KR20100072167A - 카스파제 이미징 프로브 - Google Patents

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KR20100072167A
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마이크 킨더만
카트린 미니에쥬
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사노피-아벤티스
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Abstract

본 발명은 시험관내 검정에서, 세포에서 또는 다세포 유기체에서, 선택된 카스파제의 촉매 활성의 관찰을 가능하게 하는, 본 명세서에 정의된 화학식 I의 분자 프로브, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
[화학식 I]
{L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2

Description

카스파제 이미징 프로브{Caspase imaging probes}
본 발명은 시험관내 검정에서, 세포에서 또는 다세포 유기체에서, 개개의 단백질 분해 효소들 또는 단백질 분해 효소들의 그룹들의 촉매 활성의 관찰을 가능하게 하는 분자 프로브(기질)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 프로브(기질)의 합성 방법 및 설계 방법에 관한 것이다.
단백질 분해 효소(프로테아제)는 살아있는 세포의 내부 및 외부에서 다른 효소 또는 펩타이드를 절단하거나 분해한다. 프로테아제는 많은 생명 과정에 관여하며, 이들 중 다수는 세포 신호 전달 및 조직 항상성에 있어서 중요하다. 프로테아제의 이상(aberrant)하거나 항진된(enhanced) 활성은 암, 골관절염, 죽상경화증, 염증 및 많은 다른 질환을 포함한 각종 질환과 관련된다. 단백질 분해 활성은 생물계에서 엄격한 제어 하에서 유지되어야 하기 때문에, 많은 프로테아제는, 제어된 단백질 분해적 절단에 의해 활성화되는 불활성 전구체 단백질(지모겐)로서 발현된다. 단백질 분해 활성의 추가의 제어는, 효소에 결합되고, 이에 의해 효소의 촉매 활성 형태를 불활성화하는 내인성 억제제로부터 얻어진다. 이러한 엄격한 조절의 관점에서, 세포 사건 또는 생리학적 사건에서 프로테아제 기능의 조사는 프로테아제 발현 단독의 모니터링이라기보다는 프로테아제 활성의 모니터링을 필요로 한다. 그 결과, 각종 활성 기반의 화학적 프로브들이 문헌에 제안되어 왔다. 일반적으로 적용되는 프로테아제 프로브는 (i) 리포터 시스템 t의 분광학적 특성의 변화로 이어지는 펩타이드 결합의 효소적 절단을 통하여, 또는 (ii) 기전 기반의 억제제의, 관심있는 프로테아제에의 공유결합에 의해 검출가능한 신호를 발생시킨다. (예를 들면, 세포-기반 검정 또는 동물 전체 이미징(whole-animal imaging) 실험에서) 특이적 프로테아제 또는 프로테아제들의 그룹의 활성 및 억제의 국소화 및 정량적인 조사는 (i) 프로테아제 작용의 생리학적으로 관련된 좌위(locus) (예를 들면, 동물 전체 이미징에서 세포 또는 특이적 기관의 세포질)에 도달하고, (ii) 원하는 프로테아제 또는 프로테아제들의 그룹에 대하여 선택적인 이미징 프로브의 개발을 필요로 한다. 프로테아제 선택적 프로브의 생성은 이 분야에 상당한 도전을 가해 왔다. 본 발명은 (i) 바람직하게는 카스파제 서브패밀리로부터의 시스테인 프로테아제에 대하여 선택적인 신규한 프로브, (ii) (예를 들면, 분자 이미징에 의한) 시험관내 검정에서, 세포에서 또는 다세포 유기체에서, 이들 프로브의 적용 및 (iii) 이러한 프로브의 합성 방법 및 설계 방법에 관한 것이다.
최근 들어, 몇 가지 분자 이미징 기술(광학적 및 비-광학적)이 생체내 특이적 분자 표적들 및 경로들의 비-침습적 가시화에 더욱 더 중요해지고 있다. 임의의 이미지 신호의 정보 내용이 주로 내부 컨트라스트(internal contrast)의 함수이기 때문에, 효소 반응시 활성화 가능한(예를 들면, 펩타이드 결합의 절단), 내부적으로 소광된 이미징 프로브의 개발이 촉매 활성 프로테아제를 이미지화하고 국소화하는 데 일반적으로 적용되어 왔다. 개개의 프로테아제에 대하여 선택적이고, 생체내에서 프로테아제 작용의 좌위에 도달하는 능력을 발휘하는 프로브의 생성은 통상의 접근으로는 거의 달성되어 있지 않다. 제약 산업에서 의약품 화학자들은 적절한 약동학적 특성을 갖는 약물의 개발 및 주어진 표적에 대한 적절한 특이성에 관련된 도전에 직면한다. 본 발명에서, 본 발명자들은 시스테인 프로테아제에 대하여 선택적인 활성 기반의 프로브를 향한 새로운 경로를 고안하고, 이 접근을 카스파제 서브패밀리로부터의 프로테아제에 적용하였다.
시스테인 프로테아제는 촉매작용 동안 친핵체로서의 역할을 하는 활성 부위 내의 시스테인 잔기에 의해 특징지어진다. 이러한 촉매 시스테인은 적절한 인접 잔기와 일반적으로 수소 결합되어, 티올레이트 이온이 형성될 수 있게 한다. 기질이 이 프로테아제에 의해 인식될 경우, 절단가능한 펩타이드 결합이 촉매 시스테인 부근에 위치되고, 이 촉매 시스테인은 옥소음이온 중간체를 형성하는 카보닐 탄소를 공격한다. 이어서, 아미드 결합이 절단되고, 아민으로서 C-말단 펩타이드를 유리시킨다. 절단가능한 펩타이드의 N-말단 부분은 공유결합된 아실-효소 중간체로 남게 되고, 이어서 이 공유결합된 아실-효소 중간체는 물에 의해 절단되고, 그 결과 효소가 재생성된다. 기질의 N-말단 절단 생성물은 카복실산으로서 유리된다.
카스파제는 시스테이닐 아스파르테이트-특이적 프로테아제의 패밀리이다. 사람 게놈은 11개의 카스파제를 암호화한다. 이들 중 8개(카스파제-2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 및 14)는 아폽토시스 또는 프로그램 세포사에 작용한다. 이들은 고도로 조절된 신호전달 연속증폭단계를 통하여 진행된다. 계층적 순서에서, 몇 가지 개시 카스파제(카스파제-2, 8, 9 및 10)는 이펙터 카스파제(카스파제-3, 6 및 7)를 절단하고 활성화한다. 이들 카스파제는 암, 자가면역 질환, 변성 장애 및 뇌졸중에 관여한다. 3개의 다른 카스파제(카스파제-1, 4 및 5) 는 상이한 작용을 제공한다: 염증성 사이토카인의 서브세트의 활성화에 의해 매개된 염증.
카스파제-1 또는 인터루킨-1β-변환 효소(ICE)는 단핵구 세포에서 주로 발견된다. 이 프로테아제는 염증촉진성 사이토카인 인터루킨-1-베타 및 인터루킨-18의 생성을 맡는다. 카스파제-1의 억제는, 류마티스성 관절염, 골관절염, 염증성 장질환 및 천식을 포함한, 사람 염증 질환의 모델에서 유익한 것으로 밝혀져 왔다.
카스파제-3은 세포골격 단백질, 키나제 및 DNA-복구 효소를 포함한, 각종 기본적인 단백질의 단백질 분해 절단을 맡는다. 이것은 신경세포에서 아폽토시스의 중요한 매개체이다. 카스파제-3의 억제는 뇌졸중, 외상성 뇌 척수 손상, 저산소 뇌 손상, 심장 허혈 및 재관류 손상과 같은 모델에서 효능을 보여주어 왔다.
카스파제-8은 TNF 수퍼-패밀리 사멸 수용체의 하류인, 아폽토시스 개시 카스파제이다. 이의 기질에는 아폽토시스-관련 이펙터 카스파제 및 아폽토시스 촉진성 Bcl-2 패밀리 구성원이 포함된다. 암에서 아폽토시스에 대한 저항성은 카스파제-8의 낮은 발현 수준과 관련되어 왔으며, 카스파아제-8의 억제는 화학요법 및 방사선과 같은 아폽토시스-유발 스트레스 인자에 대한 저항성을 증가시킨다. 이와 같이, 카스파제-8은 종양 및 전이 병소의 치료에 있어서 매력적인 표적이다. 녹아웃(knockout) 연구는 마찬가지로 아폽토시스와는 관계없는, 카스파제-8에 대한 여러 다른 잠재적인 역할을 밝힌다. 예를 들면, 카스파제-8 녹아웃은 백혈구 분화, 증식 및 면역 반응에서 결핍을 나타낸다.
단백질 분해 효소의 경우, 세포 생리학 및 병리학에서 이의 기능적 역할을 나타내는 것은 단지 발현 수준이라기보다는 이의 활성이다. 따라서, 카스파제의 활성을 억제하는 분자는, 질환의 치료에서 치료학적 제제로서, 그리고 단백질 분해 활성을 가시화하는 특이적 이미징 바이오마커의 개발에서 유용하며, 게다가 약물 후보를 통한 이의 억제는 표적 확인(validation), 약물 개발 및 심지어 임상적 시험을 가속화할 수 있다(H. Pien et al. Drug Discovery Today, 2005, 10, 259-266). 활성 기반의 이미징제(imaging reagent)를 사용하여, 복합체 단백질 혼합물, 온전한 세포 및 심지어 생체내에서 특이적 단백질 또는 단백질 패밀리를 용이하게 모니터링할 수 있다. 더욱이, 기능적 연구에 사용될 수 있는 소분자 억제제에 대한 스크린을 개발하는 데 효소 부류 특이적 프로브가 사용될 수 있다(D.A. Jeffery, M. Bogyo Curr. Opp. Biotech. 2003, 14, 87-95).
지금까지, 세포 기반 검정에서 카스파제-1(W.Nishii et al., FEBS Letters 2002, 518, 149-153) 또는 카스파제-3(S. Mizukami et al., FEBS Letters 1999, 453, 356-360)을 모니터링하고 표지화하기 위해 펩타이드 기질을 혼입시킨 활성 기반의 이미징 프로브가 개발되어 왔다. 더욱이, 근적외 형광 프로브가 살아있는 동물에서 카스파제-1 활성을 검출함이 보고되어 왔다(S. Messerli et al., Neoplasia 2004, 6, 95-105).
이들 카스파제에 의해 사용되는 효소 기전이 잘 연구되어 왔으며, 고도로 보존되어 있다. 절단가능한 펩타이드에 대한 조사 및 스크리닝 데이터로부터, 이 보존된 활성 부위와 관련해서만 단지 반응하는 친전자성 기질 유사체가 개발되어 왔다. 이러한 프로브에서 친전자 중심은 통상 이른바 "워헤드(warhead)"라는 분자적 개체(molecular entity)의 일부이며, 이것은 카스파제의 활성 부위 내로 완벽하게 넣어지도록(카스파제의 활성 부위에서 이것은 촉매 시스테인 잔기와 반응한다), 이의 친전자 특성 및 이의 기하학적 배열에 있어서 최적화되어 있다. 각종 다양한 이러한 친전자성 기질이 기전 기반의 시스테인 프로테아제 억제제로서 기재되어 왔으며, 예를 들면, 비제한적으로 디아조메틸 케톤, 플루오로메틸 케톤, 아실옥시메틸 케톤, O-아실하이드록시아민, 비닐 설폰 및 에폭시석신산 유도체를 포함한다(S. Verhelst, M. Bogyo QSAR Comb. Sci. 2005, 24, 261-269).
프로테아제 활성을 모니터링하기 위한 또 다른 도구는 생물발광 검정에 있다. 이 방법은 아미노-개질된 딱정벌레 프로-루시페린(바구니(caged) 루시페린) 또는 이의 카복시-말단 유도체의 프로테아제 기질에의 결합을 사용한다. 먼저, 단백질 분해 절단은 루시페린을 방출시키고, 이어서 루시페린은 루시퍼라제에 의해, 발광 신호로서 검출 가능하게 변환된다. 이러한 2차적 검정은 형광 프로브보다 유사한 적용 스펙트럼을 가지며, 높은 신호 대 잡음 비라는 추가의 이점을 제공한다.
