KR20100089406A - 메주로부터 분리된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 및 이를 포함하는 항진균 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메주로부터 분리되고 항진균활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 그람 양성균(gram-positive bacteria) 및 그람 음성균(gram-negative bacteria)에 대한 항균활성과 칸디다 속(Candida sp.) 효모 및 곰팡이균에 대한 항진균활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 균주(Bacillus polyfermenticus) 및 상기 균주, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 균주는 GRAS(generally regarded as safe) 미생물에 속하고, 상기 균주 또는 이의 배양액은 그람 양성균, 그람 음성균, 칸디다 속 효모 및 곰팡이에 대한 우수한 항균 및 항진균 활성을 가지며, 이러한 항균 및 항진균활성은 열처리에도 내성을 가지며, 특히 항진균활성의 경우 열처리에 대한 내성이 강하고, 단백질 가수분해효소를 이용한 효소처리 시, 항균 및 항진균활성이 불활성 되어, 인체에 투여하는 경우 내성 등의 문제가 발생되지 아니할 것으로 예상되므로, 항균 조성물, 상기 항균 조성물을 유효성분으로 포함하는 천연식품보존제와 사료보존제 및 상기 항균 조성물을 유효성분으로 포함하는 의약 조성물과 식품 조성물 등 다양한 산업분야에 이용될 수 있다.

바실러스 폴리퍼멘티쿠스, 항진균, 항균

Description

메주로부터 분리된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 및 이를 포함하는 항진균 조성물{BACILLUS POLYFERMENTICUS SEPARATED FROM MEJU AND A ANTIFUNGAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 항균활성 및 항진균활성을 갖는 미생물 및 상기 미생물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

최근 보고에 의하면, 세계 식량생산량의 5 내지 10％가 곰팡이성 변패에 의해 손실된다고 보고되고 있으며, 특히 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)은 다양한 종류의 식품이나 사료를 저장기간 중 변패시키고 있는 것으로 알려지고 있다. 이와 아울러 이들 변패 곰팡이는 곰팡이 독소를 생성하여 심각한 인체질환의 원인이 되기도 한다.

상기한 식품의 경우뿐만 아니라, 사료, 의약품이나 화장품의 경우에도 곰팡이를 비롯한 미생물에 의한 변패나 부패가 문제되고 있으며, 이러한 변패나 부패를 방지하고 상기 식품 등의 품질을 오랫동안 유지하기 위한 노력이 계속되고 있다. 상기 미생물에 의한 변패나 부패를 방지하기 위하여, 미생물에 의한 부패를 막아주는 보존제 또는 방부제가 널리 사용되고 있다.

식품의 보존제 또는 방부제, 화장품이나 의약품 등의 보존제 또는 사료의 보존제란 넓은 의미로는 식품, 의약품, 화장품이나 사료의 변질 및 부패나 화학변화를 방지하여 영양가와 신선도를 유지시키기 위하여 사용되는 첨가물을 의미하여, 좁은 의미로는 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품을 보존하는 첨가물로서 부패미생물의 발육을 저지하거나 살균하기 위하여 사용되는 것이다. 이러한 식품의 방부제 및 화장품, 의약품 등의 보존제로써 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.

기존의 보존제 또는 방부제는 주로 화학적 보존제 또는 방부제가 많이 사용되었으나, 상기 화학적 보존제 또는 방부제 중에서 가장 안전한 것으로 인정되어 범용적으로 사용되는 파라벤류의 방부제들 조차 피부알러지와 환경호르몬으로서의 가능성이라는 문제점을 가지고 있다. 또한, 식품에 주로 사용되는 보존제 또는 방부제들은 허용된 기준 내에 사용되는 경우에도, 항균력에 대한 불신뿐만 아니라 인체 안전성에 대한 불신이 계속되고 있으며, 지속적인 체내 축적으로 인한 급ㆍ만성 독성이나 돌연변이 유발 등의 새로운 문제 가능성이 대두되고 있다.

또한, 진균류에 대해 활용되는 화학요법은 세균감염증에 대한 화학요법에 비하여 그 발전이 매우 저조한 실정이고, 화학적으로 합성된 항생제의 경우, 효과가 일시적이며 난분해성이므로 인축독성을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 항생제에 대한 대상 세균의 내성 증가로 인하여 기존에 개발된 항생물질의 효능이 저하되는 문제점이 있다.

상기한 문제점에 대한 언론매체의 보도 등으로 인하여 최근 들어 대부분의 소비자들의 화학적 방부제나 첨가물에 대한 사용 거부감의 동향이 증가함에 따라 미생물이나 그 대사산물로서 변패 미생물의 생육을 저해할 수 있는 천연 보존제 또는 방부제에 대한 관심이 급증하고 있다. 이러한 천연 보존제 또는 방부제에 대한 요구에 수반하여, 안전성과 경제성이 우수한 천연방부제에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있는 실정이다.

또한, 기존에 개발된 항생물질에 대한 내성을 갖는 세균들에 대해서도 상당한 효과를 나타낼 수 있는 새로운 항균성 펩타이드(peptide)를 포함한 항생물질에 대한 연구의 필요성이 증대되면서, 여러 가지 진균류에 대한 강력한 항진균 활성을 가진 항균 물질을 생산할 수 있는 미생물의 탐색 및 개발이 꼭 필요한 실정이다.

상기 천연방부제 및 항진균활성을 갖는 물질에 대한 개발과 관련하여, 미생물로부터 생산되는 항생물질에 대한 관심이 증대되고 있다. 상기한 항생물질 중의 일 예로 박테리오신 또는 박테리오신 유사물질(bacteriocin-like substances, BLS)에 대한 관심이 증대되고 있다. 상기 박테리오신 또는 박테리오신 유사물질과 관련하여, 유산균이나 바실러스 속 미생물 등이 연구되고 있다.

이 중, 상기 유산균이 생산하는 박테리오신은 유산균이 GRAS(generally regarded as safe) 미생물이고, 인간의 장내 단백분해효소에 의해 분해되므로 안전하다는 인식에 의해, 박테리오신 중 유산균 유래의 박테리오신에 대한 연구가 가장 많이 진행되어 왔다. 그러나 이와 같은 유산균 유래 박테리오신에 관한 수많은 연구보고가 있음에도 불구하고, 항균 스펙트럼이 좁아 특히 그람 음성균이나 효모, 곰팡이에 대해서는 거의 항균력이 없다는 단점으로 인하여, 유산균 유래 박테리오 신은 실제로 식품보존제로 널리 활용되지 못하고 있는 실정이다.

특히, Klaenhammer가 주장한 바와 같이, 천연식품보존제의 경우 식품부패나 식중독 등에 관여하는 세균, 효모 및 곰팡이 등의 미생물에 대해 총체적으로 적용 가능한 넓은 범위의 항균력이 요구되므로, 상기 유산균 또는 유산균이 생산하는 박테리오신을 대체할 수 있는 천연 보존제 또는 방부제에 대한 개발이 요구된다(Klaenhammer, T. R., Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie. 70: 337-349(1988)).

즉, 세균에만 국한되어 항균작용을 나타내는 한계를 지니고 있는 지금까지 분리된 대부분의 박테리오신 및 BLS의 한계를 해결하고, 최근 상기 진균에 의해 발병된 인간의 질병, 작물의 병해 유발, 식품의 부패 등의 심각한 문제를 해결하기 위하여, 유용한 항진균 물질을 생산할 수 있는 미생물의 탐색 및 상기 미생물이 생산하는 물질에 대한 연구가 절실히 요구되고 있다.

이와 관련하여, 주로 그람 양성균의 생육저해를 할 수 있는 박테리오신을 생산해내는 상기 유산균과 달리, 넓은 항균 스펙트럼(antimicrobial spectrum)과 다양한 구조를 지니는 펩타이드 항생물질(peptide antibiotics) 즉, 박테리오신이나 박테리오신 유사물질(bacteriocin-like substances, BLS)을 생산하는 바실러스 속 균주(Bacillus sp.)에 대한 관심이 증대되고 있다.

상기 바실러스 속 미생물은 산업적으로 중요한 종으로서, 오랜 세월동안 식품 및 각종 발효산업에서 숙주 세포로서 널리 사용되고 있고, protease, amylase, glucanases 또는 cellulase 등의 중요한 효소 및 넓은 항균 spectrum과 다양한 구 조를 지니는 peptide antibiotics를 생산하는 특징을 지니고 있다. 구체적으로, B. subtilis, B. megaterium, B. stearothermophilus, B. lichemiformis, B. thuringiensis 또는 B. cereus 등 다양한 바실러스 속 미생물에서 박테리오신 또는 bacteriocin-like substances(BLS)들이 발견되어 보고되었다.

프로바이오틱 생균제는 대표적인 GRAS 미생물인 유산균을 주로 사용하여 제조되어 왔으나, 상기한 제한적 범위에서만 항균활성이 인정된다는 문제점이 제기되어 왔으여, 최근 바실러스 서브틸리스나 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 등과 같은 바실러스 속에 해당하는 GRAS 미생물을 이용한 프로바이오틱 생균제에 대한 관심이 증대되고 있다. 상기 바실러스 서브틸리스나 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 등 은 유산균과 같이 GRAS 미생물이며, 우리나라의 청국장이나 일본의 낫또(natto)를 비롯하여 극동 아시아나 아프리카 지역의 전통음료나 알칼리-발효식품에서 매우 중요한 발효미생물로 작용한다.

이 중, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스에 속하는 B. polyfermenticus SCD는 유산균과 혼합하여 식품 및 의약용 프로바이오틱 생균제로 시판되고 있다. 상기 B. polyfermenticus SCD는 1933년 일본의 Terakado가 공기로부터 분리한 그람 양성의 비병원성균으로, 아포를 형성하고 plate 배양시 콜로니의 색상으로 옅은 황색을 보이는 내생포자(endospore)성 간균으로, 비스판균이라고도 한다. 상기 B. polyfermenticus SCD는 20 여종의 효소를 분비하여 영양을 보급시키고, 인체의 3대 영양소인 탄수화물, 지방, 단백질 및 섬유소를 소화, 흡수시키며, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 K 및 비타민 C를 합성하여 영양을 보급시킬 수 있다. 또한, 상기 B. polyfermenticus SCD를 섭취하는 경우, 인체에서의 장내세균 및 부패산물에 대한 긍정적인 영향을 미치고, 활성포자를 형성하기 때문에 위산에 대한 내성이 높으므로 장내 도달율이 높아 장 질환 치료에 탁월한 효과가 있으므로 프로바이오틱 생균으로서의 유용한 특성이 있다. 뿐만 아니라, 병원성 균들인 티프스균, 파라티프스균, 적리균, 콜레라균 등을 용균시켜 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다. 다만, 상기 B. polyfermenticus SCD의 경우, 곰팡이나 진균에 대한 살균 활성, 즉 항진균 활성에 대한 효과는 전혀 보고되어 있지 않고 있다.

