KR20100084528A - 호기 입자의 수집 및 측정 - Google Patents

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안나-카린 올린
안-샤롯테 암스트랜드
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안나-카린 올린
안-샤롯테 암스트랜드
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Abstract

동물의 호흡시에 입자들이 호기된다. 입자들의 성질 및 양은 일정한 의학적 상태의 징후이다. 그러므로 그것들을 수집하고, 크기 또는 질량에 따라 분류하고, 한가지 이상의 의학적 상태의 진단에 사용될 수 있다. 본 발명은 호기된 입자를 수집 및 분류하는 방법 및 시스템, 그리고 상기 호기된 입자를 사용하는 진단 방법을 제공한다.

Description

호기 입자의 수집 및 측정{COLLECTION AND MEASUREMENT OF EXHALED PARTICLES}
본 발명은 동물, 특히 포유동물, 바람직하게는 사람의 호흡시에 호기(呼氣)되는 입자에 관한 것이다. 입자의 성질 및 양은 어떠한 의학적 상태의 징후일 수 있다. 그러므로 그것들을 수집하고 크기 또는 질량에 따라 분류하고 한가지 이상의 의학적 상태의 진단에 사용할 수 있다.
사람의 기도는 하루에 적어도 7-8 입방미터의 공기와 직면하고 흡기된 입자 또는 기체를 해독하기 위한 진보된 생물학적 시스템이 있다. 흡기된 물질에 대한 첫번째 방어선은 특히 몇가지 중요한 항산화제 시스템을 함유하는 모든 기도를 덮고 있는 기도 내막액(Respiratory Tract Lining Fluid: RTLF)이다. RTLF의 또다른 중요한 성분은 표면장력을 감소시키고 또한 선천 면역에 관계하는 화합물을 함유하는 계면활성제이다.
RTLF의 조성은 기도의 염증상태를 변화시키는 것으로 나타났다. RTLF의 항산화제와 흡기된 산화제 간의 균형이 교란될 때, 산화성 스트레스가 염증과정을 개시할 것이다. 이 염증과정은 매우 가변적이지만 천식에서 폐암까지 대부분의 호흡기 질환의 발달에 공통적인 주된 초기 사건이다.
모든 호흡기 질환을 이끄는 병리생리학적 과정은 이제까지 충분히 이해되고 있지 않다. 이것에 숨은 한가지 이유는 이들 과정이 사람에게서 모니터링하기가 어렵다는 것이다. 예를 들어서 여러가지 노출의 효과를 평가하기 위해, 이용가능한 방법들은 폐기능의 측정, 호기된 산화질소(nitric oxide), 유발된 타액, 또는 기관지 폐포 세척액(broncho-alveolar lavage: BAL)의 분석 또는 기관지경 검사(bronchoscopy)로부터의 생검에 제한되었다.
이들 현존하는 방법들은 너무 침습적이며, 즉 기관지경 검사이고, 이로써 다른 노출에의 민감성이 크게 가변적이기 때문에 보증되는 더 큰 연구에서 적용가능하지 않다. 게다가, 기관지경 검사와 유발된 타액은 둘다 사전 존재하는 심폐질환 또는 천식을 갖는 집단에서와 같은 민감한 집단에서 특히 어떠한 위험과 연관되어 있다. 호기된 공기 중의 산화질소는 크게 단독으로 알러지 염증을 반영하는 것 같고 따라서 다른 형태의 기도 질환을 연구할 때 제한된 값이다. 반면에, 폐기능은 오히려 연구된 환자에게 무해하나 질환의 근본적인 메카니즘에 대한 정보를 주지 않는다.
사용된 다른 방법들은 시험관내 연구를 포함하는데, 이것은 사람의 기도의 복잡한 환경에 대한 단지 제한된 일반화만을 허용한다. 그것은 동물연구에 대해서도 크게 사실인데, 이때 사람과 유전적 일치가 클지라도 여러가지 유전자의 발현은 실질적으로 다르다.
최근에 새로운 방법인 이른바 호기 호흡 응축물(EBC), 즉 저온의 수단에 의해 응축되는 호기 수증기의 수집이 도입되었는데, 이때 휘발성 및 비휘발성 화합물이 둘다 확인되었다. EBC에서 발견된 비휘발성 물질은 기도 내에서 형성된 입자들로부터 기원하는 것으로 생각된다. 이들 입자는 숨을 쉬거나 말하거나 기침을 할 때 호흡계에서 발생되고 관찰되었고 이제까지 주로 이러한 입자들이 감염성 물질의 운반을 위한 비히클로서 역할을 할 수도 있기 때문에 연구되었다. 이들 입자들이 어떻게 형성되는지는 아직 알려져 있지 않지만, 그럴듯한 메카니즘은 기관지의 단면적이 실질적으로 감소되는 중심 기도에서 호기된 공기의 난류를 통해서 일 수 있다. 두번째 가설은 기도가 주변 폐에서 열릴 때 입자들이 RTLF로부터 형성된다는 것이다. 질환시, 입자의 형성은 증가된 난류 및/또는 RTLF의 변화된 물리적 성질로 인해 증가될 수도 있다. 이것의 예는 WO 02/082977에 주어져 있다.
호기 호흡 응축물(EBC)의 수집은 물로 희석과 같은 수많은 심각한 방법론적 어려움과 관련되어, 매우 낮은 농도의 관심있는 물질, 구강으로부터 기원되는 물질로의 높은 오염, 높은 개체내 계수 변동 및 EBC에서 발견된 비활성물질의 매우 비효율적인 샘플채취 방식을 가져온다.
이와 같이 호흡계의 불리한 건강상의 영향을 검출 및 모니터링하는 더 양호한 비침습적 방법에 대한 필요가 있다. 이제까지 조사되지 않은 EBC의 분석과 연관된 어떤 방법론적 어려움을 극복하는 한가지 방법은 호기된 입자들을 직접 샘플채취 및 분석하는 것이 될 것이다. 수집된 입자의 양 및 크기를 결정하는 능력은 또한 기도의 상태에 대한 구체적인 정보를 제공할 것이다.
다른 크기의 입자 부분들의 분포의 측정
호기된 점적들(즉 입자)를 조사하는 공개된 단지 몇가지 연구가 있다.
파피네니와 로센탈[Papineni and Rosenthal, J Aerosol Med 10(2):105-16] 그리고 에드워드 등[Edwards et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101 (50): 17383-8]은 사람에서 수많은 농도들의 호기된 입자를 측정하고 그것이 대상자들 간에 상당히 다양하였으나 농도들은 일반적으로 전형적인 실내 공기에서 측정된 것 보다 훨씬 더 낮았다고 기술하였다. 호기된 입자의 크기 분포에 관한 어떤 정보도 또한 제공되었다. 점적들의 주 구성요소는 물이고 따라서 입자 크기는 주위 공기의 상대 습도(RH)가 변함에 따라 빠르게 변해야 한다고 가정되어야 한다. 파피네니와 로센탈에 의해 사용된 RH의 영향을 조사하는 과정들은 공기를 가열하여 RH를 변화시키기 위해 IR-램프가 사용되었기 때문에 믿을만 하지 않다. 에드워드 등은 그들의 조사에서 RH를 심각하게 고려하지 않았다. 입도는 간접 방법, 예를 들어서 건조된 점적들의 현미경검사에 의하거나 아니면 낮은 크기 분해능을 갖는 빛 산란법에 의해 끌어내었다. 따라서, 이러한 사태는 호기된 에어로졸의 농도 및 크기 분포에 있어서 가변성의 조사를 또한 보증한다.
또한 최근에 그것들의 감염 잠재성을 검출하기 위한 잠재성의 범위에서 주로 사람 에어로졸 형성에 대해 증가하는 관심이 있었다. US 2005/0073683 및 Anal. Chem. 2005, 77, 4734-4741는 사전형성된 에어로졸 입자를 확인하는 실시간 검출 방법 및 시스템을 기술한다. 기술된 방법은 전염성 물질 또는 "위협 물질(threat agents)"을 함유하는 에어로졸을 그것의 포지티브 및 네거티브 질량 스펙트럼을 또한 발달하게 될 기준 스펙트럼과 비교함으로써 온라인 검출하는 것을 목적으로 하고 있다. 그 방법은 사람 기도 상태를 진단 또는 모니터링하도록 개발되어 있지 않고 현저히 덜 민감하여 이것은 호기된 입자에서와 같은 매우 낮은 농도의 물질의 검출을 방해한다.
