KR20100091017A

KR20100091017A - 두 단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스로부터 엘－리보스의 생산 방법

Info

Publication number: KR20100091017A
Application number: KR1020090010287A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 염수진
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-09
Filing date: 2009-02-09
Publication date: 2010-08-18
Also published as: KR101081604B1

Abstract

본 발명은 두 단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스(L-ribose)를 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균으로부터 아라비노스 이성화효소(L-arabinose isomerase) 유전자와 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase) 유전자를 분리하여 제작한 아라비노스 이성화효소 및 만노스-6-인산 이성화효소를 엘-아라비노스와 반응시켜 엘-리보스를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans)로부터 유래한 재조합 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화효소를 이용하여, 높은 특이성과 친환경적으로 의약품 원료물질인 엘-리보스를 생산할 수 있다.

엘－리보스, 엘-아라비노스, 지오바실러스 써모디니트리피칸스균, 아라비노스 이성화효소, 만노스-6-인산 이성화효소

Description

두 단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스로부터 엘－리보스의 생산 방법 {Method for production of L-ribose from L-arabinose by two-step enzyme reactions}

엘-리보스(L-ribose)는 많은 엘-형태의 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 항바이러스제인 메틸-엘-리보플라노사이드(methyl-L-riboflanoside; "Bezimidavir"^TM) 등의 합성에 사용되어 엘-리보스 및 그 유도체의 세계시장은 2001년 약 11억불이었고, 최근에는 새로운 항포진제(Antiherpes)로 개발되고 있는 비더 블유1263더블유94 (BW1263W94, Glaxo Wellcome)와 비(B)형간염 치료제로 개발되고 있는 엘-에프엠에이유(L-FMAU, Bukwang & Triangle) 등의 핵심중간체로서 그 수요가 급증하고 있어, 산업적으로 이용 가능한 그의 제조방법을 개발하는 것은 동분야 많은 연구진들의 관심의 대상이다.

엘-리보스는 주로 엘-아라비노스, 엘-자일로스, 디-글루코스, 디-갈락토스, 디-리보스 또는 디-만노-1,4-락톤으로부터 화학 합성법으로 생산되어 왔다(Akagi, M., et al ., Chem . Pharm . Bull .( Tokyo ) 50:866, 2002; Takahashi, H., et al ., Org. Lett . 4:2401, 2002; Yun, M., et al ., Tetrahedron Lett . 46:5903, 2005). 그러나 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다. 실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경상의 위험성, 화학 반응 후 부가적인 당류의 생성으로 인한 복잡한 엘-리보스의 분리 및 정제 과정 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경오염 문제 등이 유발되고 있다.

상기와 같은 단점을 극복하기 위하여, 엘-리보스의 생물학적인 생산 방법을 연구한 바가 다음과 같이 있었다. 구체적으로 클리비지엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 유래 아라비노스 이성화 효소, 슈도모나스 슈체리(Pseudomonas stutzeri) 유래 람노스 이성화 효소(L-rhamnose isomerase), 스트렙토마이세스 루비지노시스(Streptomyces rubiginosus) 유래 자일로스 이성화 효소(D-xylose isomerase) 및 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis) 유래 갈락토스-6-인산 이성화 효소(galactose-6-phosphate isomerase)는 광범위한 기질 특이성을 지니고 있어서 엘-리불로스를 엘-리보스로 전환시킬 수 있지만 그 전환속도는 매우 느리다.

또한, 엘-리불로스는 매우 고가의 기질이며, 현재 시판이 되지 않는 매우 휘귀한 당이기 때문에 엘-리불로스보다는 기질로서 엘-리불로스의 이성질체인 엘-아라비노스를 사용하는 것이 적합하다.

최근 본 발명자들은 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균으로부터 아라비노스 이성화효소(L-arabinose isomerase)를 이용하여 500 g/L의 엘-아라비노스로부터 2시간 만에 전환율이 19%인 95 g/L의 엘-리불로스를 생산하였으며(Yeom SJ , Ji JH , Yoon RY , and Oh DK 2008. Biotechnol Lett 30:1789-1793), 또한 엘-리불로스로부터 엘-리보스를 효과적으로 생산할 수 있는 것을 최초로 확인바 있다(대한민국 특허출원 제2008-0121766호).