상기 B. polyfermenticus SCD는 일본약국방외의약품성분규격에 당화균(amylolytic Bacillus)이라 하여 B. subtilis 및 B. mesentericus와 함께 게재되어 있으나, 국제명명규약(예를 들어, Bergey's manual)에 의한 분류명에는 존재하지 않는다. 그러나, 미생물 분류상의 특징들을 비교해볼 때 B. polyfermenticus는 B. subtilis와 상당히 유사한 것으로 인정되고 있으나, B. subtilis와 다른 점은 유당을 분해하는 능력이 있고 포도당과 유당에서 초산과 젖산을 더욱 많이 생산하는 등, B. subtilis와 구분되는 특징이 있다. 현재 B. polyfermenticus 유래의 항균물질은 B. polyfermenticus SCD에 의해 생산되는 polyfermenticin SCD라고 명명된 박테리오신에 관한 연구가 이루어져 있으며, 이는 그람 양성균과 더불어 그람 음성균 중에서는 Helicobacter pylori 한 종에만 생육 저해활성을 가지는 좁은 범위의 항균력을 가지고 있다. 따라서, 식품의 부패나 식중독에 관여하는 곰팡이 및 세균, 효모 등의 미생물에 대해 적용될 수 있는 넓은 범위의 항균력을 가지고 있는 GRAS 등급의 항균제나 생균제재의 개발을 위해 항균 및 항진균 효과가 있는 신규한 B. polyfermenticus에 대한 연구 및 개발이 요구되고 있다.

한편, 사춘기 이전의 여성의 질 내는 피부와 유사한 pH 6 내지 8 정도의 중성을 유지하다가 사춘기에 성호르몬의 분비로 인해 글리코겐이 축적된 질 상피세포가 증식되어 세포나 균에서 나오는 효소에 의해서 글리코겐이 젖산으로 분해되어 질내 산도가 4.5로 유지된다. 질 내에 상주하는 정상 균은 6가지 정도로 그 중 제일 많은 수를 차지하는 세균은 락토바실러스(lactobacillus)로써 이들 균의 생존은 질 내 산도와 당(Glucose)의 이용도에 영향을 받는다. 질 상피세포는 여성호르몬에 의해 글리코겐을 다량 함유하게 되고, 락토바실러스균은 이들을 분해하여 젖산을 생산하게 된다. 만일 질내 산도가 유지되지 못하거나 대사 장애가 발생하게 되면 정상 균총이 감소될 수 있고, 상기 정상 균총이 감소되게 되면, 질염을 일으키는 비뇨기 감염원인세균(genitourinary pathogen)들에 의한 질의 감염을 원인으로 하는 질병이 발생될 수 있다.

상기 질염을 일으키는 비뇨기 감염원인세균들에는 Candida albicans, Staphylococcus aureus, E coli 등이 있다. 상기 비뇨기 감염원인세균들에 의한 감염은 요로감염에서부터 시작된다(Reid, G. et al., Potential uses of probiotics in clinical practice, Clinical Microbiology Reviews 16: 658-672 (2003)).

상기 비뇨기 감염의 치료에 응용될 수 있는 생균 또는 생균활성제는 상기 병원균에 대한 항균활성이 뛰어나거나 상기 병원균의 성장을 억제하는 능력이 있어야 하며, 여기에 덧붙여 인체 안전성 검사를 통과할 수 있는 GRAS(generally regarded as safe) 미생물이어야 한다.

또한, 피부진균증(dermatomycosis)은 진균(곰팡이)에 의해 발생되는 피부질환으로서, 특히 피부의 각질, 모발, 손톱, 발톱 등의 각질조직에 침입, 기생하는 피부사상균 또는 칸디다균에 의해 발생되고 피부사상균증(dermatophytosis), 백선(Tinea) 또는 표재성진균증(superficial fungal infection)이라 불리는 발생 빈도가 높은 인체감염증 중 하나이다.

상기 피부사상균증(dermatophytosis)은 침범부위에 따라 발생부위가 손, 발인 경우 수족부 백선(Tinea manus & Tinea pedis), 안면인 경우 얼굴 백선(Tinea faciale), 두부의 경우에는 두부 백선(Tinea capitis), 서혜부(사타구니)에 발생했을 때에는 완선(Tinea cruris)이라고 하며 손, 발톱의 경우에 조갑 백선(Tinea ungium 또는 Onychomycosis)이라 하고 상기부위를 제외한 부위에 발생한 경우 체부 백선(Tinea)으로 분류된다. 이중 족부 백선 및 조갑 백선은 유병기간이 길고 재발 가능성이 높은 질환이다.

상기 질환 중, 조갑 백선의 경우 그 부위에 따라 원인균들이 상이한 것으로 보고되어 있다. 조갑 백선 중 발톱 무좀의 경우, 다른 피부사상균증과 유사하게 주로 피부사상균에 속하는 마이크로스포럼(Microsporum sp) 및 트리코피톤(Tricopyton sp) 속의 진균이 원인균이나, 조갑 백선 중 손톱 무좀의 경우에는 주로 칸디다 균(Candida sp) 속의 진균이 원인균이다.

상기 칸디다균에 의한 손톱 무좀의 경우, 전염성이 강하고 영양원으로 케라틴을 이용한다는 점에서 여러 병원성 진균과 구별되는 특성을 가지며, 원인균과 침 투경로가 다양하며, 육안으로 그 원인을 파악하는 것이 불가능한 특성이 있다.

상기 손톱무좀에 대한 치료에는 기존에 피부사상균에 사용되는 치료제인 그리세오풀빈, 케토카나졸 등의 항진균제가 사용되어 왔으나, 간독성, 위장장애 등 전신적인 부작용이 많았을 뿐만 아니라, 만성 치료시 생기는 내성, 항균 스펙트럼의 한계 및 작용 부위에 대한 약물 전달에 있어서의 문제점 등으로 인해 완치율도 낮아 불신이 많았다. 현재 개발되어 많이 사용되고 있는 트리아졸계의 이트라코나졸 및 알릴아민계의 테르비나핀은 피부사상균증에 대한 치료율이 90%이상이며 부작용 또한 적은 편이나 내성균주 등의 문제가 있다. 또한, 경구용 항진균제는 제한된 균종에만 유효하며, 조갑 백선의 경우 장기간 복용하여야 효능을 알 수 있으며, 장기 복용시에는 간기능 장애 및 내성등의 부작용이 생길 수 있다.

그러므로 주로 피부사상균증의 치료에는 거부감이 없고 사용이 편리한 연고형 또는 분무형의 개발이 필요한 실정이나 현재 개발되어 약물로 사용되고 있는 항진균제는 많지 않은 실정이다. 따라서, 새로운 항진균제의 요구는 앞으로 더욱 증가될 것으로 전망되며, 독성, 약효의 한계, 내성 등을 개선하기 위하여 기존 항진균제와 달리 천연항균제의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 폭넓은 항진균활성 및 항균활성을 갖는 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 보존제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 여성 비뇨기 감염 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 조갑 백선 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 항진균활성 및 항균활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 보존제를 제공하는 것을 목적 으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 여성 비뇨기 감염 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 조갑 백선 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물, 이의 배양액, 배양액의 농축액 또는 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 1종 이상 선택된 것을 활성성분으로 포함하는 생균활성제를 제공한다.

본 발명자들은 항진균활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스에 관하여 연구를 계속하던 중에서 메주로부터 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 넓은 범위의 항균활성을 가질 뿐만 아니라, 클라도스포리움 고시피콜라(Cladosporium gossypiicola)를 포함한 클라도스포리움 속 곰팡이 및 페니실리움 로커포르(Penicillium roqueforti)를 포함한 곰팡이와 칸디다 속(Candida sp.) 효모에 대한 항진균활성을 갖고, 장내부착성도 우수하여 생균활성제로 응용이 가능한 GRAS(generally regarded as safe) 미생물을 검출하고 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 그람양성균, 그람음성균, 진균(효모 및 곰팡이)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물 질 즉, 항세균 및 항진균 효력이 있는 물질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 배양물이란 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 상기 특정 미생물을 포함하거나 포함하지 아니할 수 있다. 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다.

본 발명에 있어서, 보존제란 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상에 사용될 수 있는 것으로, 세균, 곰팡이 및 효모로 이루어지는 군 중에서 선택된 1 종 이상의 위해 미생물 또는 부패미생물의 증식을 억제하거나 살균하여 식품, 사료 의약품을 보존하는 첨가물로서 부패미생물의 발육을 저지하거나 살균할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명은 항진균활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)에 관한 것이다.

상기 항진균활성을 갖는 바실러스 폴리포멘티쿠스는 클라도스포리움 고시피콜라(Cladosporium gossypiicola)를 포함한 클라도스포리움 속 곰팡이 및 페니실리움 로커포르(Penicillium roqueforti)를 포함한 곰팡이와 칸디다 속(Candida sp.) 효모에 대한 항진균활성을 갖는 바실러스 폴리포멘티쿠스일 수 있다.

상기 항진균활성을 갖는 바실러스 폴리포멘티쿠스는 바람직하게는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항균활성을 가지고, 클라도스포리움 고시피콜라(Cladosporium gossypiicola)를 포함한 클라도스포리움 속 곰팡이 및 페니실리움 로커포르(Penicillium roqueforti)를 포함한 곰팡이와 칸디다 속(Candida sp.) 효 모에 대한 항진균활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6(Bacillus polyfermenticus CJ6) 또는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항균활성을 가지고, 클라도스포리움 고시피콜라(Cladosporium gossypiicola)를 포함한 클라도스포리움 속 곰팡이 및 페니실리움 로커포르(Penicillium roqueforti)를 포함한 곰팡이와 칸디다 속(Candida sp.) 효모에 대한 항진균활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9 (Bacillus polyfermenticus CJ9)일 수 있다.

상기 그람 양성균은 바실러스 속 균주(Bacillus sp), 마이크로코커스 속 균주(Micrococcus sp), 스트렙토코커스 속 균주(Streptococcus sp) 및 리스테리아 속 균주(Listeria sp)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 바실러스 속 균주는 일 예로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)일 수 있고, 상기 마이크로코커스 속 균주는 일 예로 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus leteus)일 수 있으며, 상기 스트렙토코커스 속 균주는 일 예로 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)일 수 있고, 상기 리스테리아 속 균주는 일 예로 리스테리아 모노시아토게네스(Listeria monocytogenes)일 수 있다.

상기 그람 음성균은 에스케리키아 속 균주(Escherichia sp), 슈도모나스 속 균주(Pseudomonas sp) 및 살모넬라 속 균주(Salmonellas sp)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 에스케리키아 속 균주는 일 예로 대장균 (Escherichia coli)일 수 있고, 상기 슈도모나스 속 균주는 일 예로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)일 수 있으며, 상기 살모넬라 속 균주는 일 예로 장티푸스 병원균(Salmonellas enterica serovar Typhi)일 수 있다.