기도의 용이한 모니터링을 위한 방법은 부족하다. 기관지폐포 세척액 및 타액 유발과 같은 침습적 과정은 환자에게 유해할 수 있고 빈번한 샘플채취를 허용하지 않는다.
호기된 공기의 바이오마커를 측정하는 것은 비침습적이고 반복된 샘플채취를 가능하게 하는데 이것은 질환 진행 및 치료 반응을 모니터링하는 것 뿐만 아니라 질환의 조기 검출에 유용할 수 있다. 그 기술은 휘발성 물질, 가장 중요하게는 알러지 천식에 대한 마커로서 사용되는 호기된 NO에 대해 성공적이었다.
비휘발성 화합물은 기도 내막액으로부터 유도되는 것으로 생각되는 에어로졸 입자에 의해 운반된다. 이것은 또한 본 발명자의 예비 데이터에 의해 확인된다. 이들 화합물은 기도에서의 병리생리학적 과정에 대한 기본적이고 구체적인 정보를 제공할 수도 있다. 호기된 호흡에서의 내인성 입자들에 대한 몇 연구들이 있다. 기도에서 입자 형성의 메카니즘 및 정확한 위치는 분명하지 않으며 입자의 화학적 조성의 구체적인 분석은 행해진 적이 없다.
호기된 호흡에서 입자의 샘플채취 및 분석에 대해 새로운 기술이 개발되었다. 대상자의 의학적 상태를 결정하는 방법은
a. 상기 대상자에 의해 호기된 입자들을 수집하는 단계;
b. 상기 입자들을 그것들의 질량 또는 크기에 따라 분류하는 단계, 그리고
g. 상기 입자들의 화학물질 함량을 분석하는 단계
를 포함하여, 따라서 상기 대상자의 의학적 상태가 결정되도록 한다.
추가로, 다음의 단계들이 또한 방법에 포함될 수도 있다;
c. 상기 입자들을 그것들의 질량 또는 크기에 따라 분류하여 상기 입자들의 입자 분포 프로파일을 얻는 단계;
d. 상기 대상자에 의해 호기된 입자들의 입자 분포 프로파일을 기준 입자 분포 프로파일과 비교하는 단계;
e. 대상자의 입자 분포 프로파일과 기준 입자 분포 프로파일 간의 유사성 및/또는 편차를 기록하는 단계; 그리고
f. 대상자의 입자 분포 프로파일과 기준 입자 분포 프로파일 간의 편차 또는 유사성을 대상자에서 한가지 이상의 의학적 상태에 할당하는 단계; 그리고 선택적으로
g. 상기 입자들의 화학물질 함량을 분석하는 단계.
의학적 상태는 기관지 천식, 낭성 섬유증, 만성 폐쇄 폐질환(COPD), 간질(interstitial) 폐질환, 사르코이드증, 전신 홍반 루프스(SLE)와 같은 전신 질환에 있어서 폐 진입, 폐렴, 세균 집락 또는 바이러스 감염과 같은 폐 감염으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
기준 입자 분포 프로파일은 주어진 의학적 상태를 갖지 않은 환자로부터 얻어질 수도 있고, 단계 e.는 대상자의 입자 분포 프로파일과 기준 입자 분포 프로파일 간의 편차를 기록하는 단계를 수반한다. 대안으로, 기준 입자 분포 프로파일은 주어진 의학적 상태를 갖는 환자로부터이고, 단계 e.는 대상자와 환자의 입자 분포 프로파일 간의 유사성을 기록하는 단계를 수반하여, 대상자에서 상기 주어진 의학적 상태의 진단을 가져온다.
본 발명은 또한 호기된 호흡 입자의 입자 분포 프로파일을 제공하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은
a. 대상자에 의해 호기된 입자들을 수집하는 단계; 그리고
b. 상기 입자들을 그것들의 크기 또는 질량에 따라 분류하여 상기 입자의 입자 분포 프로파일을 얻는 단계를 포함한다.
어느 방법이든, 입자들은 관성 충돌기를 사용하여 그들의 질량에 따라 또는 입자 계수기를 사용하여 그들의 크기에 따라 분류될 수 있다.
충돌기는 적합하게는 입구 및 출구를 가지며, 입자(P)를 포함하는 기체 스트림(A)이 입구를 통해 충돌기에 들어오고 차례로 각 스테이지를 통과한 후 상기 출구를 통해 충돌기를 나가도록 배치된 다수의 스테이지를 포함하며;
여기서 각 스테이지는 기체 스트림(A)을 수집판으로 향하게 하는 구멍을 갖는 파티션에 의해 인접 스테이지로부터 분리되고, 각 수집판의 주 면은 기체 스트림(A)의 흐름 방향에 실질적으로 수직으로 배치되며;
이로써 호기된 입자는 기체 스트림(A)에서 상기 관성 충돌기를 통과하고; 일차 기체 스트림(A)이 차례로 각 스테이지에서 각 수집판을 향하도록 하며; 제 1 스테이지에 위치된 적어도 제 1 수집판은 제 1 질량의 입자들을 수집하고 제 2 스테이지에 위치된 적어도 제 2 수집판은 제 2 질량의 입자들을 수집한다.
입자들은 그것들의 크기 또는 질량에 따라 분류된 후, 분석된다. 그것들은 수집판을 먼저 세척해 내거나 세척해 내지 않고, 비행 시간형 2차 이온 질량 분광분석법(time-of-flight secondary ion mass spectrometry: TOF-SIMS), 매트릭스 도움 레이저 탈착 이온화 질량 분광분석법(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry: MALDI-MS), 표지된 항체에 기초한 생화학적 측정 또는 프로토콜, 정량 PCR 분석, 주사 전자 현미경(SEM), 기체 크로마토그라피 질량 분광분석법(GC-MS), 액체 크로마토그라피 질량 분광분석법(LC-MS), 표면 플라스몬 공명(SPR), 형광 분광학, TOC(총 유기 함량) 분석, 원소 분석 및 유도 결합 플라즈마 질량 분광분석법(ICP-MS)으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 한가지 분석 기술에 의해 분석될 수 있다.
본 발명은 또한 호기된 입자를 수집 및 분류하는 시스템에 관련되며, 상기 시스템은
a. 제 1 개구부와 제 2 개구부를 갖는 저장소;
b. 저장소의 제 1 개구부에 연결된 2방향 마우스피스;
c. 입구와 출구를 갖는 관성 충돌기를 포함하며, 상기 충돌기는 입자(P)를 포함하는 기체 스트림(A)이 입구를 통해 충돌기로 들어오고 차례로 각 스테이지를 통과한 후 상기 출구를 통해 충돌기를 나가도록 배치된 다수의 스테이지를 포함하며;
여기서 각 스테이지는 주 기체 스트림(A)을 수집판으로 향하게 하는 구멍을 갖는 파티션에 의해 인접 스테이지로부터 분리되고, 각 수집판의 주 면은 기체 스트림(A)의 흐름 방향에 실질적으로 수직으로 배치되며; 관성 충돌기의 입구는 저장소의 제 1 개구부에 연결된다.
호기된 입자의 측정 및 분석은 다음의 요건을 충족한다:
＊ 비침습적일 것
＊ 사람에게서 반복된 측정이 가능할 것
＊ 항산화제 시스템, 단백질 발현, 지질 패턴의 변화 및 입자 크기 및 농도의 차이를 포함하는 폐에서의 여러가지 병리생리학적 과정들의 속도론을 따를 것.
＊ a) 천식, 만성 폐쇄 폐질환, 간질 폐질환, 폐암, 호흡기 감염, 그리고 SLE, 피부경화증, 및 류머티스 관절염과 같은 전신 질환에 있어서 폐 진입과 같은 호흡기 질환
b) 심혈관질환, 당뇨병, 대사증후군, 고콜레스테롤혈증과 같은 전신 질환
의 진단 및 모니터링을 위한 새로운 바이오마커의 비침습적 확인을 위한 플랫폼
＊ 삽관처치 환자의 모니터링
＊ 노출의 모니터링
＊ 약리학적 처치를 위한 새로운 타겟의 확인
＊ 일정한 노출 또는 질환에 대해 증가된 유전적 민감성을 갖는 개체의 확인.
도 1은 본 발명에 따르는 관성 충돌기를 예시한다.
도 2는 호기된 입자의 수집 시스템을 예시한다.
도 3은 한 대조군 대상자로부터 입자 스폿의 포지티브(도 3a) 및 네거티브(도 3b) TOF-SIMS 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 한 대조군 대상자로부터 호기된 입자를 갖는 한 스폿의 TOF-SIMS 이미지를 나타낸다.