생물학적 도구로서 효과적이기 위해서, 프로테아제 억제제는 특정 프로테아제에 결합함에 있어서 매우 강력해야 할 뿐만 아니라 고도로 선택적이어야 한다. 특이적 프로테아제에 대한 소분자 억제제의 개발은 흔히 펩타이드 기질로부터 출발하였다. 펩타이드가 다양한 범위의 생물학적 특성을 나타내더라도, 약물로서의 이의 사용은 이의 불안정성 및 이의 낮은 경구 생체이용률에 의해 저하될 수 있다. 효과적인 약물이기 위해서는, 감소된 펩타이드-유사 특성, 비선택적 단백질 분해에 대한 높은 안정성, 주어진 프로테아제에 대한 높은 선택성 및 프로테아제 작용의 좌위에 대한 우수한 생체이용률을 갖는 프로테아제 억제제가 바람직하다. 이러한 요구조건은 카스파제 억제제 A-B의 개발로 이어졌는데, 여기서 A는 친전자성 워헤드 B에 공유결합된 화학적 골격이다. 카스파제의 존재하에, B는 촉매 시스테인과 공유결합적으로 반응한다(기전 기반 억제제). 많은 경우에, 이러한 억제제의 선택성 및 약동학적 특성은 생물의학적 연구와 관련하여 성공적으로 최적화되었다. 촉매 시스테인의 효과적인 친핵성 공격을 가능하게 하기 위해서, 이러한 억제제의 친전자 중심은 효소의 활성 부위 내에 정확히 배향되어야 한다. 워헤드의 친전자성 탄소 원자에 대하여 촉매 시스테인의 특별한 배열은 절단가능한 펩타이드 기질의 펩타이드 카보닐 및 촉매 시스테인의 공간적 배열에 잘 대응한다. 이러한 비교로부터, 본 발명자들은 (화학적 골격 A와 친전자성 워헤드 B를 갖는) 최적화된 공유결합 억제제를 절단가능한 기질로 "재설계"하는 것이 가능할 수 있을 것이라는 착상에 도달하였다. 화학적 골격 A는 억제제 선택성의 결정인자로 고려될 수 있기 때문에, 본 발명자들의 접근은 활성 기반 화학적 프로브 내로 최적화된 억제제의 선택성 또는 선택성 일부의 이행을 가능하게 할 것이다. 본 발명자들은 이러한 방법을 선택적 카스파제 억제제로부터의 선택적 활성 기반 프로브의 "역전된 설계"라 부른다.
본 발명은 화학식 I의, 시스테인 프로테아제에 대한 분자 프로브에 관한 것이다.
[화학식 I]
{L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2
위의 화학식 I에서,
A는 카스파제에 의해 인식가능한 그룹이고;
R1은 링커이고;
R2는 결합 또는 링커이고;
L은 그룹 L1의 용이한(facile) 접합을 가능하게 하는 결합 또는 그룹이고;
L1 및 L2는, 서로 독립적으로, 고체 지지체에 임의로 결합되는 하나 이상의 표지(label)이고;
n은 1이거나,
또는
R2는 결합이고;
L2는, 커플링된 생물발광 검정에 적합한 기질이고;
n은 0이다.
화학식 I의 화합물은, 바람직하게는 카스파제 패밀리로부터의 시스테인 프로테아제에 대한 활성 기반 프로브(기질)이다.
이의 가장 기초적인 형태에서, 화학적 프로브는 4개의 기능적 요소, a) 반응성 그룹으로서, 프로테아제의 작용에 의해 절단될 수 있는 아미드 그룹 -CO-NH-, b) 주어진 프로테아제 표적에 대한 선택성을 한정하는 골격 A, c) 서브유닛들을 서로 연결하기 위한 링커 잔기 R1 및 R2 및 d) 검출을 위한 표지 L1 및 L2의 세트로 이루어진다.
그룹 A는 바람직하게는 주어진 카스파아제 또는 카스파아제들의 그룹, 바람직하게는, 예를 들면 표 1, 2 및 3의 화합물 1 내지 화합물 43에 나타낸 바와 같은 카스파제-1, 3 및 8에의 특이성에 대한 주요 결정인자이다. 본 발명의 활성-기반 프로브는 주어진 카스파제에 대한 선택성이 1000 내지 1배, 바람직하게는 10 내지 1배를 나타내며, 여기서 선택성은 바람직한 기질 농도에서 상대적인 턴오버 수(효소 1에 관한 턴오버 수 대 효소 2에 관한 턴오버 수)로 정의된다. 상대적인 턴오버 수는, 각각의 효소 쌍에 대하여, 관심있는 효소(효소 1)의 턴오버 수를, 선택성이 요구되는 또 다른 효소(효소 2)의 턴오버 수로 나눔으로써 결정된다. 생체내 적용의 경우, 높은 선택성이 낮은(예를 들면, 마이크로몰 또는 마이크로몰 이하) 기질 농도에서 요구된다.
반응식 1은 프로테아제 P의 기질과의 반응을 나타내는데, 여기서 A는 특이성 결정인자를 나타내고, P는 티올 그룹 S-를 포함하는 반응성 시스테인을 갖는 프로테아제를 나타낸다.
[반응식 1]
Figure pct00001
이 반응 속도는 기질의 구조에 의존한다.
링커 그룹 R1 또는 R2는 바람직하게는, 표지 L1 또는 L2에 각각 연결되거나, 복수의 동일하거나 상이한 표지 L2 또는 L1에 연결된 가요성 링커이다. 링커 그룹은 구상된 적용과 관련하여, 즉 특이적 프로테아제에 대한 활성 기반 이미징 프로브에 관련하여 선택된다. 당해 링커는 또한 적절한 용매에서의 기질의 용해도를 증가시킬 수 있다. 사용되는 링커들은 실제의 적용 조건 하에서 화학적으로 안정하다. 링커는 선택된 프로테아제 표적의 반응을 방해하지도 않고, 표지 L1 및/또는 L2의 검출을 방해하지도 않지만, 어떤 시점에서 절단되도록 작제될 수 있다. 더욱 구체적으로, 링커 그룹 R1 또는 R2는 1 내지 300개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 그룹이고, 여기서 임의로
(a) 하나 이상의 탄소 원자는 산소로 대체되고, 특히 세 번째 탄소 원자마다 산소로 대체되고, 예를 들면, 1 내지 100개의 에틸렌옥시 단위를 갖는 폴리에틸렌옥시 그룹이고/이거나;
(b) 하나 이상의 탄소 원자는 수소 원자를 갖는 질소로 대체되고, 인접 탄소 원자들은 옥소로 치환되어, 아미드 작용기 -NH-CO-를 나타내고/내거나;
(c) 하나 이상의 탄소 원자는 에스테르 작용기 -O-CO-로 대체되고;
(d) 2개의 인접 탄소 원자들 사이의 결합은 이중 결합 또는 삼중 결합이고/이거나;
(e) 2개의 인접 탄소 원자들은 디설파이드 결합으로 대체된다.
기질의 표지 L1 및 L2는 프로브가 목적으로 하는 적용에 따라 당업자들에 의해 선택될 수 있다.
표지 L1 및 L2는 서로 독립적으로 형광단; 소광제(quencher) 또는 발색단과 같은 분광학적 프로브; 자기 프로브; 조영제; 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합 쌍(specific binding pair)의 한 부분인 분자; 효소의 기질인 분자, 당업자들에게 공지된 중합체 지지체, 덴드리머, 유리 슬라이드, 미세역가 플레이트 분자에 공유결합되는 분자; 또는 위에 열거된 임의의 특성들의 조합을 갖는 분자이다.
본 발명의 바람직한 양태는, 중심 골격 A로부터 절단시 루시퍼라제에 의한 변환을 통하여 발광 신호를 발생시킬 수 있는 리포터 그룹으로서, 개질된 아미노루시페린 또는 이의 카복시-말단 보호된 유도체의 용도이다. 그러므로, 표지 L2는 대안적으로, 리포터 그룹으로서, 개질된 아미노루시페린 또는 이의 카복시-말단 보호된 유도체를 특징으로 하는, 커플링된 생물발광 검정에 적합한 기질일 수 있다.
미국 특허 제7148030호는 개질된 아미노루시페린에 결합되는 카스파제 기질로서 펩타이드를 포함하는 생물발광 프로테아제 검정의 예를 개시한다.
중합체 골격, 및 골격 A를 거쳐 중합체 골격에 형광 소광으로 이어지는 밀도로 공유결합된 복수의 형광색소를 포함하는, 분자내에서 소광된 형광 프로브들로 이루어진 프로브가 바람직하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 둘 이상의 형광단이 골격 A를 거쳐 형광 소광으로 이어지는 밀도로 공유결합된 덴드리머형 거대분자의 용도이다. 중합체 프로브의 용도는 국소화된 프로브 전달(표적화) 및 동물 또는 사람의 혈류에서 연장된 순환 시간의 이점을 갖는다. 중합체 접합은 저분자량 물질들의 생체내 분포를 변경시키며, 독성 부위에의 감소된 접근으로 (강화된 투과성 및 체류 효과(enhanced permeability and retention effect, EPR effect)에 의한) 종양-특이적 표적화를 가능하게 하며, 중합체 접합체와 저분자량 이미징 프로브의 조합은 마우스, 래트 등과 같은 포유동물을 포함한 다세포 유기체를 이미징함에 있어서 본 발명의 가장 바람직한 양태이다. 중합체 골격은 임의의 생체적합성 중합체로 이루어질 수 있으며, 폴리펩타이드, 폴리사카라이드, 핵산 또는 합성 중합체를 포함할 수 있다. 본 발명과 관련하여 유용한 중합체들의 포괄적인 개요는 문헌[M.J. Vincent et al. Trends Biotech. 2006, 24, 39-47] 및 문헌[R. Duncan, Nature Reviews Cancer, 2006, 688-701]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명과 관련하여 유용한 중합체들의 추가의 기재는 국제공개공보 제WO99/58161호에 개시되어 있다. 중합체 프로브 또는 덴드리머 프로브는 이의 골격 또는 이의 덴드리머형 분자에 공유결합된 보호 쇄들을 포함할 수 있다. 보호 쇄들은 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리에틸렌글리콜 및 에틸렌글리콜의 추가의 공중합체가 포함한다.
본 발명의 프로브는 표적화 부분(targeting moiety), 예를 들면, 항체, 항체 절편, 수용체-결합 리간드, 펩타이드 절편 또는 합성 단백질 억제제를 추가로 포함할 수 있다.
표지 L1 및 L2는 추가로, 양하전된 선형 또는 분지형 중합체일 수 있다. 상기 중합체는 살아있는 세포의 원형질막 전체에 걸쳐 결합 분자들의 수송을 촉진시키는 것으로 당업자들에게 공지되어 있다. 이것은, 그렇지 않으면 낮은 세포막 투과성을 갖거나, 살아있는 세포의 세포막에 대하여 사실상 불투과성인 물질에 특히 바람직하다. 세포 비투과성 화학적 프로브는 이러한 그룹 L1 또는 L2에의 접합시에 투과성인 세포막으로 될 것이다. 이러한 세포막 수송 인핸서 그룹 L1 및 L2는, 예를 들면, 6 내지 15개의 아르기닌 잔기를 갖는 D- 및/또는 L-아르기닌의 선형 폴리(아르기닌), 각각의 서브유닛이 구아니디늄 그룹을 갖는 6 내지 15개의 서브유닛의 선형 중합체, 올리고머 또는 6 내지 50개 이하의 서브유닛의 단길이 중합체, 구아니디늄 그룹들을 결합한 것의 일부분 및/또는 HIV-tat 단백질 서열의 부분, 예를 들면, 서브유닛 Tat49-Tat57(1문자 아미노산 코드에서 RKKRRQRRR)을 포함한다. 6 내지 15개의 아르기닌 잔기를 갖는 D- 및/또는 L-아르기닌의 선형 폴리(아르기닌)은 바람직하게는, 2개의 상호작용하는 분광학적 프로브 L1/L2(예를 들면, FRET 쌍에서)의 한 구성원이 L1이고, 나머지 한 구성원이 L2인 경우에 중합체 표지로서 사용된다.
표지 L1 및/또는 L2로는 분광학적 프로브가 가장 바람직하다. 표지 L2로는 L1과의 분광학적 상호작용 쌍의 한 부분으로 표시되는 분자들이 가장 바람직하며, 더욱이 고체 지지체에 공유결합되는 분자들 및 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 표지이다.
2개의 상호작용하는 분광학적 프로브 L1/L2의 한 구성원이 L1이고 나머지 한 구성원이 L2가 되도록 하는 표지가 특히 바람직한데, 이 프로브 L1/L2에서는 에너지가 동적 소광 또는 정적 소광 중 어느 하나를 통하여 공여자와 수용자(소광제) 사이에 비-방사로 전달될 수 있다. 표지 L1/L2의 이러한 상기 쌍은 이에 대응하는 카스파제 프로테아제를 통한 반응/절단시에 이 쌍의 분광학적 특성을 변화시킨다. 표지 L1/L2의 이러한 쌍의 예는 FRET(Forster resonance energy transfer) 쌍이며, 예를 들면, 한 단(예를 들어, L1)에서는 공여자(리포터)와 공유결합적으로 표지되고, 또 다른 한 위치(L2)에서는 수용자(소광제)와 공유결합적으로 표지되거나, 그 반대인 전-형광(pro-fluorescent) 프로브이다.