이러한 결과를 토대로 지오바실러스 써모디니트리피칸스로부터 유래한 아라비노스 이성화 효소 유전자와 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 미생물을 구축하고, 이들을 이용하여 아라비노스 이성화 효소 및 만노스-6-인산 이성화효소를 대량으로 제조하며, 엘-아라비노스에서 엘-리보스를 고농도, 고수율로 얻는 최적 반응 조건을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 목적은 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans)균으로부터 아라비노스 이성화효소(L-arabinose isomerase) 유전자와 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase) 유전자를 분리하여 제작한 아라비노스 이성화효소 및 만노스-6-인산 이성화효소와 엘-아라비노스(L-arabinose)를 반응시켜 엘－리보스(L-ribose)를 고농도 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) 균으로부터 아라비노스 이성화효소(L-arabinose isomerase)와 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase) 유전자를 분리하여, 발현벡터에 삽입하는 과정; (b) 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하는 과정; (c) 상기 대장균으로부터 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화효소를 분리 및 정제하는 과정; 및 (d) 상기 아라비노스 이성화 효소 및 만노스-6-인산 이성화효소와 기질로서 엘-아라비노스를 반응시키는 과정;을 포함하는 두 단계 효소 반응에 의한 엘-아라비노스로부터 엘-리보스의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 아라비노스 이성화효소 유전자는 서열번호 1인 것을 특징으로 하며, 상기 만노스-6-인산 이성화효소 유전자는 서열번호 2인 것을 특징 으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 pTrc 99a인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 엘-아라비노스는 농도 100 g/L 내지 400 g/L 범위로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 반응은 망간, 아연, 바륨, 구리, 코발트, 칼슘, 마그네슘, 니켈 및 철로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 금속 이온을 0.1 mM 내지 2 mM 범위로 처리한 상태에서 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 상기 금속이온은 코발트인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 효소 반응은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 효소 반응은 온도 50℃ 내지 80℃ 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 효소 반응에서 1,500 unit/㎖의 아라비노스 이성화 효소 및 120 unit/㎖의 만노스-6-인산 이성화 효소는 각각 20 : 80 내지 80 : 20 범위의 비율(w/w)로 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 지오바실러스 써모디니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans)균으로부터 아라비노스 이성화효소와 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 분리하여 제작한 아라비노스 이성화효소 및 만노스-6-인산 이성화효소와 기질로서 엘-아라비노스를 반응시켜 엘－리보스를 고농도 고수율로 생산하는 방 법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따르면, 지오바실러스 써모디니트리피칸스로부터 유래한 재조합 아라비노스 이성화효소와 만노스-6-인산 이성화효소를 이용하여, 높은 특이성과 친환경적으로 의약품 원료물질인 엘-리보스를 생산할 수 있으며, 상기 엘-리보스는 다양한 엘-형태 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 의약품 등의 제조 시 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 두 단계 효소 반응에 의한 엘-아라비노스로부터 엘-리보스 생산방법은 (a) 지오바실러스 써모디니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans)균으로부터 아라비노스 이성화효소(L-arabinose isomerase)와 만노스-6-인산 이성화효소(mannose-6-phosphate isomerase) 유전자를 분리하여, 발현벡터에 삽입하는 과정; (b) 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하는 과정; (c) 상기 대장균으로부터 아라비노스 이성화효소와 만노스-6-인산 이성화효소를 분리 및 정제하는 과정; 및 (d) 상기 아라비노스 이성화효소 및 만노스-6-인산 이성화효소와 기질로서 엘-아라비노스를 반응시키는 과정;으로 구성된다.