도 5는 시간에 대한 호기된 입자(0.5-2.0 μm)의 농도를 나타낸다.
도 6은 건강한 대상자와 천식 또는 낭성 섬유증을 갖는 환자의 파일럿 스터디에서 (CN+CNO)/PO3 - 비율을 나타낸다.
제 1 구체예에서, 본 발명은 대상자의 의학적 상태를 결정하는 방법에 관련된다. "결정(determining)"이라는 단어는 가장 넓은 범위로, 즉 의학적 상태의 존재(정성) 및/또는 정도(정량)의 평가로 이해된다. 게다가, "결정"은 또한 대상자가 주어진 의학적 상태를 획득해야만 하는 어떤 소인의 결정을 말한다.
용어 "의학적 상태"는 질환 및 질병에 제한된 것으로 이해해서는 안된다. 비진단 방법으로 예를 들면 다음의 상황에서의 건강한 대상자, 즉,
- 의약 또는 약물의 영향(예를 들면, 도핑 시험) 하에 있을 수 있는 대상자, 또는 달리 화학 물질(예를 들면, 공해물질, 직업상의 위험)에 노출된 대상자;
- 신체적 활동 또는 건강 프로그램에 포함된 대상자(예를 들면, 대상자의 피트니스 또는 건강을 결정하기 위함);
- 일정한 질환 또는 질병이 발달할 소인을 갖는 건강한 대상자;
- 일정한 질환 또는 질병이 발달하거나 또는 특정한 노출에 대한 내성이 적은 유전적 민감성을 갖는 건강한 대상자의 의학적 상태를 조사하기 위한 것이 관련될 수도 있다.
본 발명 방법이 적용될 수 있는 대상자는 동물, 특히 포유동물, 바람직하게는 사람이다. 본 발명은 주로 사람을 참고하여 기술할 것이다.
제 2 구체예에서, 본 발명은 호기된 호흡 입자의 입자 분포 프로파일을 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 두 방법에서 제 1 단계는 대상자에 의해 호기된 입자를 수집하는 것을 수반한다. 1회 호기는 충분한 수의 입자들을 제공하나, 전형적으로는 입자들은 반복된 호기로부터 수집된다. 사람에서의 의학적 상태의 진단을 위해, 예를 들면, 입자는 단 1회 호기를 수십분까지, 예를 들면 1초 내지 100분, 예를 들면 1초 내지 50분, 5초 내지 20분 또는 10초 내지 5분을 포함하는 시간 동안 연속 흡기/호기로부터 수집될 수도 있다.
호기 패턴을 다양하게 함으로써, 또한 기도의 다른 부분들로부터 대표적인 입자들을 수집하는 것도 가능하다. 힘을 준 호기는 기도가 좁아질 때 난류를 증가시키고 따라서 기도의 최원단부로부터 기도 개방에 의해 추정상 더 많은 입자들이 형성되는 정상 호흡과 반대로 다소 더 중심 기도에서 입자 생성을 증가시키고 있다.
수집 후, 입자들을 그것들의 질량 또는 그것들의 크기에 따라 분류한다. 입자 계수기는 개개 입자들을 계수하기 위해 사용될 수 있고 따라서 입자의 수-크기 분포를 제공한다. 질량 분포는 구형 입자들과 밀도를 추정함으로써 계산될 수 있다. 수집된 비휘발성 물질의 진보된 화학 분석을 계속할 수도 있다(이하에 상술하는 바와 같음).
그것들의 질량 또는 그것들의 크기에 따라 입자들을 분류하는 것은 또한 상기 입자의 입자 분포 프로파일을 제공할 수 있다. 입자 분포 프로파일은 특정 질량 또는 크기 (또는 질량 또는 크기 범위)의 입자들이 얼마나 많은 입자들이 호기된 공기에 존재하는지의 척도이며, 또한 대상자의 의학적 상태를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본문에서 입자는 고체, 액체 및 액체 코팅된 고체 대상물을 의미하는데, 이것은 종종 기체, 반드시는 아니지만 보통은 공기에 현탁되어 있다. 대상물 크기는 반드시는 아니지만 보통 0.005 마이크로미터보다 크고 15 마이크로미터보다 작다. 크기는 공기역학 직경이거나 아니면 전기적 이동도 직경을 의미하고 적합하게는 공기역학 직경이다.
도 1은 호기된 입자(도 1에서 P로 나타냄)를 수집하기 위해 사용된 관성 충돌기(10)를 나타낸다. 충돌기(10)는 기체와 호기된 입자가 충돌기(10)로 들어가는입구(12)와, 기체와 호기된 입자가 충돌기(10)를 나가는 출구(14)를 갖는 용기이다. 도 1에서 충돌기(10)는 원통으로서 예시되어 있고, 원통의 양쪽 원형 면에 입구(12)와 출구(14)를 갖는다. 그러나, 입구 및 출구(12, 14)의 다른 기하구조 및 배치가 가능하다.
충돌기(10)는 다수의 스테이지(20, 30, 40, 50)를 포함한다. 도 1은 네개의 스테이지(20, 30, 40, 50)를 예시하나, 2 내지 15개의 스테이지를 갖는 충돌기가 공지되어 있다. 입자(P)를 포함하는 주 기체 스트림(A)은 입구(12)를 통해 충돌기(10)로 들어가고 차례로 각 스테이지(20, 30, 40, 50)를 통과한 후 출구(14)를 통해 충돌기(10)를 나간다. 주 기체 스트림(A)은 대상자에 의해 호기된 공기 및 입자를 포함한다. 흐름은 충돌기의 출구에 연결된 펌프에 의해 야기된다. 전형적으로, 본 발명에 따르면, 호기된 공기 및 입자는 대상자를 떠나는 것과 충돌기에 들어오는 것 사이에서 개질되지 않는다.
각 스테이지(20, 30, 40, 50)는 파티션(21, 31, 41, 51)에 의해 인접 스테이지로부터 분리되어 있다. 각 파티션은 기체 스트림(A)을 수집판(33, 43, 53)으로 향하게 하는 적어도 하나의 구멍(22, 32, 42, 52)(실제로, 다수의 구멍들이 각 파티션에 존재한다)을 갖는다. 각 수집판(33, 43, 53)의 주 면은 기체 스트림(A)의 흐름 방향에 실질적으로 수직으로 배치되어 있다.
사용된 수집판(33, 43, 53)은 약 1 mm의 두께를 가지며 10-12 mm의 변을 갖는 정사각형이다. 판은 노즐을 통해 공기 스트림의 출구에서 양면 테이프에 의해 기판 홀더에서 제자리에 유지되어 있다. 판은 원소상 규소로 만들어지는데 이것이 분석을 계속하기에 유리하기 때문이다. 판은 매우 깨끗해야 하는데 미량의 불순물이 입자의 계속된 분석을 방해할 수 있기 때문이다. 규소 판의 클리닝은 몇가지 방식으로 행해질 수 있는데, 바람직하게는 유기 용매에서 초음파 클리닝 후 이어서 UV-오존 처리, 또는 1-10% 질산 또는 과산화수소에 침지함으로써 행해질 수 있다.
클리닝 후, 수집판 표면의 준비는 수집과 계속되는 화학 분석에 관하여 최적화될 수 있다. 수집판의 친수성 또는 다른 표면 화학 성질을 변화시킴으로써, 입자들의 표면과의 상호작용을 바람직한 방식으로 제어할 수 있다. 바람직하게는, 수집판의 전체 표면을 개질한다. 소수성 수집판은 친수성 표면보다 더 강하게 지질 분자의 탄화수소 사슬과 같은 소수성 부분을 결합할 것이다. 보통의 친수성 규소 표면은 메틸 실란과 같은 소수성 물질의 박층으로 코팅함으로써, 또는 규소 기판을 금으로 코팅한 다음 메틸 말단의 티올의 모노레이어를 금 위에 도포함으로써 소수성으로 만들 수 있다. 유사하게는, 수집 표면은 일정한 분자와 특이적으로 결합하도록 만들 수 있다. 수집판 표면을 문제의 단백질에 대한 항체로 코팅함으로써 특정한 단백질이 수집판 표면에 결합하도록 만들 수 있다. 적당한 시약을 사용함으로써, 분석물의 결합은 색 변화 또는 형광의 방출을 유발할 수 있는데, 이것은 인시튜 및 실시간으로 검출될 수 있다. 인시튜 검출은 또한 수집판의 표면에 분석물의 결합에 의해 유발된 전류 또는 커패시턴스 변화의 전기 측정으로 행해질 수 있다. 이 경우에 수집판은 또한 이러한 측정을 가능하게 하는 필요한 전기 연결부을 갖는다. 충돌기는 수집판에 적당한 연결부와 접촉해 있는 필요한 전기 연결부를 포함할 수 있다.
