KR20100063305A - 엘－리보스의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엘－리보스(L-ribose)의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase) 유전자를 분리하여 제작한 만노스-6-인산 이성화효소와 엘-리불로스(L-ribulose)를 반응시켜 엘－리보스를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 바실러스 서브틸리스로부터 유래한 재조합 만노스-6-인산 이성화효소를 이용하여, 높은 특이성과 친환경적으로 의약품 원료물질인 엘-리보스를 생산할 수 있다.
엘－리보스, 바실러스 서브틸리스, 만노스-6-인산 이성화효소

Description

엘－리보스의 생산방법 {Method for Production of L－ribose}
본 발명은 엘－리보스(L-ribose)의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소(mannose 6-phosphate isomerase) 유전자를 분리하여 제작한 만노스-6-인산 이성화효소와 엘-리불로스(L-ribulose)를 반응시켜 엘－리보스를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
엘-리보스(L-ribose)는 많은 엘-형태의 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 항바이러스제인 메틸-엘-리보플라노사이드(methyl-L-riboflanoside; "Bezimidavir"TM) 등의 합성에 사용되어 엘-리보스 및 그 유도체의 세계시장은 2001년 약 11억불이었고, 최근에는 새로운 항포진제(Antiherpes)로 개발되고 있는 비더블유1263더블유94 (BW1263W94, Glaxo Wellcome)와 비(B)형간염 치료제로 개발되고 있는 엘-에프엠에이유(L-FMAU, Bukwang & Triangle) 등의 핵심중간체로서 그 수요가 급증하고 있어, 산업적으로 이용 가능한 그의 제조방법을 개발하는 것은 동분야 많은 연구진들의 관심의 대상이다.
엘-리보스는 주로 엘-아라비노스, 엘-자일로스, 디-글루코스, 디-갈락토스, 디-리보스 또는 디-만노-1,4-락톤으로부터 화학 합성법으로 생산되어 왔다(Akagi, M., et al., Chem. Pharm. Bull.(Tokyo) 50:866, 2002; Takahashi, H., et al., Org. Lett. 4:2401, 2002; Yun, M., et al., Tetrahedron Lett. 46:5903, 2005). 그러나 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다. 실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경상의 위험성, 화학 반응 후 부가적인 당류의 생성으로 인한 복잡한 엘-리보스의 분리 및 정제 과정 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경오염 문제 등이 유발되고 있다.
상기와 같은 단점을 극복하기 위하여, 최근 리비톨 또는 엘-리불로스로부터 생물학적 엘-리보스 제조법이 연구되고 있다. 최근에는 엔에이디-의존적인 만니톨-1-탈수소효소(NAD-dependent mannitol-1-dehydrogenase)를 포함하는 재조합 대장균을 사용하여 100 g/L 리비톨로부터 발효 72시간에 55% 전환 수율을 얻었지만 엘-리보스의 생산성은 엘-아라비노스로부터 만드는 화학합성법보다 약 28배 낮았다 (Woodyer R. N., et al., Appl. Environ. Microbiol. 74:2967, 2008; Jumppanen, J., et al., U.S. patent 6,140,498).
구체적으로, 엘-리보스의 생물학적인 생산 방법을 연구한 바가 다음과 같이 있었다. 클리비지엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia) 유래 아라비노스 이성화 효소, 슈도모나스 슈체리 (Pseudomonas stutzeri) 유래 람노스 이성화 효소 (L-rhamnose isomerase), 스트렙토마이세스 루비지노시스 (Streptomyces rubiginosus) 유래 자일로스 이성화 효소 (D-xylose isomease) 및 락토코코스 락티스 (Lactococcus lactis) 유래 갈락토스-6-인산 이성화 효소 (galactose-6-phosphate isomerase)는 광범위한 기질 특이성을 지니고 있어서 엘-리불로스를 엘-리보스로 전환시킬 수 있지만 그 전환속도는 매우 느리다.
엘-리불로스는 생화학적으로 엘-리보스로부터 아시노박타 (Acinetobacter sp.) 유래 엘-리보스 이성화 효소, 이세리키아 콜리 (Escherichia coli) 유래 엘-아라비노스 돌연변이 이성화 효소, 악티노플라네스 미소우이엔시스 (Actinoplanes missouriensis) 유래 자일로스 돌연변이 이성화 효소 및 코넬라 래보리보시(Cohnella laevoribosii) 유래 디-릭소스 이성화 효소를 사용하여 전환되어 왔다. 그러나 지금까지의 효소적 방법은 생산성이 매우 낮은 문제가 있다. 따라서, 당업계에는 엘-리보스 생산성이 높은 경제적인 생물학적인 방법의 개발이 시급한 현실이다.
