KR100896968B1 - 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용한 알로스의 제조방법 - Google Patents

라이보스 5-인산 이성화효소를 이용한 알로스의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소 (ribose 5-phosphate isomerase)를 이용한 알로스 (allose)의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환 된 미생물 및 이들을 이용하여 라이보스 5-인산 이성화효소를 대량으로 얻는 제조방법 그리고 상기 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용하여 희소당 알로스를 고수율로 얻는 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소는 암세포의 증식의 저해하고 허혈 작용으로 인한 장기 손상을 억제하는 효능을 가지는 의약용 희소당인 D-알로스를 합성하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 알로스의 제조방법은 크로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum)으로부터 유래한 재조합 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용하는 친환경적인 과정으로 부산물의 생성과 금속 이온의 첨가 없이도 알로스만을 특이성이 높게 안정적으로 생산할 수 있게 하므로, 기능성 식품 및 의약품 등의 제조 시 유용하게 적용될 수 있다.
라이보스 5-인산 이성화효소 (ribose 5-phosphate isomerase), 알로스 (allose), 의약용 희소당, 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 크로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum)

Description

라이보스 5-인산 이성화효소를 이용한 알로스의 제조방법 {Method for preparing allose by using ribose 5-phosphate isomerase}
도 1은 본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소의 pH 에 따른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소의 온도에 따른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소를 사용한 알로스 생산 시 부가물의 생성 없이 사이코스 (psicose)로부터 알로스만이 생산되는 것을 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소 (ribose 5-phosphate isomerase)를 이용한 알로스 (allose)의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환 된 미생물 및 이들을 이용하여 라이보스 5-인산 이성화효소를 대량으로 얻는 제조방법 그리고 상기 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용하여 희소당 알로스를 고수율로 얻는 생산 방법에 관한 것이다.
알로스 (allose)는 포도당 (D-glucose)의 3번 탄소 에피머 (epimer)로서, 사이코스 (psocose)의 이성질체인 희소성 단당류로 알려져 있다. 이러한 알로스는 암세포의 증식의 저해하는 특성을 가지기 때문에 항암물질로 사용되고, 허혈작용으로 인한 장기 손상을 억제하는 기능도 가지기 때문에 장기보존액으로도 사용될 수 있다. 또한, 알로스는 분절된 호중성 백혈구의 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 혈소판의 감소도 억제하는 기능을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 알로스는 현재 의학적으로 매우 주목을 받는 희소성 당류 중 하나이다 (Hossain, M. A., Izuishi, K., and H., Maeta. 2003, Protective effects of D-allose against ischemia reperfusion injury of the rat river. J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 10: 218??225.; Hossain, M. A., Izuishi, K., Tokuda, M., Izumori, K., and H. Maeta. 2004, D-Allose has a strong suppressive effect against ischemia/reperfusion injury: a comparative study with allopurinol and superoxide dismutase. J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 11: 181??189.; Hossain, M. A., Wakabayashi, H., Izuishi, K., Okano, K., Yachida, S., Tokuda, M., Izumori, K., and H., Maeta. 2006, Improved microcirculatory effect of D-allose on hepatic ischemia reperfusion following partial hepatectomy in cirrhotic rat liver. J. Biosci. Bioeng., 101: 369??371.)
이와 같이 알로스는 의약 산업 분야에서 높은 이용 가치가 있음에도 불구하고, 자연계에는 극히 미량만이 존재하기 때문에 효과적으로 의약적 응용 분야에 공급되기 위해서는 알로스를 충분한 양으로 확보하는 것이 필요하다. 또한 지금까지 알로스는 주로 화학적인 합성 방법에 의해서만 생산되어 왔다. 그러나 알로스의 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다. 실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경 상의 위험성, 화학적 반응 후 부가적인 당류의 생성, 이로 인한 복잡한 알로스의 분리 및 정제 과정 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경오염 문제 등이 유발되고 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 특정 당류를 환경 친화적이고 특이성은 높게 대량 생산할 수 있는 방법으로서 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 생물학적으로 알로스를 고수율로 얻는 생산 방법이 최근에 주목을 받으며 시도되어 왔다. 구체적으로, 일본 카가와 대학의 이즈모리 그룹에서 알로스의 생물학적인 생산 방법을 연구한 바 있었다. 여기서는 슈도모나스 슈체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주로부터 유래한 람노스 이성화효소 (L-rhamnose isomerase)를 사용하여 사이코스로부터 처음 알로스를 생산하여 보고하였다. 그러나 이 람노스 이성화효소는 알로스 생산 시 부산물로 다량의 알트로스 (D-altrose)도 함께 생성시키므로, 이 과정에서 금속 이온을 첨가해야 하는 단점이 있었다.
