KR20100014573A - 이빨의 제조 방법 및 이로써 얻어진 이빨 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지지 담체의 내부에 양막 유래의 간엽계 세포 및 상피계 세포 중 실질적으로 어느 하나로만 이루어진 제1 세포 집합체와, 실질적으로 다른 하나로만 이루어진 제2 세포 집합체를 혼합하지 않고 밀착시켜 배치하는 단계, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 단계에 의해 이빨을 제조하는 제조 방법을 개시한다.

Description

이빨의 제조 방법 및 이로써 얻어진 이빨{Method for production of tooth, and tooth produced by the method}

본 발명은 이빨의 제조 방법 및 이로써 얻어진 이빨에 관한 것이다.

이빨은 최외층에 에나멜질, 그 내층에 상아질이라는 경조직을 가지고, 나아가 상아질 안쪽에 상아질을 생산하는 상아 아세포, 더 중심부에 치골을 가진 기관이다. 또 이빨은 우식이나 치주병 등에 의해 소실되는 경우가 있는데, 이빨의 유무는 외관이나 음식물의 미각에 크게 영향을 주고, 또 건강 유지나 질높은 생활을 유지한다는 관점에서 이빨의 재생 기술이 다양하게 개발되고 있다.

예를 들면, J.Dent.Res., 2002, Vo1.81(10), pp.695-700에는 치배에서 단리된 상피계 세포나 간엽계의 치낭 세포 등의 세포를, 생체 흡수성 담체와 함께 랫트의 복강 안에 이식함으로써 이빨 형태의 조직이 재생되는 것이 개시되어 있다.

치배의 재생 방법으로서는, 예를 들면 일본특개2004-331557호 공보에는, 생체에서 단리된 치배 세포를 선유아 세포 증식 인자 등 생리 활성 물질의 존재하에서 배양하는 것이 기재되어 있다. 또 일본특개2004-357567호 공보에는 생체에서 단리된 치배 세포 및 이들 세포로 분화 가능한 세포 중 적어도 1종류를, 피브린을 포함한 담체와 함께 배양하는 것이 제안되어 있고, 여기에서 피브린을 포함한 담체는 치배의 목적 형상의 것을 사용하여 특유의 형태를 가진 「이빨」을 형성한다고 기재되어 있다.

한편, 재생 의료의 관점에서 지금까지 폐기되었던 생체 시료의 재이용이 주목되고 있다. 특히, 질환 등에 의해 잘려나가는 조직과는 달리 출산시에 폐기 대상이 되는 제대나 양막 등의 조직은 줄기세포의 존재나 세포의 분화에 관여할 수 있는 기관으로서 주목되고 있다.

이 양막에 착안한 기술로서는, 예를 들면 일본특개2006-6249호 공보에는 양막 유래의 상피 세포나 간질 세포를 미분화한 채 대량으로 증식시키는 기술이 개시되어 있다. 이 방법에 의해 증식된 세포는 미분화된 배성(胚性) 줄기세포와 유사한 다분화 능력을 갖기 때문에 재생 의료 등에 유용하다는 내용이 기재되어 있다.

또 일본특개2004-253682호 공보에는, 인간 양막 간엽 세포층 및 인간 양막 상피 세포층에서 사이드 파퓰레이션 세포(side population cell)를 줄기세포로서 분리한 것이 기재되어 있다. 이 세포가 적어도 신경 세포로 분화 가능하며, 신경 세포에 의해 생산되는 물질의 공급원으로서 유용하다는 것이 기재되어 있다.

발명이 해결하고자 하는 과제

그러나 재생된 이빨 또는 치배가 조직으로서 기능하려면, 조직을 구성하는 여러 종류의 세포가 적절한 상대 위치에 배치(세포 배치)되어 있는 것이 필수이다. 단순히 양막을 사용한다고 해서 조직으로서 유효한 이빨을 제공하기는 어렵다.

따라서 본 발명은 양막의 새로운 용도를 제공함과 동시에 특유의 세포 배치를 유지한 이빨을 제조하는 이빨을 제공하는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명은 상기 상황을 감안하여 이루어진 것으로서, 이빨의 제조 방법 및 이것을 사용한 이빨을 제공한다.

본 발명의 제1 태양은, 지지 담체의 내부에 양막 유래의 간엽계 세포 및 상피계 세포 중 실질적으로 어느 하나로만 이루어진 제1 세포 집합체와, 실질적으로 다른 하나로만 이루어진 제2 세포 집합체를 혼합하지 않고 밀착시켜 배치하는 것, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것을 포함하는 이빨의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 제2 태양은, 상기 제조 방법에 의해 얻어진 이빨을 제공한다.

발명의 효과

본 발명에 의하면, 양막의 새로운 용도를 제공함과 동시에 특유의 세포 배치를 유지한 이빨을 제공할 수 있다.

도 1a는 본 발명의 실시예에 관한 치배 유래 간엽계 세포와 상피계 세포를 사용한 치배 재구축 순서를 개념적으로 도시한 도면으로서, 세포 배치 전의 겔 드롭의 상태를 도시한 도면이다.

도 1b는 본 발명의 실시예에 관한, 치배 유래 간엽계 세포와 상피계 세포를 사용한 치배 재구축 순서를 개념적으로 도시한 도면으로서, 제1 세포 집합체를 겔 드롭내에 배치한 상태를 도시한 도면이다.

도 1c는 본 발명의 실시예에 관한 치배 유래 간엽계 세포와 상피계 세포를 사용한 치배 재구축 순서를 개념적으로 도시한 도면으로서, 제2 세포 집합체를 겔 드롭내에 배치한 상태를 도시한 도면이다.

도 1d는 본 발명의 실시예에 관한 치배 유래 간엽계 세포와 상피계 세포를 사용한 치배 재구축 순서를 개념적으로 도시한 도면으로서, 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체가 배치된 겔 드롭을 고형화시킨 상태를 도시한 도면이다.

도 2는 본 발명의 실시예에 관한 재구성 치배의 기관 배양 후의 HE염색상이다. 도면 중의 막대(bar)는 25㎛을 나타낸다.

도 3은 본 발명의 실시예에 관한 재구성 치배의 기관 배양 후의 형광 현미경 사진상과 미분 간섭 현미경상을 겹친 도면이다. 도면 중의 막대는 1OO㎛를 나타낸다.

발명의 실시를 위한 최량의 형태

본 발명의 이빨의 제조 방법은, 지지 담체의 내부에 양막 유래의 간엽계 세포 및 상피계 세포 중 실질적으로 어느 하나로만 이루어진 제1 세포 집합체와, 실질적으로 다른 하나로만 이루어진 제2 세포 집합체를 혼합하지 않고 밀착시켜 배치하는 것(이하, 배치 공정이라고 한다), 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것(이하, 배양 공정이라고 한다)을 포함한 것이다.

