KR20100068292A

KR20100068292A - 유형 ⅱ 항-ｃｄ20 항체와 프로테아좀 억제제의 병용 치료

Info

Publication number: KR20100068292A
Application number: KR1020107009027A
Authority: KR
Inventors: 게오르크 페르티히; 토마스 프리스; 크리슈티안 클라인; 파블로 우마나
Original assignee: 로슈 글리카트 아게
Priority date: 2007-10-24
Filing date: 2008-10-22
Publication date: 2010-06-22
Also published as: WO2009053038A3; WO2009053038A2; CL2008003122A1; AU2008315926A1; CN102083499A; RU2010120724A; CA2702962A1; US20090110688A1; ES2527775T3; AR071733A1; KR101280733B1; CA2702962C; EP2205318A2; US20120219549A1; JP2011500741A; JP5469073B2; TW200927762A; RU2520757C2; IL205025A0; ZA201002575B

Abstract

본 발명은 암, 특히 CD20 발현 암 치료용 약제의 제조를 위한, 프로테아좀 억제제와 병용한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

유형 Ⅱ 항-ＣＤ20 항체와 프로테아좀 억제제의 병용 치료 {COMBINATION THERAPY OF A TYPE Ⅱ ANTI-CD20 ANTIBODY WITH A PROTEASOME INHIBITOR}

본 발명은 프로테아좀 억제제와 병용하여, 암, 특히 CD20 발현 암 치료용 약제의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도에 관한 것이다.

CD20 분자 (또한 인간 B-림프구-구속 (restricted) 분화 항원 또는 Bp35) 는 예비-B 림프구 및 성숙 B 림프구 상에 위치하는 분자량이 대략 35 kD 인 소수성 막관통 단백질이다 (Valentine, M.A., 등, J. Biol. Chem. 264 (19) (1989) 11282-11287; 및 Einfield, D.A., 등, EMBO J. 7(3) (1988) 711-717). CD20 은 말초 혈액 또는 림프 기관의 B 세포 중 90% 초과의 표면 상에서 발견되며, 초기 프리-B 세포 (pre-B cell) 발달 동안 발현되고 형질 세포 분화시까지 남아 있다. CD20 은 정상 B 세포 뿐 아니라 악성 B 세포 모두에 존재한다. 특히, CD20 은 90% 가 넘는 B 세포 비-호지킨스 림프종 (non-Hodgkin's lymphomas: NHL) 에서 발현되나 (Anderson, K.C., 등, Blood 63(6) (1984) 1424-1433), 조혈모세포, 프로-B 세포 (pro-B cell), 정상 형질 세포, 또는 기타 정상 조직에서는 발견되지 않는다 (Tedder, T.F., 등, J, Immunol. 135(2) (1985) 973-979).

CD20 단백질의 85 개의 아미노산 카르복실-말단 영역은 세포질 내에 위치한다. 상기 영역의 길이는 각각 3, 3, 28, 15, 및 16 개의 아미노산의 비교적 짧은 세포질내 영역을 갖는 IgM, IgD, 및 IgG 중쇄 또는 조직접합 항원 부류 IIα 또는 β 사슬과 같은 기타 B 세포-특이적 표면 구조와 대조된다 (Komaromy, M., 등, NAR 11 (1983) 6775-6785). 마지막 61 개의 카르복실-말단 아미노산 중에서, 21 개는 산성 잔기인 반면, 오직 2 개만이 염기성으로, 상기 영역이 강한 순 음전하를 갖고 있음을 나타낸다. GenBank 등록 번호는 NP-690605 이다. CD20 이 B 세포의 활성 및 분화 과정 중의 초기 단계(들) 를 조절하는데 관여할 수 있고 (Tedder, T.F., 등, Eur. J. Immunol. 16 (1986) 881-887), 칼슘 이온 채널으로서 작용할 것이라고 생각된다 (Tedder, T.F., 등, J. Cell. Biochem. 14D (1990) 195).

CD20 결합 방식과 생물학적 활성이 유의하게 상이한, 2 가지 상이한 유형의 항-CD20 항체가 존재한다 (Cragg, M.S., 등, Blood 103 (2004) 2738-2743; 및 Cragg, M.S., 등, Blood 101 (2003) 1045-1052). 예를 들어, 리툭시마브와 같은 유형 I 항체는 보체 매개 세포독성이 강력한 반면, 예를 들어, 토시투마브 (Tositumomab: B1), 11B8, AT80 또는 인간화된 B-Ly1 항체와 같은 유형 Ⅱ 항체는 포스파티딜세린 노출시 캐스페이즈(caspase)-의존성 세포자멸사를 통한 표적 세포 사멸을 효과적으로 개시한다.

유형 I 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가 공유하는 공통의 특징은 하기 표 1 에 요약되어 있다.

유형 I 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 특성
유형 I 항-CD20 항체	유형 Ⅱ 항-CD20 항체
유형 I CD20 에피토프	유형 Ⅱ CD20 에피토프
CD20 을 지질 라프트 (lipid raft) 로 위치시킴	CD20 을 지질 라프트로 위치시키지 않음
CDC 를 증가시킴 (IgG1 아이소타입인 경우)	CDC 를 감소시킴 (IgG1 아이소타입인 경우)
ADCC 활성 (IgG1 아이소타입인 경우)	ADCC 활성 (IgG1 아이소타입인 경우)
완전한 결합능	감소된 결합능
동종형 응집	보다 강한 동종형 응집
교차 결합시 세포자멸사 유도	교차 결합 없이 강한 세포 사멸 유도

다촉매성 단백질 가수분해 효소 복합체 (multicatalytic proteinase complex) 라고도 하는 26S 프로테아좀은 광범위하게 다양한 진핵 세포 유형의 세포질 및 핵 둘 다에서 발견되는 특이하게 고분자량의 복합체 (26S) 이다. 프로테아좀은 20S 중심 촉매 코어 및 2 개의 19S 조절 캡 (cap) 을 포함한다. 19S 조절 캡은 20S 통-형 (barrel-shaped) 복합체의 각각의 끝에서 발견되고, 기질이 중심 촉매 코어에 들어가는 것을 조절한다. 19S 캡은 8.5 kDa 폴리펩타이드 유비퀴틴의 여러 분자의 첨가에 의해 분해되는 것을 표적으로 하는 기질을 인지하는 역할을 한다 (예를 들어, Coux, O., Tanaka, K. and Goldberg, A., Ann. Rev. Biochem. 65 (1996) 801-847; Voges, D., Ann. Rev. Biochem. 68 (1999) 1015-68 and Kisselev, A.L. 등, Chem Biol Vol. 8 (8) (2001) 739-758 를 리뷰함). 기질로부터 유비퀴틴 분자를 제거하는 것을 용이하게 한 후에, 19S 캡은 중심 촉매 코어에 들어가서 기질 단백질의 풀림 (unfolding) 을 촉진시킨다.

26S 프로테아좀은 진화적으로 고도로 보전되어 있고, 연구된 모든 진핵 세포에서 발견되었으며, 조직 균질물 내 총 단백질 중 1.0% 이하를 구성할 수 있다. 프로테아좀은 세포의 세포질 및 핵 둘 다에서 발견되었고, 이는 이들 구획 둘 다에서 기능적 역할을 함을 제시한다 (Tanaka, K., 등, J. Cell Physiol. 139 (1989) 34-41; Amsterdam, A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 99-103.

프로테아좀에 대한 초기 연구로써, 5 가지 상이한 단백분해 활성에 대한 설명이 도출되었고, 각각의 활성은 복합체의 별개의 성분과 연관되어 있다 (Wilk, S., and Orlowski, M., J Neurochem. 35 (1980) 1172-1182; Wilk, S., and Orlowski, M., J Neurochem. 40 (1983) 842-849; Orlowski, M., and Wilk, S., Biochem. Biophys. Res. Comm 101 (1981) 814-822). 3 가지 주요 활성은 키모트립신, 펩신 및 펩티딜글루타밀 펩티다아제에 대한 특이성의 면에서 유사하다. 기술된 2 가지 다른 활성은 분지쇄 아미노산의 카르복실 측의 펩티드 결합, 및 단쇄 중성 아미노산 간의 펩티드 결합의 절단에 대한 선호도를 나타낸다 (Orlowski, M., Biochemistry 29 (1990) 10289-297).

현재, 프로테아좀은 세포 분열, 항원 가공, 및 종양유발 단백질, 전사 인자 및 사이클린과 같이 수명이 짧은 조절 단백질의 분해와 같은 다양한 세포 기능에 필수적인 단백분해 경로에 관여하는 주요 리소좀외 (extralysosomal) 단백분해 시스템인 것으로 잘 구축되어 있다 (Ciechanover, A., Cell 79 (1994) 13-21; Palombell, V.J., Rando, O.J., Goldberg, A.L.and Maniatis, T., Cell 78 (1994) 773-785). 프로테아좀이 세포 주기 진행 동안에 사이클린의 질서있는 분해에서 주요 역할을 하기 때문에, 프로테아좀은 세포 분열에서 역할을 한다. 추가의 연구로써, 효모 프로테아좀 하위단위를 암호화하는 13 개의 유전자 중 12 개 중 임의의 1 개의 유전자에서의 붕괴가 세포 증식 정지, 및 단백질 분해 불능을 초래하는 것으로 나타났고, 이는 또한, 세포 성장에서의 프로테아좀의 역할을 제시하는 것이다 (Fujiwara, T., 등, J. Biol. Chem. 265 (1990) 16604-1613; Beynon, Int. Committee on Proteolysis News Letter, January, 1-2 (1994)). 따라서, 프로테아좀의 억제는 암과 같은 비정상적인 세포 분열로 인한 질환의 치료에 유용할 수 있다.

유비퀴틴-매개 프로테아좀 단백분해가 NFkB 의 활성화에서 중요한 역할을 한다는 관찰은 프로테아좀에 대한 억제제의 사용에 의해 임상적으로 연구될 수 있었다. 활성 형태의 NFkB 의 형성은 NFkB 의 비활성 전구체인 p105 의 프로테아좀-매개 단백분해를 필요로 한다.

