 항문주변 농양을 포함한다. 게다가, 이들 예는 심각한 화상 및 호흡관 화상을 포함하는 화상, 욕창성 감염, 및 낭포성 섬유증을 포함한다.
본 발명에 의하면, 녹농균 관련 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공되고, 상기 방법은 예방 또는 치료상 유효량의 본 발명의 항체를 인간을 포함하는 포유류에 투여하는 단계를 포함한다.
녹농균 감염
진단제
아래의 실시예에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 항체는 녹농균에 결합한다는 것이 확인되었다 (실시예 8) 이들 결과는 본 발명의 항체가 녹농균의 존재를 검출할 수 있다는 것을 제안한다. 그러므로, 본 발명의 항체는 녹농균 감염증 진단제로서 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따라, 본 발명의 항체를 사용하는 녹농균 감염의 진단 방법이 제공된다.
본 발명의 진단방법은 녹농균 감염의 염려가 있는 인간을 포함하는 포유동물로부터 객담, 폐 세정액, 농, 눈물, 혈액, 뇨 등과 같은 생체 시료를 수집하고, 이어서,수집된 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키고, 그리고 항원-항체 반응이 생기는지 여부를 판단함으로써 수행될 수 있다.
녹농균 감염증 진단
키트
본 발명에 따라, 녹농균의 존재를 검출하기 위한 키트가 제공되고, 상기 키트는 최소한 본 발명에 따른 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 검출 키트에 포함하는 항체는 표지될 수 있다. 이 검출 키트는 항원-항체 반응을 이용하여 녹농균의 존재를 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트는 필요에 따라, 항원-항체 반응을 실시하기 위한 여러 가지 시약, 예를 들면, ELISA법 등에 사용되는, 2차 항체, 발색 시약, 완충액, 설명서 및/또는 기구 등을 더 포함할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 약제학적 조성물 또는 용제는, 본 발명의 항체를 유효 성분으로 사용하고, 그리고 바람직하기는 정제한 항체 조성물과 또 다른 성분, 예를 들면, 생리식염수, 포도당 수용액 또는 인산염 완충액 등을 함유하는 조성물 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 필요에 따라 액체 또는 동결-건조 형태로 제형화될 수 있고, 그리고 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체, 예를 들면, 안정화제, 방부제, 및 등장화제 등을 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체의 예는: 동결-건조 제제의 경우 만니톨, 락토스, 사카로스, 인간 알부민; 액상 제제의 경우 생리식염수, 주사용수, 인산염 완충액, 및 수산화알루미늄을 포함할 수 있다. 그러나, 예가 이들로 제한되는 것은 아니다.
투여는, 투여 대상의 연령, 체중, 성별, 및 일반적인 건강 상태에 따라 다를 수 있다. 투여는 경구 투여 및 비경구 투여 (예를 들면, 정맥 투여, 동맥 투여 및 국소 투여)의 투여 경로로 투여될 수 있다. 그러나 비경구 투여가 바람직하다.
약제학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중, 성별, 일반적인 건강 상태, 녹농균 감염증의 정도 및 투여하는 항체 조성물의 성분에 따라 변한다. 본 발명의 항체 조성물의 투여량은 일반적으로 정맥 투여의 경우, 하루에 성인 체중 1kg 당 0.1 내지 1000 mg, 바람직하기는 1 내지 100mg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 녹농균 감염의 위험이 있는 환자에 대해 미리 투여되는 것이 바람직하다.
약제학적 조성물이 진단제로서 조제되는 경우, 이 진단제는 그 목적에 맞는 어느 수단을 채용함에 의해 어느 제형으로도 얻어질 수 있다. 예를 들면, 복수, 목적 항체를 함유하는 배양액 또는 정제된 항체에 대해 항체 역가를 측정하여, 적당히 PBS(생리식염수를 함유하는 인산 완충액)으로 희석하고; 그 후 0.1% 소듐아지드 등이 방부제로서 첨가된다. 선택적으로, 라텍스 등에 흡착된 본 발명의 항체의 항체 역가를 측정하고 적절히 희석하고, 그리고 사용을 위해 방부제를 첨가한다. 상기와 같이 라텍스 입자에 결합된 본 발명의 항체는 진단제로서 바람직한 제형 중의 하나이다. 이 경우, 라텍스로서 적당한 수지 재료, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리비닐 톨루엔 또는 폴리부타디엔과 같은 라텍스가 적당하다.
실시예
이하 본 발명은 이해를 돕기 위해 실시예를 따라 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1: GeneChipR 분석>
GeneChipR 발현 분석 시스템 (Affymetrix Inc. 제품, GeneChipR P. aerugionsa 게놈 어레이)을 인간 혈청 첨가 배지에서 발현되어 있는 유전자를 탐색하는 수법으로서 사용하였다. 녹농균 PA01 균주를 사용하여, 2가지의 배양 조건, 즉 0% 및 50% 인간혈청이 첨가된 Luria-Bertani (LB) 배지 (Nacalai Tesque, Inc. 제품) (LB 배지의 최종 조성은 동일함)에서 37℃에서 595 nm의 흡광도가 1.0이 될 때까지 진탕 배양하였다. RNeasy Protect Bacteria Mini 키트 (QIAGEN GmbH 제품)를 사용하여, 첨부 문서에 기재된 방법에 따라 전체 RNA를 추출하고 2100 바이오분석기 (Agilent Technologies, Inc. 제품)을 사용하여 정량화하였다. 그리고 나서, GeneChipR에 첨부된 문서에 기재된 방법에 따라 실험을 수행하였다. 유전자 발현 데이타를 Microarray Suite 5.0 (Affymetrix, Inc. 제품)을 사용하여 분석하고 신호와 검출을 산출하였다. 이때, 모든 프로브 세트로부터의 신호의 평균값이 1000이 되도록 보정을 수행하였다. 실험을 독립하여 2회 실시하였다.