상기 제조 방법에서는, 상기 양막이 양막 치밀층 유래인 것이 바람직하다.

또한, 상기 제조 방법에서, 상기 상피계 세포가 치배, 피부, 점막 및 치육 중 적어도 하나에서 유래된 상피계 세포인 것이 바람직하고, 치배 유래인 것이 더 욱 바람직하다.

또한, 상기 제조 방법에서, 상기 양막 유래의 간엽계 세포를 실질적으로 포함하는 제1 세포 집합체 또는 제2 세포 집합체가 단일 세포로 구성된 세포 집합체인 것이 바람직하고, 상기 제1 세포 집합체 및 제2 집합체가 함께 단일 세포 집합체인 것이 더욱 바람직하다.

본 제조 방법에서는, 양막 유래의 간엽계 세포와 상피계 세포로 각각 형성된 세포 집합체를 혼합하지 않고 밀착시켜 지지 담체의 내부에 배치하여 배양하기 때문에 긴밀한 접촉 상태에 의해 세포간 상호 작용을 효과적으로 재현할 수 있고, 안쪽에 상아질, 바깥쪽에 에나멜질이라는 이빨 특유의 세포 배치를 효과적으로 재현하여 조직으로서의 이빨을 형성할 수 있다.

또한, 이빨을 제조하기 위한 재료로서 지금까지 대부분 폐기되었던 양막, 특히 양막 유래의 간엽계 세포를 사용함으로써 이빨 재료의 후보를 새로 창출할 수 있으며, 한편으로는 양막의 새로운 이용 형태를 제공할 수 있다.

본 발명에서 「이빨」이란, 안쪽에 상아질 및 바깥쪽에 에나멜질의 층을 연속하여 구비한 조직을 말하며, 치관이나 치근을 가진 방향성을 구비한 조직인 것이 바람직하다. 이빨의 방향성은 치관이나 치근의 배치에 의해 특정할 수 있다. 치관이나 치근은 형상이나 조직 염색 등에 기초하여 육안으로 확인할 수 있다. 치관이란, 에나멜질과 상아질의 층구조를 가진 부분을 말하며 치근에는 에나멜질의 층은 존재하지 않는다.

상아질 및 에나멜질은 당업자에게는 조직 염색 등에 의해 형태적으로 용이하 게 특정할 수 있다. 또한, 에나멜질은 에나멜 아세포의 존재에 의해 특정할 수 있고, 에나멜 아세포의 존재는 아멜로제닌(amelogenin)의 유무에 의해 확인할 수 있다. 한편 상아질은 상아 아세포의 존재에 의해 특정할 수 있고, 상아 아세포의 존재는 덴틴시아로프로틴의 유무에 의해 확인할 수 있다. 아멜로제닌 및 덴틴시아로프로틴의 확인은 이 분야에서 주지의 방법에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들면 in situ 교잡(hybridization), 항체 염색 등을 들 수 있다.

또 이빨의 방향성은 치관이나 치근의 배치에 의해 특정할 수 있다. 치관이나 치근은 형상이나 조직 염색 등에 기초하여 육안으로 확인할 수 있다.

본 발명에서 「치배」 및 「치아」는 후술하는 발생 단계에 기초하여 구별된 것을 특별히 언급하는 경우에 사용되는 표현이다. 이 경우의 「치배」란, 장래 이빨이 되는 것으로 결정된 이빨의 초기배로서, 이빨의 발생 시기에서 일반적으로 사용되는 봉상기(Bud stage)부터 종상기(Bell stage)까지의 단계의 것을 가리키며, 특히 이빨의 경조직으로서의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 인정되지 않는 조직이다. 한편 「치아」란, 본 발명에서 사용되는 「치배」의 단계 이행의, 이빨의 경조직의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 시작된 단계부터, 이빨이 치육에서 싹이 터 일반적으로 이빨로서의 기능을 발현하기 전 단계의 조직을 말한다.

치배로부터의 이빨의 발생은, 봉상기, 모상기(帽狀期), 종상(鍾狀) 전기 및 후기의 각 시기를 거쳐 이루어진다. 여기에서 봉상기에서는, 상피계 세포가 간엽계 세포를 감싸도록 함입된다. 종상 전기 및 종상 후기에 다다르면, 상피계 세포 부분이 바깥쪽 에나멜질이 되고, 간엽계 세포 부분이 내부에 상아질을 형성하게 된다. 따라서 상피계 세포와 간엽계 세포와의 세포간 상호 작용에 의해 치배로부터 이빨이 형성된다.

아울러 본 발명에서 「간엽계 세포」란, 간엽 조직 유래의 세포를 의미하고, 「상피계 세포」란, 상피 조직 유래의 세포를 의미한다.

또한, 본 발명에서 「치주 조직」이란, 이빨의 주로 외층에 형성된 치조골 및 치근막을 말한다. 치조골 및 치근막은 당업자라면 조직 염색 등에 의해 형태적으로 용이하게 특정할 수 있다.

이하, 본 발명의 이빨의 제조 방법에 대해서 설명하기로 한다.

본 발명의 이빨의 제조 방법에서의 배치 공정에서는, 지지 담체의 내부에 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치한다.

여기에서 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체는, 실질적으로 각각 간엽계 세포로만, 또는 상피계 세포로만 구성되어 있는 것이다. 여기에서 실질적으로 간엽계 세포로만 구성되어 있는 세포 집합체는, 상술한 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함하는 것이다. 이 이빨 형성용 간엽계 세포를 포함한 세포 집합체는, 상술한 제조 방법에 따른 제조 공정에 의해 제조할 수 있고, 한편 실질적으로 상피계 세포로만 구성되어 있는 세포 집합체는, 실질적으로 간엽계 세포로 이루어진 세포 집합체와는 독립시켜 제조할 수 있다(제1 세포 제조 공정 및 제2 세포 제조 공정).

또한, 「세포 집합체」란, 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직의 상태여도 좋고 단일 세포의 상태여도 좋다. 또한, 「실질적으로 이루어진」이란, 대상이 되는 세포 이외의 것을 최대한 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명에서는, 실질적 으로 양막 간엽계 세포로 이루어진 세포 집합체는 단일 세포로 구성되어 있는 데 반해, 실질적으로 상피계 세포로 이루어진 세포 집합체는 조직 일부 또는 단일 세포의 집합체로 할 수 있다. 상피계 세포 및 간엽계 세포는 모두 단일 세포로 구성된 세포 집합체인 것이, 배양 후에 여러 개의 이빨을 동시에 형성할 수 있기 때문에 바람직하다.

