KR20100044830A - 생체분자 결합 리간드 - Google Patents

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KR20100044830A
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크리스토퍼 로빈 로우
아비드 후세인
마이클 루이스 미맥
조나단 마이클 헤이그
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캠브리지 엔터프라이즈 리미티드
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Abstract

본 발명은 생체분자 결합 리간드, 생체분자 결합 리간드의 컬렉션, 및 생물학적 혼합물의 정제 및 물질에 대해 친화성을 갖는 리간드의 동정에 있어서의 그 용도를 제공한다. 상기 리간드는 하기 화학식 (III)의 화합물 또는 하기 화학식 (IV)의 화합물이다:
Figure pct00049

(상기 식에서,
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되고, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)으로부터 추가로 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 이들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있음)
Figure pct00050

(상기 식 중,
R1a, R1b, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 2개 이상은 이들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있음).

Description

생체분자 결합 리간드{BIOMOLECULE BINDING LIGANDS}
[관련 출원]
본 출원인 2007년 7월 6일에 출원된 영국 특허 출원 제0713187.3호와 관련된 것이며, 상기 특허 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
[발명의 분야]
본 발명은 생체분자 결합 리간드 및 생물학적 혼합물의 정제에 있어서의 그 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 리간드의 컬렉션(collection) 및 생물학적 분자에 대해 친화성을 갖는 화합물을 동정하는 데 있어서의 그 용도에 관한 것이다.
인간의 질병에 대한 현대적 연구는 초기에는 출발 단계의 게놈 연구를 게놈 또는 cDNA 마이크로어레이 연구와 같은 고처리율 기술(high throughput technology)과 동시에 수행함으로써 착수할 수 있다. 이로써 종종 모니터링된 질병 상태와 밀접한 상관관계가 있는 개개의 유전자 발현의 변경된 패턴 및 돌연변이 유전자 생성물을 찾게 되고, 이는 광대한 후보 유전자 리스트의 신속한 생성을 가능하게 한다. 이러한 DNA/RNA 기반 연구는, 다중 단백질-단백질 상호작용에 의한 변경된 입체구조 및 인산화와 같이 단백질이 나타낼 수 있는 신호전달 상태의 복잡한 상호작용을 고려하지 못하기 때문에, 그 자체만으로는 한계가 있다. 따라서, 임상 단백질체학 연구는 대개, 유전자 발현에 의해 확인되었든, 직접적인 단백질 프로파일링 연구에 의해 확인되었든 간에 특정 질병 상태에 깊이 연루된 다수의 후보 단백질을 완벽하게 분석하는 것을 주된 목적으로 하고 있다.
이같은 벅찬 과제는 통상적으로 수많은 개개의 단백질을 균질하게 정제할 것(이는 시간 소모적인 고비용 공정임)을 요한다. 이를 위해서는 종종, 과학자가 3D 결정학적 구조, 번역후 변형, 다른 단백질과의 복합체 형성 및 조직 편재화 연구를 보조하기 위한 특정 항체의 생산과 같은 각종 중요한 파라미터를 결정해야 한다. 또한, 신약 개발을 목적으로 소분자 이펙터가 단리된 분자에 미칠 수 있는 생물학적 활성의 조절 정도를 확인할 수 있는 시험관내 분석 시스템을 개발하기 위해서는 표적 단백질을 정제하는 것이 중요하다.
이것은 연구에 필요한 중요한 면역치료용 단백질의 수를 대체로 증가시켰으나, 새로운 생물 치료제를 비교적 단기간 내에 시장에 내놓기 위한 개발 비용에 큰 영향을 미쳤다. 최종 제품은 또한 일정한 순도, 유효성, 효능, 안정성뿐만 아니라, 명확하게 정의된 약동학적 특성, 약력학적 특성 및 면역학적 특성을 가져야 한다. 따라서, 도입 속도, 조작의 단순성 및 경제적 비용 수익을 고려하는 현대적 정제 공정의 개발에 일련의 과도한 제약이 부과되었다. 친화성 크로마토그래피는 여전히, 특이적 분자 표적 인식 및 대량 생산 공정 적부에 관한 중요한 쟁점들을 통합시킬 수 있는, 인정되고 있는 유일한 기법이며, 따라서 "충분히 규명된 생물학적 물질"을 정의하는 것과 관련된 비용 상승을 해결하기 위해 "이상적인" 기술을 제공한다. 치료제 제품의 총 제조 비용 중 50∼80%가 다운스트림 공정, 정제 및 연마 공정에서 발생하며, 이로 인해 현재 많은 종래의 정제 프로토콜이 친화성 크로마토그래피에 기초한 선택성이 높은 복잡한 방법으로 대체되고 있다(Lowe, 2001). 새로운 친화성 흡수체를 설계하고 테스트하기 위한 초기 개발 비용의 본질은, 장래의 대규모 산업 생산 단계에서 얻을 수 있는 최종적인 비용 절감에 비해 여전히 대체로 미미한 것으로 생각되고 있다.
펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 항체(즉, 면역친화성 정제)와 같은 종래의 친화성 리간드의 사용은, 대체로, 소분자 스크리닝 프로그램, 모델링 연구 및 고효율 조합 화학 기법의 출현으로 인한 인시추(in situ) 단편 스캐닝 방법 및 인실리코(in silico) 방법으로부터 유도된 제2 세대의 완전 합성 친화성 흡착제로 대체되기 시작하였다. 이는 또한, 많은 신규 표적 단백질에 대한 고품질의 결정학적 데이터에 의해 생성된 구조 정보의 급증을 통해 뒷받침되었다. 생물학적 리간드는 또한 초기 정제 비용, 로트 대 로트 편차, 불안정성 및 높은 대량 생산 비용을 포함할 수 있는 많은 한계점을 갖고 있다. 또 다른 중요한 고려사항은 친화성 흡수체를 효과적으로 세척하여 여러 번 재사용할 수 있음으로 해서 그 유효 수명을 연장시킬 수 있음과 동시에 높은 활성을 유지하여 장기적 정제 비용을 줄일 수 있는가 하는 것이다. 다수의 고특이적 분자 인식 프로파일을 나타내는 친화성 리간드의 다양한 소분자 조합 라이브러리의 개발은 여전히, 비용 효율적인 경제적 수익이 담보되도록, 최종 정제 단백질이 충분한 수율과 순도를 갖도록 하여 산업으로 도입할 수 있기를 희망하는 단백질 정제 기술자의 중요한 목표가 되고 있다.
단일 단백질의 효과적인 정제는 본래의 고친화성을 유지한 채로 표적을 인식하는 새로운 mAb의 생산을 빠르게 촉진할 수 있다. 현재, 18종의 치료용 인간 mAb가 시판되고 있는 반면, 100종이 넘는 mAb에 대해 최종 임상 시험이 현재 진행되고 있다. 지금까지, 5종의 Fab 분자가 인체 사용에 대해 FDA 승인을 받았으며, 1종의 인간화 Fab(ranibizumab rhFab)가 가까운 장래에 승인을 받을 것으로 예생된다.
생물 치료제 개발에 있어서의 이같은 최신 경향과 빠르고 효율적인 정제에 대한 절실한 요구가 리간드 설계 및 합성을 위한 신규한 일반형(generic) 친화성 스캐폴드(scaffold)의 개발을 촉진하였다. 임의의 친화성 리간드의 스캐폴드는, 특정 세트의 분자 상호작용 및 결합 상수를 얻기 위한 복잡한 유도체화 능력과 함께 고체 불용성 지지체 매트릭스에 고정화될 수 있는 능력을 이중으로 가져야 한다. 이는 별개의 크로마토그래피 흡착 공정 및 탈착 공정을 확인하고 추가로 최적화하는 데 필요한 절대적인 요건이다. 본 발명자들은 본원에서 면역약학적 표적 및 다른 중요한 생체분자의 정제에 적용될 수 있는 완전 합성 친화성 크로마토그래피 리간드의 개발을 위한 새로운 스캐폴드 화학 작용을 보고한다.
친화성 크로마토그래피 분야에서는, 관심있는 물질에 대한 낮은 결합력 및 낮은 선택도 등과 같은 문제점을 극복하기 위해 새로운 친화성 리간드를 제공할 것에 대한 수요가 꾸준히 있어 왔다. 또한, 친화성 리간드로서 사용하기 위한 화합물을 제조하기 위한 견실성있는 방법이 요구되고 있다.
다수의 생물학 및 화학 분야에서는, 핵산 또는 펩티드와 같은 관심있는 물질에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 새로운 방법의 제공이 요구되고 있다. 새로운 리간드 분자의 동정을 위해서는, 그 방법이 특히 자동화에 적합한 방법이고 고처리율의 재현성 있는 방법이며 확장에 적합한 방법인 것이 바람직한 것으로 간주된다. 또한, 다종 다양한 화학 구조 공간을 탐색할 수 있음으로 해서 물질에 대해 높은 친화성을 갖는 리간드를 동정할 가능성을 최대화하는 것이 바람직하다.
본 발명은 혼합물로부터 물질을 정제하기 위해 친화성 리간드로서 사용하기 위한 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 물질에 대해 친화성을 갖는 리간드를 동정하기 위한 화합물 및 화합물 컬렉션의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 화합물의 컬렉션을 제공하며, 상기 컬렉션의 각각의 구성원은 독립적으로 하기 화학식 (I) 또는 화학식 (II)에 따른 화합물이고, 상기 컬렉션은 화학식 (I)의 화합물만을 포함하거나, 화학식 (II)의 화합물만을 포함하거나, 화학식 (I)의 화합물과 화학식 (II)의 화합물의 혼합물을 포함한다:
Figure pct00001
(상기 식 중,
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되고, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)로부터 추가로 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 이들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있음)
Figure pct00002
(상기 식 중,
R1a, R1b, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 이들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있음).
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 물질에 대해 친화성을 갖는 고정화된 리간드를 동정하는 방법에 있어서 본 발명의 제1 양태에 따른 컬렉션을 사용하는 용도를 제공한다. 이 방법은
본 발명의 제1 양태에 따른 화합물의 컬렉션을 얻는 단계;
상기 컬렉션의 각각의 구성원을 물질을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계; 및
상기 컬렉션을 분석하여, 상기 물질이 각각의 컬렉션 구성원과 결합하는 정도를 측정하는 단계
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 물질은 핵산 또는 펩티드이다. 상기 방법은 혼합물로부터 상기 컬렉션을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 물질에 대해 친화성을 갖는 화합물을 제조하는 방법에 있어서 본 발명의 제1 양태에 따른 컬렉션을 사용하는 용도를 제공한다. 상기 방법은
본 발명의 제1 양태에 따른 화합물의 컬렉션을 얻는 단계;
상기 컬렉션의 각각의 구성원을 물질을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계;
상기 컬렉션을 분석하여, 상기 물질이 각각의 컬렉션 구성원과 결합하는 정도를 측정하는 단계;
물질에 대해 친화성을 갖는 라이브러리 구성원을 확인하는 단계; 및
상기 컬렉션 구성원에 기초한 구조를 갖는 화합물을 제조하는 단계
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 물질은 핵산 또는 펩티드이다. 상기 방법은 혼합물로부터 상기 컬렉션을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
물질에 대해 친화성을 갖는 화합물은, 상기 물질과 결합하는 것으로 확인된 컬렉션의 링커를 절단함으로서 제조할 수 있다. 대안으로, 상기 화합물은 성분 A, B, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
(여기서,
A는 R1aCOR1b이고;
B는 R2-NH2이며;
C는 R3-NC이고;
D는 R4-COOH이며;
R1a, R1b, R2, R3 및 R4는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되고, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되며, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)로부터 추가로 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨); 또는
성분 A, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
(여기서,
A는 R1aCOR1b이고;
C는 R3-NC이며;
D는 R4-COOH이고;
R1a, R1b, R3 및 R4는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)
에 의해 제조할 수 있다.
상기 후자 방법의 단계에서, 한 성분은 링커의 구조적 또는 기능적 유사체이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (III)의 화합물 또는 하기 화학식 (IV)의 화합물을 제공한다:
Figure pct00003
(상기 식에서,
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되고, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)으로부터 추가로 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 이들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있음)
Figure pct00004
(상기 식 중,
R1a, R1b, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 2개 이상은 이들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있음).
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 혼합물로부터 물질을 분리하기 위한 분리 장치를 제공하며, 이때 상기 장치는 본 발명의 제4 양태에 따른 화합물을 포함한다.
본 발명의 제6 양태에서, 본 발명은 혼합물로부터 물질을 분리하는 방법에 있어서의 본 발명의 제4 양태에 따른 화합물의 용도 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 분리 장치의 용도를 제공한다. 상기 방법은
물질을 포함하는 혼합물을, 본 발명의 제4 양태에 따른 화합물 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 분리 장치와 접촉시키는 단계; 및
상기 화합물 또는 장치에 고정화된 물질로부터, 얻어진 물질 고갈 혼합물을 분리하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 제7 양태에서, 본 발명은 진단 방법에 있어서의 본 발명의 제4 양태에 따른 화합물의 용도 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 분리 장치의 용도를 제공한다. 상기 방법은 특정 질병 상태에 관련된 물질에 대해 친화성을 갖는 화합물에 대해 생물학적 시료를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 이 방법은
생물학적 시료를, 본 발명의 제4 양태에 따른 화합물 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 분리 장치와 접촉시키는 단계; 및
상기 화합물 또는 장치를 분석하여, 특정 질병 상태에 관련된 물질이 상기 화합물 또는 장치와 결합하는 정도를 측정하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 제8 양태에서, 본 발명은 분석 시료 중 물질의 존재를 확인하기 위한 분석 방법에 있어서의 본 발명의 제4 양태에 따른 화합물의 용도 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 분리 장치의 용도를 제공한다. 상기 방법은 물질에 대해 친화성을 갖는 화합물에 대해 분석 시료를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 이 방법은
분석 시료를, 본 발명의 제4 양태에 따른 화합물 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 분리 장치와 접촉시키는 단계; 및
상기 화합물 또는 장치를 분석하여, 특정 질병 상태에 관련된 물질이 상기 화합물 또는 장치와 결합하는 정도를 측정하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 또한, 제9 양태에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 컬렉션을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 성분 A, B, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계:
(여기서,
A는 R1aCOR1b이고;
B는 R2-NH2이며;
C는 R3-NC이고;
D는 R4-COOH이며;
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되고, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되며, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)로부터 추가로 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)를 포함하고, 상기 단계는 1회 이상 반복하고, 매회 반복시마다 A, B, C 또는 D 중 하나 이상을 변경하거나;
또는, 상기 방법은 성분 A, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계:
(여기서,
A는 R1aCOR1b이고;
C는 R3-NC이며;
D는 R4-COOH이고;
R1a, R1b, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)를 포함하고, 상기 단계는 1회 이상 반복하고, 매회 반복시마다 A, C 또는 D 중 하나 이상을 변경한다.
바람직하게는, 상기 단계들을 동시에 수행한다. 바람직하게는, 각 단계를 별개의 반응 용기에서 수행한다.
본 발명은 또한, 제10 양태에서, 본 발명의 제4 양태에 따른 화합물의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 성분 A, B, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계:
(여기서,
A는 R1aCOR1b이고;
B는 R2-NH2이며;
C는 R3-NC이고;
D는 R4-COOH이며;
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되고, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되며, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)로부터 추가로 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)를 포함하거나, 또는 상기 방법은 성분 A, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계:
(여기서,
A는 R1aCOR1b이고;
C는 R3-NC이며;
D는 R4-COOH이고;
R1a, R1b, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제9 양태의 방법에 의해 얻을 수 있는 화합물의 컬렉션을 제공한다.
도 1은 화합물 5에 대한 (A) 1H NMR 및 (B) 13C NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 2는 인 시추 Ugi 스캐폴드 형성의 정성적 증거에 사용된 리간드의 형광 이미지를 보여준다.
도 3은 비최적화 표준 크로마토그래피 조건[c.v.: 200 ㎕; hIgG 로딩: 500 ㎍ml-1 (1 c.v.); 리간드 밀도: 24 μmolㆍg-1(습중량 겔)]에 기초하여 Ugi 반응에 의해 생성된 라이브러리를 hIgG 결합(㎍ml-1)에 대해 스크리닝하는 분석의 결과를 보여준다. A1-8 및 C1-8 표시는 실험 섹션에 상세히 기재한 바와 같은 Ugi 반응에 사용된 아민 성분과 카복실산 성분의 명칭이다.
도 4는 도 3과 관련하여 기재된 라이브러리를 hFab 결합에 대해 스크리닝한 분석의 결과를 보여준다.
도 5는 도 3과 관련하여 기재된 라이브러리를 hFc 결합에 대해 스크리닝한 분석의 결과를 보여준다.
도 6은 hIgG 선도 후보 리간드에 대한 결합률(%)과 용리율(%)의 비교 결과를 보여준다. 비최적화 결합(10 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.4) 및 용리(0.1M NaHCO3, 10%(v/v) 에틸렌 글리콜, pH 10.0) 조건이 적용되었다. 용리율(%)은 결합된 단백질의 백분율로서 표시된다. (리간드 밀도: 17.5 μmolㆍg-1 습중량 겔)
도 7은 도 6과 관련하여 기재된 조건하에서의 hFab 선도 리간드의 결합률(%)과 용리율(%)의 비교를 보여준다.
도 8은 도 6과 관련하여 기재된 조건하에서의 hFc 선도 리간드의 결합률(%)과 용리율(%)의 비교를 보여준다.
도 9는, 트리아진 리간드 34/43과 비교한, 선택된 리간드 화합물 4U, 8U 및 9U로 충전한 컬럼을 사용하는 인자 VIII 결합 연구의 결과를 보여준다.
도 10은, 트리아진 리간드 34/43과 비교한, 선택된 리간드 화합물 4U, 8U 및 9U의 용리 거동을 보여준다.
도 11은, 트리아진 리간드 34/43과 비교한, 선택된 리간드 화합물 4U, 6U, 7U, 8U, 9U, 10U, 11U, 12U, 13U 및 14U의 인자 VIII 마이크로플레이트 분석 결과를 보여준다.
도 12는 선택된 리간드 화합물 4U, 9U 및 14U에 대해 확인된 차등적인 결합 방식을 보여준다.
도 13은 선택된 리간드 화합물 4U, 16U, 17U 및 14U에 대해 확인된 차등적인 결합 방식을 보여준다.
도 14는 선택된 리간드 화합물 8U, 14U, 16U 및 17U로부터의 인자 VIII 용리 결과를 보여준다.
정의
R 1a , R 1b , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 및 R 7
C1-20알킬: 본원에서 사용될 때 "알킬"이란 용어는, 지방족 또는 지환족일 수 있고 포화 또는 불포화(예를 들어, 부분 불포화, 완전 불포화)일 수 있는, (달리 명시하지 않는다면) 1∼20개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거하는 것에 의해 얻어지는 1가 부분을 말한다. 따라서, "알킬"이란 용어는 하위 부류인 후술하는 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐 등을 포함한다.
알킬기에 있어서, 접두어(예를 들어, C1-4, C1-7, C1-20, C2-7, C3-7 등)는 탄소 원자수 또는 탄소 원자수의 범위를 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 사용될 때 "C1-4 알킬"이란 용어는 1∼4개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 말한다. 알킬기의 예로는 C1-4 알킬("저급 알킬"), C1-7알킬 및 C1-20알킬을 포함한다. 제1 접두어는 다른 한정에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 불포화 알킬기의 경우, 제1 접두어는 2 이상이어야 하고; 환형 알킬기의 경우, 제1 접두어는 3 이상이어야 하며; 그 이상도 마찬가지이다.
(비치환) 포화 알킬기의 예로는 메틸(C1), 에틸(C2), 프로필(C3), 부틸(C4), 펜틸(C5), 헥실(C6), 헵틸(C7), 옥틸(C8), 노닐(C9), 데실(C10), 운데실(C11), 도데실(C12), 트리데실(C13), 테트라데실(C14), 펜타데실(C15) 및 에이코데실(C20)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
