KR20100075493A - 퇴행성 질환의 치료를 위한 신경내분비 인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퇴행성 질환과 같은 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자(repellent factor) 및/또는 폴리펩티드의 용도, 특히, SLIT3 또는 NETRI N1 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 SLIT3의 폴리펩티드 단편, 상기 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

퇴행성 질환의 치료를 위한 신경내분비 인자{Neuroendocrine factors for treatment of degenerative diseases}

본 발명은 퇴행성 질환, 특히, 연골 결손(cartilage defect)을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자(repellent factor) 및/또는 폴리펩티드, 특히, NETRIN1, SLIT3 단백질 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 SLIT3의 폴리펩티드 단편, 상기 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

외상성 및 퇴행성 관절 질환에서 연골 복구 및 재생은 정형외과학에서 여전히 주요한 과제로 남아있다. 연골 손상 및 퇴행성 질환은 상당한 통증 및 관절 기능의 점진적인 상실을 유발하고 성인 인구에서 장애 및 부동(immobility)을 초래하는 주요한 원인으로 작용한다. 연골의 내재적인 복구 능력은 생체 내에서 연골세포의 낮은 유사분열 능력 때문에 제한되고 성인에서 결과적으로 생성된 조직은 정상적인 연골보다 일반적으로 열등하다. 연골, 예를 들면, 관절 연골은 혈관계가 없기 때문에, 일반적으로 손상된 연골은 복구 반응을 유발할 정도로 충분한 자극을 받지 않는 것으로 사료된다. 정상적으로 연골 조직 중 연골세포는 손상된 혈관분포(vascularised) 조직에 존재하는 성장 인자 및 피브린 응괴(fibrin clot)와 같은 복구 자극제의 충분한 양에 노출되지 않는다.

관절의 기능적 완전성(integrity)은 구획 경계(compartment border)의 엄격한 분리에 의존적이다. 관절 구획 경계의 교차 및 연골 구획의 파괴가 류마티스 관절염(RA) 및 골관절염(OA)와 같은 염증성 및 퇴행성 관절 질환에서 발견된다.

빈번하게 연골 질환(예를 들면, 류마티스 관절염)은 윤활 조직으로부터 유입되는 윤활조직 섬유모세포(synovial tissue fibroblast, SF)와 같은 주변 조직 구획으로부터의 세포 집단의 침습적 거동 및 파괴적 거동을 특징으로 하거나 또는 그에 의해 악화된다. 윤활 섬유모세포(SF)를 통한, 연골 및 뼈와 같은, 결합(joint)의 관절 구조의 파괴는 RA 및 OA에서 결정적인 사건(event)이다 (Pap, 2003; Pap, 2007; Yasuda, 2006; Huber, et al., 2006).

파괴적인 구조적 변화의 추가적인 진행을 억제하기 위한 다수의 전략 및 파괴된 연골을 복구하는 능력을 갖는 신규한 작용제의 발견을 포함한, 손상된 연골의 재생 치료에 의해 질병을 반전시키기 위한 신규한 접근방법이 다양한 성공률로 수행되었다. 이 전략들은 골수-자극 기법, 자가 이식 및 동종(allogenic) 이식, 자가 연골세포 이식, 골막 이식, Pridie 천자(pridie drilling), 미세골절술(microfracturing)을 포함한 박리 연골성형술(abrasion chondroplasty) 및 자가 골연골 이식술(mosaicplasty)을 포함한다. 그러나, 이 시술들은 확실하지 않고, 소형- 및 중형- 국소 연골 및 골연골 결손에 한정된다. 자가 골연골 이식술은 공여 부위에서 결손을 생성해야 하는 요구, 불충분한 복구 결과 및 관절의 본래의 굽이(curvature)를 재형성(resrface)시키는 데 따른 기술적 어려움에 의해 제한된다(Kuroda, et al., 2007). 자가 연골세포 이식 기법은 충분한 수의 연골세포의 부족, 공여 부위 결손의 형성의 필요성, 낮은 효율성 및 높은 치료 비용을 포함한 여러 단점을 갖는다.

전구 세포의 증식 및 기능성 골 및/또는 연골 조직으로의 분화를 유도하는, TGF-β1, FGF-2, IGF-1, TP-508, OP-1 또는 GDF를 포함하는 다른 BMP와 같은 여러 성장 인자들, 또는 이들의 조합이 확인되었다. 특히, TGF-β1은 전구 세포의 연골형성 분화를 촉진하고 연골세포 분화를 강화시키는 것으로 확인되었다. IGF-1은 프로테오글리칸 및 타입 II 콜라겐 합성을 증가시키기 위해 동화(anabolic) 방식으로 작용한다. 그러나, 이 성장 인자들은 다소 특이성이 낮아서, 원치않는 부작용에 대한 위험도를 갖는다. BMP와 같은 다른 성장 인자들은 골원성 유전자를 유도하고, 따라서, 원치않는 골 형성을 유도할 가능성을 갖는다. 이 성장 인자 기술의 적용의 또 다른 한계는 전달 후에 일시적인 생물학적 효과만을 가능하게 하는, 외래 성장 인자들의 비교적 짧은 생물학적 반감기이다.

염증촉진성(pro-inflammatory) 사이토카인, 프로테아제 및 메탈로프로테이나아제(metalloproteinase)가 OA 및 RA 환자에 존재하는 구조적 변화 및 일부 징후 및 증상을 유발하는 것으로 보인다. OA 및 RA에 대한 치료로서 이 효소들의 합성/활성의 억제가 집중적인 연구의 초점이 되었다.

현재까지, 가장 유망한 전략은 여전히 MMP의 활성을 차단할 수 있는 소형 화학 물질(small chemical entity)의 이용이다. 그러나, MMP 저해제는 부작용을 유발할 수 있고 질병 진행의 큰 경감을 보이지 않았다.

또한, 하기에 인용된 다른 새로운 전략들이 현재 개발되고 있다.

US2003068705는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 305개의 핵산을 개시하며, 이들 중 일부(예를 들면, IL-17 동족체(homolog) 또는 관련된 폴리펩티드)는 연골세포의 증식 또는 분화를 자극하기에 유용한 것으로 주장되며, 따라서, 스포츠 손상(sport injuries) 또는 관절염과 같은 다양한 골 및/또는 연골 질환에서 이용될 수 있다.

WO20001090357은 발달 결함, 염증성 질환의 치료 또는 면역 반응의 조절을 위한 단백질을 제공한다.

US2003044917은 연골세포의 증식 및 분화를 촉진하는 인간 PRO 폴리펩티드, 및 관절염 및 스포츠 손상과 같은 다양한 골 및/또는 연골 질환의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다. 그러나, 서열 6029만이 양성으로 테스트되었다.

액손 유도 분자(axonal guidance molecule)(예를 들면, Netrin, Slit)와 같은 또 다른 종류의 단백질이 염증 세포 이동(inflammatory cell movement)을 조절하기 위한 것으로 시사되었다 (WO0164837, WO05074556, WO00055321, WO0190357). WO0164837, WO03075860, WO06019904 및 US 2006/0153840은 신경병증 및 암의 치료를 위해 혈관형성, 세포의 증식 및/또는 이동을 촉진하는 방법을 개시한다.

WO2002081745는 골다공증/골 질환의 진단, 골형성의 촉진 및/또는 골다공증/골 질환의 예방을 위한 SLIT3의 용도를 교시한다.

WO99/23219, JP11164690 및 JP11075846은 인간 SLIT3 폴리펩티드 서열을 개시한다.

WO00/55321은 척추동물 SLIT DNA 서열(즉, 제노푸스(Xenopus) 및 인간 Slit2), 단백질 및 그의 용도를 개시한다.

그러나, 선행 기술에 개시된 방법 및 조성물 중 어느 것도 부작용 없이 치료 대상 질병의 진행을 크게 경감시키는 것으로 입증되거나 또는 파괴적 과정의 제거 및 연골 조직의 실질적인 복구 및 대체를 가져오지 못했다.

따라서, 진행성 연골 파괴, 특히, 외상 후 및 전층 결손(full-thickness defect) 및 표면 결손(superficial defect)과 같은 만성 질환 및 관절염(예를 들면, 골관절염, 류마티스 관절염), 반월판 파열(meniscal tears), 전방 십자 인대(ACL) 손상의 경우, 진행성 연골 파괴의 개선된 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 그의 용도에 대한 요구가 존재하며, 이는 현재 이용가능한 방법 및 조성물과 연관된 문제들을 극복한다.

따라서, 본 발명의 목적은 연골 결손의 복구 또는 재생 및/또는 관절염 및 스포스 손상과 같은 연골 질환 또는 장애의 질병 진행의 저해를 위한 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 윤활 세포 이동의 저해 및 따라서, 연골 파괴의 저해를 위한 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연골 질환 및 보다 구체적으로 염증성 연골 질환 및 윤활 섬유모 세포 침습 또는 판누스(pannus) 형성을 수반하는 질환의 치료에서 적합한 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연골 재생을 위해 주변으로부터 중간엽 줄기 세포의 유인(attraction)/화학주성을 위한 조성물 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연골 형성의 유도 및/또는 연골세포의 증식 또는 분화의 자극을 위한 조성물 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 문제는 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자(repellent factor)의 용도에 의해 해결된다. 본 발명은 특히, 퇴행성 질환, 바람직하게는 a) 윤활 섬유모세포(synovial fibroblast)의 관절 연골 또는 비-관절 연골의 침윤 또는 이동과 연관되고 및/또는 판누스(pannus) 형성과 연관되거나, b) 세포, 바람직하게는 섬유모세포, 또는 윤활 섬유모세포의 관절 연골 또는 비-관절 연골로의 감소된 부착과 연관된 퇴행성 연골 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도에 관한 것이다. 특히, 기피 인자는 윤활 섬유모세포와 같은 섬유모세포-유사 세포의 이동, 윤활 세포 과다형성의 억제를 조절 또는 저해하고 및/또는 연골 유도 및/또는 재생을 위한 중간엽 줄기 세포 및/또는 연골세포의 이동, 증식 및/또는 분화를 촉진하고, 그에 의해 퇴행성 질환의 진행을 변경, 저해, 예방 및/또는 치료한다. 특히, 기피 인자는 골증식체(osteophyte) 형성, 바람직하게는 환자에서 골증식체 형성을 억제, 변경 또는 예방한다.

특히, 본 발명은 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도로서, 상기 기피 인자는 SLIT3 (서열번호 1)의 단편인 것인 용도에 관한 것이다. 상기 단편은 바람직하게는 1523개 이하의 AA으로 구성되고, 바람직하게는 1200개 이하의 AA로 구성되며, 보다 바람직하게는 1000개 이하의 AA으로 구성되고, 가장 바람직하게는 800개 이하의 AA으로 구성되며, 특히, 20개 이상의 AA, 바람직하게는 50개 이상의 AA, 보다 바람직하게는 100개 이상의 AA으로 구성된 길이이다. 바람직하게는, SLIT3의 단편은 서열번호 1의 34번 내지 917번, 47번 내지 863번, 66번 내지 857번, 279번 내지 863번, 279번 내지 857번, 279번 내지 724번, 279번 내지 504번, 311번 내지 432번, 335번 내지 432번 또는 312번 내지 437번 위치의 서열을 포함한다. 본 발명에 따르면, 기피 인자, 특히, SLIT3이 관절 연골의 완전성(integrity)을 유지하는 것인 연골 분획 경계(cartilage compartment border)에서 발현되는 것으로 확인되었다. 추가적인 기피 인자는 섬유모세포, 신경 섬유 및 혈관의 관절 연골로의 이동을 저해한다. 만성 관절 질환에서 판누스 조직의 연골로의 침윤은 변형된 기피 인자 발현 후에만 가능하기 때문에, 이 침윤은 기피 인자, 특히, SLIT3에 의해 조절되고, 결과적으로, 이와 연관된 퇴행성 질환이 치료될 수 있다.

