KR20090114432A - 수지상 세포 아시알로당단백질 수용체(ｄｃ-ａｓｇｐｒ)를 통해 항원-제시 세포를 유도하는 제제 - Google Patents

수지상 세포 아시알로당단백질 수용체(ｄｃ-ａｓｇｐｒ)를 통해 항원-제시 세포를 유도하는 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 예를 들어 수지상 세포 및 다른 세포들을 활성화시킬 수 있는 항-DC-ASGPR 항체를 제조하고 이용하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
수지상 세포, 수지상 세포 아시알로당단백질 수용체, DC-ASGPR, 항원 제시 세포

Description

수지상 세포 아시알로당단백질 수용체(ＤＣ-ＡＳＧＰＲ)를 통해 항원-제시 세포를 유도하는 제제{Agents that engage antigen-presenting cells through dendritic cell asialoglycoprotein receptor (DC-ASGPR)}
본 발명은 수지상 세포 아시알로당단백질 수용체 (dendritic cell asialogycoprotein receptor: DC-ASGPR)를 통해 항원-제시 세포를 유도 (engage)하는 제제에 관한 것이다.
본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 본 발명의 배경을 항원 제시와 관련지어 설명한다.
수지상 세포 (DC)는 가용성의 세포간 시그널에 이어 병원체의 인식을 제공함으로써 선천 면역 및 후천 면역의 상호 연결을 조절하는데 있어 중요한 역할을 한다. DC의 이러한 기능은 특수화된 표면 수용체인 '패턴 인식 수용체 (pattern recognition receptor: PRR)', 가장 두드러지게는 toll-형 수용체 (TLR) 및 C-타입 렉틴 또는 렉틴-형 수용체 (LLR)로 대표되는 PRR의 발현에 크게 의존적이다 (참조문헌 1-3).
최근의 패러다임에서, TLR의 주요 역할은 인터루킨 12 (IL-12) 및 면역 반응을 개시시키기 위한 기타 염증성 사이토카인을 생성하도록 DC를 경계시키는 것이다. C-타입 LLR은 강력한 항원 포획 및 대식구 및 DC의 흡수 메카니즘의 구성물로서 작용한다 (참조문헌 1). 그러나, TLR과 비교하여, LLR은 세포 이동 (참조문헌 4), 세포간 상호작용 (참조문헌 5)를 포함한 보다 광범위한 범위의 생물학적 기능을 가질 것이다. LLR의 이러한 다수의 기능은, TLR과는 달리, LLR이 자신과 비자신을 인식할 수 있다는 사실 때문일 수 있다. 그러나, 면역 세포에서 발현되는 많은 LLR의 중복을 포함하여, LLR의 복잡성은 개개 LLR의 상세한 기능을 이해하는데 있어 주요한 장애물 중의 하나가 되어 왔다. 또한, 대부분의 이러한 수용체 대한 천연 리간드는 확인되지 않은 채로 남겨져 있다. 그럼에도 불구하고, 최근의 연구로부터의 증거는, LLR이 TLR과 함께 미생물 감염 동안 면역 세포의 활성화에 기여할 수 있다는 것을 제시한다 (참조문헌 6 내지 14).
문헌 [참조: Valladeau et al., The Journal of Immunology, 2001, 167: 5767-5774]은 간 아시알로당단백질 수용체와 관련된 미성숙 사람 수지상 세포 상의 신규한 LLR 수용체를 기술하며, 이 수용체가 세포내이입을 효과적으로 매개한다는 것을 입증하였다. DC-ASGPR mRNA는 주로 면역 조직, DC 및 과립세포에서는 관측되나, T, B, 또는 NK 세포에서는 관측되지 않았다. DC-ASGPR 종은 CD34-유도된 전구 세포로부터 수득된 CD14-유도된 DC에 제한되었으며, CD1a-유도된 서브세트로부터는 부재하였다. 단핵구-유도된 DC 및 편도 사이질-타입 DC는 모두 DC-ASGPR 단백질을 발현하였으나, 랑게르한스-타입 세포는 발현하지 않았다. 또한, DC-ASGPR는 이의 발현이 CD40의 활성화시 상실되었기 때문에 미성숙의 특징이었다. 세포질내 도메인에서의 타이로신-기초된 디루이신 모티프의 존재와 일치하게, DC-ASGPR에 대한 mAb는 37 ℃에서 DC에 의해 빠르게 내화되었다. 마지막으로, 세포내 DC-ASGPR은 초기 엔도솜에 국한되었으며, 이는 수용체가 리간드의 내화 후 세포로 재순환된다는 것을 제시한다. 이러한 발견으로 DC-ASGPR/사람 대식구 렉틴이 미성숙 DC의 특징이고, DC의 특수화된 Ag-포획 기능에 중요한 또 다른 렉틴이라는 것을 확인하였다.