따라서 본 발명자들은 상기 알트로스와 같은 부산물이 생성되지 않고 금속 이온의 첨가도 요구하지 않으면서 알로스를 생산할 수 있는 효소를 분리하려고 시 도하였다. 또한 종래에 라이보스-5-인산 이성화효소가 알로스 대사에 관여하는 것으로 보고된 바도 있어 이를 착안한 연구를 계속하였다 (Kim, C., Song, S., and C., Park. 1997, The D-allose operon of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 179: 7631??7637; Poulsen, T. S., Chang, Y. Y., and B., Hove-Jensen. 1999, D-Allose catabolism of Escherichia coli: involvement of alsI and regulation of als regulon expression by allose and ribose. J. Bacteriol., 181: 7126??7130). 참고로, 상기 라이보스 5-인산 이성화 효소의 유전자는 인산 5탄당 대사 회로에 있어 라이보스 (ribose)를 리불로스 (ribulose)로 전환하는 효소로 이미 알려져 있고, 여러 미생물들에서도 알로스 대사에 관여하는 것으로 보고되어 있다.
이에 본 발명자들은 보다 효과적으로 희소성 단당류를 생산하는 방법을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 다양한 미생물들에서 발견되는 라이보스 5-인산 이성화효소 (ribose 5-phosphate isomerase)가 D-사이코스로부터 D-알로스를 생산할 수 있는 것을 최초로 확인한 다음 크로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum)으로부터 유래한 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 미생물을 구축하고 이들을 이용하여 라이보스 5-인산 이성화효소를 대량으로 제조하며 이러한 친환경적인 과정으로 부산물의 생성과 금속 이온의 첨가 없이 알로스만을 고수율로 얻는 최적 반응 조건 (온도, pH 및 기질농도 등)을 조사하여 그 생산 방법을 제공함으로서 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용한 희소당의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 희소당 알로스 (allose)의 생산에 사용되는 라이보스 5-인산 이성화효소 (ribose 5-phosphate isomerase)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은
(1) 상기 형질전환 된 미생물을 배양하고;
(2) 상기 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자의 발현을 유도하고; 및
(3) 발현된 효소 단백질을 분리 및 정제하는; 과정으로 라이보스 5-인산 이성화효소를 얻는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용하여 알로스를 대량으로 얻는 생산 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소 (ribose 5-phosphate isomerase)를 희소당의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 희소당인 알로스의 생산에 사용되는 라이보스 5-인산 이성화효소를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 기질로서 사이코스 (psicose)를 사용하여 알로스를 생산할 수 있는 크로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum) 균주로부터 유래한 라이보스 5-인산 이성화효소를 제공한다. 상기 희소당 알로스는 D-알로스인 것이 바람직하고, 상기 기질인 사이코스는 D-사이코스인 것이 바람직하다.
본 발명은 미생물을 이용한 재조합 상기 라이보스 5-인산 이성화효소의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 크로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum) 균주로부터 유래하고, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pQE30/ribose 5-phosphate isomerase 를 제공한다.
또한, 본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 미생물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 크로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum) 균주로부터 유래한 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 대장균 BL21(DE3) pQE30/ribose 5-phosphate isomerase 균주를 제공한다.