상기 곰팡이 균은 클라도스포리움 속(Cladosporium sp) 곰팡이, 푸른 곰팡이 속(Penicillium sp) 곰팡이 및 누룩곰팡이 속(Aspergillus sp) 곰팡이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 클라도스포리움 속 곰팡이는 일 예로 클라도스포리움 고시피콜라(Cladosporium gossypiicola)일 수 있으며, 상기 푸른 곰팡이 속 곰팡이는 일 예로 페니실리움 로커포르(Penicillium roqueforti)일 수 있고, 상기 누룩곰팡이 속 곰팡이는 일 예로 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 페트라키(Aspergillus petrakii), 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus) 또는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)일 수 있다.

상기 칸디다 속(Candida sp.) 효모는 일 예로 칸디다 알비칸스(Candida albicans)일 수 있다.

상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6(Bacillus polyfermenticus CJ6)은 대전광역시 유성구 과학로 111번지에 위치한 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 11월 6일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC 18149P를 부여받았다.

또한, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9(Bacillus polyfermenticus CJ9)는 대전광역시 유성구 과학로 111번지에 위치한 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 11월 25일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC 18151P를 부여받았다.

본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6는 메주로부터 분리한 포자를 형성하는 간균으로, 그람 양성이고, 항진균활성 및 넓은 범위의 항균활성을 가지는 단백질성 물질을 제조할 수 있는 것으로 확인되었고, 당 이용성 및 16S rDNA 염기서열 을 분석한 결과, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스로 동정되었다. 보다 구체적으로는, 상기 도 2a 및 서열번호 3에 기재된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6의 16S rDNA 염기서열을 이용하여 계통발생론적으로 분석한 결과, 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 EF178464와 99.9%의 상동성을 보여 바실러스 폴리퍼멘티쿠스로 동정되었다. 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6는 폭 넓은 진균 및 세균에 대한 항진균활성과 항균활성을 가지며, 구체적으로 클라도스포리움 고시피콜라(Cladosporium gossypiicola)에 대한 우수한 항진균활성을 가질 뿐만 아니라 페니실리움 로커포르(Penicillium roqueforti) 및 다양한 누룩곰팡이 속 곰팡이에 대해서도 항진균활성을 가지고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대해서도 항진균 활성을 가지며, 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스 서브틸리스와 리스테리아 모노시아토게네스에 대해 우수한 항균활성을 가지고, 그람 음성균인 대장균, 녹농균 및 장티푸스 병원균에 대해 항균활성을 가지는 것으로 나타났다.

또한, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6는 유당 첨가배지와 유당 무첨가배지에서 배양한 후 생육도와 배양배지의 pH를 조사하여 확인한 결과, 유당을 분해하여 대사에 이용할 수 있고, 그 과정에서 산을 생성하고, Galactose, L-Sorbose, Inositol, D-Raffinose, Amidon 및 β-Gentiobiose에 대한 당대사능이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6는 생육곡선상 2번의 대수기를 나타내는 특징이 있고, 2차 대수기에 이르러 항진균 물질의 생산이 최대값을 나타내며, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6이 생산하는 상기 항진균물질은 단백가수분해효소로 처리하는 경우 불활성화된 결과로부터, 단백질성 물질 또는 폴리펩타 이드임이 확인되었다. 상기 항진균물질은 pH 3 내지 pH 9에서 활성이 유지되어, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6는 산성영역에서부터 알칼리영역, 구체적으로 pH 3 내지 pH 9의 범위에서 항진균 활성을 유지할 수 있다. 또한, 상기 항진균활성의 경우, 고온의 열처리, 일 예로 70℃ 이상의 열처리에서 그 활성이 다소 감소하기는 하였으나, 121℃에서 15분간 열처리하였을 때도 역가가 완전히 소실되지 않는 것이 확인되어, 3차 이상의 복잡한 단백질 구조가 아닌 1,2차 구조만을 지니는 저분자성 단백질 물질로 예상되었으며, 내열성이 있는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6는 내산성 및 내담즙성이 우수한 것으로 확인되었다. 구체적으로, 상기 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6는 pH 2.0의 조건에 2시간 동안 노출시킨 경우에도, 초기 균수를 그대로 유지하여, 높은 산 저항성을 나타내는 것으로 확인되었고, pH 2.5의 인공위액에서 2시간 처리 후에도 초기 균수를 100% 그대로 유지하여, 매우 우수한 내산성 및 위액 저항성이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6는 oxgall이 함유된 인공담즙으로 실험한 결과, 0.5% oxgall이 함유된 인공답즙에서 24시간동안 처리한 후에도 초기 균수의 85%의 생존률을 나타내, 우수한 내담즙성이 있는 것으로 확인되었다. 상기 확인된 사실로부터 구강으로 상기 균주를 섭취하는 경우에도 위산 및 답즙액에서도 잘 생존하여 장까지 높은 생존율로 도달할 수 있으므로, 상기 균주는 위생균활성제로 유효하게 작용할 수 있을 것으로 예상되었다.

상기 항세균활성 및 항진균활성은 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6를 배양한 배양물 및 상기 균주를 제균한 제균 배양물에서도 유지되었다.

또한, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9는 메주로부터 분리한 포자를 형성하는 간균으로, 그람 양성이고, 항진균활성 및 넓은 범위의 항균활성을 가지는 단백질성 물질을 제조할 수 있는 것으로 확인되었고, 당 이용성 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스로 동정되었다. 보다 구체적으로는, 상기 도 2b 및 서열번호 4에 기재된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 16S rDNA 염기서열을 이용하여 계통발생론적으로 분석한 결과, 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 EF178464와 99.9%의 상동성을 보여 바실러스 폴리퍼멘티쿠스로 동정되었다. 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9는 폭 넓은 진균 및 세균에 대한 항진균활성과 항균활성을 가지며, 구체적으로 클라도스포리움 고시피콜라(Cladosporium gossypiicola)에 대한 우수한 항진균활성을 가질 뿐만 아니라 페니실리움 로커포르(Penicillium roqueforti), 아스퍼질러스 페트라키(Aspergillus petrakii) 및 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus)에 대해서도 항진균활성을 가지고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대해서도 항진균 활성을 가지며, 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스 서브틸리스와 리스테리아 모노시아토게네스에 대해 우수한 항균활성을 가지고, 그람 음성균인 대장균, 녹농균 및 장티푸스 병원균에 대해 항균활성을 가지는 것으로 나타났다.

또한, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9는 유당 첨가배지와 유당 무첨가배지에서 배양한 후 생육도와 배양배지의 pH를 조사하여 확인한 결과, 유당을 분해하여 대사에 이용할 수 있고, 그 과정에서 산을 생성하고, L-Arabinose, D-Xylose, Amygdaline, Arbutine, D-Raffinose, 및 Amidon 에 대한 당대사능이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9는 생육곡선상 2번의 대수기를 나타내는 특징이 있고, 2차 대수기에 이르러 항진균 물질의 생산이 최대값을 나타내며, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9가 생산하는 상기 항진균물질은 단백가수분해효소로 처리하는 경우 불활성화된 결과로부터, 단백질성 물질 또는 폴리펩타이드임이 확인되었고, 상기 항진균물질은 pH 3 내지 pH 9에서 활성이 유지되어, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9는 산성영역에서부터 알칼리영역, 구체적으로 pH 3 내지 pH 9의 범위에서 항진균 활성을 유지할 수 있다. 또한, 상기 항진균활성의 경우, 고온의 열처리, 일 예로 100℃에서 30분간 열처리 후에도 활성이 100% 유지되었고, 121℃에서 15분간 열처리하였을 때도 50%의 역가가 유지되어, 3차 이상의 복잡한 단백질 구조가 아닌 1,2차 구조만을 지니는 저분자성 단백질 물질로 예상되었으며, 내열성이 강한 것으로 확인되었다.

상기 항세균활성 및 항진균활성은 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9를 배양한 배양물 및 상기 균주를 제균한 제균 배양물에서도 유지되었다.

상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주를 제균한 제균 배양물은 항진균 활성 및 항세균 활성을 가질 뿐만 아니라, pH 및 열에 안정적이다. 상기 항진균활성은 일부 단백질분해효소에 의해 실활되는 반면, 121℃에서 15분간 열처리한 경우에도 완전히 실활되지 아니하여, 저분자성 단백질 항균물질에 의한 것으로 예상되었다.

또한, 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 균주, 이의 배양물, 배양물의 농축물 또는 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. 상기 균주는 항균활성의 측면에서는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6이 우수하고, 내열성의 측면에서는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9이 우수한 것으로 확인되었다.

본 발명의 항균 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 균주, 이의 배양물, 배양물의 농축물 또는 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유효성분을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 상기 항균 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다. 상기 균주는 항균활성 및 항진균활성이 강조되어야 하는 응용의 경우에는 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6일 수 있고, 고온처리가 되는 식품에 대한 보존제 등에 사용하기 하는 등 안전성이 강조되어야 하는 응용의 경우에는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9일 수 있다.

상기 항균 조성물은 병원성 미생물, 구체적으로는 칸디다 속 효모 및 곰팡이 등에 대한 항진균 활성 및 그람 양성균과 그람 음성균에 대한 항균 활성을 갖는 항균 조성물일 수 있고, 보다 상세하게는 클라도스포리움 속 곰팡이, 푸른 곰팡이 속 곰팡이 및 누룩곰팡이 속 곰팡이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 곰팡이에 대한 항진균활성, 칸디다 속 효모에 대한 항진균활성, 바실러스 속 균주, 마이크로코커스 속 균주, 스트렙토코커스 속 균주 및 리스테리아 속 균주로 이루어진 군에 서 선택된 1종 이상의 그람 양성균에 대한 항균활성 또는 에스케리키아 속 균주, 슈도모나스 속 균주 및 살모넬라 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 그람 음성균에 대한 항균활성을 갖는 항균 조성물일 수 있다.

상기 클라도스포리움 속 곰팡이는 일 예로 클라도스포리움 고시피콜라(Cladosporium gossypiicola)일 수 있고, 상기 푸른 곰팡이 속 곰팡이는 일 예로 페니실리움 로커포르(Penicillium roqueforti)일 수 있으며, 상기 누룩곰팡이 속 곰팡이는 일 예로 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 페트라키(Aspergillus petrakii), 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus) 또는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)일 수 있다. 또한, 상기 칸디다 속(Candida sp.) 효모는 일 예로 칸디다 알비칸스(Candida albicans)일 수 있다.

상기 바실러스 속 균주는 일 예로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)일 수 있고, 상기 마이크로코커스 속 균주는 일 예로 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus leteus)일 수 있으며, 상기 스트렙토코커스 속 균주는 일 예로 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)일 수 있고, 상기 리스테리아 속 균주는 일 예로 리스테리아 모노시아토게네스(Listeria monocytogenes)일 수 있다. 또한, 상기 에스케리키아 속 균주는 일 예로 대장균 (Escherichia coli)일 수 있고, 상기 슈도모나스 속 균주는 일 예로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)일 수 있으며, 상기 살모넬라 속 균주는 일 예로 장티푸스 병원균(Salmonellas enterica serovar Typhi)일 수 있다.