발명의 요지
DC-ASGPR은 대리 (surrogate) 항원의 사람 DC로의 내화를 지시할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 본 발명은 면역계에서, 일부의 경우엔 항원 흡수 (예: 예방접종)와 관련하여, 다른 경우엔 DC, B 세포 및 단핵구 상의 DC-ASGPR 수용체를 통해 시그널전달을 유도할 수 있는 (단독 또는 다른 면역 조절 분자와 협조된) DC-ASGPR 이펙터 (effector)의 독특한 작용을 통해, 특히 목적하는 변화를 수행하기 위한 DC-ASGPR의 새로운 생물학적 활성을 이용한다. 본 발명의 기술은 DC-ASGPR을 갖는 세포를 활성화시킬 수 있는 새로운 제제를 개발하는 수단, 및 면역계의 다른 세포에 대한 작용에 있어 이러한 시그널을 받은 세포에서 발생된 변화의 효과를 나타낸다. 이러한 효과는 (단독으로나 다른 시그널과 협조하여 (즉, 공동 자극)) 특정 질환 상태에 대한 치료 결과 또는 예방접종과 관련하여 보호적 결과의 증대를 잘 예시한다.
본 발명은, 표적되는 제제가 부착되어 항체-제제 복합체를 형성하는 DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편을 분리 및 정제함으로써 (여기서, 상기 제제는 항체-제제 복합체와 접촉되었던, 예를 들어, 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시된다) DC-ASGPR-발현 항원 제시 세포에 의한 항원 제시의 효율을 증가시키는 조성물 및 방법을 포함한다. 하나의 양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이며, DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편은 코헤린/도커린 쌍 (Coherin/Dockerin pair)의 절반에 결합된다. 또한, DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편은 코헤린/도커린 쌍의 절반에 결합될 수 있고, 항원은 코헤린/도커린 쌍의 상보적 절반에 결합되어 복합체를 형성한다. 비제한적 예의 제제는 하나 이상의 펩타이드, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 이들의 조합을 포함한다.
제제는 인터루킨 중에서 선택되는 하나 이상의 사이토카인, 전환 성장 인자 (TGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈소판 유도된 성장인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 연결 조직 활성화된 펩타이드 (CTAP), 뼈형성 인자, 및 이러한 성장 인자들의 생물학적 활성 유사체, 단편, 및 유도체, B/T-세포 분화 인자, B/T-세포 성장 인자, 분열촉진 사이토카인, 화학주성 사이토카인, 콜로니 자극 인자, 혈관형성 인자, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 등, 렙틴, 미오스타틴, 대식구 자극 단백질, 혈소판-유도된 성장 인자, TNF-α, TNF-β, NGF, CD40L, CD137L/4-1BBL, 사람 림포톡신-β, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-1α, IL1-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, 에리트로포이에틴, 엔도스타틴, 안지오스타틴, VEGF, 전환 성장 인자 (TGF) 슈퍼유전자 패밀리, 예를 들어 베타 전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3); 뼈 형태형성 단백질 (예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); 헤파린-결합 성장 인자 (섬유모세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF), 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF), 인슐린-형 성장 인자 (IGF)); 인히빈 (예를 들어, 인히빈 A, 인히빈 B); 성장 분화 인자 (예를 들어, GDF-1); 및 악티빈 (예를 들어, 악티빈 A, 악티빈 B, 악티빈 AB)일 수 있다. 또 다른 양태에서, 제제는 세균, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 암 단백질인 항원을 포함한다.
또한, 본 발명은 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편을 결합시키는 것을 포함하며, 상기 항원은 항체-항원 복합체와 접촉되었던 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시되는, 수지상 세포에 의한 항원 제시의 효율을 증대시키는 조성물 및 방법을 포함한다. 또 다른 양태는, 항원-제시 세포에 항원을 전달하기 위한 DC-ASGPR 지시되는 항체 또는 기타 특이적 결합 분자의 보호적 또는 치료적 면역 반응을 유도하기 위한 용도에 관한 것이다. DC-ASGPR에 대해 특이적인 항원-표적화 시약의 피부를 통한 예방접종을 위한 용도; DC-ASGPR에 대해 특이적인 항원-표적화 시약의 함께-투여되거나 연결된 애주번트와 공동으로 예방접종을 위한 용도, 또는 재조합 항원-항체 융합 단백질로서 발현될 수 있는 특정 항원의 항원-표적화 (예방접종) 목적으로의 용도를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 환자의 수지상 세포를 분리시키고; 수지상 세포를 활성화 양의 항-DC-ASGPR 항체 또는 이의 단편 및 항원에 노출시켜 항원-로딩되고 활성화된 수지상 세포를 형성하며; 항원-로딩되고 활성화된 수지상 세포를 환자에게 재도입함으로써 수지상 세포의 효율을 증가시키는 방법을 포함한다. 항원은 세균, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 암 단백질일 수 있다. 또한, 본 발명은 포유동물 세포로부터 분비되는 항-DC-ASGPR 면역글로불린 또는 이의 일부 및 면역글로불린에 결합된 항원을 포함한다. 면역글로불린은 도헤신/도커린 도메인의 절반에 결합되거나, 모듈방식의 rAB 캐리어와 복합체를 형성하는 항원에 결합된 도헤신-도커린 결합 쌍의 상보적 절반, 또는 항원과의 융합 단백질인 도헤신-도커린 결합 쌍의 상보적 절반을 포함할 수 있다. 항원 특이적 도메인은 전장의 항체, 항체 가변 영역 도메인, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편 및 Fv 단편, Fabc 단편 및/또는 Fc 도메인의 일부와의 Fab 단편일 수 있다. 또한, 항-DC-ASGPR 면역글로불린은 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 독소에 결합될 수 있다: 방사성 동위원소, 금속, 효소, 보툴린, 테타누스, 리신, 콜레라, 디프테리아, 아플라톡신, 퍼프린겐 독소, 미코톡신, 시가톡신, 스타필로코쿠스 장독소 B, T2, 세구이톡신, 삭시톡신, 아브린, 시아노기노신, 알파톡신, 테트로도톡신, 아코노톡신, 뱀독 및 거미독. 항원은 면역글로불린과의 융합 단백질이거나 화학적으로 공유결합되거나 결합되지 않을 수 있다.