상기 재조합 발현 벡터의 제조 시 알로스의 생산에 사용될 수 있는 것이라면 발현 벡터 pQE30 를 포함하여 유전자 재조합 방법에 이용되는 어느 벡터라도 사용 될 수 있고, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 되는 미생물로는 대장균 BL21(DE3)을 사용하는 것이 바람직하나 재조합 발현 벡터로 형질전환 되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 균주라면 어느 것이라도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자로 형질전환 된 미생물을 배양하고; 및 (b) 발현된 효소 단백질을 분리 및 정제하는; 과정으로 상기 라이보스 5-인산 이성화효소를 대량으로 얻는 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (1) 상기 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 대장균을 배양하고; (2) 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자의 발현을 유도한 다음; (3) 발현된 효소 단백질을 분리 및 정제하는; 과정으로 상기 라이보스 5-인산 이성화효소를 얻는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용하여 알로스를 고수율로 얻는 생산 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 부산물의 생성 또는 금속 이온의 첨가 없이 알로스만을 선별적으로 합성할 수 있는 상기 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용한 알로스의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용한 라이보스 5-인산 이성화효소는 효소 활성을 저해하는 금속 킬레이트제인 EDTA 및 효소 활성을 증진시키는 기타 금속에 대해 전혀 영향을 받지 않는 금속 이온 비의존성 효소이다. 따라서 지금까지 알로스 생산 효소로 유일하게 보고된 슈도모나스 슈체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주의 람노스 이성화효 소 (L-rhamnose isomerase)가 금속 이온 의존성 효소인 점과 비교하여, 본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소는 알로스 생산에 유용한 금속 이온 비의존성 효소로서 큰 장점을 가진다.
상기 라이보스 5-인산 이성화효소는 상기와 같이 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 대장균을 배양하여 재조합 효소 유전자의 발현을 유도한 다음 발현된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 과정으로 제조된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 알로스는 기질로서 사이코스를 사용하여 합성되는 것이 바람직하고, D-사이코스 사용하는 것은 더욱 바람직하며, 상기 기질 농도는 0.5 내지 1.5% 범위인 것이 바람직하고 1.0% 내외 범위인 것은 더욱 바람직하다. 또한 상기 효소 반응은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, pH 7.5 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다. 또한 상기 효소 반응은 온도 60℃ 내지 70℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 65℃ 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다. 또한, 상기 효소 반응 시간도 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용하여 제조된 알로스는 암세포의 증식에 대한 저해제 및/또는 허혈 작용에 의한 장기 손상에 대한 억제제로서, 기능성 식품 및 의약품 등의 제조 시 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조
본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소를 제조하기 위하여, 크로스트리디움 써모셀럼 균주로부터 유래한 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 먼저 분리하였다. 구체적으로 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 크로스트리디움 써모셀럼 ZP00503831 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 서열번호1의 염기서열을 포함하는 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자의 서열 [서열목록 참조; 진뱅크 수탁번호 CP00058 (Genebank Accession No. CP00058)]을 기초로 하여 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열을 각각 포함하는 프라이머들(primers)을 고안 제작하였다. 그 다음 이 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 대량으로 얻은 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자는 제한효소 NcoI 및 PstI 을 사용하여 플라스미드 벡터 pBluescript ⅡSK(+) (Stratagene사 제품)에 삽입하였다. 그 다음 상기 재조합 벡터를 제한효소 NcoI 및 PstI을 처리하여 상기 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 단편을 회수하고 클레노 효소 (Klenow fragment; Takara사 제품)를 처리하여 제한효소 NcoI 인식부위를 제거하였다. 또한, 상기 유전자 단편은 다시 발현 벡터 pQE30 (Qiagen사 제품)의 제한효소 SmaI 및 PstI 부위에 삽입하여 재조합 발현 벡터 pQE30/라이보스 5-인산 이성화효소를 제작하였다. 상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환 하였다. 또한, 상기 형질전환 된 미생물은 20% 글리세린 (glycerine) 용액을 첨가하여 알로스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다. 상기 재조합 대장균은 E. coli BL21(DE3) pQE30/라이보스 5-인산 이성화효소 균주로 명명하였다.
실시예 2. 라이보스 5-인산 이성화효소의 제조
본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소를 대량 생산하기 위하여, 냉동 보관된 재조합 대장균 BL(DE21) 균주를 LB 배지 3 ㎖이 들어있는 시험관 (test tube)에 접종하고 600 ㎚에서 흡광도가 2.0 이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 250 ㎖이 들어있는 1,000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600 ㎚ 에서의 흡광도가 0.6 이 될 때, 1 mM ITPG 를 첨가하여 라이보스 5-인산 이성화효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, IPTG 를 첨가 후에는 교반 속도는 150 rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하여 배양하였다.
또한, 상기와 같이 과발현 되어 생산된 라이보스 5-인산 이성화효소는 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000×g 로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고 0.85% 염화나트륨 (NaCl)으로 두 번 세척한 다음 50 mM 트리스-염산 완충용액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5)을 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기 (sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000×g 로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 알로스의 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.