제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체는 어느 하나가 상피계 세포 및 간엽계 세포여도 좋고, 이 세포 집합체를 구성하는 세포의 수는, 동물의 종류나 지지 담체의 종류, 경도(硬度) 및 크기에 따라 다르지만, 세포 집합체 1개당 일반적으로 1O¹∼1O⁸개, 바람직하게는 1O³∼1O⁸개로 할 수 있다.

본 발명에 사용되는 간엽계 세포는 양막 유래의 간엽계 세포이다. 양막은, 태반의 일부를 구성함과 동시에 자궁 안에서 태아를 감싸는 기관으로서, 이것은 통상 분만시에 배설물로서 폐기되었다. 본 발명에서는 양막이라면 그 입수 경로는 특별히 제한되지 않지만, 분만시 폐기물로서의 양막을 이용하는 것이 바람직하다.

양막은, 양막 상피 세포층과, 양막 기저막층과, 이들 층보다도 두꺼운 양막 치밀층의 3층으로 구성되어 있다. 본 발명에서의 양막 유래의 간엽계 세포는, 이 중 양막 치밀층에 유래된 간엽계 세포이면 된다.

양막 유래의 간엽계 세포는, 양막 조직 전체에서 양막 유래의 간엽계 세포를, 표면 항원 패턴 등을 사용하여 개별적으로 선택해도 좋지만, 양막 상피 세포층과 분리된 후의 양막 치밀층으로부터 제조하는 것이, 다른 세포의 혼입을 줄일 수 있기 때문에 바람직하다.

양막 치밀층의 다른 세포층으로부터의 분리는, 막의 두께나 형태에 기초하여 다른 세포층에서 가위 등을 사용하여 물리적으로 분리한 것이어도 좋고, 효소 처리를 사용하여 화학적으로 상피 세포층 또는 기저막층 등에서 분리한 것이어도 좋다. 치밀층을 얻기 위해 사용되는 효소로서는, 상피 세포층을 분리할 수 있는 것이면 되는데, 예를 들면 상피 세포층을 분리하기 위한 트립신이나 기저막층을 용해하기 위한 디스파아제 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 이들 효소는 단독 또는 여러 개 조합하여 사용해도 좋다. 이들 효소 처리에 의해 상피 세포층 및 기저막층을 제거한 후에 얻어지는 세포층을 양막 치밀층으로 할 수 있다.

효소 처리를 위한 처리 온도나 처리 시간은, 또 경우에 따라 채용되는 원심 분리나 교배의 조건은, 사용하는 효소의 효소 활성에 기초하여 적절히 설정할 수 있으며, 당업자라면 용이하게 목적으로 하는 효소 처리를 실시할 수 있다. 이들 효소 처리는 조직 상태에 따라 반복 수행하거나 여러 종류의 효소를 조합하여 수행해도 좋다. 효소 처리를 사용한 처리로서는, 공지 문헌, 예를 들면 J.Neurosci.Res.78, 208-214, 2004 등을 참조할 수 있다.

양막 간엽계 세포를 양막 치밀층으로 하여 얻은 경우에는, 양막 치밀층을 효소 처리나 교반 등을 사용하여 더욱 단일 세포로 할 수 있다. 양막 치밀층을 단일 세포로 하기 위해 사용 가능한 효소로서는, 콜라게나아제나 디스파아제, 파파인 등의 효소를 들 수 있다. 이들 효소는 단독 또는 여러 개를 조합하여 사용해도 좋다. 이들 효소의 농도나 처리 조건은 당업자라면 용이하게 적절히 설정할 수 있다.

또 실질적으로 간엽계 세포로 이루어진 세포 집단은, 양막 유래의 간엽계 세포를 포함하고 있다면 다른 간엽계 세포를 포함하고 있어도 좋다.

상기 간엽계 세포 이외의 다른 간엽계 세포로서는, 치배 및 치배 이외로부터 유래된 간엽계 세포를 들 수 있다. 치배 이외로부터 유래된 간엽계 세포로서는, 생체내 다른 간엽계 조직에서 유래된 세포로서, 바람직하게는 혈액 세포를 포함하지 않는 골수 세포나 간엽계 줄기세포, 더욱 바람직하게는 구강내 간엽계 세포나 악골 내부의 골수 세포, 두부 신경제(神徑堤) 세포에 유래된 간엽계 세포, 상기 간엽계 세포를 만들어 낼 수 있는 간엽계 전구 세포나 그 줄기세포 등을 들 수 있다.

간엽계 세포로서 양막 이외에서 유래된 간엽계 세포를 사용할 경우에는, 조합하는 다른 간엽계 세포의 유래나 이빨 형성 능력에 따라 다르지만, 목적으로 하는 세포 배치를 가진 이빨을 확실하게 얻기 위해 양막 유래의 간엽계 세포를 적어도 50질량% 이상으로 하는 것이 바람직하고, 약 75질량% 이상이 보다 바람직하고, 90질량% 이상인 것이 더욱 바람직하다. 50질량% 이상이면, 다른 조직 유래의 간엽계 세포의 이빨 형성 능력의 크기에 상관 없이 목적으로 하는 이빨을 확실하게 얻을 수 있기 때문에 바람직하다.

본 제조 방법에서 사용되는 상피계 세포는, 생체 내에서의 세포 배치를 재현하여 특유의 구조 및 방향성을 가진 이빨을 효과적으로 형성하기 위해 치배에 유래된 것이 바람직하고, 그 중에서도 세포 분화 단계의 유약성과 균질성 관점에서 봉상기에서 모상기까지의 것이 바람직하다.

또한, 치배 이외에서 유래된 상피계 세포여도 좋고, 이것으로는 생체내의 다 른 상피 조직에서 유래된 세포를 들 수 있다. 바람직하게는, 피부나 구강내의 점막이나 치육 상피계 세포, 더욱 바람직하게는 피부나 점막 등의 분화된, 예를 들면 각화 또는 착각화(錯角化)된 상피계 세포를 만들어 낼 수 있는 미숙한 상피계 전구 세포, 예를 들면 비각화 상피계 세포나 그 줄기세포 등을 들 수 있다.

세포 집합체를 제조하기 위해 각 세포를 조직에서 단리할 경우, 치배 및 다른 조직은 포유동물의 영장류, 예를 들면 인간, 원숭이 등, 유제류, 예를 들면 돼지, 소, 말 등, 소형 포유류인 설치류, 예를 들면 마우스, 랫트, 토끼 등 여러가지 동물의 악골 등에서 채취할 수 있다. 치배 및 조직 채취는 통상 조직의 채취에 사용되는 조건을 그대로 적용하면 되며, 무균 상태에서 채취하여 적당한 보존액으로 보존하면 된다. 아울러 인간의 치배로서는, 제3대 어금니, 이른바 사랑니의 치배 외에 태아 치배를 들 수 있는데, 자가 조직 이용이라는 관점에서 사랑니 치배를 사용하는 것이 바람직하다.