그 결과, 관리(house keeping) 단백질인 PA4761 (DnaK 또는 HSP70)은 혈청 첨가 여부에 관계없이 어느 배양 조건 하에서도 전사 산물이 검출되는 것을 나타내는 "Present"로 판정되었다. 그러므로, 이것은 당해 유전자가 발현되었다는 것을 나타낸다. 더욱이, PA5158 (OpmG) 및 PA2019 (MexX)와 회합하여 약제 배출 펌프를 구성하는 내막-관통 단백질로 테트라사이클린이나 아미노글리코시드계 항생물질과같은 리보솜 저해제에 의해 유도되는 PA2018 (MexY) (J. Bacterology, 2005, 187, 5341-5346)은 이들 약제가 존재하지 않는 조건하에서 "Absent"로 판정되었다. 그러므로 이것은 당해 유전자가 발현되지 않았다는 것을 나타낸다. 반대로, PA1698 유전자는 공급된 혈청의 존재 또는 비존재에 관계없이 어느 조건하에서도 "Present"로 판정되었다.
그러므로, PA1698은 명백히 발현되었고, 그 유전자 산물인 PA1698 단백질이 일정하게 존재하고 있을 가능성이 시사되었다.
<실시예 2: 임상 분리주에서 PA1698 유전자의 분석>
사용된 균주는 일본의 임상 시설에서 각종 임상재료로부터 분리된 녹농균 93주(메이지세이카 가부시키가이샤의 요코하마 연구소에 보관)였고 이 균주들을 시험에 제공하였다. 이들 균주들은 혈액, 뇨, 객담, 고름, 인두점액 등으로부터 유래하는 것이고, 그들의 혈청형은 일본 녹농균연구회 주최의 혈청타입 검토 위원회의 결정에 의한 혈청학적 분류를 기초로 하여, A, B, E, G, I, M 등에 속한다.
(1) 게놈 DNA의 제조
녹농균의 93 임상 분리물 각각을 Mueller-Hinton 배지 (Becton, Dickinson and Compamy 제품)에서 37℃에서 밤새도록 배양하고, 저속 원심분리로 수집하였다. DNeasy Tissue 키트 (QIAGEN GmbH 제품)를 사용하여, 첨부 문서의 방법에 따라 얻어진 균체로부터 게놈 DNA를 제조하였다.
(2) PCR법에 의한 DNA 단편의 증폭
제조한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PA1698 유전자를 함유하는 영역을 PCR로 증폭하였다. 구체적으로, PA1698 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 세트 (SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO:4 )를 녹농균 PA01 (NCBI 데이타 베이스 수탁 번호:NC_002516)의 게놈 서열을 기초로 설계하였다. GeneAmp PCR 시스템 9700 (Applied Biosystems Inc. 제품)을 사용하여, PCR을 Takara ExTaq (Takara Bio Inc. 제품)으로 첨부 설명서에 따라 수행하였다. PCR에 의해 이와 같이 증폭된 DNA 단편이 목적하는 크기(1128 염기쌍)를 갖는다는 것을 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하였다.
(3) DNA 염기서열분석기를 이용한 폴리뉴클레오티드 서열의 분석
PCR 산물을 MuiltScreen PCR 플레이트(Millipore Corporation 제품)를 사용하여 정제하고 그리고 나서 시퀀싱 반응에 제공하였다. 각각의 PCR 산물을 시퀀싱 할 수 있는 프라이머들 (SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 7)을 PA01 균주의 게놈 서열 (NC-002516)을 기초로 설계하였다. BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing 키트 (Applied Biosystems Inc. 제품)를 시퀀싱 반응에 사용하였다. 시퀀싱 반응을 첨부 설명서에 따라 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems Inc. 제품)을 사용하여 수행하였다. 시퀀스 반응 산물을 미리 물로 팽창시킨 Sephadex G-50 Fine DNA Grade (Amersham Biosciences AB 제품)로 채운 MultiScreen-HV 플레이트 (Millipore Corporation 제품)를 사용하여 정제하였다. 그리고 나서, 폴리뉴클레오티드 서열을 Applied Biosystems 3730 DNA 분석기 (Applied Biosystems Inc. 제품)을 사용하여 분석하였다.
상기 분석에 의해 판명된 임상 분리주의 폴리뉴클레오티드 서열을 폴리펩티드 서열로 전환하였다. 이들 폴리펩티드 서열을 PA01 균주의 것과 비교하였다. 연구 결과, 15개의 돌연변이가 PA1698 단백질의 전장서열에서 발견되었다 (표 1).
그러나, 임상 분리주의 대략 70%는 완전히 보존된 아미노산 서열을 갖고 임상 분리주의 나머지 대략 30% 조차도 오직 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 갖는다는 것을 확인하였다. 따라서, 모든 녹농균은 보존된 영역을 가졌다. 이것은 녹농균 PA1698 단백질이 "녹농균 공통 항원"으로서 유용하다는 것을 제시한다.
<실시예 3: PA1698 유전자 DNA 단편의 클로닝>
녹농균 PA1698 유전자(SEQ ID NO: 1)의 전장 아미노산 코드 영역으로서 867 염기를 함유하는 DNA 단편을 벡터 pIVEX2.4d (Roche Diagnostics K.K.)를 사용하여 클로닝하고 다음의 방법으로 발현 벡터 pET15b (Novagen Inc.)에 병합시켰다.