실시예 3. 라이보스 5-인산 이성화효소의 금속 특이성 조사
본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소의 금속 이온에 대한 특이성을 조사하기 위하여, 상기 효소 활성은 10 mM EDTA 를 처리하고 금속 이온의 첨가 하지 않거나 1 mM 농도의 금속 이온 (Na+, K+, Mn2+, Zn2+, Ba2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Al3+)을 첨가하여 반응시킨 후 다음과 같이 활성을 측정하였다. 상기 효소 반응은 1.0% 사이코스와 0.154 단위/㎖ 효소가 포함된 50 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5)을 사용하여 65℃에서 30분 동안 수행하였고, 다시 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시켰다. 본 발명에서는 효소 활성은 사이코스를 기질로 사용하여 측정되었고, 상기 효소 활성의 효소 1 단위 (unit)는 pH 7.5와 65℃에서 분당 1 mmol의 알로스를 생산하는 양으로 정의하여 비교분석을 원활히 하였다. 또한, 효소 활성의 측정 시 사이코스 농도 및 알로스 농도 그리고 다른 당들의 분석은 알아이 (RI) 검출기 및 쇼덱스아사히펙 (Shodex Asahipak) 칼럼 또는 코스모실 (Cosmosil) 칼럼이 장착된 고압 액체 크로마토그래피를 실시하여 진행되었다. 이 때, 상기 쇼덱스아사히펙 컬럼은 30℃에서 0.8 ㎖/분 속도로 70% 아세토니트릴 (acetonitrile)을 통과시키고, 상기 코스모실 칼럼은 30℃에서 1 ㎖/분 속도로 80% 아세토니트릴을 통과시키도록 하였다.
그 결과, 라이보스 5-인산 이성화효소는 금속 이온의 영향을 전혀 받지 않은 것으로 나타나, 본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소는 금속 이온에 대해 비의존성 효소인 것을 확인하였다.
실시예 4. 라이보스 5-인산 이성화효소의 기질 특이성 조사
본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소의 사이코스 3-에피머화 효소로서의 기질 특이성을 다음과 같이 조사하여 하기 표 1에 정리하였다. 구체적으로, 상기 기질로 사이코스, 리불로스 5-인산 (D-ribulose 5-phosphate) 및 알로스 등을 사용하여 효소 반응을 25 mM 기질과 0.154 단위/㎖ 효소가 포함된 50 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5)을 사용하여 50℃에서 6시간 동안 수행하였으며, 다시 100℃에서 5분 동안 가열하여 효소 반응을 정지시켰다.
그 결과, 본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소는 리불로스 5-인산 (D-ribulose 5-phosphate), 알로스 및 사이코스에만 선별적으로 반응성을 나타내는 것으로 조사되어 매우 기질 특이성이 높은 효소인 것을 확인하였다.
당류 상대적 활성도(%) 주요 산물
D-알로스 100 D-사이코스
D-사이코스 48 D-알로스
D-라이보스 5-인산 13 D-리불로스 5-인산
L-람노스 0 -
D-자일로스 0 -
D-알트로스 0 -
D-갈락토스 0 -
실시예 5. 라이보스 5-인산 이성화효소 활성에 미치는 pH 및 온도 효과 조사
본 발명에서는 라이보스 5-인산 이성화효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성을 조사하기 위하여, 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다.
먼저 라이보스 5-인산 이성화효소 활성에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 효소 반응은 1.0% 사이코스와 0.154 단위/㎖ 효소가 포함된 50 mM 인산-칼륨 (potassium phosphate) 완충용액을 사용하여 pH 6.0에서부터 7.0 범위까지 실시하고, 1.0% 사이코스와 0.154 단위/㎖ 효소가 포함된 50 mM 트리스-염산 완충용액을 사용해 pH 7.0에서부터 9.0 범위까지 효소 반응을 실시하였으며 1.0% 사이코스와 0.154 단위/㎖ 효소가 포함된 50 mM 글리신-수산화나트륨 (glycine-NaOH) 완충용액을 사용하여 다시 pH 9.0에서부터 10.0범위까지 반응을 진행시켰다. 구체적으로, 효소반응은 50℃에서 30분 동안 수행하고 다시 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시켰다. 그 결과, 최적 pH 는 pH 7.5 인 것을 확인하였다 (도 1 참조).