또한, 본 발명은 환자의 수지상 세포를 분리시키고; 수지상 세포를 활성화 양의 항-DC-ASGPR 항체 또는 이의 단편 및 항원에 노출시켜 항원-로딩되고 활성화된 수지상 세포를 형성하며; 항원-로딩되고 활성화된 수지상 세포를 환자에게 재도입함으로써 수지상 세포의 효율을 증가시키는 조성물 및 방법을 포함한다. 제제 는, 단독으로나 공동-활성화제와 함께 DC-ASGPR을 유도 (engage)하거나, 치료적 또는 보호적 적용을 위해 항원-제시 세포를 활성화하거나, 보호적 또는 치료적 예방접종을 위해 단독으로나 공동-활성화제와 함께 항원에 연결된 DC-ASGPR 및/또는 활성화제를 결합하는데 사용될 수 있다. 또 다른 용도는, DC-ASGPR에 결합하고 활성화시킬 수 있는 특정 항체 V-영역 서열의 개발에의 이용, DC-ASGPR을 통한 면역 세포의 부적합한 활성화로부터 초래되는 것으로 알려지거나 의심되는 질환과 관련하여 치료 목적을 위한 독성제와 연결된 항-DC-ASGPR 제제로서의 이용, 및 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편 (여기서, 상기 항원은 항체-항원 복합체와 접촉되었던 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시된다)을 갖는 백신으로의 이용을 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 더욱 잘 이해하기 위해서는, 첨부된 도면과 함께 본 발명에 대한 상세한 설명을 참조한다.
도 1A 내지 1E는 렉틴-형 수용체 DC-ASGPR을 통한 시그널전달이 DC를 활성화시켜 증가된 수준의 공동-자극 분자 및 사이토카인 및 케모카인을 생성한다는 것을 입증한다. 도 1A는 3일 및 6일의 GM/IL-4 DC를 FITC-표지된 염소 항-마우스 IgG로 염색한 후 마우스 모노클로날 항-사람 DC-ASGPR 항체로 염색한 결과를 나타낸다. 도 1B는 6일의 GM/IL-4 DC를 16 내지 18시간 동안 항-DC-ASGPR 또는 대조 mAb (1 내지 2 μg/ml)로 코팅된 플레이트에서 배양한 결과를 나타낸다. 히스토그램에서 오픈 바 (open bar) 및 채워진 바 (filled bar)는 각각 이소타입 대조 mAb 및 항-렉틴 mAb로 활성화된 세포를 나타낸다. 도 1C는, 방법에서 기술하는 바와 같이, 6일의 GM/IL-4 DC를 12시간 동안 mAb로 코팅된 플레이트에서 배양하고 RNA를 분리한 후 Affymetrix Gene Chip 분석한 결과를 나타낸다. 항-렉틴 mAb에 의한 유전자 발현의 배수 (fold) 증가를 대조 mAb로 자극된 DC에서의 유전자 발현 수준과 비교한 것이다. 도 1D는 도 1B에서 나타낸 실험으로부터의 배양 상청액 중의 사이토카인 및 케모카인을 Luminex로 측정한 결과를 나타낸다. 도 1E는 6일의 GM/IL-4 DC를 16 내지 18시간 동안 50 ng/ml의 가용성 CD40L의 존재 또는 부재 하에서 mAb로 코팅된 플레이트에서 배양하고 항-CD83 항체로 염색한 결과를 나타낸다. 도 1E에서 나타낸 실험으로부터의 배양 상청액 중의 사이토카인 및 케모카인을 Luminex로 측정하였다. 나타낸 결과는 상이한 정상 공여자로부터의 세포를 사용한 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
도 2A 내지 2D는 DC 상에 발현된 DC-ASGPR이 증진된 체액성 면역 반응에 기여한다는 것을 나타낸다. 6일의 GM/IL-4 DC (5 x 103개/웰)을 16 내지 18시간 동안 항-DC-ASGPR 또는 대조 mAb로 코팅된 96웰 플레이트에서 항온배양한 후, CFSE로 염색된 1 x 105개의 자가 CD19+ B 세포를 20 유니트/ml IL-2 및 50 nM CpG의 존재 하에서 공동-배양하였다. 도 2A는 형광 표지된 항체로 염색된 6일 세포의 FACS이다. CD3+ 및 7-AAD+ 세포는 게이트 아웃 (gate out) 되었다. CD38+ 및 CFSE- 세포는 FACS 분류기에 의해 정제되고, 김자 (Giemsa) 염색을 수행하였다. 도 2B는 13일의 배양 상청액을 샌드위치 ELISA에 의해 총 IgM, IgG, 및 IgM에 대해 분석한 결과이다. 도 2C는 열-불활성화된 인플루엔자 바이러스 (PR8) 5 moi (multiplicity of infection)로 펄스처리되고 B 세포와 배양된 DC를 나타낸다. 배양 상청액을 13일에 인플루엔자-특이적 면역글로불린 (Ig)에 대해 분석하였다. 도 2D는 항-DC-ASGPR 또는 대조 mAb와 함께 배양된 DC를 세포 표면 APRIL 발현에 대해 염색하고 상청액을 가용성 APRIL에 대해 검정한 결과를 나타낸다.