클로닝되는 DNA 단편을 PCR (DNA Thermal Cycler 480; Perkin-Elmer Inc. 제품)에 의해 녹농균 PA01 균주의 게놈 DNA로부터 증폭하였다. Pyrobest (Takara Shuzo Co., Ltd. 제품)를 DNA 폴리머라제로 사용하였다. 5% 디메틸술폭시드를 반응 용액에 첨가하였다. 제한 부위 NotI (GCGGCCGC) 및 BamHI (GGATCC)의 첨가를 위해 사용된 염기를 함유하는 프라이머 (SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO: 9)를 PCR 프라이머로서 사용하였다.
PCR의 온도 조건은 94℃에서 2분, 그리고 각각 94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 그리고 72℃에서 2분의 가열로 구성되는 25회의 사이클로 정해졌다. PCR 산물을 MinElute PCR Purification 키트 (Qiagen GmbH 제품)를 사용하여 정제하였고, 그리고 나서 제한 효소 NotI (New England Biolabs Inc. 제품) 및 BamHI (Toyoba Co., Ltd.)로 절단하였다. 더욱이, pIVEX2.4d를 NotI 및 BamHI를 사용하여 절단하였다. 이와 같이 절단하여 얻은 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리시키고, QIAquick Gel 추출 키트 (Qiagen GmbH 제품)를 사용하여 추출하고 정제하였다. NotI-BamHI로 절단된 PCR 산물 및 pIVEX2.4d를 T4 DNA 리가아제(Ligation High, Toyobo., Inc. 제품)를 사용하여 결찰하고, Escherichia coli DH5α 균주 (Competent High DH5α, Toyoba Co., Ltd. 제품)으로 형질전환하였다. PA1698 유전자 단편이 도입된 pIVEX2.4d 플라스미드 (pIVEX-PA1698-1)를 QIAprep Spin Miniprep 키트 (Qiagen GmbH 제품)를 사용하여 정제하였다. 그리고 나서, 사이클 시퀀싱 반응을 BigDye Terminator v1.1 사이클 시퀀싱 키트 (Applied Biosystems Inc. 제품)를 사용하여 수행하였고, 삽입된 부분의 염기 서열을 확인하였다 (3730 DNA Anaylzer, Applied Biosystmes Inc./HITACHI Ltd. 제품).
다음에, 주형으로서 pIVEX-PA1698-1을 사용하여, 삽입 부분을 함유하는 단편을 PCR 프라이머 (SEQ ID NO:10) 및 PCR 프라이머 (SEQ ID NO: 11)을 사용하여 증폭하였다. 여기서, PCR 프라이머 (SEQ ID NO: 10)는 제한 부위 NdeI (CATATG)를 첨가하기 위한 염기를 함유하는 개시 코돈을 갖는 반면 PCR 프라이머 (SEQ ID NO: 11)은 삽입 부분의 하류에 위치한 T7 종료자 부분과 쌍을 이룬다. 단편을 정지 코돈 직후 제한 부위를 갖는 제한 효소 NdeI (New England Biolabs Inc. 제품) 및 BamHI로 절단하였다. 더욱이, pET15b를 NdeI 및 BamHI로 절단하였다. 분리 및 정제 후, 이들 절단된 DNA 단편들을 결찰하여 Escherichia coli로 형질전환되도록 하였다. PA1698 유전자 단편이 도입된 pET15b 플라스미드 (pET-PA1698-1)을 수집하였고, 삽입 부분의 염기 서열을 확인하였다.
<실시예 4: PA1698 재조합 단백질의 발현 및 정제>
T7 프로모터와 T7 RNA 폴리머라제 유전자가 도입된 Escherichia coli BL21 (DE3) 균주를 갖는 pET 벡터 발현 시스템 (Novagen Inc. 제품)을 재조합 단백질의 발현을 위해 사용하였다. Escherichia coli 발현 벡터 pET-PA1698-1은 T7 프로모터의 하류에 His-태그 (6개의 연속 히스티딘)가 융합된 PA1698 단백질을 암호화하는 플라스미드이다 (실시예 3 참조). BL21 (DE3) 균주를 염화칼슘으로 처리하고 (Molecular Cloning 2nd ed. Sambrook et al. (1989) 참조) pET-PA1698-1로 형질전환시켰다. 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 배지에서 밤새도록 배양하고, 신선 배지에서 200-배 희석시키고 현탁시켰다. 37℃에서 4시간 동안 배양 후, IPTG를 최종 농도 0.5 mM로 첨가하여 발현을 유도하고, 추가 3시간 동안 계속 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하였고, -20℃로 동결하였다. 세포를 단백질 추출 시약 B-PER 세균성 단백질 추출 시약 (Pierce Biotechnology Inc. 제품)에 용해시켰다. 발현 단백질을 함유하는 불용성 부분을 수집하고, 최종 농도 100㎍/ml에서 리소자임 (난백 리소자임, Seikagaku Corporation 제품)으로 처리하고, 이어서 1% Triton X-100이 공급된 둘베코 인산염-완충 생리식염수 (PBS)로 세척하였다.
His-태그를 이용한 Ni 킬레이트 크로마토그래피를 단백질 정제에 사용하였다. 이와 같이 발현되고 제조된 불용성 단백질을 용해 완충액 (8M 우레아, 5mM 이미다졸, 200 mM NaCl, 및 0.05% NP-40을 첨가한 PBS)으로 가용화하였다. 용해된 단백질을 Ni-NTA 아가로스 (Qiagen GmbH 제품)에 결합시키고 용해 완충액 40 용적으로 세척하였다. 단백질을 세척 완충액 (NP-40이 배제된 용해 완충액) 40 용적으로 더욱 세척하였다. 그리고 나서, His-태그-부착 단백질을 용출 완충액 (8M 우레아, 300 mM 이미다졸, 및 200 mM NaCl을 첨가한 PBS)으로 용출시키고, 수집하였다. 그 결과, Escherichia coli 배양물 230 ml로부터 단백질 2.3 mg을 최종 수집하였다.