특히, L1이 공여자(리포터)이고, L2가 수용자(소광제)이거나, L1이 소광제이고, L2가 리포터이다. 이러한 프로브를 사용할 때, 시스테인 프로테아제와 당해 프로브의 반응은 형광의 변화로 이어질 것이다. 이중 표지된 기질 내의 리포터-소광제 거리는 프로테아제와의 반응시에 변화되며, 리포터와 소광제의 공간적 분리로 이어지며, 이는 방출 파장의 형광 또는 변화의 출현의 원인이 된다. 리포터 그룹들의 폭넓은 선택이 각각 표지 L1 또는 L2로서 사용될 수 있으며, 예를 들면, 근적외 발광 형광단을 포함한다. 리포터 및 소광제를 함유하는 기질은 이것이 프로테아제와 반응할 때까지는 어두운 채로 유지되다가, 반응하자마자 반응 혼합물이 형광단 방출을 켜면서(switching on) "밝아지는데(lit up)", 이는 리포터 표지 및 소광제 표지가 지금 공간적으로 분리되어 있기 때문이다. 형광 소광 및 에너지 전달은 2개의 표지, 소광된 표지 또는 에너지 공여자 표지 중 단지 하나의 방출에 의해 측정될 수 있다. 에너지 전달이 일어나고, 에너지를 수용하는 표지가 또한 형광성인 경우, 수용자 표지 형광이 또한 측정될 수 있다. 이들 2개의 상호작용하는 표지의 공여자 표지는 화학발광성 공여자 프로브들로부터 선택될 수 있는데, 이러한 공여자 표지는 여기(excitation) 램프의 필요성을 없애주고, 수용자 배경 형광을 감소시킨다. 이러한 이중-표지된 기지들을 사용하는 언급된 특별한 방법은 형광 시간 측정에 기반한 반응 속도론을 결정하는 데 유용하며, 시험관내뿐만 아니라 생체내에도 적용될 수 있다.
대안적으로, 표지 L2는 고체 지지체이거나, 고체 지지체에 추가로 결합되거나 중합체/고체 지지체에 결합 가능할 수도 있다. 6 개지 15개의 아르기닌 잔기를 갖는 D- 및/또는 L-아르기닌의 선형 폴리(아르기닌)은 바람직하게는 L1/L2 FRET 쌍의 중합체 표지로서 사용된다.
특히 바람직한 조합은 2개의 상이한 친화성의 표지, 특히 분광학적 상호작용 표지 L1/L2의 쌍, 예를 들면, FRET 쌍이다. 친화성 표지는 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합 쌍의 한 부분인 분자로서 정의된다. 고려되는 특이적 결합 쌍은, 예를 들면, 비오틴, 아비딘 또는 스트렙타비딘, 더욱이 메토트렉세이트이며, 메토트렉세이트는 효소 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)의 밀접-결합(tight-binding) 억제제이다.
리포터 및 소광제의 적절한 쌍은 당업자들에 의해 선택될 수 있다. 통상적으로 리포터 및 소광제는 큰 스펙트럼 중첩을 갖는 형광 염료이며, 예를 들면, 리포터로서는 플루오레세인, 그리고 소광제로서는 로다민과 같은 것이다. 다른 소광제는 금 클러스터 및 금속 크립테이트이다.
본 발명에 사용되는 소광제의 두 번째 부류는 "어두운 소광제"이며, 즉 통상의 리포터 염료의 방출 스펙트럼과 중첩되는 흡수 스펙트럼을 가져 최대 FRET 소광으로 이어지는 천연 형광을 갖지 않는 염료이다. 더욱이, 염료들의 쌍은 기저 상태 복합체(정적 소광) 내의 공명 쌍극자-쌍극자 상호작용 기전을 촉진시키기 위해서 이들의 흡수 밴드가 중첩되도록 선택될 수 있다.
고려되는 특정 형광단 및 소광제는, Alexa 350, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 555, Alexa 635 및 Alexa 647(미국 특허 제5696157호, 미국 특허 제6130101호, 미국 특허 제6716979호)를 포함한 Alexa 염료; 디메틸아미노쿠마린(예를 들면, Invitrogen, 미국 캘리포니아주 92008 소재)에 의해 제품 D374로서 공급되는 7-디메틸아미노쿠마린-4-아세트산 석신이미딜 에스테르; 소광제 QSY 35, QSY 9 및 QSY 21(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 92008 소재); 시아닌-3(Cy 3), 시아닌 5(Cy 5) 및 시아닌 5.5(Cy 5.5) (Amersham - GE Healthcare, 독일 졸링엔 소재); BHQ-1, BHQ-2 및 BHQ-3(Biosearch Technologies, Inc.의 Black Hole QuencherTM, 미국 캘리포니아주 94949 노바토 소재); 형광단 ATTO 488, ATTO 532, ATTO 600 및 ATTO 655 및 소광제 ATTO 540Q 및 ATTO 612Q(Atto-Tec, 독일 D57076 지겐 소재); 형광단 DY-505, DY-547, DY-632 및 DY-647(Dyomics, 독일 예나 소재); 5/6-카복시플루오레세인, 테트라메틸로다민, 4-디메틸아미노아조벤젠-4'-설포닐 유도체(Dabsyl) 및 4-디메틸아미노아조벤젠-4'-카보닐 유도체(Dabcyl)이다. 이들은 하기 조합으로 유리하게 조합될 수 있다.
형광단
● Alexa 350, 디메틸아미노쿠마린, 5/6-카복시-플루오레세인, Alexa 488, ATTO 488, DY-505
● 5/6-카복시플루오레세인, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 555, ATTO 488, ATTO 532, 테트라메틸로다민, Cy 3, DY-505, DY-547,
● Alexa 635, Alexa 647, ATTO 600, ATTO 655, DY-632, Cy 5, DY-647 Cy 5.5
소광제
● Dabsyl, Dabcyl, BHQ 1, QSY 35
● BHQ 2, QSY 9, ATTO　540Q
● BHQ 3, ATTO 612Q, QSY　21
효소 사건에 관련된 생물발광 검정은 촉매작용의 순간 속도에 결합되는 광을 발생시킨다. 이 방법은 아미노-개질된 딱정벌레 아미노루시페린 또는 이의 카복시-말단 보호된 유도체를 포함하는데, 아미노루시페린의 아미노-그룹이 아미드 결합을 거쳐 중심 골격 A에 결합되어 있으며, 그 결과 카스파제에 의해 인식되고, 이어서 절단되는 기질로 된다. 카스파제의 효소 활성은 아미노루시페린을 골격 A에 연결하는 펩타이드 결합의 절단으로 이어지며, 루시퍼라제의 기질인 아미노루시페린을 유리시킨다. 이후의, 루시퍼라제와 이의 기질의 반응은 검출가능한 신호(발광)를 발생시킨다. 이와 같이, 이 방법은 카스파제 활성을 두 번째 효소 반응과 관련시키며, 판독 신호로서 발광을 생성한다. 이러한 유형의 검정은 "프로-루시페린"("바구니 루시페린")의 개발을 필요로 하며, 이것은 앞선 효소 사건, 예를 들면, 단백질 분해 절단에 의해 루시페린으로 변환될 때에만, 루시퍼라제에 의해 기질로서 인식된다. 이런 방법으로, 발광 신호는 이전의 효소 사건에 직접적으로 의존한다. 그러므로, 본 발명의 추가의 양태는 발광에 의해 카스파제의 단백질 분해 활성을 검출하기 위한 프로브를 제공하는 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 L2가 고체 지지체이거나, 리포터/소광제 쌍의 한 구성원을 추가로 갖는 고체 지지체에 결합되거나, L2가 고체 지지체와 리포터/소광제 쌍의 한 구성원의 조합이고, L1이 이 쌍의 나머지 한 구성원인 기질을 포함한다. 이런 방법으로, 어두운 고체 지지체는 적절한 프로테아제와의 반응시에 형광성으로 된다.
고체 지지체는 유리 슬라이드, 미세역가 플레이트 또는 당업자들에게 공지된 임의의 중합체, 예를 들면, (바람직하게는 비드 형태의) 작용화된 중합체, 화학적으로 개질된 산화성 표면, 예를 들면, 이산화규소, 오산화탄탈 또는 이산화티탄이거나, 화학적으로 개질된 금속 표면, 예를 들면, 금 또는 은 표면과 같은 귀금속 표면일 수도 있다. 고체 지지체는 또한 적합한 센서 요소일 수 있다.
바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 카스파제-1의 억제제인 그룹 A를 포함한다. 카스파제-1 억제 활성을 갖는 골격 A의 제조는, 예를 들면, 미국 특허 제5670494호; 국제공개공보 제WO9526958호; 제WO9722619호; 제WO9816504호; 제WO0190063호; 제WO03106460호; 제WO03104231호; 제WO03103677호; 문헌[W. G. Harter, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 809-812; Shahripour et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 2779-2782]; 문헌[Shahripour et al., Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 31-40]; 문헌[M. C. Laufersweiler et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 4322-4326]; 문헌[K. T. Chapman, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1992, 2, 613-618]; 문헌[Dolle et al., J. Med. Chem. 1997, 40, 1941-1946]; 문헌[D. L. Soper et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 4233-4236]; 문헌[D. L. Soper et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 7880-7892]; 문헌[D. J. Lauffer et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12,1225-1227]; 및 문헌[C. D. Ellis et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 4728-4732]에 기재되어 있다. 더욱 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 하기의 바람직한 골격 A를 포함하는 화합물을 특징으로 하는, 카스파제-1에 대한 프로브이다(표 1).
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
위의 표 1에서, 그룹 1 내지 28에서의 변수들은 각각의 화합물 옆의 정의에 지시된 바와 같이 정의된다: X는 -CONH-R2-L2이고; Y는 -L-R1-L1이고; R1, R2, L, L1 및 L2은 위에 기재된 바와 같다.
더욱 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 카스파제-3의 억제제인 그룹 A를 포함한다. 카스파제-3 억제 활성을 갖는 골격 A의 제조는, 예를 들면, 국제공개공보 제WO0032620호; 제WO0055127호; 제WO0105772호; 제WO03024955호; 제WO 2008/008264호; 문헌[P. Tawa et al., Cell Death and Differentiation 2004, 11, 439-447; Micale et al., J. Med. Chem. 2004, 47, 6455-6458];　및 문헌[Berger et al., Molecular Cell, 2006, 23, 509-521]에 기재되어 있다. 더욱 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 하기의 바람직한 골격 A를 포함하는 화합물을 특징으로 하는, 카스파제-3에 대한 프로브이다(표 2).