조직, 예를 들면 치배로부터 상기 세포를 제조할 경우에는, 우선 주위의 조직에서 단리된 치배를, 형상에 따라 치배 간엽 조직 및 치배 상피 조직으로 나눈다. 이 때, 치배 조직은 현미경하에서 구조적으로 분별할 수 있기 때문에 해부용 가위나 핀셋 등으로 절단, 혹은 벗겨냄으로써 용이하게 분리할 수 있다. 또한, 치배 조직으로부터의 치배 간엽 조직 및 치배 상피 조직의 분리는, 그 형상에 따라 주사바늘, 텅스텐 니들, 핀셋 등으로 절단 또는 벗겨냄으로써 용이하게 수행할 수 있다.

바람직하게는 주위 조직에서 치배 세포를 용이하게 분리하기 위해 및/또는 치배 조직에서 상피 조직 및 간엽 조직을 분리하기 위해 효소를 사용해도 좋다. 이와 같은 용도로 사용되는 효소로서는, 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등을 들 수 있다.

세포 집합체를 구성하는 세포는, 채취한 조직으로부터 단일 세포의 상태로 제조해도 좋다. 제조 공정에서 단일 세포로 용이하게 분산할 수 있도록 하기 위해 효소를 사용해도 좋다. 이와 같은 효소로서는, 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등을 들 수 있다. 이 때, 상피 조직으로부터의 상피계 세포의 분리에는 콜라게나아제 처리 후에 트립신 처리와 DNase처리를 하는 것이 바람직하다. 한편, 간엽 조직으로부터의 간엽계 세포의 분리는, 콜라게나아제와 트립신으로 동시에 처리하고 최종적으로 DNase처리를 하는 것이 바람직하다. 이 때 DNase처리를 하는 것은 효소 처리에 의해 일부 세포가 손상을 입어 세포막이 용해되었을 때 용액중에 방출되는 DNA에 의해 세포가 응집되어 세포의 회수량이 저하되는 것을 막기 위함이다.

아울러 세포 집합체를 구성하는 세포는, 각각 충분한 세포수를 얻기 위해 배치 공정에 앞서 예비적인 배양을 거친 것이어도 좋다. 세포의 배양은, 일반적으로 동물 세포의 배양에 사용되는 온도 등의 조건을 그대로 이용할 수 있다.

배양에 사용되는 배지로서는, 일반적으로 동물 세포의 배양에 사용되는 배지, 예를 들면 둘베코 개변 이글 배지(DMEM) 등을 사용할 수 있다. 이 배지에는 세포의 증식을 촉진하기 위한 혈청을 첨가하거나 혹은 혈청을 대체하는 것으로서, 예를 들면 FGF, EGF, PDGF 등의 세포 증식 인자나 트랜스페린 등 기지의 혈청 성분을 첨가해도 좋다. 아울러 혈청을 첨가할 경우의 농도는, 그 때의 배양 상태에 따라 적절히 변경할 수 있지만 통상 10용량%로 할 수 있다. 세포의 배양에는 통상의 배양 조건, 예를 들면 37℃의 온도에서 5% CO₂ 농도의 인큐베이터 내에서의 배양이 적용된다. 또한, 적절히 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가한 것이어도 좋다.

배치 공정에 있어서 세포 집합체의 배치는 상기 제1 및 제2 세포 집합체를, 세포의 접촉 상태를 유지할 수 있는 지지 담체의 내부에 배치한다. 이 때, 각 세포 집합체는 서로 혼합하지 않는다. 이와 같이 각 세포 집합체를 혼합하지 않고 배치하기 때문에 세포 집합체간에 경계선이 형성된다. 이와 같은 배치 형태를, 본 명세서 중에서는 적절히 「구획화」라고 표현한다.

여기에서 사용되는 지지 담체로서는, 세포를 내부에서 배양 가능한 것이면 되는데, 바람직하게는 상기 배지와의 혼합물이다. 이와 같은 지지 담체로서는, 콜라겐, 피브린, 라미닌, 세포 외 매트릭스 혼합물, 폴리글리콜산(PGA), 폴리유산(PLA), 유산/글리콜산 공중합체(PLGA), 셀 매트릭스(상품명), 메비올 겔(Mebiol Gel, 상품명), 매트리 겔(Matrigel, 상품명) 등을 들 수 있다. 이들 지지 담체는 세포를 내부에 배치했을 때 배치한 위치를 대부분 유지할 수 있는 정도의 경도를 가진 것이면 되는데, 겔형, 섬유형, 고체형의 것을 들 수 있다. 여기에서 세포의 위치를 유지할 수 있는 경도란, 통상 3차원 배양으로서 적용되는 경도, 즉, 세포의 배치를 유지할 수 있음과 동시에 증식에 의한 비대화를 저해하지 않는 경도이면 되므로 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 콜라겐의 경우, 최종 농도 2∼3㎎/㎖의 농도에서의 사용이 적절한 경도를 제공한다.

아울러, 여기에서 지지 담체는, 제1 및 제2 세포 집합체가 담체 내부에서 생육할 수 있는 정도의 두께를 가지면 되는데, 목적으로 하는 조직의 크기 등에 의해 적절히 설정할 수 있다.

또한, 지지 담체는 세포가 분산되지 않고 세포의 접촉 상태를 유지할 수 있는 유지력을 갖추고 있으면 된다. 여기에서 말하는 「접촉 상태」란, 각 세포 집합체에서, 그리고 세포 집합체간에서 확실하게 세포 상호 작용시키기 위해 긴밀한(고밀도) 상태인 것이 바람직하다.

고밀도의 상태란, 조직을 구성할 때의 밀도와 동등한 정도임을 말하며, 예를 들면 세포 집합체의 경우, 세포 배치시에 5×1O⁷∼1×1O⁹개/㎖, 세포의 활성을 손상시키지 않고 확실하게 세포 상호 작용시키기 위해 바람직하게는 1×1O⁸∼1×1O⁹개/㎖, 가장 바람직하게는 2×1O⁸∼8×1O⁸개/㎖의 밀도를 말한다. 이와 같은 세포 밀도로 세포 집합체를 제조하려면, 세포를 원심에 의해 응집시켜 침전화하는 것이 세포의 활성을 손상시키지 않고 간편하게 고밀도화할 수 있기 때문에 바람직하다. 이와 같은 원심은 세포의 생존을 손상시키지 않는 300∼1200×g, 바람직하게는 500∼1000×g의 원심력에 해당하는 회전수로 3∼10분간 실시하면 된다. 300×g보다도 낮은 원심에서는, 세포의 침전이 불충분해져 세포 밀도가 낮아질 우려가 있고, 한편 1200×g보다도 높은 원심에서는 세포가 손상을 입는 경우가 있기 때문에 각각 바람직하지 않다.