<실시예 5: 항원에 의한 면역 및 면역혈청 제조>
다음의 방법으로 얻은 불활성화된 녹농균을 사용하였다. 녹농균 PA103 균주 (ATCC29260)를 밤새도록 37℃에서 Mueller-Hinton 아가 배지에서 배양하였다. 그들의 여러 콜로니들을 LB 배지에 현탁시키고 밤새도록 37℃에서 진탕 배양하고, PBS로 세척하고, 재현탁하였다. 이어서, 불활성화 처리를 1% 포르말린의 첨가에 의해 24시간 이상 수행하였다.
면역화에 사용하기 위해, PA1698 재조합 단백질을 8 M 우레아 용액 중에 용해시켜 농도가 100㎍/ml가 되도록 하였다.
면역화 방법에서, 수컷 BN 래트 (Charles River Laboratories Japan, Inc. 제품)을 피하 또는 근육 내에, 첫회에만 프로인트 완전 애쥬번트와 함께, 그리고 이후에는 불완전 애쥬번트와 함께 2주 간격으로 총 6회 투여하여 면역화하였다. 면역화를 위해, 동물 당 포르말린-불활성화 세균 및 PA1698 재조합 단백질 각각 20 ㎍을 투여하였다. 최종 면역화 1주 후에, 경동맥 또는 복부 대동맥으로부터 전혈을 수집하였다. 혈액을 실온에서 1시간 방치 후, 원심분리(1500G, 20분)하여 면역혈청으로서 상청액을 래트 당 대략 5ml를 수집하였다.
<실시예 6: 면역혈청 및 복수로부터 IgG 분획의 정제>
래트 면역혈청 및 복수로부터의 IgG 분획을, 예를 들면 Harlow & Lane, 288-318, Chapter 8, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1988) 등의 방법을 사용하여 정제하였다. 마우스 복강 중에서 래트-마우스 하이브리도마를 증식시켜 얻은 래트 면역혈청 또는 복수를 10,000 × g에서 20분 동안 원심분리하였다. 불용물을 제거하고, 상청액을 얻었다. 60mM 소듐아세테이트 (pH 4.0) 2 용적을 첨가하고, 그 후 1 N 염산으로 pH를 4.8로 조절하였다. 면역혈청 또는 복수 시료에 대해 카프릴산 0.06 용적을 실온에서 점진적으로 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하여 불용물을 제조하였다. 침전물을 13,000 × g에서 10분 동안 원심분리하여 제거하였다. 생성된 용액을 0.45㎛ 필터를 통과시켰다. 얻은 샘플을 Amicon Ultra-15 (Millipore Corporation)을 사용하여 농축시키고, 생성물을 최종적으로 PBS (-) 용액과 교환하여, 최종 샘플을 얻었다. 이 방법으로, 래트 면역혈청 40 ml 또는 일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터의 수탁번호 FERM BP-11055 및FERM BO-11056인 하이브리도마로부터 생산된 래트 MAb를 함유하는 마우스 복수 75 ml 및 35 ml로부터 정제하여, IgG 분획으로서 단백질 102 mg, 14mg, 그리고 3 mg을 수집하였다. 단백질을 Lowry법을 기초로 DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Inc 제품)에 따라 정량화하였고, IgG 순도fmf SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
<실시예 7: ELISA 시험>
PA1698 재조합 단백질에 결합하는 항체를 ELISA 법으로 검출하기 위해, PA1698 재조합 단백질을 8M 우레아를 첨가한 PBS에 용해하였다. 96-웰 니켈 플레이트 (고민감성 HIS-선택 (HS) 니켈 코팅 플레이트, Sigma-Aldrich Co. 제품)의 웰 당 단백질 0.5㎍을 넣었다. 단백질을 실온에서 플레이트에 결합시켰다. 플레이트를 세척 완충액 (0.05% Tween 20, 5 mM 이미다졸 및 500 mM NaCl이 공급된 PBS)으로 세척하고 블로킹 완충액 (0.5% 젤라틴이 공급된 세척 완충액)으로 블로킹하였다. 그리고 나서 실시예 5 또는 6에서 얻은 항체를 포함하는 샘플을 웰에 놓고 실온에서 반응시켰다. 그 후 플레이트를 세척 완충액으로 세척하였다. 2차 항체 (퍼옥시다제-표지된 염소 항-래트 IgG 항체, 10000 배 희석, Sigma-Aldrich Co. 제품)를 넣고 반응시켰다. 그 후 플레이트를 세척하였다. 발색 기질 (TMB Microwell Peroxidase Sbustrate System, KPL, Inc. 제품)을 첨가하여 반응 후, 1M 인산으로 효소 반응을 종결시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
그 결과, PA1698 재조합 단백질 면역화-래트 면역혈청 (10,000-배 희석) 샘플의 흡광도는 0.490이었고, 반면 면역화 전의 음성 대조 혈청의 흡광도 (10,000-배 희석)는 0.061이었다. 이것은 면역원으로서 PA1698 재조합 단백질에 결합한 항체가 PA1698 재조합 단백질 면역-래트 면역혈청 중에 함유되어 있다는 것을 나타낸다.