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
위의 표 2에서, 그룹 29 내지 42에서의 변수들은 각각의 화합물 옆의 정의에 지시된 바와 같이 정의된다: X는 -CONH-R2-L2이고; Y는 -L-R1-L1이고; R1, R2, L, L1 및 L2은 위에 기재된 바와 같다.
더욱 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 카스파제-8의 억제제인 그룹 A를 포함한다. 카스파제-8 억제 활성을 갖는 골격 A의 제조는, 예를 들면, 문헌[Berger et al., Molecular Cell, 2006, 23, 509-521]; 및 문헌[Garcia-Calvo, J. Biol. Chem. 1998, 273 (49), 32608-32613]에 기재되어 있다. 더욱 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 하기의 바람직한 골격 A를 포함하는 화합물을 특징으로 하는, 카스파제-8에 대한 프로브이다(표 3).
Figure pct00018
위의 표 3에서, X는 -CONH-R2-L2이고; Y는 -L-R1-L1이고; R1, R2, L, L1 및 L2는 위에 기재된 바와 같다.
달리 기재되지 않는다면, 하기 정의가 적용된다:
알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 의미한다. (C1-C6)알킬 그룹의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, 부틸, 3급-부틸, 2급-부틸, 펜틸 및 헥실이다.
아실은 그룹 -C(=O)알킬로 정의된다.
아릴은 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 방향족 탄화수소로 정의된다. 아릴 그룹의 예는 페닐 및 나프틸을 포함한다.
헤테로아릴은 방향족 탄화수소의 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로원자로 대체된 아릴 그룹으로 정의되며, 여기서 "헤테로원자"라는 용어는 산소, 질소, 황 및 인을 포함한다. 헤테로아릴 그룹의 예는 푸란, 티오펜, 벤조티오펜, 피롤, 티아졸, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 벤조푸란, 인돌, 쿠마린, 퀴놀린, 이소퀴놀린 및 나프티리딘을 포함한다.
사이클로알킬은 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 알킬 그룹을 의미한다. 사이클로알킬 그룹의 예는 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄 및 사이클로헥산을 포함한다.
헤테로사이클 또는 헤테로사이클릴은 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로원자로 대체된 사이클로알킬 그룹을 의미한다. 헤테로사이클의 예는 피페라진, 모르폴린 및 피페리딘을 포함한다.
아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬 그룹은 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다. 적합한 치환체의 예는 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 하이드록시, 할로겐, 트리플루오로메틸, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, NO2, CN, CO2H, CO2알킬, SO3H, CHO, C(=O)알킬, CONH2, CONH-알킬, CONHRq, C(=O)N(알킬)2, (CH2)nNH2, OH, CF3, O(C1-C6)알킬, (CH2)nNH-알킬, NHRq, NHCORq, 페닐을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 5이고, Rq는 수소 또는 (C1-C6)알킬이다.
본 발명의 활성 기반 프로브는 당해 기술분야에서 공지된 적절한 보호 그룹 화학을 사용하여 중심 골격 A를 구축하고, 어느 하나의 링커 및 표지 L1 또는 L2를 그룹 L 및 그룹 -C(O)-NH-를 거쳐 이 단위에 결합하여 합성할 수 있다. 적절한 빌딩 블록(building block) 및 FRET-쌍, 예를 들면, 시아닌-염료(예를 들어, Cy3 B, Cy 5.5, Cy 7)가 구매 가능하다(예를 들어, Sigma-Aldrich, GE-Healthcare). 본 발명에 기재된 프로브의 서브세트인 경우, 고상 합성 방법이 특히 유용하다(B. J. Merrifield, Methods in Enzymology 1997, 289, 3-13). 합성 요구조건에 따라서는, 결합 링커, 소광제 또는 형광단이 고체 지지체 상에서 행해지거나, 용액상 화학에 의해 행해질 수 있다.
일반적으로, 중심 골격 A 상의 반응성 측쇄 잔기 및 임의로 그룹 L은 보호되고, 각각 서브유닛 L1R1 및 L2R2에 의한 추가의 개질을 위해 연속해서 유리될 것이다. 이들 서브유닛의 접합은 화학 합성의 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 양쪽의 단위를 아미드 결합에 의해 결합하는, 염료 활성 에스테르와 골격 A의 1급 아민 그룹 사이의 반응이 특히 유용하다. 중간체 및 최종 프로브 분자는 표지화 및 이미징 실험에 사용되기 전에, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제되고, 이들이 질량 분광분석법 및 분석적 HPLC에 의해 특성화될 수 있다.
본 발명은 하기 단락에서 비제한적인 몇 가지 예에 의해 설명된다.
바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브는 C-말단 측 및 N-말단 측에 발색단을 갖는 테트라펩타이드 카스파제-1 억제제(표 1, 화합물 2)로부터 유래되는 골격 A를 포함한다. 적절한 발색단들이, 이들의 스펙트럼 특성이 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 적합하도록 선택된다. 발색단은 형광성이거나 비형광성일 수 있다. 원칙적으로, 펩타이드 결합의 단백질 분해 절단 후의 스펙트럼 변화인 중심 요건이 만족되는 한 각종 다양한 발색단이 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 상호작용 발색단들과 중심 골격의 결합은 임의로 링커 단위들을 거쳐 만들어진다.
바람직하게는, 형광단은 크산텐- 또는 시아닌 염료의 그룹으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 카바시아닌, 티아시아닌, 옥사시아닌 및 아자시아닌의 그룹으로부터의 시아닌 염료이다. 본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 시아닌 염료는 미국 특허 제5268468호 및 미국 특허 제5627027호에 개시되어 있다. 이들은 상표명(Amersham, GE Healthcare) Cy 3, Cy 3B, Cy 3.5, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7 및 Cy 7.5를 갖는 염료를 포함한다.
바람직하게는, 소광제 단위는 비-형광 발색단이며, 이는 2,4-디니트로페닐, 4-(4-디메틸아미노페닐)아조벤조산(DABCYL), 7-메톡시-쿠마린-4-일)아세틸 및 국제공개공보 제WO9964519호에 개시된 비 형광 시아닌-염료를 포함한다.
바람직한 양태에서, 소광제는 상당한 방출을 나타내지 않으며, 더욱 바람직하게는 비-형광 발색단이다. 이 양태에서, 이미징제는 형광단 및 비-형광(어두운) 수용자 발색단을 포함한다.
더욱 바람직하게는, N-말단 측에 QSY 21-소광제, 그리고 C-말단 측에 CY 5.5 형광단을 갖는 테트라펩타이드 골격(표 1, 화합물 2)에 기반한 화학식 I의 프로브이다(구조식 2).
[구조식 2]
Figure pct00019
다른 바람직한 양태는 N-말단 측에 어두운 소광제 BHQ 3, 그리고 C-말단 측에 Cy 7 형광단을 갖는 동일한 골격을 포함한다(구조식 3).
[구조식 3]
Figure pct00020
바람직한 양태에서는, 플루오레세인 및 테트라메틸로다민이 상호작용 FRET 쌍으로서 선택되고, 구조식 4에 나타난 바와 같이, 테트라메틸로다민은 골격의 N-말단 측에 위치되며, 한편 플루오레세인은 C-말단 측에 결합되어 있다(구조식 4).
[구조식 4]
Figure pct00021
다른 바람직한 양태에서, FRET 쌍의 한 상호작용 파트너는 나노입자를 포함한다. 본 발명과 관련하여 더욱 바람직하게는, CdSe 나노입자(예를 들면, 양자점들(Quantum-dots)), 란탄족-이온 도핑된 산화물 나노입자(예를 들면, Y0 .6Eu0 .4VO4) 및 철-산화물 나노입자(예를 들면, VisEn Medical, Inc.(미국 매사추세츠주 01801 소재)에 의해 공급되는 AminoSPARK 680 및 AminoSPARK 750)이다. 이러한 나노입자가 FRET 쌍에서 공여자로서 사용될 경우, 이들은 수용자 흡수보다 훨씬 더 짧은 파장에서 여기될 수 있으며, 이에 의해 직접적인 수용자 여기가 최소화된다. 추가로, 좁은 공여자 방출은 수용자 방출과 중첩되지 않는다. 더욱이, 이러한 나노입자는 빠른 광퇴색을 겪는 유기 염료보다 훨씬 더 광안정성인 것으로 증명되었다. 화학적 접합을 위하여 활성화된 양자점들이 구매 가능하며(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 92008 소재), 이들의 방출 파장이 각종 제품으로부터 선택될 수 있다.
구조식 5 및 구조식 6은 카스파제-1에 대하여 특이적인 화학식 I의 양자점 기반 프로브를 보여준다. 이와 같이, 화학식 I의 다른 바람직한 프로브에서는, 양자점(예를 들면, Invitrogen(미국 캘리포니아주 92008 소재)에 의해 공급되는 QD605)이 적절한 링커를 거쳐 카스파제-1 프로브의 N-말단 측(구조식 5) 또는 카스파제-1 프로브의 C-말단 측(구조식 6)에 위치될 수 있을 것이다.
[구조식 5]
Figure pct00022
[구조식 6]
Figure pct00023
양자점은 검정원으로 표시되며, 적절한 수용자 분자는 시아닌-염료 CY 7로 표시된다.
다른 바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브 중의 양자점들은 단백질 분해 절단 서브유닛을 거쳐 금-나노입자에 연결된다(구조식 7).
[구조식 7]
Figure pct00024
양자점 및 금-나노입자는 검은원으로 표시된다.
금 나노입자(Gold nanoparticle, AuNP)는 유기 형광 염료 및 양자점에 대하여 효과적인 소광제로서 밝혀져 왔다. AuNP와 조합한 양자점의 적용은, 예를 들면, 국제공개공보 제 WO2006126570호에 개시되어 있다.
다른 바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브는 2개의 특이적 프로테아제 프로브가 함께 공유결합된 다중-FRET 시스템으로 이루어진다(구조식 8).
[구조식 8]
Figure pct00025