공기 스트림이 제 1 수집판(33) 둘레에 편향될 때 공기 스트림을 따를 수 없도록 되어 있는 관성을 갖는 입자들은 수집판(33)에 충돌하게 되는 한편, 더 적은 관성을 갖는 입자들은 다음 스테이지(40)로 계속될 것이다. 입자의 관성은 그것의 질량에 의존하고, 이것은 차례로 그것의 크기에 의존한다. 이런 식으로, 입자의 질량 또는 크기-분리가 가능하다.
이와 같이 각 스테이지에서 구멍의 수, 그것들의 직경 및 구멍으로부터 수집판의 거리를 선택함으로써, 에어로졸에서 입자의 질량 또는 크기 분리를 달성하는 것이 가능하다. 높은 관성, 즉 큰 질량/크기를 갖는 입자들은 초기 스테이지에서 분리되는 한편, 덜 관성을 갖는, 즉 더 작은 질량/크기를 갖는 입자들은 나중 스테이지에서 충돌할 것이다. 구멍의 형태를 선택함으로써, 계속되는 화학 분석에 적합한 형태로 수집된 재료를 농축시키는 것이 가능하다. 호기된 공기 또는 호흡 응축물과 비교하여 수집판에 재료의 농도의 증가는 상당하다.
본 발명의 경우에, 변형된 3-스테이지 Dekati PM 10이 사용되었다. 변형안은 제 3 스테이지의 노즐의 수를 2의 인수 만큼 감소시키는 것과 충돌기의 설계 유속을 1.5의 인수 만큼 증가시키는 것으로 구성되었다.
원래의 충돌기는 분당 15리터의 흐름에서 작동한 분당 10리터 변화이었다. 마지막 스테이지의 20개의 구멍들은 10개로 감소시켰고 따라서 각 노즐에서의 기체 속도를 2의 인수만큼 증가시켰다. 50% 컷-오프 크기[즉, 그 크기의 입자 수 절반은 수집되는 한편 수의 절반은 계속된다. 이것은 단계식 수집 특징을 나타내지 않고, 오히려 "S-형" 특징을 나타낸다]는 세 스테이지에서 각각 7, 1.5 및 0.5 μm이었다.
수집판의 표면 기능화는 상기한 바와 같이 소형화될 수 있어서 각 노즐에서 다른 기능화를 달성하여 다른 분석물의 최적의 병행 수집을 용이하게 한다. 유사하게는, 특정 물질의 병행 인시튜 광학 또는 전기 검출은 수집판 칩에 의해 행해질 수 있는데, 이때 적당한 표면 기능화 및/또는 전기 연결부가 노즐 출구의 위치에서 수집판에 공급되었다.
충돌기는 호기된 입자를 가능한 한 효율적인 방식으로 수집하도록 설계된다. 이것은 호기된 공기에 존재하는 궁극적으로 모든 입자들이 주어진 질량/크기 간격으로 수집되어 분석된다. 입자들은 진보된 화학 분석에 적합한 농축된 형태로 회수된다.
본 발명은 또한 호기된 입자들을 수집하고 분류하기 위한 시스템(100)을 제공하는데, 상기 시스템은
a. 제 1 개구부(112)와 제 2 개구부(113)를 갖는 저장소(114);
b. 저장소(114)의 제 1 개구부(112)에 연결된 2방향 마우스피스(110);
c. 입구(12)와 출구(14)를 갖는 관성 충돌기(10)를 포함하며, 상기 충돌기(10)는 입자(P)를 포함하는 기체 스트림(A)이 입구(12)를 통해 충돌기(10)로 들어오고 차례로 각 스테이지(20, 30, 40, 50...)를 통과한 후 상기 출구(14)를 통해 충돌기(10)를 나가도록 배치된 다수의 스테이지(20, 30, 40, 50...)를 포함하며;
여기서 각 스테이지(20, 30, 40, 50...)는 주 기체 스트림(A)을 수집판(33, 43, 53...)으로 향하게 하는 구멍(22, 32, 42, 52...)을 갖는 파티션(21, 31, 41, 51 ...)에 의해 인접 스테이지로부터 분리되고, 각 수집판(33, 43, 53...)의 주 면은 기체 스트림(A)의 흐름 방향에 실질적으로 수직으로 배치되며; 관성 충돌기의 입구(12)는 저장소(114)의 제 1 개구부(112)에 연결된다.
수집 시스템은 도 2에 예시된 바와 같이 설치될 수 있다. 시스템의 더 큰 부분이 자동온도조절된 구획(120)에 위치된다. 호기된 입자를 원하는 개체는 2방향 마우스피스(110)를 통해 실내 공기를 흡기한다. 흡기시, 흡기된 공기(A)는 마우스피스 앞에 위치된 고효율 입자 필터(125)를 통과한다.
마우스피스(110)는 호기된 에어로졸의 크기 분포가 수증기의 증발에 의해서나 아니면 응축에 의해서 변하지 않도록 하는 온도에서 유지시킨다. 호기된 공기(A)는 마우스피스(110)를 통과해 자동온도조절된 구획(120)에 위치된 시스템으로 가고, 또한 여기서 에어로졸 크기 분포를 유지할 목적을 갖는다. 구획에는 호기된 공기를 위한 저장소(114)가 위치된다. 또한, 입자 계수기(116)는 입자 크기를 계수 및 측정하기 위해 저장소(114)의 제 1 개구부(112)에 연결된다. 입자(P)의 수집을 위한 관성 충돌기(10)는 또한 저장소 제 1 개구부(112)에 연결되어 있다.
충돌기(10)를 통한 흐름은 전형적으로 자동온도조절된 구획 외부에 위치된 펌프(115)에 의해 유지된다. 도 2는 또한 기체 방출(130)을 나타내고 입자 없는 가습된 공기가 첨가됨을 나타낸다(135).
수-크기 분포를 측정할 수 있는 입자 계수기(116)는 추가의 중요한 정보를 공급한다. 여기서 사용된 입자 계수기는 0.3 내지 20 마이크로미터의 15개의 크기 간격으로 입자를 계수 및 크기분류할 수 있는 Grimm 1.108 광학 입자 계수기(Grimm Aerosol Technik, Ainring, Germany)이다. 기기는 측정된 수 크기 분포로부터 계산된 측정된 에어로졸 또는 질량 분포의 수 크기 분포를 제공할 수 있다. 기기에서, 입자가 실린 공기는 한번에 단지 하나의 입자가 조명되도록 하는 방식으로 작은 잘 규정된 강렬하게 조명된 공간을 통과하게 된다. 조명된 입자는 산란광의 펄스를 일으키고, 그것의 강도를 측정한다. 산란광의 강도는 입자 크기에 의존하기 때문에, 공기 스트림에서 입자를 계수하고 크기분류하는 것이 가능하다.
저장소(114)는 호기된 공기의 흐름이 조합된 충돌기(10) 및 입자 계수기(116) 흐름을 초과할 때 호기된 공기가 저장되는 버퍼로서 작용한다. 저장소(114)는 호기가 일어나지 않을 때 공기를 충돌기(10) 및 입자 계수기(116)에 공급한다. 습한, 입자 없는 공기는 저장소(114)의 제 2 개구부(113)에 첨가되어 항상 포지티브 방출 흐름이 있도록 한다. 흐름은 저장소(114)의 방출 단부에 위치된 유량계(119)에 의해 측정된다. 흐름을 실시간 그래프로 표시함으로써, 대상자가 지시에 따라 호흡 빈도 및 강도를 조절하도록 하는 것이 가능하다.