<실시예 8: 전세포 ELISA 시험>
전 세포 ELISA로서, LB 배지에서 밤새 배양된 PA103 균주의 균액 100㎕를 96-웰 ELISA 플레이트 (MaxiSorp Type, Nunc 제품)의 각 웰에 분주하고, 이어서 4℃에서 1시간 동안 면역화하였다. 그리고 나서, 플레이트를 세척 완충액 (0.05% Twen 20 함유 TBS)으로 세척하고 블로킹 완충액 (2% 소 혈청 알부민 함유 TBS)으로 블로킹하였다. 그 후, 실시예 5 및 실시예 6에서 얻어지고, PBS로 희석된, 정제된 IgG 분획 또는 PA1698 재조합 단백질 면역화-래트 면역혈청을 1차 항체 샘플로서 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 2차 항체 (퍼옥시다제-표지된 염소 항-래트 IgG 항체, 5000-배 희석, Sigma-Aldrich Co. 제품)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 세척하였다. 발색 기질(TMB Microwell Peroxidase Sbustrate System, KPL Inc. 제품)을 첨가하고 암실에서 반응시키고, 그 후 1M 인산 용액을 첨가하여 효소 반응을 종료하였다. 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, PA1698 재조합 단백질 면역화-래트 면역혈청의 흡광도는 1.058이었고, 반면 면역화 전의 음성 대조 혈청의 흡광도는 0.729였다. 이 결과는 녹농균 세포 표면 위에 또는 배양 상등액 중에 존재하는 PA1698 단백질을 인식하는 항체(IgG)가 PA1698 재조합 단백질 면역화-래트 면역혈청 중에 함유되어 있다는 것을 나타낸다.
한편, PA1698 재조합 단백질 면역화-래트 면역혈청에서 얻은 정제된 IgG 분획인 항-PA1698 IgG에 관하여, 애쥬번트 만을 투여하여 의해 얻은 대조 래트 혈청의 정제된 음성 대조 IgG 분획 (50㎍/웰)의 흡광도는 0.147이었고, 반면 항-PA1698 IgG ((50㎍/웰)의 흡광도는 0.460이었다. 이것은 녹농균을 인식하는 항체 (IgG)가 IgG 분획 중에 함유되어 있다는 것을 나타낸다.
<실시예 9: 모노클로날 항체 (MAb)의 제조>
실시예 5의 PA1698 재조합 단백질로의 최종 면역화 1주 후, 래트로부터 비장을 마취하에서 무균적으로 적출하였다. 얻어진 비장을 RPMI-1640 배지 (Gibco Corp 제품)로 세척하였다. 그리고 비장을 슬라이드 글라스 사이에 삽입하고 으깨어 미소편 형태의 비장 세포 시험 샘플을 얻었다. 얻어진 비장 세포를 RPMI-1640 배지를 사용하여 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세척하였다. 한편, 골수종 세포 (P3X63Ag8U1 세포)를 10% FCS (소태아 혈청)을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 5% CO2, 상대 습도 100% 및 37℃의 조건하에서 미리 배양하였다. 대수 증식기에 있는 골수종 세포를 RPMI-1640 배지를 사용하여 원심분리하여 세척하였다. 상기 비장 세포와 골수종 세포를 비장 세포 대 골수종 세포의 비가 4:1이 되도록 혼합하였다. 혼합 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 따라버리고, 세포를 충분히 풀었다. 세포를 함유하는 원심분리 튜브에, 폴리에틸렌 글리콜(M.W.1000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품) 2 g, RPMI-1640 배지 2ml 및 DMSO (Nacalai Tesque, Inc 제품) 2ml를 함유하는 용액 1ml를 부드럽게 첨가하였다. 원심분리 튜브를 느리게 회전시켜 세포를 혼합하였다. 1분 후, 원심분리 튜브를 천천히 회전시키면서, RPMI-1640 배지 15 mL를 3분에 걸쳐 첨가하였다. 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 그리고 나서 상등액을 따라버리고, 세포를 충분히 풀어주었다. 그 후, 세포 농축물을 HAT 배지 (Gibco Corp. 제품)을 사용하여 비장 세포의 항으로서 1.6×106 세포/ml로 조정하였다. 생성된 세포를 96-웰 마이크로플레이트로 0.2 ml/웰의 농도로 분주하였다. 세포를 5% CO2, 상대 습도 100% 및 37℃의 조건하에서 약 1 내지 2주 동안 배양하였다. 그 후, 웰에서 성장한 하이브리도마를 현미경으로 관찰하였다.
(1) 목적 항체의 스크리닝
PA1698 재조합 단백질에 결합하는 항체를 실시예 7에 기재된 ELISA 방법으로 검출하였다. 또한, 녹농균에 결합하는 항체를 실시예 8에 기재된 전세포 ELISA 방법으로 검출하였다.
(2) 목적 항체를 생산하는 세포의 클로닝
스크리닝 결과, 목적 항체를 생산한다고 판정된 하이브리도마의 농도를, 5% BM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement (Roche Diagnostics K.K.)를 함유하는 10% FCS/HT (Gibco Corp. 제품) 배지를 사용하여, 5 하이브리도마/0.2 ml 또는 20 하이브리도마/0.2 ml로 조정하였다. 하이브리도마를 0.2ml/웰의 농도로 분주하였다. 1~2주 후, 클로니의 생육을 현미경으로 관찰하였다. 클로니를 스크리닝 부분에서 설명한 방법으로 분석하여 목적 항체를 생산하는 클로니를 선택하였다. 다시, 하이브리도마의 농도를, 상기 방법에 의해 5% BM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement를 함유하는 10% FCS/HT (Gibco Corp. 제품) 배지를 사용하여, 1 하이브리도마/0.2 ml 또는 2 하이브리도마/0.2 ml로 조정하였다. 이와 같은 하이브리도마를 96-웰 마이크로플레이트에 0.2 ml/웰의 농도로 분주하였다. 1~2주 후, 목표 항체를 생산하는 모노클로날을 선택하기 위해 스크리닝 부분에 기재된 방법으로 분석을 수행하였다. 따라서, 일본 독립행정법인 산업기술총합연구소 국제 특허 생물 기탁센터의 수탁번호 FERM BP-11055 및 FERM BP-11056의 하이브리도마를 얻었다.