도 3A 내지 3D는 B 세포 상의 DC-ASGPR의 세포 표면 발현이 B 세포 활성화 및 면역글로불린 생성에 기여한다는 것을 나타낸다. 도 3A는 연막(buffy coat)으로부터의 PBMC를 항-CD19, 항-CD3 및 항-DC-ASGPR 또는 대조 mAb로 염색한 결과이다. CD19+ 및 CD3+ 세포를 게이트 아웃시켰으며, CD19+ B 세포 상의 분자의 발현 수준을 유동 세포계로 측정하였다. 도 3B는, 방법에서 기술되는 바와 같이, 연막으로부터의 CD19+ B 세포를 12시간 동안 mAb로 염색된 플레이트에서 배양하고 RNA 분리한 후 Affymetrix Gene Chip 분석한 결과이다. 항-DC-ASGPR mAb에 의한 유전자 발현의 배수 증가를 대조 mAb로 자극된 CD19+ B 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하였다. 도 3C는 CD19+ B 세포를 16 내지 18시간 동안 mAb로 코팅된 플레이트에서 배양한 후 상청액을 Luminex로 사이토카인 및 케모카인에 대해 분석한 결과를 나타낸다. 도 3D는 1 x 105개의 CD19+ B 세포를 13일 동안 mAb로 코팅된 플레이트에서 배양한 결과를 나타낸다. 총 Ig 수준을 ELISA로 측정하였다. 자료는 3개의 상이한 정상 공여자로부터의 세포를 사용한 2번의 반복 실험에 대한 것이다.
도 4A 내지 4D는 정제된 동종이형 T 세포의 증식이 DC-ASGPR에 대해 특이적인 mAb로 자극된 DC에 의해 상당히 향상되었다는 것을 나타낸다.
도 5는 특정한 항-DC-ASGPR mAb가 DC를 활성화할 수 있다는 것을 나타낸다. GM-CSF/IL-4. DC를 일단의 12개의 순수한 항-ASGPR mAb 중 하나와 함께 24시간 동안 항온배양하였다. 이어서, 세포를 세포 표면 CD86 (DC 활성화 마커)의 발현에 대해 시험하고, 상청액을 분비된 사이토카인에 대해 검정하였다. 항-ASGPR mAb 패널로부터의 3개의 mAb (36, 38, 43)가 DC를 활성화시켰다.
도 6은 DC-ASGPR rAb과 관련하여 상이한 항원이 발현될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 항-DC-ASGPR rAb.Doc 단백질은 임의의 코헤신.융합 단백질과 단순 혼합되어 마치 rAb.융합 단백질과 같이 작용하는 안정한 비-공유 [rAb.Doc:Coh.융합] 복합체를 어셈블링할 수 있다.
도 7은 GM-CSF/IFNa DC (5,000개/웰)에 10 또는 1 nM 항-DC-ASGPR.Doc:Coh.Flu M1, 또는 hIgG4.Doc:Coh.Flu M1 복합체를 로딩한 결과를 나타낸다. 6시간 후, 자가 CD8+ T 세포 (200,000/웰)를 배양물에 가하였다. 8일에, CD8+ T 세포를 HLA-A201 면역-우세 펩타이드에 특이적인 TCR을 갖는 세포의 증대에 대해 분석하였다. 내부 박스는 4량체-특이적 CD8+ T 세포의 백분율 (%)을 나타낸다.
도 8은 상이한 항체의 원숭이 ASGPR과의 교차 반응을 입증한다.