본 발명자들은 기피 인자의 일원들 및 그들의 수용체가 골관절염 및 관절염과 같은 퇴행성 질환을 앓는 환자의 윤활 섬유모세포에서 상이하게 발현된다는 것을 입증했다. 이것은 Lightcycler에서 수행된, 배양된 일차 인간 윤활 섬유모세포로부터 분리된 cDNA의 유전자 정량적 RT-PCR에 의해 분석되었다. OASF에서 매우 약한 발현에 비해 RASF에서 현저하게 강화된 ROBO3 mRNA 발현을 제외하고, ROBO 및 SLIT은 골관절염 환자의 윤활 섬유모세포(OASF) 및 류마티스 관절염 환자의 윤활 섬유모세포(RASF)에서 유사하게 발현된다. SLIT1 mRNA 수준은 SLIT2 또는 SLIT3에 비해 명확하게 저하되나, OASF에서 SLIT의 발현은 RASF에서보다 일반적으로 어 높은 것으로 보인다.

ROBO1 및 ROBO2는 분화된 연골세포 및 OA 연골세포 모두에서 발현되나, OA 연골세포에서의 발현이 분화된 연골세포 대비 10배(ROBO1) 및 심지어 100배(ROBO2) 증가된다. ROBO3의 발현은 두 세포 종류 모두에서 측정되지 않았다. 모든 3종의 SLIT가 분화된 연골세포 및 OA 연골세포에서 발현되고, 분화된 세포에서보다 OA에서 더 높은 수준으로 발견된다.

UNC5B 및 UNC5C는 OA 환자 및 RA 환자의 윤활 섬유모세포에서 유의성 있게 상향조절되었다.

또한, 보다 높은 계대의 윤활 섬유모세포에서 RASF에서 ROBO3 발현의 유의성있는 상실이 SLIT3에 대한 기피 활성(repulsive activity)의 상실에서 중요한 단계일 수 있다. 본 발명자들에 의해 제시된 이 발견은 RA(및 OA)에서 윤활 섬유모세포 중 ROBO3 수용체의 조절상실(deregulation)이 섬유모세포의 공격성과 상관된다는 것을 시사한다.

또한, 본 발명은 NETRIN1, SLIT3 및 그의 단편과 같은 기피 인자가 윤활 섬유모세포와 같은 세포의 공격적 행동 및 이 세포들의 연골 또는 연골내로의 이동의 조절에 관여된다는 발견에 근거하고, 이는 류마티스 관절염과 같은 퇴행성 질환에서 주요한 문제이다. 특정한 분자에 한정되지 않으면서, 본 발명은 NETRIN1과 SLIT3 및 그의 단편과 같은 기피 인자가 OASF 및 RASF 세포의 이동을 억제한다는 발견에 근거한다. 이 놀라운 발견 때문에, 기피 인자가 윤활 섬유모세포와 같은 섬유모세포-유사 세포의 변화된 이동을 포함한 세포의 이동 및 침윤 및/또는 뒤이어 관절 연골 또는 비-관절 연골과 같은 조직의 파괴 또는 변화된 기능을 유발할 수 없는 판누스 형성과 관련된 다양한 질환의 치료를 위해 이용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 놀라운 발견을 고려할 때, 기피 인자는 본 명세서에 기재된 다양한 질환 및 질환 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 약제로서 이용될 수 있다. 개별적인 질환은 특히, 퇴행성 질환, 바람직하게는 전술된 것들을 포함한, 퇴행성 관절 및/또는 디스크 질환과 같은 퇴행성 연골 질환을 포함한다. 특히, 본 발명에 따르면, 상기 질환은 퇴행성 추간판증(degenerative disc disease), 반월판 파열(meniscus tears), 전방십자인대(ACL) 손상, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 연소기 만성 관절염(juvenile chronic arthritis), 근성 가성관절염(rhizomelic pseudoarthritis), 류마티스 다발성 관절염, 윤활막염 또는 융모결절성 윤활막염으로부터 선택된다.

본 발명에 따르면, 연골 관절 또는 연골 질환은 예방되거나 또는 치료될 수 있다.

본 발명자들의 또 다른 발견은 연골세포로 분화될 수 있는 능력으로 알려진 인간 중간엽 줄기 세포의 이동성 행동에 대한 기피 인자들의 영향이다. 이동의 유도는 NETRIN1과 같은 인자들을 하부 챔버(lower chamber)로 첨가한 후 Boyden Chamber 분석법을 이용하여 관찰되었고, 이는 기피 인자가 윤활막 세포 또는 윤활막 내피 세포(lining cell)와 같은 중간엽 줄기 세포를 위한 화학유인물질(chemoattractant)로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 발견에 따르면, 이동성 세포들의 파괴적 행동이 저해될 수 있을 뿐 아니라, 파괴된 조직의 재생을 위한 세포가 유인될 수 있다. 따라서, 기피 인자들은 퇴행성 질환의 치료를 더 개선한다.

추가적인 발견은 인간 중간엽 줄기 세포의 연골형성 세포 계통으로의 유도된 분화이고 이는 SLIT3과 같은 기피 인자가 연골형성을 유도할 수 있고 따라서 재생 및 연골 질환의 치료를 위해 유용하다는 것을 보여준다.

따라서, 본 발명은 환자에서 세포의 연골로의 이동, 증식, 및/또는 부착을 조절하는 기피 인자의 유효량을 투여하는 것에 의해 공격적 섬유모세포에 의해 유발된 연골 결손, 특히, 퇴행성 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도를 포괄한다.

바람직하게는, 환자에게 투여되는 기피 인자의 유효량은 환자의 체중에 대해, 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg, 가장 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg 이다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "기피 인자(repellent factor)"는 특정 농도 또는 농도 범위에서 조직 경계, 예를 들면, 연골 경계를 통과한 세포의 이동을 저해할 수 있는 활성제를 의미한다. 따라서, 예를 들면, 공격적인 윤활 섬유모세포의 연골 및/또는 골로의 이동이 저해되거나 변화될 수 있다. 이는 또한 판누스 형성의 추가적인 진행 또는 연골로의 판누스 침습의 저해를 포함한다. 기피 인자는 신경 섬유의 액손 유도 신호(axon guiding cue)로서의 발아(sprouting)를 예를 들면, 기피 활성 또는 유인 활성에 의해 변화시킬 수 있다.

기피 인자는 신경계에서 액손 증식(axonal outgrowth)을 조절하는 액손 유도 분자(axon guidance molecule)로도 알려진 다수의 분자들을 포함한다. 그들은 네트린(NETRIN), SLIT, 세마포르(SEMAPHORE) 및 에프린(EPHRIN) 및 그의 수용체 뉴로필린(NEUROPILIN), ROUNDABOUT (ROBO), 및 UNC5 및 DCC 패밀리의 일원들을 포함한다 (Klagsbrun and Eichmann, 2005).

NETRIN은 라미닌 도메인에 대한 상동성을 갖는 분비 단백질의 패밀리이다. 이 패밀리는 NETRIN1, 2, 3 및 4로 구성된다. 그들은 라미닌-VI 도메인, EGF-유사 반복(repeat) 도메인 및 헤파린-결합 C-말단 도메인을 포함한다. NETRIN 수용체는 DCC 및 네오게닌으로 구성된, DCC(deleted in colorectal cancer) 수용체 패밀리, 또는 UNC5A, 5B, 5C, 5D를 포함하는 UNC5(uncoordinated-5) 패밀리이다. NETRIN은 혈관형성, 및 폐 분지형성(lung branching), 유선 발달 및 종양형성과 같은 형태발생에 관여되었다. DCC 및 네오게닌으로의 NETRIN의 결합은 세포 유인을 초래하나, UNC 수용체로의 결합은 기피(repulsion)를 조절하는 것으로 확인되었다.

SLIT는 초파리(Drosophila)에서 최초로 액손 유도 분자로 확인되었다. 포유동물 SLIT1, SLIT2 및 SLIT3 오르토로그(ortholog)는 4개의 루이신-리치 반복(leucine-rich repeat, LRR) 도메인, 9개의 EGF 도메인, 라미닌 G (LamG) 도메인, 및 C-말단 시스테인 매듭(cystine knot)을 갖는 대형 분비 단백질이다. SLIT1 mRNA는 뇌, 역형성 희소돌기아교세포종(anaplastic oligodendroglioma), 및 Jurkat T 세포에서 발현된다. SLIT2 및 SLIT3 mRNA는 배아체(embryoid body) 형성을 갖는 배아 줄기(ES) 세포에서 공-발현된다(Katoh and Katoh, 2005; Vargesson, et al., 2001). Slit2는 아니나, Slit3은 미토콘드리아 내에 위치하며, 이는 Slit3이 다른 Slit 단백질에 의해 공유되지 않는 잠재적으로 독특한 기능을 갖는다는 것을 암시한다 (Little, et al., 2001). Slit은 Roundabout 수용체로의 결합에 의해 작용한다. 피브로넥틴 타입 III 및 면역글로불린-유사 도메인(Ig)을 공유하나, 세포질 도메인(cytoplasmic domain)은 다양한 4개의 인간 Robo 막관통 수용체(transmembrane domain)(Robol, Robo2, Robo3 및 Robo4)가 있다 (Itoh, et al., 1998; Howitt, et al., 2004; Hohenester, et al., 2006). Slit 단백질은 성장 원추(growth cone)의 유인 또는 기피를 통한 액손 유도를 매개하는 것에 의해 배아 발달 동안 이동하는 세포의 세포-세포 상호작용 및 세포-매트릭스 상호작용의 조절에 관여되는 것으로 주로 알려져 있다. 지난 10년 동안, Robo-/Slit 시스템은 세포 부착을 매개하고 종양 혈관형성을 유도하는 것으로 설명되었다. Slit은 또한 초파리에서 근육 전구체 세포 이동, 백혈구 수송(leucocyte trafficking) 및 신장 유도(kidney induction)와 같은 다른 발생 과정에 관여된다(Klagsbrun and Eichmann, 2005).

세마포린(Semaphorin)은 뉴로필린(neuropilin) 1 및 뉴로필린 2와 같은 별개의 표면 수용체를 통해 신경 섬유에 대한 특이적 기피 작용을 갖는 표면 또는 국소로 분비된 신경 기피 인자(nerve repellent factor)이다. 클래스 III 세마포린은 SEMA A, B, C, 및 F를 포함한다. 에프린(Ephrin) 및 그의 수용체 Eph는 신경계 발생 및 혈관형성을 포함한 다양한 발생 과정에 관여하는 리간드 및 티로신 키나아제 수용체를 의미한다. 에프린 A 리간드 (Ephrin A1, A2, A3, A4, A5)는 EphA 수용체에 결합하는 GPI 고정 분자(anchored molecule)이고, 에프린 B 단백질(Ephrin B1-3)은 Eph B 수용체에 결합한다. 에프린은 또한 반대로(vice versa) 리간드인 Eph에 의해 결합되는 수용체로서 기능할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 기피 인자는 ROUNDABOUT 수용체 (예를 들면, ROBO1, 2, 3), DCC(Deleted in Colon Cancer)(예를 들면, DCC) 또는 UNC (예를 들면, UNC5A-D) 수용체의 효능제(agonist) 또는 길항제(antagonist)이다. 본 명세서에서 사용된, 효능제 또는 길항제는 ROUNDABOUT 수용체, DCC 또는 UNC 수용체의 활성을 활성화하거나 또는 억제하고, 바람직하게는 수용체와 리간드 간의 상호작용에 의해 전환(transduce)된 신호이거나 또는 리간드에 의해 차지되지 않은 수용체에 의해 전환된 신호의 억제이다.

일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 효능제, 길항제 및/또는 기피 인자는 NETRIN(예를 들면, NETRIN1, NETRIN2, NETRIN4, NETRING1), SLIT (예를 들면, SLIT1, SLIT2, SLIT3), 에프린(EPHRIN)(예를 들면, 에프린 A2, A4, A5) 및 세마프린(SEMAPHRIN)(예를 들면, 세마포린(SEMAPHORIN) 3A, 3B, 3C 및 3F), 그의 단편 및 그의 아미노산 서열의 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료(treating or treatment)"는 질병 또는 질환의 경감, 또는 질병 또는 질환과 연관된 증상의 경감, 상기 증상의 추가적인 진행 또는 악화의 중단을 의미한다.

용어 "예방(prevention)"은 질병 또는 질환의 예방(prevention or prophylaxis)을 포함한다.

용어 "연골 결손(cartilage defect)"은 연골 질환, 예를 들면, 외상 또는 퇴행 과정에 의해 유발된 연골의 변성을 포함한 연골 이상(cartilage abnormality)을 의미한다.