(비치환) 포화 선형 알킬기의 예로는 메틸(C1), 에틸(C2), n-프로필(C3), n-부틸(C4), n-펜틸(아밀)(C5), n-헥실(C6) 및 n-헵틸(C7)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
(비치환) 포화 분지형 알킬기의 예로는 이소-프로필(C3), 이소-부틸(C4), sec-부틸(C4), tert-부틸(C4), 이소-펜틸(C5) 및 네오-펜틸(C5)을 포함한다.
알케닐: 본원에서 사용될 때 "알케닐"이란 용어는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 알킬기를 말한다. 알케닐기의 예는 C2-4알케닐, C2-7알케닐, C2-20알케닐을 포함한다.
(비치환) 불포화 알케닐기의 예는 에테닐(비닐, -CH=CH2), 1-프로페닐(-CH=CH-CH3), 2-프로페닐(알릴, -CH-CH=CH2), 이소프로페닐(1-메틸비닐, -C(CH3)=CH2), 부테닐(C4), 펜테닐(C5) 및 헥세닐(C6)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
알키닐: 본원에서 사용될 때 "알키닐"이란 용어는 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 알킬기를 말한다. 알키닐기의 예는 C2-4알키닐, C2-7알키닐, C2-20알키닐을 포함한다.
(비치환) 불포화 알키닐기의 예는 에티닐(ethynyl, ethinyl, -C≡CH) 및 2-프로피닐(프로파길, -CH2-C≡CH)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
사이클로알킬: 본원에서 사용될 때 "사이클로알킬"이란 용어는, 역시 사이클릴기인 알킬기, 즉, 탄소환 화합물의 탄소환 고리의 지환족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하는 것에 의해 얻어지는, (달리 명시하지 않는다면) 3∼20개의 고리 원자를 포함하여 3∼20개의 탄소 원자를 가지는 1가 부분(상기 탄소환 고리는 포화 또는 불포화(예를 들어, 부분 불포화, 완전 불포화)일 수 있음)을 말한다. 따라서, "사이클로알킬"이란 용어는 하위 부류인 사이클로알케닐 및 사이클로알키닐을 포함한다. 바람직하게는, 각각의 고리는 3∼7개의 고리 원자를 갖는다. 사이클로알킬기의 예는 C3-20 사이클로알킬, C3-15 사이클로알킬, C3-10 사이클로알킬, C3-7 사이클로알킬을 포함한다.
사이클로알킬기의 예는 이하의 것으로부터 유도된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는다:
포화 단환 탄화수소 화합물:
사이클로프로판(C3), 사이클로부탄(C4), 사이클로펜탄(C5), 사이클로헥산(C6), 사이클로헵탄(C7), 메틸사이클로프로판(C4), 디메틸사이클로프로판(C5), 메틸사이클로부탄(C5), 디메틸사이클로부탄(C6), 메틸사이클로펜탄(C6), 디메틸사이클로펜탄(C7), 메틸사이클로헥산(C7), 디메틸사이클로헥산(C8), 메탄(C10);
불포화 단환 탄화수소 화합물:
사이클로프로펜(C3), 사이클로부텐(C4), 사이클로펜텐(C5), 사이클로헥센(C6), 메틸사이클로프로펜(C4), 디메틸사이클로프로펜(C5), 메틸사이클로부텐(C5), 디메틸사이클로부텐(C6), 메틸사이클로펜텐(C6), 디메틸사이클로펜텐(C7), 메틸사이클로헥센(C7), 디메틸사이클로헥센(C8);
포화 다환 탄화수소 화합물:
투잔(C10), 카란(C10), 피난(C10), 보란(C10), 노르카란(C7), 노르피난(C7), 노르보난(C7), 아다만탄(C10), 데칼린(데하이드로나프탈렌)(C10);
불포화 다환 탄화수소 화합물:
캄펜(C10), 리모넨(C10), 피넨(C10);
방향족 고리를 갖는 다환 탄화수소 화합물:
인덴(C9), 인단(예를 들어, 2,3-디하이드로-1H-인덴)(C9), 테트랄린(1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌)(C10), 아세나프텐(C12), 플루오렌(C13), 페날렌(C13), 아세페난트렌(C15), 아세안트렌(C16), 콜란트렌(C20).
C3-20헤테로사이클릴: 본원에서 사용될 때 "헤테로사이클릴"이란 용어는, (달리 명시하지 않는다면) 3∼20개의 고리 원자(이 중, 1∼10개는 고리 이종 원자임)를 갖는, 복소환 화합물의 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하는 것에 의해 얻어지는 1가 부분을 말한다. 바람직하게는, 각각의 고리는 3∼7개의 고리 원자를 가지고, 이 중, 1∼4개가 고리 이종 원자이다.
여기에서, 접두어(예를 들어, C3-20, C3-7, C5-6 등)는 탄소 원자이든 이종 원자이든 간에 고리 원자수 또는 고리 원자수의 범위를 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 사용될 때 "C5-6 헤테로사이클릴"이란 용어는 5개 또는 6개의 고리 원자를 갖는 헤테로사이클릴기를 말한다. 헤테로사이클릴기의 예는 C3-20헤테로사이클릴, C5-20헤테로사이클릴, C3-15헤테로사이클릴, C5-15헤테로사이클릴, C3-12헤테로사이클릴, C5-12헤테로사이클릴, C3-10헤테로사이클릴, C5-10헤테로사이클릴, C3-7헤테로사이클릴, C5-7헤테로사이클릴 및 C5-6헤테로사이클릴을 포함한다.
단환 헤테로사이클릴기의 예는 이하의 것으로부터 유도된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는다:
N1: 아지리딘(C3), 아제티딘(C4), 피롤리딘(테트라하이드로피롤)(C5), 피롤린(예를 들어, 3-피롤린, 2,5-디하이드로피롤)(C5), 2H-피롤 또는 3H-피롤(이소피롤, 이속사졸)(C5), 피페리딘(C6), 디하이드로피리딘(C6), 테트라하이드로피리딘(C6), 아제핀(C7);
O1: 옥시란(C3), 옥세탄(C4), 옥솔란(테트라하이드로퓨란)(C5), 옥솔(디하이드로퓨란)(C5), 옥산(테트라하이드로피란)(C6), 디하이드로피란(C6), 피란(C6), 옥세핀(C7);
S1: 티이란(C3), 티에탄(C4), 티오란(테트라하이드로티오펜)(C5), 티안(테트라하이드로티오피란)(C6), 티에판(C7);
O2: 디옥솔란(C5), 디옥산(C6) 및 디옥세판(C7);
O3: 트리옥산(C6);
N2: 이미다졸리딘(C5), 피라졸리딘(디아졸리딘)(C5), 이미다졸린(C5), 피라졸린(디하이드로피라졸)(C5), 피페라진(C6);
N1O1: 테트라하이드로옥사졸(C5), 디하이드로옥사졸(C5), 테트라하이드로이속사졸(C5), 디하이드로이속사졸(C5), 모르폴린(C6), 테트라하이드로옥사진(C6), 디하이드로옥사진(C6), 옥사진(C6);
N1S1: 티아졸린(C5), 티아졸리딘(C5), 티오모르폴린(C6);
N2O1: 옥사디아진(C6);
O1S1: 옥사티올(C5) 및 옥사티안(티옥산)(C6); 및
N1O1S1: 옥사티아진(C6).
치환된 (비방향족) 단환 헤테로사이클릴기의 예는 환형 형태의 사카라이드로부터 유도된 기, 예를 들어, 퓨라노스(C5), 예컨대 아라비노퓨라노스, 릭소퓨라노스, 리보퓨라노스 및 크실로퓨라노스, 및 피라노스(C6), 예컨대 알로피라노스, 알트로피라노스, 글루코피라노스, 만노피라노스, 굴로피라노스, 이도피라노스, 갈락토피라노스 및 탈로피라노스를 포함한다.
스피로-C3-7 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴: 본원에서 사용될 때 "스피로 C3-7 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴"이란 용어는 양 고리에 공통인 단일 원자에 의해 다른 고리에 연결된 C3-7 사이클로알킬 또는 C3-7 헤테로사이클릴을 말한다.
C5-20아릴: 본원에서 사용될 때 "C5-20아릴"이란 용어는 C5-20 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하는 것에 의해 얻어지는 1가 부분을 말하며, 상기 화합물은 1개의 고리, 또는 2개 이상의 고리(예를 들어, 축합 고리)를 가지고, 5∼20개의 고리 원자를 가지며, 여기서 상기 고리(들) 중 적어도 1개는 방향족 고리이다. 바람직하게는, 각각의 고리는 5∼7개의 고리 원자를 갖는다.
상기 고리 원자는 "카보아릴기"에서와 같이 모두 탄소 원자일 수 있으며, 이 경우 기는 편의상 "C5-20 카보아릴" 기라 칭할 수 있다.
고리 이종 원자를 갖지 않는 C5-20아릴기(즉, C5-20카보아릴기)는 벤젠으로부터 유도된 것(즉, 페닐)(C6), 나프탈렌(C10), 안트라센(C14), 페난트렌(C14) 및 파이렌(C16)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
대안으로, 상기 고리 원자는 "헤테로아릴기"에서와 같이 산소, 질소 및 황을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 이종 원자를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 기는 편의상 "C5-20헤테로아릴기"라 칭할 수 있으며, 이때 "C5-20"은 탄소 원자이든 이종 원자이든 간에 고리 원자를 나타낸다. 바람직하게는, 각각의 고리는 5∼7개의 고리 원자를 가지며, 이 중, 0∼4개가 고리 이종 원자이다.
C5-20헤테로아릴기의 예는 퓨란(옥솔), 티오펜(티올), 피롤(아졸), 이미다졸(1,3-디아졸), 피라졸(1,2-디아졸), 트리아졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 옥사디아졸, 테트라졸 및 옥사트리아졸로부터 유도된 C5헤테로아릴기; 및 이속사진, 피리딘(아진), 피리다진(1,2-디아진), 피리미딘(1,3-디아진; 예를 들어, 사이토신, 티민, 우라실), 피라진(1,4-디아진) 및 트리아진으로부터 유도된 C6 헤테로아릴기를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
상기 헤테로아릴기는 탄소 또는 이종 고리 원자에 의해 결합될 수 있다.
축합 고리를 포함하는 C5-20헤테로아릴기의 예는 벤조퓨란, 이소벤조퓨란, 벤조티오펜, 인돌, 이소인돌로부터 유도된 C9헤테로아릴기; 퀴놀린, 이소퀴놀린, 벤조디아진, 피리도피리딘으로부터 유도된 C10헤테로아릴기; 아크리딘 및 크산텐으로부터 유도된 C14헤테로아릴기를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
상기 알킬, 헤테로사이클릴 및 아릴 기는, 단독으로 또는 다른 치환기의 일부로서, 그 자체가, 그 자체 및 하기에 기재된 추가의 치환기로부터 선택되는 하나 이상의 기로 임의로 치환될 수 있다:
수소: -H. 특정 위치의 치환기가 수소인 경우, 화합물 또는 기가 그 자리에서 "비치환"되어 있다고 말하는 것이 편리할 수 있다.
할로: -F, -Cl, -Br 및 -I.
하이드록시: -OH.
에테르: -OR, 여기서 R은 에테르 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기(C1-7알콕시기라고도 함), C3-20헤테로사이클릴기(C3-20헤테로사이클릴옥시기라고도 함), 또는 C5-20아릴기(C5-20아릴옥시기라고도 함), 바람직하게는 C1-7알킬기이다.
알콕시: -OR, 여기서 R은 알킬기, 예를 들어, C1-7알킬기이다. C1-7알콕시기의 예는 -OMe(메톡시), -OEt(에톡시), -O(nPr)(n-프로폭시), -O(iPr)(이소프로폭시), -O(nBu)(n-부톡시), -O(sBu)(sec-부톡시), -O(iBu)(이소부톡시) 및 -O(tBu)(tert-부톡시)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
아세탈: -CH(OR1)(OR2), 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아세탈 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이나, 또는 "환형" 아세탈기인 경우, R1 및 R2가, 이들이 부착된 2개의 산소 원자 및 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, 4∼8개의 고리 원자를 갖는 복소환 고리를 형성한다. 아세탈기의 예는 -CH(OMe)2, -CH(OEt)2 및 -CH(OMe)(OEt)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
헤미아세탈: -CH(OH)(OR1), 여기서 R1은 헤미아세탈 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 헤미아세탈기의 예는 -CH(OH)(OMe) 및 -CH(OH)(OEt)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
케탈: -CR(OR1)(OR2), 여기서 R1 및 R2는 아세탈에 대해 정의된 것과 같고, R은 수소 이외의 케탈 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 케탈의 예는 -C(Me)(OMe)2, -C(Me)(OEt)2, -C(Me)(OMe)(OEt), -C(Et)(OMe)2, -C(Et)(OEt)2 및 -C(Et)(OMe)(OEt)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
헤미케탈: -CR(OH)(OR1), 여기서 R1은 헤미아세탈이고, R은 수소 이외의 헤미케탈 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기, 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 헤미아세탈기의 예는 -C(Me)(OH)(OMe), -C(Et)(OH)(OMe), -C(Me)(OH)(OEt) 및 -C(Et)(OH)(OEt)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
옥소(케토, -온): =O.
티온(티오케톤): =S.
이미노(이민): =NR, 여기서 R은 이미노 치환기, 예를 들어, 수소, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1-7알킬기이다. 이미노기의 예는 =NH, =NMe, =NEt 및 =NPh를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
포르밀(카브알데하이드, 카복스알데하이드): -C(=O)H.
아실(케토): -C(=O)R, 여기서 R은 아실 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기(C1-7알킬아실 또는 C1-7알카노일이라고도 함), C3-20헤테로사이클릴기(C3-20헤테로사이클릴아실이라고도 함), 또는 C5-20아릴기(C5-20아릴아실이라고도 함), 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 아실기의 예는 -C(=O)CH3(아세틸), -C(=O)CH2CH3(프로피오닐), -C(=O)C(CH3)3(t-부티릴) 및 -C(=O)Ph(벤조일, 페논)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
카복시(카복실산): -C(=O)OH.
보론산: -B(OH)2.
보론산: -B(OR)2, 여기서 R은 알킬 또는 아릴이다.
티오카복시(티오카복실산): -C(=S)SH.
티올로카복시(티올로카복실산): -C(=O)SH.
티오노카복시(티오노카복실산): -C(=S)OH.
이미드산: -C(=NH)OH.
하이드록삼산: -C(=NOH)OH.
에스테르(카복실레이트, 카복실산 에스테르, 옥시카보닐): -C(=O)OR, 여기서 R은 에스테르 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기, 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 에스테르기의 예는 -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3 및 -C(=O)OPh를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
아실옥시(역 에스테르): -OC(=O)R, 여기서 R은 아실옥시 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 아실옥시기의 예는 -OC(=O)CH3(아세톡시), -OC(=O)CH2CH3, -OC(=O)C(CH3)3, -OC(=O)Ph, -OC(=O)C6H4F 및 -OC(=O)CH2Ph를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
옥시카보일옥시: -OC(=O)OR, 여기서 R은 에스테르 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 에스테르기의 예는 -OC(=O)OCH3, -OC(=O)OCH2CH3, -OC(=O)OC(CH3)3 및 -OC(=O)OPh를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
아미노: -NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노 치환기, 예를 들어, 수소, C1-7알킬기(C1-7알킬아미노 또는 디-C1-7알킬아미노라고도 함), C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1-7알킬기이거나, 또는 "환형" 아미노 기의 경우, R1 및 R2는, 이들이 부착된 질소 원자와 함께, 4∼8개의 고리 원자를 갖는 복소환 고리를 형성한다. 아미노기는 1차(-NH2), 2차(-NHR1) 또는 3차(-NHR1R2)일 수 있고, 양이온 형태로 4차(-+NR1R2R3)일 수 있다. 아미노기의 예는 -NH2, -NHCH3, -NHCH(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2 및 -NHPh를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 환형 아미노기의 예는 아지리디닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디노, 피페라지닐, 퍼하이드로디아제피닐, 모르폴리노 및 티오모르폴리노를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
아미도(카바모일, 카바밀, 아미노카보닐, 카복사미드): -C(=O)NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 것과 같은 아미노 치환기이다. 아미노기의 예는 -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3 및 -C(=O)N(CH2CH3)2 및 아미도기(여기서 R1 및 R2는, 이들이 부착된 질소 원자와 함께, 예를 들어, 피페리디노카보닐, 모르폴리노카보닐, 티오모르폴리노카보닐 및 피페라지닐카보닐에서와 같이 복소환 구조를 형성함)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
티오아미도(티오카바밀): -C(=S)NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 것과 같은 아미노 치환기이다. 아미노기의 예는 -C(=S)NH2, -C(=S)NHCH3, -C(=S)N(CH3)2 및 -C(=S)NHCH2CH3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
아실아미도(아실아미노): -NR1C(=O)R2, 여기서 R1은 아미드 치환기, 예를 들어, 수소, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1-7알킬기, 가장 바람직하게는 H이고, R2는 아실 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 아실아미드기의 예는 -NHC(=O)CH3 , -NHC(=O)CH2CH3 및 -NHC(=O)Ph를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. R1　및 R2는 함께, 예를 들어, 숙신이미딜, 말레이미딜 및 프탈이미딜에서와 같이 환형 구조를 형성할 수 있다:
Figure pct00005
아미노카보닐옥시: -OC(=O)NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 것과 같은 아미노 치환기이다. 아미노카보닐옥시기의 예는 -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHMe, -OC(=O)NMe2 및 -OC(=O)NEt2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
우레이도: -N(R1)CONR2R3, 여기서 R2 및 R3은 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 것과 같은 아미노 치환기이고, R1은 우레이도 치환기, 예를 들어, 수소, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1-7알킬기이다. 우레이도기의 예로는 -NHCONH2, -NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, -NMeCONH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2, -NMeCONEt2 및 -NHC(=O)NHPh를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
구아니디노: -NH-C(=NH)NH2.
테트라졸릴: 4개의 질소 원자와 1개의 탄소 원자를 갖는 5원 방향족 고리:
Figure pct00006
.
이미노: =NR, 여기서 R은 이미노 치환기, 예를 들어, 예를 들어, 수소, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1-7알킬기이다. 이미노기의 예는 =NH, =NMe 및 =NEt를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
아미딘(아미디노): -C(=NR)NR2, 여기서 각각의 R은 아미딘 치환기, 예를 들어, 수소, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1-7알킬기이다. 아미딘기의 예는 -C(=NH)NH2, -C(=NH)NMe2, 및 -C(=NMe)NMe2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
니트로: -NO2.
니트로소: -NO.
아지도: -N3.
시아노(니트릴, 카보니트릴): -CN.
이소시아노: -NC.
시아네이토: -OCN.
시오시아네이토: -NCO.
티오시아노(티오시아네이트): -SCN.
이소티오시아노(오소티오시아네이토): -NCS.
설프하이드릴(티올, 머캅토): -SH.
티오에테르(설파이드): -SR, 여기서 R은 티오에테르 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기(C1-7알킬티오기라고도 함), C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. C1-7알킬티오기의 예는 -SCH3 및 -SCH2CH3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
디설파이드: -SS-R, 여기서 R은 디설파이드 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기(C1-7알킬 디설파이드라고도 함). C1-7알킬 디설파이드기의 예는 -SSCH3 및 -SSCH2CH3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설핀(설피닐, 설폭시드): -S(=O)R, 여기서 R은 설핀 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 설핀기의 예는 -S(=O)CH3 및 -S(=O)CH2CH3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설폰(설포닐): -S(=O)2R, 여기서 R은 설폰 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기(예를 들어, 불화 또는 과불화 C1-7알킬기를 포함함)이다. 설폰기의 예는 -S(=O)2CH3(메탄설포닐, 메실), -S(=O)2CF3(트리플릴), -S(=O)2CH2CH3(에실), -S(=O)2C4F9(노나플릴), -S(=O)2CH2CF3(트레실), -S(=O)2CH2CH2NH2(타우릴), -S(=O)2Ph(페닐설포닐, 베실), 4-메틸페닐설포닐(토실), 4-클로로페닐설포닐(클로실), 4-브로모페닐설포닐(브로실), 4-니트로페닐(노실), 2-나프탈렌설포네이트(나프실) 및 5-디메틸아미노-나프탈렌-1-일설포네이트(단실)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설핀산(설피노): -S(=O)OH, -SO2H.
설폰산(설포): -S(=O)2OH, -SO3H.