이러한 구성에서는, 단일 파장에서 여기시키고, 독특한 FRET 특징들로서 상이한 방출 비들을 사용하는 것이 가능하다(K.E Sapsford et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4562-4588). 이러한 프로브는 한 분자 내에 2개의 특이성을 조합하는데, 이것은 카스파제-1에 대한 골격 및 카스파제-3에 대한 골격이다.
다른 바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브는 오랜 순환 시간을 갖도록, 높은 종양 누적(tumoral accumulation)을 갖도록, 그리고 효소 활성화 후에 근적외 스펙트럼에서 형광성으로 되는 소광된 형광 마커를 함유하도록 설계된다. 이러한 프로브들은 합성 그래프트 공중합체[부분적으로 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)로 개질된 폴리-L-리신] 상에 다중 NIR 형광색소가 유리(free) 폴리-리신 잔기들에 결합된, 이러한 합성 그래프트 공중합체에 기반한다. 이들 거대분자의 형광은 고밀도 및 이에 매우 가까운 NIR-발색단에 의한 내부 소광에 의해 고도로 감소된다.
예로서, 구조식 9는 D- 및/또는 L-리신의 폴리-리신 골격에의 A의 연결이 C-말단 측에서 링커를 거쳐 달성되며, 한편 NIR-발색단 Cy 5.5는 N-말단 측에서 링커를 거쳐 결합되는 중합체-기반 카스파제-1 프로브를 보여준다.
[구조식 9]
Figure pct00026
반대 상황이 구조식 10에 나타나 있는데, 여기서는 D- 및/또는 L-리신의 폴리-리신 골격에의 A의 연결이 N-말단 측에서 링커를 거쳐 달성되며, 한편 NIR-발색단 Cy 5.5가 C-말단 측에서 링커를 거쳐 결합된다.
[구조식 10]
Figure pct00027
다른 바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브는 균일 효소가 결합된 발광 검정에서 사용되도록 설계된다. 하기의 반응식은 위에 언급된 작용 기전을 포괄적으로 나타낸다. 루시페린은 루시퍼라제의 기질이며, 두 번째 효소 반응에 의해 발광 신호가 발생될 것이다.
Figure pct00028
하기의 반응식은 위에 언급된 작용 기전을 보여주는데, 여기서는 루시페린이 피리다지노디아제핀-유도체로 차폐되어 있으며, 상기 카스파제-1의 단백질 분해 활성을 통하여 유리된다.
Figure pct00029
본 발명은 또한 시험관내 검정에서, 세포에서 또는 다세포 유기체에서, 하나의 개개의 단백질 분해 효소 또는 단백질 분해 효소들의 그룹들, 예를 들면, 하나의 카스파제 또는 수 개의 카스파제들의 촉매 활성을 관찰하기 위한 분자 프로브의 설계 방법에 관한 것으로서, 개개의 단백질 분해 효소 또는 단백질 분해 효소들의 그룹의 억제제를 이들 개개의 단백질 분해 효소 또는 단백질 분해 효소들, 바람직하게는 카스파제 효소들의 그룹에 대하여 선택적인 이미징 프로브로 변형시키는 것을 특징으로 한다. 이를 달성하기 위해서, 본 발명자들은 소정의 공지된 카스파제 억제제의 친전자성 그룹들을 절단가능한 아미드 결합으로 대체한다. 바람직한 화합물은 검출가능한 신호가 특이적 표적의 효소(예를 들면, 단백질 분해) 활성에 의해 발생되는 방법으로 합성된다. 특히, 바람직한 프로브는 (i) 절단가능한 결합의 N-말단부에서, 그리고 (ii) 절단가능한 결합의 C-말단부에서 특이성 결정인자 A에 결합된, 내부적으로 소광된 형광단들(예를 들면, 적절한 FRET-쌍들)을 포함한다. 본 발명은 공지된 억제제의 바람직하고 이전에 최적화된 특성 요소들의 신규한 활성 기반의 프로브 내로의 이행을 가능하게 한다.
선행 기술에 기재된 카스파제 억제제는 P1 위치에서 친전자성 워헤드를 이용한다. 본 발명의 활성 기반 프로브는 상기 공지된 골격을 사용하며, 2가지 변형, 즉 첫째, 친전자성 워헤드의 절단가능한 아미드 결합으로의 변환과, 둘째, 절단가능한 아미드 결합의 양측 상에의 상호작용 표지화 쌍들 또는 특성 조절자들의 위치결정을 도입한다.
시험관내에서, 프로테아제와 본 발명의 기질의 반응은 일반적으로, 세포 추출물 내에서 수행되거나, 프로테아제의 정제되거나 농축된 형태를 사용하여 수행될 수 있다. 생체내 적용의 경우, 리포터들은 바람직하게는 근적외(NIR) 영역 내의 방사체(emitter)인데, 이 이유는 이 영역이 생물형광을 방해하지 않기 때문이다. 바람직하게는, 이들 요건에 부합되는 공지된 시아닌 NIR 염료가 본 발명의 기질 내에 혼입된다.
화학식 I의 화합물의 분자 구조는 아미드 작용성 그룹을 갖는 중심 골격 A 및 L1R1 및 L2R2의 2개의 개별 서브유닛으로 이루어진다. L2R2는, 화학식 I에 나타난 바와 같이, 항상 아미드 그룹을 거쳐 중심 A에 연결되는데, 이 이유는 아미드 그룹은 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있기 때문이다. 서브유닛 L1R1을 골격 A에 결합하기에 적절한 작용성 그룹은 당업자들에 의해 선택될 수 있으며, 예가 하기에 주어져 있다. 전구체 화합물에서 특이적 작용성 그룹 L'는 화학식 I의 화합물 내에 그룹 L을 생성하기 위해서, 적합한 L1R1 서브유닛들이 결합하는 골격 A 상에 위치될 수 있으며, 이는 단지 활성 기반 이미징제로서의 이러한 기질의 최종 용도 및 합성 전략의 요건에 의해서만 제한된다. 이에 따라, 이들의 선택은 원하는 기질을 형성하기 위해 선택되는 특이적 시약에 의존할 것이다. A를 서브유닛 L1R1과 연결시키기 위해서 골격 A 상에 제공될 수 있는 작용성 그룹 L'의 예에는 플루오로, 클로로, 브로모, 시아노, 니트로, 아미노, 아지도, 알킬카보닐아미노, 카복시, 카바모일, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 카브알데히드, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 탄소-탄소 이중 결합 및 탄소-탄소 삼중 결합 등이 포함된다. 가장 바람직한 예에는 아미노, 아지도, 하이드록시, 시아노, 카복시, 카바모일, 카브알데히드, 또는 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합이 포함된다. 이에 따라, L은 바람직하게는 직접 결합이거나
Figure pct00030
, -(NRx)-, -O-, -C=N-, -C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -C(=O)H, -CRx=CRy-, -C=C- 및 페닐로부터 선택되는 그룹이고, 여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬이다.
특히, 화학식 I의 화합물의 바람직한 합성은 직교 보호된 작용성 그룹을 사용하여 이루어진다. 보호 그룹의 이러한 선택은 개별적인 탈보호를 가능하게 하여, 각각의 방출된 작용기가 또한, 대응하는 서브유닛의 골격 A에 결합되게 하는 방향으로 추가로 화학적으로 조작되게 할 수 있다. 구상된 작용기들에 대하여 적절한 보호 그룹이 당업자들에 의해 선택될 수 있으며, 예를 들면, 문헌[T.W. Greene and P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York 1991]에 요약되어 있다.
화학식 L'-A-CO-OH(골격들)의 화합물은, 예를 들면, 미국 특허 제5670494호; 국제특허출원 제WO9526958호; 제WO9722619호; 제WO9816504호; 제WO0032620호; 제WO0055127호; 제WO0105772호; 제WO0190063호; 제WO03024955호; 제WO03106460호; 제WO03104231호; 제WO03103677호; 문헌[W. G. Harter, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 809-812]; 문헌[Shahripour et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 2779-2782]; 문헌[Shahripour et al., Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 31-40]; 문헌[M. C. Laufersweiler et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 4322-4326]; 문헌[K. T. Chapman, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1992, 2, 613-618]; 문헌[Dolle et al., J. Med. Chem. 1997, 40, 1941-1946]; 문헌[D. L. Soper et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 4233-4236]; 문헌[D. L. Soper et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 7880-7892]; 문헌[D. J. Lauffer et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12,1225-1227]; 문헌[C. D. Ellis et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 4728-4732]; 문헌[P. Tawa et al., Cell Death and Differentiation 2004, 11, 439-447]; 문헌[Micale et al., J. Med. Chem. 2004, 47, 6455-6458];　문헌[Berger et al., Molecular Cell, 2006, 23, 509-521]; 및 문헌[Garcia-Calvo, J. Biol. Chem. 1998, 273 (49), 32608-32613]에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한,
n이 1인 경우:
(a) 화학식 II의 화합물을 당업자에게 공지된 조건 하에서 화학식 L1-R1-H(여기서, L1은 이의 일반적이고 바람직한 의미로 위에 정의된 바와 같다)과 반응시켜 화학식 III의 화합물을 수득하고,
(b) 화합물(III)을 화합물 H2N-R2-L2와 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득하는 것을 특징으로 하는 화학식 I의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
[화학식 II]
L'-A-CO-OH
[화학식 III]
L1-R1-L-A-CO-OH
위의 화학식 II에서, A는 이의 일반적이고 바람직한 의미로 위에 정의된 바와 같고, L'는 플루오로, 클로로, 브로모, 시아노, 니트로, 아미노, 아지도, 알킬카보닐아미노, 카복시, 카바모일, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 카브알데히드, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합이며, 바람직하게는 아미노, 아지도, 하이드록시, 시아노, 카복시, 카바모일, 카브알데히드, 또는 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합이며, 더욱 바람직하게는 아미노이다.