용어 "퇴행성 질환(degenerative disease)"은 골 구조를 포함하거나 또는 포함하지 않는 연골 퇴행 또는 파괴와 같은 손상된 연골 구조를 갖는 질환 또는 결손을 의미한다. 바람직하게는, 퇴행성 질환은 퇴행성 연골 질환이다. 이들은 턱관절 장애(temporomandibular joint disorder, TMD), 절구 테두리 장애(acetabular labrum disorder), 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 연소기 만성 관절염, 근성 가성관절염, 류마티스 다발성 관절염, 퇴행성 추간판증, 골연골 결손, 표층 연골 결손(superficial chondral defect), 박리성 골 연골염(osteochondritis dissecans), 전층 연골 결손(full-thickness chondral defect), 부분층 연골 결손(partial-thickness chondral defect), 반월판 파열, 전방십자인대(ACL) 손상, 윤활막 골연골종증(synovial osteochondromatosis), 강직성 척추염, 윤활막염, 또는 융모결절성 윤활막염을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 연골 결손 및 퇴행성 질환은 특히, 골다공증을 포함하지 않는다.

용어 "퇴행성 추간판증(degenerative disc disease, DDD)"은 특발성 요통(iopathic low back pain), 추간판 탈출, 내부 추간판 파열(internal disc disruption) 또는 추간판 균열(fissured discs), 신경근병증, 척주관 협착증(spinal stenosis), 수핵 탈출증-유도 좌골신경통(herniated nucleus pulposus-induced sciatica), 좌골신경통, 특발성 척주측만증(idiopathic scoliosis) 및/또는 척수병증과 같은 여러 질환에서 나타날 수 있는 하나 이상의 추간판의 수핵(nucleus pulposus)의 프로테오글리칸과 수분 함량의 점진적인 손실을 부분적으로 특징으로 하는 만성 과정(chronic process)이다. 추간판 퇴행 등급은 수술전 MRI의 분석에 의해 결정될 수 있다.

용어 "관절 연골(articular cartilage)"은 관절 내의 뼈의 부분의 표면을 뒤덮고 관절에서 운동을 가능하게 하기 위해 두 개의 뼈 간의 완충물(cushion)로 작용한다. 정상적인 건강한 연골은 유리 연골(hyaline cartilage)로 설명된다. 관절 연골은 프로테오글리칸, 주로 아그레칸(aggrecan), 콜라겐 타입 II 원섬유, 기타 단백질 및 물이 풍부한 세포내 물질의 매트릭스에 임베딩된 특화된 세포(연골세포)로 구성된다. 상기 매트릭스는 그 내부에 임베딩된 연골세포에 의해 생성되고 유지된다. 연골 조직은 신경 및 혈관이 분포되지 않고, 기저 조직(underlying tissue)에 의해 영양분이 공급된다.

비-관절 연골(non-articular cartilage)은 관절 표면(articulating surface)을 포함하지 않고 섬유연골(fibrocartilage)(관절간 섬유연골(interarticular fibrocartilage), 예를 들면, 추간판의 반월판 및 섬유연골 포함) 및 탄력 연골(elastic cartilage)을 포함한다.

본 명세서에서 이용된 "윤활 세포(synovial cell)", "윤활막(synovium)" 또는 "윤활 섬유모세포(synovial fibroblast)"는 윤활막과 생리학적으로 연관된 세포 또는 윤활막 공간(synovial space)에 존재하는 세포; 관절의 윤활막 또는 윤활액으로부터 수득된 세포를 의미한다. 윤활막은 또한 윤활 관절의 비-연골 표면을 뒤덮는 세포 내층을 의미한다. 윤활막은 윤활 내층 세포(synovial lining cell), 및 관절낭과 융합되는 윤활하막(subsynovium)으로 구성된다.

용어 "판누스 조직(pannus tissue)"은 윤활 세포의 증식 및/또는 세포 또는 물질의 연골(예를 들면, 관절 연골)로의 침착과 같은 조직의 침식, 연골하(subchondral) 영역의 관여를 동반하거나 또는 동반하지 않는 관절 연골의 침식 또는 파괴를 의미한다. 연골하 골수로의 세포의 침식도 포함된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에서 해결하고자 하는 문제는 바람직하게는 골다공증이 아닌 퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 이용에 의해 해결되며, 상기에서, 기피 인자는 a) SLIT3 (서열번호 1) 또는 NETRIN1 (서열번호 10)의 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 상동성, 바람직하게는 90%, 95%의 상동성, 보다 바람직하게는 동일성을 가지거나, b) SLIT3 또는 NETRIN1의 활성 단편이거나, 또는 c) b)의 활성 단편의 아미노산 서열에 대해 85%, 90% 95% 이상의 상동성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다.

용어 "활성 단편(active fragment)"은 바람직하게는 예를 들면, SLIT3 폴리펩티드와 같은 성숙 전장 폴리펩티드와 동일한 수용체 또는 결합 파트너에 결합하는 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 결합은 예를 들면, 수용체 및 하류 캐스캐이드(downstream cascade)를 활성화하거나 또는 억제할 수 있다. SLIT3 단편 활성은 예를 들면, Biacore 결합 분석법, (Marlot et al., 2007)에 기재된 인 비트로 풀다운 분석법(pulldown assay), ELISA 단백질 결합 분석법 또는 면역침전과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법을 이용하여 ROBO 수용체로의 결합에 의해 결정될 수 있다. 단편의 활성은 또한 본 발명의 실시예 2, 3, 4, 6, 7, 또는 9에 기재된 분석법, 예를 들면, Boyden Chamber 이동 분석법, 증식 분석법 또는 실시예 6 및 7에 기재된 것과 같은 인 비트로 기능성 분석법을 이용하여 결정될 수 있다.

두 개의 아미노산 서열의 백분율 상동성(percent homology)을 결정하기 위해, 최적 비교 목적을 위해 서열들이 정렬된다(예를 들면, 다른 단백질 또는 핵산과의 최적 정렬을 위해 하나의 단백질 또는 서열에 갭(gap)이 도입될 수 있다). 그 후, 상응하는 아미노산 위치의 아미노산 잔기가 비교된다. 하나의 서열 중의 위치가 다른 서열 중의 상응하는 위치에서와 동일한 아미노산 잔기에 의해 차지되는 경우, 분자들은 그 위치에서 상동성이다.

두 개의 서열 간의 백분율 상동성은 서열들에 의해 공유되는 일치하는 위치의 갯수의 함수이다(즉, %상동성 = 일치하는 위치의 갯수/위치의 총 갯수 x 100).

전술된 방법 외에, 두 개의 서열 간의 백분율 상동성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 두 개의 서열의 비교를 위해 이용된 수학적 알고리즘의 바람직한, 비-한정적인 예는 Karlin and Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)의 알고리즘이다. 그와 같은 알고리즘은 Altschul 등 (1990 J. Mol. Biol. 215:403-410)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 내포된다.

BLAST 단백질 검색은 본 발명의 CCSRP에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, score=50, wordlength=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭이 도입된 정렬(gapped alignment)을 수득하기 위해, Gapped BLAST가 Altschul 등 (1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 개별적인 프로그램(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다. 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비-한정적 예는 Myers 및 Miller (CABIOS 1989)의 알고리즘이다. 그와 같은 알고리즘은 GCG 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 내포된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, 본 발명의 CCSRP에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해, PAM120 가중치 잔기 표(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 이용될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 도입된 정렬(gapped alighment)을 수득하기 위해, Altschul 등 (1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 기재된 바와 같이, Gapped BLAST이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 개별적인 프로그램 (예를 들면, XBLAST and NBLAST)의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다. 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비-한정적 예는 Myers 및 Miller (CABIOS 1989)의 알고리즘이다. 그와 같은 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 내포된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM 120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 이용될 수 있다.

단편은 바람직하게는 1523개 미만 또는 1522개 미만의 아미노산, 바람직하게는 1491개 미만, 900개 미만, 500개 미만, 400개 미만, 300개 미만, 200개 미만의 아미노산, 바람직하게는 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상의 아미노산 및 100개 이하, 200개 이하, 300개 이하, 400개 이하, 500개 이하의 아미노산으로 구성된 길이를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 기피 인자는 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로부터 선택된 아미노산 서열, 및 바람직하게는 아미노산 서열의 길이가 성숙 SLIT3 단백질보다 더 짧은 것인 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 서열은 길이가 1523개 또는 1522개의 아미노산으로 구성된 길이보다 더 짧고, 바람직하게는 1491개의 아미노산으로 구성된 길이보다 더 짧거나 또는 900개의 아미노산으로 구성된 길이보다 더 짧고, 바람직하게는 200개 내지 900개의 아미노산으로 구성된 길이이거나, 보다 바람직하게는 220개 내지 760개의 아미노산, 240개 내지 520개의 아미노산, 250개의 아미노산 내지 300개의 아미노산으로 구성된 길이이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 기피 인자는 적어도 서열번호 6, 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 성숙 SLIT3 단백질보다 더 짧다.

용어 "성숙 SLIT3 단백질(mature SLIT3 protein)"은 신호 펩티드 서열을 갖지 않는 인간 SLIT3 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 성숙 SLIT3 단백질은 서열번호 1의 33번 또는 34번 위치에서 시작되거나 또는 서열번호 2의 1번 또는 2번 위치에서 시작된다.

일부 구체예에서, 기피 인자는 서열번호 1 내지 9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 상동성을 가지며, 상기 아미노산 서열은 바람직하게는 성숙 SLIT3 단백질보다 더 짧다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 기피 인자는 적어도 서열번호 1의 34번 내지 917번, 47번 내지 863번, 66번 내지 857번, 279번 내지 863번, 279번 내지 857번, 279번 내지 724번, 279번 내지 504번, 311번 내지 432번, 335번 내지 432번 또는 312번 내지 437번 위치의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 기피 인자는 적어도 서열번호 1의 308번 내지 413번, 308번 내지 317번, 331번 내지 340번, 344번 내지 352번, 357번 내지 366번, 380번 내지 389번, 394번 내지 402번 또는 404번 내지 413번 위치의 아미노산 서열 또는 이들의 조합을 포함한다.

하나 이상의 Cys가 또 다른 아미노산, 특히, Ala에 의해 치환된 것인 기피 인자가 더 바람직하다. 서열번호 1 내지 9, 특히, 서열번호 2 내지 9로부터 선택된 서열을 포함하고, 하나 이상의 Cys가 또 다른 아미노산, 특히, Ala에 의해 치환된 것인 기피 인자가 바람직하다. 그와 같은 기피 인자의 바람직한 예는 85번 위치의 Cys를 Ala로 치환하는 것에 의해 서열번호 9로부터 유래된 서열번호 21이다.

바람직한 구체예에서, 기피 인자는 적어도 제2 루이신-리치 반복(LRR) 도메인 또는 상동성 루이신-리치 반복 도메인에서 당화(glycosylate)되지 않는다.

본 발명에서 용어 "제2 루이신-리치 반복 도메인(second leucine-rich repeat domain)"은 SLIT 단백질에 존재하는 보존된 루이신-리치 아미노산 서열을 의미한다. SLIT3의 루이신-리치 반복(leucine-rich repeat, LRR) 도메인은 아미노-말단 보존 영역 및 카르복시-말단 보존 영역(LRR-NR 및 LRR-CR)에 의해 플랭킹된 4개의 LRR(LRR1 내지 LRR4)로 구성된다 (Itoh, et al., 1998; Howitt, et al., 2004; Hohenester, et al., 2006). 제2 루이신 리치 도메인은 서열번호 1의 248번 내지 467번의 아미노산 서열을 포함한다. 상동성 루이신-리치 반복 도메인은 제2 루이신-리치 반복 도메인의 보존된 아미노산 교환을 갖는 아미노산 서열, SLIT1 및 SLIT2와 같은 다른 SLIT 패밀리 일원들의 상동성 영역 및/또는 서열번호 1의 248번 내지 467번의 아미노산 서열에 대한 80%, 85%, 90%, 95%의 상동성 영역을 의미한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 기피 인자는 비-당화되고, 보다 바람직하게는 기피 인자는 재조합 대장균 유래 단백질이다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 퇴행성 질환, 바람직하게는 퇴행성 연골 질환은 퇴행성 추간판증, 반월판 파열, 전방십자인대(ACL) 손상, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 연소기 만성 관절염, 근성 가성관절염, 류마티스 다발성 관절염, 융모결절성 윤활막염 또는 윤활막염으로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 관절 연골은 유리질 관절 연골이다.