원심 분리에 의해 고밀도의 세포를 제조할 경우에는, 통상적으로 세포를 원 심 분리하기 위해 사용되는 튜브 등의 용기에 단일 세포의 현탁액을 제조한 후에 원심 분리하여 상청액을 최대한 제거하면 된다. 이 때 사용되는 튜브 등의 용기는 상청액을 완전히 제거하는 관점에서 실리콘 코팅된 것이 바람직하다.

원심분리에 의한 침전물로 한 경우에는, 침전물을 그대로 지지 담체의 내부에 배치하면 된다. 이 때, 목적으로 하는 세포 이외의 성분(예를 들면, 배양액, 완충액, 지지 담체 등)은, 세포의 용량과 동량 이하인 것이 바람직하고, 목적으로 하는 세포 이외의 성분을 포함하지 않는 것이 가장 바람직하다. 이와 같은 고밀도의 세포 집합체에서는 세포가 긴밀하게 접촉되어 있어 세포간 상호 작용이 효과적으로 발휘된다.

조직 상태에서 사용할 경우에는, 효소 처리 등을 하여 대상이 되는 세포 이외의 결합 조직 등을 제거하는 것이 바람직하다. 목적으로 하는 세포 이외의 성분이 많은 경우, 예를 들면 세포의 용량과 동량 이상이 되면, 세포간 상호 작용이 충분히 발휘되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

또한, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉은 밀접할수록 바람직하고, 제1 세포 집합체에 대해 제2 세포 집합체를 눌러붙여 배치하는 것이 특히 바람직하다. 또 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체의 주위를 배양액, 산소 투과를 저해하지 않는 고형물로 감싸는 것도 세포 집합체끼리의 접촉을 밀접하게 하기에 효과적이다. 점도가 다른 용액에 밀도가 높은 세포 현탁액을 집어넣어 배치시키고, 용액을 그대로 고형화시키는 것도 세포의 접촉 유지를 용이하게 달성할 수 있기 때문에 바람직하다. 이 때, 제1 세포 집합체를 치배 간엽계 세포의 단일 세포 집합물로 하 고, 제2 세포 집합체를 치배 상피 조직으로 한 경우에는, 치배 상피 조직의 에나멜 결절이 제1 세포 집합체에 접촉하도록 배치하는 것이 바람직하지만, 여기에 한정되지는 않는다.

지지 담체가 겔 형태 혹은 용액 형태인 경우에는 배치 공정 후에 지지 담체를 고형화시키는 고형화 공정을 마련해도 좋다. 고형화 공정에 의해 지지 담체 내부에 배치된 세포가 지지 담체 내부에 고정화된다. 지지 담체의 고형화에는, 일반적으로 사용한 지지 담체의 고형화 조건을 그대로 적용하면 된다. 예를 들면 지지 담체에 콜라겐 등의 고형화 가능한 화합물을 사용한 경우에는, 통상 적용되는 조건으로, 예를 들면 배양 온도하에서 수분∼수십분 정치시킴으로써 고형화시킬 수 있다. 이로써 지지 담체 내부에서의 세포간 결합을 고정화시킴과 동시에 견고하게 할 수 있다.

본 발명의 제조방법에서의 배양 공정에서는, 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체를 지지 담체 내부에 배양한다. 이 배양 공정에서는 서로 긴밀하게 접촉된 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체에 의해 세포간 상호 작용이 효과적으로 이루어져 조직, 즉 이빨이 재구성된다.

배양 공정은, 지지 담체에 의해 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉 상태가 유지되어 이루어지면 되는데, 제1 및 제2 세포 집합체를 가진 지지 담체 단독에 의한 배양이어도 좋고 다른 동물 세포의 존재하에서의 배양이어도 좋다.

배양 기간은, 지지 담체 내부에 배치된 세포수 및 세포 집합체 상태, 나아가 배양 공정의 실시 조건에 따라 다르지만, 일반적으로 1∼300일, 에나멜질을 바깥쪽 에 가지고 상아질을 안쪽에 가진 이빨을 형성하기 위해서는, 바람직하게는 1∼120일, 신속하게 제공할 수 있도록 하는 관점에서는, 바람직하게는 1∼60일로 할 수 있다. 나아가 치주 조직을 구비한 이빨로 하기 위해서는 일반적으로 1∼300일, 바람직하게는 1∼60일로 할 수 있다.

지지 담체만의 배양으로 한 경우에는, 동물 세포의 배양에 사용되는 통상의 조건하에서의 배양으로 할 수 있다. 여기에서의 배양은, 일반적으로 동물 세포에서의 배양 조건을 그대로 적용하면 되므로 전술한 조건을 그대로 적용할 수 있다. 또한 배양에는 포유동물 유래의 혈청을 첨가해도 좋고, 이들 세포의 증식이나 분화에 유효한 것으로 이미 알려져 있는 각종 세포 인자를 첨가해도 좋다. 이와 같은 세포 인자로는 FGF, BMP 등을 들 수 있다.

또한, 조직이나 세포 집합체의 가스 교환이나 영양 공급의 관점에서 기관 배양을 사용하는 것이 바람직하다. 기관 배양에서는, 일반적으로 동물 세포의 증식에 적합한 배지상에 다공성 막을 플로팅시키고, 그 막 위에 지지 담체로 감싸져 있는 세포 집합체를 놓고 배양한다. 여기에서 사용되는 다공성 막에는 0.3∼5㎛ 정도의 포어를 다수 가진 막인 것이 바람직하고, 구체적으로는 셀 컬쳐 인서트(상품명), 아이소포어 필터(isopore filter, 상품명)를 들 수 있다.

다른 동물 세포의 존재하에서의 배양인 경우에는, 동물 세포로부터 각종 사이토카인 등의 작용을 받아 조기에 특유의 세포 배치를 가진 이빨을 형성할 수 있기 때문에 바람직하다. 이와 같은 다른 동물 세포의 존재하에서의 배양은, 단리 세포나 배양 세포를 사용하여 생체 외에서의 배양에 의해 수행해도 좋다.

또한, 제1 및 제2 세포 집합체를 가진 지지 담체를 생체에 이식하여 생체 내에서 배양해도 좋다. 이와 같은 생체 내에서의 배양은, 이빨, 나아가 치주 조직의 형성을 조기에 실시할 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 이 경우, 지지 담체와 함께 제1 및 제2 세포 집합체가 생체 내에 이식된다.