상기 칸디다 속 균주는 진균류의 한 속으로 사상균과 효모의 중간형태로 사람이나 동물에 기생하여 질병을 일으키는 병원균에 속한다. 상기 칸디다 속 균주는 칸디다증, 질칸디다증, 조갑백선 및 폐칸디다증의 원인인 것으로 보고 되어 있다. 상기 칸디다 속 균주에 의해 발병되는 질병은 90% 이상이 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 유발되는 것으로 보고 되어 있다.

본 발명의 항균 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용되어 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 곡류를 포함한 식품, 화장품 또는 의약에 적용되어 그람 양성균, 효모 또는 곰팡이에 의한 제품의 부패를 억제하거나 예방할 수 있다.

상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배성 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 바람직하게는 꿩 또는 닭 등의 가금류를 포함하는 조류 또는 인간, 돼지, 소 염소 등의 포유류일 수 있다.

본 발명의 항균 조성물은 상기 유효성분 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다.

상기 당질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아 제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.　 상기 비타민류는 특별한 제한은 없으며, 상기 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 보존제 조성물에 관한 것이다.

상기 보존제 조성물은 세균, 곰팡이 및 효모 등의 위해 미생물 또는 부패 미생물의 증식을 억제하거나 살균하여, 위해 미생물 또는 부패 미생물에 의해 감염되거나 부패될 수 있는 보존대상의 변질, 산패 또는 부패를 방지하고 보존대상의 상 태를 유지하기 위하여 사용되는 물질을 의미하며, 바람직하게는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상에 사용될 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 식품은 통조림식품 등을 포함하는 식품가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 건강보조식품, 조미식품, 제빵 및 제과류, 유제품을 포함하는 유가공품, 절임식품, 발효유 및 발효알콜음료를 포함하는 발효식품 또는 음료 등을 포함하며, 상기 사료는 일 예로 가축 사료일 수 있고, 그 용도에 제한되지 아니하고, 고체 또는 액체일 수 있다.

본 발명의 상기 항균 조성물을 포함하는 보존제 조성물은 상기 항균 조성물을 포함하는 것을 제외하고는 보존제에 포함되는 통상의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 보존제 조성물은 전체 조성물 100 중량부에 대하여 상기 항균 조성물을 0.1 내지 50 중량부 또는 0.5 내지 10 중량부 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 보존제 조성물은 항균 및 항진균활성으로 인한 보존제가 사용되는 식품 또는 사료 등의 저장성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 열처리량 감소에 의한 영양적가치, 조직감 및 맛을 향상시킬 수 있는 효과가 있다 또한, 상기 보존제 조성물은 Listeria 속 균, 저온성균, 기타 병원성균, 식품오염 공팜이, 피부질환의 원인이 되는 곰팡이 및 부패의 원인이 되는 미생물 등의 제어가 요구되는 다양한 용도에 응용될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 보존제 조성물은 천연보존제란 특징이 있으나, 본 발명의 효과를 제한하지 않는 범위 내에서 종래의 합성 보존제 또는 유기산 혼합물을 함께 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 감염되어 발병되는 질병에 관한 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 칸디다 알비칸스에 감염되어 발병되는 질병은 주로 여성 비뇨기 감염 또는 조갑 백선일 수 있고, 구체적으로 칸디다증, 조갑백선 또는 폐칸디다증일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 여성 비뇨기 감염 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 조갑 백선 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

상기 칸디다증은 칸디다균의 감염으로 발생하는 염증으로, 피부 각층, 각막, 구강 점막 따위에 옮는 표재성과 피부 심지, 기관지, 폐, 소화기 따위의 내장에 옮는 심재성이 있다. 상기 질칸디다증은 여성의 질에 칸디다가 침범하여 일으키는 질의 질환으로, 외음부에 심한 가려움을 느끼며 질구와 그 둘레, 대음순 및 소음순에 흰 막이나 알갱이 꼴의 것이 붙어 있는 증상을 일으키기도 한다.

상기 폐칸디다증은 상기 칸디다균, 특히 칸디다 알비칸스에 의한 폐 질환, 기침, 가래, 혈담, 미열, 빈혈 및 체중감소 따위가 나타나며 만성 폐결핵과 비슷한 증상을 보이는 질병이다.

상기 여성 비뇨기 감염은 질염을 일으키는 비뇨기 감염원인세균(genitourinary pathogen)들의 감염에 인한 질병으로, 주로 칸디다 알비칸 스(Candida albicans), 황색포도산구균(Staphylococcus aureus), 대장균(E coli) 등에 의해 여성의 비뇨기가 감염되어 발생되고, 주로 요로감염에서부터 시작되며, 바람직하게는 칸디다성 질염일 수 있다.

상기 칸디다성 질염은 여성 비뇨기 감염 중 가장 많이 나타나는 질염으로서 대부분의 여성이 일생동안 한번 이상 경험하는 질염이며, 임산부 중 약 1/3이 이 질염에 감염되어 있는 주요 산부인과 질환 중의 하나이다. 대하와 국소소양증이 주된 증상이며 작열감(burning sensation), 성교통, 부종, 외음부통증 등이 있고 임상소견으로는 외음부 및 질의 홍반, 울혈, 표피박리, 소포, 농포 등의 증상이 있다. 상기 칸디다성 질염에 관한 기존 치료제로는 케토코나졸(ketoconazole)과 마이코스타틴(mycostatin)의 병합 치료가 보고된 바 있으며, 근래에 와서는 이미다졸(imidazole) 제제로서 마이코나졸나이트레이트(myconazole nitrate)와 클로트리마졸(clotrimazole)을 사용할 수 있는 것으로 보고 되어 있다.

상기 조갑백선은 칸디다균이 손톱이나 발톱에 침입하여 손톱이나 발톱을 거칠고 더럽게 만들며 때로 흰색의 점이 생기는 증상을 수반하는 질병으로 손발톱 무좀이라고 한다. 상기 조갑백선 중 발톱 무좀의 경우, 피부사상균이 원인균이나, 조갑백선 중 손톱 무좀의 경우에는 주로 칸디다 균(Candida sp) 속의 진균이 원인균이다. 상기 칸디다균에 의한 손톱 무좀의 경우, 전염성이 강하고 영양원으로 케라틴을 이용한다는 점에서 여러 병원성 진균과 구별되는 특성을 가지며, 원인균과 침투경로가 다양하며, 육안으로 그 원인을 파악하는 것이 불가능한 특성이 있다.

본 발명의 항균 조성물은 칸디다 속 효모에 대한 항진균 활성을 가지고 있으 므로, 상기 항균 조성물은 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 및 예방 효과를 갖는다.

본 발명의 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유류일 수 있다. 구체적으로는 상기 포유류는 인간, 돼지, 소 또는 염소 등일 수 있다.

상기 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물은 상기 항균 조성물을 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아키시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광 물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 항균 조성물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

상기 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 항균 조성물을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함될 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 항균 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.

또한, 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 보존제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 그 제형으로는 주로 비경구, 예컨데 국부적으로 감염된 부위에 도말하여 적용될 수 있다.

구체적으로 비경구투여를 위한 형태로는 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제 등을 들 수 있다. 상기 국소 투여제의 제형의 일예로는, 유효성분인 항균 조성물 또는 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물을 천연 섬유 또는 합성 섬유로 만든 거즈 등의 담체에 함침시킨 것일 수 있다.

상기 크림 또는 연고의 경우, 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선의 환부나 그 주위에 직접 도포하는데 적합할 수 있다. 상기 분무제의 경우, 유효성분으로 항균 조성물을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 분무제 제조방법으로 제조될 수 있고, 압축용기나 기타 분무용기에 충전포장하여 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선 부위에 수시로 분무도포하여 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선을 치료 또는 예방할 수 있다. 상기 드레싱 용액의 경우, 유효성분으로 항균 조성물을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 드레싱 용액의 제조방법으로 제조될 수 있고, 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선 부위에 드레싱이나 기타 세균 감염부위의 드레싱에 사용하여 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선을 치료 또는 예방할 수 있다.

또한, 본 발명의 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 더 나아가 본 발명의 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물의 투여량은, 제제화 방법, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도, 투여 경로와 반응 감응성 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일예로, 본 발명의 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물은 항균 조성물을 기준으로 할 때, 0.0001 mg/kg 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물은 항균조성물 이외에 공지의 여성 비뇨기 감염 또는 조갑백선 치료 또는 예방효과를 갖거나, 칸디다 알비칸스 또는 황색포도상구균의 항균활성 또는 억제활성을 갖는 화합물이나 천연물 또는 천연물의 추출물 등을 더욱 포함할 수 있으며, 상기 더욱 포함되는 성분은 항균조성물 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 20 중량부로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된 것을 활성성분으로 포함하는 생균활성제를 제공한다.

본 발명에서, 생균활성제란 사람과 가축의 장내 미생물 균총의 개선으로 건강에 유익한 효능을 갖는 생균제재를 의미한다. 일반적으로, 생균활성제로 기능하기 위한 미생물은 장내 생존력이 좋아 섭취 후 일정기간 그 활성이 유지되어야 하고, 많은 종류의 유해균의 경우 그 증식 속도가 빠르므로, 섭취된 생균의 활성 속도도 빠를 것을 요구된다. 본 발명에서, 배양배지란 동물세포나 식물세포 또는 세균 따위를 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체 또는 액체를 의미하며, 배양 액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 또한, 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다.

상기 생균활성제는 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천영 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 상기 생균활성제에는 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 함량은 상기 생균활성제 총 중량을 기준으로 0 내지 20 중량%의 범위에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 이러한 생균활성제가 포함된 식품 또는 식품조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 이러한 생균활성제가 포함된 의약품 또는 의약조성물을 제공한다.

본 발명에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 일 예로 발효식품 또는 기능성 식품일 수 있다. 본 발명의 식품은 지시된 비율로 필수성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제안이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 생 균활성제는 상기 식품의 제조시 원료물질에 첨가되거나 조리된 식품에 적절히 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제와 함께 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 등에 첨가되는 상기 생균활성제의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량%일 수 있고, 음료의 경우 100 ml를 기준으로 0.02 내지 20g의 비율로 가할 수 있으며, 상기 생균활성제에 포함된 균체의 양을 기준으로 할 때, 전체 식품 중량을 기준으로 10kg 당 1 x 10⁶개(1 x 10⁶ cfu) 내지 5 x 10⁷개(5 x 10⁷ cfu)일 수 있다.