(3) 인 비트로에서의 세포 배양 및 MAb의 생산
96-웰 마이크로플레이트에서 충분히 증식시킨 목적 클론을 48-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 50ml 플라스크 및 250 ml 플라스크로 서서히 규모를 늘리고, 10% FCS-RPMI 배지에서 배양하였다. 이 방법으로 얻은 세포는 그 배양 상청에 생산된 MAb를 가졌고, MAb는 실시예 7에 기재된 ELISA법으로 검출하였다.
그 결과, PA1698 재조합 단백질이 흡착되어 있는 웰에 대한 결합을 검출하기 위한 ELISA의 흡광도는 음성 대조 10% FCS-RPMI 배지에서 0.056이었다. 한편, 수탁 번호 FERM BP-11055의 하이브리도마의 배양 상등액의 흡광도는 0.828이었고, 반면, 수탁번호 FERM BP-11056의 하이브리도마의 배양 상등액의 흡광도는 0.811이었다. 이 결과로부터, PA1698 재조합 단백질에 결합된 MAb가 생생되었다는 것이 분명해졌다.
(4)인 비보에서의 세포 증식 및 MAb의 생산
일본 독립행정법인 산업기술총합연구소 국제 특허 생물 기탁센터의 수탁번호 FERM BP-11055 및 FERM BP-11056의 하이브리도마 각각을 1×107/마우스의 농도로 BALB/c-nu/nu 마우스(Charles River Laboratories Japan, Inc. 제품)에 복강내 투여하였다. 1~2주 후, 복수를 수집하였다. 복수에 함유된 MAb를 실시예 6에 기재된 방법으로 정제하였다. 얻은 정제된 IgG 분획을 항-1698-1 IgG (MAb) 및 항-1698-2 IgG (MAb)로 명명하였다. 이 래트 MAb의 IgG 서브클래스의 중사슬 및 경사슬을 모노클로날 항체 이소타이핑 키트 (RMT1, Dainippon Pharmaceuticla Co., Ltd. 제품)로 판정하였다. 그 결과, 중사슬은 각각 IgG2a 및 IgG2a, 모든 경사슬은 κ로 판정되었다.
실시예 6에 기재된 방법으로 마우스 복수로부터 정제된 MAb의 녹농균 표면에 대한 결합을 실시예 8에 기재된 전세포 ELISA으로 확인하였다.
항-1698-1 IgG (MAb)의 결과: 항-1698-1 IgG (MAb), 즉 수탁번호 FERM BP-11055의 하이브리도마가 투여된 마우스 복강을 정제하여 얻은 IgG 분획의 흡광도는 0.871이었다. 한편, 오직 애쥬번트만을 투여하여 얻은 대조 래트 혈청으로부터 정제된 음성 대조 IgG 분획 (50㎍/웰)의 흡광도는 0.084였다. 이 결과는 녹농균을 인식하는 항체 (IgG)가 IgG 분획에 함유되어 있다는 것을 증명한다.
항-1698-2 IgG (MAb)의 결과: 항-1698-2 IgG (MAb), 즉 수탁번호 FERM BP-11056의 하이브리도마가 투여된 마우스 복강을 정제하여 얻은 IgG 분획의 흡광도는 1.415였다. 한편, 오직 애쥬번트만을 투여하여 얻은 대조 래트 혈청으로부터 정제된 음성 대조 IgG 분획 (50㎍/웰)의 흡광도는 0.084였다. 이 결과는 녹농균을 인식하는 항체 (IgG)가 IgG 분획에 함유되어 있다는 것을 증명한다.
<실시예 10: 인간 기도 상피 세포에서 녹농균 PA103 균주의 세포독성 활성에 대한 PA1698 항체의 감염 방어능>
Beas 2B 세포를 96-웰 배양 플레이트에 5×104/웰의 세포 농도로 분주하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS(-)로 2회 세척하고, 16% BSA(해리 후, KOH로 중화)가 공급된 DMEM/F12 배지 50㎕를 첨가하였다. 녹농균 PA103 균주 5×108 cfu/ml 및 항-1698-1 IgG (MAb), 항-1698-2 IgG (MAb) 또는 항-PA1698 IgG, 즉 PA1698 재조합 단백질 면역화-래트 면역혈청으로부터 얻고, PBS로 희석된 IgG 분획 각각의 25㎕를 첨가하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후, 배양 상등액 중의 LDH (락테이트 디하이드로게나제)의 양을 세포 사멸 인덱스로 측정하였다. 세포 사멸의 양을 다음과 같이 산출하였다. 측정된 LDH의 양이 세포를 0.2% Triton X-100으로 가용화할 때 얻어진 것과 동일한 경우, 세포 사멸의 양을 100으로 하였다. 한편, 측정된 LDH의 양이 녹농균 PA103 균주가 첨가되지 않을 때 얻어진 것과 동일한 경우, 세포 사멸의 양을 0%로 하였다.
그 결과, 세포 사멸은 항-PA1698 IgG, 즉 PA1698 재조합 단백질 면역화-래트 면역혈청으로부터 얻어진 정제된 IgG 분획의 첨가 (2.5 mg/ml)에 의해 16.3%까지 억제되었다. 더욱이, 항-1698-1 IgG (0.625 mg/ml), 즉 수탁 번호 FERM BP-11055의 하이브리도마가 투여된 마우스 복강을 정제하여 얻은 IgG 분획은 세포 사멸을 18.9%까지 억제하였다. 더욱이, 항-1698-2 IgG (MAb) (0.265 mg/ml), 즉 수탁 번호 FERM BP-11056의 하이브리도마가 투여된 마우스 복강을 정제하여 얻은 IgG 분획은 세포 사멸을 22.5% 까지 억제하였다.