이러한 용도로 이용 가능한 동물은, 포유동물, 예를 들면 인간, 돼지, 마우스 등을 바람직하게 들 수 있고, 치배 조직과 동일한 종에서 유래된 것이 더욱 바람직하다. 인간 치배 조직을 이식할 경우에는, 인간, 또는 면역이 불완전하게 변형된 인간 이외의 다른 포유동물을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 생체내 생육에 적합한 생체 부위로서는, 동물 세포의 기관이나 조직을 최대한 정상적으로 발생시키기 위해서는 신장 피막하, 장간막, 피하 이식, 구강 내 등이 바람직하다.

이식에 의한 생육 기간으로서는, 이식시의 크기와 발생시키는 이빨의 크기에 따라 다르지만 일반적으로 3∼400일로 할 수 있다. 예를 들면, 신장 피막하로의 이식 기간은 이식하는 배양물의 크기와 재생시키는 이빨의 크기에 따라서도 다르지만, 이빨의 재생과 이식처에서 발생시키는 이빨의 크기 관점에서 7∼60일간인 것이 바람직하다.

생체에 이식하기 전에 생체 외에서의 배양(전배양)을 해도 좋다. 이 전배양에 의해 세포간의 결합과 제1 및 제2 세포 집합체끼리의 결합을 견고하게 하여 세포간 상호 작용을 보다 견고하게 할 수 있기 때문에 바람직하다. 그 결과, 전체 생육 기간을 단축할 수 있다.

전배양 기간은 단기여도 좋고 장기여도 좋다. 장기간, 예를 들면 3일 이상, 바람직하게는 7일 이상으로 한 경우에는 치배에서 치아로 발생시킬 수 있어 이식 후에 이빨이 생길 때까지의 기간을 단축할 수도 있기 때문에 바람직하다. 전배양 기간으로서는, 예를 들면 신장 피막하에 이식할 경우의 기관 배양으로서, 바람직하게는 1∼7일로 하는 것이 효율적으로 이빨을 재생하기 위해 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 이빨은 안쪽에 상아질, 바깥쪽에 에나멜질이라는 이빨 특유의 세포 배치(구조)를 갖는 것으로서, 또한 바람직하게는, 이빨의 선단(치관)과 치근이라는 방향성도 갖춘 것이다. 적어도 이와 같은 특유의 세포 배치, 바람직하게는 세포 배치에 추가하여 방향성을 가짐으로써 이빨로서의 기능도 발휘할 수 있는 것이다. 따라서 이빨의 대체물로서 널리 이용할 수 있다. 특히, 자가의 치배에 유래된 간엽계 세포 및 상피계 세포를 사용한 경우에는 거부 반응에 의한 문제를 회피하면서 사용할 수 있다. 또한, 일반적으로 이식 항원이 적합한 타인의 치배에서 유래된 세포를 사용하는 경우에도 거부반응에 의한 문제를 회피할 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 이빨은 이빨 특유의 세포 배치를 가진 이빨의 집합체여도 좋다.

이와 같은 이빨의 집합체는, 이빨 특유의 세포 배치를 가진 여러 개의 이빨로 구성되어 있기 때문에 각각의 이빨을 집합체에서 분리하여 이하에 설명하는 바와 같이 이빨 1개의 이식편으로서 사용할 수 있다. 그 결과, 이식편으로서의 이빨을 효율적으로 제작할 수 있다.

복수 개의 이빨로 구성된 이빨의 집합체를 얻기 위해서는, 제1 및 제2 세포 집합체 모두 단일 세포로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 이로써 이빨의 갯수를 제어하는 에나멜 센터 등의 인자를 포함한 부분을 여러 개 존재시킬 수 있어 여러 개의 이빨을 용이하게 형성할 수 있다.

아울러, 배양 공정은 상기와 같이 기관 배양이어도 좋고 신장 피막하에서의 배양이어도 좋지만, 얻어진 이빨을 이식편으로서 사용할 경우에는, 다른 동물 세포와의 접촉이 없고 또 전과정을 in vitro로 제조할 수 있는 기관 배양으로 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 제조방법에서는, 배양 기간을 치주 조직이 형성될 때까지 계속해도 좋다. 이로써 이빨 그 자체에 추가하여 이빨을 악골 위에서 지지하고 고정화시키는 치조골이나 치근막 등의 치주 조직도 형성시킬 수 있다. 그 결과, 이식 후에 실용 가능한 이빨을 제공할 수 있다.

아울러, 치주 조직을 제조하기 위해서는 상기 배양 공정 후에 상기 배양에 의해 얻어진 치주 조직을 단리하는 공정을 마련하여 치주 조직만을 얻어도 좋다. 치주 조직의 단리는, 배양 공정의 과정에서 형성된 치주 조직과 이빨을 분리할 수 있는 방법이라면 어떤 방법으로 수행해도 좋은데, 핀셋 등에 의한 분리나 효소에 의한 부분 소화 등을 들 수 있다.

본 발명에 따라 얻어진 이빨 및 치주 조직은, 이식편으로서 사용되는 것 외에 이빨의 발생 과정을 해명하기 위한 연구에도 바람직하게 이용할 수 있고, 앞으로 이빨에 관련된 조직 발생을 위해 유효한 리서치 툴(tool)로서 이용할 수 있다.

아울러, 얻어진 이빨 또는 치주 조직을 이식편으로서 사용할 경우에는, 제조 방법에서의 배양 공정을 다른 동물 세포와의 접촉이 없고 또한 전과정을 in vitro로 제조할 수 있는 기관 배양으로 한 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에는 이빨의 이식 방법이 포함된다. 이 이식 방법에는, 상기 이빨의 집합체를 얻는 공정과, 이빨의 복합체로부터 개개의 이빨을 분리하는 공정과, 분리된 이빨을 이식 부위에서의 다른 이빨과 동일한 방향성이 되도록 일치시켜 이식하는 공정을 포함한다.

이로써 이빨의 이식을, 특유의 세포 배치와 방향성을 구비한 여러 개의 이빨을 동시에 얻어 효율적으로 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 이빨은 이빨의 결손 및 손상을 동반한 각종 증상, 예를 들면 충치, 변연성(邊緣性) 치주염(치조농루), 치주병에 의한 이빨의 결손, 사고 등에 의한 절손이나 탈락 등의 치료 또는 조치에 적용할 수도 있다.

즉, 본 발명의 치료 방법은, 본 발명에 의한 제조방법에 의해 얻어진 이빨 및/또는 치주 조직을 결손 및/또는 손상 부위에 이식하는 것을 포함한다. 이로써 결손 및/또는 손상 부위의 상기 증상을 치료 및/또는 완화시킬 수 있다.