본 발명에서 발효식품이란 유산균이나 효모 등 미생물을 한가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품의 일 예로는 주류, 빵류, 김치, 젖갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등일 수 있고, 비살균 개방형 발효식품을 포함할 수 있다. 상기 생균활성제는 상기 발효식품에 유효성분으로 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 발효식품용 종균으로 사용될 수 있다. 상기 발효식품용 종균은 바람직하게는 김치의 종균일 수 있다. 이 때, 종균의 사용량은 발효식품의 종류 및 종균의 종류에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 일 예로 식품 주재료 전체 중량을 기준으로 0.0001 중량% 내지 0.01중량%(습윤 중량) 접종할 수 있다.

본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고, 주류, 청량음료, 물, 시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되고, 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료는 유산균을 배양하여 유산발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

본 발명에서 의약품이란 각각 통상의 방법에 따라 제형화하여 상용될 수 있으며, 의약품의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 생균제제를 포함하는 의약품에 통상적으로 포함되는 부가성분을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 생균활성제의 약학적 투여 형태와 관련하여 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 생균활성제의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 의약품에도 역시 필요에 따라 다양한 보조 생약제, 비타민, 미네랄, 식이섬유 및 기타 의약용이나 식품용 보조제(예컨 데, 부형제, 증강제, 코팅제 등) 등이 함유될 수 있을 것이다.

상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9는 보편적으로 인체에 안전한 것으로 인정되는 GRAS 미생물에 해당되고, 상기 균주 자체 및 상기 균주를 배양한 배양물에서 상기 균주를 제균한 배양물에서도 그람 양성균에 대한 폭 넓은 항세균활성 및 및 칸디다 속 효모와 곰팡이에 대한 폭 넓은 항진균활성이 확인되었므로, 상기 균주, 상기 항균 조성물 및 상기 생균활성제는 천연식품보존제, 사료보존제, 의약 조성물 및 식품 조성물 등 다양한 산업분야에 이용될 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9는 다양한 곰팡이와 칸디다 속 효모에 대한 폭 넓은 항진균활성과 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 폭 넓은 항세균활성을 갖고, 사기 항균 및 항진균활성은 폭 넓은 pH 범위에서도 활성이 유지되며, 상기 항진균활성은 단백질 분해효소의 처리에 의해 실활되므로 내성과 관련된 안전성도 보장되고, 상기 균주들은 보편적으로 인체에 안전한 것으로 인정되는 GRAS(generally regarded as safe) 미생물에 해당되므로, 항균 조성물 및 천연식품보존제, 사료보존제, 의약 조성물 및 식품 조성물 등 다양한 산업분야에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 특히 상기 폴리퍼멘티쿠스 CJ6은 내산성 및 내담즙성이 우수하여 생균활성제(probiotics)로 이용할 수 있으므로, 그 산업적 이용가치가 매우 크다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 항균활성을 가진 균주의 분리 및 동정

1-1. 항균활성을 가진 균주의 분리

메주가루를 멸균수에 희석한 시료를 LB, PDA 및 MEA 평판배지(Difco Laboratories, U.S.A.)에 도말하여 배지에 도말하여 25℃에서 5일 동안 평판배양하면서 집락을 형성하는 균주를 관찰하였다.

상기 평판배지에서 5일간 배양한 후, 형성되는 미생물의 집락을 관찰한 결과, 다양한 종류의 세균(352종)과 곰팡이(10종)들이 동일한 배지 내에서 관찰되었으며, 이 중 동시에 형성된 세균 및 곰팡이 집락 들에 대해 생육저해 활성을 나타내는 균주 18종을 1차 선별하였고, 2차로 감수성 곰팡이 7종에 대한 항진균 활성의 범위 및 정도를 확인하여 표 1에 나타내었다.

[표 1]

상기 표 1의 '-' 또는 '+'는 생균 저해환의 지름크기를 기준으로 결정한 것으로, '-'는 항균 또는 항진균활성이 없는 것을 의미하고, '+'는 저해환 지름 크기 가 14.05mm 이하인 것을 의미하며, '++'는 저해환 지름 크기가 14.05 내지 17.05mm인 것을 의미하고, '+++'는 저해환 지름 크기가 17.05mm 이상인 것을 의미한다. 상기 표 1에 나타난 결과 등을 근거로, 최종적으로 2종의 균주를 선별하여 분리하고, 각각 4-6 및 4-9라 명명하였다.

1-2. 항균활성을 가진 균주의 동정

상기 곰팡이에 대해 생육 저해 활성을 나타내는 분리균주의 동정을 위하여, 일차적으로 형태학적, 생화학적 조사를 수행하였고, 최종적인 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.

상기 형태학적 조사는 그람 염색 여부와 현미경을 이용하여 균의 형태 및 포자형성 과정을 관찰하였으며, 생화학적 조사는 API 50 CHB system(BioMerieux, Marcy IEtoile, France)을 이용하여 당 발효능을 조사한 후에 균주동정 프로그램(http://apiweb.biomerieux.com)을 이용하여 수행하였다.

상기 곰팡이에 대해 생육 저해 활성을 나타내는 분리균주의 그람 염색 결과 그람 양성의 간균이었고, 위상차 현미경을 이용하여 관찰한 결과 포자를 형성하는 것으로 확인되었다. 또한, API 50CHB system을 이용하여 당 이용성 조사 결과를 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

[표 2]

상기 표 2의 '-' 또는 '+'는 당대사능 또는 당이용능을 기준으로 결정한 것으로, 상기 4-6 균주 및 4-9 균주를 37℃에서 48시간 동안 배양한 결과 각 당에 대한 당대사능이 없는 경우 '-'로 표시하고, 당대사능이 있는 경우, '+'로 표시하였다. 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 또한, 상기 4-6 균주 및 상기 4-9 균주는 바 실러스 서브틸리스와 달리 모두 유당에 대한 당대사능이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 4-6 균주는 Galactose, L-Sorbose, Inositol, D-Raffinose, Amidon 및 β-Gentiobiose에 대한 당대사능이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 4-6 균주는 L-Arabinose, D-Xylose, Amygdaline, Arbutine, D-Raffinose, 및 Amidon 에 대한 당대사능이 있는 것으로 확인되었다. 상기 결과를 종합한 결과, API 50CHB system에 의하면 상기 4-6 균주 및 4-9 균주는 각각 바실러스 서브틸리스와 86.1% 및 87%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.

상기 4-6 균주 및 4-9 균주의 당대사능 중, 바실러스 서브틸리스와 구분되는 유당분해능에 대한 추가적인 확인을 위하여, 상기 균주들에 대한 유당 분해능을 확인하였다.

상기 유당 분해능의 확인은 상기 균주 및 B. subtilis ATCC 6633 균주를 tryptic soy broth(TSB, Difco Laboratories, U.S.A.) 5 ml에 접종하여 37℃에서 12시간 전배양한 후 전배양액을 유당이 0%, 1%, 2% 각각 첨가된 50 ml TSB 액체 배지에 1% 접종하여 37℃에서 48시간 동안 진탕배양 후 12시간 간격으로 pH(pH meter, Pinnacle 545-475772, Corning, U.S.A.)와 600 nm(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에서 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 측정 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 유당 첨가배지와 유당 무첨가배지에서 배양한 후 생육도와 배양배지의 pH를 조사하여 확인한 결과, 바실러스 서브틸리스의 경우 유당 첨가 여부와 관계없이 생육도와 배양배지의 pH에 변화가 없었던 것에 반하여, 상기 4-6 균주(1.10~3.96(A₆₀₀)) 및 4-9 균주(0.55~2.37(A₆₀₀))는 모두 유당을 첨가한 TSB 배지에서 유당을 첨가하지 않은 TSB 배지에서 보다 더 높은 생육도를 나타내었고, 상기 4-6 균주 및 4-9 균주 모두 유당 첨가 TSB 배지에서 약 pH 1.0 정도 더 감소하였다. 상기 결과로부터 상기 4-6 균주 및 4-9 균주는 모두 유당을 분해하여 대사에 이용하고, 산을 생성함을 알 수 있었다. 상기 결과는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스가 바실러스 서브틸리스와 구분되는 가장 큰 특징으로 보고된 것인 유당을 분해하는 능력이 있고 포도당과 유당에서 초산과 젖산을 더욱 많이 생산한다는 점과 일치하는 결과이다.

보다 정확한 동정을 위하여, 상기 분리균주의 16S rDNA 염기서열을 결정하 고, 이를 GenBank에 등록된 다른 균주들의 염기서열과 비교하여 16S rDNA 염기서열 분석을 수행하였다.

상기 분리균주의 16S rRNA의 염기서열은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 분리균주의 chromosomal DNA를 Genomic DNA purification kit(Q-Biogene, U.S.A.)를 이용하여 분리한 후에, 바실러스 속 특이적인 프라이머인 서열번호 1의 Ba4-F(5'-AGCTTGCTCCCTGATGTTAG-3')와 서열번호 2의 4-subR-R(5'-TCGAAGAATCGAATG ATCCT-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 전변성단계(pre-denaturation)를 수행하고 95℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 1분 30초의 과정을 30회 반복한 후, 72℃ 10분간 후연장단계(post-elongation)의 방법으로 수행하였다. 상기 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T easy vector(Promega Co., USA)에 클로닝(cloning)한 후, ABI PRISM 3730 DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.)를 이용하여 각각 1520bp의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 도 2와 서열번호 3 및 서열번호 4에 나타내었다. 상기 결정된 염기서열을 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank에 ribosomal RNA gene sequence로 등록된 염기서열과 비교하였으며, 염기서열간의 상동성은 Clustal X program을 이용하여 비교분석하였다. 상기 비교분석한 결과를 바탕으로, 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 도 3에 나타내었다.

상기 분석결과, 상기 분리균주 4-6 균주 및 4-9 균주의 16S rRNA는 총 1,520 bp를 가지고 있고, 그 염기서열은 상기 도 2와 서열번호 3 및 서열번호 4와 같이 결정되었고, 서로 간에 약 99.9%의 상동성을 나타내었으며, GenBank에 등록된 다른 균주들의 염기서열과 비교한 결과, B. polyfermenticus EF178464와 99.9%의 상동성을 보였다. 따라서 상기 균주들은 최종 바실러스 폴리퍼멘티쿠스로 동정되었으며, 상기 4-6 균주는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6으로 명명하였고, 상기 4-9 균주는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9로 명명하였다.

< 실시예 2> 분리균주의 항균활성

2-1. 조항균 물질의 준비

분리균주의 항균활성을 확인하기 위하여, 조항균 물질을 준비하였다.

구체적으로, 상기 분리균주 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9를 tryptic soy broth(TSB, Difco Laboratories, U.S.A.) 5 ml에 접종하여 37℃에서 12시간 전배양한 후, 상기 전배양액을 50 ml TSB 액체 배지에 1% 접종하여 37℃에서 30시간 동안 본배양하였다. 상기 본 배양액을 9,500xg 및 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상징액을 0.2 ㎛ membrane filter(Advantec MFS, Inc., Japan)로 제균하였다. 상기 제균과정 후, 수득한 배양상징액을 조항균물질로 사용하거나 또는 동결건조(Labconco Co., USA)후 3차 증류수로 녹여 5배, 10배, 20배 농축하여 사용하였다. 상기 조항균물질의 항균활성의 측정은 diamatic caliper(CD-15CPX, Mitutoyo, Japan)를 사용하여 생육저해환의 지름을 측정하는 방법으로 수행하였다.