<실시예 11: 정상 마우스에서 PA103 균주 전신 감염에 대한 PA1698 재조합 단백질 면역-래트 면역혈청의 감염 방어능>
정상 마우스의 전신 감염 모델에 의한 평가에서, 5% 뮤신을 함유하는 생리식염수 500㎕ 중에 현탁된 PA103 균주를 1.7×105 cfu/마우스 (34LD50)의 양으로 4-주령 CD-1 수컷 마우스에게 복강 내 접종하였다. 그 직후, 생리 식염수로 2.5배 희석한 혈청 샘플을 꼬리 정맥을 통해 10 ml/kg의 투여량으로 투여하였다. 감염에 대한 보호 활성을 7일 후 생존을 기초로 평가하였다.
그 결과, 오직 애쥬번트 만을 투여하여 얻은 음성 대조 래트 모의 혈청이 투여된 군에서 7마리 마우스 모두가 사멸하였다. 반대로, 실시예 5에서 얻은 포르말린-불활성화 PA103 균주 면역화-래트 면역혈청이 투여된 군에서는 모든 마우스가 생존하였다. 그러므로, 감염에 대한 보호 활성이 확인되었다. 이 조건하에서, 실시예 5에서 얻은 PA1698 재조합 단백질 면역화-래트 면역혈청이 투여된 그룹에서 7마리 중 5마리가 생존하였다. 그러므로, 감염에 대한 보호 활성이 확인되었다.
<실시예 12: 호중구감소성 마우스에서 PA103 균주 전신성 감염에 대한 PA1698 재조합 단백질 면역-래트 면역혈청의 방어능>
호중구감소 마우스의 전신성 감염 모델의 평가에서, 시클로포스파미드 (이하 CY로 명명, Sigma-Aldrich Co. 제품) 12.5mg/ml (생리식염수)를 제조하고 4-주령 CD-1 수컷 마우스에 제 -5일, 제 -2일 및 제 0일에 각각 125 mg/kg으로 총 3회 복강내 투여하여 말초 혈중의 호중구를 감소시켰다. 그 후, 생리 식염수 250㎕에 현탁된 PA103 균주를 9.5×104 cfu/마우스 (70 LD50)의 투여량으로 복강내 접종하였다. 그 직후, 샘플을 꼬리정맥에 10 mL/kg의 투여량으로 투여하였다. 감염에 대한 보호 활성을 7일 후의 생존을 기초로 평가하였다.
그 결과, 애쥬번트만을 투여하여 얻은 음성 대조 래트 모조 혈청을 투여한 그룹에서 7마리 모두가 죽었다. 반대로, 실시예 5에서 얻어진 포르말린-불활성화 PA103 균주 면역화-래트 면역혈청을 투여한 그룹에서는 7마리 마우스 중 6마리가 생존하였다. 그러므로, 감염에 대한 보호 활성을 확인하였다. 이 조건하에서, 실시예 5에서 얻은 PA1698 재조합 단백질 면역화-래트 면역혈청이 투여된 그룹에서 7마리 마우스 중 4마리가 생존하였다. 그러므로, 감염에 대한 보호 활성을 확인하였다.
산업상 이용가능성
본 발명의 항체에 의해 표적화된 PA1698 단백질은 혈청형 등과 상관없이 균주들 중에서 보존성이 매우 높다는 것을 발견하였다. 그러므로, 본 발명의 항체는 다양한 임상 분리주와 반응할 수 있고 녹농균 감염의 예방 및 진단을 위한 의약 및 진단제로서 뛰어난 효과를 나타낼 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 인간 기도 상피세포에 대해 녹농균에 의한 병변을 억제하는 효과를 증명할 수 있다. 그러므로, 항체는 미만성 범세기관지염 (DPB) 및 낭포성 섬유증(CF)과 같은 만성 호흡관 감염에 효과적일 것으로 예상된다. 본 발명의 백신 조성물은 신체에서 본 발명의 항체를 유도하고, 그것에 의해 녹농균 감염에 대한 뛰어난 예방적 및 치료적 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 항체 및 백신 조성물을 따라서 녹농균 감염의 예방, 치료 또는 진단에 크게 기여할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Meiji Seika Kaisha, Ltd.