설피네이트(설핀산 에스테르): -S(=O)OR; 여기서 R은 설피네이트 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기, 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 설피네이트기의 예는 -S(=O)OCH3(메톡시설피닐; 메틸 설피네이트) 및 -S(=O)OCH2CH3(에톡시설피닐; 에틸 설피네이트)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설포네이트(설폰산 에스테르): -S(=O)2OR, 여기서 R은 설포네이트 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기, 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 설포네이트기의 예는 -S(=O)2OCH3(메톡시설포닐; 메틸 설포네이트) 및 -S(=O)2OCH2CH3(에톡시설포닐; 에틸 설포네이트)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설피닐옥시: -OS(=O)R, 여기서 R은 설피닐옥시 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 설피닐옥시기의 예는 -OS(=O)CH3 및 -OS(=O)CH2CH3.를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설포닐옥시: -OS(=O)2R, 여기서 R은 설포닐옥시 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 설포닐옥시기의 예는 -OS(=O)2CH3(메실레이트) 및 -OS(=O)2CH2CH3(에실레이트)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설페이트: -OS(=O)2OR; 여기서 R은 설페이트 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 설페이트기의 예는 -OS(=O)2OCH3 및 -SO(=O)2OCH2CH3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설파밀(설파모일; 설핀산 아미드; 설핀아미드): -S(=O)NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 것과 같은 아미노 치환기이다. 설파밀기의 예는 -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, -S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2 및 -S(=O)NHPh를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설폰아미도(설피나모일; 설폰산 아미드; 설폰아미드): -S(=O)2NR1R2, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 것과 같은 아미노 치환기이다. 설폰아미도기의 예는 -S(=O)2NH2, -S(=O)2NH(CH3), -S(=O)2N(CH3)2, -S(=O)2NH(CH2CH3), -S(=O)2N(CH2CH3)2 및 -S(=O)2NHPh를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설프아미노: -NR1S(=O)2OH, 여기서 R1은 아미노기에 대해 정의된 것과 같은 아미노 치환기이다. 설프아미노기의 예는 -NHS(=O)2OH 및 -N(CH3)S(=O)2OH를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설폰아미노: -NR1S(=O)2R, 여기서 R1은 아미노기에 대해 정의된 것과 같은 아미노 치환기이고, R은 설폰아미노 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기아다. 설폰아미노기의 예는 -NHS(=O)2CH3 및 -N(CH3)S(=O)2C6H5를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
설핀아미노: -NR1S(=O)R, 여기서 R1은 아미노기에 대해 정의된 것과 같은 아미노 치환기이고, R은 설핀아미노 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기이다. 설핀아미노기의 예는 -NHS(=O)CH3 및 -N(CH3)S(=O)C6H5를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
포스피노(포스핀): -PR2, 여기서 R은 포스피노 치환기, 예를 들어, -H, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7알킬기 또는 C5-20아릴기이다. 포스피노기의 예는 -PH2, -P(CH3)2, -P(CH2CH3)2, -P(t-Bu)2 및 -P(Ph)2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
포스포: -P(=O)2.
포스피닐(포스핀 옥시드): -P(=O)R2, 여기서 R은 포스피닐 치환기, 예를 들어, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C1-7알킬기 또는 C5-20아릴기이다. 포스피닐기의 예는 -P(=O)(CH3)2, -P(=O)(CH2CH3)2, -P(=O)(t-Bu)2 및 -P(=O)(Ph)2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
포스폰산(포스포노): -P(=O)(OH)2.
포스포네이트(포스포노 에스테르): -P(=O)(OR)2, 여기서 R은 포스포네이트 치환기, 예를 들어, -H, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7알킬기 또는 C5-20아릴기이다. 포스포네이트기의 예는 -P(=O)(OCH3)2, -P(=O)(OCH2CH3)2, -P(=O)(O-t-Bu)2 및 -P(=O)(OPh)2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
인산(포스포노옥시): -OP(=O)(OH)2.
포스페이트(포스포노옥시 에스테르): -OP(=O)(OR)2, 여기서 R은 포스페이트 치환기, 예를 들어, -H, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7알킬기 또는 C5-20아릴기이다. 포스페이트기의 예는 -OP(=O)(OCH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)2, -OP(=O)(O-t-Bu)2 및 -OP(=O)(OPh)2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
아인산: -OP(OH)2.
포스파이트: -OP(OR)2, 여기서 R은 포스파이트 치환기, 예를 들어, -H, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7알킬기 또는 C5-20아릴기이다. 포스파이트기의 예는 -OP(OCH3)2, -OP(OCH2CH3)2, -OP(O-t-Bu)2 및 -OP(OPh)2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
포스포아미다이트: -OP(OR1)-NR2 2, 여기서 R1 및 R2는 포스포아미다이트 치환기, 예를 들어, -H, (임의로 치환된) C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7알킬기 또는 C5-20아릴기. 포스포아미다이트의 예는 -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 및 -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
포스포아미데이트: -OP(=O)(OR1)-NR2 2, 여기서 R1 및 R2는 포스포아미데이트 치환기, 예를 들어, -H, (임의로 치환된) C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7알킬기 또는 C5-20아릴기이다. 포스포아미데이트의 예는 -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 및 -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
실릴: -SiR3, 여기서 R은 실릴 치환기, 예를 들어, -H, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7알킬기 또는 C5-20아릴기이다. 실릴기의 예는 -SiH3, -SiH2(CH3), -SiH(CH3)2, -Si(CH3)3 , -Si(Et)3, -Si(iPr)3, -Si(tBu)(CH3)2 및 -Si(tBu)3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
옥시실릴: -Si(OR)3, 여기서 R은 옥시실릴 치환기, 예를 들어, -H, C1-7알킬기, C3-20헤테로사이클릴기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 -H, C1-7알킬기 또는 C5-20아릴기이다. 옥시실릴기의 예는 -Si(OH)3, -Si(OMe)3, -Si(OEt)3 및 -Si(OtBu)3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
실록시(실릴 에테르): -OSiR3, 여기서 SiR3은 전술한 것과 같은 실릴기이다.
옥시실록시: -OSi(OR)3, 여기서 OSi(OR)3은 전술한 것과 같은 옥시실릴기이다.
많은 경우, 치환기는 그 자체가 치환된다.
예를 들어, C1-7알킬기는, 예를 들어
하이드록시(하이드록시-C1-7알킬기라고도 함);
할로(할로-C1-7알킬기라고도 함);
아미노(아미노-C1-7알킬기라고도 함);
카복시(카복시-C1-7알킬기라고도 함);
C1-7알콕시(C1-7알콕시-C1-7알킬기라고도 함);
C5-20아릴(C5-20아릴-C1-7알킬기라고도 함)
에 의해 치환될 수 있다.
마찬가지로, C5-20아릴기는, 예를 들어
하이드록시(하이드록시-C5-20아릴기라고도 함);
할로(할로-C5-20아릴기라고도 함);
아미노(아미노-C5-20아릴기라고도 함, 예를 들어 아닐린에서와 같이);
카복시(카복시-C5-20아릴기라고도 함, 예를 들어 벤조산에서와 같이);
C1-7알킬(C1-7알킬-C5-20아릴기라고도 함, 예를 들어 톨루엔에서와 같이);
C1-7알콕시(C1-7알콕시-C5-20아릴기라고도 함, 예를 들어 아니솔에서와 같이);
C5-20아릴(C5-20아릴-C5-20아릴이라고도 함, 예를 들어 비페닐에서와 같이)
에 의해 치환될 수 있다.
이러한 치환된 치환기의 이와 같은 예들은 하기에 기재한다.
하이드록시-C1-7알킬: 본원에서 사용될 때 "하이드록시-C1-7알킬"이란 용어는 1개 이상의 수소 원자(예를 들어, 1, 2, 3)가 하이드록시기로 치환된 C1-7알킬기를 말한다. 이러한 기의 예는 -CH2OH, -CH2CH2OH 및 -CH(OH)CH2OH를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
할로-C1-7알킬기: 본원에서 사용될 때 "할로-C1-7알킬"이란 용어는 1개 이상의 수소(예를 들어, 1, 2, 3)가 할로겐 원자(예를 들어, F, Cl, Br, I)로 치환된 C1-7알킬기를 말한다. 1개보다 많은 수소 원자가 할로겐으로 치환될 경우, 그 할로겐 원자는 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있다. 각각의 수소 원자가 할로겐으로 치환될 수 있으며, 이 경우 그 기를 편의상 "C1-7퍼할로알킬기"라 칭할 수 있다. 이러한 기의 예는 -CF3, -CHF2, -CH2F, -CCl3, -CBr3, -CH2CH2F, -CH2CHF2 및 -CH2CF3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
아미노-C1-7알킬: 본원에서 사용될 때 "아미노-C1-7알킬"이란 용어는 1개 이상의 수소(예를 들어, 1, 2, 3)가 아미노기로 치환된 C1-7알킬기를 말한다. 이러한 기의 예는 -CH2NH2, -CH2CH2NH2 및 -CH2CH2N(CH3)2를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
카복시-C1-7알킬: 본원에서 사용될 때 "카복시-C1-7알킬"이란 용어는 1개 이상의 수소(예를 들어, 1, 2, 3)가 카복시기로 치환된 C1-7알킬기를 말한다. 이러한 기의 예는 -CH2COOH 및 -CH2CH2COOH를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
C1-7알콕시-C1-7알킬: 본원에서 사용될 때 "C1-7알콕시-C1-7알킬"이란 용어는 1개 이상의 수소(예를 들어, 1, 2, 3)가 C1-7알콕시기로 치환된 C1-7알킬기를 말한다. 이러한 기의 예는 -CH2OCH3, -CH2CH2OCH3 및 -CH2CH2OCH2CH3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
C5-20아릴-C1-7알킬: 본원에서 사용될 때 "C5-20아릴-C1-7알킬"이란 용어는 1개 이상의 수소(예를 들어, 1, 2, 3)가 C5-20아릴기로 치환된 C1-7알킬기를 말한다. 이러한 기의 예는 벤질(페닐메틸, PhCH2-), 벤즈하이드릴(Ph2CH-), 트리틸(트리페닐메틸, Ph3C-), 펜에틸(페닐에틸, Ph-CH2CH2-), 스티릴(Ph-CH=CH-), 신나밀(Ph-CH=CH-CH2-)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
하이드록시-C5-20아릴: 본원에서 사용될 때 "하이드록시-C5-20아릴"이란 용어는 1개 이상의 수소(예를 들어, 1, 2, 3)가 하이드록시기로 치환된 C5-20아릴기를 말한다. 이러한 기의 예는 페놀, 나프톨, 파이로카테콜, 레조르시놀, 하이드로퀴논, 파이로갈롤, 플로로글루시놀로부터 유도된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
할로-C5-20아릴: 본원에서 사용될 때 "할로-C5-20아릴"이란 용어는 1개 이상의 수소(예를 들어, 1, 2, 3)가 할로(예를 들어, F, Cl, Br, I) 기로 치환된 C5-20아릴기를 말한다. 이러한 기의 예는 할로페닐(예를 들어, 플루오로페닐, 클로로페닐, 브로모페닐, 또는 요오도페닐(오르토-, 메타- 또는 파라-치환 어느 것이나), 디할로페닐, 트리할로페닐, 테트라할로페닐 및 펜타할로페닐을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
C1-7알킬-C5-20아릴: 본원에서 사용될 때 "C1-7알킬-C5-20아릴"이란 용어는 1개 이상의 수소(예를 들어, 1, 2, 3)가 C1-7알킬기로 치환된 C5-20아릴기를 말한다. 이러한 기의 예는 톨릴(톨루엔으로부터), 크실릴(크실렌으로부터), 메시틸(메시틸렌으로부터) 및 큐메닐(또는 큐밀, 큐멘으로부터) 및 듀릴(듀렌으로부터)을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
하이드록시-C1-7알콕시: -OR, 여기서 R은 하이드록시-C1-7알킬기이다. 하이드록시-C1-7알콕시기의 예는 -OCH2OH, -OCH2CH2OH 및 -OCH2CH2CH2OH를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
할로-C1-7알콕시: -OR, 여기서 R은 할로-C1-7알킬기이다. 할로-C1-7알콕시기의 예는 -OCF3, -OCHF2, -OCH2F, -OCCl3, -OCBr3, -OCH2CH2F, -OCH2CHF2 및 -OCH2CF3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
카복시-C1-7알콕시: -OR, 여기서 R은 카복시-C1-7알킬기이다. 카복시-C1-7알콕시기의 예는 -OCH2COOH, -OCH2CH2COOH 및 -OCH2CH2CH2COOH를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
C1-7알콕시-C1-7알콕시: -OR, 여기서 R은 C1-7알콕시-C1-7알킬기이다. C1-7알콕시-C1-7알콕시기의 예는 -OCH2OCH3, -OCH2CH2OCH3 및 -OCH2CH2OCH2CH3를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
C5-20아릴-C1-7알콕시: -OR, 여기서 R은 C5-20아릴-C1-7알킬기이다. 이러한 기의 예는 벤질옥시, 벤즈하이드릴옥시, 트리틸옥시, 펜에톡시, 스티릴옥시 및 신나밀옥시를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
C1-7알킬-C5-20아릴옥시: -OR, 여기서 R은 C1-7알킬-C5-20아릴기이다. 이러한 기의 예는 톨릴옥시, 크릴실옥시, 메시틸옥시, 규메닐옥시 및 듀릴옥시를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
아미노-C1-7알킬-아미노: 본원에서 사용될 때 "아미노-C1-7알킬-아미노"란 용어는 치환기, R1 또는 R2 중 1개 그 자체가 아미노-C1-7알킬기(-C1-7알킬-NR3R4)인 -NR1R2를 말한다. 아미노-C1-7알킬아미노기는, 예를 들어 -NR1-C1-7알킬-NR3R4로 표시될 수 있다. 이러한 기의 예는 화학식 -NR1(CH2)nNR1R2(식 중, n은 1∼6임)의 기(예를 들어, -NHCH2NH2, -NH(CH2)2NH2, -NH(CH2)3NH2, -NH(CH2)4NH2, -NH(CH2)5NH2, -NH(CH2)6NH2), -NHCH2NH(Me), -NH(CH2)2NH(Me), -NH(CH2)3NH(Me), -NH(CH2)4NH(Me), -NH(CH2)5NH(Me), -NH(CH2)6NH(Me), -NHCH2NH(Et), -NH(CH2)2NH(Et), -NH(CH2)3NH(Et), -NH(CH2)4NH(Et), -NH(CH2)5NH(Et) 및 -NH(CH2)6NH(Et))를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
두 자리 치환기 및 두 자리 반응물
본원에서 사용될 때 "두 자리 치환기"란 용어는 2개의 공유 결합 지점을 가지고 2개의 다른 부분 사이에서 연결기로서 작용하는 치환기를 말한다.
본원에서 사용될 때 "두 자리 반응물"란 용어는 공유 결합 지점으로서 사용될 수 있는 2개의 작용기를 갖는 반응물을 말한다. 두 자리 반응물은 두 자리 치환기를 갖는 생성물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우(A), 두 자리 치환기는 단일 원자(A1)에 공유 결합된다. 일부 경우(B), 두 자리 치환기는 2개의 상이한 원자(A1 및 A2)에 공유 결합되어, 그 사이에서 연결기로서 작용한다.
Figure pct00007
(B)에서는, 일부 경우(C), 두 자리 치환기가, 다른 방식으로는(직접적으로 또는 중간 기를 통해) 공유 결합되지 않는 다른 2개의 상이한 원자에 공유 결합된다. 일부 경우(D), 두 자리 치환기가, 그 자체기 이미 공유 결합된(직접적으로 또는 중간 기를 통해) 2개의 상이한 원자에 공유 결합되며; 이러한 경우, 환형 구조가 생성된다. 일부 경우, 두 자리 기가 모(parent) 기의 이웃자리 원자, 즉 인접 원자에 공유 결합된다.
Figure pct00008
일부 경우(A 및 D), 상기 두 자리 기가 이것이 부착된 원자(들)(및 존재한다면, 임의의 개재 원자)와 함께 추가의 환형 구조를 형성한다. 이렇게 하여, 상기 두 자리 치환기가 환 또는 다환(예를 들어, 축합, 가교, 스피로) 구조를 형성할 수 있으며, 이것은 방향족일 수 있다.
두 자리 기의 예는 C1-7알킬렌기, C3-20헤테로사이클릴렌기 및 C5-20아릴렌기 및 이들의 치환된 형태를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
지지체
본원에 기재된 지지체는 물질을 함유하는 혼합물로부터 화합물을 물리적으로 분리할 수 있게 하는 임의의 구조일 수 있다. 이 지지체는 고체 지지체 또는 가용성 지지체일 수 있다.
상기 고체 지지체는 (흔히 링커에 의해) 부착될 수 있는 화합물 또는 반응물을 과잉 반응물, 가용성 반응 부산물 또는 용매로부터 (예를 들어, 여과, 원심분리 등에 의해) 쉽게 분리할 수 있게 하는 불용성의 작용기화된 중합체 물질일 수 있다.
상기 가용성 지지체는 라이브러리 합성 조건하에 화합물을 가용성으로 만들지만, 필요할 경우 몇 가지 간단한 물리적 공정에 의해 대부분의 다른 가용성 성분으로부터 쉽게 분리될 수 있는 부착물일 수 있다. 이 공정을 액상 화학이라 부른다. 가용성 지지체의 예로는 선형 중합체, 폴리(에틸렌 글리콜), 덴드리머, 또는 불소가 많은 용매로 선택적으로 분배되는 불화 화합물을 포함한다.
상기 지지체는 임의의 물리적 형태를 가질 수 있다. 상기 지지체는 특히 입자 또는 비드, 필름, 메쉬, 튜브, 실린더, 광섬유일 수 있다. 상기 지지체는 또한 특히 입자 또는 비드, 필름, 메쉬, 튜브, 실린더 상의 라이닝(lining)일 수 있다.
상기 지지체는 자성일 수도 있고 자성 물질을 포함할 수도 있다. 상기 지지체는 강자성 또는 상자성일 수 있다.
상기 지지체는 외부 코팅을 갖거나 갖지 않는 입자일 수 있다. 상기 입자는 중합체 물질의 고형 코어 또는 금속의 코어 또는 이 둘 다의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 금속은 금속 형태 또는 염 형태일 수 있다.
상기 지지체는 중합체, 예컨대 폴리(스티렌) 또는 폴리사카라이드일 수 있거나, 또는 상기 지지체는 덴드리머, 바람직하게는 고세대(high generation) 덴드리머일 수 있다.
상기 지지체는 금과 같은 금속, 또는 금속 산화물 또는 다른 금속 염일 수 있다.
상기 지지체는 일반적으로 섬유 또는 슬라이트 형태의 유리일 수 있다.
상기 지지체는 일반적으로 웨이퍼 형태의 반도체 물질일 수 있다.
상기 지지체는, 분석 장치, 예를 들어 SPR(표면 플라스몬 공명) 장치에 사용하기 위한 칩 또는 다른 표면일 수 있다.
바람직하게는 상기 지지체는 비교적 비활성이다. 즉, 상기 지지체는 바람직하게는 상기 물질에 대한 친화성이 거의 또는 전혀 없어야 한다. 상기 지지체는 비특이적 결합이 최소화되도록 재료로 코팅할 수 있다.
'지지체'란 용어는 표면에 화합물을 공유 결합하는 역할을 할 수 있는 반응성 작용기를 포함하거나 포함하도록 유도체화될 수 있는 경질 또는 반경질 표면을 갖는 재료를 지칭할 수 있다. 이러한 재료는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Si-OH 기를 포함한느 이산화규소 지지체, 폴리아크릴아미드 지지체, 폴리스티렌 지지체, 폴리에틸렌글리콜 지지체 등을 포함한다. 상기 지지체는 작용기의 혼합물을 갖는 지지체일 수 있다. 예를 들어 상기 지지체는 폴리에틸렌글리콜이 그래프팅된 폴리스티렌 골격을 가질 수 있다. 상기 지지체는 TentagelTM으로서 시판된다. 이러한 지지체는 소형 비드, 핀/크라운, 박층 표면, 펠릿, 디스크의 형태를 가질 수 있다. 다른 통상적인 형태로 이용될 수 있다.
상기 지지체는 링커가 부착될 수 있는 작용점을 가질 수 있음이 이해될 것이다.
지지체의 정확한 '로딩', 단위 질량당 이용 가능한 작용점의 수는 지지체의 정확한 성질에 따라 달라진다. 로딩은 지지체의 시판 공급처에 의해 제공될 수 있다. 로딩은 또한 당업계에 알려진 방법 중 어느 하나, 예컨대 원소 분석(1H 및 13C NMR)에 의해 실험적으로 측정할 수도 있다. 로딩은 또한 지지체로 화합물을 첨가하거나 이로부터 화합물을 제거하는 것으로부터 유도된 질량 차이 계산으로부터 측정할 수 있다. 이는 소위 'Fmoc 카운트'에 기초한 방법과 같은 분광분석적 측정에 의해 수행할 수 있다.
편의상, 본원에서 상기 지치체를 도시할 때, 이 지지체가 단 하나의 링커에 부착되어 있는 것으로 표현한다. 그러나, 지지체 상의 작용기의 정확한 수는 이보다 훨씬 더 많을 수 있다. 아미노메틸화 폴리스티렌과 같은 시판되는 수지 지지체는 0.25∼0.75 mmolㆍeg-1의 아미노 작용기를 가질 수 있다. 세파로스 지지체 C1-6B(아가로스계 지지체)와 같은 지지체는 로딩량이 약 24 μmmolㆍeg-1일 수 있다.
링커
본 발명의 화합물은 링커를 통해 지지체에 연결될 수 있다. 상기 링커는 임의로 치환된 C1-20알킬 또는 임의로 치환된 C5-20아릴과 같은 기 또는 직접 결합일 수 있다. 상기 링커는 분석을 보조하거나 지지체로부터 화합물을 절단할 수 있도록 하는 작용기를 제공하기 위해 제공될 수 있다. 상기 링커는 또한 관심있는 물질과 상호작용할 수 있는 구조적 또는 기능적 단위를 제공할 수 있다.
상기 링커는 고체 지지체로부터 화합물을 유리시킬 수 있는 절단 가능한 링커일 수 있다. 대안으로, 상기 링커는 절단이 불가능한 링커일 수 있다. 상기 링커는 가요성 링커일 수 있다.
링커가 절단되어 지지체로부터 화합물을 유리시킬 경우, 링커 구조의 일부가 유리된 화합물의 일부로서 포함될 수 있다. 대안으로, 상기 화합물은 어떠한 링커 분자 부분도 포함하지 않은 상태로 유리될 수 있다. 상기 화합물은 화합물 상에 카복실산과 같은 작용기 "잔여부"를 남긴 채 또는 화합물 상에 수소를 남긴 채 유리될 수 있다. 화합물 상에 수소를 남긴 채 유리될 수 있는 링커를 흔적이 없는(traceless) 링커라 부른다.