상기 재조합 발현 벡터의 제조시 리보스의 생산에 사용될 수 있는 것이라면 발현 벡터 피티알씨(pTRC 99a)를 포함하여 유전자 재조합 방법에 이용되는 어느 벡터라도 사용될 수 있고, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 되는 미생물로는 대장균 이알2566(ER2566)을 사용하는 것이 바람직하나, 재조합 발현 벡터로 형질전환 되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 균주라면 어느 것이라도 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용한 아라비노스 이성화효소와 만노스-6-인산 이성화 효소는 효소 활성을 증진시키는 금속에 대해 영향을 받는 금속 이온 의존성 효소이다. 따라서, 상기 효소반응은 망간, 아연, 바륨, 구리, 코발트, 칼슘, 마그네슘, 니켈 및 철로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 금속 이온을 0.1 mM 내지 2 mM 범위로 처리한 상태에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상기 금속 이온은 코발트인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 두 종류의 이성화효소의 기질로서 엘-아라비노스를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 기질 농도는 100 g/L 내지 400 g/L 범위인 것이 바람직하며, 300 g/L 내외 범위인 것은 더욱 바람직하다.

또한 상기 효소 반응은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, pH 7.0 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다.

또한 상기 효소 반응은 온도 50℃ 내지 80℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 65℃ 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하나, 상기 효소 반응 시간도 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.

또한, 상기 효소 반응에서 두 종류의 이성화 효소는 각각 1,500 unit/㎖의 아라비노스 이성화 효소 및 120 unit/㎖의 만노스-6-인산 이성화 효소를 20 : 80 내지 80 : 20 범위의 비율(w/w)로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 40 : 60 내지 60 : 40의 비율(w/w)로 혼합하는 것이 좋다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 아라비노스 이성화 효소와 만노스 -6-인산 이성화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화 효소를 제조하기 위하여, 지오바실러스 써모디니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans) 균주로부터 유래한 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화 효소를 먼저 분리하였다.

구체적으로 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 지오바실러스 써모디니트리피칸스 균주를 선별하고(Dae-Heoun Baek, Yujin Lee, Hong-Sig Sin, and Deok-Kun (2004) J Microbiol . Biotechnol . 14: 312-316), 이로부터 유래한 아라비노스 이성화 효소의 공지의 DNA 염기서열(Genebank Accession Number ; AY302754 ; 서열번호 1)과 만노스-6-인산 이성화 효소의 공지의 DNA 염기서열(Genebank Accession Number CP000557; 서열번호 2)을 기초로 하여 각각 다음의 프라이머(primer)를 고안하였다.

(1) 아라비노스 이성화 효소

서열번호 3(정방향 프라이머): 5'-CGCGGGATCCATGATGCTGTCATTACGTCCTT-3'

서열번호 4(역방향 프라이머): 5'-AGAGTCTCCATATGATGCTGTCATTACGTCCTTA-3'

(2) 만노스-6-인산 이성화 효소

서열번호 5(정방향 프라이머): 5'-TTTGAATTCATGCATCAAGAACCGATTTTTC-3'

서열번호 6(역방향 프라이머): 5'-TTTAAGCTTTTATTTGCTTGTCCGTGG-3'

상기 아라비노스 이성화 효소 유전자의 프라이머는 KpnI 과 EcoR Ⅰ, 그리고 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자의 프라이머는 EcoR Ⅰ과 Hind Ⅲ 제한효소 절단부분으로 설계되었다. 상기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 대량으로 얻은 아라비노스 이성화 효소 유전자와 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자는 각각의 제한효소를 사용하여 플라스미드 벡터 pTRC 99a(Novagen 사)에 삽입하여 pTRC 99a/아라비노스 이성화 효소와 pTRC 99a/만노스-6-인산 이성화 효소를 제작하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 2: 아라비노스 이성화 효소와 만노스 -6-인산 이성화효소의 제조

아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화효소를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 LB 배지 3 ㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600 ㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500 ㎖이 들어있는 2,000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1 mM IPTG를 첨가하여 아라비노스 이성화 효소와 만노스 6-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, 아이피티지(IPTG)를 첨가한 후에 같은 조건으로 5시간동안 배양하였다.

또한, 상기와 같이 과발현 되어 생산된 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000× g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두번 세척한 다음 50 mM 트리스-염화수소 완충용액과 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 65℃에서 10분간 열처리를 한 후 다시 13,000× g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA))에 음이온 수지인 하이트랩 에이치피(Hi Trap^TM HP) 흡착 컬럼을 장착 하여 엘-리보스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.