<120> Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system related protein PA1698
<130> PM1927
<150> JP 2007-331653
<151> 2007-12-25
<160> 11
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 867
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 1
atggacatcc tccagagttc ctccgccgcg cccctcgcgc cgcgggaagc ggccaacgcc 60
cccgcgcagc aggctggcgg cagctttcag ggcgagcgcg tccactacgt ttccgtttcg 120
cagtcgctgg ccgatgccgc ggaagagctg accttcgcct tttccgagcg cgccgagaaa 180
tccctggcca agcgccgcct gagcgacgcc catgcgcgcc tgagcgaagt ccaggccatg 240
ctgcaggagt actggaagcg cattccggac ctggaaagcc agcagaagct cgaggcgctg 300
atcgcccacc tgggcagcgg ccaactgagc agcctggcgc agctcagcgc ttacctggag 360
ggcttctcca gcgagatcag ccagcgcttc ctggcgctgt cgcgggcgcg cgacgtcctg 420
gccgggcggc cggaggcgcg ggcgatgctg gcgctggtcg accaggcgtt gctgcggatg 480
gccgacgagc agggcctgga gatcgaactc ggcctgcgca tcgagccgct ggccgccgag 540
gcttccgccg ccggtgtcgg cgatatccag gcgctgcgcg atacctaccg tgacgcggta 600
cttgactacc ggggcctgtc ggcggcctgg caggacatcc aggcgcgctt cgccgcgacg 660
ccgctggagc gggtcgtggc cttcctgcag aaagccctga gcgccgacct ggacagtcag 720
tcgagccggc tcgatccggt gaagctggag cgggtcatga gcgacatgca caagctgcgc 780
gtgctcggcg gcctggcgga gcaggtgggg gcgctctggc aggtgctggt gacaggggag 840
cggggccatg gcatacgggc cttctga 867
<210> 2
<211> 288
<212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 2
Met Asp Ile Leu Gln Ser Ser Ser Ala Ala Pro Leu Ala Pro Arg Glu
1 5 10 15
Ala Ala Asn Ala Pro Ala Gln Gln Ala Gly Gly Ser Phe Gln Gly Glu
20 25 30
Arg Val His Tyr Val Ser Val Ser Gln Ser Leu Ala Asp Ala Ala Glu
35 40 45
Glu Leu Thr Phe Ala Phe Ser Glu Arg Ala Glu Lys Ser Leu Ala Lys
50 55 60
Arg Arg Leu Ser Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Glu Val Gln Ala Met
65 70 75 80
Leu Gln Glu Tyr Trp Lys Arg Ile Pro Asp Leu Glu Ser Gln Gln Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Leu Ile Ala His Leu Gly Ser Gly Gln Leu Ser Ser Leu
100 105 110
Ala Gln Leu Ser Ala Tyr Leu Glu Gly Phe Ser Ser Glu Ile Ser Gln
115 120 125
Arg Phe Leu Ala Leu Ser Arg Ala Arg Asp Val Leu Ala Gly Arg Pro
130 135 140
Glu Ala Arg Ala Met Leu Ala Leu Val Asp Gln Ala Leu Leu Arg Met
145 150 155 160
Ala Asp Glu Gln Gly Leu Glu Ile Glu Leu Gly Leu Arg Ile Glu Pro
165 170 175
Leu Ala Ala Glu Ala Ser Ala Ala Gly Val Gly Asp Ile Gln Ala Leu
180 185 190
Arg Asp Thr Tyr Arg Asp Ala Val Leu Asp Tyr Arg Gly Leu Ser Ala
195 200 205
Ala Trp Gln Asp Ile Gln Ala Arg Phe Ala Ala Thr Pro Leu Glu Arg
210 215 220
Val Val Ala Phe Leu Gln Lys Ala Leu Ser Ala Asp Leu Asp Ser Gln
225 230 235 240
Ser Ser Arg Leu Asp Pro Val Lys Leu Glu Arg Val Met Ser Asp Met
245 250 255
His Lys Leu Arg Val Leu Gly Gly Leu Ala Glu Gln Val Gly Ala Leu
260 265 270
Trp Gln Val Leu Val Thr Gly Glu Arg Gly His Gly Ile Arg Ala Phe
275 280 285
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ggcgcatccg gacgatgaga ggaga 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
ctcgagcaag gcgatgactg cgccg 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ccgagaaatc cctggccaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
acagcgccag gaagcgctgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gatcgaactc ggcctgcgca 20
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
aaggaaaaaa gcggccgcat ggacatcct 29
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
cgcggatcct cagaaggccc gtatg 25
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
cagtcagtca tatggacatc ctccagagtt c 31
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
gctagttatt gctcagcgg 19
Claims (15)
- 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래된 PA1698 단백질에 결합하는 항체 또는 그것의 기능적 단편.
- 제1항에 있어서, 녹농균으로부터 유래된 PA1698 단백질은 하기 (ⅰ) 및 (ⅱ) 중 어느 하나에 기재된 단백질인 것인 항체 또는 그것의 기능적 단편:
(ⅰ) SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(ⅱ) SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가에 의해 얻어진 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질. - 제1항에 있어서, 녹농균의 표면에 결합하는 것인 항체 또는 그것의 기능적 단편.
- 제1항에 있어서, 인간 기도 상피 세포에 대한 녹농균의 세포독성 활성을 억제하는 활성을 갖는 것인 항체 또는 그것의 기능적 단편.
- 제1항에 있어서, 녹농균에 감염된 환자에게서 항균 활성을 갖는 것인 항체 또는 그것의 기능적 단편.
- 제5항에 있어서, 호중구 수준이 감소된 환자에게서 녹농균 감염에 대한 항균 활성을 갖는 것인 항체 또는 그것의 기능적 단편.
- 제1항에 있어서, 수탁번호 FERM BP-11055 및 FERM BP-11056 중 어느 하나로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 에피토프에 결합하는 항체 또는 그것의 기능적 단편.
- 수탁번호 FERM BP-11055 및 FREM BP-11056 중 어느 하나로 기탁된 하이브리도마.
- 녹농균 관련 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 백신 조성물로, 상기 백신 조성물은 녹농균으로부터 유래된 PA1698 단백질에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있는 단백질 항원 및 펩티드 항원 중 어느 하나를 포함하고; 및 임의로 최소한 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 애쥬번트를 포함하는 것인 백신 조성물.
- 제9항에 있어서, 녹농균으로부터 유래된 PA1698 단백질은 하기 (ⅰ) 및 (ⅱ) 중 어느 하나에 기재된 단백질인 것인 백신 조성물:
(ⅰ) SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(ⅱ) SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가에 의해 얻어진 아미노산 서열을 포함하는 단백질로, SEQ ID NO:2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질. - 제9항에 있어서, 녹농균과 관련된 질병은 녹농균 감염에 의해 야기된 전신성 감염증인 것인 백신 조성물.
- 녹농균 관련 질병의 예방 및 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물로, 상기 약제학적 조성물은: 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편; 및 임의로 최소한 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 녹농균 관련 질병은 녹농균 감염에 의해 야기된 전신성 감염증인 것인 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는 녹농균 감염 진단 시약.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는 녹농균 검출 키트.
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