또한, 가공된 형태의 NFkB (p65/p50) 는 억제성 단백질 IkB 에 결합된 비활성 복합체로서 시토졸 내에서 유지된다. IkB 의 프로테아좀-매개 분해를 초래하는 신호 경로를 개시함으로써, 다양한 자극이 NFkB 를 활성화시킨다. NFkB 의 비정상적인 활성화와 뒤이은 사이토카인 합성의 자극은 다양한 염증성 및 감염성-2 질환에서 관찰되었다. NFkB 의 활성화는 또한, 혈관신생 및 부착 분자의 발현에 필수적이고, 따라서, 프로테아좀 억제제는 또한, 혈관계와 연관된 질환의 치료에서 사용될 수 있다.

예를 들어, [Kisselev, A.L., 등, Chem Biol Vol. 8 (8) (2001) 739-758], WO　2004/004749 및 [Joazeiro, C., 등, Cancer Res. 66 (16) (2006) 7840-7842] 에서 기술된 바와 같이 다양한 프로테아좀 억제제가 존재하고, 이들 모두는 26S 프로테아좀 활성을 억제시키는 동일한 특성을 갖고 있다. 상기 프로테아좀 억제제에는 즉, 예를 들어, 펩티드 유도체, 예컨대 펩티드 알데하이드 (예를 들어, MG132, MG115, CEP-1615 또는 PSI), 펩티드 보로네이트 (예를 들어, 보르테조미브 (PS-341) 또는 DFLB), 펩티드 에폭시케톤 (예를 들어, 에폭소미신, 디히드로에포네마이신, 또는 에폭소미신 유도체 PR-171), 또는 펩티드 비닐 술폰 (예를 들어, NLVS) 및 비-펩티드 유도체, 예컨대 살리노스포라미드 A (NPI-0052), 살리노스포라미드 A 유도체, 락타시스틴 (lactacystin) 또는 락타시스틴 유도체 (예를 들어, 클라스토-락타시스틴-L-락톤 (오무랄라이드 (omuralide)) 또는 PS-519) 이 포함된다 ([Kisselev, A.L., 등, Chem Biol Vol. 8 (8) (2001) 739-758], WO　2004/004749 및 [Joazeiro, C., 등, Cancer Res. 66(16) (2006) 7840-7842] 에서).

[Smolewski, P., 등, Leukemia Research 30 (2006) 1521-1529] 는 보르테조미브 및 리툭시마브, 유형 I 항-CD20 항체의 시험관 내에서의 추가의 세포독성 효과를 기술한다. [Wang, M., 등, Leukemia, 22 (2008) 179-185] 는 시험관 내에서 그리고 하나의 맨틀 세포 (mantle cell) 림프종 이종 이식 모델에서 보르테조미브, 리툭시마브 및 시클로포스파미드의 3 중 병용 효과를 기술한다.

발명의 개요

본 발명은 프로테아좀 억제제와 병용하여, CD20 발현 암의 치료용 약제의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 추가로 프로테아좀 억제제와 병용하여, CD20 발현 암 환자의 치료용 약제의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도를 포함한다.

바람직하게는 상기 프로테아좀 억제제는 항-프로테아좀 억제 활성의 IC₅₀ 을 5 μM 이하로 갖는 프로테아좀 억제제이다.

바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시마브와 비교한, 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 결합능의 비를 0.3 내지 0.6, 더욱 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 더욱 더 바람직하게는 0.4 내지 0.5 로 갖는다.

바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 인간화된 B-Ly1 항체이다.

바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 증가된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 을 갖는다.

바람직하게는 상기 프로테아좀 억제제는 펩티드 알데하이드, 펩티드 보로네이트, 펩티드 에폭시케톤, 또는 살리노스포라미드 A 로 이루어진 군으로부터 선택된다.

발명의 상세한 설명

"항체" 라는 용어는 전체 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 및 모노클로날 항체, 키메라성 항체 또는 재조합 항체와 같은 유전자 조작 항체, 뿐만 아니라 본 발명에 따른 특징을 보유한다면 상기 항체의 절편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물" 이라는 용어는 단일 아미노산 조성의 항체 분자 제제를 말한다. 따라서, "인간 모노클로날 항체" 라는 용어는 인간 생식선 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 한 구현예에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 이식유전자 및 인간 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 비-인간 동물, 예를 들어 유전자이식 마우스로부터 수득되는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 제조된다.

바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 모노클로날 항체이다.

"키메라성 항체" 라는 용어는 하나의 기원 또는 종으로부터의 가변 영역, 즉, 결합 영역, 및 통상 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 상이한 기원 또는 종 유래의 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 모노클로날 항체를 말한다. 쥣과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라성 항체가 특히 바람직하다. 이러한 쥣과/인간 키메라성 항체는 쥣과 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 조각, 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 조각을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 본 발명에 포함되는 "키메라성 항체" 의 다른 형태는 부류 또는 하위부류가 본래 항체의 것으로부터 변형된 또는 변화된 항체이다. 이러한 "키메라성" 항체를 또한 "부류-스위치 항체" 라고도 한다. 키메라성 항체의 제조 방법에는 현재 당업계에 잘 알려진 통상의 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술이 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 및 US 5,204,244] 를 참조한다.

"인간화된 항체" 라는 용어는, 골격 또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 이 부모 면역글로불린의 것과 비교해 상이한 특이성을 가진 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 변형된 항체를 말한다. 바람직한 구현예에서, 쥣과 CDR 이 인간 항체의 골격 영역 내에 이식되어 "인간화된 항체" 가 제조된다. 예를 들어, 문헌 [Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., 등, Nature 314 (1985) 268-270] 를 참조한다. 특히 바람직한 CDR 은 키메라성 및 2 작용성 항체에 대해 상기 표시된 항원을 인지하는 서열을 나타내는 것에 상응한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "인간 항체" 라는 용어는 인간 생식선 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것이다. 인간 항체는 당업계에 잘 알려져 있다 (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). 이러한 기술을 바탕으로, 매우 다양한 표적에 대한 인간 항체가 제조될 수 있다. 인간 항체의 예는 예를 들어, 문헌 [Kellermann, S. A., 등, Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597] 에 기술되어 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "재조합 인간 항체" 라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 제작 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 NSO 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식된 동물 (예를 들어, 마우스) 로부터 단리되는 항체, 또는 숙주 세포 내에 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현되는 항체를 포함하고자 한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 재배열된 형태로 갖는다.

본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내 체세포 과돌연변이에 적용된다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 서열이 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 반면, 생체 내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리 (repertoire) 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "특이적으로 결합하는" 또는 "~ 에 특이적으로 결합한다" 라는 용어는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 바람직하게는 결합 친화성은 10^-8mol/ℓ 이하의 KD 값, 바람직하게는 10^-9 mol/ℓ 이하의 KD 값 (예를 들어, 10^-10 mol/ℓ), 바람직하게는 10^-10 mol/ℓ 이하의 KD 값 (예를 들어, 10^-12 mol/ℓ) 이다. 결합 친화성은 CD20 발현 세포에 대해 스캐차드 플롯 (Scatchard plot) 분석과 같은 표준 결합 어세이를 사용해 측정된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "핵산 분자" 라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 이다.

"불변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는 데에는 직접적으로 관여하지 않으나 효과기 기능 (ADCC, 보체 결합, 및 CDC) 에는 관여한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "가변 영역" (경쇄의 가변 영역 (VL), 중쇄의 가변 영역 (VH)) 은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접적으로 관여하는 경쇄 및 중쇄 쌍의 각각을 표시한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄 도메인은 동일한 일반 구조를 갖고, 각각의 도메인은 그 서열이 광범위하게 보존되고, 3 개의 "초가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결되는 4 개의 골격 (FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-병풍 구조를 채택하며 CDR 은 β-병풍 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 사슬 내의 CDR 은 골격 영역에 의해 3 차원 구조로 유지되고, 다른 사슬의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 하므로, 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

본원에서 사용되는 경우, 용어 "초가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부분" 은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 에서 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 항원 결합에 최고로 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌 [Kabat, 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 의 표준 정의 및/또는 "초가변 루프" 로부터의 이들 잔기에 따라 정의된다.

"CD20" 및 "CD20 항원" 이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 CD20 유전자로 트랜스펙션된 세포 상에서 발현되는 인간 CD20 의 임의의 변이체, 아이소폼 (isoform) 및 종 상동체가 포함된다. CD20 항원에 대한 본 발명의 항체의 결합은 CD20 을 불활성화시킴으로써 CD20 을 발현하는 세포 (예를 들어, 종양 세포) 의 사멸을 매개한다. CD20 을 발현하는 세포의 사멸은 세포 사멸/세포자멸사 유도, ADCC 및 CDC 기작 중 하나 이상에 의해 일어날 수 있다.

당업계에서 인지되는 바와 같은 CD20 의 동의어에는 B-림프구 항원 CD20, B-림프구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35, BM5, 및 LF5 가 포함된다.

본 발명에 따른 "항-CD20 항체" 라는 용어는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. CD20 항원에 대한 항-CD20 항체의 결합 특성 및 생물학적 활성에 따라, 문헌 [Cragg, M.S., 등, Blood 103 (2004) 2738-2743; 및 Cragg, M.S., 등, Blood 101 (2003) 1045-1052] 에 따르면 2 가지 유형의 항-CD20 항체 (유형 I 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체) 로 구별될 수 있다 (하기 표 2 참조).

유형 I 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 특성
유형 I 항-CD20 항체	유형 Ⅱ 항-CD20 항체
유형 I CD20 에피토프	유형 Ⅱ CD20 에피토프
CD20 을 지질 라프트로 위치시킴	CD20 을 지질 라프트로 위치시키지 않음
CDC 를 증가시킴 (IgG1 아이소타입인 경우)	CDC 를 감소시킴 (IgG1 아이소타입인 경우)
ADCC 활성 (IgG1 아이소타입인 경우)	ADCC 활성 (IgG1 아이소타입인 경우)
완전한 결합능	감소된 결합능
동종형 응집	보다 강한 동종형 응집
교차 결합시 세포자멸사 유도	교차 결합 없이 강한 세포 사멸 유도

유형 I 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 하나의 필수적인 특성은 이들의 결합 방식이다. 따라서, 유형 I 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시마브와 비교한, 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 상기 항-CD20 항체의 결합능의 비에 의해 분류될 수 있다.

상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시마브와 비교한, 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 상기 항-CD20 항체의 결합능의 비를 0.3 내지 0.6, 더욱 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 더욱 더 바람직하게는 0.4 내지 0.5 로 갖는다. 이러한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 예에는 예를 들어, 토시투모마브 (B1 IgG2a), 인간화된 B-Ly1 항체 IgG1 (WO 2005/044859 호에 기술된 바와 같은 키메라성 인간화된 IgG1 항체), 11B8 IgG1 (WO 2004/035607 호에 기술됨), 및 AT80 IgG1 이 포함된다. 바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 인간화된 B-Ly1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다 (WO 2005/044859 호에 기술됨) .