실시예 3: 아라비노스 이성화 효소와 만노스 -6-인산 이성화효소의 금속 특이 성 조사

먼저, 본 발명의 아라비노스 이성화 효소의 금속 이온에 대한 특이성을 조사하기 위하여, 상기 효소 활성은 10mM EDTA를 처리하고 금속 이온 (Mn² ⁺, Ba² ⁺, Cu² ⁺, Co²⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Fe² ⁺)을 첨가하여 반응시킨 후 다음과 같이 활성을 측정하였다. 상기 효소 반응은 10 mM 엘-아라비노스, 각각의 금속 이온과 0.1 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM EPPS(N-(2-hyroxyethyl) piperazine-N-(3-propane sulfonic acid) 완충용액(pH 8.0)을 사용하여 70℃에서 10분 동안 수행하였고, 다시 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 효소 활성은 엘-아라비노스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효소 1 unit은 pH 7.0와 70℃에서 분당 1μmole의 엘-리불로오스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 하였다.

또한, 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 금속 이온에 대한 특이성을 조사하기 위하여서는, 상기 효소 활성은 10 mM EDTA를 처리하고 금속 이온(Mn² ⁺, Zn² ⁺, Ba²⁺, Cu² ⁺, Co² ⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Ni² ⁺, Fe² ⁺)을 첨가하여 반응시킨 후 다음과 같이 활성을 측정하였다. 상기 효소 반응은 10 mM 엘-리보스, 각각의 금속 이온과 2 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM PIPES(piperazine-N,N’-bis(2-ethane sulfonic acid) 완충용액(pH 7.0)을 사용하여 70℃에서 10분 동안 수행하였고, 다시 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.

효소 활성은 엘-리보스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효 소 1 unit은 pH 7.0와 70℃에서 분당 1 nmole의 엘-리불로오스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 하였다. 또한, 효소 활성의 측정 시 엘-리보스 농도 및 엘-리불로오스 농도 그리고 다른 당들의 분석은 전기화학적 검출기(electrochemical detector) 및 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼이 장착된 바이오 액체 크로마토그래피(Bio-LC) 시스템(Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA)을 이용하여 진행되었다. 이때, 상기 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼은 30℃에서 1 ㎖/분 속도로 200 mM 수산화나트륨을 통과시키도록 하였다.

그 결과, 실험한 금속염 중 지오바실러스 써모디니트리피칸스( Geobacillus thermodenitrificans) 유래의 아라비노스 이성화 효소에 의한 아라비노스 이성화에는 망간(Mn² ⁺)이 가장 효과적이었고, 만노스-6-인산 이성화 효소에 의한 리보스 이성화에 코발트(Co² ⁺)가 가장 효과적이었다. 농도별 테스트 결과 두 효소에 대한 금속염 모두 최적농도는 1 mM이었다. 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화효소는 1 mM 망간 및 코발트 금속 이온의 영향을 받는 것으로 나타나, 본 발명의 아라비노스 이성화 효소와 만노스 6-인산 이성화효소는 금속 이온에 대해 의존성 효소인 것을 확인하였다.

금속 이온에 대한 아라비노스 이성화 효소와 만노스 6-인산 이성화효소에 대한 활성은 각각 도 1a 및 도 1b에 나타내었고, 아라비노스 이성화 효소와 만노스 6-인산 이성화효소에 대한 금속염 최적 농도는 각각 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

본 발명은 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화 효소를 이용한 것이나, 만노스-6-인산 이성화 효소의 활성이 아라비노스 이성화 효소의 그것에 비해 현저히 떨어지기 때문에 만노스-6-인산 이성화 효소를 기준하여 두 효소의 최적을 위한 금속이온은 1 mM 코발트로 결정하였다.

실시예 3: pH 및 온도가 아라비노스 이성화효소와 만노스 6-인산 이성화효소 활성에 미치는 영향

상기 실시예 2에서 분리한 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성도를 다음과 같이 확인하였다. 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다.

3-1: pH 가 아라비노스 이성화 효소와 만노스 -6-인산 이성화효소에 미치는 영향

상기 두 효소에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 아라비노스 이성화 효소는 10 mM 엘-아라비노스, 1 mM 망간, 0.1 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM PIPES 완충용액을, 만노스-6-인산 이성화효소는 10 mM 엘-리보스, 1 mM 코발트, 2 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM EPPS 완충용액을 사용하여 pH 6.5에서부터 8.5 범위까지 효소 반응을 실시하였다. 구체적으로, 효소반응은 70℃에서 10분 동안 수행하고 다시 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 그 결과, 도 3a와 도 3b에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 아라비노스 이성화 효소와 만노스- 6-인산 이성화효소 모두 7.0인 것을 알 수 있었다.