본 발명의 다른 치료 방법은, 본 발명에서의 배양 공정만, 또는 배치 공정 및 배양 공정을 결손 및/또는 손상 부위에서 실시하는 것을 포함한다. 이 경우, 지지 담체로서는, 상술한 것에 추가하여 결손 및/또는 손상 부위의 주위 조직 그 자체를 지지 담체로서 적용해도 좋다. 이로써 생체 내의 주변 조직에서의 사이토카인 등에 의해 보다 신속하게 결손 및/또는 손상 부위의 치료 등을 수행할 수 있다.

이하에 본 발명의 실시예에 대해서 설명하였으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예 중의 %는 별도로 기재하지 않는 한 중량(질량) 기준이다.

(1)양막 유래의 간엽계 세포의 제조

인간 양막 간엽계 세포의 이빨 형성 능력을 평가하기 위해 인간 양막 조직으로부터 인간 양막 간엽계 세포를 제조하였다.

사전 동의(Informed Consent)를 얻어 제공된 태반으로부터 양막 조직을 물리적으로 벗겨냈다. 15㎝의 접시에 PBS(-)를 적당량 넣어 외과용 가위로 절단하고 핀셋을 사용하여 세정함으로써 얻어진 양막 조직에서 혈구계 세포를 제거하였다. 처리 후의 양막 조직을 새로운 접시에 옮겨 PBS(-)로 다시 한 번 세정하고 나서 한번 더 재단한 후, 25㎖의 0.25% 트립신(GIBCO社製)을 넣은 50㎖ 원심관으로 옮겼다.

우선 양막 유래 상피 세포를 제거하기 위해 다음과 같이 효소 처리를 실시하였다. 진탕 배양기를 사용하여 효소 반응(200rpm, 15분, 37℃)을 실시한 후, 처리 후의 양막 조직을 새로운 25㎖의 0.25% 트립신(GIBCO社製)을 넣은 50㎖ 원심관으로 옮겨 효소 반응(400rpm, 15분, 37℃)을 수행하였다. 트립신 처리를 3회(합계 5회) 더 반복하여 주로 상피 세포층을 제거하였다.

이어서 양막 유래 간엽 세포를 회수하기 위해 15㎜의 접시에 PBS(-)를 적당량 넣어 5회째 트립신 처리를 마친 양막 조직을 옮겨 세정하고 사방 약 5㎜를 가위로 절단하였다. 절단 후의 조직 시료를 계속해서 효소 혼합액(행크스 평형 염류 용액 중, 1mg/㎖ 콜라게나아제(Sigma社製), O.1% 디스파아제Ⅱ(Roche社製), O.01% 파파인(Worthington社製), 0.01% DNase(Sigma社製)를 넣은 50㎖ 원심관으로 옮겨 진 탕 배양기로 효소 반응(400rpm, 1시간, 37℃)을 수행하였다. 효소 처리하여 얻어진 세포 현탁액을 금속 필터로 여과시키고 얻어진 여과액을 50㎖ 원심관으로 옮겨 원심분리(2000rpm, 10분, 실온)하였다. 원심분리 후의 상청액을 버리고 펠릿을 PBS(-)로 3회 세정하였다. 40㎛의 나일론 메쉬로 여과 후, 원심(2000rpm, 10분, 실온)하여 양막 간엽계 세포를 얻었다.

양막 간엽계 세포를 10ng/㎖의 hLIF(Sigma社製), 0.2mM의 머캅토에탄올(Sigma社製), 10%의 FCS(JRH Biosciences, Lenexa, KS)를 첨가한 DMEM/F12(Sigma社製)에 현탁하고 1㎖ 중에 약 1∼5×1O⁵개의 세포 밀도로 1O㎝ 세포 배양 접시에 파종하였다. 재구성 치배를 제작할 때까지 적시에 트립신 처리로 세포를 분산하여 계대 배양을 실시하였다.

(2)치배 상피 조직의 제조

Green Fluorescence Protein(EGFP) 트랜스제닉 마우스인 C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131(리켄(理硏) 바이오리소스 센터에서 구입)의 배자(胚子)(태령 14.5일)로부터 하악 절치(切齒) 치배 조직을 현미경하에서 통상의 방법으로 적출하였다. 하악 절치 치배 조직을 Ca²⁺, Mg²⁺ 미함유 인산 완충액(PBS(-))으로 세정하고, PBS(-)에 최종 농도 1.2U/㎖의 디스파아제II(Roche社製)를 첨가한 효소액으로 실온에서 12.5분간 처리하였다. 그 후, 10% FCS(JRH社製)를 첨가한 DMEM(Sigma社製)으로 3회 세정하였다. 또한, DNaseI용액(Takara社製)을 최종 농도 70U/㎖가 되도록 첨가하여 치배 조직을 분산시키고, 25G 주사바늘(Terumo社製)를 사용하여 외과적으로 치배 상피 조직을 분리하였다.

(3)재구성 치배의 제작

재구성 치배의 제작에는 상기에서 제조된 치배 상피계 조직과, 인간 양막 간엽계 세포를 사용하였다.

인간 양막 간엽계 세포를 트립신 처리에 의해 접시에서 회수하였다. 실리콘 그리스를 도포한 1.5㎖ 마이크로 튜브(Eppendorf社製)에 10% FCS(JRH) 첨가 DMEM(Sigma社製)으로 현탁한 인간 양막 간엽계 세포를 넣고 원심분리에 의해 세포를 침전시켜 회수하였다. 원심 후 배양액의 상청액을 최대한 제거하고 다시 한번 원심조작을 하여 실체 현미경으로 관찰하면서 세포의 침전 주위에 잔존하는 배양액을 GELoader Tip 0.5-20㎕(에펜돌프社製)를 사용하여 완전히 제거하고 재구성 치배 제작에 사용하는 인간 양막 간엽계 세포를 준비하였다.

실리콘 그리스를 도포한 페트리 디쉬에 2㎎/㎖의 Cellmatrix type I-A(新田젤라틴社製)를 30㎕ 떨어뜨려 콜라겐 겔드롭을 제작하였다. 이 용액에 상기 인간 양막 간엽계 세포를 0.1-10㎕의 피펫 팁(Quality Scientific plastics社製)을 사용하여 0.2㎕∼0.3㎕ 적용하여 세포 응집체를 제작하였다. 계속해서 1O㎕의 피펫 팁을 사용하여 치배 상피 조직을 같은 겔드롭 안에 적용하고 텅스텐침을 사용하여 분리한 치배 유래 상피 조직이 본래 간엽 조직과 접촉되어 있던 면을 인간 양막 간엽계 세포의 세포 응집괴에 밀착시켰다. 그 후, 겔 드롭을 고형화시킴으로써 치배 상피 조직과 인간 양막 간엽계 세포간의 결합을 보다 견고하게 함으로써 고밀도 재구성 치배를 제작하였다.