유형 Ⅱ 항체와 대조적으로 유형 I 항-CD20 항체는 리툭시마브와 비교한, 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 상기 항-CD20 항체의 결합능의 비를 0.8 내지 1.2, 바람직하게는 0.9 내지 1.1 로 갖는다. 이러한 유형 I 항-CD20 항체의 예에는 예를 들어, 리툭시마브, 1F5 IgG2a (ECACC, 하이브리도마; Press, 등, Blood 69/2 (1987) 584-591), HI47 IgG3 (ECACC, 하이브리도마), 2C6 IgG1 (WO 2005/103081 호에 기술됨), 2F2 IgG1 (WO 2004/035607 및 WO 2005/103081 호에 기술됨) 및 2H7 IgG1 (WO 2004/056312 호에 기술됨) 이 포함된다.

"리툭시마브와 비교한, 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 항-CD20 항체의 결합능의 비" 는 실시예 2 에서 기술되는 바와 같이 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 를 사용하는 FACSArray (Becton Dickinson) 에서 Cy5 와 공액된 상기 항-CD20 항체 및 Cy5 와 공액된 리툭시마브를 사용하여 직접적인 면역형광 측정 (평균 형광 강도 (MFI) 를 측정함) 에 의해 측정되고 하기와 같이 계산된다 :

라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합능의 비 =

MFI 는 평균 형광 강도이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "Cy5-표지 비" 는 분자 항체 당 Cy5-표지 분자의 수를 의미한다.

전형적으로, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시마브와 비교한, 라지 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 상기 제 2 항-CD20 항체의 결합능의 비를 0.3 내지 0.6, 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 0.5 로 갖는다.

바람직한 구현예에서, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화된 B-Ly1 항체는 증가된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 을 갖는다.

"증가된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 을 갖는 항체" 라는 말은 그 용어가 본원에 정의되는 바와 같이, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정된 바와 같이 증가된 ADCC 를 갖는 항체를 의미한다. 하나의 허용되는 시험관 내 ADCC 어세이는 다음과 같다 :

1) 어세이에서, 항체의 항원-결합 영역에 의해 인지되는 표적 항원을 발현하는 것으로 알려진 표적 세포를 사용함 ;

2) 어세이에서, 효과기 세포로서 무작위하게 선택된 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리되는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 사용함 ;

3) 하기 프로토콜에 따라 어세이를 실시함 :

i) PBMC 를 표준 밀도 원심분리 절차를 사용하여 단리하고 RPMI 세포 배양 배지 내에 5 x 10⁶ 세포/ml 로 현탁함 ;

ii) 표적 세포를 표준 조직 배양법에 의해 성장시키고, 90% 초과의 생존능을 갖는 기하급수적 성장기 (exponential growth phase) 로부터 수확하여, RPMI 세포 배양 배지로 세정하고, 100 마이크로-퀴리 (micro-Curies) 의 ⁵¹Cr 으로 표지하고, 세포 배양 배지로 2 회 세정하고, 세포 배양 배지에 10⁵ 세포/ml 의 밀도로 재현탁함 ;

iii) 상기 최종 표적 세포 현탁액 100 ㎕ 를 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 옮김 ;

iv) 항체를 세포 배양 배지에서 4000 ng/ml 내지 0.04 ng/ml 로 연속 희석하고, 수득되는 항체 용액 50 ㎕ 를 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 있는 표적 세포에 첨가하고, 상기 전체 농도 범위를 포함한 다양한 항체 농도를 3 중으로 테스트함 ;

v) 최대 방출 (MR) 대조군의 경우에는, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트의 3 개의 추가의 웰에, 항체 용액 (상기 iv 문단) 대신에 2% (VN) 비이온성 세제 수용액 (Nonidet, Sigma, St. Louis) 50 ㎕ 를 넣음 ;

vi) 자연 방출 (SR) 대조군의 경우에는, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트의 3 개의 추가의 웰에, 항체 용액 (상기 iv 문단) 대신에 RPMI 세포 배양 배지 50 ㎕ 를 넣음 ;

vii) 다음, 96 웰 마이크로타이터 플레이트를 50 x g 에서 1 분 동안 원심분리하고 4℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시킴 ;

viii) PBMC 현탁액 (상기 i 문단) 50 ㎕ 를 효과기 세포:표적 세포 비가 25:1 이 되도록 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% CO₂ 분위기, 37℃ 의 인큐베이터에 4 시간 동안 둠 ;

ix) 각 웰로부터 세포가 없는 상청액을 수확하고, 실험적으로 방출된 방사능활성 (ER) 을 감마선 계수기를 사용하여 정량화함 ;

x) 특정 용해 백분율을 식 (ER-MR)/(MR-SR) x 100 [식 중, ER 은 해당 항체 농도에 대해 정량된 평균 방사능활성 (상기 ix 문단 참조) 이고, MR 은 MR 대조군 (상기 v 문단 참조) 에 대해 정량된 평균 방사능활성 (상기 ix 문단 참조) 이고, SR 은 SR 대조군 (상기 vi 문단 참조) 에 대해 정량된 평균 방사능활성 (상기 ix 문단 참조) 임] 에 따라 각 항체 농도에 대해 계산함 ;

4) "증가된 ADCC" 는 상기 테스트된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 최대 특정 용해 백분율의 증가, 및/또는 상기 테스트된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 최대 특정 용해 백분율의 절반을 달성하는데 필요한 항체의 농도의 감소로서 정의된다. ADCC 의 증가는, 당업자에게 알려진 동일한 표준 제조, 정제, 제형 및 보관 방법을 사용하여, 동일한 항체에 의해 매개되며, 상기 어세이로 측정되고, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되나 GnTIII 을 과발현하도록 조작된 숙주 세포에 의해서는 생성되지 않는 ADCC 와 관련이 있다.

상기 "증가된 ADCC" 는 상기 항체의 당조작에 의해 수득될 수 있고, 이는 문헌 [Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 US 6,602,684 에 기술된 바와 같이, 모노클로날 항체의 올리고사카라이드 성분을 조작함으로써 상기 항체의 상기 자연적인, 세포-매개 효과기 작용을 증진시키는 것을 의미한다.

"보체-의존성 세포독성 (CDC)" 이라는 용어는 보체의 존재하에서 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 종양 표적 세포의 파쇄를 말한다. CDC 는 바람직하게는, CD20 발현 세포 제제를 보체의 존재 하에 본 발명에 따른 항-CD20 항체로 처리함으로써 측정된다. CDC 는 항체가 100 nM 의 농도에서 4 시간 후 종양 세포의 20% 이상의 파쇄 (세포 사멸) 를 유도하는 경우 발견된다. 어세이는 바람직하게는 ⁵¹Cr 또는 Eu 표지 종양 세포를 사용해 실시되고, 방출된 ⁵¹Cr 또는 Eu 를 측정한다. 대조군에는 보체는 있으나 항체는 없이 종양 표적 세포를 인큐베이션하는 것이 포함된다.

전형적으로 IgG1 아이소타입의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가 특징적인 CDC 특성을 나타낸다. 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 IgG1 아이소타입의 유형 I 항체에 비해 감소된 CDC (IgG1 아이소타입인 경우) 를 갖는다. 바람직하게는 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 IgG1 아이소타입 항체이다.

"리툭시마브" 항체 (참조 항체; 유형 I 항-CD20 항체의 예) 는 인간 CD20 항원에 대한 모노클로날 항체를 함유하는 유전적으로 조작된 키메라성 인간 감마 1 쥣과 불변 도메인이다. 상기 키메라성 항체는 인간 감마 1 불변 도메인을 함유하고, IDEC Pharmaceuticals Corporation 의 1998 년 4 월 17 일에 발행된 US 5,736,137 호 (Andersen, K. C, 등,) 에서 명칭 "C2B8" 로 규명된다. 리툭시마브는 재발 또는 난치성 저 악성도 (low-grade) 또는 여포성, CD20 양성의, B-세포 비-호지킨스 림프종 환자의 치료를 위해 승인되었다. 작용 기작에 대한 시험관 내 연구에서, 리툭시마브는 인간 보체-의존성 세포독성 (CDC) 을 나타내는 것으로 나타났다 (Reff, 등, Blood 83(2) (1994) 435-445). 추가로, 이것은 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 을 측정하는 어세이에서 유의한 활성을 나타낸다.

"인간화된 B-Ly1 항체" 라는 용어는 IgG1 의 인간 불변 도메인과의 키메라화, 및 연이은 인간화에 의해 쥣과 모노클로날 항-CD20 항체 B-Ly1 (쥣과 중쇄의 가변 영역 (VH): SEQ ID NO: 1; 쥣과 경쇄의 가변 영역 (VL): SEQ ID NO: 2 - 문헌 [Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139] 참조) 로부터 수득되는, WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호에 기술된 바와 같은 인간화된 B-Ly1 항체를 말한다 (WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호 참조). 이러한 "인간화된 B-Ly1 항체" 는 WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호에 상세히 기술되어 있다.

바람직하게는, "인간화된 B-Ly1 항체" 는 SEQ ID No.3 내지 SEQ ID No.20 (WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호의 B-HH2 ~ B-HH9 및 B-HL8 ~ B-HL17) 의 군으로부터 선택되는 중쇄의 가변 영역 (VH) 을 갖는다. 특히 바람직한 것은 Seq. ID No. 3, 4, 7, 9, 11, 13 및 15 (WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호의 B-HH2, BHH-3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 및 B-HL13) 이다. 바람직하게는 "인간화된 B-Ly1 항체" 는 SEQ ID No. 20 의 경쇄의 가변 영역 (VL) (WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호의 B-KV1) 을 갖는다. 더욱이, 인간화된 B-Ly1 항체는 바람직하게는 IgG1 항체이다. 바람직하게는, 이러한 인간화된 B-Ly1 항체는 WO 2005/044859 호, WO 2004/065540 호, WO 2007/031875 호, [Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 WO 99/154342 호에 기술된 방법에 따라 Fc 영역에서 당조작 (glycoengineered: GE) 된다. 이러한 당조작된 인간화된 B-Ly1 항체는 변경된 글리코실화 패턴을 Fc 영역에서 가지며, 바람직하게는 감소된 푸코오스 잔기 수준을 갖는다. 바람직하게는 Fc 영역의 올리고사카라이드 중 적어도 40% 이상 (한 구현예에서는 40% 내지 60%, 또다른 구현예에서는 50% 이상, 또다른 구현예에서는 70% 이상) 이 비-푸코실화된다. 더욱이, Fc 영역의 올리고사카라이드는 바람직하게는 양분된다.