이에 본 발명자들은 보다 효과적으로 희소성 단당류를 생산하는 방법을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 다양한 미생물들에서 발견되는 만노스-6-인산 이성화 효소(mannose 6-phosphate isomerase)가 엘-리불로스로부터 엘-리보스를 생산할 수 있는 것을 최초로 확인한 다음, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 미생물을 구축하고 이들을 이용하여 만노스-6-인산 이성화효소를 대량으로 제조하며 이러한 친환경적인 과정으로 부산물의 생성 없이 리보스만을 고 수율로 얻는 최적 반응 조건을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 목적은 바실러스 서브틸리스 균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 분리하여 제작한 만노스-6-인산 이성화효소와 엘-리불로스(L-ribulose)를 반응시켜 엘－리보스(L-ribose)를 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 바실러스 서브틸리스 균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 분리하여, 발현벡터에 삽입하는 단계; (b) 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하는 단계; (c) 상기 대장균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소를 분리 및 정제하는 단계; 및 (d) 상기 만노스-6-인산 이성화효소와 엘-리불로스를 기질로서 반응시키는 단계를 포함하는 엘-리보스의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 만노스-6-인산 이성화효소 유전자는 서열번호 1인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 피이티-28에이(플러스) (pET-28a(+))인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엘-리불로스는 농도 100 g/L 내지 400 g/L 범위로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 반응은 망간, 알루미늄, 아연, 바륨, 구리, 코발트, 칼슘, 마그네슘, 니켈 및 철로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 금속 이온을 0.1 mM 내지 2 mM 범위로 처리한 상태에서 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 상기 금속이온은 코발트인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 반응은 pH 6.5 내지 pH 9.0 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소 반응은 온도 30℃ 내지 45℃ 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스 균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 분리하여 제작한 만노스-6-인산 이성화효소와 엘-리불로스를 반응시켜 엘－리보스를 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따르면, 바실러스 서브틸리스로부터 유래한 재조합 만노스-6-인산 이성화효소를 이용하여, 높은 특이성과 친환경적으로 의약품 원료물질인 엘-리보스를 생산할 수 있으며, 상기 엘-리보스는 다양한 엘-형태 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 의약품 등의 제조 시 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 엘-리보스 생산방법은 (a) 바실러스 서브틸리스 균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소 유전자를 분리하여, 발현벡터에 삽입하는 단계; (b) 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하는 단계; (c) 상기 대장균으로부터 만노스- 6-인산 이성화효소를 분리 및 정제하는 단계; 및 (d) 상기 만노스-6-인산 이성화효소와 엘-리불로스를 기질로서 반응시키는 단계로 구성된다.
상기 재조합 발현 벡터의 제조시 리보스의 생산에 사용될 수 있는 것이라면 발현 벡터 피이티-28에이(플러스)를 포함하여 유전자 재조합 방법에 이용되는 어느 벡터라도 사용될 수 있고, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 되는 미생물로는 대장균 이알2566 (ER2566)을 사용하는 것이 바람직하나, 재조합 발현 벡터로 형질전환 되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 균주라면 어느 것이라도 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용한 만노스-6-인산 이성화 효소는 효소 활성을 증진시키는 금속에 대해 영향을 받는 금속 이온 의존성 효소이다. 따라서, 상기 효소반응은 망간, 알루미늄, 아연, 바륨, 구리, 코발트, 칼슘, 마그네슘, 니켈 및 철로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 금속 이온을 0.1 mM 내지 2 mM 범위로 처리한 상태에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상기 금속이온은 코발트인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 리보스는 기질로서 리불로스를 사용하여 합성되는 것이 바람직하고, 엘-리불로스 사용하는 것은 더욱 바람직하며, 상기 기질 농도는 100 g/L 내지 400 g/L 범위인 것이 바람직하고 300 g/L 내외 범위인 것은 더욱 바람직하다. 또한 상기 효소 반응은 pH 6.5 내지 pH 9.0 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, pH 7.5 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다. 또한 상기 효소 반응은 온도 30℃ 내지 45℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 40℃ 내외 범위에 서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다. 또한, 상기 효소 반응 시간도 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조
만노스-6-인산 이성화 효소를 제조하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 균주로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소를 먼저 분리하였다.