또한 라이보스 5-인산 이성화효소에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 효소 반응은 온도 40℃에서 80℃ 범위까지 1.0% 사이코스와 0.154 단위/㎖ 효소가 포함된 50 mM pH 7.5 트리스-염산 완충용액을 사용하여 각각 30분 동안 반응을 실시하였다. 그 다음 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시키고 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, 최적 온도는 65℃ 인 것을 확인하였다 (도 2 참조).
도 1은 본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소의 pH 에 따른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이고, 도 2는 본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소의 온도에 따른 효소 활성도를 조사하여 나타낸 것이다. 도 1 에서의 pH 에 따른 라이보스 5-이성화 효소의 활성도에서 ○는 인산-칼륨 완충용액을 나타내고, ●는 트리스-염산 완충용액을, △는 글리신-수산화나트륨 완충용액을 나타낸 것이다.
실시예 5. 라이보스 5-이성화효소를 이용한 알로스의 대량 생산
본 발명에서는 알로스를 고수율로 생산하기 위하여, 500 g/ℓ 사이코스 및 2.8 단위/㎖ 효소가 포함된 50 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5)에서 6시간동안 온도 50℃에서 효소 반응을 수행하였다. 상기 알로스가 생산되는 과정을 조사하기 위하여, 매시간 효소 반응액을 수집하고 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시킨 다음 HPLC 를 실시하여 사이코스 생산량을 측정하였다. 반응시간에 따른 사이코스 생산량은 표 2 에 나타난 바와 같다.
반응 시간 (시간) 알로스 (g/ℓ)
0 0
0.5 93
1 129
2 148
3 157
4 159
5 165
6 165
그 결과, 배양시간 5 시간에서 165 g/ℓ 농도의 알로스가 생산되었고 이를 환산하는 경우 전환 수율은 33%에 해당되었다. 지금까지 유일한 알로스 생산효소로 알려져 있는 람노스 이성화효소와 비교하여, 람노스 이성화효소는 사이코스로부터 알로스의 생산 시 부산물로서 알트로스를 생성하는 반면, 본 발명에서 사용한 라이보스 5-이성화효소는 사이코스로부터 알로스를 생산하는 것은 동일하지만 부산물인 알트로스가 전혀 생성되지 않고 알로스만이 선택적으로 높게 생산할 수 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 방법은 부산물인 알트로스의 생성이 없어 생산 수율이 향상되고 반응 후에도 알로스만을 순수 분리하기 위한 별도의 정제 과정이 필요 없다. 도 3은 본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소를 사용한 알로스 생산 시 부가물의 생성 없이 사이코스로부터 알로스만이 생산되는 것을 알아이 검출기와 코스모실 칼럼이 장착된 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 실시하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 라이보스 5-인산 이성화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환 된 미생물 및 이들을 이용하여 라이보스 5-인산 이성화효소를 대량으로 얻는 제조방법 그리고 상기 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용하여 희소당 알로스를 고수율로 얻는 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 라이보스 5-인산 이성화효소는 암세포의 증식의 저해하고 허혈 작용으로 인한 장기 손상을 억제하는 효능을 가지는 의약용 희소당인 D-알로스를 효율적으로 생산할 수 있다. 본 발명의 알로스의 제조방법은 종래의 화학적인 생산방법과 비교하여 친환경적이면서, 유일한 효소적 방법으로 알려진 람노스 이성화효 소를 이용한 생산방법과 비교해도 부산물인 알트로스가 생성되지 않은 높은 특이성을 가진 알로스의 생산을 가능하게 한다. 따라서 부산물의 생성과 금속 이온을 배제하고 안정적으로 알로스만을 특이적으로 생산할 수 있어 기능성 식품 및 의약품 등의 제조 시 유용하게 사용될 수 있다.
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  7. 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용하여 알로스를 대량으로 얻는 생산방법.
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  9. 제 7항에 있어서,
    상기 알로스는 기질로서 사이코스를 사용하여 합성되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 알로스는 D-알로스이고, D-사이코스 (D-psicose)를 사용하여 합성되는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 D-사이코스는 농도 0.5 내지 1.5% 범위로 첨가되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  12. 제 7항에 있어서,
    상기 효소 반응은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  13. 제 7항에 있어서,
    상기 효소 반응은 온도 60℃ 내지 70℃ 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
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