올리고사카라이드 성분은 신체적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 저항성, 면역계와의 상호작용, 약동학, 및 특정 생물학적 활성을 비롯한 치료성 당단백질의 효능과 관련된 특성에 유의하게 영향을 줄 수 있다. 이러한 특성은 올리고사카라이드의 존재 또는 부재, 뿐만 아니라 그의 특정 구조에 따라 다를 수 있다. 올리고사카라이드 구조와 당단백질 기능 간에 어느 정도의 일반화가 이뤄질 수 있다. 예를 들어, 일부 올리고사카라이드 구조는 특정 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 혈류로부터의 당단백질의 빠른 제거를 매개하는 반면, 다른 구조는 항체에 의해 결합되고 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있다 (Jenkins, N., 등, Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).

포유류 세포는 인간 적용을 위해, 단백질을 가장 융화성인 형태로 글리코실화시키는 능력을 가져서, 치료성 당단백질 제조를 위한 바람직한 숙주이다 (Cumming, D.A., 등, Glycobiology 1 (1991) 115-130; Jenkins, N., 등, Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981). 박테리아는 단백질을 거의 글리코실화시키지 않고, 효모, 사상 진균류, 곤충 및 식물 세포와 같은 기타 종류의 통상의 숙주는, 혈류로부터의 빠른 제거, 원치 않는 면역 상호작용, 및 일부 특정 경우에서는 감소된 생물학적 활성과 관련된 글리코실화 패턴을 초래한다. 포유류 세포 중, 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO) 세포가 지난 20 년 동안 가장 통상적으로 사용되어 왔다. 적합한 글리코실화 패턴을 제공하는 것 외에도, 이들 세포들은 유전적으로 안정하고, 고도로 생산적인 클론 세포주의 일관된 세대를 가능하게 한다. 이들은 무혈청 배지를 사용하여 간단한 생물반응기에서 고밀도로 배양될 수 있고, 안전하고 재현성 있는 생물공정 개발을 가능하게 한다. 기타 통상적으로 사용되는 동물 세포에는 아기 햄스터 신장 (baby hamster kidney: BHK) 세포, NSO- 및 SP2/0-마우스 골수종 세포가 포함된다. 더욱 최근에는, 유전자이식 동물로부터의 생산이 또한 테스트되고 있다 (Jenkins, N., 등, Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).

모든 항체는 중쇄 불변 영역 내의 보존된 위치에서 탄수화물 구조를 함유하고, 각각의 아이소타입은 단백질 조립, 분비 또는 기능 활성에 다양하게 영향을 미치는 N-연결 탄수화물 구조의 차별되는 어레이를 갖는다 (Wright, A., and Monison, S. L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). 부착된 N-연결 탄수화물의 구조는 가공 정도에 따라 상당히 다르며, 고-만노오스, 복합 분지, 뿐만 아니라 바이안테너리 (biantennary) 복합체 올리고사카라이드가 포함될 수 있다 (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). 전형적으로, 특정 글리코실화 부위에서 부착된 코어 올리고사카라이드 구조의 이질적 가공이 있어서 심지어 모노클로날 항체가 복합 글리코형태로서 존재하도록 한다. 마찬가지로, 세포주 사이에서 항체 글리코실화의 주된 차이가 발생하고, 상이한 배양 조건 하에서 성장되는 해당 세포주에 대해서는 심지어 작은 차이도 나타난다는 것이 제시되었다 (Lifely, M. R., 등, Glycobiology 5 (1995) 813-822).

간단한 생산 공정을 유지하고 유의한, 원치 않는 부작용을 잠재적으로 피하면서 효능 면에서 큰 증가를 수득하기 위한 하나의 방법은 문헌 [Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 및 US 6,602,684 호] 에 기술되는 바와 같이, 항체의 올리고사카라이드 성분을 조작함으로써 모노클로날 항체의 자연적인, 세포-매개 효과기 작용을 증진시키는 것이다. 암 면역치료법에 가장 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인 내의 Asn297 에서 보존된 N-연결 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297 에 부착된 2 개의 복합체 바이안테너리 올리고사카라이드는 CH2 도메인 사이에 묻혀서 폴리펩티드 골격과의 폭넓은 접촉을 형성하고, 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 작용을 매개하기 위해서는 이들의 존재가 항체에 필수적이다 (Lifely, M. R., 등, Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., 등, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32).

양분된 올리고사카라이드의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라아제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III ("GnTII17y) 의 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 과발현되는 것이, 조작된 CHO 세포에 의해 생성되는 항신경모세포종 키메라성 모노클로날 항체 (chCE7) 의 시험관 내 ADCC 활성을 유의하게 증가시킨다는 것이 이미 나타났다 (전체 내용이 본원에 참조로서 인용되는 [Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] ; 및 WO 99/154342 호 참조). 항체 chCE7 은 높은 종양 친화성 및 특이성을 갖지만, GnTIII 효소가 결핍된 표준 산업 세포주에서 생성되는 경우 효능이 너무 작아서 임상적으로 유용하지 않은 비공액 모노클로날 항체의 큰 부류에 속한다 (Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180). 상기 연구는 ADCC 활성의 큰 증가가 GnTIII 을 발현하도록 항체 생성 세포를 조작함으로써 수득될 수 있고, 이는 또한 양분된, 비-푸코실화된 올리고사카라이드를 비롯한 불변 영역 (Fc) 에 관련된 양분된 올리고사카라이드의 비율을, 자연 발생 항체에서 발견되는 수준 초과로 증가시킨다는 것을 처음으로 보여주었다.

용어 "프로테아좀" 은 예를 들어, [Coux, O., Tanaka, K. and Glodberg, A., Ann. Rev. Biochem. 65 (1996) 801-847; Voges, D., Annu Rev Biochem. 68 (1999) 1015-68 or Kisselev, A.L., 등, Chem Biol Vol. 8 (8) (2001) 739-758] 에서 기술된 바와 같이, 26S 프로테아좀을 말한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "프로테아좀 억제제" 는 26S 프로테아좀의 활성을 억제시키는 제제를 말한다. 상기 프로테아좀 억제제에는 즉, 예를 들어, 펩티드 유도체, 예컨대 펩티드 알데하이드 (예를 들어, MG132, MG115, CEP-1615, PSI, 또는 면역프로테아좀 특이적 억제제 IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N-카르보벤질옥시-루실-노르루시날, US　2006/0241056 참조), 펩티드 보로네이트 (예를 들어, 보르테조미브 (PS-341) 또는 DFLB), 펩티드 에폭시케톤 (예를 들어, 에폭소미신, 디히드로에포네마이신, 또는 에폭소미신 유도체 카르필조미브 (PR-171)), 또는 펩티드 비닐 술폰 (예를 들어, NLVS) 및 비-펩티드 유도체, 예컨대 살리노스포라미드 A (NPI-0052), 살리노스포라미드 A 유도체, 락타시스틴 또는 락타시스틴 유도체 (예를 들어, 클라스토-락타시스틴-L-락톤 (오무랄라이드) 또는 PS-519) 가 포함된다. 상기 프로테아좀 억제제의 상이한 유형 및 구조는 예를 들어, [Kisselev, A.L., 등, Chem Biol Vol. 8 (8) (2001) 739-758], WO　2004/004749 및 [Joazeiro, C., 등, Cancer Res. 66(16) (2006) 7840-7842)], [Kanagasabaphy, P., 등, Curr Opin Investig Drugs 8 (2007) 447-51], [Adams, J., Nat Rev Cancer 4 (2004) 349-360] 및 US　2006/0241056 에 기술되어 있다.

바람직하게는 상기 프로테아좀 억제제는 펩티드 알데하이드 (바람직하게는 N-카르보벤질옥시-루실-노르루시날 (IPSI-001)), 펩티드 보로네이트 (바람직하게는 보르테조미브 (PS-341)), 펩티드 에폭시케톤 (바람직하게는 에폭소미신 유도체 카르필조미브 (PR-171)), 또는 살리노스포라미드 A (NPI-0052) 로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 상기 프로테아좀 억제제는 보르테조미브 (PS-341), 카르필조미브 (PR-171), 살리노스포라미드 A (NPI-0052) 또는 N-카르보벤질옥시-루실-노르루시날 (IPSI-001) 로부터 선택된다.

바람직한 구현예에서, 프로테아좀 억제제는 펩티드 알데하이드 (바람직하게는 N-카르보벤질옥시-루실-노르루시날 (IPSI-001)), 펩티드 보로네이트 (바람직하게는 보르테조미브 (PS-341)) 또는 펩티드 에폭시케톤으로부터 선택되는 펩티드 유도체이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 프로테아좀 억제제는 펩티드 보로네이트 (바람직하게는 보르테조미브 (PS-341); 예를 들어, [Adams, J., Cur. Opin. Chem Biol. 6 (2002) 493-500] 및 US　5,780,454) 참조) 이다.

바람직하게는, 프로테아좀 억제제의 항-프로테아좀 억제 활성의 IC₅₀ 은 5 μM 이하, 더욱 바람직하게는 1 μM 이하이다. 단계 희석, 및 비-선형 곡선 피트 (fit) (XLfit 소프트웨어 (ID Business Solution Ltd., Guilford, Surrey, UK)) 를 사용한 계산을 통해 상기 프로테아좀 억제제를 규명하고 항-프로테아좀 억제 활성의 IC₅₀ 을 측정하는 세포-기재 어세이는 U266 세포 (인간 형질 골수종) 를 사용한 Promega 의 Proteasome-Glo™ Cell-Based Assay Reagent 을 이용하는 [Moravec, R., 등, Cell Notes 15 (2006) 4-7] 에 기술되어 있다. 상기 "첨가-혼합-측정" 어세이는 배양된 세포 내에서 프로테아좀과 연관된 키모트립신-형 프로테아제 활성을 측정한다.

IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N-카르보벤질옥시-루실-노르루시날) 외에도, US　2006/0241056 의 하기 펩티드 유도체가 또한 바람직한 프로테아좀 억제제이다 : N-카르보벤질옥시-호모페닐알라닐-페닐알라닐알, N-카르보벤질옥시-루실-페닐알라닐알, N-카르보벤질옥시-알라닐-페닐알라닐알, N-카르보벤질옥시-글리실-프로필-알라닐-페닐알라닐알, N-카르보벤질옥시-글리실-프로필-페닐알라닐-페닐알라닐알, N-카르보벤질옥시-글리실-페닐알라닐-페닐알라닐알, N-카르보벤질옥시-루실-노르루신 보론산, N-카르보벤질옥시-페닐알라닐-페닐알라닌 보론산, N-카르보벤질옥시-호모페닐알라닐-페닐알라닌 보론산, N-카르보벤질옥시-루실-페닐알라닌 보론산, N-카르보벤질옥시-글리실-프로필-알라닐-페닐알라닌 보론산, N-카르보벤질옥시-글리실-프로필-페닐알라닐-페닐알라닌 보론산, N-카르보벤질옥시-루실-루실-페닐알라닌 보론산, N-카르보벤질옥시-글리실-페닐알라닐-페닐알라닌 보론산, N-카르보벤질옥시-루실-노르루신 메틸 비닐 술폰, N-카르보벤질옥시-페닐알라닐-페닐알라닌 메틸 비닐 술폰, N-카르보벤질옥시-호모페닐알라닐-페닐알라닌 메틸 비닐 술폰, N-카르보벤질옥시-루실-페닐알라닌 메틸 비닐 술폰, N-카르보벤질옥시-알라닐-페닐알라닌 메틸 비닐 술폰, N-카르보벤질옥시-글리실-프로필-알라닐-페닐알라닌 메틸 비닐 술폰, N-카르보벤질옥시-글리실-프로필-페닐알라닐-페닐알라닌 메틸 비닐 술폰, N-카르보벤질옥시-루실-루실(Iθucyl)-페닐알라닌 메틸 비닐 술폰, N-카르보벤질옥시-글리실-페닐알라닐-페닐알라닌 메틸 비닐 술폰, N-카르보벤질옥시-루실-노르루신 에폭시 케톤, N-카르보벤질옥시-페닐알라닐-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카르보벤질옥시-호모페닐알라닐-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카르보벤질옥시-루실-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카르보벤질옥시-알라닐-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카르보벤질옥시-글리실-프로필-알라닐-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카르보벤질옥시-글리실-프로필-페닐알라닐-페닐알라닌 에폭시 케톤, N-카르보벤질옥시-루실-루실-페닐알라닌 에폭시 케톤, 및 N-카르보벤질옥시-글리실-페닐알라닐-페닐알라닌 에폭시 케톤.

용어 "CD20 항원의 발현" 은 종양 또는 암, 각각, 바람직하게는 비-고형 종양의 세포, 바람직하게는 T- 또는 B-세포, 더욱 바람직하게는 B-세포의 세포 표면 상에서의 CD20 항원의 유의한 발현 수준을 나타내는 것이다. "CD20 발현 암" 환자는 당업계에 공지된 표준 어세이에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, CD20 항원 발현은 면역조직화학 (IHC) 검출, FACS 를 사용해서 또는 상응하는 mRNA 의 PCR-기재 검출을 통해 측정된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "CD20 발현 암" 은 암 세포가 CD20 항원의 발현을 나타내는 모든 암을 말한다. 이러한 CD20 발현 암은 예를 들어, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비 소세포 폐 (NSCL) 암, 세기관지폐포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 (intraocular) 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 위장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 외음부암종, 호지킨스 질환, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신세포암종, 신우암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추 신경계 (CNS) 의 신생물, 척추종양, 뇌간교종, 다형성 아교모세포종, 별아교세포종, 신경초종, 뇌실막세포종, 수질아세포종, 수막종, 편평세포암종, 뇌하수체샘종일 수 있고, 상기 임의의 암 중 난치성 유형을 포함하며, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합일 수 있다.

바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같은 CD20 발현 암은 림프종 (바람직하게는 B-세포 비-호지킨스 림프종 (NHL)) 및 림프구성 백혈병을 말한다. 이러한 림프종 및 림프구성 백혈병에는 예를 들어 a) 여포성 림프종, b) 소 비-분할 세포 림프종/버킷 (Burkitt) 림프종 (토착성 버킷 (Burkitt) 림프종, 산발성 버킷 림프종 및 비-버킷 림프종을 포함) c) 변연대 림프종 (림프절 이외 변연대 B 세포 림프종 (점막-관련 림프 조직 림프종, MALT), 결절 변연대 B 세포 림프종 및 지라 변연대 림프종 포함), d) 맨틀 세포 림프종 (MCL), e) 대세포 림프종 (B-세포 확산 대세포 림프종 (DLCL), 확산 혼합 세포 림프종, 면역모세포 림프종, 일차성 종격동 B-세포 림프종, 혈관중심성 림프종-폐 B-세포 림프종 포함) f) 모발상 세포 백혈병, g) 림프구성 림프종, 발덴스트룀 마크로글로불린혈증, h) 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소 림프구성 림프종 (SLL), B-세포 전림프구성 백혈병, i) 형질 세포 신생물, 형질 세포 골수종, 다발성 골수종, 형질세포종 j) 호지킨스 질환이 포함된다.

더욱 바람직하게는, CD20 발현 암은 B-세포 비-호지킨스 림프종 (NHL) 이다. 특히 CD20 발현 암은 맨틀 세포 림프종 (MCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), B-세포 확산 대세포 림프종 (DLCL), 버킷 림프종, 모발상 세포 백혈병, 여포성 림프종, 다발성 골수종, 변연대 림프종, 이식후 림프세포 증식 장애 (PTLD), HIV 관련 림프종, 발덴스트룀 마크로글로불린혈증, 또는 일차성 CNS 림프종이다.

예를 들어, 암에 적용될 때, 용어 "치료 방법" 또는 그와 동일한 용어는 환자에서 암 세포의 수를 감소 또는 제거하기 위해, 또는 암 증상을 완화시키기 위해 고안되는 작용의 절차 또는 과정을 말한다. 암 또는 기타 증식 장애의 "치료 방법" 은 본질적으로는, 암 세포 또는 기타 장애가 사실상 제거될 것이고, 암 또는 기타 장애의 수가 사실상 감소될 것이고, 또는 암 또는 기타 장애의 증상이 사실상 완화될 것임을 의미하지는 않는다. 종종, 암 치료 방법은 심지어 성공가능성이 낮아도 수행될 것이나, 그럼에도 불구하고, 환자의 제시된 병력 및 추정 생존 기대치가 전반적인 유리한 작용 경과를 유도하는 것으로 생각된다.

용어 "공동-투여" 또는 "공동-투여하기" 는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 프로테아좀 억제제를 하나의 단일 제형으로서 또는 2 개의 분리 제형으로서 투여하는 것을 말한다. 공동-투여는 동시에 또는 서로 연속으로 이뤄질 수 있고, 이 때 바람직하게는 두 가지 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 시간대가 있다. 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 프로테아좀 억제제는 동시에 또는 연속으로 공동-투여된다 (예를 들어, 지속적 주입을 통한 정맥내 (i.v.) 를 통해 (항체에 대해 한번 그리고 최종적으로 프로테아좀 억제제에 대해 한번; 또는 프로테아좀 억제제를 경구로 투여함). 2 가지 치료제가 연속으로 공동-투여되는 경우, 투여량은 동일한 날에 2 개의 개별 투여로, 또는 제제 중 하나를 제 1 일에 투여하고, 두번째 것을 제 2 일 내지 제 7 일, 바람직하게는 제 2 일 내지 제 4 일에 공동-투여한다. 따라서 "연속으로" 이라는 용어는 제 1 항체의 투여 후 7 일 내에, 바람직하게는 제 1 항체의 투여 후 4 일 내에를 의미하고 ; "동시에" 라는 용어는 동시각에를 의미한다. 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제의 유지 투여량과 관련된 "공동-투여" 라는 용어는 치료 주기가 2 가지 약물에 적합한 경우 유지 투여량을 예를 들어 매주 동시에 공동-투여할 수 있음을 의미한다. 또는 예를 들어, 프로테아좀 억제제를 예를 들어 매 제 1 일 내지 제 3 일에 투여하고 유형 Ⅱ 항-CD20 항체를 매주 투여한다. 또는 유지 투여량을 1 일 내에 또는 수 일 내에 연속으로 공동-투여한다.

항체는 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 찾아진 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 각각의 화합물 또는 병용물의 양인 "치료적 유효량" (또는 간단히 "유효량") 으로 환자에게 투여되는 것이 자명하다.

상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 프로테아좀 억제제의 공동-투여 양 및 공동-투여 시기는 치료되는 환자의 유형 (종, 성별, 연령, 체중 등) 및 상태, 및 치료되는 질환 또는 상태의 중증도에 따라 상이할 것이다. 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 프로테아좀 억제제는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 공동-투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예를 들어, 0.1 ~ 20 mg/kg) 의 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예를 들어, 0.1 ~ 20 mg/kg) 의 상기 프로테아좀 억제제가 환자에게 있어서 모든 약물의 공동-투여를 위한 초기 후보 투여량이다. 정맥 투여의 경우, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 또는 상기 프로테아좀 억제제에 대한 초기 주입 시간은 후속 주입 시간보다 더 길어질 수 있고, 예를 들어 초기 주입은 대략 90 분, 및 후속 주입은 대략 30 분 (초기 주입이 잘 용인되는 경우) 일 수 있다.

상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 바람직한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 30 mg/kg 의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 의 하나 이상의 투여량이 환자에게 공동-투여될 수 있다. 상기 프로테아좀 억제제의 바람직한 투여량은 보르테조미브에 대해 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10.0 mg/kg 의 범위일 것이다. 환자의 유형 (종, 성별, 연령, 체중 등) 및 상태, 및 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제의 유형에 따라, 상기 항-CD20 항체의 투여량 및 투여 스케쥴은 프로테아좀 억제제의 투여량과 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 항-CD20 항체는 예를 들어, 1 내지 3 주마다 투여될 수 있고, 상기 프로테아좀 억제제는 매일 또는 2 내지 10 일마다 투여될 수 있다. 초기 로딩 투여량이 더 높으면, 이어서 더 낮은 투여량으로 1 회 이상 투여될 수도 있다.