3-2: 온도가 아라비노스 이성화 효소와 만노스 -6-인산 이성화효소에 미치는 영향

상기 효소에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 각각 효소 반응은 온도 55℃에서 80℃ 범위까지 아라비노스 이성화 효소는 10 mM 엘-아라비노스, 1 mM 망간과 0.1 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 8.0 인 50 mM EPPS 완충용액을 사용하고, 만노스-6-인산 이성화 효소는 10 mM 엘-리보스, 0.5 mM 코발트와 2 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.0인 50 mM PIPES 완충용액을 사용하여 각각 10분 동안 반응을 실시하였다. 그 다음 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.

그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 두 효소 모두 70℃인 것을 알 수 있었다.

도 3a는 본 발명의 아라비노스 이성화 효소의 pH에 따른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이고, 도 3b는 만노스-6-인산 이성화 효소의 pH에 따른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이며, 도 4a는 본 발명의 아라비노스 이성화 효소의 온도에 따른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이고, 도 4b는 만노스-6-인산 이성화 효소의 온도에 따른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이다.

또한, 도 3a와 도 3b의 pH에 따른 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화 효소의 활성도에서 ●는 PIPES 완충용액을 나타내고, ○는 EPPS 완충용액을 나타낸다.

3-3: 아라비노스 이성화 효소와 만노스 -6-인산 이성화효소의 온도 안정성 조사

아라비노스 이성화 효소의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 온도 60℃에서 80℃까지의 범위에서 10 mM 아라비노스, 1 mM 망간, 0.1 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 8.0인 50 mM EPPES 완충용액을 사용하여 각각 효소 활성이 절반으로 줄어드는 시간까지 반응을 진행시켰다. 반응이 끝난 다음, 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 아라비노스 이성화 효소 효소의 활성을 측정하였다.

만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 온도 60℃에서 80℃까지의 범위에서 10 mM 리보스, 1 mM 코발트, 2 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.0인 50 mM PIPES 완충용액을 사용하여 각각 효소 활성이 절반으로 줄어드는 시간까지 반응을 진행시켰다. 반응이 끝난 다음, 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 만노스-6-인산 이성화효소 효소의 활성을 측정하였다.

도 5a는 본 발명의 아라비노스 이성화 효소의 온도 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다. 상기의 그래프에서 온도 표기는 60℃(○), 65℃(▼), 70℃(△), 75℃(□) 및 80℃(■)로 각각 나타내었다.

그 결과 도 5a에 나타난 바와 같이, 온도 60℃에서는 90시간, 65℃는 50시간, 70℃는 32시간, 75℃는 4.5시간, 그리고 80℃에서는 0.3시간 경과 시 상기 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 5b는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성 측정 결 과를 나타낸 것이다. 상기의 그래프에서 온도 표기는 60℃(▲), 65℃(△), 70℃(▲), 75℃(□) 및 80℃(■)로 각각 나타내었다.

그 결과 도 5b에 나타난 바와 같이, 온도 60℃에서는 338시간, 65℃는 73시간, 70℃는 27시간, 75℃는 17시간, 그리고 80℃에서는 6.2시간 경과 시 상기 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 리보스의 생산에서 아리비노스 이성화 효소와 만노스 -6-인산 이성화 효소의 최적 비율 조사

본 발명에 따른 리보스 생산에서 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화 효소의 최적 비율을 조사하기 위하여 1,000 unit/㎖ 만노스-6-인산 이성화효소와 80 unit/㎖ 아라비노스 이성화 효소를 비율별(w/w)로 혼합하여 효소의 최적 pH 7.0, 1 mM 코발트 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(65℃)에서 15 g/L 아라비노스를 기질로 5시간 동안 효소 반응을 실시하였다. 그 다음 최종 농도 200 mM의 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 최적 비율을 50 : 50 인 것으로 확인되었다.