구체적으로 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 바실러스 서브틸리스 에이티씨씨(ATCC) 23857 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 만노스-6-인산 이성화 효소의 공지의 DNA 염기서열(Genebank Accession Number AF324506; 서열목록 1)을 기초로 하여 다음의 프라이머(primer)를 고안하였다.
서열번호 2(정방향 프라이머): 5'-TTTCATATGACGCATCCTTTATT-3'
서열번호 3(역방향 프라이머): 5'-TTTCTCGAGTTAAGGATGAGATATCA-3'
상기 프라이머는 각각 엔디이 원(Nde I)과 엑스에이치오 원(Xho I) 제한효소 절단부분으로 설계되었다. 상기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 대량으로 얻은 만노스-6-인산 이성화 효소 유전자는 제한효소 엔디이 원 및 엑스에이치오 원을 사용하여 플라스미드 벡터 피이티-28에이(플러스)(Novagen 사)에 삽입하여 피이티-28에이(플러스)/만노스-6-인산 이성화 효소를 제작하였다.
상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 이알 2566 균주에 형질 전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 엘-리보스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.
실시예 2: 만노스-6-인산 이성화효소의 제조
만노스-6-인산 이성화효소를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 이알 2566 균주를 엘비 (LB) 배지 3 ㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600 ㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500 ㎖이 들어있는 2,000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1 mM 아이피티지(IPTG)를 첨가하여 만노스 6-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, 아이피티지를 첨가한 후에 교반 속도는 150 rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하여 배양하였다.
또한, 상기와 같이 과발현 되어 생산된 만노스-6-인산 이성화효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000× g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두번 세척한 다음 50mM 제일인산 나트륨, 300mM 염화나트륨, 10 mM 이미다졸(imidazole), 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000× g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그라피(fast protein liquid chromatography system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA))에 히스 텍 (His-tag)를 이용한 히스트랩 에이치피(HisTrap HP) 흡착 컬럼을 장착 하여 엘-리보스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.
실시예 3: 만노스-6-인산 이성화효소의 금속 특이성 조사
본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 금속 이온에 대한 특이성을 조사하기 위하여, 상기 효소 활성은 10 mM 이디티에이(EDTA)를 처리하고 금속 이온(Mn2+, Al3+, Zn2+, Ba2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Mg2+, Ni2+, Fe2+)을 첨가하여 반응시킨 후 다음과 같이 활성을 측정하였다. 상기 효소 반응은 10 mM 엘-리보스, 각각의 금속 이온과 1.5 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM 이피피에스(EPPS) 완충용액(pH 7.5)을 사용하여 40℃에서 20분 동안 수행하였고, 다시 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다.
효소 활성은 엘-리보스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효소 1 unit은 pH 7.5와 40℃에서 분당 1μmole의 엘-리불로오스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 하였다. 또한, 효소 활성의 측정 시 리보스 농도 및 리불로오스 농도 그리고 다른 당들의 분석은 전기화학적 검출기(electrochemical detector) 및 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼이 장착된 바이오 액체 크로마토그래피(Bio-LC) 시스템(Dionex ICS-3000, Sunnylvale, CA)을 이용하여 진행되었다. 이때, 상기 카보팩 피에이(CarboPacPA) 컬럼은 30℃에서 1 ㎖/분 속도로 200 mM 수산화 나트륨을 통과시키도록 하였다.
그 결과, 정제된 효소와 이디티에이를 처리한 효소는 활성이 없었다. 실험한 금속염 중 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 만노스-6-인산 이성화 효소에 의한 리보스 이성화에 코발트(Co2+)가 가장 효과적이었고 농도별 테스트 결과 최적농도는 0.5 mM이었다. 만노스-6-인산 이성화효소는 0.5 mM 코발트 금속 이온의 영향을 받는 것으로 나타나, 본 발명의 만노스 6-인산 이성화효소는 금속 이온에 대해 의존성 효소인 것을 확인하였고, 그에 대한 활성은 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.
실시예 3: pH 및 온도가 만노스 6-인산 이성화효소 활성에 미치는 영향
상기 실시예 2에서 분리한 만노스-6-인산 이성화효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성도를 다음과 같이 확인하였다. 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기 질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다.