샘플은 다음 방식으로 채취된다. 충돌기는 깨끗한 수집판을 로딩하고 시스템, 특히 충돌기는 원하는 온도를 달성하였다고 가정한다. 처음에, 유량계는 흐름의 적당한 측정을 허용하기 위해 제로로 되어 있고, 그 다음 습한 깨끗한 공기 흐름을, 측정동안 시스템으로부터 포지티브 흐름이 유지되도록 하는 값으로 설정한다. 다음에 충돌기 흐름은 깨끗한 공기 흐름보다 낮은 값으로 설정한다. 이 과정의 동안에, 시스템은 깨끗한 입자 없는 공기가 공급되기 때문에 판에 부착물이 수집되지 않을 것이다. 다음에 광학 입자 계수기를 시동하고 예를 들면 시스템으로의 누출을 가리키는 허위 입자는 존재하지 않음을 점검한다. 그다음 시스템으로의 호기를 시작하고, 입자 계수기는 계속해서 샘플을 끌어내고 매 6초 마다 크기 분포를 산출하는 한편 충돌기는 나중 분석을 위해 샘플을 수집한다. 요구되는 양의 샘플이 얻어졌을 때, 수집을 종결하고, 샘플채취 시간 및 호기된 부피를 기록하였다. 충돌기를 통한 흐름을 잠그고, 충돌기를 측정 시스템으로부터 제거하고 로딩된 판을 회수한다.
시스템의 두 구성요소가 "연결되어 있는" 점에서, 공기 및 호기된 입자는 구성요소들 간에 흐를 수 있음을 이해해야 한다. 연결은 보통 관에 의해 만들어지고, 기체/입자 흐름을 향하게 하도록 적당한 접합부, 밸브 또는 시일을 갖는다.
이 시스템이 가능한 한가지 가능성은 다른 호기 속도에서 다른 분율로 입자형성의 정량화이다. 이것은 예를 들면 천식에서와 같이 격렬한 공기 흐름을 검출하는 매우 쉬운 방법일 수 있고 질환의 마커로서 사용될 수 있다.
분석
수집판(23, 33, 43, 53) 및 그것들의 관련 입자(P)는 충돌기(10)로부터 제거될 수 있고 입자들은 그것들의 화학물질 함량에 관하여 분석될 수 있다. 입자(P)의 화학물질 함량은 대상자의 의학적 상태에 대한 식견을 제공한다(의학적 상태 제목의 단원에 이하에 기술됨).
한가지 분석 전략에 있어서는, 입자들은 수집판에 여전히 있으면서 분석된다. 이것은 입자들에 존재하는 특정 물질에 대한 상보 정보를 제공하는 다음의 화학적 분석 기술로 행해진다. 비행 시간형 2차 이온 질량 분광분석법(TOF-SIMS)은 1000 u까지의 질량 범위의 물질, 특히 여러가지 유형의 지질의 분석에 특히 용이한데, 이것에 대해 프로파일은 여러가지 질환 상태의 동안에 변화할 것이다. 매트릭스 도움 레이저 탈착 이온화 질량 분광분석법(MALDI-MS)은 염증 반응과 연관된 펩티드 및 더 큰 거대분자(여러가지 단백질)를 분석하는 적합한 방법이다. 단백질의 MALDI-MS 확인은 또한 단백질 분해 효소, 바람직하게는 트립신을 적용함으로써 용이하게 될 수 있는데, 이것은 공공연하게 이용가능한 데이터 베이스와 비교함으로써 결정적 단백질 확인을 위해 결정되고 사용될 수 있는 세그멘트로 단백질을 분해할 것이다. 특정 단백질 또는 다른 생체분자(예를 들면 DNA)의 분석은 또한 수집판에 직접 표지된 항체에 기초하여 다른 생화학적 분석 또는 프로토콜을 적용함으로써 행해질 수 있다. 주사 전자 현미경(SEM)은 수집된 입자 집합체의 형태학을 분석하는데 사용할 수 있다. 이러한 분석은 비생물학적 기원의 입자, 예를 들면 대상자의 노출로 인한 입자를 나타낼 수 있다.
또 다른 분석 전략에서, 수집된 재료는 수집판으로부터 제거된다(씻어냄). 수집된 입자를 함유하는 세척 용액은 그 다음 다른 화학적 또는 생화학적 분석 기술을 위해 더 처리될 수 있다. 가장 간단한 분석에서, 수집된 입자 중 유기 물질의 총량은 TOC (총 유기 함량) 분석기로 분석될 수 있다. 다른 원소 분석기는 수집된 재료에서 탄소, 질소, 산소 및 황의 양을 얻기 위해 사용될 수 있는데, 이것은 차례로 다른 부류의 생체분자(지질, 탄수화물, 단백질)의 상대적인 양을 반영한다. 미량의 무기 원소, 특히 금속은 유도 결합 플라즈마 질량 분광분석법 (ICP-MS)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 분석은 비생물학적 기원의 물질에 대한 정보를 제공하게 될 뿐만 아니라, 특정 질환 상태, 예를 들면 철-반응 단백질(IRP)에서 중요한 금속-함유 생체분자(단백질)를 검출하기 위해 사용될 수 있다. Cu 및 Zn은 또한 폐 종양 조직에서 증가되는 것으로 나타났고, 둘다 기도에서 염증 반응을 조절하는데 중요한 것 같다. 보다 생체분자 특이적 분석을 위해서는, 세가지 기술인 기체-크로마토그라피 질량 분광분석법(GC-MS), 액체 크로마토그라피 질량 분광분석법(LC-MS), 및 직접적 MALDI-MS는 상보 정보를 제공할 것이다. GC-MS는 약 500 u까지의 질량 범위에서 반-휘발성 물질에 대한 정보를 제공할 것이다. LC-MS는 지질, 펩티드 및 단백질과 같은 다른 생체분자와 또한 그것들의 변형물에 대해 정성 및 정량 정보를 제공할 것이다. 직접적 MALDI-MS는 최종적으로 수 10 000 u까지의 생체 분자의 패턴 검출에 사용될 수 있어 지질 및 단백질 프로파일 둘다의 한번 검출 및 확인을 허용한다. 수집되고 세척된 물질, 특히 관심있는 특정 단백질에 대한 표지된 항체들은 또한 생화학적 분석을 시킬 수 있고, 또는 유전 물질 분석을 위한 정량적 PCR 분석을 시킬 수 있다.
샘플 취급을 용이하게 하고 방법의 감도를 증가시키기 위한 몇가지 기술이 있다. 이 방법에서 이미 존재하는 한가지 이점은 표면 탈착 질량 분광분석 기술을 사용하여 충돌기로부터 취한 수집판을 직접 분석하는 가능성이다. 더 이상의 이점은 샘플을 정제 및/또는 그것을 예를 들면 상기한 효소로 판 위에서 직접 변형시키는 것, 소위 판 위 분해(on-plate digestion)일 것이다. 입자 샘플에서 특정 분석물의 직접 결합 또는 변형을 위한 수용체 분자 또는 효소로 공유 변형시킨 수집판 위의 다른 종류의 표면을 만드는 것도 또한 가능하다. 이들 방법은 잘 공지되어 있고 유기 실험실에서 쉽게 적용될 수 있다. 이것은 분석 공정을 상당히 속도를 높이게 만들어서 큰 환자 군의 조사에 대해 더욱 편리하게 만들 것이다.
질량 분광분석법에 의해 신규한 바이오마커의 확인 후 큰 집단 군에 대한 분석을 쉽게 규모확대하기 위해 표면 플라스몬 공명(SPR) 및 형광 분광학과 같은 새로운 분석 기기를 도입하는 것이 가능하다. 이들 두 방법은 입자 수집 방법을 병원 및 건강관리센터에서 사용하기에 더 접근가능하게 만드는 비전문가에 의해 더 쉽게 사용되며 또한 큰 환자 군의 연구를 더 시간효율적이 되도록 할 것이다. 충돌기로부터 직접 수집판을 사용할 수 있는 것이 매우 유리하다.
상기 언급한 다른 질량 분광분석(MS) 기술은 그것들이 수집된 입자의 조성에 대한 전체적인 정보를 제공한다는 뚜렷한 이점을 갖는다. 이것은 다른 MS 기술들을 조합함으로써, 대부분의 생체분자를 비지정 방식으로 검출하는 것을 가능하게 할 것이다. 이것은 단지 사전선택된 표지된 물질을 검출하는 많은 다른 생화학적 분석 기술과 대조적이다. MS 기술로 하는 본 방법의 적합성은 따라서 다른 질환들에 대한 새로운 특이적 바이오마커를 확인하기 위한 중요한 이점이다.
입자의 분석은 기준 화학 분석과 비교할 수 있고, 기준 화학 분석으로부터의 편차 및/또는 유사성이 확인될 수 있다. 이것은 대상자에서 한 가지 이상의 의학적 상태를 결정하는데 사용될 수 있다. 기준 화학 분석은 일정한 의학적 상태를 갖는 대상자(이 경우 화학적 분석에서의 유사성을 찾음), 일정한 의학적 상태를 갖지 않는 환자(이 경우 화학적 분석에서의 편차를 찾음)로부터일 수 있고, 또는 다른 상황하에서(예를 들면 나중 시점에서, 또는 치료 또는 운동의 일정한 과정 후) 택한 대상자 자신들로부터 일 수 있다.