본 발명의 화합물에 사용될 수 있는 링커는 특히 Wang, HMPB, HMPA, Sieber 아미드, Rink 아미드, FMPB, DHP, 클로로트리틸, 하이드라지노벤조일, 설파밀부티릴, 옥심 및 MBHA에 기초한 링커이다. 이러한 링커는 화학 업체로부터 널리 입수할 수 있다(예를 들어, Novabiochem 카탈로그 2006/2007 참조).
대안으로, 상기 링커가 비시판 링커일 수 있다.
연결기가 고체 지지체 상에 제공된 단순한 작용기, 예를 들어 아민일 수도 있으며, 이 경우 상기 연결기는 절단이 용이하지 않을 수 있다. 이러한 유형의 연결기는 온비드 스크리닝(on-bead screening)(하기 참조)에 적용되는 컬렉션의 합성에 유용하며, 이때 절단은 필요하지 않다. 이러한 수지는 NovaBiochem, Advanced ChemTech 및 Rapp Polymere를 비롯한 다수의 회사로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 이러한 수지에는 아미노-텐타겔(Tentagel) 및 아미노 메틸화 폴리스티렌 수지가 포함된다.
링커는 다양한 조건하에 절단될 수 있으며, 본 발명에 사용하기 위해 선택된 링커는 다양한 조건하에 절단될 수 있다.
상기 링커는 지지체와 링커 작용기 사이에 스페이서를 추가로 포함한다. 상기 스페이서는 흡착과 탈착 과정에서 입체 장애를 피하기 위해 포함될 수 있다. 일반적으로, 상기 스페이서는 짧고 가요성인 알킬기이다.
다른 형태를 포함함
전술한 것에는 이러한 치환기의 잘 알려진 이온 형태, 염 형태, 용매화물 형태 및 보호된 형태가 포함된다. 예를 들어, 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV)에서 치환기 카복실산(-COOH)이라고 언급한 것은 그 음이온 (카복실레이트) 형태(-COO-), 염 또는 용매화물뿐만 아니라, 통상적인 보호된 형태도 포함한다. 마찬가지로, 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV)에서 치환기 아미노기라고 언급한 것은 아미노기의 양성자화 형태(-N+HR1R2), 염 또는 용매화물(예를 들어, 염산염)뿐만 아니라, 아미노기의 통상적인 보호된 형태도 포함한다. 마찬가지로, 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV)에서 치환기 하이드록실기라고 언급한 것은 하이드록실기의 음이온 형태(-O-), 염 또는 용매화물뿐만 아니라, 통상적인 보호된 형태도 포함한다.
이성체
특정 화합물은 시스 및 트랜스 형태; E 및 Z 형태; c, t 및 r 형태; 엔도 및 엑소 형태; R, S 및 메소 형태; D 및 L 형태; d 및 l 형태; (+) 및 (-) 형태; 케토, 에놀 및 에놀레이트 형태; 신 및 안티 형태; 향사 및 배사 형태; α및 β 형태; 축 및 적도 형태; 보트, 체어, 트위스트, 엔벨로프 및 하프체어 형태; 및 이들의 조합(이하, "이성체"(또는 "이성질 형태")라 총칭함)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 기하이성체, 광학이성체, 거울상이성체, 부분입체이성체, 에피머, 입체이성체, 호변이성체, 입체구조 형태 및 아노머 형태로 존재할 수 있다.
화합물이 결정질 형태로 존재할 경우, 이것은 다수의 다양한 다형체 형태로 존재할 수 있다.
호변이성체 형태에 대해 후술하는 것을 제외하고는, 본원에서 사용되는 "이성체"란 용어로부터 구조(structural 또는 constitutional) 이성체(즉, 단순히 원자의 공간적 위치에 의해서가 아니라 원자 간의 결합에 있어서 상이한 이성체)는 구체적으로 배제된다는 점에 유념해야 한다. 예를 들어, 메톡시기(-OCH3)가 그 구조 이성체인 하이드록시메틸기(-CH2OH)를 지칭하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 마찬가지로, 오르토클로로페닐이 그 구조 이성체인 메타클로로페닐을 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다. 그러나, 구조의 부류를 언급한 것은 그 부류에 속하는 구조적으로 이성질인 형태를 충분히 포함할 수 있다(예를 들어, C1-7알킬은 n-프로필 및 이소-프로필을 포함하고; 부틸은 n-, 이소-, sec- 및 tert-부틸을 포함하며; 메톡시페닐은 오르토-, 메타- 및 파라-메톡시페닐을 포함함).
상기 배제는, 예를 들어 하기 호변이성체 쌍: 케토/에놀, 이민/에나민, 아미드/이미노 알코올, 아미딘/아미딘, 니트로소/옥심, 티오케톤/엔티올, N-니트로소/하이드록시아조 및 니트로/애시-니트로에서와 같이, 호변이성체 형태, 예를 들어, 케토-, 에놀- 및 에놀레이트 형태에는 적용되지 않는다.
"이성체"란 용어에는 구체적으로 하나 이상의 동위 원소 치환을 갖는 화합물이 포함된다는 점에 주목해야 한다. 예를 들어, H는 1H, 2H(D) 및 3H(T)를 비롯한 임의의 동위 원소 형태일 수 있고; C는 12C, 13C 및 14C를 비롯한 임의의 동위 원소 형태일 수 있으며; O는 16O 및 18O를 비롯한 임의의 동위 원소 형태일 수 있고; 그 밖의 것도 마찬가지이다.
달리 명시하지 않는다면, 특정 화합물을 언급한 것은 그 (전체 또는 부분) 라세미체 및 다른 혼합물을 비롯한 이러한 모든 이성체 형태를 포함한다. 이러한 이성체 형태의 제조 방법(예를 들어,　비대칭 합성) 및 분리 방법(예를 들어, 분별 결정화법 및 크로마토그래피법)은 당업계에 공지되어 있거나 본원에 교시된 방법 또는 공지된 방법 채택하여 공지된 방식으로 용이하게 얻을 수 있다.
달리 명시하지 않는다면, 특정 화합물을 언급한 것은, 예를 들어 후술하는 것과 같은 그 이온, 염, 용매화물 및 보호된 형태뿐만 아니라 그 다양한 다형체 형태도 포함한다.
염 및 이온
예를 들어, 화합물이 음이온성이거나 음이온성일 수 있는 작용기를 가질 경우(예를 들어, -COOH는 -COO-일 수 있음), 염은 적절한 양이온과 함께 형성될 수 있다. 적절한 무기 양이온의 예는 알칼리 금속 이온, 예컨대 Na+ 및 K+, 알칼리 토금속 양이온, 예컨대 Ca2+ 및 Mg2+ 및 다른 양이온, 예컨대 Al3+를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 적절한 유기 양이온의 예로는 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예를 들어, NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 적절한 치환된 암모늄 이온의 예는 에틸아민, 디에틸아민, 디시클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민뿐만 아니라, 아미노산, 예컨대 라이신 및 아르기닌으로부터 유도된 것들이다. 일반적인 4차 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
화합물이 양이온성이거나, 양이온성일 수 있는 작용기를 가질 경우(예를 들어, -NH2는 -NH3 +일 수 있음), 염은 적절한 음이온과 함께 형성될 수 있다. 적절한 무기 음이온의 예는 하기 무기산, 즉, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산 및 아인산으로부터 유도된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 적절한 유기 음이온의 예는 하기 유기산, 즉, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 팔미트산, 락트산, 말산, 파모산, 타르타르산, 시트르산, 글루콘산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 아스파르트산, 벤조산, 신남산, 피루브산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세티옥시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이세티온산, 발레르산 및 글루콘산으로부터 유도된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 적절한 중합체 음이온의 예는 하기 중합체 산, 즉, 탄닌산, 카복시메틸 셀룰로스로부터 유도된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
보호된 형태
활성 화합물을 화학적으로 보호된 형태로 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 본원에서 사용될 때 "화학적으로 보호된 형태"란 용어는 하나 이상의 반응성 작용기가 바람직하지 않은 화학 반응으로부터 보호된, 즉, 보호된 또는 보호 기(마스킹된 또는 마스킹 기 또는 블로킹된 또는 블로킹 기라고도 함)의 형태인 화합물을 말한다. 반응성 작용기를 보호함으로써, 다른 비보호 반응성 작용기를 연루시키는 반응을 보호된 기에 영향을 주지 않고 수행할 수 있으며; 보호 기는 통상적으로 후속 단계에서 분자의 다른 부분에 실질적으로 영향을 주지 않고서 제거될 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌["Protective Groups in Organic Synthesis" (T. Green and P.　Wuts; 3rd Edition; John Wiley and Sons, 1999]을 참조할 수 있다.
예를 들어, 하이드록시기는 에테르(-OR) 또는 에스테르(-OC(=O)R)로서, 예를 들어, t-부틸 에테르; 벤질, 벤즈하이드릴(디페닐메틸), 또는 트리틸(트리페닐메틸) 에테르; 트리메틸실릴 또는 t-부틸디메틸실릴 에테르; 또는 아세틸 에스테르(-OC(=O)CH3, -OAc)로서 보호될 수 있다.
예를 들어, 알데하이드 또는 케톤 기는 각각 아세탈 또는 케탈로서 보호될 수 있으며, 이 경우 카보닐기(>C=O)는, 예를 들어 1차 알코올과의 반응에 의해, 디에테르(>C(OR)2)로 전환된다. 상기 알데하이드 또는 케톤 기는 산 존재하에 과량의 물을 사용한 가수분해에 의해 쉽게 재생된다.
예를 들어, 아민기는, 예를 들어, 아미드 또는 우레탄으로서, 예를 들어, 메틸 아미드(-NHCO-CH3); 벤질옥시 아미드(-NHCO-OCH2C6H5, -NH-Cbz)로서; t-부톡시 아미드(-NHCO-OC(CH3)3, -NH-Boc)로서; 2-비페닐-2-프로폭시 아미드(-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5, -NH-Bpoc)로서, 9-플루오레닐메톡시 아미드(-NH-Fmoc)로서, 6-니트로베라트릴옥시 아미드(-NH-Nvoc)로서, 2-트리메틸실릴에틸옥시 아미드(-NH-Teoc)로서, 2,2,2-트리클로로에틸옥시 아미드(-NH-Troc)로서, 알릴옥시 아미드(-NH-Alloc)로서, 2(-페닐설포닐)에틸옥시 아미드(-NH-Psec)로서; 또는 적절한 경우, N-옥시드(>NOㆍ)로서 보호될 수 있다.
예를 들어, 카복실산기는 에스테르로서, 예를 들어, C1-7알킬 에스테르(예를 들어, 메틸 에스테르; t-부틸 에스테르); C1-7할로알킬 에스테르(예를 들어, C1-7트리할로알킬 에스테르); 트리C1-7알킬실릴-C1-7알킬 에스테르; 또는 C5-20아릴-C1-7알킬 에스테르(예를 들어, 벤질 에스테르; 니트로벤질 에스테르)로서; 또는 아미드, 예를 들어, 메틸 아미드로서 보호될 수 있다.
예를 들어, 티올기는 티오에테르(-SR)로서, 예를 들어, 벤질 티오에테르; 아세트아미도메틸 에테르(-S-CH2NHC(=O)CH3)로서 보호될 수 있다.
아미노산으로부터 유도된 기를 언급할 때, 경우에 따라, 아미노-, 카복시- 또는 측쇄 작용기가 보호될 수 있다. 아미노기의 경우 보호기는 Fmoc, Boc, Ac, Bn 및 Z(또는 Cbz)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 상기 측쇄 또한 경우에 따라 보호될 수 있다. 상기 측쇄 보호기는 측쇄게 적절하게 Pmc, Pbf, OtBu, Trt, Acm, Mmt, tBu, Boc, ivDde, 2-ClTrt, t부티오(tButhio), Npys, Mts, NO2, Tos, OBzl, OcHx, Acm, pMeBzl, pMeOBz, OcHx, Bom, Dnp, 2-Cl-Z, Bzl, For 및 2-Br-Z로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 상기 카복시기는 메틸 에스테르와 같은 에스테르로서 보호될 수 있다.
바람직한 실시형태
본 발명의 제4 양태의 바람직한 화합물은 이하에 설명한다. 본 발명의 제4 양태의 화학식 (III) 및 (IV)의 화합물의 바람직한 실시형태는 또한 본 발명의 제1 양태의 컬렉션에 따른 화학식 (I) 및 (II)의 화합물 각각에 독립적으로 적용될 수 있다.
R2는 화학식 (III) 및 (I)의 화합물과 관련해서만 언급된다.
바람직한 실시형태는 또한 본 발명의 제3, 제9 및 제10 양태의 방법에 사용하기 위한 성분들에 독립적으로 적용될 수 있다.
이하의 바람직한 실시형태는 경우에 따라 임의의 조합으로 병용될 수 있다.
지지체
바람직하게는, 상기 지지체는 유리, 금, 폴리스티렌, 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드 또는 폴리(알콕시드)를 포함한다. 상기 지지체는 폴리사카라이드이고, 가장 바람직하게는 아가로스이다.
링커
상기 링커는 링커와 부착 지점 사이에 스페이서를 추가로 포함할 수 있다. 상기 스페이서는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴일 수 있다. 상기 스페이서는 임의로 치환된 C1-6알킬기일 수 있다.
상기 링커는 그 자체가 친화성 단편과 함께 지지체로부터 제거될 수 있는 분석용 링커일 수 있다. 이러한 링커는 당업계에 잘 알려져 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 상기 지지체와 함께 화학식 (V)으로 표시된다:
Figure pct00009
상기 식에서, 별표 "*"는 부착 지점이고, 상기 원은 지지체를 나타낸다.
R1a 및 R1b 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, 상기 링커는 바람직하게는 알데하이드 작용기화 링커로부터 유도된 링커이다. 이 링커는 지지체와 함께, 특히 포르밀 폴리스티렌, 텐타겔 아세탈 수지, (3-포르밀인돌릴)아세트아미도메틸 폴리스티렌 또는 가르너(Garner) 알데하이드 작용기화된 아미노-메틸화 폴리스티렌으로부터 유도될 수 있다.
R1a 및 R1b 중 하나가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, 바람직하게는 상기 링커는 화학식 (V)로 표시된다.
R2가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, 상기 링커는 바람직하게는 링커 아민 작용기화된 링커로부터 유도된다. 상기 링커는 상기 지지체와 함께, 특히 아미노-메틸화 폴리스티렌, 3-아미노-페녹시메틸 폴리스티렌, 아미노메틸 NovaGelTM, TentagelTM 아미노 에틸, 아미노 PEGA, [G 1,3]-아미노덴드리머 폴리스티렌, MBHA, 아미노-(4-메톡시페닐)메틸 폴리스티렌, 링크(Rink) 아미드 수지, 하이드록실아민 왕(Wang) 수지 및 설파밀 수지로부터 유도될 수 있다.
R4가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, 상기 링커는 바람직하게는카복시 작용기화된 링커로부터 유도된 링커이다. 상기 링커는 지지체와 함께, 특히 카복시폴리스티렌 및 TentagelTM 카복시 수지로부터 유도될 수 있다.
R 1a , R 1b , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 및 R 7
R1a, R1b, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 임의로 치환될 수 있거나 또는 경우에 따라 추가로 적절하게 치환될 수 있다.
상기 알킬기 C1-10알킬기, 바람직하게는 C1-6알킬기일 수 있다.
상기 아릴기는 C5-20아릴기, 바람직하게는 C5-7아릴기일 수 있다. 대안으로, 상기 아릴기는 C10-20아릴기일 수 있다.
상기 헤테로사이클릴기는 C5-20헤테로사이클릴기, 바람직하게는 C5-7헤테로사이클릴기일 수 있다. 대안으로, 상기 헤테로사이클릴기는 C10-20헤테로사이클릴기일 수 있다.
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상이 이들이 부착된 원자와 함께 고리를 형성할 경우, 이 고리는 바람직하게는 C5-20헤테로사이클릴기이다. 상기 C5-20헤테로사이클릴기는 C5-20아릴 치환기를 가질 수 있다.
바람직하게는, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개가 이들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성한다. 나머지 중 2개가 R2, R3, R4 및 R1a 또는 R1b로부터 선택될 경우, 그 2개를 함께 두 자리 치환기라 칭할 수 있다.
치환기 R1a, R1b, R2, R3 및 R4가 지지체에 부착된 링커를 포함하지 않을 경우, 상기 치환기는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴이다. 바람직하게는 상기 알킬 또는 아릴기는 치환된다.
상기 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴기는 화합물을 편재화하고/하거나 동정할 수 있도록 하는 분석용 표지를 포함할 수 있다. 상기 분석용 표지는, 예를 들어 분광분석적 방법에 의해 분석될 경우 특징적인 신호를 제공하는 기일 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 표지는 형광 표지이다. 부가적으로 또는 대안으로, 상기 표지는 방사성 동위원소를 비롯한 하나 이상의 동위원소에 의해 제공될 수 있다. 상기 표지는, 질량분광 분석법에 의해, 예를 들어 특유의 동위원소 패턴을 제공함으로써, 지지체로부터 절단되는 생성물의 검출 또는 확인을 보조할 수 있다. 상기 표지는 또한 NMR에 의한 분석을 보조할 수 있으며, 이 경우 표지 내의 동위원소는 NMR 스펙트럼에서 관찰된 신호의 강도를 증가시킬 수 있다. 표지에 사용하기 위한 동위원소의 예로는 2H(D) 및 13C를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 이러한 분석에 의하면, 지지체로부터 단편을 제거할 필요없이 화합물을 분석하는 것이 가능해진다.
상기 표지는 특징적인 IR 신축 주파수를 갖는 작용기를 포함할 수 있다. 상기 표지는 반응물와 반응할 수 있는 작용기를 포함할 수 있으며, 그 반응 생성물은 해당 화합물이 존재한다는 것을 나타낼 수 있다. 상기 반응 생성물은 눈으로 식별이 가능하도록 유색 생성물일 수 있다.
상기 표지는 이 표지에 부착된 지지체를 눈으로 볼 수 있도록 유색이거나 형광성 또는 발광성일 수 있다. 이러한 표지는 또한 지지체로부터 단편을 제거할 필요없이 화합물을 분석할 수 있게 해준다.
상기 화합물이 절단 가능한 링커를 포함할 경우, 상기 링커는 분석을 위해 절단되어 단편을 유리시킬 수 있다. 절단법은 링커와 관련하여 상기에 기재하였다. 대안으로, 표지 그 자체를 수지로부터 절단할 수 있다.
그 밖의 표지도 당업자에게 알려져 있다.
상기 아릴기는 형광성일 수 있다. 상기 아릴기는 파이렌일 수 있다. 바람직하게는 상기 파이렌은 하기 화합물의 군으로부터 선택된다:
Figure pct00010
(식 중, n은 0 또는 1이고, 별표는 부착 지점을 나타냄).
치환된 C1-20알킬, 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 치환된 C5-20아릴기는 아세탈, 헤미아세탈, 알콕시, 케탈, 헤미케탈, 옥소, 티온, 이미노, 포르밀, 할로, 하이드록시, 티오카복시, 티올로카복시, 이미드산, 하이드록삼산, 티오노카복시, 에테르, 니트로, 시아노, 에테르, 니트로, 니트로소, 아지도, 시아네이토, 이소시아네이토, 티오시아노, 이소티오옥타노, 시아노, 아실, 카복시, 에스테르, 아미도, 아미노, 구아니디노, 테트라졸릴, 이미노, 아미딘, 아실아미도, 우레이도, 아실옥시, 티올, 디설파이드, 티오에테르, 설폭시드, 설포닐, 티오아미도, 설피닐옥시, 설페이트, 설폰아미도, 설포네이트, 설프아미노, 포스피노, 포스포, 포스피닐, 포스폰산, 포스포네이트, 포스페이트, 인산, 아인산, 포스포아미다이트, 포스포아미데이트, 실릴, 옥시실릴, 실록시, 옥시실록시 및 설폰아미노로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 또한, 알킬 치환기는 그 자체가 아릴 또는 헤테로사이클릴 기로 치환될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다.
가장 바람직하게는, 상기 치환된 C1-20알킬, 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 치환된 C5-20아릴기는 하이드록시, 할로, 니트로, 설폰산, 설폰아미도, 옥소, 티온, 카복시, 아미노, 보론산, 아미도, 티오아미도로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된다. 또한, 알킬 치환기는 그 자체가 아릴 또는 헤테로사이클릴 기로 치환될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다.
바람직한 아릴 및 알킬 치환기는 그 자체가 바람직한 치환기 리스트로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
R 1a 및 R 1b
R1a 및 R1b가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, R1a 및 R1b는 둘 다 수소일 수 있다.
바람직하게는, R1a는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 치환기이다.
R1b가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 치환기가 아닌 경우, 바람직하게는, R1b는 수소이다.
바람직하게는, R1b는 수소이다.
R1a 또는 R1b 중 하나가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, R1a 또는 R1b는 독립적으로 하기 표에 기재된 치환기 리스트로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00011
R 2
R2가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, R2는 하기 표에 기재된 치환기 리스트로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
상기 표에서, G는 아미노산의 측쇄를 나타낸다. 예를 들어, 글리신의 경우 G는 -H이고, 알라닌의 경우 G는 -CH3이다. G는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산의 측쇄일 수 있다. 바람직하게는, 상기 측쇄는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 또는 발린이다. R2 아미노산은 L- 또는 D-아미노산으로부터 유도될 수 있다.
R2가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, 가장 바람직한 치환기는 하기 표에 기재된 리스트로부터 선택된다:
Figure pct00016
R 3
R3이 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, R3은 하기 표에 기재된 리스트로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00017
R 4
R4가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, R4는 하기 표에 기재된 치환기 리스트로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
상기 표에서, G는 아미노산의 측쇄를 나타낸다. 예를 들어, 글리신의 경우 G는 -H이고, 알라닌의 경우 G는 -CH3이다. G는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산의 측쇄일 수 있다. 바람직하게는, 상기 측쇄는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 또는 발린의 측쇄이다.
R4가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기인 경우, 가장 바람직한 치환기는 하기 표의 리스트로부터 선택된다:
Figure pct00021
컬렉션