바람직한 구현예에서, 약제는 CD20 발현 암 환자에서 전이 또는 추가의 파종을 예방 또는 감소시키기에 유용하다. 약제는 상기 환자의 생존 기간을 증가시키고, 상기 환자의 무-진행 생존을 증가시키고, 반응 기간을 증가시켜서, 생존 기간, 무-진행 생존, 반응률 또는 반응 기간에 의해 측정된 바와 같이 치료되는 환자의 통계학적으로 유의하고 임상적으로 의미있는 향상을 초래하는데 유용하다. 바람직한 구현예에서, 약제는 환자군에서 반응률을 증가시키는데 유용하다.

본 발명의 문맥에서, 추가의 기타 세포독성제, 화학치료제 또는 항암제, 또는 이러한 제제의 효과를 증진시키는 화합물 (예를 들어, 사이토카인) 이 CD20 발현 암의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제 병용 치료에 사용될 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도되는 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재한다. 바람직하게는 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제 병용 치료는 이러한 추가의 세포독성제, 화학치료제 또는 항암제, 또는 이러한 제제의 효과를 증진시키는 화합물 없이 사용된다.

이러한 제제에는 예를 들어 하기가 포함된다 : 알킬화제 또는 알킬화 작용을 갖는 제제, 예컨대 시클로포스파미드 (CTX; 예를 들어, cytoxan®), 클로람부실 (CHL; 예를 들어, leukeran®), 시스플라틴 (CisP; 예를 들어, platinol®), 부술판 (예를 들어, myleran®), 멜팔란, 카르무스틴 (BCNU), 스트렙토조토신, 트리에틸렌멜라민 (TEM), 미토마이신 C 등; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트 (MTX), 에토포시드 (VP16; 예를 들어, vepesid®), 6-머캅토퓨린 (6MP), 6-티오구아닌 (6TG), 시타라빈 (Ara-C), 5-플루오로우라실 (5-FU), 카페시타빈 (예를 들어, Xeloda®), 다카르바진 (DTIC) 등; 항생제, 예컨대 악티노마이신 D, 독소루비신 (DXR; 예를 들어, adriamycin®), 다우노루비신 (다우노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 등; 알칼로이드, 예컨대 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴 (VCR), 빈블라스틴 등; 및 기타 항종양제, 예컨대 파클리탁셀 (예를 들어, taxol®) 및 파클리탁셀 유도체, 세포증식억제제, 글루코코르티코이드, 예컨대 덱사메타손 (DEX; 예를 들어, decadron®) 및 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 뉴클레오시드 효소 억제제, 예컨대 히드록시우레아, 아미노산 고갈 효소, 예컨대 아스파라기나아제, 류코보린 및 기타 엽산 유도체, 및 유사체, 다양한 항종양제. 하기 제제가 또한 추가의 제제로서 사용될 수 있다 : 아르니포스틴 (예를 들어, ethyol®), 닥티노마이신, 메클로레타민 (질소 머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 로무스틴 (CCNU), 독소루비신 리포 (예를 들어, doxil®), 겜시타빈 (예를 들어, gemzar®), 다우노루비신 리포 (daunorubicin lipo) (예를 들어, daunoxome®), 프로카르바진, 미토마이신, 도세탁셀 (예를 들어, taxotere®), 알데스류킨, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, CPT 11 (이리노테칸), 10-히드록시 7-에틸-캄프토테신 (SN38), 플록스우리딘, 플루다라빈, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 인터페론 베타, 인터페론 알파, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 타목시펜, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 클로람부실. 바람직하게는, 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제 병용 치료는 이러한 추가의 제제 없이 사용된다.

화학치료 섭생에서 상기 기술된 세포독성제 및 항암제, 뿐만 아니라 단백질 키나아제 억제제와 같은 항증식 표적-특이적 항암 약물의 사용은 일반적으로 암치료 분야에서 잘 특징화되어 있고, 본원에서 이들의 사용은 내성 및 효능의 모니터링, 및 투여 경로 및 투여량의 조절에 대해 일부 조정이 있으면서 동일하게 고려된다. 예를 들어, 세포독성제의 실제 투여량은 조직 배양법을 사용하여 측정되는 환자의 배양된 세포 반응에 따라 다를 수 있다. 일반적으로, 투여량은 추가의 기타 제제의 부재 시 사용되는 양에 비해 감소될 것이다.

효과적인 세포독성제의 전형적인 투여량은 제조업자가 권고하는 범위 내에 있을 수 있고, 시험관 내 반응 또는 동물 모델에서의 반응에 의해 지시되는 경우 약 1 차수 (one order of magnitude) 이하의 농도 또는 양으로 감소될 수 있다. 따라서, 실제 투여량은 주치의의 판단, 환자의 상태, 및 1 차 배양된 악성 세포 또는 조직학적 배양된 조직 샘플의 시험관 내 반응성, 또는 적절한 동물 모델에서 관찰된 반응을 바탕으로 한 치료 방법의 효능에 따라 다를 것이다.

본 발명의 문맥에서, 효과적인 양의 이온화 방사선치료가 수행될 수 있고/거나, 또는 방사성약학제 (radiopharmaceutical) 가 CD20 발현 암의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제 병용 치료에 더해져서 사용될 수 있다. 방사선원은 치료되는 환자의 외부 또는 내부일 수 있다. 공급원이 환자의 외부에 있는 경우, 상기 치료는 외부 빔 방사선 치료 (EBRT) 로서 알려져 있다. 방사선 공급원이 환자 내부인 경우, 상기 치료는 근접조사치료 (BT) 로서 알려져 있다. 본 발명의 문맥에서 사용되는 방사성 원자는 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 요오드-123, 요오드-131, 및 인듐-111 을 포함하나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 방사성 동위원소로 항체를 표지하는 것이 또한 가능하다. 바람직하게는 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제 병용 치료는 상기 이온화 방사선치료 없이 사용된다.

방사선 치료는 제거불가능한 또는 수술불가능한 종양 및/또는 종양 전이의 조절을 위한 표준 치료법이다. 방사선 치료를 화학치료법과 병용하였을 때, 향상된 결과가 나타났다. 방사선 치료는 고-선량 방사선을 표적 영역에 쬐었을 때, 종양 및 정상 조직 둘 다에서 생식 세포가 사멸할 것이라는 원리를 바탕으로 한다. 방사선량 섭생은 일반적으로 방사선 흡수 선량 (Gy), 시간 및 분할법 (fractionation) 의 면에서 규정되고, 종양학자에 의해 주의깊게 규정되어야 한다. 환자가 받는 방사선 양은 다양한 고려사항에 따라 다를 것이나, 2 가지 가장 중요한 점은 신체의 다른 중요 구조 또는 기관과 관련된 종양의 위치, 및 종양이 퍼펴 있는 범위이다. 방사선 치료를 받는 환자에 대한 전형적인 치료 코스는 1 내지 6 주에 걸친 치료 스케쥴로서, 총 선량은 10 내지 80 Gy 이고, 약 1.8 내지 2.0 Gy 의 단일 일일 분획으로 1 주에 5 일 환자에 쬐어진다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 인간 환자의 종양이 본 발명 및 방사선의 병용 치료로 치료되는 경우, 상승 효과가 있다. 즉, 본 발명의 병용을 포함하는 제제를 이용한 종양 성장의 억제는 방사선, 임의로 추가의 화학치료제 또는 항암제와 병용되었을 때 증진된다. 보조 방사선 치료의 파라미터는 예를 들어, WO　99/60023 에 기술되어 있다.

유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 공지된 방법에 따라, 일시의 정맥내 투여 또는 일정 기간에 걸친 지속적 주입, 근육내, 복강내, 뇌척수내 (intracerobrospinal), 피하, 관절내, 활액막내 (intrasynovial), 또는 수강내 (intrathecal) 경로에 의해 환자에 투여된다. 정맥내 또는 피하 항체 투여가 바람직하다.

프로테아좀 억제제는 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 일시의 정맥내 투여 또는 일정 기간에 걸친 지속적 주입, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액막내, 수강내, 또는 경구 경로에 의해 환자에 투여된다. 프로테아좀 억제제의 정맥내, 피하 또는 경구 투여가 바람직하다.

본 발명은 CD20 발현 암으로 고통받는 환자의 병용 치료를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제를 포함하는 키트를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 키트 용기는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 멸균 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 바람직하게는 개별 추가 용기에서 보관된다. 상기 키트에는, CD20 발현 암 질환, 바람직하게는 B-세포 비-호지킨스 림프종 (NHL) 에 대한 방법으로서 병용 치료를 사용하는 것에 관한 인쇄된 지시물이 든 포장 삽입물이 추가로 포함될 수 있다.

용어 "포장 삽입물" 은 치료 제품의 시판의 포장 내에 관례상 포함된 지시물을 말하고, 이에는 상기 치료 제품의 사용과 관련한 지시사항, 용법, 투여량, 투여, 사용 중지 사유 및/또는 주의사항에 대한 정보가 포함될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 제조 용기 물품은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품은 멸균 희석제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 바람직하게는 개별 추가 용기 내에 보관된다.

본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체" 는 약학적 투여와 융화성인 임의의 및 모든 물질을 포함하고자 하며, 이에는 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제, 및 화학적 투여와 융화성인 기타 물질 및 화합물이 포함된다. 임의의 통상의 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비융화성이라는 점을 제외한다면, 본 발명의 조성물에서의 이의 용도가 고려된다. 보조 활성 화합물이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다.

약학적 조성물 :

약학적 조성물은 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및/또는 본 발명에 따른 프로테아좀 억제제와 약학적으로 허용가능한, 무기 또는 유기 담체를 가공함으로써 수득될 수 있다. 락토스, 옥수수 전분 또는 그의 유도체, 탈크, 스테아르산 또는 그의 염 등이 예를 들어, 정제, 코팅 정제, 당의정 및 경질 젤라틴 캡슐용 상기 담체로서 사용될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐에 적합한 담체는 예를 들어, 식물유, 왁스, 지방, 준-고체 및 액체 폴리올 등이다. 그러나, 활성 성분의 성질에 따라, 연질 젤라틴 캡슐의 경우에는 보통 담체가 필요하지 않다. 용액 및 시럽 제조에 적합한 담체는 예를 들어, 물, 폴리올, 글리세롤, 식물유 등이다. 좌제에 적합한 담체는 예를 들어, 천연유 또는 경화유, 왁스, 지방, 준-고체 또는 액체 폴리올 등이다.

더욱이, 약학적 조성물은 방부제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 삼투압을 다양하게 하기 위한 염, 완충제, 맛가림제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한, 다른 치료학적으로 가치있는 성분을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 한 구현예는 특히 CD20 발현 암에서 사용하기 위한, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 프로테아좀 억제제 둘 다를 포함하는 약학적 조성물이다.