2-2. 분리균주의 항균활성

바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 항균 활성은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균, 구체적으로 그람 양성균과 그람 음성균을 포함한 세균 10종, 곰팡이 7종 및 효모 3종을 대상으로 Direct method 법과 Paper disk법으로 조사하였다.

상기 세균 및 진균은 ATCC 균주의 경우, American Type Culture Collection(ATCC, U.S.A.)로부터 구입하였고, Bacillus subtilis DJⅠ, Bacillus subtilis cxⅠ, Aspergillus petrakii PF-1, Aspergillus ochraceus PF-2, Aspergillus nidulans PF-3, Cladosporium gossypiicola KF-2는 본 실험실에서 된장(DJⅠ), 토양(cxⅠ), 메주(PF-1,2,3) 그리고 김치(KF-2)로부터 분리하여 동정한 균주를 사용하였다. 또한, 항균 활성 측정을 위한 감수성 세균은 LB 또는 brain heart infusion(BHI, Difco Laboratories, U.S.A.) 평판배지, 감수성 곰팡이는 MEA 또는 PDA 평판배지, 감수성 효모는 YM(Difco Laboratories) 또는 sabouraud dextrose (Difco Laboratories) 평판배지에 1 × 10⁶ cfu/ml로 도말하였다.

상기 Direct method 법은 5 ml TSB 액체배지에서 12시간 전 배양된 분리균주 6 μl를 감수성 균주가 도말된 평판배지 위에 micropipette을 사용하여 3 cm 길이로 직접 그어 주는 방법으로 수행하였다. 또한, 상기 Paper disk 법은 감수성 균주가 도말된 평판배지 위에 8 mm 직경의 paper disk(ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 놓고 조항균 물질을 100 μl씩 일정하게 가하는 방법으로 수행하였다. 상기 Direct method 법과 상기 Paper disk 법에 의한 항균 및 항진균 활성의 측정은 항세균 실험의 경우, 37℃에서 12시간 동안 배양하고, 항진균 실험(효모와 곰팡이)의 경우 25℃ 또는 30℃에서 24시간 내지 72시간 동안 배양하여 분리균주가 생산하는 항균물질에 의한 감수성 균주의 생육저지환 생성 여부를 관찰하는 방법으로 수행하였다.

상기 Direct method 법을 수행한 결과를 도 1에 나타내었다.

상기 도 1에서 확인된 바와 같이, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9는 곰팡이, 세균 및 효모에 대하여 넓은 활성 범위를 나타내었으며, 항진균 활성(효모, 곰팡이)이 항세균 활성보다 강하게 나타났다.

또한, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9의 배양상징액의 항균 활성을 paper disk 법을 이용하여 측정한 결과, 모두 그람양성균인 B. subtilis ATCC 6633 및 Listeria monocytogenes ATCC 19113에 대한 저해 활성을 나타내었고, Aspergillus ochraceus PF-2와 C. gossypiicola KF-2의 곰팡이에 대한 저해 활성도 나타내었다. 또한, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9의 배양상징액을 5배, 10배, 20배 농축하여 처리한 경우, 두 균주는 모두 그람양성균과 그람음성균을 모두 저해하였으며 Candida albicans strain에 속하는 효모들에 대해서도 저해활성을 나타내었다. 한편, 곰팡이에 대한 실험에서는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6는 Aspergillus flavus ATCC 22546을 제외한 Aspergillus fumigatus ATCC 96918, A. petrakii PF-1, A. ochraceus PF-2, Aspergillus nidulans PF-3, C. gossypiicola KF-2, Penicillium roqueforti ATCC 10110에 대한 생육 저해활성을 나타내었으나, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9는 A. petrakii PF-1, A. ochraceus PF-2, C. gossypiicola KF-2, P. roqueforti ATCC 10110에 대해서만 생육 저해활성을 나타내었다. 상기 실험결과에 따른 두 균주의 항균 활성의 스펙트럼(spectrum)을 비교한 결과, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6의 곰팡이에 대한 항진균 활성 범위가 더 넓고 항세균 및 항진균 물질의 저해활성이 더 강하게 나타났으며, 두 균주가 생산하는 항균 물질은 서로 다른 것으로 추정되었다.

항균 활성을 나타내는 바실러스 속 균주에 대한 많은 보고가 있는데 이는 주로 박테리오신과 같은 항세균 활성에 대한 보고로서, 항세균 활성과 항진균 활성이 동시에 나타나는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스는 아직 학계에 보고되지 아니하였으므로, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9는 기존에 연구되어 유일하게 항세균 활성이 있는 것으로 보고되어, 산업적으로 활용되고 있는 B. polyfermenticus SCD에 비하여 훨씬 폭넓은 항세균 활성 및 항진균 활성이 있는 신규한 균주이므로, 기존에 개발된 B. polyfermenticus SCD와 달리 항균 스펙트럼이 세균에 제한되지 않는 GRAS 균주란 점에서 그 산업적 의미가 매우 크다 할 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9는 기존 B. polyfermenticus SCD와 같이 정장용 생균제재(probiotics)로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 그 우수한 항진균 활성에 의해서 식품, 사료, 화장품 및 의약품에 적용 될 수 있는 보존제, 생균제재, 생균활성제 또는 천연항균제재와 새로운 항생제 대체 의약품으로 활용될 수 있는 새로운 소재의 개발이라는 점에서 그 산업적 응용의 폭이 매우 넓은 것으로 평가된다.

2-3. 생육시기에 따른 항진균활성

상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9의 생육시기에 따른 항균활성은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

구체적으로, 상기 생육시기에 따른 항균활성의 측정은 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9를 37℃에서 0 내지 120시간 동안 진탕배양하면서, 600 nm에서 흡광도를 측정(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, Sweden)하여 생육곡선을 그리고, 이 때 생육시기에 따른 항진균 활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 항진균 활성 측정은 spot-on-the lawn test 법을 사용하였고, 구체적으로 감수성 곰팡이인 Aspergillus petrakii PF-1의 포자를 PDA 배지 20 ml에 1 × 10⁶ cfu/ml로 첨가하여 petri dish에 부은 후에 굳으면 항진균 물질 10 μl를 배지 위에 spotting하여 30℃에서 48시간 배양한 후 활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 측정법에서 활성 역가는 항진균 물질을 순차적으로 2배씩 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역을 취하고, 이 값에 1 ml에 대해서 환산해주는 환산계수를 곱하여 AU/ml로 나타내었으며, 측정값은 3회의 반복실험을 한 후 평균값을 사용하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4a에 나타낸 바와 같이 생육곡선 측정 결과, 상기 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6는 배양 12시간에 1차 대수기 중반을 지나 24시간에 생육 정지기에 잠시 이르다가 다시 36시간에 2차 대수기에 접어들어 생육 60시간경최대 생육을 나타내었다(A₆₀₀: 7.63). 그 이후 사멸기에 접어들면서 세포 현탁도가 서서히 감소하여 A₆₀₀에서 6.16에 이른 후 아주 낮은 세포 현탁도 감소를 나타내었다. 또한, 항진균 활성은 배양 6시간부터 나타나기 시작하여 30시간 이후부터 최대 활성(3,200 AU/ml)을 나타내었으며, 자가분해에 의한 포자방출시기인 72시간 이후 급격히 활성이 감소(1,600 AU/ml)하였으나, 그 후 120시간까지 활성(1,600 AU/ml)이 유지되었다.

또한, 상기 도 4b에 나타낸 바와 같이, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9는 배양 6시간에 대수기 중반을 지나 12시간 이후에 정지기에 이르다가 30시간에 2차 대수기에 접어든 후 48시간경 사멸기에 도달하고 60시간 이후 세포현탁도가 서서히 떨어지는 현상을 나타내었다. 항진균 활성은 배양 6시간부터 나타나기 시작하여 24시간 이후부터 최대활성(1,600 AU/ml)을 나타내었으며, 사멸기 이후 60시간 이후에 급격히 활성이 감소(800 AU/ml)되었으나 그 이후 120시간까지 활성(800 AU/ml)이 유지되었다.

상기 결과에 의하면, 세균의 일반적인 생육곡선의 형태인 sigmoid 형태와 달리 두 균주의 생육곡선은 2단 생육곡선의 형태를 나타내었다. 또한, 항진균 물질의 최대 활성은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6의 항진균 물질이 3,200 AU/ml 로 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9의 항진균 물질의 1,600 AU/ml 보다 더 강한 것으로 확인되어, 상기 실시예의 결과와 일치하였다.

또한, B. polyfermenticus SCD는 TSB배지에서 배양하여 polyfermenticin SCD 를 생산 할 때 정지기(4시간) 이후 항균활성이 급격히 감소되는 반면, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9 균주는 생육곡선상 2번의 대수기를 나타내었고, 2차 대수기에 이르러 항진균 물질의 생산이 최대값을 나타내었으며 그 이후 지속적으로 항진균 활성 물질이 분비되는 장점이 있는 것이 확인되었다.

또한, 균이 사멸기에 도달하면서 세포 현탁도 감소 현상과 함께 항진균 활성이 감소되는 결과는 균이 사멸기에 이르러 포자형성과 함께 세포의 자가분해에 의해 세포 내 단백분해효소의 방출에 의한 작용으로, 상기 결과로부터 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9에 의해 생산된 항진균 물질은 세포 내 단백가수분해효소에 의해 분해되는 단백질성 물질임을 추정할 수 있다.

2-4. 항진균활성의 안정성

상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 및 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9의 항진균 활성의 온도, pH 및 각종 효소처리에 대한 안정성을 조사하였다.