실시예 5. 리보스의 최대 생산을 위한 기질 농도 및 효소량 조사

리보스의 최대 생산을 조사하기 위하여 1,500 unit/㎖의 만노스-6-인산 이성화효소와 120 unit/㎖의 아라비노스 이성화 효소를 50 : 50 비율(w/w)로 혼합한 후 15 g/L 내지 300 g/L의 엘-아라비노스를 기질로 하여 65℃에서 5시간 반응하였다.

그 결과, 300 g/L 엘-아라비노스에서 54 g/L의 엘-리보스가 생산되었고, 이는 18%의 전환율을 나타내었다.

또한, 기질 300 g/L의 아라비노스와 만노스-6-인산 이성화 효소와 아라비노스 이성화 효소의 농도를 증가시키면서 5시간 반응 한 경과, 2,000 unit/㎖의 만노스-6-인산 이성화 효소와 160 unit/㎖의 아라비노스 이성화 효소를 50 : 50 비율(w/w)로 혼합한 실험군에서 65 g/L의 엘-리보스가 생산되었고, 이는 21%의 전환율을 나타내었다.

도 7a와 도 7b는 각각 본 발명에 따른 리보스의 최대 생산을 위한 아라비노스 이성화효소와 만노스-6-인산 이성화효소의 기질 농도 실험 및 효소량 실험 결과를 나타낸 것이다.

실시예 6. 아라비노스 이성화효소와 만노스 -6-인산 이성화효소를 이용한 엘- 리보스의 생산

아라비노스 이성화효소와 만노스-6-인산 이성화효소를 이용한 엘-리보스의 생산 방법을 개발하기 위하여, 상기에서 확인한 효소의 최적 pH 7.0 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(60 ℃)에서 2,000 unit/㎖ 만노스-6-인산 이성화효소와 160 unit/㎖ 아라비노스 이성화효소를 50 : 50의 비율(w/w)로 혼합한 후 300 g/L 엘-아라비노스를 가지고 엘-리보스의 시간별 생산량을 측정하였다.

도 8은 기질로서 농도 300 g/L의 엘-아라비노스에서 본 발명의 아라비노스 이성화효소와 만노스-6-인산 이성화 효소에 의한 엘-리보스의 생산량을 나타낸 그래프로, 300 g/L 엘-아라비노스로부터 반응 4.5시간 후에 67.4 g/L 리보스를 얻어 15 g L^-1 h^- ¹생산성과 22.5% 전환수율을 나타내었다. 따라서, 엘-리보스를 4.5시간에 67.4 g/L 생산함을 확인할 수 있었다.

현재까지 엘-리보스의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 Molybdic acid를 사용한 화학합성법은 엘-아라비노스 로부터 23% 전환수율과 20 g L^-1h^-1생산성을 나타내었다(Jumppanen, J., J. Nurmi, and O. Pastinen. October 2000. Process for the continuous production of high purity of L-ribose. U.S. Patent 6,140,498).

또 다른 비교로는 엔에이디-의존적 만니톨-1-탈수소효소(NAD-dependent mannitol-1-dehydrogenase)가 포함된 재조합 대장균을 사용하여 100 g/L 리비톨로부터 배양 72시간 후에 52 g/L 엘-리보스를 얻어 생산성 0.72 g L^-1h^-1을 보여 주었다(Woodyer, R., N. Wymer, F. Racine, S. Khan, and B. Saha. 2008. Efficient production of L-ribose with a recombinant Escherichia coli biocatalyst. Appl. Environ. Microbiol.74: 2967~2975).

상기는 보고된 생물학적 엘-아라비노스로부터 엘-리보스 생산에서 가장 높은 생산성 및 생산농도로, 본 발명에 따른 엘-리보스 생산 방법은 생산성, 생산 농도 및 정제의 용이함 등에서 종래 기술인 발효법과 화학합성법보다 훨씬 우수하다는 것을 알려주는 결과이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 아라비노스 이성화효소(a)와 만노스-6-인산 이성화효소(b)의 무기염 종류에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 아라비노스 이성화효소(a)와 만노스-6-인산 이성화효소(b)의 최적 무기염의 농도에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 아라비노스 이성화효소(a)와 만노스-6-인산 이성화효소(b)의 pH에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 아라비노스 이성화효소(a)와 만노스-6-인산 이성화효소(b)의 온도에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 아라비노스 이성화효소(a)와 만노스-6-인산 이성화효소 (b)의 온도에 따른 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화 효소의 혼합비율에 따른 엘-리보스의 생산량을 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화 효소의 엘-리보스의 생산량을 나타낸 것으로, (a)는 기질 농도 및 (b)는 효소량에 따른 엘-리보스의 생산량이다.