본 발명의 다양한 양태의 제조 및 이용에 대해 하기에서 상세히 기술하지만, 본 발명은 매우 다양한 구체적 내용으로 양태화될 수 있는 많은 적용가능한 발명의 개념을 제공할 수 있다. 본원에서 논의되는 구체적인 양태는 단지 본 발명을 이용하는 구체적인 방식을 설명하고자 하는 것으로서 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명을 설명을 돕고자, 다수의 용어가 하기와 같이 정의된다. 본원에서 정의된 용어는 본 발명 관련 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 용어 "하나의 (a 또는 an)" 및 "상기 (the)"는 단지 단일 실체만을 언급하고자 하는 것이 아니며, 구체적인 예가 설명에 이용될 수 있는 일반적 부류를 포함한다. 본원에서의 용어는 본 발명의 구체적인 양태를 기술하기 위해 사용되었으며, 이러한 사용이 청구범위를 제외하고는 본 발명을 제한하지 않는다.
수지상 세포 (DC)는 항원-특이적 면역을 조절하는데 중요한 역할을 하는 항원-제시 세포이다 [참조: Mellman and Steinman 2001, Banchereau, Briere et al. 2000, Cella, Sallusto et al. 1997]. DC는 항원을 포획하고, 이를 펩타이드로 프로세싱하며, 이들을 T 세포에 제시한다. 따라서, DC로의 직접적인 항원 전달이 백신을 개선하기 위한 주요 분야이다. 하나의 일례는 자가 DC의 생체외 항원-로딩 후 환자에 재투여하는 DC-기초된 백신의 개발이다 [참조: Banchereau, Schuler-Thurner et al. 2001, Steinman and Dhodapkar 2001]. 백신 효율을 개선하기 위한 또 다른 전략은 DC-특이적 수용체의 내화에 대한 항체에 접합된 항원의 DC에의 특이적 표적화이다. 예방접종을 위한 표적화 DC의 가능성은 주요한 마우스 조사에서 강조된다. 생체내에서, 오브알브민 (OVA)에 커플링된 항-LOX-1 mAb를 사용한 표적화가 제I형 MHC 경로에 대한 외인성 항원 교차-제시를 통해 보호적 CD8+ T 세포를 유도하였다 [참조: Delneste, Magistrelli et al. 2002]. 또한, CD40L 성숙 자극과 병용하여 항-DEC205 mAb에 접합된 OVA는 생체내에서 DC에 의한 제I형 MHC-제한된 제시를 향상시켰으며, 이펙터 메모리 CD8+ T 세포의 오랜 형성을 이끌었다 [참조: Bonifaz, Bonnyay et al. 2004]. 이러한 조사 모두 극적인 용량-보존 (즉, 매우 낮은 항원 농도에서 강력한 면역-반응)을 나타내었으며, 다른 타입의 OVA 면역화로 통상 나타나는 것보다 광범위한 반응을 제시하였다. DEC205를 통한 HIV gag 항원의 DC에의 표적화를 이용한 최근의 작업으로, 이러한 개념을 임상적으로 관련된 항원까지 확장하였으며, 단일 예방접종으로부터 DC-극적 용량-보존적 보호적 반응에 대해 표적화 항원의 이용, 및 CD8 및 CD4 구획 모두에서 항원-특이적 T 세포의 확장을 확인하였다 [참조: Trumpfheller, Finke et al. 2006].
본 발명은 다수의 항원 또는 단백질 (일차적 mAB로부터 독립적으로 조작, 발현 및 정제됨)을 조절되는 다변형 양상으로 하나의 단일한 일차적 재조합 mAb에 복합화하는 것을 제공한다. 현재, 상이한 단백질 (각각 스트렙타비딘에 분리되게 연결되도록 조작됨)을 하나의 일차적 mAb에 첨가하기 위해 부위-특이적 바이오티닐화 부위를 조작하는 방법들이 있다. 그러나, 본 발명은 별도로 조작된 단백질을 고정된 등몰량 비율 및 위치로 다수 조합의 일차적 mAb에 첨가하는 것을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "모듈방식의 rAb 캐리어 (modular rAb carrier)"는 단일 재조합 모노클로날 항체 (mAb)에 대해 다양한 항원, 활성화 단백질 또는 다른 항체의 조절된 모듈방식 첨가를 제공하도록 조작된 재조합 항체 시스템을 기술하기 위해 사용된다. rAb는 표준 하이브리도마 기술, 재조합 항체 디스플레이, 사람화 모노클로날 항체 등을 이용하여 제조되는 모노클로날 항체일 수 있다. 모듈방식의 rAb 캐리어는, 예를 들어 다수 항원 및/또는 항원 및 DC에 대한 활성화 사이토카인을 (내화 수용체, 예를 들어 사람 수지상 세포 수용체에 대한 하나의 일차적 재조합 항체를 통해) 표적화하는데 사용될 수 있다. 또한, 모듈방식의 rAb 캐리어는 2개의 상이한 재조합 mAb를 말단-대-말단으로 조절되고 규정된 방식으로 연결하는데 사용될 수 있다.
"모듈방식의 rAb 캐리어"의 항원 결합부는 하나 이상의 가변 도메인, 하나 이상의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편, 및 Fv 단편, 및 Fabc 단편 및/또는 동족 (cognate) 모듈방식의 결합부가 아미노산 서열에 첨가되고/되거나 결합된 Fc 도메인의 일부를 갖는 Fab 단편일 수 있다. 모듈방식의 rAb 캐리어에 사용하기 위한 항체는 임의의 이소타입 또는 부류, 아부류의 것이거나 임의의 공급원 (동물 및/또는 재조합)으로부터의 것일 수 있다.