바람직한 구체예에서, 비-관절 연골은 반월판 및 추간판의 군으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 및/또는 본 발명의 구체예의 단리된 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 바람직하게는 결손 부위에 국소로 또는 비-전신적으로(non-systematically) 주사되거나 또는 훨씬 더 바람직하게는 관절 내로, 윤활막 내로 및/또는 윤활액으로 주사되는 주사용 제제이다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 및/또는 본 발명의 구체예의 단리된 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들면, 정맥내 투여에 의해 전신적으로 투여되는 주사용 제제이다.

특정한 구체예에서, 약제학적 조성물은 치료를 필요로 하는 부위에 국소로 투여된다. 이는 예를 들면, 수술 동안의 국소 주입, 국소 적용, 주사, 카테터 또는 이식물에 의해 달성되고, 상기 이식물은 다공성이거나 또는 비-다공성이다.

본 발명에 속하는 약제학적 조성물의 다른 투여 경로는 피내 경로, 근육내 경로, 복막내 경로, 피하 경로, 비강내 경로 또는 경구 경로이다. 채택된 투여량 범위는 투여 경로, 및 치료대상 환자의 연령, 체중 및 상태에 의존적일 것이다.

환자에게 투여된 폴리펩티드의 적합한 양은 바람직하게는 환자의 체중 기준으로 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg, 가장 바람직하게는 0,1 mg/kg 내지 1 mg/kg이다.

본 발명의 기피 인자를 포함하는 약제학적 조성물 및/또는 하기 및 상기의 구체예의 단리된 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 다양한 제제, 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 담체에 존재할 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 "Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, ISBN #: 0912734027, Mack Pub Co)에 기재된다. 제제는 기피 인자를 신속하게 전달할 수 있거나 또는 지속 방출 제제(sustained release formulation)일 수 있다. 그와 같은 조성물은 환자로의 적절한 투여를 위한 제형을 제공할 수 있도록 적합한 양의 담체와 함께 치료적 유효량(therapeutically effective amount)의 기피 인자를 포함할 수 있다. 상기 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 투여 경로에 관계없이, 기피 인자는 약제학적 분야의 당업자에게 알려진 통상적인 방법에 의해 허용가능한 단위 투여 제형(unit dosage form)으로 제제화된다. 바람직한 구체예에서, 기피 인자는 인간으로의 정맥내 투여를 위한 약제학적 조성물로서 통상적인 절차에 따라 제제화된다. 통상적으로, 정맥내 투여를 위한 약제학적 조성물은 가용화제(solubilization agent), 예를 들면, 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함하거나 또는 포함하지 않는 멸균 등장성 수성 완충액을 포함한다. 일반적으로, 성분들은 별개로 공급되거나 또는 단위 투여 제형, 예를 들면, 앰플이나 사쉐(sachet)와 같은 밀봉된 용기 중의 동결건조 분말 또는 무수 농축물(water-free concentrate)로 함께 혼합되어 공급된다. 약제학적 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 약제학적 조성물은 가용화제를 담은 주입 병에 분산될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 제제는 수용액, 식염수(saline solution), 고체, 반-고체, 액체, 페이스트, 퍼티(putty) 투여 제형, 분산액, 현탁액, 겔, 리포좀, 매트릭스, 형태 안정 물질(shape stable material), 인 시투 설정 물질(in situ setting material), 조직 부착성 생체물질(tissue adhesive biomaterial), 주사제 및 최소 침습제(minimal invasive) 및 이식용 투여 제형(implantable application form)을 포함한다.

일부 다른 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 수용액, 고체, 반-고체, 페이스트, 퍼티, 리포좀, 형태 안정 물질, 매트릭스, 인-시투 설정 물질, 조직 부착성 생체물질로 구성된 군으로부터 선택된다.

바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 리포좀에 캡슐화된 기피 인자 및/또는 기피 인자의 단리된 폴리펩티드를 포함한다. 리포좀 제제는 치료제의 보다 긴 지속기간 및 적용 부위에서의 보다 느린 제거(clearance) 외에 단백질이 생물학적 환경 내에서 분해로부터 보호된다는 점에서 용액보다 장점을 갖는다.

리포좀은 일반적으로 수성 매질 중에 화합물을 포함하는 코어(core)를 갖는 포위된 지질 액적(enclosed lipid droplet)을 포함한다. 특정한 구체예에서, 화합물은 지질 성분에 화학적으로 결합하거나 또는 단순히 리포좀의 수성 내부 분획 내에 담긴다.

본 발명에 따라 제공되는 약제학적 조성물은 바람직하게는 기피 인자 및/또는 폴리펩티드를 캡슐화하는 리포좀을 제조하기 위해 재구성될 수 있는 건조된 리포좀 조성물로 제공되고, 바람직하게는 상기 리포좀 제제는 수용액 중에서 재구성시, 단백질을 캡슐화한 리포좀을 형성하는 것인 건조된 재구성 소포(dried reconstituted vesicle, DRV)이다. 본 발명에서 사용되는 리포좀 조성물은 예를 들면, 물의 첨가 시 분산되어 생물학적 활성 성분을 포함하는 다층(multi-lamellar) 리포좀 제제를 형성하는 건조된 과립 제품이다. 유리하게는, 응집 또는 산화와 같은 안정성 문제가 건조된 리포좀을 이용하는 것에 의해 회피된다.

개별적으로 존재하거나 또는 혼합물로 존재하는 제제에서 사용하기 위해 적합한 지질은 콜레스테롤, 포스파티딜콜린, 수소화 포스파티딜콜린, 디스테아로일-포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 디올레일 포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜글리세롤, 포스파틸글리세롤, 디미리스토일포스파티딜 콜린, 디팔미토일콜린, 강글리오시드, 세라미드, 포스파티딜이노시틸, 포스파트산, 디세틸포스페이트, 디미리스토일(dimyrylstoyl) 포스파티딜콜린, 스테아릴아민, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 및 기타 유사 지질과 같은 중성 지질 또는 양전하를 띤 지질을 포함한다. 바람직하게는, 지질 믹스(lipid mix)는 전하를 띤다. 리포좀 제제는 일반적으로 콜레스테롤 및 포스파티딜콜린과 같은 두 개 이상의 지질 및 보다 통상적으로 세 개 이상의 지질의 혼합물이다.

본 발명은 또한 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 상동성, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 서열은 성숙 SLIT3 단백질보다 더 짧고, 바람직하게는 상기 단리된 폴리펩티드는 1523개의 아미노산으로 구성된 길이보다 더 짧거나, 바람직하게는 1491개의 아미노산으로 구성된 길이보다 더 짧거나 또는 900개의 아미노산으로 구성된 길이보다 더 짧고, 바람직하게는 200개 내지 900개의 아미노산으로 구성된 길이이고, 보다 바람직하게는 200개 내지 760개, 200개 내지 520개, 200개 내지 300개의 아미노산으로 구성된 길이인 것인 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 9로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9의 아미노산을 포함하고 상기 아미노산 서열은 성숙 SLIT3 단백질보다 더 짧고, 바람직하게는 상기 단리된 폴리펩티드는 1523개의 아미노산으로 구성된 길이보다 짧고, 바람직하게는 1491개의 아미노산으로 구성된 길이보다 짧거나, 또는 900개의 아미노산으로 구성된 길이보다 짧고, 바람직하게는 200개 내지 900개의 아미노산으로 구성된 길이, 또는 보다 바람직하게는 220개 내지 760개, 240개 내지 520, 250개 내지 300개의 아미노산으로 구성된 길이이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 또한 적어도 서열번호 1의 34번 내지 917번, 47번 내지 863번, 66번 내지 857번, 279번 내지 863번, 279번 내지 857번, 279번 내지 724번, 279번 내지 504번, 311번 내지 432번, 335번 내지 432번 또는 312번 내지 437번 위치의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.

보다 바람직하게는, 본 발명은 적어도 서열번호 1의 308번 내지 413번, 308번 내지 317번, 331번 내지 340번, 344번 내지 352번, 357번 내지 366번, 380번 내지 389번, 394번 내지 402번 또는 404번 내지 413번 위치의 아미노산 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 단리된 폴리펩티드 및/또는 기피 인자는 페길화(pegylate)된다. 그와 같이 변형된 폴리펩티드 및/또는 기피 인자는 변형되지 않은 작용제보다 더 긴 생물학적 반감기를 가지며 따라서, 퇴행성 질환의 의학적 치료를 위한 작용제의 효능을 개선한다. 또한, 단백질의 응집 경향이 감소된다.

페길화는 단백질 상의 아미노 또는 설프히드릴기와 폴리에틸렌글리콜(PEG) 상의 화학적 반응성 작용기(카보네이트, 에스테르, 알데히드, 또는 트레실레이트) 간의 안정한 공유 결합을 통해 달성될 수 있다. 결과적으로 수득되는 구조는 직선형 또는 분지형일 수 있다. PEG 시약은 예를 들면, Roberts 등(Roberts, et al., 2002)에 기재된다. 다른 페길화제는 메톡시폴리(에틸렌글리콜)(mPEG), 메틸 PEO₁₂ 말레이미드 PEG, 아민-반응성, 메틸-캡핑된(methyl-capped) 폴리에틸렌 옥시드(PEO)-함유 변형제(modification agent) (메틸 PEO_n-NHS 에스테르, n=4, 8,12)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 펩티드의 분해를 방지하기 위해 변형된 결합을 갖는 안정화된 펩티드와 같은, 변형된 및/또는 안정화된 펩티드가 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 전술된 구체예 중 하나의 단리된 폴리펩티드 또는 기피 인자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 단백질이 담체, 이식물 또는 전달 시스템과 조합된 것인 전술된 구체예 중 하나의 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 담체, 이식물 또는 전달 장치는 무독성이고 신체 내에서 염증 반응을 유발하지 않는다는 점에서 바람직하게는 생체적합성이다. 이들은 매트릭스 또는 스카폴드(scaffold) 구조를 포함하고, 고체, 액체, 겔, 페이스트, 또는 다른 주사용 제형일 수 있다. 바람직하게는, 상기 담체, 이식물 또는 전달 장치는 예를 들면, WO2005/113032에 기재된 것과 같은 히드로겔, 특히, 주사가능한 히드로겔, 술페이트화 히알루론산, 고 치환된(highly substituted) 카르복시메틸셀룰로오스 및 그의 염, 알기네이트, 히드록시프로필알기네이트, 키토산, 히드록시에틸전분, 콜라겐, 젤라틴, 역 써말 겔(reverse thermal gel)(예를 들면, Pluronic F128), 키토산-기반 열민감성(thermosensitive) 공중합체(예를 들면, chitosan-Pluronic® 히드로겔), 다공성 실크 스카폴드, 복수 개의 미세구, 리포좀 제제 및 히드록시아파타이트 섬유 메쉬(hydroxyapatite fiber mesh)를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 담체는 혈소판-리치(platelet-rich) 혈장으로 구성된 피브린 겔, 생분해성 젤라틴 히드로겔을 포함한, 혈소판 강화된 혈장(platelet enriched plasma), 피브린/히알루론산 복합물, 인자 캡슐화 젤라틴 히드로겔 미세구(factor encapsulated gelatine hydrogel microsphere), 예를 들면, 올리고(폴리(에틸렌글리콜)) 푸마레이트, 폴리락티드(PLA)/폴리글리콜산(PGA) 및 폴리 엡실론 카프로노락톤과 같은 중합체를 포함하는 주사용 생분해성 히드로겔 복합물을 포함한다.

바람직하게는, 담체는 키토산-글리세롤 포스페이트 또는 키토산-글리세롤 포스페이트 용액으로 안정화된 인 시투 혈병(in situ blood clot)을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 전달 시스템은 젤라틴 마이크로입자, 중합체 기반 생분해성 및 생체적합성 히드로겔, 중합체-강화된 하이브리드 덩이(polymer-reinforced hybrid clot) 또는 기타 중합체 기반 생분해성 및 생체적합성 이식물, 또는 본 발명의 기피 인자 및/또는 단리된 폴리펩티드의 전달을 위한 전달 시스템을 포함한다.