구체적으로, 온도에 따른 안정성의 측정은 배양상징액을 25℃, 30℃, 37℃, 50℃, 70℃에서 24시간, 100℃에서 30분, 121℃에서 15분간 열처리한 후에, 항진균활성에 대한 잔존활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 또한, pH에 따른 안정성의 측정은 배양상징액을 5N NaOH 와 5N HCl을 사용하여 배양상징액의 pH를 pH 3.0 내지 pH 9.0으로 조정하여 4℃에서 4시간 동안 처리한 후, 항진균활성에 대한 잔존활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 또한, 각종 효소에 대한 안정성의 측정은 분리균주의 배양상징액에 proteinase K(EC 3.4.21.64, Sigma Co., U.S.A.)는 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA(pH 7.5)와 함께 처리하고, protease(type I, Sigma) 및 trypsin(EC 3.4.21.4, Sigma)은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)와 함께 처리하며, pepsin(EC 3.4.23.1, Sigma)은 10 mM citrate(pH 6.0)와 함께 처리하고, α-chymotrypsin(EC 3.4.21.1, type I-S, Sigma)은 10 mM phosphate(pH 7.0)와 함께 처리하며, lipase(EC 3.1.1.3, type VII, Sigma)는 50 mM Tris-HCl 및 10 mM CaCl₂(pH 7.0)와 함께 처리하고, α-amylase(EC 3.2.1.1, Type VIII, Sigma)는 50 mM sodium phosphate 및 10 mM NaCl(pH 7.0)와 함께 처리하며, 각 효소의 농도는 4 mg/ml의 농도로 처리한 후, 항진균활성에 대한 잔존활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 측정한 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4]

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6은 70℃ 이상의 열처리에서는 활성이 감소되는 결과(3,200→1,600 AU/ml)를 나타내었고, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9는 100℃에서 30분간 열처리 후에도 활성을 100% 유지하였으나 121℃에서 15분간 열처리하였을 때 활성이 감소(1,600→800 AU/ml)하였 다. 또한, 상기 균주 모두 121℃에서 15분간 열처리하였을 때 역가가 완전히 소실되지 않고 일부 남아있는 것(800 AU/ml)이 확인되어, 두 균주 모두 기본적으로 열에 대한 안정성이 우수하고, 특히 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9가 열에 대한 안정성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.

또한, pH 안정성 실험 결과, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9 균주의 항진균 활성은 pH 3.0 내지 9.0 구간에서 안정한 활성(6 : 3,200 AU/ml, 4-9 : 1,600 AU/ml)을 나타내어 2종의 분리균주의 항진균 활성을 나타내는 물질이 산성 pH 영역에서부터 알칼리 pH 영역에까지 넓은 영역에서 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다.

또한, 각종 효소에 대한 영향을 살펴본 결과, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9 균주의 항진균 물질은 pepsin, trypsin, α-amylase, lipase 처리에는 영향을 받지 않았으나, proteinase K(CJ 6 : 3,200→200 AU/ml, CJ 9 : 1,600→200 AU/ml), protease(CJ 6 : 3,200→0 AU/ml, CJ 9 : 1,600→0 AU/ml), α-chymotrypsin(CJ 6 : 3,200→0 AU/ml, CJ 9 : 1,600→0 AU/ml)등의 단백가수분해효소 처리로 불활성화 되어 역가를 상실하는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9가 생산하는 항진균 활성 물질은 단백질성 물질임을 확인할 수 있었고, 이와 같은 결과는 생육시기에 따른 항진균 활성 실험에서의 결과와 일치하는 결과로 해석되었다. 또한 단백질성 물질임에도 pH 3.0 내지 9.0 구간에서 안정한 활성을 보이고, 121℃에서 15분간 열처리한 후에도 항진균 활성이 완전히 소실되지 않는 결과로부 터, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9가 생산하는 항진균 활성 물질은 3차 이상의 복잡한 단백질 구조가 아닌 1, 2차 구조만를 지니는 저분자성 단백질 물질일 것으로 예상되었다.

기존에 보고된 바실러스 속 유래의 항진균 활성 물질은 열에 매우 안정하며 cyclic peptide의 구조를 가지거나 물질 구조내에 D형 아미노산을 가져 단백분해효소에도 영향을 받지 않는 물질이었다. 일 예로, B. licheniformis M-4가 생산하는 fungicin M4의 항진균 활성 물질은 cyclic peptide 구조를 가져서, proteinase K, trypsin, carboxypeptidase A 등의 단백분해 효소에 영향을 받지 않았고, B. subtilis가 생산하는 항진균 활성 물질인 bacillomycin D와 plipastatin B1은 구조내에 D형 아미노산을 가지므로 단백분해효소에 영향을 받지 않는 것으로 보고되었다. 그러나, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9가 생산하는 항진균 물질은 열에는 안정하나 일부 단백분해 효소에 실활되므로, 기존에 보고된 바실러스 속 유래의 항진 물질들과 서로 다른 구조를 가지는 신규한 단백질성 물질일 것으로 추정되었다.

2-5. 항진균물질의 정제

상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9 유래의 항균물질의 정제는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

보다 구체적으로, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9를 50 ml TSB 액체 배지에서 37℃의 조건으로 30시간 진탕배양 한 후, 9,500 ×g, 4℃의 조건으로 15분간 원심분리하여 회수한 상징액을 0.2 μm membrane filter로 제균하였다. 상기 제균된 상징액을 100% 메탄올과 3차 증류수로 미리 soaking된 소수성 column인 C₁₈ Sep-Pak cartridge(Waters Co., U.S.A.)에 흡착시킨 후, 3차 증류수로 수세하고 100% methanol로 용출하였다. 메탄올에 녹아있는 분획은 Speed Vac Concentrator(Centra-Vac VS-802, Vision, Korea)를 이용하여 용매를 제거한 후, 멸균수에 녹여 항진균 활성 측정 및 Tricine-SDS-PAGE에 사용하였다.

상기 C18 Sep-Pak column으로 부분 정제한 시료로부터 항진균 활성을 나타내는 것으로 확인된 물질의 분자량의 측정은 Tricine-SDS-PAGE법으로 수행하였다. 보다 구체적으로, 18% acrylamide gel과 표준 분자량 물질인 polypeptide SDS-PAGE standards(Bio-Rad, U.S.A.)를 사용하여, 전기영동하였고, 상기 전기영동 후, 코마시 블루(coomassie brilliant blue G, Sigma Co., U.S.A.)로 단백질을 염색하였다. 상기 코마시 블루에 의해 염색되어 단백질로 확인된 겔(Gel) 상의 물질 중에서 항균활성을 나타내는 물질의 band 확인은 direct detection 법으로 수행하였다. 보다 상세하게, 상기 전기영동한 겔을 25%(v/v) isopropanol과 10%(v/v) glacial acetic acid 용액에 담근 후, 상온에서 30분간 고정시키고 증류수로 1시간 30분 동안 세척하였다. 상기 세척한 겔은 염색된 겔상에서의 band와 비교하여, 주요 band 부위를 잘라 PDA 평판배지 위에 놓고 그 위에 PDA top agar (0.7%, w/v) 10 ml를 분주하여 굳힌 후에 배지 표면에 Cladosporium gossypiicola KF-2를 전면에 도말하였다. 상기 감수성 균주를 도말한 다음, 25℃에서 72시간 배양하고, 항진균 생육 저해환이 생성되는 band를 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 대조구로는 acrylamide gel을 direct detection 법에 사용된 band gel과 같은 크기로 잘라 동일한 세척 및 활성 측정법을 시행하여 acrylamide 성분에 의한 생육 저해 작용이 없음을 확인하였다.

바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9의 배양상징액을 C₁₈ Sep-Pak column에 흡착시킨 후, 100% 메탄올로 용출하여 얻은 분획에서만 강한 항진균 활성을 관찰하였다. 상기 결과로부터, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9가 생산하는 항진균 물질은 소수성 물질임을 알 수 있었다. 또한, 상기 도 5에 나타낸바와 같이, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9의 배양상징액을 각각 C₁₈ Sep-Pak column으로 부분 정제한 시료를 Tricine-SDS-PAGE로 단백질 분리를 하였을 때 두시료 모두 세 개의 주된 band를 나타내었다. 상기 세 개의 band를 잘라 각각 C. gossypiicola KF-2에 대한 항진 활성을 direct detection 법으로 측정한 결과를 나타낸 도 5b 및 도 5c에 따르면, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9 모두 분자량 3.3 kDa 부분의 band를 이용하여 측정한 경우에만 C. gossypiicola KF -2에 대한 항진균 활성을 나타내었고 다른 band 부분에서는 항진균 활성이 관찰되지 않는 것으로 확인되어, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9가 생산하는 항진균 물질의 분자량은 약 3.3 kD인 것으로 예상되었다.

상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9가 생산 하는 항진균 물질은 항진균 물질의 분자량에서 유사한 결과를 보였으나, 생육곡선, 열 안전성 및 효소에 대한 안정성, 항세균 및 항진균 물질의 활성범위와 저해활성에서 차이를 보여 두 균주가 생산하는 항진균 활성 물질은 서로 다른 물질임을 확인할 수 있었다.

기본에 보고된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 유래 항균물질은 B. polyfermenticus SCD에 의해 생산되고 polyfermenticin SCD라고 명명된 박테리오신이 유일하며, 상기 polyfermenticin SCD는 좁은 범위의 항세균 활성을 나타내었으며 항진균 활성은 나타내지 않는 것으로 보고되어 있으나, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9는 넓은 항세균 활성과 항진균 활성을 갖는 물질을 생산하며, 이러한 바실러스 폴리퍼멘티쿠스가 생산하는 항진균 물질은 지금까지 보고되지 않은 신규한 물질이다. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스가 GRAS 미생물이라는 점과 상기 물질이 천연물질이란 점에서, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9가 생산하는 항진균물질은 천연항생제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 식품가공의 이용에 있어서 저장성 향상뿐만 아니라 열처리량 감소에 의한 영양적가치, 조직감 및 맛의 향상을 유도할 수 있으므로, 통조림식품에서의 포자형성균(Bacillus 속)의 제어나 발효유, 발효알콜음료, 유제품 등 여러 가지 식품 및 사료에 천연보존제로의 응용도 가능할 것으로 예상된다. 또한, Listeria 속 균주, 저온성균, 고온성균, 병원성균, 식품오염 곰팡이, 피부질환 원인균 곰팡이 및 부패미생물의 제어와 관련된 용도에도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

< 실시예 3> 장내 생존성 및 부착성

3-1. 내산성 및 인공위액 저항성

구강을 통하여 섭취된 균이 최종 목적 부위인 장에 도달하기 위해서는 강산성의 위액을 통과하여 생존해야 한다. 따라서, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6과 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 9의 생균활성제의 응용여부를 확인하기 위하여, 장내 생존성을 확인하였다.

장내 생존성과 관련하여, 내산성 및 인공위액 저항성에 대한 실험은 다음과 같은 방법으로 수행하였다 보다 구체적으로, 분리균주의 내산성 시험은 1N HCl을 사용하여 pH 2.0과 2.5로 조정한 0.05M sodium phosphate 용액을 이용하여 수행하였고, 인공위액 저항성 시험은 체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액을 조제하여 실시하였다. 상기 인공위액의 조제는 Kobayashi등의 방법을 변형하여 1N HCl을 사용하여 pH 2.0과 2.5로 조정한 TSB 액체배지에 pepsin(Sigma Co., USA)을 1,000 unit/ml로 각각 첨가하는 방법으로 수행하였다. 상기 내산성 및 인공위액 저항성은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 균주를 TSB 액체배지에 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 72시간 배양하고, 13,000 ×g의 조건으로 원심분리를 10분간 수행하여 상징액을 제거하고 균체를 회수하였다. 상기 회수한 균체에 pH 2.0과 2.5의 0.05 M sodium phosphate 용액과 인공위액을 각각 상징액과 동량으로 첨가하여 37℃에서 내산성의 경우 2시간, 인공위액의 경우 2시간 및 4시간 배양하였다. 배양 후 생균수를 측정하여 내산성과 인공위액에 대한 저항성을 비교 하였다. 생균수는 적정비율로 희석하여 3번씩 측정하였으며, 측정값은 그 평균값을 사용하였다. 대조군으로는 위와 동일한 방법으로 균주를 배양한 후 원심분리하여 상징액을 제거하고 균제를 회수한 다음 TSB 액체배지를 상징액과 동량으로 처리하였다.