하나의 비-제한적 예에서, 모듈방식의 rAb 캐리어는 조작된 재조합 mAb에 대해 구체적이고 특징적인 단백질 복합체를 제조하기 위해 하나 이상의 모듈방식의 코헤신-도커린 단백질 도메인을 갖도록 조작된다. 그러한 mAb는 하나 이상의 모듈방식의 코헤신-도커린 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. 코헤신-도커린 단백질 도메인은 심지어, 예를 들어 화학적 교차-링커 및/또는 디설파이드 결합에 의해, 해독 후에 부착될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 항원의 수용체에서 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 개시할 수 있는 분자를 언급한다. 항원은 본 발명에서 2가지의 상이한 개념으로 사용될 수 있다: 항체 또는 rAb의 다른 항원 인식 도메인에 대한 표적물로서, 또는 모듈방식의 rAb 캐리어에 대한 도커린/코헤신-분자 보완물의 일부로서 rAb에 의해 세포 또는 표적물에 운반되고/되거나 세포 또는 표적물로 운반되는 분자로서. 항원은 통상적으로 질병을 일으키고 이에 대한 예방접종이 유리한 처리일 수 있는 제제이다. 항원이 MHC에 제시되는 경우, 펩타이드는 종종 약 8 내지 약 25개 아미노산이다. 항원은 모든 타입의 생물학적 분자, 예를 들어 단순한 중간 대사물, 슈가, 지질 및 호르몬, 및 거대분자, 예를 들어 복합 탄수화물, 인지질, 핵산 및 단백질을 포함한다. 항원에 대한 일반적인 종류는, 이로 제한됨이 없이, 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원, 원생동물 항원 및 기타 기생충 항원, 종양 항원, 자가면역 질환, 알러지 및 이식 거부에 수반되는 항원, 및 기타 다양한 항원을 포함한다.
모듈방식의 rAb 캐리어는 다수의 활성제, 예를 들어 항생제, 항감염제, 항바이러스제, 항종양제, 항발열제, 진통제, 소염제, 골다공증용 치료제, 효소, 사이토카인, 항응고제, 다당류, 콜라겐, 세포 및 이들 중 2개 이상의 조합을 운반할 수 있다. 본 발명을 이용하여 전달을 위한 항생제의 예는, 이로 제한됨이 없이, 테트라사이클린, 아미노글리코사이드, 페니실린, 세팔로스포린, 설폰아미드 약물, 클로람페니콜 나트륨 석시네이트, 에리트로마이신, 반코마이신, 린코마이신, 클린다마이신, 니스타틴, 암포테리신 B, 아만티딘, 이독수리딘, p-아미노 살리사이클산, 이소니아지드, 리팜핀, 안티노마이신 D, 미트라마이신, 다우노마이신, 아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 프로카바진, 이미다졸 카복사미드 등을 포함한다.
본 발명을 이용하여 전달하기 위한 항종양제의 예는, 이로 제한됨이 없이, 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 메톡트렉세이트 등을 포함한다. 항발열제 및 진통제의 예는 아스피린, Motrin®, Ibuprofen®, 나프로신, 아세트아미노펜 등을 포함한다.
본 발명을 이용하여 전달하기 위한 소염제의 예는, 이로 제한됨이 없이, NSAIDS, 아스피린, 스테로이드, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 디클로페낙 Na 등을 포함한다.
본 발명을 이용하여 전달하기 위한 골다공증을 치료하기 위한 치료제 및 뼈 및 골격에 작용하는 다른 인자의 예는, 이로 제한됨이 없이, 칼슘, 알렌드로네이트, 골 GLa 펩타이드, 부갑상선 호르몬 및 이의 활성 단편, 히스톤 H4-관련 골 형성 및 증식 펩타이드 및 이의 돌연변이물, 유도체 및 유사체를 포함한다.
본 발명을 이용하여 전달하기 위한 효소 및 효소 보조인자의 예는, 이로 제한됨이 없이, 판크레아제, L-아스파라기나제, 히알루로니다제, 키모트립신, 트립신, tPA, 스트렙토키나제, 우로키나제, 판크레아틴, 콜라게나제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 플라스미노겐, 스트렙토키나제, 아데닐 사이클라제, 수퍼옥사이드 디스무타제 (SOD) 등을 포함한다.