본 발명의 바람직한 중합체는 콜라겐, 콘드로이틴 술페이트, 히알루론산, 히알루로네이트, 히알루론산 에스테르(hyaluronic esther), 히알루론산 벤질에스테르, 올리고(폴리)(에틸렌 글리콜) 푸마레이트, 키토산, 키토산 글리세롤 포스페이트, 젤라틴/콘드로이틴-6-술페이트/히알루로난 삼중-공중합체(tri-copolymer)와 같은 삼중-공중합체 또는 이들의 조합을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 지속 방출 제제(sustained release formulation)로서 제제화된다. 또 다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 간헐적인 방출을 제공하는 지속 방출 제제로서 제제화된다.

퇴행성 질환의 치료는 퇴행된 조직의 병변에 형성된 혈병을 혈전형성(thrombogenic) 활성을 가지며 상처 복구 과정을 촉진하는 중합체로 안정화시키는 것에 의해 더 개선될 수 있다. 따라서, 또 다른 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 혈전형성 활성을 갖는 하나 이상의 물질, 첨가제 또는 매트릭스를 더 포함한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 중합체는 혈전을 형성하고 및/또는 혈소판 응집 및 탈과립(degranulation)을 촉진한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 중합체는 지혈 활성을 가지며, 보다 바람직하게는, 중합체는 지혈 활성을 가지고 상처 조직의 혈관재형성(revascularization) 및/또는 결합 조직 복구를 촉진한다.

또 다른 구체예에서, 중합체는 생리적 조건 하에서 가용화되고 전혈(whole blood)와의 혼합 후에 고체 이식물을 형성한다. 이 이식물은 정상적인 혈병(clot)보다 조직 결손에 더 잘 부착하는 장점을 가지며, 따라서 연골 재생성을 개선한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 구체예의 약제학적 조성물은 연골조직 세포(cartilage cell)를 더 포함하고, 바람직하게는 상기 연골조직 세포는 연골세포(chondrocyte)이다.

전술된 구체예 또는 이들의 조합에서, 다양한 조직, 예를 들면, 인간 귀, 비강, 늑골, 내부 반월상 세포(inner meniscus cell, IMS), 지방체 세포(fat pat cell, FPC), 윤활막 세포(synovial membrane cell, SMC), 관절 연골세포 또는 기타 연골세포 조직, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및/또는 골수 간질 세포(bone marrow stroma cell)와 같은 조직으로부터 유래된 인간 연골세포의 공-캡슐화(co-encapsulation)도 본 발명의 구체예이다. 특히, 이 세포들은 상이한 연골세포 종류의 연골형성을 강화하고 이식 후 연골 조직을 형성하도록 유도하기 위해 성장 인자와 함께 또는 성장 인자 없이 확장된다.

본 발명에 따른 "중간엽 줄기 세포(Mesenchymal stem cell, MSC)"는 미정된 중간엽 전구 세포(uncommitted mesenchymal progenitor cell)로서 다수의 성숙 골격 조직에 존재하는 원시(primitive) 또는 휴지(resting) 세포 집단이다. MSC는 가변적(flexible)이고, 이 휴지 세포들에게 제공되는 생물학적 신호 및 환경에 따라, 연골, 뼈, 지방 및 기타 조직을 포함한, 여러 성숙 조직 타입으로 분화될 수 있는 능력을 갖는다. MSC는 심각한 공여 부위 이환율(donor site morbidity) 또는 면역원성(immunogenic potential) 없이 이 세포들을 분리하기 위해 수집될 수 있는 골수, 혈액, 근육 조직 및 지방을 포함한, 다수의 자가 공급원(autologous source)으로부터 이용가능하다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 문제는 퇴행성 질환과 같은 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 전술된 구체예의 폴리펩티드의 이용에 의해 해결된다. 바람직한 구체예에서, 퇴행성 질환은 전술된 구체예 중 하나에서 특정된 것과 같은 퇴행성 질환이다. 바람직하게는, 퇴행성 질환은 골관절염, 또는 만성 류마티스 관절염 또는 급성 류마티스 관절염과 같은 류마티스 관절염이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 중간엽 줄기 세포의 이동 행동에 영향을 주기 위한 전술된 구체예 중 하나에 따른 기피 인자의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 중간엽 줄기 세포의 이동 또는 유인의 유도를 위한, 전술된 구체예 중 하나에 따른 기피 인자의 용도를 포괄한다.

바람직하게는, 본 발명은 연골 형성의 유도 및/또는 연골세포의 증식 또는 분화의 촉진을 위한, 전술된 구체예 중 하나에 따른 기피 인자의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 공통 서열(consensus sequence) C(Y)₃CYC(Y)₆C(Y)₉₉C(Y)₄₇CYC(Y)_2OC(Y)_2OC(Y)_2OC(Y)_13-22C를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 더 포함한다.

공통 서열 C(Y)₃CYC(Y)₆C(Y)₉₉C(Y)₄₇CYC(Y)_{2 O}C(Y)_{2 O}C(Y)_{2 O}C(Y)_13-22C를 포함하는 단리된 폴리펩티드가 또한 바람직하고, 상기에서 C는 시스테인을 나타내고, Y는 아미노산을 나타내며, 하나 이상의 시스테인이 시스테인을 제외한 다른 아미노산에 의해 치환된다. 하나 이상의 시스테인을 또 다른 아미노산에 의해 치환하는 것에 의해, 상기 서열의 폴딩 및/또는 이량체(dimer) 형성이 영향받을 수 있다.

본 발명은 본 발명 내에서 기재된 질병과 같은 퇴행성 질환에 대한 치료적 효과를 갖는 기피 인자 또는 그의 활성 단편을 코딩하는, 기피 인자 유전자의 DNA, 또는 그의 일부를 포함하는, 퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 유전자 치료(gene therapy)용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 따르면, 기피 인자 유전자 또는 그의 일부의 DNA는 손상된 조직에 국소로(국소 투여), 전신적으로 또는 지속적으로 기피 인자를 적용하기 위해, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스-연관 바이러스(adenovirus-associated viral, AAV) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 벡터, MLV(murine leukemia virus) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 인간 세포 또는 기피 인자 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환되거나 또는 형질감염된 재조합 세포에서 발현될 수 있는 플라스미드에 의해 제공될 수 있다.

용어 "DNA 기피 인자 유전자(DNA repellent factor gene)"는 기피 인자 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 DNA를 의미한다. 이는 천연의 단리된 DNA에 한정되지 않고, 번역 후에, 본 발명의 구체예에 다른 폴리펩티드를 형성하거나 또는 본 발명의 목적을 위해 적합한 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 조절을 위한 요소(예를 들면, 유도성 프로모터 요소 및/또는 인핸서 요소) 외에 바람직하게는 기피 인자의 활성의 유지 하에 폴리펩티드를 형성하는 천연 뉴클레오티드 서열의 변형 형태도 포함한다. 재조합 벡터는 또한 세포로부터 유전자에 의한 폴리펩티드의 분비를 위해 요구되는 신호 펩티드(signal peptide)를 위한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 더 포함할 수 있다.

상기 DNA는 인간, 마우스, 랫트, 또는 기타 척추동물 기피 인자로부터 유래될 수 있다. 이 단백질들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업자에게 용이하게 입수가능하다. 바람직하게는, 상기 DNA는 인간 기피 인자로부터 유래된다. 서열은 예를 들면, GenBank, SwissProt 및 기타 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 그들은 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있고, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론은 ATCC와 같은 기탁 기관으로부터 유래될 수 있거나, 또는 PCR 방법에 의해 클로닝될 수 있거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 서열은 코돈 사용(codon usage)에 대해 더 최적화될 수 있다. 기피 인자에 대한 DNA 서열의 예는 GI4507060 (Slit1), GI4759145 (Slit2), GI11321570 (Slit3), GI:148613883 (Netrin1) 또는 그의 핵산 단편이다.

바람직하게는, 재조합 세포는 윤활막, 피부, 골수 기원, 림프구 또는 수지상 세포(dendritic cell)의 자가 섬유모세포이다. 가장 바람직하게는, 재조합 세포는 윤활막, 피부 또는 수지상 세포의 자가 섬유모세포이다.

본 발명의 일 구체예는 관절염성 관절, 특히, 류마티스성 윤활막과 같은 영향받은 조직으로 기피 인자 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 핵산 분자를 국소로 전달하기 위한 약제학적 조성물 및 그의 용도를 제공한다. 특히, 약제학적 조성물 및 그의 용도는 치료적 유효량으로 표적 세포에서 바람직하게는 치료 단백질의 고 발현을 위한 충분한 시간 동안 윤활 세포와 같은 조직의 세포에서 기피 인자를 코딩하는 핵산 분자의 효율적인 형질감염 또는 형질도입을 가능하게 한다.

바람직하게는, 벡터 또는 플라스미드는 예를 들면, 염색체외 방식(extrachromosomal manner)으로 단백질을 발현하기 위해, 형질도입된 세포의 게놈으로 삽입되지 않는다.

바람직하게는, 벡터 또는 플라스미드는 형질도입된 세포의 게놈으로 안정적으로 삽입되고 바람직하게는 치료 단백질의 장기 및/또는 지속적 방출을 제공한다.

약제학적 조성물의 관절염성 관절과 같은 영향받은 조직으로의 국소 투여는 바람직하게는 관절염성 윤활막으로의 인 비보 투여 또는 엑스 비보(ex vivo) 투여를 의미한다. 핵산의 엑스 비보 전달은 바이러스 벡터에 의한 자가 윤활 세포 또는 비-자가 윤활 세포의 형질도입 또는 기피 인자 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 플라스미드에 의한 형질감염을 수행하는 단계, 형질도입된 세포를 선택하는 단계 및 형질도입된 세포를 예를 들면, 개체의 관절로의 세포의 재이식, 주사 또는 재주입에 의해 개체의 류마티스성 관절로 투여하는 단계를 포함한다. 인 비보 투여는 기피 인자 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 개체의 관절에 예를 들면, 관절내 주사에 의해 직접 투여하는 것을 의미한다. 국소 투여의 장점은 개별적인 관절을 치료하기 위해 보다 소량의 유전자 산물 및 따라서 보다 적은 수의 벡터가 요구된다는 것이다.

전신성 전달을 위해, 벡터는 바람직하게는 예를 들면, 단일 또는 복수 회의 주사 또는 주입에 의해 근육내, 피하 또는 정맥내 주사에 의해 관절외 위치에 도입된다.

바람직하게는, 전술된 구체예의 약제학적 조성물은 생리적 액체, 물, 염수, 완충액, 유화제, 안정화제, 동결건조제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 추가적인 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함한다.

대안으로서, 기피 인자 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 기피 인자 유전자의 DNA 또는 그의 일부를 포함하는, 퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 유전자 치료용 약제학적 조성물은 리포좀 내로 도입되고 관절의 영역에 직접 주사되며, 상기 리포좀이 윤활 세포와 융합되어 전술된 구체예의 기피 인자의 인 비보 발현이 이루어진다.

바람직하게는, 전술된 구체예의 약제학적 조성물은 노출된(naked) DNA로서 주사된다.

본 발명은 예시적인 것에 불과하고 본 발명의 범위의 한정으로 해석되지 않는 도면 및 실시예에 의해 더 설명된다.