임의로, 화학식 I의 화합물의 합성은 직교 보호된 작용성 그룹의 사용에 의해 이루어진다. 보호 그룹의 이러한 선택은 개별적인 탈보호를 가능하게 하여, 각각의 방출된 작용기가 또한, 표지를 이것에 결합시키도록 하거나, 링커 R1 및/또는 R2의 추가의 신장의 도입을 위하여, 추가로 화학적으로 조작되게 할 수 있다. 구상된 작용기들에 대하여 적절한 보호 그룹이 당업자들에 의해 선택될 수 있으며, 예를 들면, 문헌[T.W. Greene and P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York 1991]에 요약되어 있다.
n이 1인 경우, 화학식 I의 프로브의 다른 제조 방법은
(a1) 화학식 II의 화합물을 당업자에게 공지된 조건 하에서 화학식 IV의 화합물과 반응시켜 화학식 V의 화합물을 수득하고,
(b) 이어서, 화합물(V)을 개별 그룹들에 대하여 당업자에게 공지된 조건 하에서 화합물(VI)과 반응시켜 화학식 VI'의 화합물을 수득하고,
(c1) 화합물 VI'의 그룹 PG2를 절단시키고, 수득한 화합물을 표지 L2와 반응시키고, 이어서 보호 그룹 PG1을 절단시키고, 수득한 화합물을 표지 L1과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득하거나,
(c2) 화합물 VI'의 그룹 PG1을 절단시키고, 수득한 화합물을 표지 L1과 반응시키고, 이어서 보호 그룹 PG2를 절단시키고, 수득한 화합물을 표지 L2와 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득하는 것을 포함한다.
[화학식 IV]
H2N-L2-PG2
[화학식 V]
L'-A-CO-NH-R2-PG2
[화학식 VI]
PG1-R1-L''
[화학식 VI']
PG1-R1-L-A-CO-NH-R2-PG2
위의 화학식에서, PG1 및 PG2는 서로 독립적으로 보호 그룹, 바람직하게는 직교 보호 그룹이고,
L"는 당업자에 의해 선택될 L'를 위한 개별 연결 그룹, 또는 결합이다.
단계 (b)에서, L' 및 L''의 바람직한 조합 및 반응 유형(괄호 안)은 하기와 같다.
L'가 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도인 경우, L''는 아미노(R-NH2), 하이드록시(R-OH), 삼중 결합(소노가시라(Sonogashira) 반응), 이중 결합(헤크(Heck) 반응), 알킬 보란(스즈키(Suzuki)-반응)이고;
L'가 시아노인 경우, L''는 아미노(R-NH2), 하이드록시(R-OH), 티올(R-SH)이고;
L'가 아미노인 경우, L''는 활성화된 카복실산(NHS-에스테르, ...), 카브알데히드, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도이고;
L'가 아지도인 경우, L''는 삼중 결합, 포스핀 잔기(슈타우딩거 연결(Staudinger ligation))이고;
L'가 카복시인 경우, L''는 아미노, 하이드록실, 히드라지드이고;
L'가 알콕시카보닐인 경우, L''는 아미노, 하이드록실, 히드라지드이고;
L'가 아릴옥시카보닐인 경우, L''는 아미노, 하이드록실, 히드라지드이고;
L'가 하이드록시인 경우, L''는 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 하이드록시(미츠노부(Mitsunobu)-반응), 카복시이고;
L'가 카브알데히드인 경우, L''는 아미노, 히드라진이고;
L'가 탄소-탄소 이중 결합인 경우, L''는 브로모, 클로로, 요오도(헤크 반응), 알킬 보란(스즈키-반응)이고;
L'가 탄소-탄소 삼중 결합인 경우, L''는 브로모, 클로로, 요오도(소노가시라 반응), 아지도이다.
n이 0인 경우, 화학식 I의 화합물은 화학식 IV의 화합물을 화합물 H2N-R2-L2와 반응시켜 화학식 I의 프로브를 수득함으로써 제조될 수 있다.
[화학식 IV]
A-CO-OH
바람직하게는, 상이한 표지로 작용화된 시스테인 프로테아제 기질이 고체 지지체 상에 합성된다.
펩타이드 모방체 구조를 갖는 화학식 I의 카스파제 프로브의 합성의 경우, 비-펩타이드 빌딩 블록이 고상 합성에 이용될 수 있다. 빌딩 블록 합성은 실시예 8에 추가로 기재되어 있다.
빌딩 블록(VII)은 바람직하게는 카스파제-1 프로브, 예를 들면, 실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 합성에 사용된다.
[화학식 VII]
Figure pct00031
본 발명의 프로브는 바람직하게는 카스파제-1, 카스파제-3 또는 카스파제-8에 대한 프로브이다.
본 발명의 프로브는 시험관내에서, 세포-배양 실험에서, 생체외 실험에서 또는 살아 있는 유기체(생체내)에서의 분자 이미징과 관련되어 사용되며, 이러한 분자 이미징에는 스크리닝 및 동물 전체 이미징이 포함된다. 가장 바람직하게는 이미징 기법, 예를 들면, 광학 이미징 및 자기 공명 이미징(MRI)이다.
본 발명의 프로브는 프로테아제 활성의 진단 이미징에 사용하고자 한다. 가장 바람직한 적용은 표적화된 프로테아제에 대한 약물 또는 약물-유사 물질의 효과를 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 약물 또는 약물 유사 물질의 투여는 본 발명의 프로브로부터의 신호에 대하여 측정 가능한 효과를 가져야 한다.
본 발명의 프로브의 다른 가장 바람직한 측면은 외과적 유도(surgical guidance)에서 및 내과 요법(medical treatment)의 효과를 모니터링하기 위한 이미징제로서의 이의 용도이다. 외과적 유도는 종양 경계의 검출 및 종양 전이의 진행의 검출을 포함한다.
그러므로, 본 발명의 다른 측면은
(a) 살아있는 유기체에 화학식 I의 프로브를 투여하는 단계,
(b) 상기 유기체를, 소광되지 않은 형광단을 여기시키는 전자기 방사선에 노출시켜 검출가능한 신호를 생성하는 단계 및
(c) 상기 신호를 검출하고, 이에 의해 이미지를 생성하는 단계를 포함하는, 살아있는 유기체를 이미징하는 방법이다.
대안적으로, 살아있는 유기체를 이미징하는 방법은
(a) 살아있는 유기체에 화학식 I의 프로브를 투여하는 단계,
(b) 상기 유기체를, 형광단을 여기시키는 전자기 방사선에 노출시켜 검출가능한 신호를 생성하는 단계 및
(c) 상기 신호를 검출하고, 이에 의해 이미지를 생성하는 단계를 포함한다.
"살아있는 유기체"는 검출하려는 시스테인 프로테아제를 포함하는 임의의 살아있는 세포 또는 유기체 전체일 수 있으며, 바람직하게는 살아있는 유기체는 포유동물, 예를 들면, 마우스 또는 래트이다.
본 발명의 프로브는 고도로 선택적이며, 이에 의해 가양성(false positive)의 위험을 피할 수 있다.
약어:
DMF = 디메틸포름아미드
DMSO = 디메틸설폭사이드
DCM = 디클로로메탄
equiv. = 당량
sat. = 포화
THF = 테트라하이드로푸란
DIPEA = 디이소프로필에틸 아민
HOAt = 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸
HATU = O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N, N' , N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 　
NHS = N-하이드록시석신이미딜 에스테르
고상 펩타이드 합성을 위한 일반적 절차:
표준 고상 펩타이드 합성을 사용하여 하기의 프로브들을 합성하였다. 2-클로로트리틸-수지를 고체 지지체로서 사용하였다. 수지의 로딩(loading)을 위하여, 2당량의 Fmoc-보호된 아미노산 및 3당량의 DIPEA를 DCM 중에 용해시키고, 반응 혼합물을 수지에 첨가하였다(로딩: 1.4mmol/g). 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 진탕시켰다. 수지를 DCM 및 DMF로 세정하였다. Fmoc-탈보호를 위하여, 수지를 30% 피페리딘/DMF 용액으로 15분 동안 2회 처리하였다. 고상 펩타이드 합성을 위하여, 표준 프로토콜을 사용하였다: 4당량의 Fmoc-보호된 아미노산, 4당량의 HATU, 4당량의 HOAt 및 8당량의 DIPEA를 DCM/DMF(1/1)의 혼합물 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반시키고, 이어서 수지에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안, 또는 Fmoc-보호된 아미노산이 입체적으로 방해되어 있다면 그 이상 동안 진탕시켰다. 고상으로부터의 절단을 위하여, 수지를 DCM 중의 5% TFA로 15분 동안 2회 처리하였다. 용매를 감압 하에서 톨루엔과 함께 공증발(coevaporate)시키고, 최종 생성물을 분취 HPLC(구배: H2O+0.05% TFA; 5 내지 95% CH3CN)로 정제하였다.
실시예 1: 카스파제 -1 프로브
Figure pct00032
이 화합물을 일반적 절차에 따라 고체-지지체 상에 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제하였다. 계산치: [M+H]+ = 1569.70, 실측치: [M+H]+ = 1569.45. 수율: 54%.
실시예 2: 카스파제 -1 프로브
Figure pct00033
이 화합물을 일반적 절차에 따라 고체-지지체 상에 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제하였다. 계산치: [M+H]+ = 1583.73 실측치: [M+H]+ = 1583.2 . 수율: 72%.
실시예 3: 카스파제 -1 프로브
Figure pct00034
이 화합물을 일반적 절차에 따라 고체-지지체 상에 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제하였다. 계산치: [M+H]+ = 1591.19 실측치: [M+H]+ = 1591.50. 수율: 66%.
실시예 4: 카스파제 -3 프로브
Figure pct00035
이 화합물을 일반적 절차에 따라 고체-지지체 상에 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제하였다. 계산치: [M+H]+ = 1517.66 실측치: [M+H]+ = 1517.55. 수율: 59%.
실시예 5: 카스파제 -3 프로브
Figure pct00036
이 화합물을 일반적 절차에 따라 고체-지지체 상에 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제하였다. 계산치: [M+H]+ = 1546.79 실측치: [M+H]+ = 1546.35. 수율: 61%.
실시예 6: 카스파제 -8 프로브
Figure pct00037
이 화합물을 일반적 절차에 따라 고체-지지체 상에 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제하였다. 계산치: [M+H]+ = 1523.45 실측치: [M+H]+ = 1523.25. 수율: 55%.
실시예 7
[화학식 VII]
Figure pct00038
빌딩 블록(VII)을 국제공개공보 제WO9722619호에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
실시예 8: 카스파제 -1 생물발광 프로브
Figure pct00039
이 화합물을 6-Fmoc-아미노-D-루시페린으로부터 출발하여, 일반적 절차에 따라 고체-지지체 상에 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제하였다. 계산치: [M+H]+ = 772.82, 실측치: [M+H]+ =773.15. 수율: 13%.