본 발명을 이용하여 전달하기 위한 사이토카인의 예는, 이로 제한됨이 없이, 인터루킨, 전환 성장 인자 (TGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 연결 조직 활성화된 펩타이드 (CTAP), 골형성 인자, 및 이러한 성장 인자의 생물학적 활성 유사체, 단편 및 유도체를 포함한다. 사이토카인은 B/T-세포 분화 인자, B/T-세포 성장 인자, 분열촉진 사이토카인, 화학주성 사이토카인, 콜로니 자극 인자, 혈관형성 인자, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 등, 렙틴, 미오스타틴, 대식구 자극 단백질, 혈소판-유도된 성장 인자, TNF-α, TNF-β, NGF, CD40L, CD137L/4-1BBL, 사람 림포톡신-β, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-1α, IL1-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, 에리트로포이에틴, 엔도스타틴, 안지오스타틴, VEGF 또는 이에 대한 임의의 단편 또는 조합을 포함한다. 기타 사이토카인은 전환 성장 인자 (TGF) 슈퍼유전자 패밀리, 베타 전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3); 골 형태형성 단백질 (예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); 헤파린-결합 성장 인자 (예를 들어, 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF), 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF), 인슐린-형 성장 인자 (IGF); 인히빈 (예를 들어, 인히빈 A, 인히빈 B); 성장 분화 인자 (예를 들어, GDF-1); 및 악티빈 (예를 들어, 악티빈 A, 악티빈 B, 악티빈 AB)를 포함한다.
본 발명을 이용하여 전달하기 위한 성장 인자의 예는, 이로 제한됨이 없이, 천연 공급원, 예를 들어 포유동물 세포로부터 분리될 수 있거나 합성적으로, 예를들어 재조합 DNA 기술 또는 다양한 화학적 공정에 의해 제조될 수 있는 성장 인자를 포함한다. 또한, 이들 인자들의 유사체, 단편 또는 유도체는, 천연 분자의 생물학적 활성 중 적어도 일부를 나타내는 한, 사용될 수 있다. 예를 들어, 유사체는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 다른 유전자 조작 기술에 의해 변형되는 유전자의 발현에 의해 제조될 수 있다.
본 발명을 이용하여 전달하기 위한 항응고제의 예는, 이로 제한됨이 없이, 와파린, 헤파린, 히루딘 등을 포함한다. 본 발명을 이용하여 전달하기 위한 면역계에 작용하는 인자의 예는, 이로 제한됨이 없이, 염증 및 악성 신생물을 조절하는 인자 및 감염성 미생물을 공격하는 인자, 예를 들어 화학주성 펩타이드 및 브라디키닌을 포함한다.
바이러스 항원의 예는, 이로 제한됨이 없이, 레트로바이러스 항원, 예를 들어 사람 면역결핍 바이러스 항원으로부터의 레트로바이러스 항원, 예를 들어 gag, pol 및 env 유전자의 유전자 생성물, Nef 단백질, 역전사효소, 및 기타 HIV 성분; 간염 바이러스 항원, 예를 들어 B형 간염 바이러스의 S, M 및 L 단백질, B형 간염 바이러스의 프리(pre)-S 항원, 및 기타 간염, 예를 들어 간염 A, B 및 C 바이러스 성분, 예를 들어 C형 간염 바이러스 RNA; 인플루엔자 바이러스 항원, 예를 들어 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 및 기타 인플루엔자 바이러스 성분; 홍역 바이러스 항원, 예를 들어 홍역 바이러스 융합 단백질 및 기타 홍역 바이러스 성분; 풍진 바이러스 항원, 예를 들어 단백질 E1 및 E2 및 기타 풍진 바이러스 성분; 로타바이러스 항원, 예를 들어 VP7sc 및 기타 로타바이러스 성분; 시토메갈로바이러스 항원, 예를 들어 엔벨로프 당단백질 B 및 기타 시토메갈로바이러스 항원 성분; 호흡기세포융합바이러스 항원, 예를 들어 RSV 융합 단백질, M2 단백질 및 기타 호흡기세포융합바이러스 항원 성분; 단순헤르페스바이러스 항원, 예를 들어 조기 발현 단백질, 당단백질 D 및 기타 단순헤르페스바이러스 항원 성분; 베리셀라 조스터 바이러스 항원, 예를 들어 gpI, gpII 및 기타 바리셀라 조스터 바이러스 항원 성분; 일본 뇌염 바이러스 항원, 예를 들어 단백질 E, M-E, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A, 80% E 및 기타 일본 뇌염 바이러스 항원 성분; 광견병 바이러스 항원, 예를 들어 광견병 당단백질, 광견병 핵산단백질 및 기타 광견병 바이러스 항원 성분을 포함한다. 추가의 바이러스 항원에 대한 예는 문헌 [참조: Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991]을 참조한다.