도 1은 윤활 섬유모세포의 이동에 대한 NETRIN1의 저해 효과를 보여준다. 계대 3 및 10의 OA (A) 및 RA (B) 윤활 섬유모세포에 대한 NETRIN1의 효과를 Boyden Chamber 분석법으로 측정하였다. NETRIN1을 각각 상부 챔버 또는 하부 챔버에 적용하였다.
도 2는 Boyden Chamber Migration Assay에서 분석된, Slit3의 추가 후 OASF 및 RASF의 이동을 보여준다.
Slit3 인큐베이션(0.1 ㎍/ml)은 초기 계대(P3 및 P4)의 OASF의 이동을 대조군 대비 약 60%(상부 챔버의 OASF와 함께 조합된 Slit3) 및 약 40% (하부 챔버의 Slit3) 감소시켰다. RASF (P3/P4)에서, Slit3은 이동을 각각 약 45% (상부 챔버의 Slit3) 및 50% (하부 챔버의 Slit3)까지 감소시켰다.
도 3은 골관절염(OASF) 환자 및 류마티스 관절염(RASF) 환자의 윤활 섬유모세포의 증식에 대한 Slit3의 영향을 보여준다. OASF 및 RASF와 함께 Slit3 인큐베이션(0,1 ㎍/ml)은 OASF 및 RASF의 증식을 약간 감소시켰다.
도 4는 Slit3 첨가 후 인간 중간엽 줄기 세포(HMSC)의 분화를 보여준다.
A Slit3은 처리의 7일 후에 아그레칸(aggrecan) 발현을 증가시켰다.
B HMSC의 TGFβ에 의해 유도된 연골세포로의 분화는 MIA 발현의 분석에 따르면 Slit3 처리에 의해 더 강화되었다.
도 5는 SDS PAGE에서 RTS 500 시스템(Roche Molecular Biochemicals)으로 발현된 LRR2 구조물(construct)의 발현을 보여준다.
래인 1: 대조군인 RTS 500 (His-Tag 불포함)의 재조합 단백질 10 ㎕
래인 2: 재조합 SLIT3 단편 LRR2 10㎕
래인 3: 재조합 SLIT3 단편 LRR2 1 ㎕
래인 4: 재조합 마우스 Slit3 (250ng; R&D Systems)
도 6은 Slit3 (R&D Systems), LRR2, LRR2 dNC를 이용한 Mel Im (R&D Systems) 및 A 375 세포의 이동에 대한 SLIT3 매개 저해를 보여준다.
도 7 및 도 8은 Slit 3 (R&D Systems, 도 7, 도 8 래인 2, LRR2 (도 7, 도 8 래인 3), LRR2 dNC (도 7, 도 8 래인 4), LRR 2dNCmut (도 8 래인 5) 및 LRR3 (도 8 래인 6)에 의한 처리 후, 초기 계대에서 Boyden Chamber Migration Assay (실시예 2 및 5에 따름)에서 OASF 및 RASF의 감소된 이동을 보여준다. 래인 1: 대조군
도 9는 상이한 기피 단백질과의 공-배양 후 OA 윤활 섬유모세포의 상층액에서 GAG 단백질 수준으로 측정된 연골 파괴의 저해를 보여준다.
래인 1: 연골 대조군(OA 윤활 섬유모세포 불포함)
래인 2: OA 윤활 섬유모세포
래인 3: OA 윤활 섬유모세포 + NETRIN1
래인 4: OA 윤활 섬유모세포 + mSlit3
래인 5: OA 윤활 섬유모세포 + LRR2 dNCmut

실시예 1: 일차 인간 윤활 섬유모세포의 분리

고지된 동의 및 지역 윤리 위원회의 승인 후에, 4명의 RA 환자 및 4명의 OA 환자 (Clinic of Orthopedic Surgery, Schulthess Clinics, Zuerich, Switzerland)의 윤활막절제술 및 관절성형술로부터 윤활막 조직 시료를 수득하였다. OA의 진단은 임상적 및 방사선학적 기준에 따라 이루어졌다. 모든 RA 환자가 RA의 진단을 위한 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology) 1987 기준을 충족시켰다. OA 환자에서, 말기 관절강 협착(end-stage joint space narrowing)을 보이는 고관절 및 무릎 관절로부터 윤활막 조직을 수득하고, RA 환자에서는, 개화성 윤활막염(florid synovitis) 및/또는 관절염성 파괴(arthritic destructions)를 보이는, 손목 관절 또는 근위지간 관절로부터 시료를 채취하였다. 윤활 조직을 기계적으로 잘게 썰고, 멸균된 인산염-완충 염수(PBS)로 철저하게 세척하고 지속적인 교반 하에 37℃에서 1시간 동안 150 mg/ml Dispase II (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)로 처리하였다. 결과적으로 수득된 세포 현탁액을 조직 배양 디쉬에 접종하고, 습화된(humidified) 대기에서 10% 우태혈청(fetal calf serum) 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 당 100 U/ml 페니실린을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; Gibco Life Technologies, Basel, Switzerland)에서 배양하고, 뒤이어 5% CO₂를 첨가했다. 3대, 5대 및 10대 계대에서, 부착성 섬유모세포를 세척하고 트립신으로 처리하고 RNA 분리를 위해 또는 분석법에서 이용하였다. 대조군으로서, 피부 섬유모세포를 이용하였다.

실시예 2: RA 및 OA 환자로부터의 일차 인간 윤활 섬유모세포의 이동의 저해

골관절염 및 류마티스 관절염 환자로부터의 윤활 섬유모세포의 이동에 대한 기피 인자의 저해 능력을 이동 분석법(migration assay)에서 분석하였다.

세포 이동에 대한 저해 인자의 효과는 본질적으로 이전에 설명된 바와 같이(Jacob, et al., 1995), 8 ㎛ 세공 크기를 갖는 폴리카보네이트 필터(Costar, Bodenheim, Germany)를 포함하는 Boyden Chamber 분석법을 이용하여 분석하였다. 필터를 젤라틴으로 코팅하였다. 하부 구획(lower compartment)에 화학-유인물질(chemo-attractant)로 이용된, 섬유모세포-조건화 배지(fibroblast-conditioned medium)를 충진시켰다. 세포를 2분 동안 트립신 처리하고, FCS를 포함하지 않는 DMEM에 2 x 10⁵ 개의 세포/ml의 밀도로 재현탁시키고 상기 챔버의 상부 구획에 배치했다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 필터를 수집하고 하부 표면에 부착된 세포들을 고정시키고, 염색하고, 계수하였다. 기피 인자, 예를 들면, 재조합 NETRIN1 (HEK293 세포로부터 유래된 인간 재조합 NETRIN1 단백질, 아미노산 28번 내지 604번, N-말단 Flag-tag, Alexis Biochemicals), Slit3 (재조합 마우스 Slit3 단백질, Ser27 - His 901, R&D Systems)을 0.1 ㎍/ml의 농도로 상기 시스템의 상부 챔버 또는 하부 챔버에 첨가하였다.

인 비트로 배양 동안 윤활 섬유모세포에서 표현형 변화가 일어나고 이 세포들은 인 비트로에서 증식하면서 점진적으로 그들의 공격적 표현형을 상실한다는 것이 알려져 있다(Zimmermann et al., 2001). 따라서, 본 발명자들은 인 비보에서 관찰되는 구조(configuration)와 최대한 가까운 표현형 특징을 갖는 새로 단리된 윤활 섬유모 세포를 수득하기를 원했고, 초기 및 후기 계대의 세포를 이용하여 기피 인자의 이동에 대한 효과를 분석하였다.

이 실험들은 RA 및 OA 환자의 인간 윤활막 조직으로부터 새로 분리된 윤활 섬유모세포의 이동에 대한 이 인자들의 저해를 명확하게 입증했다.

결과가 도 1 및 2에 도시된다.

도 1(A) 및 도 1(B)에 도시된 바와 같이, 초기 계대(계대 3)에 RA 및 OA 윤활 섬유모세포 이동의 강한 저해가 있었고 건강한 공여자로부터 유래되거나 또는 높은 계대에 있는 섬유모세포들은 영향받지 않았다. 재조합 NETRIN1을 각각 상부 및 하부 챔버에 첨가한 후 효과가 나타났으며, 이는 화학주성이 아닌, 이동의 분자적 과정(molecular process)이 NETRIN1에 의해 영향받는다는 것을 나타냈다.

본 실시예에서 제시된 이 발견은 NETRIN이 잠재적으로 세포의 기피(repulsion)에 의해, 세포의 이동 능력을 감소시킨다는 것을 시사한다.

도 2에 도시된 바와 같이, OASF 및 RASF의 이동 및 상기 세포에 대한 유도 신호(guidance cue) Slit3의 영향을 분석하였다. 초기 계대(P3 및 P4)에서, 미처리 세포 대비, OASF 및 RASF (n=2)에 대한 Slit3의 강한 저해 효과를 측정하였다. 이 효과는 SF를 포함하는 상부 챔버에서 SF와 조합된 Slit3의 존재에서 명백하였고, 또한, 하부 챔버에 화학유인물질인 섬유모세포-조건화 배지와 Slit3의 조합에서도 효과가 명백하였다.

실시예 3: 재조합 Slit 3 및 NETRIN1 의 OASF 및 RASF 의 증식에 대한 영향

증식은 공급업체의 설명서에 따라 Cell Proliferation Kit II (Roche)를 이용하여 측정하였다. 측정은 4일 동안 수행된 세포 증식의 비색(XTT) 측정 비-방사성활성 정량화(colorimetric (XTT) measured non-radioactive quantification)에 근거했다. 재조합 Slit3 또는 NETRIN1을 0.1 ㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 세포 증식 분석법은 OASF에 대해 약 4.5일(d) 및 RASF에 대해 3.5일의 계산된 배가 시간(doubling time)을 밝혔다. Slit3 처리는 증식의 약한 저해를 가져왔고, Slit3 처리 후 OASF 및 RASF의 세포 증식은 약 1일 동안 감속되었다(도 3). 또한 NETRIN1 처리 후 세포 증식의 약한 저해를 관찰하였으나, 그 효과는 유의하지 않았다.

실시예 4: 인간 중간엽 줄기 세포( HMSC )의 분화

분화에 대한 Slit3의 효과를 평가하기 위해, HMSC를 펠렛 배양(pellet culture)에서 배양하고 각각 Slit3, TGFβ 또는 Slit3fTGFβ로 처리하였다. Slit3은 처리의 7일 후에 아그레칸(Aggrecan)의 발현을 증가시켰고 TGFβ에 의한 유도 없이 처리의 21일 후에 MIA의 발현을 증가시켰다 (도 4). TGFβ-유도 HMSC의 연골세포로의 분화는 MIA 발현을 분석하는 Slit3 처리에 의해 약간 증가되었다 (도 4B).

실시예 5: RTS 시스템에서 SLIT3 구조물의 발현

SLIT3의 단편이 RA의 치료를 위한 약제학적 제품의 제조를 위한 약제학적 활성 성분으로 이용될 수 있는지 여부를 분석하기 위해, 다양한 인간 SLIT3 구조물을 생성하고 Mel Im 세포, A375 세포, 일차 인간 RASF 및 OASF 세포 및 HMSC 및 Example 9를 이용하여 실시예 1 내지 4에 따라 기능 분석에서 테스트하였다. 모든 구조물을 다수의 공여자로부터의 인간 연골세포 또는 윤활 섬유모세포로부터 분리된 RNA로부터 유래된 cDNA의 PCR 증폭에 의해 제조하였다. 구조물 LRR1-4 (서열번호 7)을 프라이머 5' GAC CAT ATG GCC CCT GCC CCA CCA AGT GTA CC 3' 및 5' GAC CCC GGG ATT GCA TTT GGC CAC AAT G 3'를 이용하여 증폭하고, LRR2 (서열번호 8)는 프라이머 5'GAC CAT ATG ATC TCC TGC CCT TCG CCC TGC 3' 및 5' GAC CCC GGG GAA GCA CTC GCT GCT GAA CC 3'을 이용하여 증폭시키고, LRR2 dNC (서열번호 9)는 프라이머 5' GAC CAT ATG ATC GTC GAA ATA CGC CTA GAA C 3'및 5' GAC CCC GGG TGG GTT TTG GGC TAA GTG GAG 3'를 이용하여 증식시키고, LRR3은 프라이머 5' GAC CAT ATG GAC CTC GTG TGC CCC GAG AAG 3' 및 5' GAC CCC GGG GCT CAG CTG GCA GCT ACT CTC 3'을 이용하여 증폭시켰다. 잔류 Cys가 Ala로 교환된 것인(Cys85Ala) LRR2 dNCmut (서열번호 21)를 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Amsterdam, Netherlands) 및 프라이머 5' CCA ACA AGA TCA ACG CCC TGC GGG TTA ACA CGT TTC AGG 3' 및 5' CCT GAA ACG TGT TAA CCC GCA GGG CGT TGA TCT TGT TGG 3'을 이용하여 부위-지향적 돌연변이생성에 의해 클로닝하였다. 단편을 발현 벡터 plVEX2.3-MSC의 NdeI 및 SmaI 부위에 클로닝시키고 삽입 서열을 서열결정에 의해 확인하였다. C-말단 HIS 태깅된(tagged) SLIT3 단백질을 RTS 500 시스템 (Roche Molecular Biochemicals)에서 발현시켰다. 제조사의 설명서에 따라, 인 비트로 전사 및 번역을 수행하였다. RTS 500 발현 시스템에 의해 생성된 단백질의 상이한 양(1 ㎕, 10 ㎕)을 이용하여 웨스턴 블롯 분석(SDS-PAGE)에 의해 단백질 발현을 분석하였다 (도 5). RTS 500 시스템에 의해 생성된 단백질 단편들의 활성을 RTS 500 시스템에 의해 생성된 단백질 1 ㎕를 상기 시스템의 상부 챔버 또는 하부 챔버에 첨가한 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 Boyden Chamber 분석법을 이용하여 a) Mel Im (Jacob, et al., 1995에 기재됨), b) A375 (CRL1619, ATCC) 세포 및 c) 실시예 2에 기재된 OASF 및 RASF 세포를 이용한 이동 분석법에서 분석하였다. 도 6 A 및 B, 도 7 및 도 8에 표시된 바와 같이, Slit3, LRR2, LRR2 dNC 및 LRR2 dNCmut을 이용한 경우, 모든 세포주의 이동의 저해가 있었다. 놀랍게도, SLIT3 단백질 서열의 N-말단 및 C-말단 안정화 부분이 결여된 LRR2 dNC 단백질 및 LRR2 dNCmut (Cys85Ala 변이체) 단백질도 윤활 섬유모세포의 이동을 저해하여, 2차 구조의 일부를 포함하는 단백질의 최소 결합 도메인(minimal binding domain)이 저해 효과를 위해 충분하다는 것을 보여주었다.