상기 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 하기를 포함하는, 특히 암에서 사용하기 위한 약학적 조성물을 추가로 제공한다 : (i) 효과적인 제 1 양의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체, 및 (ii) 효과적인 제 2 양의 프로테아좀 억제제. 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 임의로 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 단독의 약학적 조성물은 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로, 목적하는 순도를 갖는 항체를 임의의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) 와 함께 혼합함으로써, 보관용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 적용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이고, 이에는 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충제 ; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제 ; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드 ; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드 ; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜 ; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤 ; 카테콜 ; 레소르시놀 ; 시클로헥사놀 ; 3-펜타놀 ; 및 M-크레졸) ; 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드 ; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질 ; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체 ; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산 ; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물 ; EDTA 와 같은 킬레이트화제 ; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당 ; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온 ; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체) ; 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 과 같은 비-이온성 계면활성제가 포함된다.

프로테아좀 억제제 단독의 약학적 조성물은 그의 약학적 특성에 의존하는데 ; 예를 들어, 보르테조미브 (bortezomib) 와 같은 작은 화학 화합물에 대해, 하나의 제제는 예를 들어, 하기일 수 있다 :

a) 정제 제제 (습식 과립화) :

목록	성분	mg/정제
1.	화학식 (I) 의 화합물	5	25	100	500
2.	락토스 무수 DTG	125	105	30	150
3.	Sta-Rx 1500	6	6	6	30
4.	미세결정질 셀룰로스	30	30	30	150
5.	마그네슘 스테아레이트	1	1	1	1
	총	167	167	167	831

제조 과정 :

1. 목록 1, 2, 3 및 4 를 혼합하고, 정제수로 과립화시킴.

2. 상기 과립을 50℃ 에서 건조시킴.

3. 상기 과립을 적합한 분쇄 장치에 통과시킴.

4. 목록 5 를 첨가하고, 3 분 동안 혼합시키고 ; 적합한 압축기 상에서 압축시킴.

b) 캡슐 제제 :

목록	성분	mg/캡슐
1.	화학식 (I) 의 화합물	5	25	100	500
2.	수화 락토스	159	123	148	---
3.	옥수수 전분	25	35	40	70
4.	탈크	10	15	10	25
5.	마그네슘 스테아레이트	1	2	2	5
	총	200	200	300	600

제조 과정 :

1. 목록 1, 2 및 3 을 적합한 혼합기 내에서 30 분 동안 혼합함.

2. 목록 4 및 5 를 첨가하고, 3 분 동안 혼합함.

3. 적합한 캡슐에 충전시킴.

본 발명의 하나의 추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 프로테아좀 억제제에 대한 2 개의 개별 제제이다.

활성 성분은 또한, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 미세유화제, 나노입자 및 나노캡슐), 또는 마크로유화제 내에서, 각각 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 인터레이셜 (interracial) 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리- (메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포장될 수 있다. 상기 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 에 개시되어 있다.

서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반침투성 (semipermeable) 매트리스가 포함되고, 상기 매트리스는 성형 물품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태로 있다. 서방성 매트리스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드 (US　3,773,919), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해가능성 에틸렌-비닐 아세테이트, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 (leuprolide) 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미세구) 과 같은 분해가능한 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.

생체 내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

본 발명은 (i) 효과적인 제 1 양의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 ; 및 (ii) 효과적인 제 2 양의 프로테아좀 억제제를 암 치료가 필요한 환자에 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 추가로 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자" 는 바람직하게는 임의의 목적을 위해 유형 Ⅱ 항-CD20 항체를 사용한 치료가 필요한 인간 (예를 들어, CD20 발현 암 환자), 및 더욱 바람직하게는 암, 또는 전암성 상태 또는 병변을 치료하기 위해 상기 치료가 필요한 인간을 말한다. 그러나, 용어 "환자" 는 또한, 비-인간 동물, 바람직하게는 그 중에서도 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류와 같은 비-인간 동물을 말할 수 있다.

본 발명은 추가로 CD20 발현 암 환자의 치료를 위해 유형 Ⅱ 항-CD20 항체를 프로테아좀 억제제와 병용하여 포함한다.

본 발명은 추가로 CD20 발현 암의 치료에 사용하기 위해 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제를 포함한다.

본 발명은 추가로 CD20 발현 암 환자의 치료에 사용하기 위해 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제를 포함한다.

바람직하게는, 프로테아좀 억제제는 항-프로테아좀 억제 활성의 IC₅₀ 을 5 μM 이하로 갖는다. 바람직하게는 상기 프로테아좀 억제제는 펩티드 알데하이드 (바람직하게는 N-카르보벤질옥시-루실-노르루시날 (IPSI-001)), 펩티드 보로네이트 (바람직하게는 보르테조미브 (PS-341)), 펩티드 에폭시케톤 (바람직하게는 에폭소미신 (epoxomicin) 유도체 카르필조미브 (carfilzomib) (PR-171)), 또는 살리노스포라미드 A (salinosporamide A, NPI-0052) 로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 상기 프로테아좀 억제제는 보르테조미브 (PS-341), 카르필조미브 (PR-171), 살리노스포라미드 A (NPI-0052) 또는 N-카르보벤질옥시-루실-노르루시날 (IPSI-001) 로부터 선택된다.

바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시마브와 비교한 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의, 라지 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합능의 비를 0.3 내지 0.6, 더욱 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 및 더욱 더 바람직하게는 0.4 내지 0.5 로 갖는다.

바람직하게는 CD20 발현 암은 B-세포 비-호지킨스 림프종 (NHL) 이다.

하기 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕고자 제공된 것이고, 이의 실제 범주는 첨부된 청구항에 나타나 있다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 과정에 변형을 줄 수 있음을 이해한다.

서열 목록

SEQ ID NO: 1 쥣과 모노클로날 항-CD20 항체 B-Ly1 의 중쇄 가변 영역 (VH) 의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 2 쥣과 모노클로날 항-CD20 항체 B-Ly1 의 경쇄 가변 영역 (VL) 의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 3 ~ 19 인간화된 B-Ly1 항체 (B-HH2 내지 B-HH9, B-HL8, 및 B-HL10 내지 B-HL17) 의 중쇄 가변 영역 (VH) 의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 20 인간화된 B-Ly1 항체 B-KV1 의 경쇄 가변 영역 (VL) 의 아미노산 서열.

도 1 SU-DHL-4 DLBCL B-세포 비-호지킨스 림프종 (NHL) 에 대한, 프로테아좀 억제제 (보르테조미브) 와 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 (B-HH6-B-KV1 GE) (리툭시마브와 비교한 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의, 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합능의 비가 0.44 임) 의 병용 치료의 항종양 활성. 종양 부피의 평균 값 [㎣] 은 y-축에서 +/- IQR 로 작성되고 ; 종양 세포의 주입 후 날수는 x-축에 작성되어 있음. 설명 : A) 비히클 (원형), B) 매주 1 회 인간화된 B-Ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) 10 mg/kg (사각형), C) 매주 1 회 프로테아좀 억제제 보르테조미브 1 mg/kg (삼각형), 및 D) 프로테아좀 억제제 보르테조미브 (1 mg/kg 매주 1 회) 와 함께 공동-투여되는 매주 1 회의 인간화된 B-Ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) 10 mg/kg (엑스표).
도 2 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 유형 I 항-CD20 항체 (Cy5-리툭시마브 = 흰색 막대) 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 (Cy5 인간화된 B-Ly1 B-HH6-B-KV1 GE = 검은색 막대) 의 평균 형광 강도 (MFI, 좌측 y-축); 리툭시마브와 비교한, 유형 I 항-CD20 항체 (리툭시마브) 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 (B-HH6-B-KV1 GE) 의 CD20 에 대한 결합능의 비 (우측 y-축 눈금)
도 3 Z138 인간 비-호지킨스 림프종 (NHL) 에 대한 2 가지 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 치료의 항종양 활성. 모든 항체는 인간화 B-Ly1 항-CD20 항체임 ; 1) B-HH6-B-KV1 당조작 (GE) 및 2) B-HH6-B-KV1 야생형 (wt, 비-당조작). 종양 부피의 평균 값 [㎣] 은 y-축 상에 작성되고; 종양 세포의 주입 후 날수는 x-축 상에 작성되어 있음. 설명: A) 비히클 (원형), B) 매주 1 회 인간화된 B-Ly1 GE (B-HH6-B-KV1 GE) 30 mg/kg (삼각형), 및 C) 매주 1 회 인간화된 B-Ly1 wt (B-HH6-B-KV1 wt) 30 mg/kg (엑스표).

실시예 1

프로테아좀 억제제 (보르테조미브) 와 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 (B-HH6-B-KV1 GE) 의 병용 치료의 항종양 활성

테스트 제제

유형 Ⅱ 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 GE (= 인간화된 B-Ly1, 당조작 B-HH6-B-KV1, WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호 참조) 는 저장 용액 (stock solution) (c = 9.4 mg/ml) (GlycArt, Schlieren, Switzerland) 으로서 제공되었다. 항체 완충제에는 히스티딘, 트레할로오스 및 폴리소르베이트 20 이 포함되어 있었다. 항체 용액을, 주입 전에 저장 용액으로부터 PBS 에서 적합하게 희석하였다.

프로테아좀 억제제 보르테조미브는 Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Germany 로부터 임상 제제로서 구매하였다. 재구성된 저장액으로부터 희석액을 조정하였다.

세포주 및 배양 조건

SU-DHL-4 인간 비-호지킨스 림프종 (NHL) 세포 (Chang, H., 등, Leuk. lymphoma. 8 (1992) 129-136) 는 DSMZ, Braunschweig 로부터 친절히 제공받았다. 종양 세포주를 37℃, 5% CO₂ 의 수-포화 분위기에서 10% 태아 소 혈청 (PAA Laboratories, Austria) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 배지 (PAA, Laboratories, Austria) 에서 정규적으로 배양하였다. 5 번 계대배양한 것을 이식에 사용하였다.