이것을, 도 1을 참조하여 설명하기로 한다. 아울러 도 1에서, 10은 겔 드롭(지지 담체)이고, 12는 세포 응집체(제1 세포 집합체)이고, 14는 세포 응집체(제2 세포 집합체)이고, 16은 피펫 팁을 나타낸다.

피펫 팁(16)으로 먼저 겔 드롭(10)(도 1a 참조) 안에 배치된 세포 응집체(12)는 겔 드롭(10) 안에서 구체를 구성한다(도 1b 참조). 그 후에 다른 쪽 세포 응집체(14)를 밀어넣음으로써 구체의 세포 응집체(12)가 으깨어져 다른 쪽 세포 응집체(14)를 감싸게 된다(도 1c 참조). 그 후에 겔 드롭(10)을 고형화시킴으로써 세포간의 결합이 견고해진다(도 1d 참조).

(4)재구성한 치배의 기관 배양

겔 속에서 제작한 고밀도 재구성 치배는 CO₂ 배양기에 10분간 정치시켜 Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin 社製)를 고형화하였다. 10용량% FCS(JRH社製), 0.1㎎/㎖의 L―아스코르빈산(Sigma社製), 2mM의 L―글루타민(GIBCO社製)을 첨가한 DMEM(Sigma社製)에 셀 컬쳐 인서트(포어 사이즈가 0.4미크론인 PET멤브레인; BD社製)가 접하도록 배양 용기를 준비하였다. 배양 용기의 셀 컬쳐 인서트의 막위에 재구성 치배를 지지 담체인 주위의 겔과 함께 옮겨 기관 배양하였다.

기관 배양에 의해 이빨의 발생을 해석할 경우에는, 통상 14일간 배양하였다. 배양 종료 후, 4% 파라포름알데히드-인산 완충액으로 6시간 고정시킨 후, 4.5%의 EDTA(pH 7.2)에서 24시간 중성 탈회(脫灰)를 수행하였다. 그 후, 통상의 방법에 의해 파라핀으로 감싸서 10㎛의 절편을 제작하였다. 조직학적 해석을 위해서는 통상 의 방법에 따라 헤마톡시린-에오신 염색(HE염색)을 수행하였다.

또한, C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131 마우스 유래의 치배를 사용한 경우에는, 중성 탈회 후 12.5%의 수크로오스(Wako社製)에서 12시간, 25%의 수크로오스(Wako社製)에서 12시간 처리하여 OCT compound(Miles Inc.社製)로 감싸서 클리오스탯(Leica社製)으로 10 ㎛의 절편을 제작하고, 형광 현미경(ZEISS절조각)으로 관찰하였다. 또한, 조직학적 해석을 위해서는 통상의 방법에 의해 헤마톡실린-에오신 염색(HE염색)을 수행하였다.

(5)기관 배양에 의한 평가

도 2에 도시된 바와 같이, 상기와 같이 하여 얻어진 재구성 치배를 기관 배양함으로써 재생 이빨이 형성되었다. 이 재생 이빨은, 도 2에 도시된 바와 같이 바깥쪽에서부터 에나멜 아세포, 에나멜질, 상아질, 상아 아세포, 중앙에 치수(齒髓) 세포를 가지고 있었다. 이 세포 배치는 정상적인 이빨과 동일하다.

이로부터, 본 실시예에 의하면, 인간 양막 간엽계 세포와 치배 상피 조직을 고밀도로 구획화하여 배양함으로써 간엽계 세포와 상피 조직이 효과적으로 상호 작용하여 특유의 조직 구조를 가진 이빨을 형성할 수 있다는 것이 명백해졌다.

다음으로, 형성된 이빨을 구성하는 각 세포의 유래를, 미분 간섭 현미경(differential interference microscope) 및 형광 현미경을 사용하여 확인하였다.

미분 간섭 현미경상에 의한 관찰에서는 치배의 기관 배양과 마찬가지로 이빨 특유의, 바깥쪽에서부터 에나멜 아세포, 에나멜질, 상아질, 상아 아세포, 중앙에 치수 세포를 가진 조직 구조를 확인할 수 있었다. 또한 도 3에 도시된 바와 같이, 형광 현미경에 의한 GFP의 관찰로부터, 에나멜질의 바깥쪽에 위치한 에나멜 아세포는 GFP양성(도 3 중, 밝은 부분)이고, 상아질의 내부에 위치한 상아 아세포와 치수 세포는 GFP음성(도 3 중, 어두운 부분)이라는 것이 판명되었다.

그 결과는, 에나멜질의 바깥쪽에 위치한 에나멜 아세포가 상피계 세포에서 유래된 세포이고, 상아질의 안쪽에 위치한 상아 아세포와 치수 세포가 양막 간엽계 세포에서 유래된 것을 나타내고 있다.

이와 같이 본 발명에 의하면, 양막 유래의 간엽계 세포와 치배 유래의 상피계 세포를 구획화하여 배양함으로써 특유의 세포 배치를 가진 이빨을 형성할 수 있다. 또한, 양막 유래의 간엽계 세포가 이빨의 형성에 유용하다는 것이 명백하다.

일본특허출원 제2007-49128호의 개시는 그 전체가 참조로 본 명세서에 통합되어 있다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허출원 및 기술규격은 각각의 문헌, 특허출원 및 기술규격이 참조로 통합되는 것이 구체적 및 개별적으로 기록된 경우와 동일한 정도로 본 명세서 중에 참조로 통합된다.

Claims (9)

1. 지지 담체의 내부에 양막 유래의 간엽계 세포 및 상피계 세포 중 실질적으로 어느 하나로만 이루어진 제1 세포 집합체와, 실질적으로 다른 하나로만 이루어진 제2 세포 집합체를 혼합하지 않고 밀착시켜 배치하는 단계,

   상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 단계를 포함하는 이빨의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 양막이 양막 치밀층 유래인 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 상피계 세포가 치배, 피부, 점막 및 치육 중 적어도 하나에서 유래된 상피계 세포인 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 상피계 세포가 치배 유래인 이빨의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 양막 유래의 간엽계 세포를 실질적으로 포함하는 제1 세포 집합체 또는 제2 세포 집합체가 단일 세포로 구성된 세포 집합체인 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 제1 세포 집합체 및 제2 집합체가 모두 단일 세포 집합체인 제조방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 지지 담체가 콜라겐, 피브린, 라미닌, 세포외 매트릭스 혼합물, 폴리글리콜산(PGA), 폴리유산(PLA), 유산/글리콜산 공중합체(PLGA), 셀 매트릭스(상품명), 메비올 겔(상품명) 및 매트리 겔(상품명)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종류인 제조방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 배양을 치주 조직이 형성될 때까지 계속하는 것을 특징으로 하는 이빨의 제조방법.
9. 제1항에 따른 이빨의 제조방법에 의해 얻어진 이빨.

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