Claims (18)

  1. 화학식 I의, 시스테인 프로테아제에 대한 분자 프로브.
    [화학식 I]
    {L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2
    위의 화학식 I에서,
    A는 카스파제에 의해 인식가능한 그룹이고;
    R1은 링커이고;
    R2는 결합 또는 링커이고;
    L은 그룹 L1의 용이한(facile) 접합을 가능하게 하는 결합 또는 그룹이고;
    L1 및 L2는, 서로 독립적으로, 고체 지지체에 임의로 결합되는 하나 이상의 표지(label)이고;
    n은 1이거나,
    또는
    R2는 결합이고;
    L2는, 커플링된 생물발광 검정에 적합한 기질이고;
    n은 0이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 카스파제가 카스파제-1, 카스파제-3 또는 카스파제-8인, 프로브.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, L이 직접 결합이거나
    Figure pct00040
    , -(NRx)-, -O-, -C=N-, -C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -C(=O)H, -CRx=CRy-, -C=C- 및 페닐로부터 선택되는 그룹이고, 여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬인, 프로브.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R1 또는 R2가 1 내지 300개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 그룹이고, 여기서 임의로
    (a) 하나 이상의 탄소 원자는 산소로 대체되고, 특히 세 번째 탄소 원자마다 산소로 대체되고, 예를 들면, 1 내지 100개의 에틸렌옥시 단위를 갖는 폴리에틸렌옥시 그룹이고/이거나;
    (b) 하나 이상의 탄소 원자는 수소 원자를 갖는 질소로 대체되고, 인접 탄소 원자들은 옥소로 치환되어, 아미드 작용기 -NH-CO-를 나타내고/내거나;
    (c) 하나 이상의 탄소 원자는 에스테르 작용기 -O-CO-로 대체되고;
    (d) 2개의 인접 탄소 원자들 사이의 결합은 이중 결합 또는 삼중 결합이고/이거나;
    (e) 2개의 인접 탄소 원자들은 디설파이드 결합으로 대체되는, 프로브.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표지 L1 및 L2가 서로 독립적으로 형광단; 소광제 또는 발색단과 같은 분광학적 프로브; 자기 프로브; 조영제; 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합 쌍의 한 부분인 분자; 유리 슬라이드, 미세역가 플레이트 또는 당업자들에게 공지된 임의의 중합체일 수 있는 고체 지지체에 공유결합되는 분자; 바람직한 효소적, 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 생체분자; 또는 위에 열거된 임의의 특성들의 조합을 갖는 분자; 또는 양하전된 선형 또는 분지형 중합체인, 프로브.
  6. 제5항에 있어서, 표지 L1 및 L2가 서로 독립적으로, 양하전된 선형 또는 분지형 중합체에 결합되는, 프로브.
  7. 제6항에 있어서, 표지 L1 및 L2 중 하나가 6 내지 15개의 아르기닌 잔기를 갖는 D- 및/또는 L-아르기닌의 선형 폴리(아르기닌)인, 프로브.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L1이 2개의 상호작용하는 분광학적 프로브 L1/L2의 한 구성원이고, L2가 나머지 한 구성원인, 프로브.
  9. 제8항에 있어서, L1/L2가 FRET 쌍인, 프로브.
  10. 제9항에 있어서, L1/L2 중 하나는 Alexa 350, 디메틸아미노쿠마린, 5/6-카복시-플루오레세인, Alexa 488, ATTO 488, DY-505, 5/6-카복시플루오레세인, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 555, ATTO 488, ATTO 532, 테트라메틸로다민, Cy 3, DY-505, DY-547, Alexa 635, Alexa 647, ATTO 600, ATTO 655, DY-632, Cy 5, DY-647 Cy 5.5로부터 선택되는 형광단이고, L1/L2 중 나머지 한 표지는 Dabsyl, Dabcyl, BHQ 1, QSY 35, BHQ 2, QSY 9, ATTO　540Q, BHQ 3, ATTO 612Q, QSY　21로부터 선택되는 소광제인, 프로브.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, n이 0이고, R2가 결합이고, L2가, 중심 골격 A로부터 절단시 루시퍼라제에 의한 변환을 통하여 발광 신호를 발생시킬 수 있는 리포터 그룹으로서, 개질된 아미노루시페린 또는 이의 카복시-말단 보호 유도체임을 특징으로 하는, 커플링된 생물발광 검정에 적합한 기질인, 프로브.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 표의 화합물 1 내지 화합물 28임을 특징으로 하는 선택적 카스파제-1 프로브.
    Figure pct00041