바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6의 단순 산성 pH에 대한 내성은 도 6a에 나타내었다. 상기 도 6a에 나타낸 바와 같이, pH 2.0과 2.5의 0.05 M sodium phosphate 조건에서 2시간이 지난 후에도 초기 균수를 그대로 유지하며(10⁸ CFU/ml) 높은 산 저항성을 나타내었다. 또한, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6의 인공위액에 대한 저항성은 도 6b에 나타내었다. 상기 도 6b에 나타낸 바와 같이, pH 2.0에서 2시간 처리 후 98%, 4시간 처리 후에는 96% 정도의 생존률을 나타내었다. 또한, pH 2.5의 인공위액에서 2시간 처리 후에는 초기 균수를 100% 그대로 유지하였다. 상기 결과로 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6은 산 저항성이 매우 뛰어나 낮은 pH의 위산에서도 잘 생존하여 장까지 높은 생존율로 도달할 수 있는 가능성을 제시하였다. 순수한 위액의 pH는 1.4 내지 2.0 정도로 거의 대부분 미생물은 여기에서 사멸하게 되지만 섭취한 음식물의 완충작용으로 인해 위의 pH가 높아진다는 것을 고려한다면, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6의 생존율은 더욱 높아질 것으로 고려된다.

3-2. 인공담즙 저항성

구강으로 섭취된 생균활성제에 포함되어 있는 미생물이 위를 거쳐 장에 도달하는 중에 췌장과 십이지장을 통과하게 되는데, 이 부위에서는 담즙액이 분비된다. 따라서, 구강으로 섭취된 미생물이 최종적으로 장내로 들어오기 위해서는 담즙액에 대한 내성을 갖추어야 한다. 따라서, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6의 생균활성제의 응용여부를 확인하기 위하여, 인공담즙 저항성을 확인하였다.

인공담증 저항성과 관련하여, 인공담즙에 대한 실험은 다음과 같은 방법으로 수행하였다 보다 구체적으로, 인공담즙은 TSB 액제배지에 0.45 ㎛ filter(Milipore Co., USA)로 여과 제균된 Oxgall(Sigma chemical Co., USA) 용액을 0.3% 및 0.5%가 되도록 첨가하여 제조하였다. 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6의 인공담즙에 대한 내성은 TSB 액체배지에서 배양한 배양액과 pH 2.0 과 2.5 조건의 인공위액에서 2시간 동안 배양한 배양액을 각각 13,000 ×g의 조건으로 10분간 원심분리하여 상징액을 제거하고 균체를 회수한 후, 인공담즙액을 상징액과 동량으로 첨가하여 37℃에서 24시간 배양한 후 생균수를 측정하는 방법으로 수행하였다. 생균수는 적정비율로 희석하여 3번씩 측정하였으며, 측정값은 그 평균값을 사용하였다. 대조군으로는 위와 동일한 방법으로 균주를 배양한 후 원심분리하여 상징액을 제거하고 균제를 회수한 다음 TSB 액체배지를 상징액과 동량으로 처리하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

Gilliland 등은 생균활성이 있는 생균이 가져야할 담즙액에 대한 내성은 oxgall이 0.3% 함유된 배지에서 성장할 수 있다고 보고한바 있으나, 실제로 probiotic 생균으로서의 기능을 정상적으로 수행하려면 장내 담즙의 농도(0.6 g/L) 보다 훨씬 많은 oxgall이 함유된 배지에서 성장할 수 있는 내성을 가져야 한다.

상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6의 배양액은 0.3%와 0.5% oxgall 함유 인공담즙에서 24시간동안 처리 후에도, 각각 초기 균수의 84%와 85%의 생존률을 나타내었고, pH 2.0의 인공위액에서 2시간동안 처리 후, 이를 다시 0.3%와 0.5% oxgall 함유 인공담즙에서 각각 24시간동안 처리한 경우에도 초기 균수의 약 84%의 생존률을 나타내었다. 또한, pH 2.5의 인공위액으로 2시간동안 처리 후 0.3% oxgall 함유 인공담즙에서 24시간동안 처리시에는 92%의 높은 생존률을 나타내었다. 위 결과로부터 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6의 생육은 pH 2.0과 2.5 조건의 인공위액에서는 거의 영향을 받지 않는 것을 알 수 있었으며, 인공담즙에 대한 저항성이 인공위액 저항성에 비해 다소 떨어짐을 알 수 있었다. 그러나, 인공위액과 인공담즙의 연쇄 처리 후에도 약 10⁷ CFU/ml의 생균수(85~92%의 생존율)를 유지함을 나타내어 목적부위인 장에 살아서 도달하여야 하는 생균제로서의 기능을 충분히 수행할 수 있을 것으로 기대되었다.

상기한 결과로부터, 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ 6 균주는 생균활성을 가지는 것으로 확인되어, 다양한 목적의 생균활성제로 응용될 수 있을 것으로 예상된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 항균활성을 나타낸 것으로, 도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 페니실리움 로커포르에 대한 항진균활성을 나타낸 사진이고, 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 칸디다 알비칸스에 대한 항진균활성을 나타낸 사진이며, 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 리스테리아 모노시아토게네스에 대한 항진균활성을 나타낸 사진이고, 각 도의 좌측은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6의 항균활성에 관한 것이고, 각 도의 우측은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 항균활성에 관한 것이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 16S rDNA의 염기서열을 나타낸 것으로, 도 2a는 본 발명의 일 실시예에 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6의 16S rDNA의 염기서열을 나타낸 도면이고, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9 의 16S rDNA의 염기서열을 나타낸 도면이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 16S rDNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 표이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 생육에 따른 항진균 활성을 나타낸 그래프로, 도 4a는 본 발명의 일 실시예에 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6의 생육에 따른 항진균 활성을 나 타낸 그래프이고, 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 생육에 따른 항진균 활성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 항진균물질을 분리한 결과 및 분리된 물질의 항진균활성을 확인한 것으로, 상기 도 5a는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 배양상징액으로부터 분리한 단백질 또는 단백질성 물질을 Tricine-SDS-PAGE로 분리한 사진으로, 두번째 라인이 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6의 항진균물질을 분리한 사진이고, 세번째 라인이 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 항진균물질을 분리한 사진이며, 도 5b는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6의 배양상징액으로부터 분리된 물질의 클라도스포리움 고시피콜라에 대한 항진균활성을 확인한 사진이고, 도 5c는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9의 배양상징액으로부터 분리된 물질의 클라도스포리움 고시피콜라에 대한 항진균활성을 확인한 사진으로, 각 사진에서 ①은 10 kDa 위치의 물질이고, ②는 5.5 kDa 위치의 물질이며, ③은 3.3 kDa 위치의 물질이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 내산성 및 인공위액 저항성을 확인한 그래프로, 상기 도 6a는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6의 내산성을 확인한 그래프이고, 도 6b는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6의 인공위액 저항성을 확인한 그래프이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 인공담즙 저항성과 내산성 및 인공담즙 저항성을 확인한 그래프로, 상기 도 7a는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6의 인공담즙 에 대한 저항성을 확인한 그래프이고, 도 7b는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6을 산처리 한 후의 인공담증에 대한 저항성을 확인한 그래프이다.

<110> CHANG HAE CHOON <120> BACILLUS POLYFERMENTICUS SEPARATED FROM MEJU AND A ANTIFUNGAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> KP200080248 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ba4-F <400> 1 agcttgctcc ctgatgttag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4subR-R <400> 2 tcgaagaatc gaatgatcct 20 <210> 3 <211> 1520 <212> DNA <213> B.polyfermenticus CJ6 <400> 3 agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa 60 gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg cttgtttgaa ccgcatggtt 120 cagacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt 180 tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc 240 acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc 300 aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa 360 gctctgttgt tagggaagaa caagtgccgt tcaaataggg cggcacattg acggtaccta 420 accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 480 tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc 540 ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag 600 tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg 660 cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag 720 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct 780 tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac 840 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 900 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt 960 cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1020 taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta 1080 aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1140 tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg 1200 ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg 1260 aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1320 gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt 1380 tatggagcca gccgccgaag gtgggacaga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc 1440 gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggat tttaacggaa tataagacct 1500 tgggtcttat aaacagaacg 1520 <210> 4 <211> 1520 <212> DNA <213> B.polyfermenticus CJ9 <400> 4 agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa 60 gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg cttgtttgaa ccgcatggtt 120 cagacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt 180 tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc 240 acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc 300 aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa 360 gctctgttgt tagggaagaa caagtgccgt tcaaataggg cggcacattg acggtaccta 420 accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 480 tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc 540 ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag 600 tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg 660 cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag 720 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct 780 tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac 840 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 900 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt 960 cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1020 taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta 1080 aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1140 tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg 1200 ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg 1260 aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1320 gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt 1380 tatggagcca gccgccgaag gtgggacaga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc 1440 gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggat tttaacggaa tataagacct 1500 tgggtcttat aaacagaacg 1520

Claims (8)

1. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스는 곰팡이 및 칸디다 속 효모에 대한 항진균활성 및 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항균활성을 가지며, 기탁번호 KCTC 18149P를 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ6 균주(Bacillus polyfermenticus CJ6 KCTC 18149P)인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스.
2. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스는 곰팡이 및 칸디다 속 효모에 대한 항진균활성 및 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항균활성을 가지며, 기탁번호 KCTC 18151P를 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 CJ9 균주(Bacillus polyfermenticus CJ9 KCTC 18151P)인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 곰팡이는 클라도스포리움 속 곰팡이, 푸른 곰팡이 속 곰팡이 및 누룩곰팡이 속 곰팡이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 칸디다 속 효모는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)이며, 상기 그람 양성균은 바실러스 속 균주, 마이크로코커스 속 균주, 스트렙토코커스 속 균주 및 리스테리아 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 그람 음성균은 에스케리키아 속 균주, 슈도모나스 속 균주 및 살모넬라 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스.
4. 제1항의 균주 및 제2항의 균주로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
5. 제4항의 항균 조성물을 포함하는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 보존제 조성물.
6. 제4항의 항균 조성물을 포함하는 여성 비뇨기 감염 또는 조갑 백선에 대한 치료 또는 예방용 조성물.
7. 제1항의 균주 및 제2항의 균주로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된 것을 활성성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics).
8. 제7항의 생균활성제를 포함하는 식품.

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