3-1: pH가 만노스-6-인산 이성화효소에 미치는 영향
상기 효소에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 10 mM 리보스, 0.5 mM 코발트, 1.5 unit/㎖ 효소가 포함된 50 mM 피페스 piperazine-N,N’-bis(2-ethane sulfonic acid, PIPES) 완충용액, 10 mM 엘-리보스, 0.5 mM 코발트와 1.5 단위/㎖ 효소가 포함된 50 mM 이피피에스(N-(2-hyroxyethyl) piperazine-N-(3-propane sulfonic acid, EPPS) 완충용액을 사용하여 pH 7.5에서부터 8.5 범위까지 효소 반응을 실시하였다. 구체적으로, 효소반응은 40℃에서 20분 동안 수행하고 다시 최종 농도 200 mM 염화 수소을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 7.5인 것을 알 수 있었다.
3-2: 온도가 만노스-6-인산 이성화효소에 미치는 영향
상기 효소에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 효소 반응은 온도 20℃에서 50℃ 범위까지 10 mM 리보스, 0.5 mM 코발트와 1.5 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.5인 50mM EPPS 완충용액을 사용하여 각각 20분 동안 반응을 실시하였다. 그 다음 최종 농도 200mM 염화 수소을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 40℃인 것을 알 수 있었다.
도 2a는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 pH에 따른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이고, 도 2b는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 온도에 따 른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이다. 도 2a에서의 pH에 따른 만노스-6-인산 이성화 효소의 활성도에서 ●는 피페스 완충용액을 나타내고, ○는 이피피에스 완충용액을 나타낸 것이다.
3-3: 만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성 조사
만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 온도 25℃에서 50℃까지의 범위에서 10 mM 엘-리보스, 0.5 mM 코발트, 1.5 unit/㎖ 효소가 포함된 pH 7.5인 50 mM EPPS 완충용액을 사용하여 각각 효소 활성이 절반으로 줄어드는 시간까지 반응을 진행시켰다. 반응이 끝난 다음, 최종 농도 200 mM 염화 수소을 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 만노스-6-인산 이성화효소 효소의 활성을 측정하였다.
도 3은 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 온도 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 3의 그래프에서 온도 표기는 25℃(●),30℃(■), 35℃(▲), 40℃(○), 45℃(□) 및 50℃(◇)로 각각 나타내었다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 온도 20℃에서는 461시간, 30℃는 325시간, 35℃는 236시간, 40℃는 111시간, 45℃는 56시간 그리고 50℃에서는 10시간 경과 시 상기 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 만노스-6-인산 이성화효소를 이용한 엘-리보스의 생산
만노스-6-인산 이성화효소를 이용한 엘-리보스의 생산 방법을 개발하기 위하 여, 상기에서 확인한 효소의 최적 pH 7.5 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(40 ℃)에서 300 g/L 엘-리불로스로를 가지고 엘-리보스의 시간별 생산량을 측정하였다.
도 4는 기질로서 농도 300 g/L의 엘-리불로스에서 본 발명의 만노스-6-인산 이성화 효소에 의한 리보스의 생산량을 나타낸 그래프로, 300 g/L 엘-리불로오스로부터 반응 3시간 후에 213 g/L 리보스를 얻어 71 g L-1 h-1생산성과 71% 전환수율을 나타내었다. 따라서, 엘-리보스를 3시간에 213 g/L 생산함을 확인할 수 있었다.
현재까지 엘-리보스의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 Molybdic acid를 사용한 화학합성법은 엘-아라비노스 로부터 23% 전환수율과 20 g L-1h-1 생산성을 나타내었다(Jumppanen, J., J. Nurmi, and O. Pastinen. October 2000. Process for the continuous production of high purity of L-ribose. U.S. patent 6,140,498).
또 다른 비교로는 엔에이디-의존적 만니톨-1-탈수소효소(NAD-dependent mannitol-1-dehydrogenase)가 포함된 재조합 대장균을 사용하여 100 g/L 리비톨로부터 배양 72시간 후에 52 g/L 엘-리보스를 얻어 생산성 0.72 g L-1h-1을 보여 주었다(Woodyer, R., N. Wymer, F. Racine, S. Khan, and B. Saha. 2008. Efficient production of L-ribose with a recombinant Escherichia coli biocatalyst. Appl. Environ. Microbiol.74: 2967~2975).