입자 분포 프로파일은 각 수집판에서 입자들을 분류함으로써 결정될 수 있다. 얻어진 입자 분포 프로파일은 대상자에서 한가지 이상의 의학적 상태를 결정하는데에 사용될 수 있다. 만일 진단이 행해진다면, 대상자에 의해 호기된 입자의 입자 분포 프로파일을 기준 입자 분포 프로파일과 비교한다. 대상자의 입자 분포 프로파일과 기준 입자 분포 프로파일 간의 유사성 및/또는 편차를 기록하고 대상자의 입자 분포 프로파일과 기준 입자 분포 프로파일 간의 편차 또는 유사성은 대상자에서 한가지 이상의 의학적 상태에 할당된다.
기준 입자 분포 프로파일은 주어진 의학적 상태를 갖지 않는 대상자로부터의 입자 분포 프로파일일 수 있다. 이 경우에, 대상자의 입자 분포 프로파일과 기준 입자 분포 프로파일 간의 편차를 기록할 수 있고, 의학적 상태의 징후를 제공한다.
기준 입자 분포 프로파일은 대안으로 주어진 의학적 상태를 갖는 대상자로부터 일 수 있다. 다음에 대상자 및 환자의 입자 분포 프로파일 간에 유사성이 기록될 수 있고, 대상자에서 상기 주어진 의학적 상태의 진단을 이끌 수 있다.
기준 입자 분포 프로파일은 또한 다른 상황하에서(예를 들면 나중 시점에서, 또는 치료 또는 운동의 일정한 과정 후) 택한 대상자 자신들로부터 일 수 있다. 이것은 본 발명의 방법에 의한 의학적 상태의 모니터링을 허용할 것이다,
의학적 상태
본 발명에 의해 결정되거나 모니터링될 수 있는 의학적 상태는
- 기관지 천식
- 낭성 섬유증
- 만성 폐쇄 폐질환(COPD)
- 폐암
- 간질 폐질환
- 사르코이드증
- 전신 홍반 루프스(SLE)와 같은 전신 질환에 있어서 폐 진입
- 폐 감염 : 폐렴, 세균 집락, 바이러스 감염
또한 다음과 같은 다른 전신 의학적 상태가 모니터링될 수 있는 것이 가능하다.
- 심부전증(예를 들면 엔도텔린-1)
- 고콜레스테롤혈증(콜레스테롤이 호기된 입자에서 발견됨)
- 당뇨병(인슐린이 입자에서 발견됨)
- 대사증후군
- 질환 또는 노출에 대해 증가된 유전적 민감성
입자는 특정 의학적 상태의 징후인 바이오마커를 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다. 본 발명에 따르는 방법은 이러한 바이오마커의 검출을 허용한다.
호기된 입자는 다량의 항산화제 및 계면활성제를 함유하는 전체 호흡기 상피를 덮고 있는 기도 내막액(RTLF)[ Pediatr Allergy Immunol 15(1 ):4-19]으로부터 기원되는 것으로 생각된다. RTLF의 구성물질은 기단 기도로부터 원단 기도로 변화한다는 것을 또한 염두에 두어야 한다.
RTLF에 풍부하게 존재하는 한가지 물질은 Clara 세포에 의해 생산된 항염증 단백질로도 작용하는 Clara 세포 단백질 16 (CC16)이다. CC16은 지금까지 BAL 및 혈액에서만 측정되었다. 이제까지 관심을 얻은 다른 물질은 또한 기관지 폐포 세척액, BAL에서만 측정된 계면활성제 단백질 A-D이다.
특별한 관심은 입자에서 항산화제의 농도의 검출 및 모니터링이다. 잠재적인 바이오마커는 기도에서 크게 풍부한 글루타치온이다. 호기 점적들에서 잠재적인 바이오마커인 다른 항산화제는 금속 결합 단백질 세룰로플라스민 및 트랜스페린인데 이것들은 매트릭스 도움 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법(MALDI MS)으로 검출되는 것이 가능하다. 저분자량을 갖는 추가의 잠재적 항산화제, 예를 들면 아스코르베이트, α- 토코페롤, 우레이트 및 L-시스테인은 또한 질량 분광분석법으로 검출되는 것이 가능하며, 이들 분자는 또한 산화성 스트레스에 대한 바이오마커이다.
항산화제로서 산화성 스트레스에 직접 수반되는 잠재적 바이오마커는 글루타치온, 세룰로플라스민, 트랜스페린, 아스코르베이트, α-토코페롤, 우레이트 및 L-시스테인이다. 글루타치온은 그것이 기도에서 크게 풍부하기 때문에 특히 관심을 끈다. 이들 항산화제를 검출하기 위해 사용될 분석 방법은 질량 분광분석법이 될 것이다.
a. 지질
RTLF에서 인지질의 프로파일은 질환에 대한 바이오마커로서 역할을 할 수도 있다. 인지질 조성(PC)에 있어서의 변경은 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome: ARDS), 폐렴, 낭성 섬유종 및 천식과 같은 대분분의 기도 질환에서 볼 수 있었다. 천식에서 PC는 BAL에서 감소되었고 PC/포스파티딜글리세롤(PG) 간의 관계는 알레르겐 도전 후 변하는 것으로 나타났다.
호흡기 질환에서 새로이 드러나는 연구 영역은 또한 지질의 질화 및 산화인데, 이것은 그것들의 기능을 변경시킬 수 있다.
RTLF에서 인지질 및 단백질을 포함하는 계면활성제는 선천 면역 체계에서 중요한 기능을 제공하는 것으로 생각된다. 인지질은 프로스타글란딘, 트롬복산, 에오탁신, 리폭신, 레솔빈 등과 같은 선천 면역에 있어서 활성인 여러가지 시토킨에 대한 전구물질이다. 계면활성제 단백질은 또한 특히 항원 제공 세포 및 세포 사멸의 조절로서 작용하는 선천 면역에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 계면활성제의 대사의 지식은 지금까지 매우 제한되어 있으나 호흡기 질환의 병인론을 이해하는데 중요한 것으로 생각된다.
TOF-SIMS로 규소 수집판의 표면 분석은 호기된 입자에서 넓은 범위의 인지질을 나타내었다. 입자에서 검출된 인지질은 BAL 연구에서 RTLF에서 발견된 인지질과 일치한다. 인지질의 상대적인 양은 또한 BAL과 일치되어 있다. CN-+CNO-(추정상 단백질과 펩티드로부터 주로 나오는 단편)의 PO3 -에 대한 비율은 천식을 가진 환자와 낭성 섬유증을 갖는 환자들 중에서 높았다. 이 비율은 기도 질환 때문에 공간으로의 혈장 단백질 누출을 반영한다.
b. 단백질 및 펩티드
기관지 폐포 세척액의 단백질 분석은 샘플에서 존재하는 다수의 단백질을 나타내었다. 분석은 2D 겔 및 질량 분광분석법을 사용하여 수행하였다. 특히 면역염증 과정, 세포 성장, 산화제-항산화제 및 프로테아제-항프로테아제 시스템에 수반된 단백질과 또한 미지의 기능을 갖는 단백질. 예를 들면 BAL의 단백질 연구는 알러지 천식 환자에 대해 수행되었다. 이 연구에서, 1592개의 단백질이 확인되었고 이것들 중 160개가 대조군과 비교하여 환자들에서 다르게 발현되었다. 가장 풍부한 단백질은, 아마도 혈액-공기 장벽으로부터의 확산으로부터 유도되는 혈장 단백질이다. 혈장 단백질의 증가는 아마도 삼출 또는 손상에 기인한다. BAL에서 검출된 펩티드 및 단백질의 몇가지는 호기 입자들에서 또한 존재할 가능성이 크다.
기도에서 질환에 대한 바이오마커인 펩티드 및 단백질은 엔도텔린-1, 인터류킨-4, 인터페론-g, 계면활성제 단백질 A-D 및 Clara 세포 단백질 16을 포함한다. 이들 분자는 ESI-MS 및 MALDI-MS로 또는 면역측정(immuno-assays)에 의해 검출될 수 있다. 더 많은 유형의 바이오마커가 본 발명에서 검출될 가능성이 높은데 더 적은 수의 입자가 수집되는 호기된 호흡 응축물을 사용하는 것보다 입자의 수집이 더 효율적이기 때문이다. 수집된 샘플에서의 단백질을 트립신과 같은 단백질분해 효소로 처리하는 것은 특정 단백질 세트에 독특한 패턴을 일으키게 되는 몇가지 펩티드 단편을 가져올 것이다.