본 발명은 화합물의 컬렉션 또는 라이브러리에 관한 것이다. 상기 컬렉션의 각각의 구성원은 화학식 (I) 또는 (II) 중 하나로 표시된다. 라이브러리 내 화합물의 다양성은 하나 이상의 치환기의 실체에 있어서 상이한 화합물의 존재를 반영할 수 있다. 상기 라이브러리 내의 구성원의 수는 변이체의 수 및 각 변이체에 대한 가능성의 수에 따라 달라진다. 예를 들어, 치환기 R2, R3 및 R4가 각각의 치환기에 대해 3 가지의 가능성으로 변화될 경우, 라이브러리는 27종의 화합물(3×3×3)을 포함할 것이다. 라이브러리는 이하에 기재하는 바와 배열될 수 있는 1,000, 5,000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000종의 화합물 이상을 포함할 수 있다. 대안으로, 상기 라이브러리는 96종 화합물 또는 그 배수를 포함할 수 있다.
화학식 (I) 및 (II)의 화합물의 컬렉션은, 예를 들어 튜브 또는 웰 중에서 별개의 용매 부피 중에 유지될 수 있다. 대안으로, 상기 컬렉션은 경우에 따라 별개의 입자로서, 또는 별개의 겔로서 유지될 수 있다. 화합물의 컬렉션은 바람직하게는 별개의 위치에, 예를 들어 개개의 핀/크라운 또는 비드 상에 결합된다. 화합물의 컬렉션은 라이브러리에 적절한 크기인 플레이트 상에 제공되거나, 또는 표준 크기의 다수의 플레이트(예를 들어 96웰 플레이트) 상에 제공될 수 있다. 라이브러리 구성원의 수가 많다면, 플레이트 상의 각각의 웰이 라이브러리 유래의 다수의 관련 화합물, 예를 들어 10∼100종의 화합물을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 유형의 화합물 그룹화의 한 가지 가능성은 치환기의 부분 집합만을 알고 있고 나머지는 무작위 할당하는 경우인데, 이 배열은 반복 스크리닝 공정에 유용하다(하기 참조). 이 라이브러리는 잘 알려진 다른 형태로도 제공될 수 있다.
화합물의 제조
본 발명의 화합물은 일반적으로 다성분 반응을 이용하여 제조한다. 본 발명에 사용하기에 가장 바람직한 반응 종류는 Ugi계 반응 및 파세리니(Passerini)계 반응이다.
일반적으로, Ugi 반응은 통상적으로 하나의 반응 용기에서 알데하이드 작용기화 반응물, 카복실산 작용기화 반응물, 아민 작용기화 반응물 및 이소니트릴 작용기화 반응물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 파세리니 반응은 통상적으로 하나의 반용 용기에서 알데하이드 작용기화 반응물, 카복실산 작용기화 반응물 및 이소니트릴 작용기화 반응물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
Ugi 반응과 같은 다성분 성분 반응은 보다 통상적인 '2성분' 방법에 비해 많은 뚜렷한 장점을 갖는다. 첫째, 다성분 반응에 의하면 3종 또는 4종(또는 그 이상)의 반응물(그 각각을 체계적으로 변화시킬 수 있다)을 도입하는 것에 의해 리간드의 다양성을 더 크게 할 수 있어서, 최종 리간드 구조에 매우 다양한 미묘한 변화를 유발할 수 있다. 신속한 화학적 치환 과정의 명백한 용이성이 조합 기법에 도움이 되어, 비교적 단시간 내에 쉽게 조사할 수있는 "화학적 공간"을 크게 증가시킬 수 있는데, 다시 말해서, 간단한 몇 단계로 막대한 수의 화합물을 생성하는 것이 가능하다. 따라서, '더 성긴 그물'을 던져 화학적 가설을 탐색하는 것이 가능하고, 한정된 세트의 매우 다양한 화합물에 기초하는 보다 전통적인 '샷건(shot-gun)' 접근법에 대한 실효성 있는 대안을 제공하는 것이 가능하다. 이러한 특정 다성분 화학법에 적합한 시판되는 화합물의 수를 간단히 조사하는 것이, 이러한 접근법이 스캐폴드 다양성 및 신규 친화성 흡착제로서의 적용을 증가시킬 수 있는 잠재력을 갖고 있음을 밝힌다(표 1). 둘째, 다성분 반응의 "원포트(one-pot)" 특성으로 인해 시간, 반응물 비용 및 정제 기술 비용이 크게 절감되어, 수많은 화학적 가설을 더 효율적으로 조사할 수 있게 해준다. 반응물 수송의 신속성 및 화학적 다양성에 대한 요건이 단일 합성 단계에서 해결된다. Ugi 반응은 수렴형 합성의 좋은 예로서, 임의의 화학적 중간체를 단리하거나 확인할 필요없이 다양한 성분들 간에 다중 결합 형성을 가능하게 하기 때문에, 이로 인하여 이 공정은 조합 라이브러리 합성에 있어 매우 바람직하다.
ADC(Available Chemicals Directory)로부터 입수한 상업적으로 이용 가능한 Ugi 반응 성분의 현재 리스트
작용기 상업적 이용 가능성
1차/2차 아민 R-NH2 95,398
알데하이드 R-CHO 10,982
이소니트릴 R-NC 644
카복실산 R-COOH 2,158
화학적 성분들의 반응성이 가변적이라는 곤란한 문제점은 Ugi 반응에 있어 최종 화합물 수율에 훨씬 덜 심각한 영향을 미친다: 트립타민 및 티이라민과 같은 특정 아민은 트리아진 활성화 아가로스에 커플링될 경우 과반응성을 나타내어(비공개 문헌, Hussain 2001), 바람직하지 않은 이치환 반응 생성물을 초래하는 경향이 있다. 그러나, 다성분 반응 또는 Ugi 반응에서는, 이 반응이 등몰량의 4종의 성분 각각이 완전히 반응될 것을 요하기 때문에, 아민 반응성의 문제가 덜 중요해지게끔 한다. 반응물이 특히 비반응성일 경우, 반응은 임의의 유의적인 수준으로 진행되지 않을 것이다. 따라서, '부분 생성물' 또는 바람직하지 않은 부산물이 형성되지 않는다.
리간드 설계를 위한 Ugi 화학법의 또 다른 장점은 본래의 디펩티드 결합을 모방할 수 있는 스캐폴드의 잠재성에 있다. Ugi 스캐폴드와 비교하여, 본래의 디펩티드 결합 내 O1-N-O2 사이의 원자간 거리 계산값의 차이는 3개 원자 모두 사이의 1.0 Å보다 작으며, 이는 상기 스캐폴드가 본래의 디펩티드 결합을 정확히 모방할 수 있는 능력을 가질 수 있음을 시사한다. 또한, R4(카복실산) 및 R2(아민) 부분은 둘 다 스캐폴드로부터 돌출되어, 그 결과 크로마토그래피 매트릭스 표면으로 돌출되도록 제시된다는 점에 주목해야 한다. 따라서 이러한 2개의 작용기는 표적 상호작용을 위해 이용 가능한 결합 부위를 제공한다.
Ugi 반응
본 발명의 일 양태에 따르면, 화학식 (III)에 따른 화합물의 제조 방법이 제공된다. 상기 화합물은 다성분 Ugi 반응을 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 방법은 하기 성분 A, B, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서,
A는 R1aCOR1b이고;
B는 R2-NH2이며;
C는 R3-NC이고;
D는 R4-COOH이며;
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되고, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되며, R2는 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)로부터 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결된다.
일 실시형태에서, 상기 반응의 화합물은 하나의 반응 용기에서 모든 반응물들을 혼합하여 제조할 수 있다. 대안으로, 아민 및 알데하이드/케톤 성분(각각 B 및 A)을 미리 반응시켜 이민 중간체를 형성한 후, 나머지 카복실산 및 이소니트릴 반응물 (각각 D 및 C)을 첨가해도 좋다. 바람직하게는, 이러한 반응은 원포트로 수행된다.
R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 2개 이상이 연결될 경우, 해당 반응물을 2개의 치환기가 연결될 때와 같이 두 자리 반응물이라 칭하거나, 3개의 치환기가 연결될 때와 같이 세 자리 반응물이라 칭할 수 있다.
A, B, C 또는 D가 추가의 작용기를 포함할 경우, 이 기는 보호된 형태로 존재할 수 있다. 보호기의 예는 상기에 기재하였다. 이 보호기는 스캐폴드 생성물이 형성된 후 제거될 수 있다. 예를 들어, 반응물 B는 카복실산기를 가질 수 있다. 이 기는 유리 산(COO-) 또는 에스테르(COOMe)로서 보호될 수 있으며, 이것은 필요할 때 산으로 가수분해될 수 있다. 반응물 D는 아미노기(-NH2)를 가질 수 있다. 이 기는 Fmoc(-NHFmoc)로 보호될 수 있다. 이 보호기는 나중에, 예를 들어 피리딘 또는 DBU에 의해 제거될 수 있다.
아미노산 성분이 반응물 B 및 D로서 사용될 수 있다. 아미노산의 적절히 보호된 형태(이때, 아미노-, 카복시- 또는 측쇄 작용기가 경우에 따라 보호됨)는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적 공급업체, 예를 들어 Aldrich 및 Novabiochem으로부터 쉽게 입수할 수 있다.
A가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기일 경우, R1a 또는 R1b 중 하나는 특히 포르밀 폴리스티렌, 텐타겔(tentagel) 아세탈 수지, (3-포르밀인돌릴)아세트아미도메틸 폴리스티렌 또는 가르너(Garner) 알데하이드 작용기화 아미노-메틸화 폴리스티렌일 수 있다.
R1a, R1b, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7에 대해 바람직한 것은 상기 화학식 (I) 및 (III)의 화합물과 관련하여 기재된 것과 동일하다.
리간드 및 지지체에 대해 바람직한 것은 전술한 화합물 및 컬렉션에 대한 링커 및 지지체와 관련하여 기재된 것과 동일하다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 물질에 대해 친화성을 갖는 것으로 확인된 화합물을 제조하는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 A, B, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계를 포함한다. 이들 성분 중 하나는 라이브러리 구성원의 링커의 구조적 또는 기능적 유사체일 수 있다. 예를 들어, 상기 링커가 아릴기를 포함할 경우, 상기 유사체는 아릴기를 포함할 수 있다.
파세리니 반응
본 발명의 일 양태에 따르면, 화학식 (IV)의 화합물의 제조 방법이 제공된다. 상기 화합물은 다성분 파세리니 반응을 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 방법은 하기 성분 A, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서
A는 R1aCOR1b이고;
C는 R3-NC이며;
D는 R4-COOH이고;
R1a, R1b, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되고며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결된다.
R1a, R1b, R3 및 R4 중 2개 이상이 연결될 경우, 해당 반응물은 2개의 치환기가 연결될 때와 같이 두 자리 반응물로 칭해지거나, 3개의 치환기가 연결될 때와 같이 세 자리 반응물로 칭해질 수 있다.
A, C 또는 D가 추가의 작용기를 포함할 경우, 이 기는 보호된 형태로 존재할 수 있다. 보호기의 예는 상기에 기재하였다. 이 보호기는 스캐폴드가 형성된 후 제거될 수 있다. 예를 들어, 반응물 D는 아미노기(-NH2)를 가질 수있다. 이 기는 Fmoc(-NHFmoc)에 의해 보호될 수 있다. 이 보호기는 나중에, 예를 들어 피리딘 또는 DBU에 의해 제거될 수 있다.
R1a, R1b, R3 및 R4에 대해 바람직한 것은 상기 화학식 (II) 및 (IV)의 화합물에 대해 기재된 것과 동일하다.
리간드 및 지지체에 대해 바람직한 것은 전술한 화합물 및 컬렉션에 대한 링커 및 지지체와 관련하여 기재된 것과 동일하다.
컬렉션의 제조
화학식 (III) 및 (IV)의 화합물을 제조하기 위한 상기에 기재된 방법은 화학식 (I) 및 (II)의 화합물의 컬렉션의 제조에 적용될 수 있다. 컬렉션의 구성원은, 예를 들어 조합 화학 분야에서 통상적인 기법을 이용하여, 동시에 제조될 수 있다. 이러한 공정들은 당업계에 잘 알려진 기법을 이용하여 자동화할 수 있다.
분석
화학식 (III) 및 (IV)의 화합물은 특히 IR, NMR[특히 겔상 및 마법의 각도 스핀(magic angle spinning; MAS) 기법) 및 원소 분석에 의해 분석할 수 있다. 링커가 절단 가능한 링커일 경우, 이 링커를 절단하여 지지체로부터 화합물을 유리시킬 수 있다. 유리된 화합물은 당업계에 통상적인 기법, 예를 들어 LC-MS, HPLC, NMR, 원소 분석, IR, TLC 및 중량 측정 분석법을 이용하여 분석하여, 화합물의 실체와 그 양을 확인한 후, 고체 지지체 상의 재료의 실체와 그 양을 확인할 수 있다.
또한, 컬렉션의 개개의 구성원을 전술한 기법으로 분석할 수 있다. 구성원의 분석은 자동화할 수 있다.
링커 및 R1a, R1b, R2, R3 및 R4 기와 관련하여 상기에 기재된 바와 같이, 이들 중 어느 하나는 반응 방법 및 반응 생성물의 실체 및 양의 확인 및 정량을 보조하기 위한 분석용 마커를 포함할 수 있다.
화합물 및 컬렉션의 용도
본원에 기재된 화합물 및 컬렉션은 정제 방법에 사용될 수 있다. 이 화합물은 또한 분석용 또는 진단용 장치에 도입될 수 있다.
상기 화합물은 물질의 입체구조 형태에 맞는 리간드를 동정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 텔로미어 유사 DNA 부분 상의 G-사중 가닥 구조에 맞는 리간드를 동정하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 화합물은 상기 물질의 다른 입체구조 형태에 비해 한 입체구조 형태에 선택적일 수 있다.
물질과 리간드 간의 결합은 수많은 방법 중 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 물질 그 자체가 식별이 가능한 표지일 수 있다.
컬렉션 내의 화합물은, 예를 들어 표면 상에 또는 웰 플레이트의 웰 사이에 공간적으로 배치될 수 있다.
본 발명은 또한 생물학적 활성 화합물을 발굴하기 위해 화학식 III 및 IV의 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 스크리닝은 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 또는 단백질과의 결합 상호작용을 평가하거나, 또는 단백질-단백질 또는 핵산-단백질 상호작용, 예를 들어 전사 인자 DP-1과 E2F-1의 상호작용, 또는 에스트로겐 반응 요소(ERE)와 인간 에스트로겐 수용체(호르몬에 의해 활성화되는 인자로서 작용하는 66 kd 단백질, 그 서열은 당업계에 공개되어 있고 널리 이용 가능함)와의 상호작용을 평가하기 위한 것일 수 있다. 상기 스크리닝은 표적 거대분자를 상기에 기재된 개개의 화합물 또는 어레이 또는 라이브러리와 접촉시키거나, 웰을 가장 큰 효과를 나타내는 화합물의 혼합물과 접촉시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 효과는 단순히 세포에 대한 해당 화합물의 세포독성일 수도 있고 핵산에 대한 화합물의 결합일 수도 있다. 단백질-단백질 또는 핵산-단백질 상호작용에 있어서는, 상기 효과는 조사된 상호작용의 파괴일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 진단 방법에 있어서의 화학식 III 및 IV의 화합물의 용도에 관한 것이다. 의학적 상태의 지표자인 것으로 알려진 DNA 또는 단백질의 확인된 서열에 결합하는 화학식 III 및 IV의 화합물은 진단 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은, 예를 들어 컬럼에서, 화학식 III 및 IV의 고정화된 화합물 상에, 예를 들어 적절히 처리된 혈액 또는 조직 추출물의 시료를 통과시키는 단계 및 그 후 화학식 III 및 IV의 화합물에 대한 표적 DNA의 임의의 결합이 발생했는지를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 확인 단계는 화합물 III 및 IV에 결합하는 것으로 알려진 표지된 표적 DNA의 기지량을 상기 컬럼에 통과시키고 결합되지 않은 채로 남은 화합물 III 및 IV의 양을 계산함으로써 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 표적 검증에 있어서의 화학식 III 또는 IV의 화합물의 용도에 관한 것이다. 표적 검증은 확인된 DNA 서열을 파괴하여 그 서열의 기능을 확인하는 것으로서, 화학식 III 또는 IV의 화합물을 사용하여 확인된 서열에 선택적으로 결합시켜 그 기능, 즉 기능성 게놈을 파괴할 수 있다. 화학식 (I) 및 (II)의 화합물의 컬렉션도 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 혼합물로부터 오염물을 정제하는 방법을 제공한다. 화합물은 혼합물 중의 오염물을 고정화할 수 있다. 혼합물로부터 오염물을 제거하게 되면 혼합물이 정제된다. 이러한 방법은 각각 상이한 오염물에 대한 친화성을 갖는 여러 종의 화합물을 사용하는 것을 포함한다.
이 방법은 혼합물을 여러 종의 화합물과 일 단계로 접촉시킴으로써 복수의 오염물을 동시에 제거하는 것을 포함할 수 있다. 이는 혼합물 정제 시간을 개선시킴으로써 처리율을 증가시킬 수 있다.
화합물의 라이브러리는 상업적 공급업체로부터 입수하거나 본원에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
정의
물질
본 발명은 혼합물로부터 물질을 정제하는 방법 및 물질에 대한 친화성 리간드를 동정하는 방법을 제공한다.
상기 물질은 혼합물로부터 단리할 것이 요망되는 바람직한 임의의 실체일 수 있다. 상기 물질은 또한 이에 결합할 수 있는 화합물을 확인할 것이 요망되는 임의의 실체일 수 있다.
상기 물질은 소형 또는 대형 유기 분자(각각 500 달톤 미만 및 500 이상), 거대분자, 중합체, 예컨대 핵산 또는 펩티드, 또는 복합체, 예컨대 박테리아 또는 바이러스와 같은 세포일 수 있다.
상기 물질은 생물학적 활성을 갖는 화합물일 수 있다. 상기 물질은 천연 분자의 구조적, 조절성 또는 생화학적 기능을 가질 수 있다. 상기 물질은 대사산물, 약물, 효소, 메신저 등일 수 있다.
바람직하게는 상기 물질은 핵산, 펩티드, 사카라이드, 또는 폴리케티드 또는 지질(글리코실화 형태를 포함함)이다.
바람직하게는 상기 물질은 효소 억제제, 조절 효소, 호르몬 결합성 단백질, 비타민 결합성 단백질, 수용체, 렉틴 및 당단백질, RNA 및 DNA, 박테리아, 바이러스 및 파지, 마이코플라즈마, 세포 및 천연 및 인공 공급원으로부터 유도된 유전자 조작된 단백질 생성물(예를 들어 HIS 태그 접합 단백질)일 수 있다.
핵산 및 펩티드
펩티드는 폴리펩티드, 예컨대 펩티드, 리보솜 펩티드, 비리보솜 펩티드, 펩톤및 이들의 번역후 변형 형태뿐만 아니라, 이들의 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다.
펩티드 특히 효소, 항체 또는 수용체일 수 있다. 펩티드는 임의의 크기일 수 있다. 펩티드는 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 일반적으로 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
"항체"란 용어는 광의의 의미로 사용되며, 구체적으로 단일클론 항체(효현제 및 길항체 항체를 포함함) 및 다중 에피토프 특이성을 가즌 항체 조성물을 포함한다. 본원에서 단일클론 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유도된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 해당 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유도된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 해당 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린) 및 이러한 항체의 단편(이것이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한)을 포함한다[Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851 (1984)].
상기 펩티드는 포유동물 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 폴리펩티드, 또는 인간 폴리펩티드와 높은 서열 동일성(예를 들어, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과의 동일성)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
포유동물 폴리펩티드의 예로는 분자, 예를 들어, 레닌; 인간 성장 호르몬 또는 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 1-안티트립신; 인슐린 A쇄; 인슐린 B쇄; 프로인슐린; 트롬보포이에틴; 여포 자극 호르몬; 캘시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화 인자, 예컨대 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직 유형 플라스미노겐 활성화 인자(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; ErbB2 도메인(들)에 대한 항체, 예컨대 2C4(WO 01/00245; 하이브리도마 ATCC HB-12697)(ErbB2의 세포외 도메인의 영역(예를 들어, ErB2의 약 22번 내지 약 584번 잔기에 이르는 영역 내의 임의의 하나 이상의 잔기)에 결합하는 것); 엔케팔리나제; 뮐러리안(mullerian) 억제 물질; 릴랙신 A쇄; 릴랙신 B쇄; 프로릴랙신; 마우스 성선 자극 호르몬 관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNA 분해 효소; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경 영양 인자, 예컨대 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF; 카디오트로핀(심비대 인자), 예컨대 카디오트로핀-1(CT-1); 혈소판 유래 성장 인자(PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피세포 성장 인자(EGF); 변환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타(TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 또는 TGF-5를 포함함); 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I); 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골 유도 인자; 면역독소; 골 형태 형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 소 혈청 알부민(BSA); 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨(IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10; 항HER-2 항체; Apo2 리간드(Apo2L); 슈퍼옥시드 디스뮤타제; T 세포 수용체; 표면 막 단백질; 분해 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어, AIDS 외피의 일부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 항체; 및 상기에 열거된 폴리펩티드 중 언 것의 단편을 포함한다.
본 발명에 사용하기에 바람직한 물질은 혈액 단백질, 특히 응고 단백질, 가장 특히 인자 VII 및 인자 VIII과; 그 단편, 변이체 및 유도체이다.
다른 실시형태에서, 상기 물질은 면역글로불린, 바람직하게는 IgG일 수 있으며, 그 단편, 변이체 및 유도체일 수 있다.
핵산은 DNA, RNA뿐만 아니라 인공적 형태인 PNA, LNA, GNA 및 TNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 염기 및/또는 변형된 골격을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 임의의 크기일 수 있다.
상기 핵산은 센스 또는 안티센스 서열일 수 있다.
상기 DNA는 mtDNA, cDNA, 플라스미드, 코스미드, BAC, YAC 또는 HAC일 수 있다.
상기 RNA는 mRNA, piRNA, tRNA, rRNA, ncRNA, sgRNA, shRNA, siRNA, snRNA, miRNA, snoRNA 또는 LNA일 수 있다.
혼합물