이것은 보고된 생물학적 엘-리보스 생산에서 가장 높은 생산성 및 생산농도 이다. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래한 만노스 6-인산 이성화 효소의 생산성 및 생산농도는 앤에이디-의존적인 만니톨-1-탈수소효소(NAD-dependent mannitol-1-dehydrogenase)가 포함된 재조합 대장균에서 얻은 결과 보다 각각 98배와 4배 높은 결과를 나타내어 본 발명에서 얻은 엘-리보스 생산 효소법은 생산성, 생산농도 및 정제의 용이함 등에서 발효법과 화학합성법보다 훨씬 우수하다는 것을 알려준 결과이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 무기염 종류(1a) 및 무기염 농도(1b)에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소의 pH(2a) 및 온도(2b)에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 만노스-6-인산 이성화효소의 온도에 대한 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 기질 농도 300 g/L에서 본 발명의 만노스-6-인산 이성화효소에 의한 리보스의 생산량을 나타낸 것이다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Method for Production of L-ribose <130> P08-E349 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 948 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 atgacgcatc ctttattttt agagcctgtc tttaaagaaa gactatgggg agggacgaag 60 cttcgtgacg cttttggcta cgcaataccc tcacaaaaaa caggtgagtg ctgggccgtt 120 tctgcacatg cccatggctc gtcgtctgta aaaaatggcc cgctggcagg aaagacactt 180 gatcaagtat ggaaagatca tccagagata ttcgggtttc cggatggtaa ggtgtttccg 240 ctgctggtaa agctgctgga cgccaatatg gatctctccg tgcaagtcca tcctgatgat 300 gattatgcaa aactgcacga aaatggcgac cttggtaaaa cggagtgctg gtatatcatt 360 gattgcaaag atgacgccga actaattttg ggacatcatg caagcacaaa ggaagagttc 420 aaacaacgaa tagaaagcgg tgattggaac gggctgctga ggcgaatcaa aatcaagcca 480 ggagatttct tttatgtgcc aagcggtaca ctccatgctt tatgtaaggg aacccttgtc 540 cttgaaatcc agcaaaactc tgatacaaca tatcgcgtat acgattatga ccgctgtaat 600 gaccagggcc aaaaaagaac tcttcatata gaaaaagcca tggaagtcat aacgataccg 660 catatcgata aagtgcatac accggaagta aaagaagttg gtaacgctga gatcattgtt 720 tatgtgcaat cagattattt ctcagtgtac aaatggaaga ttagcggccg agctgctttt 780 ccttcatatc aaacctattt gctggggagt gttctgagcg gatcaggacg aatcataaat 840 aatggtattc agtatgaatg caatgcaggc tcacacttta ttctgcctgc gcattttgga 900 gaatttacaa tagaaggaac atgtgaattc atgatatctc atccttaa 948 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tttcatatga cgcatccttt att 23 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tttctcgagt taaggatgag atatca 26

Claims (8)

  1. 다음의 단계를 포함하는 엘-리보스(L-ribose)의 생산방법:
    (a) 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소(mannose-6-phosphate isomerase) 유전자를 분리하여, 발현벡터에 삽입하는 단계;
    (b) 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환하고 배양하는 단계;
    (c) 상기 대장균으로부터 만노스-6-인산 이성화효소를 분리 및 정제하는 단계; 및
    (d) 상기 만노스-6-인산 이성화효소와 엘-리불로스 (L-ribulose)를 기질로서 반응시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 만노스-6-인산 이성화효소 유전자는 서열번호 1인 것을 특징으로 하는 엘-리보스(L-ribose)의 생산방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 피이티-28에이(플러스) (pET-28a(+))인 것을 특징으로 하는 엘-리보스(L-ribose)의 생산방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 엘-리불로스 (L-ribulose)는 농도 100 g/L 내지 400 g/L 범위로 첨가되는 것을 특징으로 하는 엘-리보스(L-ribose)의 생산방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 반응은 망간, 알루미늄, 아연, 바륨, 구리, 코발트, 칼슘, 마그네슘, 니켈 및 철로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 금속 이온을 0.1 mM 내지 2 mM 범위로 처리한 상태에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 엘-리보스 (L-ribose)의 생산방법.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 금속이온은 코발트인 것을 특징으로 하는 엘-리보스 (L-ribose)의 생산방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 반응은 pH 6.5 내지 pH 9.0 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 엘-리보스 (L-ribose)의 생산방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 효소 반응은 온도 30℃ 내지 45℃ 범위에서 이루어지 는 것을 특징으로 하는 엘-리보스 (L-ribose)의 생산방법.
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