도 8은 기질 농도 300 g/L에서 본 발명의 아라비노스 이성화 효소와 만노스-6-인산 이성화효소에 따른 엘-리보스의 생산량을 나타낸 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Method for production of L-ribose from L-arabinose by two-step enzyme reactions <130> P09-E020 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1494 <212> DNA <213> Geobacillus thermodenitrificans <400> 1 atgatgctgt cattacgtcc ttatgaactt tggtttgtga caggaagcca gcacttatac 60 ggggaagaag cgttaaaaca agttgaagaa cattcaagaa cgatcgtcaa tgagttgaac 120 cgtgattcgg tgtttccgtt cccactcgtt ttcaaaccga tcgtcacaac cccagaagaa 180 attcgcaaca tctgtcttga ggcgaatgcg agcgaacaat gtgccggcgt tgtcacatgg 240 atgcatacgt tctcgccagc gaagatgtgg attggcggcc ttttggagtt gcgaaaaccg 300 ttattgcatc ttcacactca gtttaaccgt gatattccgt gggacagcat cgatatggac 360 tttatgaact taaaccaatc ggctcacggt gaccgagaat acggatttat cggtgcgaga 420 atgggagttg cccggaaagt cgtcgttggt cattgggaag acccagaagt ccgcgagcgg 480 ctggcgaaat ggatgcggac ggccgtcgcc tttgcggaaa gtcgacatct taaagttgcc 540 cgtttcggcg ataacatgcg tgaagtggcg gtaacggaag gggacaaagt gggagcgcaa 600 attcaattcg gctggtcgat caacggttat ggcattgggg atttggtgca atctattcgc 660 gatgtttctg aacaaagcgt caacgaactg cttgatgaat atgctgaact atatgacatt 720 gtacctgctg gccgtcaaga tggacccgtt cgtgagtcga tccgtgagca ggcgcggatt 780 gagcttgggt taaaagcatt tttgcaagac gggaacttca ctgcctttac gacgacgttt 840 gaagatttgc acggcatgaa gcaacttcca ggactagcgg ttcaacggct tatggcagag 900 ggatatggat ttggcggcga aggcgactgg aaaacggctg ctctcgttcg gttgatgaaa 960 gtcatggcgg atggcaaagg aacatcgttc atggaagact acacgtacca ctttgagccg 1020 ggcaacgaaa tgattcttgg cgctcatatg ctcgaagtat gcccgacgat cgcagcaacg 1080 cgaccgcgca tcgaagttca tccgctttcg attggtggaa aagaagatcc agcccgtctc 1140 gtgtttgacg gcggtgaggg cgcagcggtc aatgcttcgc tgattgactt agggcaccgt 1200 ttccgtctca ttgtcaatga agtcgatgcg gtgaaaccgg aatacgacat gccgaaattg 1260 ccggttgccc gtattttatg gaaaccgcgc ccgtcgttgc gtgattcagc tgaagcatgg 1320 attttagccg gcggtgctca tcacacatgc ttctcgtttg ccgtcacggc tgaacagctg 1380 gaagactttg cggaaatgac cggcattgaa tgtgtcgtga tcaatgaaca tacttccgtc 1440 tcgtcattca aaaacgaact gaggtggaat gaggtgtttt ggcgggggcg gtaa 1494 <210> 2 <211> 963 <212> DNA <213> Geobacillus thermodenitrificans <400> 2 atgcatcaag aaccgatttt tctcactcct gtcttccaag agcgcatttg gggcggcacg 60 aagctcgccg aacggttcgg ctacgatatc ccgtcatcgc aaacagggga atgttgggcg 120 gtatcggccc atccgcacgg acagacggtt gtcgcccgcg ggccgtttca agggatgacg 180 cttggacagc tatgggagga gcgccgcgac ttgttcggca attttccatc cgatcgcttt 240 ccgttgctga cgaaaatttt agacgccaac gccgatttgt ccgtccaagt ccatccggat 300 gacgactatg caaaaacaaa cgaaggtggg gagctcggta agacagaatg ttggtacatt 360 atcgactgca agccgggcgc ccagttaatt tacggccatt atgcccaaac gaaagaagag 420 ctgcgcgcca tgatggaggc gggagaatgg gatcgtttgc tgcggaaagt gccgatccat 480 cccggcgact tcttctatgt cccgagcggc acgattcacg ccctctgtga ggggacgctt 540 gttctcgaga cgcagcaaag ctctgacacg acttatcgcg tctacgatta cgaccgcgtc 600 gacagccaag gccggaagcg tgagctccac ttagagaaag ccattgacgt caccactgtc 660 ccgcatcgcg acaccgatgt ccagccccat gtcgccaaca tacctggtgc aaccgtgacg 720 acctttgtgg agggcgacta ctttggcgtc caaaaatggc atgtccatgg agaagccgag 780 tgggagcaga cgaagccatt tctcatcgtc agcatccttc aaggagaggg cgagcttgtt 840 cacggcgagc gtacataccc gatccgccaa ggtgaccatt ttattttgcc gcaccaattc 900 ggccggtttg cgattcgtgg cacacttgaa gccattgcct cttggccacg gacaagcaaa 960 taa 963 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cgcgggatcc atgatgctgt cattacgtcc tt 32 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 agagtctcca tatgatgctg tcattacgtc ctta 34 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tttgaattca tgcatcaaga accgattttt c 31 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tttaagcttt tatttgcttg tccgtgg 27