"혼합물"이란 용어는 관심있는 물질을 포함할 수 있는 임의의 생물학적 시료를 의미할 수 있다. 혼합물은 체액, 예컨대 전혈 또는 전혈의 성분들(적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장을 포함함), 복수액, 뇨, 유리체액, 림프액, 활액, 난포액, 정액, 양수, 젖, 타액, 객담, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액 및 관심있는 피분석물을 포함할 수 있는 신체의 다른 구성성분뿐만 아니라, 조직 배양 배지 및 조직 추출물, 예컨대 균질화 조직 및 세포 추출물의 시료일 수 있다. 바람직하게는, 상기 시료는 임의의 동물 유래의 체시료이나, 바람직하게는 포유동물 유래, 더 바람직하게는 인간 피험체 유래의 체시료이다. 가장 바람직하게는, 이러한 생물학적 시료는 임상 환자 유래의 시료이다. 바람직한 생물학적 시료는 혈청, 혈장 또는 뇨이며, 더 바람직하게는 혈청이고, 가장 바람직하게는 임상 환자 유래의 혈청이다.
혼합물은 오염물을 함유할 수 있다. 상기 오염물은 원하는 물질과는 다른 재료이다. 상기 오염물은 원하는 폴리펩티드의 변이체(예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 변이체) 또는 다른 폴리펩티드, 핵산 등일 수 있다.
용리
화합물에 결합되는 또는 다른 방식으로 화합물에 회합되는 물질(이것을 친화성 리간드라 칭할 수 있음)은 용리제를 사용하여 화합물로부터 제거할 수 있다. 용리 혼합물은 지지체에 결합된 리간드와 물질 간의 상호작용을 파괴하기 위한 것이다. 상기 용리 혼합물은 리간드와 물질 간의 수소 결합 상호작용, 정전기 상호작용 및 소수성 상호작용을 파괴하도록 선택될 수 있다.
"용리 완충액"은 화합물로부터 관심있는 물질을 용리시키기 위해 사용될 수 있다. 용리 완충액의 전도성 및/또는 pH는 관심있는 물질이 지지체로부터 용리되도록 선택된다.
용리제는 상기 물질 및 상기 화합물의 해리 파라미터를 연구하는 방법의 일부로서 사용될 수 있다. 이 경우, 시간 경과에 따른 화합물로부터의 상기 물질의 유리를 모니터링한다.
친화성 리간드로부터의 물질의 분리 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.
분석
고정화된 리간드가 물질과 결합하는지를 확인하기 위한 방법은 다수가 있다.
화합물을 다른 화합물로부터 공간적으로 분리할 경우, 상기 물질을 최초로 포함했던 혼합물을 제거하고, 그 후 그 화합물을 용리 혼합물을 사용해서 세척하여 물질을 제거한다. 그 후, 용리 혼합물을 분석하여, 상기 물질이 존재하는지와 어느 정도로 존재하는지를 측정한다.
그러나, 본 발명의 컬렉션의 경우, 컬렉션의 개개의 구성원의 공간적 배열을 고려해 볼 때 이러한 분석이 비실용적 또는 불가능할 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 물질에는 방사능 표지를 할 수 있다. 과잉 혼합물이 제거되도록 컬렉션을 세척한 후, 이 컬렉션을 분석하여, 방사능의 위치 및 강도를 측정함으로써, 물질이 어느 리간드에 어느 정도로 결합했는지를 확인할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 물질 또는 리간드에 표지를 할 수 있다. 표지에 의해 발생된 신호는 리간드와 물질의 결합에 의해 켄칭될 수 있다. 미리 형성된 결합 복합체로부터의 물질과 경쟁하고 이것을 치환하는 테스트 물질을 첨가하면, 바탕값보다 높은 신호가 발생될 것이다. 이렇게 하여, 물질/리간드 상호작용을 파괴하는 테스트 물질을 확인할 수 있다.
대안으로, 리간드에 결합된 물질을 ELISA형 분석을 이용하여 검출할 수 있다.
화합물과 물질, 구체적으로 펩티드와의 상호작용은 또한 브래드포드(Bradford) 단백질 분석법을 이용하여 측정할 수 있다.
이러한 기법들과 기타 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.
분리
본 발명은 본 발명의 양태에 따라 혼합물로부터 물질을 분리하는 방법을 제공한다. 상기 혼합물을 본 발명의 화합물과 접촉시켜, 혼합물 중의 물질을 상기 화합물에 고정화할 수 있다. 그 후, 물질이 고갈된 혼합물을 제거할 수 있다.
상기 물질은 오염물일 수 있다. 대안으로, 상기 물질은 관심있는 분자일 수 있다. 상기 관심있는 분자는 상기 화합물을 용리제로 처리하여 상기 화합물로부터 수집할 수 있다.
상기 물질이 오염물일 경우, 상기 방법에 의하면 혼합물의 정제가 이루어진다. 혼합물로부터 1종 이상의 오염물을 정제한다는 것은, 조성물로부터 1종 이상의 물질을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 조성물 중의 관심있는 화합물의 순도를 증가시킨다는 것을 의미한다. "정제 단계"는 "균질한" 조성물을 산출하는 전체 정제 공정의 일부일 수 있으며, 본원에서는 "균질한" 조성물이란 표현을, 관심있는 화합물을 조성물의 총 중량을 기준으로 약 70 중량% 이상, 바람직하게는 약 80 중량% 이상 포함하는 조성물을 말할 때 사용한다.
분리 장치
본원에 기재된 화합물은 혼합물의 정제에 사용하기 위한 장치에 도입될 수 있다. 상기 장치는 오염물을 고정화하거나 또는 대안으로 원하는 물질을 고정화함으로써(이는 나중 시점에 장치로부터 유리될 수 있음) 혼합물을 정제하는 데 사용될 수 있다.
상기 분리 장치는 적절한 화합물이 충전된 크로마토그래피 컬럼의 형태를 취할 수 있다. 대안으로, 상기 장치는 적절한 화합물을 함유하는 필터층을 포함할 수 있다.
장치 내에서 상기 화합물은 별개의 입자로 존재할 수 있거나 또는 표면에 또는 다공성 매트릭스 내에 결합되어 있을 수 있다.
친화성 리간드를 포함하는 장치의 다른 유형은 당업자에게 명백할 것이다.
실험예
재료
모든 화학물질은 달리 명시하지 않는다면 시약 등급이었다. 티라민, 4-아미노벤즈아미드, 글루타르산, 2,4-피리딘 디카복실산, 이소프탈산, Boc-글루타민, 아세트산, 벤질아민, 아세트알데하이드, 이소프로필 이소사아나이드, 이소시아노-사이클로헥산, 에피클로로하이드린, 과요오드산나트륨, 인산수소이나트륨, 에틸렌 글리콜, 염화나트륨, 1-파이렌 메틸아민 및 1-파이렌 부티르산은 모두 Sigma-Aldrich(Gillingham, UK)로부터 입수하였다. 1-아미노-2-나프톨, 4-아미노페놀, 3-아미노페놀, 아미노-8-나프톨, 벤조산 및 수산화나트륨은 Acros Organics(Loughborough, UK)로부터 입수하였다. 4-하이드록시벤질아민은 Chontech, Inc.(Waterford, USA)로부터 입수하였다. Boc-글리신 및 1-아미노-2-프로판올은 Fluka(UK)로부터 입수하였다. 에탄올, 메탄올, 디클로로메탄 및 프로판-2-올은 모두 Fisher Chemicals(UK)로부터 입수하였다. 가교 결합된 아가로스(Sepharose CL-6B)는 G. E. Healthcare(Uppsala, Sweden)로부터 구입하였다. 인간 IgG(혼주 인간 혈장으로부터 유도된 순도 95% 이상의 것)는 Sigma(Dorset, UK)로부터 입수하였으며, hFab 및 Fc(인간 혈장으로부터 유도된 순도 95% 이상의 것)는 Calbiochem(Nottingham, UK)으로부터 입수하였다. 폴리프로필렌 컬럼(0.8×6.0 cm) 및 프릿은 Varian(Oxford, UK)으로부터 구입하였다. 96웰 표준 미량적정 플레이트 및 단백질 농도 측정을 위한 쿠마스 플러스 단백질 분석 시약(Bradford 분석)은 각각 Corning Incorporated(Fisher Scientific UK) 및 Pierce(UK)로부터 구입하였다.
장치
리간드 합성은 Hybaid Maxi 14 하이브리드화 오븐(Thermo Electron, UK)을 이용하여 수행하였다. 총 단백질 농도는, Coomassie PlusTM 단백질 분석 시약을 사용하고, Dynex Technologies에서 구입한 Opsys MR 플레이트 판독기로 595 nm 파장에서 시료의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 분자 이미지는 Molegro Virtual Docker 2007 소프트웨어 MVD v2.0.0(Molegro ApS - Bioinformatic Solutions(Denmark) 제품)을 이용하여 얻었다. 1H 및 13C 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼은 Joel JNM 람다 LA400 FT NMR 분광광도계를 사용하여 얻었다. 질량 스펙트럼은 영국 캠브리지 대학 화학 실험실에서 전자 충격 모드로 AEI MS30 또는 AEI MS50 질량 분광광도계에 기록하였다. 형광 분석은 올림푸스 CX40 현미경, 니콘 EFD-3 필터(λex=330∼380 nm), 니콘 수은 100W 램프 및 코닥 DC290 줌 디지털 카메라를 사용하여 수행하였다.
방법
IgG에 대한 친화성 리간드의 확인
IgG에 대한 가능한 친화성 리간드를 확인하기 위해 화합물을 컬렉션을 제조하였다. 이 화합물의 컬렉션은, Ugi 다성분 반응로 지지체에 부착된 알데하이드 작용기화 링커를 카복실산, 아민 및 이소니트릴과 반응시킴으로써 제조한 스캐폴드를 토대로 하였다. 그 후, 생성물을 IgG에 결합하는 능력에 대해 스크리닝하였다.
링커 및 지지체 제조
매트릭스 지지체 세파로스 CL-6B[수지(2), 반응식 1]는 중합체 망상구조 전반에 1차 말단 하이드록실기를 보유하는 고도로 가교된 다공성 비드(평균 입자 크기 95 ㎛)로서 공급되었다. 이 비드를, 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 리간드 스페이서 암을 첨가하여 추가로 변형시킬 수 있다:
반응식 1 - 알데하이드 활성화를 위해 세파로스 비드에 4C 스페이서 암을 첨가함(주: 명료성을 위해 1개의 작용기만을 표시함)
Figure pct00022
먼저, NaOH 존재하에 세파로스 비드를 에피클로로하이드린으로 처리하여 에폭시 활성화 수지(3)을 얻었다. 활성화 정도는 이 단계에서 첨가된 NaOH의 양에 의해 정확히 조절될 수 있다. '에폭시드 활성화 분석'은 수지(3)과 Na2S2O3를 항온처리한 후, 0.1 M HCl로 적정하는 단계를 필요로 하며, 이로써 비드의 에폭시드 함량이 1 μmolㆍg-1 수지로 확인된다. 수지(3)을 새로 제조한 5 M NaOH로 추가로 처리할 경우, 에폭시드 형태는 개환되어 디올 형태(4)를 생성한다. 그 후, 디올 형태(4)를 0.1 M NaIO4에 가하여, 디올 형태의 절단을 유발하였으며, 이로써 최종 알데하이드 활성화 수지(5)를 수득한다.
에폭시드 활성화 및 분석치 측정
세파로스 비드(200 g)[수지(2), 반응식 1]를 2등급 소결 유리 깔때기에 주입하여 '침강 겔' 점조도가 형성될 때까지 배액하였다. 이 시료를 칭량하여 비이커에 넣고, 멸균 탈이온수(200 ml)를 사용하여 50% 비드/물(v/v)로 슬러리화하였다. 그 후, 이 슬러리를 소결 유리 깔때기에 다시 주입하고, 수지가 잘 교반되도록 물(5×400 ml)로 철저히 세척한 후, 진공을 가하여 여과가 일어나도록 하였다. 마지막 세척시에는 '침강 겔' 점조도가 다시 얻어질 때까지 진공을 가하지 않은 채 중력하에(10분) 완전히 배액되도록 실시하였다. 세척된 수지를 물(100 mL)에 슬러리화하여 500 듀란 보틀로 옮겼다. 이 슬러리에 10 M NaOH(8 mL)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 온도를 34℃까지 높이고 반응 혼합물에 새로운 에피클로로하이드린(14 mL)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 3시간 동안 약하게 교반하면서 34℃에서 유지하였다. 이 시간 후, 듀란 보틀의 내용물을 2등급 소결 유리 깔때기에 주입하고 탈이온수(5×400 ml)로 세척하여, 에폭시드 활성화 수지를 수득하였다(잔류 에피클로로하이드린은 NaOH로 24시간 동안 처리한 후 안전하게 폐기 처분함). 수지가 침강되면, 전술한 에폭시드 활성화 분석을 적용하여 이 수지에 대해 에폭시드 밀도를 조사하였다. 1.3 M Na2S2O3를 사용한 적정에 의해 측정시 전형적인 활성화 수준 24.0 mmol/g(침강된 겔)이 얻어졌다.
시드-디올 활성화
에폭시드 활성화 수지[수지(3), 반응식 1](60 g)을 5 M NaOH(60 mL)로 처리하여 34℃에서 밤새 약하게 교반하였다. 이러한 염기 촉매를 사용한 공정은 에폭시드 고리를 서서히 가수분해하여 시스-디올 반응 생성물(4)이 형성되게 한다.
알데하이드 활성화
그 후, 디올 활성화 수지(4)(56 g)를 0.1 M NaIO4(100 ml)로 처리하여 30℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이 공정에 의하면 시스-디올이 절단되어, 말단 작용기화 알데하이드기가 남게 된다. 공기에 노출된 반응성 알데하이드는 산화되기 쉽기 때문에, 수지는 리간드 라이브러리 생성을 위해 즉시 제조하였다.
화합물 컬렉션의 제조
다수의 리간드를 동시에 생성하기 위해, 본 발명자들은 각각의 웰 바닥에 20 ㎛ 프로필렌 프릿을 포함하는 CaptivaTM 96웰 블록(영국 Varian 제품)을 사용하였다. 이로써 이러한 내화학성 블록 시스템은 반응 용기와 최종 반응 종료시에 후속 저장 시설을 구성하였다.
알데하이드 활성화 수지[수지(5), 반응식 1](36 g)에 대해 일련의 메탄올 세척을 수행하였다(10%에서 출발하여 100%까지 10%씩 메탄올 농도를 증가시킴). 수지에 의해 흡수되는 물을 점차적으로 대체하지 않고 100% 메탄올이 바로 차지한다면 아가로스 비드가 분해될 수 있기 때문에 상기 단계는 필요하다. 그 후, 메탄올 포화 수지(36 g)를 100% 메탄올(36 ml)에 슬러리화하여 약진탕의 쉐이커에 놓고 수지가 침강되는 것을 방지한다. 1 ml 슬러리 분액을 반응 블록(8×6)의 48웰에 더 쉽게 전달할 수 있도록 1 ml 글리슨(Gilson) 피펫 팁의 끝을 약 2 mm 절단하였다. 이 단계에서 가요성 말단 캡 매트를 분리하여 용매가 완전히 배액되고 수지가 블록에 침강되도록 하였다. 그 후, 말단 캡을 블록 바닥의 제자리에 단단히 재배치하였다.
일정 농도의 미리 선택한 제1 아민 성분(메탄올 중 5배 몰과량)(부피 0.25 ml)를 6웰의 첫번째 열에 위에서부터 아래로 첨가하였다(1, A→F). 제2의 상이한 아민 성분을 전술한 바와 같이 두 번째 열에 위에서부터 아래로 첨가하였다(2, A→F). 이 과정을, 총 8종의 상이한 아민이 각 열에 첨가될 때까지 반복하였다(라이브러리 성분 구조에 대해서는 하기 참조). 그 후, 윗쪽 캡 매트를 블록에 단단히 고정하여 200 rpm에서 1시간 동안 진탕시켰다. 이 절차에 의해 아민 성분이 공급된 수지 시료와 완전히 혼합되었다.
마찬가지로, 일정 농도의 미리 선택한 카복실산 성분(메탄올 중 5배 몰과량)(부피 0.25 ml)을 첫번째 행(A, 1→8)에 가로 방향으로 첨가하였다. 제2의 상이한 카복실산 성분을 두 번째 행(B, 1→8)에 가로 방향으로 첨가하였다. 이 과정을, 총 6종의 상이한 카복실산이 각 행에 가로 방향으로 첨가될 때까지 반복하였다(라이브러리 성분 구조에 대해서는 하기 참조). 마지막으로, 일정 분액(0.25 ml)의 이소프로필 이소시아나이트 성분(메탄올 중 5배 몰과량)을 48웰의 각 웰에 피펫으로 첨가하였다. 따라서, 2D 라이브러리 어레이의 구성을 위해, Ugi 반응에 관여하는 4종의 가능한 성분 중 2종만을 변경하였다.
그 후, 윗쪽 캡-매트를 반응 블록 상부에 단단히 고정하였다. 그 후, 전체 블록을 진탕 플랫폼(200 rpm)을 갖춘 50℃ 인큐베이션 오븐에 넣어 48시간 동안 두었다. 반응 시간 종료 후, 아랫쪽과 윗쪽 캡 매트를 조심스럽게 제거하고 10분 동안 웰 내용물을 배액하였다. 그 후, 얻어진 수지 시료로부터 미반응 시약이 제거되도록, 웰을 철저히 세척하였다(하기 참조).
반응 후, 유도치화된 세파로스 비드에 대해, 표적 스크리닝 전에 모든 미반응 화합물이 제거되도록 일련의 별도의 세척 단계(하기 참조)로 이루어진 철저한 세척 절차를 실시한다. 모든 세척 단계는 1) 100% MeOH; 2) 50% DMF + 50% MeOH(v/v); 3) 수중 50% DMF(v/v); 4) 물; 5) 0.1 M HCl; 6) 물; 7) 50% IPA 중 0.2 M NaOH; 8) 2× 물 및 9) 수중 20% EtOH(v/v)를 웰당 5 ml씩 사용하여 수행하였다. 그 후, 세척된 비드를 멸균 탈이온수 중 20% EtOH(v/v), 멸균 탈이온수 중)에 넣어 4℃에서 사용시까지 저장하였다.
이소니트릴 성분에 변화를 주기 위해, 전술한 바와 동일하게 하되 반응 블록의 상이한 위치에 상이한 이소니트릴 성분을 사용하여 동일한 라이브러리를 제조하였다. 이러한 방식으로, 상이한 이소니트릴 성분을 사용해서 다수의 다양한 라이브러리를 용이하게 생성할 수 있으며, 이로써 리간드 구조에 대한 3D 어레이를 효과적으로 제공할 수 있다.
라이브러리 성분
Figure pct00023
상기 표는 hIgG 결합형 Ugi 조합 라이브러리의 아민 성분들의 구조를 보여준다.
Figure pct00024
상기 표는 hIgG-결합 Ugi 조합 라이브러리의 카복실산 성분(C1-C6) 및 이소니트릴 성분(I1)의 구조를 보여준다(주: 이소프로필 이소시아나이드는 전체 조합 라이브러리에 대해 보존된 상태로 유지됨). * 디카복실산 성분을 먼저 등몰량의 NaOH와 항온처리하여(실온에서 10분), 세파로스 비드 상에 인접 형성된 스캐폴드 구조 간의 가교결합을 막을 수 있도록 이용 가능한 COOH 기 중 절반을 보호하였다. 반응후 세척은 효율적인 탈보호를 유발하여 최종 리간드 구조 내에 카복실산기를 드러내었다.
정성적 Ugi 리간드 형광 연구
전술한 바와 같은 알데하이드 활성화 세파로스 비드 CL-6B(26 μmolㆍg-1 습중량 겔)를 사용하여 리간드를 생성하였다(2.5 g, 수지 스케일). 메탄올(5.0 ml) 중에 용해된 아민계 파이렌 리간드 1-파이렌 메틸아민, Boc-글리신(카복실산 성분) 및 이소시아노-사이클로헥산(이소니트릴 성분)(사용된 모든 성분은 325 μmol(즉, 5배 몰과량, 2.5 g 스케일)을 상기 수지에 첨가하고 60 ml 사각 목 Nalgene 보틀에서 약진탕으로 50℃에서 42시간 동안 항온처리하였다. 아민 성분 4-아미노페놀(A5) 및 이소니트릴 성분 이소시아노-사이클로헥산을 사용하여 동일한 방식으로 카복실산계 파이렌 리간드(B, D)를 제조하였다. 항온처리 후, 비드를 (전술한 바와 같이) 조심스럽게 세척하고, 제조된 50% 슬러리 5.0 ㎕를 피펫을 이용하여 현미경 슬라이드에 올려 놓고, 올림푸스 CX40 현미경, 니콘 EFD-3 필터(λex=330∼380 nm), 니콘 수은 100W 램프 및 코닥 DC290 줌 디지털 카메라를 사용하여 관찰하였다.
크로마토그래피 스크리닝 프로토콜 및 총 단백질 정량
얻어진 합성 리간드 흡착제(0.4 ml 리간드 - 50%로 제조된 슬러리)를, 크로마토그래피 분석용으로 제조된 4.0 ml(0.8×6 cm) 폴리프로필렌 컬럼(200 ㎕ c.v.)에 중력으로 충전한 후[재생하고(0.1 M NaOH, 30% 이소프로판올, 10 c.v), 세척하고(멸균 탈이온 H2O, 10 c.v.), 평형화함(10 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.4, 10 c.v)], 로딩하였다(1 c.v, 평형화 완충액 중에서 재구성한 500 ㎍ㆍml-1 hIgG/hFab/hFc). 1 c.v. 분획을 수집하고(10× F.T., 10× 용리), 표준 브래드포드 분석 프로토콜(쿠마시 플러스 분석 시약, Pierce, UK)을 이용해서 분석하여 각각의 수집된 컬럼 분획의 총 단백질 함량을 측정하였다. 이러한 시료 표적 스크리닝 방법을 이하에서 표준 크로마토그래피 조건으로 언급한다.
용액상 합성
세파로스 비드는 고온(100℃ 이상), 비극성 용매 및 강무기산과 같은 가혹한 조건하에서의 손상에 취약하다. 따라서, 온화한 반응 조건이 라이브러리 합성 및 대규모 반응에 바람직한 조건으로 간주된다. Ugi 반응의 기본적 역학 특성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 허용 가능한 생성물 형성을 담보하기 위해 아세트산, 벤질아민, 아세트알데하이드 및 이소시아노-사이클로헥산을 함께 반응시킴으로써 용액상으로 온화한 반응 조건(메탄올 중 실온)을 이용하였다. 생성물(5)은 수율 68%(20% 고온 에탄올로부터 재결정화한 후)로 수득되었다. Ugi 부가생성물(5)의 실체는 각각 도 1(a) 및 (b)에 도시된 바와 같이 1H 및 13C NMR에 의해, 또한 질량 분광분석법에 의해 추가로 확인하였다(m.p 119∼120℃. m/z (EI) 303.41 (M+1, 100%). 실측치: M+1 303.2074. C18H27N2O2 이론치: 303.207253).
Figure pct00025
Ugi 스캐폴드 형성의 증거
인시추 Ugi 스캐폴드 형성의 증가는 "온비드" 형광 분석(도 2)을 통해 정성적으로 얻었다. 파이렌 함유 아민 성분(도 2a) 및 파이렌 카복실산 성분(도 2b)은 개별적으로 Ugi 스캐폴드로 도입하였고(각각 도 2c 및 d), 그 후 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다(도 2e 및 f). Ugi 스캐폴드로의 아민계 1-파이렌 메틸아민의 도입(도 2에 도시된 구조)는 고정화된 알데하이드 활성화 수지와 함께 이민이 형성되었다는 분명한 증거이며, 이것은 Ugi 반응 메커니즘에서 첫 번째로 인식되는 단계이다. Ugi 스캐폴드 내에 일체형 복합체를 형성하는 4종의 성분 중 마지막 성분이 카복실산 성분이며, 따라서 카복실산계 1-파리엔-부티르산 통합의 증거 또한 매트릭스 지지체 상에서 치환된 Ugi 리간드의 완전한 형성을 시사하였다. 또한 철저한 세척은, 성분들이 단순히 친수성 세파로스 비드 표면에 흡착되는 것이 아니도록 담보하였으며, 알데하이드 활성화 매트릭스 지지체에 파이렌 성분을 첨가하는 대조군 실험 역시 이 점을 확인해주엇다(데이터는 제시하지 않음).
도 2 - 인시추 Ugi 스캐폴드 형성의 정성적 증거에 사용된 형광 리간드. a) 1-파이렌 메틸아민; b) 1-파이렌 부티르산; c) Ugi 스캐폴드로 통합된 1-파이렌 메틸아민: Boc-글리신, 이소니트릴: 이소시아노-사이클로헥산); d) Ugi 스캐폴드 아민으로 통합된 1-파이렌 부티르산: 4-아미노페놀, 이소니트릴: 이소시아노-사이클로헥산; e) 1-파이렌 메틸아민 리간드의 형광 이미지(0.03초 노출, 10배 확대); f) 1-파이렌 부티르산 리간드의 형광 이미지(0.25초 노출, 10배 확대). 스케일 바(∼100 mm). 형광 관찰은 올림푸스 CX40 현미경, 니콘 EFD-3 필터(λex=330∼380 nm), 니콘 수은 100W 램프 및 코닥 DC290 줌 디지털 카메라를 사용하여 수행하였다.
합리적 라이브러리 설계
라이브러리 성분의 선택은, 최근의 과학 문헌으로부터 입수한 리간드 정보와 함께 영국 캠브리지 대학 생명공학 연구소에서 최초로 동정한 종래에 알려진 면역글로불린 결합성 리간드에 기초하였다.
친화성 크로마토그래피를 통해 전체 IgG 정제 및 단편화 IgG 정제 둘 다에 성공적인 것으로 입증된 다양한 트리아진계 조합 라이브러리로부터 다수의 선도 리간드가 발견되었다. 인공 단백질 A(ApA) 리간드(Li et al., 1998)는 인간 혈장으로부터 hIgG를 절대 순도 98%로 용리시켰으며, 습중량 겔 g당 20.0 mg IgG의 결합능을 나타내었다. 이 리간드는 (스타필로코커스 유래의) 천연 단백질 A(SpA)의 단편 B 내의 나선 끝에 위치한 연속형 Phe132-Tyr133 디펩티드를 모방하는 것으로 생각된다. 천연 단백질의 이러한 특정 영역이 주로 소수성 상호작용을 통해 IgG의 CH2 및 CH3 도메인에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, ApA는 종래의 Fc 결합 부위와 대안의 Fab 결합 부위 둘 다에서 IgG에 결합하는 능력을 갖는다(Hillson et al., 1993).
이 연구에서, Ugi 리간드는 특이적 Fab 및 Fc 결합 리간드 이외에도 전체 hIgG에 결합하는 것으로 확인되었다. ApA 유사 상호작용을 모방하도록 선택된 이러한 조합 라이브러리의 성분들로는 벤조산(C5), 티라민(A1), 4-아미노페놀(A5), 3-아미노페놀(A6) 및 4-하이드록시벤질아민(A7)을 들 수 있다.
트리아진계 면역글로불린 특이적 리간드는 이하에 예시된다. (A) 인공 단백질 A; (B) 최적화된 IgG-결합 리간드 22/8; (C) PpL 생체 모방 리간드 8/7. 주: 사용된 리간드 명칭은 조합 트리아진 라이브러리 성분을 말하는 것이다.
Figure pct00026
관련 리간드 구조의 의도적 편향 조합 라이브러리를 사용하여 수년에 걸쳐 단계적인 최적화 절차를 수행한 결과(Teng et al., 1999), ApA 리간드는 가까이 이웃한 트리아진 리간드 22/8로 구조적으로 진화하였다(Teng et al., 2000). 이 소수성 리간드 22/8은, 사용된 용리 완충액의 pH 값에 따라 hIgG를 회수율 67∼69%, 순도 97∼99%로 용리시키는 것으로 확인되었고, 종래의 ApA 리간드에 비해 훨씬 더 높은 개선된 결합능, 즉 습중량 겔 g당 51.9 mg IgG를 나타내었다. 또한, 리간드 22/8은 ApA 및 SpA와 유사한 방식으로 Fab 및 Fc 단편에 결합하는 것으로 나타났다.