    Figure pct00042

    Figure pct00043

    Figure pct00044

    Figure pct00045

    Figure pct00046

    Figure pct00047

    Figure pct00048

    Figure pct00049
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 표의 화합물 29 내지 화합물 42임을 특징으로 하는 선택적 카스파제-3 프로브.
    Figure pct00050

    Figure pct00051

    Figure pct00052

    Figure pct00053

    Figure pct00054

    Figure pct00055

    Figure pct00056
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 표의 화합물 43 또는 화합물 44임을 특징으로 하는 선택적 카스파제-8 프로브.
    Figure pct00057
  15. n이 1인 경우:
    (a) 화학식 II의 화합물을 화학식 L1-R1-H의 화합물과 반응시켜 화학식 III의 화합물을 수득하고,
    (b) 화합물(III)을 화합물 H2N-R2-L2와 반응시켜 화학식 I의 프로브를 수득하고, R1 및/또는 R2를 적합한 직교 보호 그룹들로 보호하고, 이어서 화합물 I의 제조 과정에서 절단시킬 수 있음을 특징으로 하고;
    n이 0인 경우:
    화학식 IV의 화합물을 화합물 H2N-R2-L2와 반응시켜 화학식 I의 프로브를 수득함을 특징으로 하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 프로브의 제법.
    [화학식 II]
    L'-A-CO-OH
    [화학식 III]
    L1-R1-L-A-CO-OH
    [화학식 IV]
    A-CO-OH
    위의 화학식 II에서, L'는 플루오로, 클로로, 브로모, 시아노, 니트로, 아미노, 아지도, 알킬카보닐아미노, 카복시, 카바모일, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 카브알데히드, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 바람직하게는 아미노, 아지도, 하이드록시, 시아노, 카복시, 카바모일, 카브알데히드, 또는 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합이며, 더욱 바람직하게는 아미노이다.
  16. 시험관내에서, 세포-배양 실험에서, 생체외 실험에서 또는 살아있는 유기체에서 분자 이미징을 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 프로브의 용도.
  17. (a) 살아있는 유기체에 화학식 I의 프로브를 투여하고,
    (b) 상기 유기체를, 소광되지 않은 형광단을 여기시키는 전자기 방사선에 노출시켜 검출가능한 신호를 생성하고,
    (c) 상기 신호를 검출하고, 이에 의해 이미지를 생성함을 포함하는, 살아있는 유기체를 이미징하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 프로브의 용도.
  18. (a) 살아있는 유기체에 화학식 I의 프로브를 투여하고,
    (b) 상기 유기체를, 형광단을 여기시키는 전자기 방사선에 노출시켜 검출가능한 신호를 생성하고,
    (c) 상기 신호를 검출하고, 이에 의해 이미지를 생성함을 포함하는, 살아있는 유기체를 이미징하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 프로브의 용도.
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