동물

암컷 SCID 베이지 마우스; 도착시 4 ~ 5 주령 (Bomholtgard, Ry, Denmark 로부터 구입함) 를 특정-병원균이 없는 조건 하에서 위원회 지침에 따라 (GV-Solas; Felasa; TierschG) 일일 12 시간 광주기/12 시간 암주기로 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지역 정부에 의해 검토되고 승인되었다. 도착 후 동물을, 관찰을 위해 그리고 새로운 환경에 적응하도록 1 주일 동안 동물 설비의 격리 부분에서 유지하였다. 정기 검진으로 지속적인 건강 모니터링을 수행하였다. 식이 음식 (Provimi Kliba 3337) 및 물 (산성화됨 pH 2.5 ~ 3) 은 자유롭게 제공되었다.

모니터링

동물을 매일 임상적 증상 및 부작용 검출을 위해 통제하였다. 모니터링을 위해 실험 내내 동물의 체중을 매주 2 회씩 기록하였고 병기화 후 종양 부피를 캘리퍼로 측정하였다.

동물의 치료

무작위화하는 날인, 세포 이식 후 22 일째에 동물 치료를 시작하였다. 단일 제제로서 또는 병용하여 인간화된 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 GE 를 수여받는 군, 및 상응하는 비히클 군을 i.v. q7d 로 연구일 제 22 일, 제 29 일, 제 36 일 및 제 43 일에 지시된 투여량 10 mg/kg 으로 처리하였다. 프로테아좀 억제제 보르테조미브를 복강내로 매주 1 회 제 23 일, 제 29 일, 및 제 37 일에 1 mg/kg 로 제공하였다.

생체 내 종양 성장 억제 연구

비히클 대조군을 수여받은, 종양을 갖고 있는 동물은 종양 부담 (tumor burden) 으로 인해 치료 개시 후 15 째일에 배제해야만 했다. 매주 B-HH6-B-KV1 GE (10 mg/kg) 로 매주 1 회 단일 제제로서 동물을 치료하면, 대조군에 비해 14 일 동안 이종이식 성장이 유의하게 억제되었다 (TGI 87%). 그러나, 매주의 항체 치료에도 불구하고 SU-DHL-4 이종이식은 계속해서 진행되었다. 반대로, 프로테아좀 억제제 보르테조미브를 사용한 단일 제제 치료법을 매주 1 회 1 mg/kg 로 제공하면, 단지 약간의 활성만 있었고, 종양 성장은 대조군과 유사하게 진행되었다. 2 가지 화합물 모두가 단일 제제로서는 낮은 활성을 갖고 있음에도 불구하고, SU-DHL-4 림프종 이종이식은 병용 시 차도를 보이게 되었다. 매주 B-HH6-B-KV1 GE (10 mg/kg) 로 치료하고 매주 1 회 프로테아좀 억제제 보르테조미브를 주사하면, 첫 주 내에 림프종 퇴행을 야기하였고, 후속한 병용 치료 기간에서는 9 개의 SU-DHL-4 종양 중 4 개에서 완전한 종양 퇴행이 나타났으며 또한 재성장이 관찰되지 않았다.

실시예 2

리툭시마브와 비교한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의, 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합능의 비 측정

라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 를 10% FCS (Gibco, Cat.-No.10500-064) 를 함유하는 RPMI-1640 배지 (PanBiotech GmbH, Cat.-No. PO4-18500) 에서 배양하여 유지하였다. 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 (인간화된 B-Ly1 항체) 및 리툭시마브를 제조업자의 지침에 따라 Cy5 Mono NHS 에스테르 (Amersham GE Healthcare, Catalogue No. PA15101) 를 사용하여 표지하였다. Cy5-공액 리툭시마브은 항체 당 2.0 분자 Cy5 의 표지 비를 가졌다. Cy5-공액 B-HH6-B-KV1 은 항체 당 2.2 분자 Cy5 의 표지 비를 가졌다. 2 가지 항체 모두의 결합능 및 방식을 측정하고 비교하기 위해, 결합 곡선 (Cy5-공액 리툭시마브 및 Cy5-공액 B-HH6-B-KV1 의 적정에 의함) 을 버킷 림프종 세포주 라지 (Raji) (ATCC-No. CCL-86) 를 사용해 직접 면역형광에 의해 작성하였다. 평균 형광 강도 (MFI) 를 Cy5-공액 리툭시마브 및 Cy5-공액 B-HH6-B-KV1 각각에 대해 EC50 (최대 강도의 50%) 으로서 분석하였다. 샘플 당 5 × 10⁵ 세포를 4℃ 에서 30 분 동안 염색하였다. 이후, 세포를 배양 배지로 세정하였다. 사멸 세포를 배제하기 위해 요오드화프로피듐 (PI) 염색을 사용하였다. FACSArray (Becton Dickinson) 를 사용하여 측정하고, 요오드화프로피듐 (PI) 을 Far Red A 에서 측정하고, Cy5 를 Red-A 에서 측정하였다. 도 2 는 Cy5-표지 B-HH6-B-KV1 (검은 막대) 및 Cy5-표지 리툭시마브 (흰색 막대) 의 EC50 (최대 강도의 50%) 에서의 결합에 대한 평균 형광 강도 (MFI) 를 보여준다.

그 후 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합능의 비를 하기 식에 따라 계산한다 :

따라서 전형적인 유형 Ⅱ 항-CD20 항체로서의 B-HH6-B-KV1 은 리툭시마브와 비교해, 결합능이 감소함을 보여준다.

실시예 3

SCID 베이지 마우스에서의 Z138 MCL 이종이식에 대한 당조작 (GE) 및 비-당조작 (야생형, wt) 항-CD20 항체 (B-HH6-B-KV1 GE 및 wt) 의 유사한 항종양 활성

테스트 제제

유형 Ⅱ 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 (당조작 (GE) 및 야생형 (wt)) 은 GlycArt, Schlieren, Switzerland 로부터의 저장 용액 (c = 9.4 mg/ml 및 12.5 mg/ml) 으로서 제공되었다. 항체 완충제에는 히스티딘, 트레할로오스 및 폴리소르베이트 20 이 포함되어 있었다.

2 가지 용액 모두를, 주입 전 저장 용액으로부터 PBS 에서 적합하게 희석하였다.

세포주 및 배양 조건

Z138 인간 비-호지킨스 림프종 (NHL) 세포를 본래 Glycart 에서 입수하였다 (맨틀 세포 림프종-MCL). 종양 세포주를 37℃, 5% CO₂ 의 수-포화 분위기에서 10% 태아 소 혈청 (PAA Laboratories, Austria) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM 배지 (PAA, Laboratories, Austria) 에서 정규적으로 배양하였다. 2 번 계대배양한 것을 이식에 사용하였다.

동물

모니터링

동물을 매일 임상적 증상 및 부작용 검출을 위해 통제하였다. 모니터링을 위해 실험 내내 동물의 체중을 주 2 회씩 기록하였고 병기화 시작 시 종양 부피를 캘리퍼로 측정하였다.

동물의 치료

무작위화하는 날인, 피하 세포 이식 후 14 째일에 동물 치료를 시작하였다. 인간화된 항-CD20 항체 (B-HH6-B-KV1 GE 및 wt) 를 수여받은 군, 및 상응하는 비히클 군을 i.v. q7d 로 연구일 14, 20, 27 및 34 일에 지시된 투여량 10 mg/kg 으로 처리하였다.

생체 내 종양 성장 억제 연구

비히클 대조군을 수여받은, 종양을 갖고 있는 동물은 종양 부담으로 인해 치료 개시 후 19 일째에 배제해야만 했다. 매주 야생형 또는 당조작으로서 B-HH6-B-KV1 (B-HH6-B-KV1 GE 및 야생형) (10 mg/kg) 로 동물을 치료하면, 치료 시작 직후부터 이종이식 성장이 억제되었다. 조절 종료 시, 모든 항체 종양이 퇴행되었고 이후 대부분의 Z138 종양 이종이식물이 완전한 차도를 보였다. 상기 이종이식 모델에서 야생형과 당조작 형태의 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이는, 마우스가 그들의 NK 세포 상에서 올바른 Fc 수용체를 발현하지 않을 뿐만 아니라, SCID 베이지 마우스가 극심한 삼중 면역결핍으로 인해 NK-매개 ADCC 에 대해 무능한 것으로 생각되기 때문에, 예상 밖의 결과였다. 따라서, SCID 베이지 마우스에서의 피하 이종이식 모델은 당조작 변형 항체를 사용한 인간 ADCC 매개 효과를 흉내내기에는 적합하지 않다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Combination therapy of a type II anti-CD20 antibody with a proteasome inhibitor <130> 24570 <150> EP 07020820 <151> 2007-10-24 <160> 20 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of the heavy chain (VH) of murine monoclonal anti-CD20 antibody B-Ly1 <400> 1 Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys 1 5 10 15 Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Leu 20 25 30 Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp 35 40 45 Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 50 55 60 Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr 65 70 75 80 Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly 85 90 95 Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 100 105 110 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of the light chain (VL) of murine monoclonal anti-CD20 antibody B-Ly1 <400> 2 Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 1 5 10 15 Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu 20 25 30 Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn 35 40 45 Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60 Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 85 90 95 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HH2) <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HH3) <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HH4) <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HH5) <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 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B-Ly1 antibody (B-HH8) <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HH9) <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL8) <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL10) <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL11) <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys 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Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL13) <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL14) <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL15) <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL16) <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val 115

Claims

프로테아좀 억제제와 병용하여, CD20 발현 암 치료용 약제의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도.
프로테아좀 억제제와 병용하여, CD20 발현 암 환자의 치료용 약제의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 프로테아좀 억제제의 항-프로테아좀 억제 활성의 IC₅₀ 이 5 μM 이하인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가 리툭시마브와 비교한 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의, 라지 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상 CD20 에의 결합능의 비를 0.3 내지 0.6 으로 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가 인간화된 B-Ly1 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형　II 항-CD20 항체가 증가된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 Fc 영역의 올리고사카라이드 중 40% 이상이 비-푸코실화된 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아좀 억제제가 펩티드 알데하이드, 펩티드 보로네이트, 펩티드 에폭시케톤, 또는 살리노스포라미드 A 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 7 항에 있어서, 상기 프로테아좀 억제제가 보르테조미브인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 다른 세포독성제, 화학치료제 또는 항암제, 또는 상기 제제의 효과를 증진시키는 화합물이 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, CD20 발현 암이 B-세포 비-호지킨스 림프종 (NHL) 인 것을 특징으로 하는 용도.
CD20 발현 암 환자의 병용 치료를 위한, 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제를 포함하는 키트.
특히 CD20 발현 암에서 사용하기 위한, 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 프로테아좀 억제제 둘 다를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서, 상기 약학적 조성물이 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는 약학적 조성물.