리간드 22/8에 의해 나타나는 상호작용을 모방하도록 상기 라이브러리에 도입된 성분들로는 아민: 티라민(A1), 4-아미노페놀(A5), 3-아미노페놀(A6) 및 4-하이드록시벤질아민(A7) 및 나프톨 유도체 1-아미노-2-나프톨(A3) 및 아미노-8-나프톨(A8)을 포함한다. SpA는 Fab 단편과 상호작용하지만, SpA가 IgG와 주고받는 지배적인 상호작용은 Fc 영역을 통해 이루어지는 것으로 생각되며, 따라서, 이러한 상호작용을 모방하도록 선택된 전술한 성분들은 Ugi 스캐폴드로 도입될 경우 유사한 방식으로 상호작용하여 잠재적으로 Fc 특이적 리간드를 산출할 것으로 기대된다. Fab 특이적 Ugi 리간드를 생성하기 위한 또 다른 시도에서는 또한, 다수의 개별 성분들을 단백질 L 모방체 리간드 8/7의 구조와 기능을 닮은 라이브러리에 도입하였다(Roque et al., 2005b). 단백질 L(PpL)은, κ1, κ3 및 κ4 서브그룹의 경쇄에 대해 높은 친화성을 가지나, κ2 및 λ 서브그룹에 대해서는 그렇지 않은 박테리아 표면 단백질[펩토스트렙토코커스 마그너스(Peptostreptococcus magnus) 유래]이기 때문에(Nilson et al., 1992; Enokizono et al., 1997), 전체 및 경쇄 관련 IgG 단편(즉, Fab 및 scFv)과 상호작용한다. 이러한 특정 리간드의 기능적 요소는, 카복실산 성분 글루타르산(C1), 2,4-피리딘 디카복실산(C2), 이소프탈산(C3) 및 Boc 보호 글루타민(C4)과 함께 아민 성분 4-아미노벤즈아미드(A4)에 의해 본 발명의 Ugi 라이브러리에 반영된다. 또한, 트리아진계 라이브러리로부터 발견된 9종의 추정 선도 리간드 중 7종은 타이로신을 모방하여(즉, 티라민(A1)을 포함함), 이 성분을 Ugi 라이브러리 선별 과정에 포함시킨 것을 추가로 정당화시켰다. 타이로신기를 모방하는 것의 중요성을 뒷받침하는 추가 증거가, PpL 잔기 Tyr51 및 Tyr53을 각각 화학적으로 변형할 경우 PpL이 IgG에 대해 나타내는 친화성이 140배 감소되는 것을 보여주는 연구(Beckingham et al., 2001)를 통해 확인된다. 또한, 선택된 최종 후보 리간드(8/7)는 리간드 8/7에 의해 나타나는 높은 특이성 수준으로 인해 타이로신 작용기를 포함하지 않았다.
최근의 문헌은, 서로 다른 PpL 도메인에 7종의 주요 잔기가 보존되어 있으며, 이것은 PpL과 IgG 경쇄의 주요 상호작용에 관여하는 PpL 도메인(β2 가닥 및 α1 나선)으로부터의 복합체 형성시 대체로 매립되어 있다는 것을 제시한다. 이러한 잔기를 이하에 열거하였고, 그 뒤에 이탤릭체로 Ugi 라이브러리 유사체를 기재였다: Gln35: 4-아미노벤즈아미드(A2) 및 Boc-글루타민(C4); Thr36: 1-아미노-2-프로판올(A4); Ala37: 아세트산(C6); Glu38: 글루타르산(C1), 2,4-피리딘 디카복실산(C2) 및 이소프탈산(C3), Phe39: 벤조산(C5); Lys40 및 Tyr53: 티라민(A1), 4-아미노페놀(A5), 3-아미노페놀(A6) 및 4-하이드록시벤질아민(A7).
Ugi 라이브러리 스크리닝 및 추정 선도 리간드 선별
추가 개발 및 평가를 위한 선도 후보를 신속하게 확인하고자 이머징 라이브러리 후보의 효능을 결정하기 위해서, 비최적화 표준 크로마토그래피 스크리닝 조건을 확립하였다. 리간드 흡착제에 대한 데이타는, 표준 Bradford 분석법(Bradford 1976)에서 측정되는 바와 같이, 각각 hIgG, hFab 및 hFc 결합에 대해 도 3, 4 및 5에 도시되어 있다. 데이타의 분석 결과로 전체 hIgG에 대한 선도 리간드 및 특이적 hFab 및 hFc 단편 결합 리간드를 선별하였다.
선도 리간드 선별을 위한 중요한 기준은 얻어지고 관찰되는 총 hIgG 결합능을 기초로 한 유효 hIgG-결합이었다. 후보 리간드 A7C5, A8C5 및 A8C6는 각 컬럼에 적용된 초기 500 ㎍/㎖ 로딩으로부터 100% hIgG 결합을 나타내었다. hIgG 선도 구조물 및 비최적화된 흡착률/탈착률(%)에 대해서는 도 6 참조. 흥미롭게도, 추정 선도 리간드 A7C5는 ApA 리간드의 거의 인접하는 기능적 모방체를 나타내므로, 따라서 사용된 전체 라이브러리 선별 공정을 지원한다. 역으로, Ugi 라이브러리에 존재하는 직접적인 ApA 모방체(A1C5)는 A7C5처럼 잘 기능하지 않는데(43% hIgG 결합), 이는 더욱 경질인 4-히드록시벤질아민 성분(A7)과 비교하여 티라민 성분(A1)에 의한 추가의 유연성에 기인하는 것으로 생각되며, 관찰되는 결합능의 ∼57% 손실을 설명하는데 도움을 줄 수 있다. Ugi 라이브러리의 상세한 결합 분석으로부터, 아미노-8-나프톨 성분(A8)을 함유하는 모든 리간드는 다양한 Fab 및 Fc 결합 프로파일 외에 100% hIgG 결합을 나타내었다. 이는 A8 성분을 함유하는 리간드가 트리아진 리간드 22/8과 유사한 결합 성질(즉, 전체, Fab 및 Fc 단편에 대한 면역글로불린 결합)을 나타낼 수 있다는 것을 제시한다.
또한, 아미노-나프톨 성분 1-아미노-2-나프톨(A3)는 유망한 전체 hIgG 결합(카복실산 성분에 따라 크게 좌우되는 약 60∼86% 결합)을 나타내지만, 카복실산 C1-C4의 경우 Fab 단편에 대한 완전한 특이성이 관찰되었다(즉, 0% Fc 결합). 이는 A8 성분과 비교하여 A3 성분에 대해 관찰되는 hIgG 결합 감소를 설명할 수 있다. 이 관찰을 기초로 하여, A3C1, A3C2, A3C3 및 A3C4를 추가의 최적화 연구를 위한 추정 Fab 선도물로 선택하였다. hFab 선도 구조물 및 비-최적화된 흡착률/탈착률(%)에 대해서는 도 7 참조.
제안된 hFc 선도 후보 리간드 A2C2, A2C4 및 A2C5의 선택(도 8)은 또한 Ugi 및 트리아진 스캐폴드가 리간드 결합 양상 측면에서 다르다는 일부 증거를 제공한다. 리간드 A2C1은 치환된 작용기 측면에서 트리아진계 생체모방체 단백질 L8/7과 전적으로 등가이지만, 동일한 작용기가 Ugi 스캐폴드 상에서 치환된 경우, 이 리간드는 Fc 단편에 대해 완전한 특이성을 명백하게 나타낸다. 본 발명자들은 7개의 전체 IgG 및 Fab 특이적 선도물 중 6개가 2개의 밀접하게 관련된 나프톨 성분(A3 또는 A8) 중 하나를 포함하며, 이들 리간드 대부분은 비최적화된 용리 조건(0.1M NaHCO3, 10% (v/v) 에틸렌 글리콜, pH 10.0)에 잘 반응하는 것을 관찰하였다. 역으로, A2-관련 hFc 선도물 중 어느 것도 선택된 용리 조건에 잘 반응하지 않았는데, 이는 이들 리간드의 경우 hFc에 대한 결합 방식이 이 연구에서 확인된 전체 IgG 및 특이적 hFab의 결합 방식과 차이가 있음을 강하게 시사하는 것이다. 이는 아마도 결합 부위 주변에 존재하는 용매 노출 잔기의 특성에 기인하는 것 같으며, 이는 리간드와 각각의 표적 사이에 발생할 수 있는 상호작용의 종류를 구성한다. 2종의 무작위로 선택된 hFab 및 hFc 단편(PDB 코드 각각 1AQK 및 1H3W)의 전체 소수성은 소프트웨어 패키지 일부, HyperChem 7.5 Professional (http://www.hyper.com/index.htm) 의 컴퓨터 방법을 사용하여 비교하였다. 용매 노출 아미노산 잔기를 기초로 한 2개의 단백질 단편에 대한 LogP 값(hFab log10 P= -1573.3; hFc log10 P= -510.4)은, hFc가 hFab 단편보다 소수성이 상당히 더 크다(대략 Fc > Fab 3x)는 것을 제시한다. 이러한 종류의 분석은 대규모 정제 방법의 경우 선택된 Fab 및 Fc 선도 리간드에 필요한 최적화된 최종 흡착 및 탈착 조건을 규정하는데 도움을 줄 수 있다.
상기 보고된 결합능은, 비최적화된 흡착/탈착 조건을 이용하여 평균 ∼30s 컬럼 체류 시간을 적용하여 표적 단백질의 1회 통과로 결정하였다. 이러한 단순한 스크리닝 절차의 목적은 모든 리간드에 대한 상대적 결합능 수치를 결정하여 선도 선별 공정을 단순화하는 것이다. 정확한 전단 분석법(frontal analysis) 유래 결합능은 최적화된 조건 하에 선도 리간드 후보(1 ㎖ c.v 스케일)를 측정하여 현재 이용가능한 IgG-결합 리간드와 유사한 값을 밝히기 위해서 필요할 것으로 또한 생각된다. 이들 리간드는 통상적으로 ∼40 ㎎/㎖ 겔 습식 중량 범위에서 결합능을 나타낸다. 최근, 다른 적절한 유효 후보 리간드가 완전 및 단편화된 면역글로불린 표적에 대한 이 라이브러리로부터 나타났다. 초기 선도 선별은 주로 스크리닝 절차 중에 적용되는 비최적화 흡착 및 탈착 조건에 대한 반응, 특이성 및 절대 결합능에 기초하였다. 이들 선도 후보들은 다양한 길이의 스페이서 아암(C2-C8)의 도입을 통해 추가로 최적화 및 특성화될 것으로 생각되며, 사용된 크로마토그래피 조건의 추가 최적화 및 다양한 이소니트릴 성분의 이용은 리간드 결합 및 용리 양상을 개선시킬 것 같다. 그러나, 다른 후보 리간드가 필요에 따라서 고려될 수 있으며, 리간드 디자인의 반복적 접근법을 이용한다.
여기에 제시된 데이타로 Ugi 스캐폴드 상에서 치환된 특정 종류의 아민 성분을 확인하였으며, 이는 hFab(A3 및 A4) 및 hFc(A2 및 A7) 단편에 대한 특이성을 제공하며, 따라서, 모든 확인된 hFc 선도물이 A2 아민 성분을 함유한다는 것은 놀랍지 않다. 또한, A8 아민 성분은 전체 IgG 및 단편화된 표적 둘다에 대한 결합을 위해 비특이적이고 상대적으로 고용량인 다수의 흡착제를 생성하는데, 이는 전체 IgG 선도물 중 2가지의 포함을 뒷받침하는 증거가 된다. 역으로, 도입된 카복실산 성분에 대해 확인된 경향은 쉽게 확인할 수 있는 것이 아닌데, 이는 아민 성분이 리간드 표적 결합 계면을 결정하는 데 제일 중요함을 제안하는 것일 수 있다.
인자 VIII에 대한 친화성 리간드의 확인
추가 연구에서, 화합물 컬렉션을 준비하여 인자 VIII에 대한 가능한 친화성 리간드를 확인하였다. 각 화합물은 상기 IgG 실험 부분에서 설명한 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 따라서, 지지체에 부착된 알데히드 작용화된 링커를, UgI 다성분 반응으로 카복실산, 아민 및 이소니트릴과 반응시켰다. 그 다음, 생성물을 인자 VIII에 결합하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 앞서 확인한 리간드에 대한 각 화합물의 결합력을 비교하였다.
본 프로젝트는 전길이 재조합 인자 VIII의 대규모 정제의 비용-효과를 개선하기 위해 소형 분자 친화성 리간드의 개발 가능성을 조사하는 것이다. 이 생성물은 혈우병 A 및 관련 혈액 질병의 치료에 있어서 입증된 임상적 생물치료 분자로서 현재 사용되고 있다.
기존 C7F7 모노클로날 항체 수지 접근법(예컨대 Bayer에 의해 사용된 것)에 비해 소형 분자 리간드의 장점은, 소형 분자 리간드가 제조 비용이 유의적으로 저렴하며, 현재 Bayer 항체 컬럼에 사용될 수 없는 다중 컬럼 실행에 대한 더욱 엄격한 수지 재생 조건을 견딜 수 있다는 것이다.
별도의 절차로 고상 매트릭스 지지체(Sepharose CL-6B)에 형성된 알데히드 부분을 통해 그 자체가 치환된 일반 Ugi 스캐폴드에 특정 작용기를 도입한 것을 기초로 하여 일련의 친화성 리간드를 개발하였다. 단일 다성분 반응으로서 세파로스 비드 상의 최종 리간드 구조 형성을 나타내는 기초 화학은 4가지 별도의 성분, 즉 알데히드(R1), 1차/2차 아민(R2), 이소니트릴(R3) 및 카복실산 (R4)의 사용을 필요로 한다.
링커 및 지지체 제조
사용된 링커 및 지지체는 IgG 실험과 관련하여 상기 개시된 바와 동일하였다.
화합물 컬렉션 제조
IgG 실험과 관련하여 상기 개시된 Ugi 기반의 프로토콜에 따라 화합물 컬렉션을 제조하였다.
제조된 화합물은 하기 제시된 구조를 가진다:
Figure pct00027
상기 식에서, R1은 링커 및 지지체이고, R2는 아민 성분이며, R3은 이소니트릴 성분이고, R4는 카복실산 성분이다.
컬렉션을 형성하는 데 사용된 카복실산, 이소니트릴 및 아민 성분의 조합은 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00028
인자 VIII 마이크로플레이트 분석에 의해 각 화합물 U1 내지 U4를 스크리닝하고, 그 결과를 상기 표에 제시하였다. 이들 결과는 방향족 복소환 복잡성 증가로 인해 인자 VIII 결합이 향상된다는 것을 보여준다.
이들 결과를 본 발명에 의해 앞서 제조되고 인자 VIII에 대한 공지된 리간드인 트리아진 리간드 34/43(106.3 ㎍/㎖)와 유리하게 비교한다.
Figure pct00029
초기 인자 VIII 마이크로플레이트 분석 결과는, 아민 성분이 구조적 및 정전기적 복잡성 증가 측면에서 달라지기 때문에 트리아진계 선도 리간드에 대해 관찰된 유사한 증가와 비견할만한 인자 VIII의 결합 증가가 관찰된다는 것을 보여준다. 이것이 시사하는 바는, 2종의 스캐폴드(트리아진 및 Ugi)가 화학적 구조 측면에서 상당히 다르지만, 인자 VIII 결합에 대한 각 작용기의 영향은 유지되며, 따라서 유사한 선도물 발견 공정을 실시할 수 있다는 것이다.
초기 컬렉션으로부터 얻은 결과에 기초하여, 인자 VIII 결합 및 용리 양상과 관련하여 추가 리간드를 제조 및 스크리닝하였다. 이들 연구는, 대략 인자 VIII 결합 친화도를 결정하기 위한 단순한 마이크로역가 플레이트 분석(수지 부피 40 □L/웰)을 이용하여 수행한 후 중력-흐름 충전 수지 컬럼(0.5 mL 수지 부피)를 사용한 더욱 상세한 연구를 수행하였다. 이들 충전 컬럼 연구는 더욱 정확하며, 컬럼의 점차적 포화(200 ㎕, 100 ㎍/㎖) 및 컬럼에 적용된 각 인자 VIII 분액의 연속 첨가 후에 용리제 중의 단백질 농도에 따라서 절대적 수지 친화도를 측정하기 위해서 간단히 실험할 수 있다. 이러한 방식으로, 결합을 확립하고 각 리간드의 용리 양상을 함께 확립할 수 있다.
선택된 리간드의 용리 양상을 조사하는데 사용된 또 다른 종류의 연구는 초기에 단일 인자 VIII 분액(1.2 ㎖, 100 ㎍/㎖)의 반복 첨가(x10)에 의해 0.5 ㎖ 충전 컬럼을 포화시킨 후 단백질 농도가 실험적으로 결정된 후에 일련의 세척 및 용리 완충 분액(400 ㎕)을 후속 첨가하는 것이다. 따라서, 리간드의 결합 및 용리 양상은 높은 초기 인자 VIII 로딩의 조건 하에서 생길 수 있다. 이들 연구의 특징은 선택된 Ugi 리간드가 인자 VIII 용리과 관련하여 고 농도의 1가 및 2가 양이온 염(CaCl2, NaCl)에 잘 반응한다는 관찰 결과를 이끌어냈다는 것이다. 이 보고서에서는 이것이 인자 VIII에 대한 상이한 정제 접근법에 대한 기초를 형성할 수 있다고 제안하고 있다. 또한, 결합, 세척 및 용리 조건을 정확하게 확인하여 유의적인 수준의 배경 숙주 세포 단백질 결합을 제거할 수 있다.
그 다음 Ugi 다성분 반응을 이용하여 추가의 라이브러리를 제조하였다. 산, 아민 및 이소니트릴 성분은 인자 VIII 마이크로플레이트 분석 데이타와 함께 하기 표에 제시되어 있다. 알데히드 성분은 알데히드 작용화된 세파로스 상에 존재하였다.
Figure pct00030
인자 VIII 마이크로플레이트에 의해 Ugi 리간드 (4-9U) 및 트리아진 리간드 34/43를 초기에 스크리닝하였으며, 그 결과는 인자 VIII 결합에 대한 긍정적 영향을 가지는 아민(R2) 위치에서의 이환 방향족 고리를 선호하는 일반적인 경향을 나타낸다. 이소니트릴(R3) 위치 중 추가의 설파닐산 부분의 존재는 인자 VIII 결합에 강하게 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았으며, 유사하게 카복실산(R1) 위치 중의 트리아졸 부분의 존재는 강한 추가 결합 잠재력을 제공하지 않았다. 이들 연구에 기초하여 본래의 트리아진 리간드 34/43이 최강의 인자 VIII 결합 및 용리 특성을 보유하는 것으로 나타났다.
충전 컬럼(0.5 ㎖ 리간드 수지)을 사용한 이들 시리즈(4, 8, 9U + 리간드 34/43)로부터 선택된 리간드의 추가 조사 결과, 4U, 8U, 9U의 인자 VIII 결합 잠재력이 트리아진 리간드 34/43보다 유의적으로 낮지만, 유사한 용리 조건, 0.5M CaCl2 / 50% 에틸렌 글리콜 / 20 Tris.HCl pH 7.0을 사용한 용리 양상은 유사한 것으로 나타난다는 것을 확인하였다(도 9 및 10).
선택된 Ugi 리간드 4U, 8U 및 9U에 대한 인자 VIII 결합 가능성 감소는 추가의 리간드 및 적절한 대조군 리간드를 고안 및 합성하여 이 효과의 성질을 추가로 조사할 수 있게 한다. 현재 Ugi 리간드 세트는 10-17U이며, 인자 VIII 결합 및 용리 양상에 대해 현재 조사중이다(도 7 참조). 본 발명자들은 인자 VIII 마이크로플레이트 분석에 의해 이 보고서에서 언급한 이전의 구체예들과 이들 신규한 리간드를 초기에 스크리닝하였다. 리간드 U14 및 U17은, 이전에 사용된 벤조산에 대한 치환기를 고려하고 포스파티딜세린에 대한 인자 VIII의 잠재적 결합 모드를 참작한 리간드 구조를 재규명하기 위해 니트로 및 디니트로-벤젠 부분를 포함한다. 이 점에 있어서, 본 발명자들이 카복실산(R1) 위치에서 치환된 벤조산을 가지는 추가의 리간드를 생성하여 지금까지 제조된 리간드와 잠재적 결합 모드를 비교해야 한다는 것은 분명하다.
이 연구 결과, 트리아진 리간드 34/43는 최고의 인자 VIII 결합 잠재력을 가지는 리간드 중 하나를 지속되고 생성하는 것으로 밝혀졌지만, Ugi 리간드 4U, 7U, 8U, 9U 및 U14는 유사하게 높은 수준의 인자 VIII 결합을 생성하는 것에 주목하였다. Ugi 리간드 U10-U13는 단순 분석으로 판단되는 바와 같이 유의적으로 더 낮은 인자 VIII 결합을 생성하는 것으로 보인다. Ugi 스캐폴드 자체는 기능적 나프탈렌 부분(Ugi 리간드 - U12)의 존재 하에서도 인자 VIII 결합에 대해 특별히 강한 영향을 미치지 않는다는 것이 이들 결과에 의해 제시된다. 또한, 리간드 U10은 결합 잠재력 감소를 나타내기 때문에, 비드 표면으로부터 Ugi 스캐폴드에 의해 제공되는 적당한 공간과 나프탈렌 설포네이트 부분의 존재의 조합은 강한 인자 VIII 결합 잠재력을 제공하는 것으로 보인다(도 11).
마이크로플레이트 분석은 이들 결과를 확인하는데 필요한 정확성을 제공하지 못하는 것으로 생각되어, 트리아진 리간드 34/43를 포함하는 이 세트로부터의 선택된 Ugi 리간드에 대해서 연속 인자 VIII 분액(200 ㎕, 100 ㎍/㎖)을 05 ㎖ 충전 컬럼에 적용하여 추가의 인자 VIII 결합 실험을 실시하였다(도 12 참조). 이 연구로부터 Ugi 리간드 14U는 트리아진 리간드 34/43보다 높은 인자 VIII 결합 잠재력을 나타내는 것으로 보인다. 또한, Ugi 리간드 4U 및 9U는 유사하게 감소된 인자 VIII 결합 잠재력을 나타내는 것으로 보인다(도 12 참조). 4종의 선택된 Ugi 리간드 4U, 14U, 16U, 17U의 별도 연구에서 이들 결과가 또한 확인되었는데, 이는 차등 인자 VIII 결합 모드가 적당한 리간드 디자인에 의해 확인될 수 있음을 제시한다(도 13 참조). 이들 결과는 카복실산(R1) 위치에서의 벤젠 방향족 고리의 존재가 전체 인자 VIII 결합 잠재력에 긍정적으로 기여함을 강력하게 제시하는 것이다. 이는 상이한 작용기의 적절한 첨가에 의해 추가로 연구되어야 하는 것은 분명하게, 현재 연구중이다. 마찬가지로, C2 도메인에 대한 인자 VIII의 특정 억제제의 고안은 4개의 6C-5C-5C-6C 방향족 고리 구조물과 추가의 전기음성 치환기(CF3, NO2, =S, =O 및 디클로로벤젠)의 일반식을 보유하는 것은 주목할 만하다(Spiegel et al., 2004).
선택된 Ugi 리간드(U8, U14, U16, U17)를, 0.5 ㎖ 충전 컬럼에서 인자 VIII의 결합 및 용리 능력에 대해 스크리닝하였다(도 14 참조). 이들 결과는 리간드 8U 및 14U가 비슷한 양상을 나타내며 초기 분획에서 고효율로 뚜렷이 용리된다는 것을 보여준다. 반면, 리간드 U16 및 U17는 덜 효율적으로 더 광범위하게 전면에서 용리된다. 리간드 U17은 특히 다른 기란드에 대해 약간 상이한 결합 모드를 가지는 것으로 보이는데, 이는 디니트로벤젠기가 결합 또는 용리 또는 둘다에 강하게 영향을 미친다는 것을 의미한다.
Figure pct00031
또한, 3종의 대조군 리간드를 제조하였다:
Figure pct00032
Molegro 가상 도커 소프트웨어를 사용한 인자 VIII-C2 도메인에 대한 Ugi 리간드 모델링
트레이닝 가상 리간드 세트를 초기에 사용하여 인자 VIII-C2 도메인의 2개의 별개 영역에 대한 가능한 결합 모드를 확인하였다(도 12 참조). 이들 2개의 표면 캐비티는 반경이 10∼17 Å으로 반경이 다르고(도 13 참조), 적당한 리간드가 C2 도메인과 우세하게 상호작용할 수 있는 가능한 영역으로서 이전 연구에서 확인되었다(데이타는 도시되지 않음). Molegro 소프트웨어 패키지(미국 SIM 바이오시스템즈)의 일부로서 자동화된 도킹 소프트웨어 Moldock을 사용하여 50 무작위 리간드 형태의 총 세트, 4000회의 별도 도킹 반복 및 평균 3회 이상의 독립적인 프로그램 실행을 이용하여 리간드 결합을 평가하였다. 프로그램은 Moldock 스코어, 친화성 및 기타 관련 파라미터, 예컨대 reRank 스코어, 총 정전기적 에너지 및 총 H-결합 에너지 등의 리포트와 조합된 발견된 5가지 최상 포즈(도킹 모드) 세트를 전한다. 이 프로그램에 의해 제공되는 정량 데이타를 첨부된 엑셀 파일로 제공한다.
이 결과는 캐비티 1 및 2에서 Moldock 스코어 또는 친화성 파라미터와 연관된 Ugi 리간드 14U, 17U, 20U 및 21U와 관련된 개선된 도킹 모드에 대한 몇몇 증가가 있다는 것을 보여준다. 제안된 최상의 도킹 모드는 리간드 14U에 대해서는 표면도(하단 좌측) 및 측면 "스틱" 도(하단 우측)로 도시되어 있다(도 13 참조). 이 리간드와 가장 잘 상호작용할 것 같은 잔기는 다음과 같이 제시된다: 아르기닌 2220 (청색 - 양전하), 글루타민 2316(라임그린 - 양/음 전하), 페닐알라닌 2196(적색 - 소수성), 아스파기닌 2224(황록색 - 양/음 전하), 발린 2223(마젠타 - 비극성), 히스티딘 2315(살몬핑크 - 양전하). 유사하게, 최상의 도킹 모드가 리간드 17U에 대해 제시되어 있으며, 이 리간드와 가장 잘 상호작용할 것 같은 잔기를 상기 언급한 바와 같이 표지한다(도 14 참조). 이들 연구의 주목할 만한 특징은 캐비티 1 및 2에서 설포네이트 부분 및 나트팔렌 방향족 고리 구조와 표면 노출된 아르기닌 잔기의 가능한 상호작용이다. 또한, 엑셀 파일로 리간드 4U 및 34/43 (Bayer 코드 - 리간드 3A)에 대한 자동화된 도킹 데이타를 포함할 수 있는데, 이는 리간드 4U와 비교하여 리간드 34/43의 경우 캐비티 1에 대한 높은 결합 잠재력을 제시하는 것이며, 지금까지 얻어진 실험 데이타와 매우 일치한다. 리간드 34/43의 캐비티 1에 대한 도킹 모드는 특히 양호한데, 이는 각 핑거 영역 사이의 C2 도메인 구조 하부에 대한 높은 결합 잠재력을 제시하는 것이다.
가상 리간드 트레이닝 세트는 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00033
인자 VIII C1/C2 도메인의 트립토판 잔기에 근접한 표면 노출된 여러 아르기닌 잔기가 있다는 있으며, 이것이 강한 양이온-π 상호작용을 형성한다는 것은 주목할 만하다. 나프탈렌 설포네이트 부분과 C2 도메인 간의 우세한 상호작용의 하나의 특징은 그러한 상호작용을 포함할 수 있음이 제시된다. Friess 및 Zenobi(2001)는 선택된 단백질의 아르기닌 잔기와 나프탈렌 설포네이트 유도체 간의 양의 상호작용을 MALDI 질량 분광분석으로 확인하였다. 단백질-단밸질 상호작용에 관련된 고온 스폿이, 특별히 강력한 상호작용을 형성하는데 또한 연관되어 있는 것으로 생각되는 특정 잔기, 즉 트립토판, 티로신 및 아르기닌에 풍부하다는 것도 알려져 있다(Bogan 및 Thorn, 1998). C2 도메인의 윈위 단부에 위치하는 트립토판과 아르기닌 잔기의 고유 배열은, 트립토판 잔기에 의해 생성된 확장된 π-구름과 양으로 하전된 아르기닌 잔기에 의해 형성되는 정전기적 결합에 의해 주로 VWF 단백질 및 인지질막 둘다와 상호작용을 형성할 수 있다. 현재 표면 노출된 아르기닌 잔기에 의한 단백질 결합에 대해 설포네이트 기의 역할을 조사중이다. 이러한 점에서, 인자 VIII-C2 도메인은 여러 다른 단백질이 또한 공유하는 2개의 설페이트-결합 부위를 보유한다. 단백질의 설페이트 및 포스페이트-결합 부위는 관련된 잔기가 상이한 것으로 알려져 있지만, 아르기닌 잔기가 주로 관련되는 것으로 보인다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036