실시예 6: 류마티스 관절염( RA )의 치료를 위한 동물 모델

윤활 섬유모세포의 이동 및 파괴적 행동 및 본 발명의 기피 인자의 영향이 상이한 동물 모델에서 분석될 수 있다. 류마티스 관절염(RA)의 치료를 위한 새로운 생물학적 물질을 분석하는 확립된 모델은 설치류, 예를 들면, 랫트 또는 마우스에서의 콜라겐-유도 관절염(CIA) 모델이다 (Bendele et al., 2000). RA는 프로인트 불완전 아쥬반트(Freund's incomplete adjuvant) 중의 소 타입 II 콜라겐의 피내/피하 주사에 의해 암컷 랫트에서 유도된다. 랫트가 RA를 발병하는 경우, 기피 인자가 피하로 또는 복막내로 예를 들면, 리포좀 또는 염수(PBS)의 지속 전달 시스템으로 투여된다. 치료는 발목 관절 부기(ankle joint swelling) 및 염증의 척도 및 탈회(decalcification) 후 관절의 조직병리학적 평가(histopathological scoring)의 결정에 의해 분석될 수 있다.

대안적인 모델은 SCID(severe-combined immunodeficient mouse) 마우스 공-이식(co-implantation) 모델이다. 인간 RASF 및 신선한 인간 연골이 SCID 마우스의 부신(kidney capsule) 아래에 비활성 스폰지(예를 들면, 콜라겐 스폰지)와 함께 이식되고, 이들은 60일 동안 유지된다 (Huber, et al., 2006). RASF 세포는 인간 관절 연골에 침입하고 파괴한다.

사용될 수 있는 제3 모델은 LPS/PBS 중의 항-타입 II 콜라겐 단일클론 항체의 혼합물의 복막내 주사가 Balb/c 마우스와 같은 마우스에서 RA를 유도하는 것인 항체-유도 관절염 모델이다(Terato, et al., 1992).

제4 모델은 토끼의 만성 OVA-유도 또는 항원-유도 관절염 모델이다 (Podolin, et al., 2002). 동물을 2 ml의 CFA 중의 10 mg OVA의 피하(s.c.) 주사에 의해 감작(sensitize)시키고 IFA 중의 OVA의 견갑골내(intrascapula) 투여에 의해 3-주 또는 4-주 간격으로 강화(bosst)시킨다. 양성 피부 테스트된 동물에게 무릎 관절로 PBS 중의 OVA를 투여한다. 토끼에게 SLIT3 단편과 같은 기피 인자 또는 비히클을 경구로(p.o.) 투여한다. 화합물의 효과를 측정하기 위해, 윤활액 중의 총 세포 수, 차등적 세포 분석(differential cell analysis), 에이코사노이드(eisosanoid)/사이토카인 측정 및 측경기(calliper)를 이용한 무릎 직경의 측정을 수행한다. 화합물의 투여 전 및 후에 혈액 시료를 채취한다.

윤활 섬유모세포 이동의 변화 및 관절염에 대한 치료 옵션에서의 관여에 대해 화합물을 테스트하기 위해, 해당 화합물이 상기 시스템에 첨가될 수 있고, 선택적으로 염수 용액으로서 또는 리포좀 제제와 같은 약제학적 제제로서 첨가될 수 있다.

실시예 7: 골관절염( OA )의 치료를 위한 동물 모델

골관절염의 치료를 위한 동물 모델은 토끼 전방십자인대 횡절단 모델이다. 전신 마취 및 무균 조건 하에서, 토끼의 무릎 관절에 내측 슬개 절개(medial parapatellar incisions)(안쪽곁인대와 슬개 인대 사이)를 통해 접근한다. 무릎뼈가 측면으로 전치되고 슬개하 지방체(infrapatellar fat pad)가 동원되고 들어가서 전체 전방십자인대가 노출된다.

수술 및 주사 일정은 하기와 같다: 그룹(가장(sham), 비히클 및 기피 인자) 당 6마리. 동물에게 1회 내지 복수 회(예를 들면, 5회)의 주사를 바람직하게는 10일 간격으로 적용한다. 최종 주사 10일 후에 동물을 희생시키고 X-선 분석 결과를 수득한다.

뒤이어, 사파린 0-패스트(fast) 그린 및 헤마톡실린과 에오신 염색 후, 조직학적 검사를 위한 시료를 제조한다(예를 들면, 10% 중성 완충 포르말린에 의한 고정, EDTA 중의 탈회 및 파라핀 포매(embedding)).

실시예 8: 인 비트로 유전자 전달

분자 생물학의 통상적인 방법을 이용하여 유전자 치료 벡터를 제조할 수 있다. 윤활 섬유모세포의 비-바이러스 형질도입 및 바이러스 형질도입이 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Meinecke et al., 2007에 기재된다. 국소 관절-내 유전자 치료가 실시예 6 및 7에 기재된 모델을 포함하나, 이에 한정되지 않는 류마티스 관절염 및 골관절염의 다양한 동물 모델에서 분석될 수 있다.

본 명세서에서 인용된 각 특허 출원과 특허 및 본 명세서에서 인용된 각 참조문헌은 이에 의해 참조에 의해 명확하게 본 명세서에 포함되고 본 발명의 실시예에서 이용될 수 있다("본 명세서에 인용된 참조문헌(herein cited references)"). 상기 참조문헌에서 인용된 각 문서 또는 인용문헌 및 특허 출원과 특허는 이에 의해 참조로 본 명세서에 명확하게 포함된다.

바람직한 구체예가 예시되고 설명되었으나, 청구항에 의해 한정된 바와 같은 보다 넓은 양태에서 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 기술에 따라 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

실시예 9: GAG 분비의 저해

인간 연골의 시료(입방체 변 길이 5mm, 처리 당 4개의 입방체(50mg))를 OA 윤활 섬유모세포(50,000개의 세포)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션시켰다. OA SF의 존재 하의 시료를 추가적으로 각각 NETRIN1, mSlit3 또는 LRR2 dNCmut으로 처리하였다. 공-배양의 6일 후에 상층액을 채취하고 상업적으로 입수가능한 GAG-ELISA (Euro-Diagnostica, Malmo, Sweden; Wieslab sGAG quantitative Kit)를 이용하여 GAG 농도를 측정하였다. 결과는 도 9에 표시된다.