단백질의 포스포릴화 및 글리코실화와 같은 번역후 변형의 조사는 또한 바이오마커를 위한 잠재적 타겟이다. 나쁜 포스포릴화 패턴은 몇가지 질환의 부분인 것이 공지되어있다.
기도에서 바이오마커의 또다른 중요한 부류는 병원균 및 환경 독소에 대해 기도를 보호하는 점액섬모 방어에 기여하는 뮤신 당단백질이다. 천식, COPD 및 낭성 섬유증을 갖는 환자들에 대해, 당단백질의 과생산이 있다. 당단백질의 분석은 그것들의 가변적 글리코실화 패턴으로 인해 약간의 어려움이 있지만 다른 호흡기 질환에 그것들이 수반되는 것으로 인해 이 화합물 군을 추구하는 것은 여전히 가치가 있다. 당단백질을 분석하는데에 이점은 어피니티 크로마토그라피에 의한 그것들의 용이한 정제이다. 더 나아가서, 관찰된 단백질 글리코실화 패턴의 변동은 질환에 관련될 것이 예상되고, 따라서 잠재적 바이오마커로서 고려되어야 한다.
c. 세포 물질 및 유전자 발현
호기된 입자는 유전자 정보를 갖는 물질, 특히 DNA 및 RNA를 함유하는 세포 또는 세포 구조물을 함유할 것이다. 이 세포 물질은 기도의 세균, 바이러스, 또는 세포에 기인할 수 있다. 이러한 물질의 유전자 발현의 분석은 특정 질환의 병인에 대한 새로운 정보를 제공할 수 있고, 아니면 특정 질환을 진단하는 고도의 특이적이고 민감한 수단으로서 사용될 수 있다. 방법은 따라서 폐렴 및 COPD의 악화와 같은 질환에서의 병인을 확인하기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 예를 들어서 종종 임상 문제인 낭성 섬유증에서 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)와의 콜로니형성의 조기 검출을 위해 사용될 수 있다.
d. 금속
철, 카드뮴, 납, 알루미늄, 구리와 같은 EBC에서의 금속에의 노출을 추적하는 것이 가능하였다. 금속은 가장 예상되기는 호기된 입자에 결합된 EBC로 운반된다. 이것은 방법이 또한 철, 아연, 카드뮴 또는 알루미늄과 같은 공해의 여러가지 구성성분들에의 노출을 모니터링하는 가능성을 갖는다는 것을 암시한다. 주위 나노입자들에서 금속에의 노출은 또한 호흡기 질환의 발달과 결합되었다.
실시예
실시예 1. 네명의 건강한 대상자로부터의 호기된 입자를 실리카 웨이퍼에 수집하였다. 입자의 농도는 광학 입자 계수기(Grimm 1.108)에 의해 기록하였다. 높은 입자 생산을 얻기 위해 힘을 준 호기(코는 막은 상태로)를 행하였다. 대상자를 그들의 개인적인 1초에 최대 힘을 준 내쉰 부피(maximal forced expired volume in one second: FEV1)의 80%에 해당하는 반복된 연속 호기를 행하도록 훈련시켰다. 타겟 흐름으로부터 10%의 편차는 허용가능한 것으로 생각되었다. 제 1 일 아침에 15분 동안 샘플채취를 행하였고 유사한 방식으로 제 2일에 반복하였다.
실리카 웨이퍼 상의 호기된 입자의 화학적 조성을 비행 시간형 2차 이온 질량 분광분석법(TOF-SIMS IV IONTOF GmbH)을 사용하여 분석하였다. 25 keV Bi3+ 주 이온을 스폿 둘레에 입자들이 집중된 500 x 500 μm2 의 면적에 걸쳐 래스터하였다. 포지티브 및 네거티브 2차 이온의 질량 스펙트럼을 최대 분해능에 최적인 기기로 기록하였다. 총 분석 면적으로부터 또는 관심있는 선택된 영역으로부터의 스펙트럼과 선택된 이온들에 대한 이미지를 기기 소프트웨어를 사용하여 기록된 원 데이터 파일로부터 추출하였다. 스펙트럼에서 피크의 할당을, 순수한 물질로부터 및 다른 질량 분광분석법으로부터의 공개된 데이터로부터의 기준 스펙트럼과 비교하여 행하였고, 할당을 또한 이론적 동위원소 패턴과 비교하여 조절하였다. 확인된 피크의 상대적 강도를 각각의 스펙트럼에서의 총 이온 강도에 대해 정규화에 의해 계산하였다.
도 3은 한 대조군 대상자로부터 입자 스폿의 포지티브(도 3a) 및 네거티브(도 3b) TOF-SIMS 스펙트럼이다.
도 4는 한 대조군 대상자로부터 호기된 입자를 갖는 한 스폿의 TOF-SIMS 이미지이다.
도 5는 시간에 대한 호기된 입자(0.5-2.0 μm)의 농도를 나타낸다.
도 6은 건강한 대상자와 천식 또는 낭성 섬유증을 갖는 환자의 파일럿 스터디에서 (CN+CNO)/PO3 - 비율을 나타낸다.
하기 표 1은 호기된 입자의 TOF-SIMS 스펙트럼의 피크의 m/z 비율의 할당을 나타낸다. 인지질의 분자종은 x:a로 칭하고, 이때 x는 탄소의 수이고 a는 이중결합의 수이다.
Figure pct00001
하기 표 2는 15분 샘플채취 기간에 대해 호기된 입자(0.5-2.0 μm)의 총 호기된 부피 및 평균 농도를 나타낸다.
Figure pct00002
모든 입자 샘플은 인지질로부터의 강한 신호를 얻었다(도 2 및 4 그리고 표 1). 포스파티딜콜린(PC)의 다른 종들을 포지티브 방식으로 양성자화 또는 알칼리금속 양이온화 분자 이온으로서 검출한 한편, 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜이노시톨(PI) 및 포스파티드산(PA)을 네거티브 방식으로 탈양성자화 이온으로서 검출하였다(표 1). 인지질의 조성은 기관지 폐포 세척액(BAL) 체액에서 조기 발견된 것과 일치하였고, 가장 가능하게는 호기된 입자가 하부 기도로부터 유도됨을 가리켰다.
실시예 2. 대상자들을 그들의 개인적인 1초에 최대 힘을 준 내쉰 부피(FEV1)의 80%에 해당하는 반복된 연속 호기를 행하도록 훈련시켰다. 네명의 자원자, 네명의 천식환자 그리고 낭성 섬유증을 갖는 네명의 환자가 각각 10회의 힘을 준 호기를 행하였다. 크기 0.5-2.0 μm의 호기된 입자를 실리카 웨이퍼에 수집하였다. 광학 입자 계수기로 입자 농도를 실시간 측정하였다. 샘플채취 전에 입자 없는 공기의 3분 호흡의 세척 기간을 적용하였다. 실리카 웨이퍼를 비행 시간형 2차 이온 질량 분광분석법(TOF-SIMS)으로 분석하였다. 몇가지 부류의 인지질, 즉 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜이노시톨(PI) 및 포스파티드산(PA)이 입자들에서 검출되었다. 군들 간에 약간의 차이가 관찰되었다. PC 신호들의 합계와 PG 신호들의 합계의 비율은 대조군과 비교하여 천식환자와 낭성 섬유증을 갖는 환자들 간에 높아지는 경향이 있었다. 또한, 단백질 및 펩티드에 특징인 것으로 알려진 신호(CNO-)는 대조군과 비교하여 천식환자와 낭성 섬유증을 갖는 환자들의 샘플에서의 인지질과 비교하여 높아 있었다(도 6).
실시예 3. 대상자들은 힘을 준 호기를 20분 동안 행하였다. 크기 0.5-2.0 μm의 호기된 입자들을 실리카 웨이퍼에 수집하였다. 실리카 웨이퍼를 DNA 및 RNA에 강하게 결합하는 형광 시약, DAPI(4,6-디아미디노-2-페닐인돌)로 염색하였다. 입자 스폿에 강한 신호가 얻어졌고 호기된 입자가 핵산을 함유함을 가리킨다.