Claims (33)

  1. 화합물의 컬렉션(collection)으로서, 이 컬렉션의 각각의 구성원은 독립적으로 하기 화학식 (I) 또는 하기 화학식 (II)에 따른 화합물이고, 이 컬렉션은 하기 화학식 (I)의 화합물만을 포함하거나, 하기 화학식 (II)의 화합물만을 포함하거나, 하기 화학식 (I)의 화합물과 하기 화학식 (II)의 화합물의 혼합물을 포함하는 것인 화합물의 컬렉션:
    Figure pct00037

    (상기 식 중,
    R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
    R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되고, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)로부터 추가로 선택되거나,
    또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 이들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있음)
    Figure pct00038

    (상기 식 중,
    R1a, R1b, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
    R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
    또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 이들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있음).
  2. 제1항에 있어서, R1a가 지지체에 부착된 링커를 포함하는 치환기인 컬렉션.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1b가 수소인 컬렉션.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴이 아세탈, 알킬, 아릴, 헤미아세탈, 알콕시, 케탈, 헤미케탈, 헤테로사이클릴, 옥소, 티온, 이미노, 포르밀, 할로, 하이드록시, 티오카복시, 티올로카복시, 이미드산, 하이드록삼산, 티오노카복시, 에테르, 니트로, 시아노, 에테르, 니트로, 니트로소, 아지도, 시아네이토, 이소시아네이토, 티오시아노, 이소티옥타노, 시아노, 아실, 카복시, 에스테르, 아미도, 아미노, 구아니디노, 테트라졸릴, 이미노, 아미딘, 아실아미도, 우레이도, 아실옥시, 티올, 디설파이드, 티오에테르, 설폭시드, 설포닐, 티오아미도, 설피닐옥시, 설페이트, 설폰아미도, 설포네이트, 설프아미노, 포스피노, 포스포, 포스피닐, 포스폰산, 포스포네이트, 포스페이트, 인산, 아인산, 포스포아미다이트, 포스포아미데이트, 실릴, 옥시실릴, 실록시, 옥시실록시 및 설폰아미노로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있는 것인 컬렉션.
  5. 제4항에 있어서, 상기 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴이 하이드록시, 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 할로, 니트로, 설폰산, 설폰아미도, 옥소, 티온, 카복시, 아미노, 보론산, 아미도 및 티오아미도로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있는 것인 컬렉션.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 하기 치환기 리스트로부터 선택되는 것인 컬렉션:
    Figure pct00039

    Figure pct00040

    Figure pct00041

    Figure pct00042
  7. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 하기 표에 제시된 리스트로부터 선택되는 것인 컬렉션:
    Figure pct00043
  8. 제1항 내지 제3항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 하기 표에 제시된 리스트로부터 선택되는 것인 컬렉션:
    Figure pct00044

    Figure pct00045

    Figure pct00046
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물에 있어서 R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지 또는 화학식 (II)의 화합물에 있어서 R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지가 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 및 임의로 치환된 C5-20아릴로 구성된 군에서 선택되는 것인 컬렉션.
  10. 제1항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물에 있어서 R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상 또는 화학식 (II)의 화합물에 있어서 R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상이 이들이 결합된 원자와 함께 임의로 치환된 C5-20헤테로사이클릴기를 형성하는 것인 컬렉션.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 분석용 표지를 갖는 것인 컬렉션.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체가 유리, 금, 폴리스티렌, 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드 또는 폴리(알콕시드)를 포함하는 것인 컬렉션.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 10개 이상의 구성원을 갖는 컬렉션.
  14. 하기 화학식 (III)의 화합물 또는 하기 화학식 (IV)의 화합물:
    Figure pct00047

    (상기 식에서, R1a, R1b, R2, R3 및 R4는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서의 화학식 (I)의 화합물에 따라 정의됨)
    Figure pct00048

    (상기 식에서, R1a, R1b, R3 및 R4는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서의 화학식 (II)의 화합물에 따라 정의됨).
  15. 제14항에 따른 화학식 (III)의 화합물 또는 화학식 (IV)의 화합물을 포함하는, 혼합물로부터 물질을 분리하기 위한 분리 장치.
  16. 제15항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼의 형태인 분리 장치.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 컬렉션을 얻는 단계;
    상기 컬렉션의 각각의 구성원을, 물질을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계; 및
    상기 컬렉션을 분석하여, 상기 물질이 각각의 컬렉션 구성원과 결합하는 정도를 측정하는 단계
    를 포함하는, 물질에 대해 친화성을 갖는 고정화된 리간드를 확인하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 혼합물로부터 상기 컬렉션을 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 컬렉션을 얻는 단계;
    상기 컬렉션의 각각의 구성원을, 물질을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계; 및
    상기 컬렉션을 분석하여, 상기 물질이 각각의 컬렉션 구성원과 결합하는 정도를 측정하는 단계;
    상기 물질에 대해 친화성을 갖는 라이브러리 구성원을 확인하는 단계; 및
    상기 컬렉션 구성원에 기초한 구조를 갖는 화합물을 제조하는 단계
    를 포함하는, 물질에 대해 친화성을 갖는 화합물을 제조하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 컬렉션 구성원에 기초한 구조를 갖는 화합물을,
    (i) 상기 물질과 결합하는 것으로 확인된 컬렉션 구성원의 링커를 절단하는 단계; 또는
    (ii) 하기 성분 A, B, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    (여기서,
    A는 R1aCOR1b이고;
    B는 R2-NH2이며;
    C는 R3-NC이고;
    D는 R4-COOH이며;
    R1a, R1b, R2, R3 및 R4는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되고, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되며, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)로부터 추가로 선택되거나,
    또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨); 또는
    하기 성분 A, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    (여기서,
    A는 R1aCOR1b이고;
    C는 R3-NC이며;
    D는 R4-COOH이고;
    R1a, R1b, R3 및 R4는 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 선택되고, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
    또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)
    에 의해 제조하는 것인 방법.
  21. 물질을 포함하는 혼합물을, 제14항에 따른 화합물 또는 제15항 또는 제16항에 따른 분리 장치와 접촉시키는 단계; 및
    상기 화합물 또는 장치에 고정화된 물질로부터, 얻어진 물질 고갈 혼합물을 분리하는 단계
    를 포함하는, 혼합물로부터 물질을 분리하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 화합물 또는 장치에 고정화된 물질을 용리제로 처리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  23. 분석 시료를, 제14항에 따른 화합물 또는 제15항 또는 제16항에 따른 분리 장치와 접촉시키는 단계; 및
    상기 화합물 또는 장치를 분석하여, 상기 물질이 상기 화합물 또는 장치와 결합하는 정도를 측정하는 단계
    를 포함하는, 분석 시료 중 물질의 존재를 확인하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 화합물 또는 상기 장치의 상기 화합물이 특정 질병 상태에 관련된 물질에 대해 친화성을 갖는 것인 방법.
  25. 제17항 내지 제20항 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 핵산 또는 펩티드인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 펩티드가 혈액 단백질인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 혈액 단백질이 응고 단백질인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 응고 단백질이 인자 VII 및 인자 VIII과 그 단편, 변이체 및 유도체로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 펩티드가 면역글로불린인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgG 또는 그 단편, 변이체 및 유도체인 방법.
  31. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 컬렉션의 제조 방법으로서,
    하기 성분 A, B, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계:
    (여기서,
    A는 R1aCOR1b이고;
    B는 R2-NH2이며;
    C는 R3-NC이고;
    D는 R4-COOH이며;
    R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
    R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되고, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되며, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)로부터 추가로 선택되거나,
    또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)
    (상기 단계는 1회 이상 반복하고, 매회 반복시마다 A, B, C 또는 D 중 하나 이상을 변경함)
    를 포함하거나, 또는
    성분 A, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계:
    (여기서,
    A는 R1aCOR1b이고;
    C는 R3-NC이며;
    D는 R4-COOH이고;
    R1a, R1b, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
    R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
    또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)
    (상기 단계는 1회 이상 반복하고, 매회 반복시마다 A, C 또는 D 중 하나 이상을 변경함)
    를 포함하는 제조 방법.
  32. 제14항에 따른 화합물의 제조 방법으로서,
    성분 A, B, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계:
    (여기서,
    A는 R1aCOR1b이고;
    B는 R2-NH2이며;
    C는 R3-NC이고;
    D는 R4-COOH이며;
    R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
    R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되고, R1a, R1b 및 R2는 또한 수소로부터 선택되며, R2는 또한 -S(=O)R5 및 -C(=S)NR6R7(식 중, R5, R6 및 R7은 독립적으로 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴임)로부터 추가로 선택되거나,
    또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R2, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)
    를 포함하거나, 또는
    성분 A, C 및 D를 함께 접촉시키는 단계:
    (여기서,
    A는 R1aCOR1b이고;
    C는 R3-NC이며;
    D는 R4-COOH이고;
    R1a, R1b, R3 및 R4 중 하나는 지지체에 부착된 링커를 포함하는 기이고,
    R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지는 임의로 치환된 C1-20알킬, 임의로 치환된 C3-20헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C5-20아릴로부터 독립적으로 선택되며, R1a 및 R1b는 또한 수소로부터 선택되거나,
    또는, 경우에 따라, R1a, R1b, R3 및 R4 중 나머지에서 2개 이상은 연결됨)
    를 포함하는 제조 방법.
  33. 제31항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 컬렉션.
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