Claims

다음의 과정을 포함하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스(L-ribose)의 생산방법:

(a) 지오바실러스 써모디니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans)균으로부터 아라비노스 이성화 효소(L-arabinose isomerase)와 만노스-6-인산 이성화효소(mannose-6-phosphate isomerase) 유전자를 분리하여, 발현벡터에 삽입하는 과정;

(b) 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하는 과정;

(c) 상기 대장균으로부터 아라비노스 이성화효소와 만노스-6-인산 이성화효소를 분리 및 정제하는 과정; 및

(d) 상기 아라비노스 이성화효소 및 만노스-6-인산 이성화효소와 엘-아라비노스를 기질로서 반응시키는 과정.
제1항에 있어서,

상기 아라비노스 이성화 효소 유전자는 서열번호 1인 것을 특징으로 하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스(L-ribose)의 생산방법.
제 1항에 있어서,

상기 만노스-6-인산 이성화효소 유전자는 서열번호 2인 것을 특징으로 하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스(L-ribose)의 생산방법.
제1항에 있어서,

상기 발현벡터는 pTRC 99a인 것을 특징으로 하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스(L-ribose)의 생산방법.
제1항에 있어서,

상기 엘-아라비노스는 농도 100 g/L 내지 400 g/L 범위로 첨가되는 것을 특징으로 하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스(L-ribose)의 생산방법.
제1항에 있어서,

상기 반응은 망간, 아연, 바륨, 구리, 코발트, 칼슘, 마그네슘, 니켈 및 철 로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 금속 이온을 0.1 mM 내지 2 mM 범위로 처리한 상태에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스 (L-ribose)의 생산방법.
제1항 또는 제5항에 있어서,

상기 금속이온은 코발트인 것을 특징으로 하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스 (L-ribose)의 생산방법.
제1항에 있어서,

상기 반응은 pH 6.5 내지 pH 8.5 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스 (L-ribose)의 생산방법.
제1항에 있어서,

상기 효소 반응은 온도 55℃ 내지 80℃ 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스 (L-ribose)의 생산방법.
제1항에 있어서,

상기 효소 반응에서 아라비노스 이성화효소 및 만노스-6-인산 이성화 효소는 각각 20 : 80 내지 80 : 20 범위의 비율(w/w)로 혼합되는 것을 특징으로 하는 두단계 효소반응에 의한 엘-아라비노스(L-arabinose)로부터 엘-리보스 (L-ribose)의 생산방법.