실시예 4. 두명의 대상자가 150 L 공기를 2회 호기하였다; 한번은 입자 수집을 위해서이고 한번은 호흡 응축물 수집을 위해서 이었다. 호기된 입자들은 실리카 웨이퍼로부터 탈착되었고 호흡 응축물은 ELIZA에 의해 계면활성제 단백질 A의 분석 전에 농축시켰다. 계면활성제 단백질 A(Sp A)의 총량은 호기된 호흡 응축물에서 발견된 것들보다 호기된 입자들에서 6배 더 높았고 100 μl 혈청에서보다 4배 더 높았다. Sp A의 분석은 시험했을 때 높은 개체내 재현성(다른 세 경우에서 시험했을 때 두 대상자에 대한 CV 5.4)을 나타내었다.
개발된 샘플링 방법은 호기된 공기에서의 새로운 바이오마커의 검출 및 호흡기 질환의 모니터링을 위한 높은 잠재성을 갖는다.

Claims (16)

  1. 대상자의 의학적 상태를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
    a. 상기 대상자에 의해 호기된 입자들을 수집하는 단계;
    b. 상기 입자들을 그것들의 질량 또는 크기에 따라 분류하는 단계,
    g. 상기 입자들의 화학물질 함량을 분석하는 단계
    를 포함하여, 따라서 상기 대상자의 의학적 상태가 결정되도록 하는, 대상자의 의학적 상태를 결정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    c. 상기 입자들을 그것들의 질량 또는 크기에 따라 분류하여 상기 입자들의 입자 분포 프로파일을 얻는 단계;
    d. 상기 대상자에 의해 호기된 입자들의 입자 분포 프로파일을 기준 입자 분포 프로파일과 비교하는 단계;
    e. 대상자의 입자 분포 프로파일과 기준 입자 분포 프로파일 간의 유사성 및/또는 편차를 기록하는 단계; 그리고
    f. 대상자의 입자 분포 프로파일과 기준 입자 분포 프로파일 간의 편차 또는 유사성을 대상자에서 한가지 이상의 의학적 상태에 할당하는 단계; 그리고 선택적으로
    g. 상기 입자들의 화학물질 함량을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 의학적 상태는 기관지 천식, 낭성 섬유증, 만성 폐쇄 폐질환(COPD), 간질 폐질환, 사르코이드증, 전신 홍반 루프스(SLE)와 같은 전신 질환에 있어서 폐 진입, 폐렴, 세균 집락 또는 바이러스 감염과 같은 폐 감염, 심부전증(예를 들면 엔도텔린-1), 고콜레스테롤혈증(콜레스테롤이 호기된 입자에서 발견됨), 당뇨병(인슐린이 입자에서 발견됨), 대사증후군, 질환 또는 노출에 대해 증가된 유전적 민감성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 의학적 상태는 기관지 천식, 낭성 섬유증, 만성 폐쇄 폐질환(COPD), 간질 폐질환, 사르코이드증, 전신 홍반 루프스(SLE)와 같은 전신 질환에 있어서 폐 진입, 폐렴, 세균 집락 또는 바이러스 감염과 같은 폐 감염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 기준 입자 분포 프로파일은 주어진 의학적 상태를 갖지 않은 환자로부터 얻어질 수도 있고, 단계 e.는 대상자의 입자 분포 프로파일과 기준 입자 분포 프로파일 간의 편차를 기록하는 단계를 수반하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2 항, 제 4 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 입자 분포 프로파일은 주어진 의학적 상태를 갖는 환자로부터이고, 단계 e.는 대상자와 환자의 입자 분포 프로파일 간의 유사성을 기록하는 단계를 수반하여, 대상자에서 상기 주어진 의학적 상태의 결정을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. a. 대상자에 의해 호기된 입자들을 수집하는 단계; 그리고
    b. 상기 입자들을 그것들의 크기 또는 질량에 따라 분류하여 상기 입자의 입자 분포 프로파일을 얻는 단계를 포함하는, 호기된 호흡 입자의 입자 분포 프로파일을 제공하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 입자들은 관성 충돌기(10)를 사용하여 그들의 질량에 따라 분류되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 충돌기(10)는 입구(12) 및 출구(14)를 가지며, 상기 충돌기(10)는 입자(P)를 포함하는 기체 스트림(A)이 입구(12)를 통해 충돌기(10)에 들어오고 차례로 각 스테이지(20, 30, 40, 50...)를 통과한 후 상기 출구(14)를 통해 충돌기(10)를 나가도록 배치된 다수의 스테이지(20, 30, 40, 50...)를 포함하며;
    여기서 각 스테이지(20, 30, 40, 50...)는 기체 스트림(A)을 수집판(33, 43, 53...)으로 향하게 하는 구멍(22, 32, 42, 52...)을 갖는 파티션(21, 31, 41, 51...)에 의해 인접 스테이지(20, 30, 40, 50...)로부터 분리되고, 각 수집판(33, 43, 53...)의 주 면은 기체 스트림(A)의 흐름 방향에 실질적으로 수직으로 배치되며;
    이로써 호기된 입자는 기체 스트림(A)에서 상기 관성 충돌기(10)를 통과하고; 일차 기체 스트림(A)이 차례로 각 스테이지(20, 30, 40, 50...)에서 각 수집판(23, 33, 43, 53...)을 향하도록 하며; 제 1 스테이지(30)에 위치된 적어도 제 1 수집판(33)은 제 1 질량의 입자들을 수집하고 제 2 스테이지(40)에 위치된 적어도 제 2 수집판(43)은 제 2 질량의 입자들을 수집하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 입자들은 입자 계수기(116)를 사용하여 그들의 크기에 따라 분류되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 입자들은 그것들의 크기 또는 질량에 따라 분류된 후, 수집판을 먼저 세척해 내거나 세척해 내지 않고, 입자들을, 비행 시간형 2차 이온 질량 분광분석법(TOF-SIMS), 매트릭스 도움 레이저 탈착 이온화 질량 분광분석법(MALDI-MS), 표지된 항체에 기초한 생화학적 측정 또는 프로토콜, 정량 PCR 분석, 주사 전자 현미경(SEM), 기체 크로마토그라피 질량 분광분석법(GC-MS), 액체 크로마토그라피 질량 분광분석법(LC-MS), 표면 플라스몬 공명(SPR), 형광 분광학, TOC(총 유기 함량) 분석, 원소 분석 및 유도 결합 플라즈마 질량 분광분석법(ICP-MS)으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 한가지 분석 기술에 의해 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 호기된 입자를 수집 및 분류하는 시스템(100)으로서, 상기 시스템은
    a. 제 1 개구부(112)와 제 2 개구부(113)를 갖는 저장소(114);
    b. 저장소(114)의 제 1 개구부(112)에 연결된 2방향 마우스피스(110);
    c. 입구(12)와 출구(14)를 갖는 관성 충돌기(10)를 포함하며, 상기 충돌기(10)는 입자(P)를 포함하는 기체 스트림(A)이 입구(12)를 통해 충돌기(10)로 들어오고 차례로 각 스테이지(20, 30, 40, 50...)를 통과한 후 상기 출구(14)를 통해 충돌기(10)를 나가도록 배치된 다수의 스테이지(20, 30, 40, 50...)를 포함하며;
    여기서 각 스테이지(20, 30, 40, 50...)는 주 기체 스트림(A)을 수집판(33, 43, 53...)으로 향하게 하는 구멍(22, 32, 42, 52...)을 갖는 파티션(21, 31, 41, 51...)에 의해 인접 스테이지로부터 분리되고, 각 수집판(33, 43, 53...)의 주 면은 기체 스트림(A)의 흐름 방향에 실질적으로 수직으로 배치되며; 관성 충돌기의 입구(12)는 저장소(114)의 제 1 개구부(112)에 연결되는, 호기된 입자를 수집 및 분류하는 시스템(100).
  13. 제 12 항에 있어서, 각 스테이지(20, 30, 40, 50...)는 다른 스테이지(20, 30, 40, 50...)에서의 수집판(33, 43, 53...)과 다른 분석물을 검출하기에 적합한 수집판(33, 43, 53...)을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템(100).
  14. 제 12 항 또는 제 13 항의 시스템(100)에 사용하기에 적합한 수집판(33, 43, 53...).
  15. 제 14 항에 있어서, 적어도 한 표면이 예를 들어서 소수성 물질 또는 항체와 같은 물질로 코팅함으로써 변형되어 있는 것을 특징으로 하는 수집판(33, 43, 53...).
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 수집판에의 입자의 결합에 반응하여 검출되도록 수집판(33, 43, 53...)의 전류 또는 커패시턴스의 변화를 가능하게 하는 전기 연결부를 포함하는 것을 특징으로 하는 수집판(33, 43, 53...).
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