참조 문헌 목록

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Arg Cys Glu 465 470 475 480 Gly Thr Ile Val Asp Cys Ser Asn Gln Lys Leu Val Arg Ile Pro Ser 485 490 495 His Leu Pro Glu Tyr Val Thr Asp Leu Arg Leu Asn Asp Asn Glu Val 500 505 510 Ser Val Leu Glu Ala Thr Gly Ile Phe Lys Lys Leu Pro Asn Leu Arg 515 520 525 Lys Ile Asn Leu Ser Asn Asn Lys Ile Lys Glu Val Arg Glu Gly Ala 530 535 540 Phe Asp Gly Ala Ala Ser Val Gln Glu Leu Met Leu Thr Gly Asn Gln 545 550 555 560 Leu Glu Thr Val His Gly Arg Val Phe Arg Gly Leu Ser Gly Leu Lys 565 570 575 Thr Leu Met Leu Arg Ser Asn Leu Ile Gly Cys Val Ser Asn Asp Thr 580 585 590 Phe Ala Gly Leu Ser Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Arg 595 600 605 Ile Thr Thr Ile Thr Pro Gly Ala Phe Thr Thr Leu Val Ser Leu Ser 610 615 620 Thr Ile Asn Leu Leu Ser Asn Pro Phe Asn Cys Asn Cys His Leu Ala 625 630 635 640 Trp Leu Gly Lys Trp Leu Arg Lys Arg Arg Ile Val Ser Gly Asn Pro 645 650 655 Arg Cys Gln Lys Pro Phe Phe Leu Lys Glu Ile Pro Ile Gln Asp Val 660 665 670 Ala Ile Gln Asp Phe Thr Cys Asp Gly Asn Glu Glu Ser 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Cys Pro Thr Lys Cys Thr Cys Ser Ala Ala Ser Val Asp Cys His 1 5 10 15 Gly Leu Gly Leu Arg Ala Val Pro Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ala Glu 20 25 30 Arg Leu Asp Leu Asp Arg Asn Asn Ile Thr Arg Ile Thr Lys Met Asp 35 40 45 Phe Ala Gly Leu Lys Asn Leu Arg Val Leu His Leu Glu Asp Asn Gln 50 55 60 Val Ser Val Ile Glu Arg Gly Ala Phe Gln Asp Leu Lys Gln Leu Glu 65 70 75 80 Arg Leu Arg Leu Asn Lys Asn Lys Leu Gln Val Leu Pro Glu Leu Leu 85 90 95 Phe Gln Ser Thr Pro Lys Leu Thr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gln 100 105 110 Ile Gln Gly Ile Pro Arg Lys Ala Phe Arg Gly Ile Thr Asp Val Lys 115 120 125 Asn Leu Gln Leu Asp Asn Asn His Ile Ser Cys Ile Glu Asp Gly Ala 130 135 140 Phe Arg Ala Leu Arg Asp Leu Glu Ile Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn 145 150 155 160 Ile Ser Arg Ile Leu Val Thr Ser Phe Asn His Met Pro Lys Ile Arg 165 170 175 Thr Leu Arg Leu His Ser Asn His Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala 180 185 190 Trp Leu Ser Asp Trp Leu Arg Gln Arg Arg Thr Val Gly Gln Phe 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135 140 Trp Leu Ser Glu Trp Val Lys Ala Gly Tyr Lys Glu Pro Gly Ile Ala 145 150 155 160 Arg Cys Ser Ser Pro Glu Pro Met Ala Asp Arg Leu Leu Leu Thr Thr 165 170 175 Pro Thr His Arg Phe Gln Cys Lys Gly Pro Val Asp Ile Asn Ile Val 180 185 190 Ala Lys Cys Asn 195 <210> 6 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Ile Ser Cys Pro Ser Pro Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp 1 5 10 15 Cys Arg Gly Lys Gly Leu Met Glu Ile Pro Ala Asn Leu Pro Glu Gly 20 25 30 Ile Val Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Ser Ile Lys Ala Ile Pro Ala 35 40 45 Gly Ala Phe Thr Gln Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Ile Asp Ile Ser Lys 50 55 60 Asn Gln Ile Ser Asp Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Lys Ser 65 70 75 80 Leu Thr Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Ile Ala Lys 85 90 95 Gly Leu Phe Asp Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala 100 105 110 Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln Asp Leu Gln Asn 115 120 125 Leu Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ser Lys 130 135 140 Gly Leu Phe Ala 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Asp Val Lys 115 120 125 Asn Leu Gln Leu Asp Asn Asn His Ile Ser Cys Ile Glu Asp Gly Ala 130 135 140 Phe Arg Ala Leu Arg Asp Leu Glu Ile Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn 145 150 155 160 Ile Ser Arg Ile Leu Val Thr Ser Phe Asn His Met Pro Lys Ile Arg 165 170 175 Thr Leu Arg Leu His Ser Asn His Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala 180 185 190 Trp Leu Ser Asp Trp Leu Arg Gln Arg Arg Thr Val Gly Gln Phe Thr 195 200 205 Leu Cys Met Ala Pro Val His Leu Arg Gly Phe Asn Val Ala Asp Val 210 215 220 Gln Lys Lys Glu Tyr Val Cys Pro Ala Pro His Ser Glu Pro Pro Ser 225 230 235 240 Cys Asn Ala Asn Ser Ile Ser Cys Pro Ser Pro Cys Thr Cys Ser Asn 245 250 255 Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly Lys Gly Leu Met Glu Ile Pro Ala Asn 260 265 270 Leu Pro Glu Gly Ile Val Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Ser Ile Lys 275 280 285 Ala Ile Pro Ala Gly Ala Phe Thr Gln Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Ile 290 295 300 Asp Ile Ser Lys Asn Gln Ile Ser Asp Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln 305 310 315 320 Gly Leu Lys Ser Leu Thr Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn 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Asn 50 55 60 Gln Ile Ser Asp Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Lys Ser Leu 65 70 75 80 Thr Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Ile Ala Lys Gly 85 90 95 Leu Phe Asp Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 100 105 110 Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln Asp Leu Gln Asn Leu 115 120 125 Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ser Lys Gly 130 135 140 Leu Phe Ala Pro Leu Gln Ser Ile Gln Thr Leu His Leu Ala Gln Asn 145 150 155 160 Pro Phe Val Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Gln 165 170 175 Asp Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Ser Ser Pro Arg Arg 180 185 190 Leu Ala Asn Lys Arg Ile Ser Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys 195 200 205 Ser Gly Ser Glu Asp Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Ser Glu Cys Phe 210 215 220 <210> 9 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ile Val Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Ser Ile Lys Ala Ile Pro Ala 1 5 10 15 Gly Ala Phe Thr Gln Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Ile Asp Ile Ser Lys 20 25 30 Asn Gln Ile Ser Asp Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Lys Ser 35 40 45 Leu Thr Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Ile Ala Lys 50 55 60 Gly Leu Phe Asp Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala 65 70 75 80 Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln Asp Leu Gln Asn 85 90 95 Leu Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Gly Leu Phe Ala Pro Leu Gln Ser Ile Gln Thr Leu His Leu Ala Gln 115 120 125 Asn Pro 130 <210> 10 <211> 603 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Met Arg Ala Val Trp Glu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 Cys Leu Val Gly Ala Val Arg Gly Gly Pro Gly Leu Ser Met Phe Ala 20 25 30 Gly Gln Ala Ala Gln Pro Asp Pro Cys Ser Asp Glu Asn Gly His Pro 35 40 45 Arg Arg Cys Ile Pro Asp Phe Val Asn Ala Ala Phe Gly Lys Asp Val 50 55 60 Arg Val Ser Ser Thr Cys Gly Arg Pro Pro Ala Arg Tyr Cys Val Val 65 70 75 80 Ser Glu Arg Gly Glu Glu Arg Leu Arg Ser Cys His Leu Cys Asn Ala 85 90 95 Ser Asp Pro Lys Lys Ala His Pro Pro Ala Phe Leu Thr Asp Leu Asn 100 105 110 Asn Pro His Asn Leu Thr Cys Trp Gln Ser Glu Asn Tyr Leu Gln Phe 115 120 125 Pro His Asn Val Thr Leu Thr Leu Ser Leu Gly Lys Lys Phe Glu Val 130 135 140 Thr Tyr Val Ser Leu Gln Phe Cys Ser Pro Arg Pro Glu Ser Met Ala 145 150 155 160 Ile Tyr Lys Ser Met Asp Tyr Gly Arg Thr Trp Val Pro Phe Gln Phe 165 170 175 Tyr Ser Thr Gln Cys Arg Lys Met Tyr Asn Arg Pro His Arg Ala Pro 180 185 190 Ile Thr Lys Gln Asn Glu Gln Glu Ala Val Cys Thr Asp Ser His Thr 195 200 205 Asp Met Arg Pro Leu Ser Gly Gly Leu Ile Ala Phe Ser Thr Leu Asp 210 215 220 Gly Arg Pro Ser Ala His Asp Phe Asp Asn Ser Pro Val Leu Gln Asp 225 230 235 240 Trp Val Thr Ala Thr Asp Ile Arg Val Ala Phe Ser Arg Leu His Thr 245 250 255 Phe Gly Asp Glu Asn Glu Asp Asp Ser Glu Leu Ala Arg Asp Ser Tyr 260 265 270 Phe Tyr Ala Val Ser Asp Leu Gln Val Gly Gly Arg Cys Lys Cys Asn 275 280 285 Gly His Ala Ala Arg Cys Val Arg Asp Arg Asp Asp Ser Leu Val Cys 290 295 300 Asp Cys Arg His Asn Thr Ala Gly Pro Glu Cys Asp Arg Cys Lys Pro 305 310 315 320 Phe His Tyr Asp Arg Pro Trp Gln Arg Ala Thr Ala Arg Glu Ala Asn 325 330 335 Glu Cys Val Ala Cys Asn Cys Asn Leu His Ala Arg Arg Cys Arg Phe 340 345 350 Asn Met Glu Leu Tyr Lys Leu Ser Gly Arg Lys Ser Gly Gly Val Cys 355 360 365 Leu Asn Cys Arg His Asn Thr Ala Gly Arg His Cys His Tyr Cys Lys 370 375 380 Glu Gly Tyr Tyr Arg Asp Gly Lys Pro Ile Thr His Arg Lys Ala Cys 385 390 395 400 Lys Ala Cys Asp Cys His Pro Val Gly Ala Ala Gly Lys Thr Cys Asn 405 410 415 Gln Thr Thr Gly Gln Cys Pro Cys Lys Asp Gly Val Thr Gly Ile Thr 420 425 430 Cys Asn Arg Cys Ala Lys Gly Tyr Gln Gln Ser Arg Ser Pro Ile Ala 435 440 445 Pro Cys Ile Lys Ile Pro Val Ala Pro Pro Thr Thr Ala Ala Ser Ser 450 455 460 Val Glu Glu Pro Glu Asp Cys Asp Ser Tyr Cys Lys Ala Ser Lys Gly 465 470 475 480 Lys Leu Lys Ile Asn Met Lys Lys Tyr Cys Lys Lys Asp Tyr Ala Val 485 490 495 Gln Ile His Ile Leu Lys Ala Asp Lys Ala Gly Asp Trp Trp Lys Phe 500 505 510 Thr Val Asn Ile Ile Ser Val Tyr Lys Gln Gly Thr Ser Arg Ile Arg 515 520 525 Arg Gly Asp Gln Ser Leu Trp Ile Arg Ser Arg Asp Ile Ala Cys Lys 530 535 540 Cys Pro Lys Ile Lys Pro Leu Lys Lys Tyr Leu Leu Leu Gly Asn Ala 545 550 555 560 Glu Asp Ser Pro Asp Gln Ser Gly Ile Val Ala Asp Lys Ser Ser Leu 565 570 575 Val Ile Gln Trp Arg Asp Thr Trp Ala Arg Arg Leu Arg Lys Phe Gln 580 585 590 Gln Arg Glu Lys Lys Gly Lys Cys Lys Lys Ala 595 600 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <400> 11 gaccatatgg cccctgcccc accaagtgta cc 32 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <400> 12 gaccccggga ttgcatttgg ccacaatg 28 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <400> 13 gaccatatga tctcctgccc ttcgccctgc 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <400> 14 gaccccgggg aagcactcgc tgctgaacc 29 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <400> 15 gaccatatga tcgtcgaaat acgcctagaa c 31 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <400> 16 gaccccgggt gggttttggg ctaagtggag 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <400> 17 gaccatatgg acctcgtgtg ccccgagaag 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <400> 18 gaccccgggg ctcagctggc agctactctc 30 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <400> 19 ccaacaagat caacgccctg cgggttaaca cgtttcagg 39 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <400> 20 cctgaaacgt gttaacccgc agggcgttga tcttgttgg 39 <210> 21 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ile Val Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Ser Ile Lys Ala Ile Pro Ala 1 5 10 15 Gly Ala Phe Thr Gln Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Ile Asp Ile Ser Lys 20 25 30 Asn Gln Ile Ser Asp Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Lys Ser 35 40 45 Leu Thr Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Ile Ala Lys 50 55 60 Gly Leu Phe Asp Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala 65 70 75 80 Asn Lys Ile Asn Ala Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln Asp Leu Gln Asn 85 90 95 Leu Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Gly Leu Phe Ala Pro Leu Gln Ser Ile Gln Thr Leu His Leu Ala Gln 115 120 125 Asn Pro 130

Claims (20)

1. 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자(repellent factor)의 용도.
2. 제1항에 있어서, 상기 기피 인자는 슬리트(Slit), 네트린(Netrin), 에프린(Ephrin) 및 세마포린(Semaphorin)의 군으로부터 선택되는 것인 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기피 인자는 a) SLIT3 (서열번호 1) 또는 NETRIN1 (서열번호 10)의 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 상동성을 가지거나, b) SLIT3 또는 NETRIN1의 활성 단편이거나 또는 c) b)의 활성 단편의 아미노산 서열에 대해 85% 이상 상동성을 갖는 것인 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기피 인자는 서열번호 1 내지 9 또는 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 1 내지 9 또는 21의 아미노산 서열 중 하나에 대해 85% 이상의 상동성을 갖고 상기 아미노산 서열은 성숙(mature) SLIT3 단백질보다 더 짧은 것인 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기피 인자는 SLIT3 (서열번호 1)의 단편인 것인 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기피 인자는 ROBO 수용체, DCC 또는 UNC 수용체의 효능제(agonist) 또는 길항제(antagonist)인 것인 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골 결손은 윤활 섬유모세포(synovial fibroblast)의 관절 연골 또는 비-관절 연골로의 침습 또는 이동과 연관되거나 및/또는 판누스(pannus) 형성과 연관된 것인 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골 결손은 관절 연골 또는 비-관절 연골로의 세포의 감소된 부착과 연관된 퇴행성 질환인 것인 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골 결손은 퇴행성 질환이고, 상기 질환은 퇴행성 추간판증(degenerative disc disease), 반월판 파열(meniscus tears), 전방십자인대(ACL) 손상, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 연소기 만성 관절염(juvenile chronic arthritis), 근성 가성관절염(rhizomelic pseudoarthritis), 류마티스 다발성 관절염, 윤활막염 또는 융모결절성 윤활막염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도.
10. 제1항 내지 제9항에 있어서, 상기 기피 인자는 적어도 제2 루이신-리치 반복(leucine-rich repeat) 도메인 또는 상동성 루이신-리치 반복 도메인에서 당화되지 않은(non-glycosylated) 것인 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 기피 인자의 용도.
11. 서열번호 1 내지 9 또는 21의 아미노산 서열 중 하나와 85% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 단리된 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 서열은 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 성숙 SLIT3 단백질보다 짧은 것인 단리된 폴리펩티드.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 기피 인자 또는 제11항의 폴리펩티드를 포함하는, 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 담체, 이식물, 또는 전달 시스템과 조합되는 것인 약제학적 조성물.
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 기피 인자, 또는 제11항의 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 혈전형성 활성을 갖는 하나 이상의 물질, 첨가제 또는 매트릭스를 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 기피 인자, 또는 제11항의 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 연골조직 세포(cartilage cell)를 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 연골조직 세포는 연골세포인 것인 약제학적 조성물.
17. 약제학적 조성물은 주사용 제제인 것인 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 기피 인자의 용도 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 관절내 및/또는 윤활액내로의 투여를 위한 주사용 제제인 것인 기피 인자의 용도 또는 약제학적 조성물.
19. 약제학적 조성물은 수성 액체, 고체, 반고체, 페이스트, 퍼티(putty), 리포좀, 형태 안정 물질(shape stable material), 매트릭스, 인-시투 설정 물질(in situ setting material), 또는 조직 부착성 생체물질(tissue adhesive biomaterial)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제1항 내지 제10항, 제17항 또는 제18항에 따른 기피 인자의 용도 또는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물.
20. C는 시스테인을 나타내고 Y는 아미노산을 나타내는 것인, 공통 서열(consensus sequence) C(Y)₃CYC(Y)₆C(Y)₉₉C(Y)₄₇CYC(Y)_{2 O}C(Y)_{2 O}C(Y)_{2 O}C(Y)_13-22C를 포함하는, 연골 결손의 예방 및/또는 치료를 위한 단리된 폴리펩티드.

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