본 발명의 rAb-DC/DC 항원을 이용하여 전달될 수 있는 항원 표적물은 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원 또는 기생충 항원과 같은 항원을 암호화하는 유전자를 포함한다. 바이러스는 피코나바이러스, 코로나바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 라도바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 파필로마바이러스, 파보바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스 및 스폰지폼 바이러스를 포함한다. 기타 바이러스 표적물은 인플루엔자, 단순 헤르페스 바이러스 1 및 2, 홍역, 뎅기, 천연두, 폴리오 또는 HIV를 포함한다. 병원체는 파동편모충, 촌충, 회충, 연충, 말라리아를 포함한다. 종양 마커, 예를 들어 태아 항원 또는 전립선 특이적 항원이 이러한 방식으로 표적될 수 있다. 다른 예는 HIV env 단백질 및 B형 간염 표면 항원을 포함한다. 예방접종 목적의 본 발명에 따른 벡터의 투여는, 강력한 면역 반응이 필요하므로 벡터-관련된 항원이 형질전환유전자를 장기간 발현시킬 수 있도록 충분히 비-면역원성이어야 한다. 일부의 경우, 개체의 예방접종은 단지 가끔, 예를 들어 일년 단위 또는 2년 단위로 필요할 수 있으며, 감염제에 대해 장기간 면역원에 대한 보호를 제공할 수 있다. 본 발명에서 벡터에 사용하고 궁극적으로는 항원으로서의 유기체, 알레르기항원 및 핵산 및 아미노산 서열에 대한 구체적인 예를 미국 특허 제6,541,011호 (관련 부분이 본원에 참조로 삽입됨), 특히 본 발명에서 사용될 수 있는 유기체 및 특정 서열과 조화되는 표에서 찾을 수 있다.
본원에 기술된 rAb 백신과 함께 사용하기 위한 세균 항원은, 이로 제한됨이 없이, 세균 항원, 예를 들어 백일해 독소, 실모양 헤마글루티닌, 페르탁틴, FIM2, FIM3, 아데닐레이트 사이클라제 및 기타 백일해 세균 항원 성분; 디프테리아 세균 항원, 예를 들어 디프테리아 독소 및 톡소이드 및 기타 디프테리아 세균 항원 성분; 파상풍 세균 항원, 예를 들어 파상풍 독소 또는 톡소이드 및 기타 파상풍 세균 항원 성분; 스트렙토코커스 세균 항원, 예를 들어 M 단백질 및 기타 스트렙토코커스 세균 항원 성분; 그람-음성 바실러스 세균 항원, 예를 들어 지다당류 및 기타 그람-음성 세균 항원 성분, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 세균 항원, 예를 들어 미콜산, 열 쇼크 단백질 65 (HSP65), 30 kDa 주요 분비 단백질, 항원 85A 및 기타 미코박테리아 항원 성분; 헬리코박터 피롤리 (Helicobacter pylori) 세균 항원 성분; 폐렴구균 세균 항원, 예를 들어 뉴몰리신, 폐렴구균 피막 다당류 및 기타 폐렴구균 세균 항원 성분; 해모필루스 인플루엔자 세균 항원, 예를 들어 피막 다당류 및 기타 해모필루스 인플루엔자 세균 항원 성분; 탄저병 세균 항원, 예를 들어 탄저병 보호 항원 및 기타 탄저병 세균 항원 성분; 리케챠 (rickettsiae) 세균 항원, 예를 들어 rompA 및 기타 리케챠 세균 항원 성분을 포함한다. 또한, 본원에 기술된 세균 항원에는 임의의 다른 세균, 미코박테리아, 미코플라스마, 리케챠 또는 클라미디아 항원을 포함한다. 또한, 하기 병원체의 부분 또는 전체일 수 있다: 해모필루스 인플루엔자; 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum); 나이제리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis); 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae); 나이제리아 고노로애 (Neisseria gonorrhoeae); 살모넬라 혈청형 티피 (Salmonella serotype typhi); 쉬겔라 (Shigella); 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae); 뎅기열; 뇌염군; 일본 뇌염; 라임 질환; 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis); 서나일 바이러스; 황열병; 야토병; 간염 (바이러스성; 세균성); RSV (호흡기세포융합바이러스); HPIV 1 및 HPIV 3; 아데노바이러스; 천연두; 알러지 및 암.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 진균 항원은, 이로 제한됨이 없이, 예를 들어 칸디다 진균 항원 성분; 히스토플라스마 진균 항원, 예를 들어 열 쇼크 단백질 60 (HSP60) 및 기타 히스토플라스마 진균 항원 성분; 크립토코커스 진균 항원, 예를 들어 피막 다당류 및 기타 크립토코커스 진균 항원 성분; 코시디오데스 (coccidiodes) 진균 항원, 예를 들어 구상체 (spherule) 항원 및 기타 코시디오데스 진균 항원 성분; 및 백선 항원, 예를 들어 트리코피틴 및 기타 코시디오데스 진균 항원 성분을 포함한다.
원생동물 및 기타 기생충 항원의 예는, 이로 제한됨이 없이, 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸 (Plsmodium falciparum) 항원, 예를 들어 분열소체 표면 항원, 포자소체 (sporozoite) 표면 항원, 포자소체 (circumsporozoite) 항원, 생식모세포 (gametocyte)/생식세포 (gamete) 표면 항원, 혈액 단계 항원 pf 155/RESA 및 기타 플라스모디아 (plasmodial) 항원 성분; 톡소플라스마 항원, 예를 들어 SAG-1, p30 및 기타 톡소플라스마 항원 성분; 쉬스토소매 (schistosomae) 항원, 예를 들어 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 파라미오신 및 기타 쉬스토소마 항원 성분; 레이슈마니아 주요 및 기타 레이슈마니애 항원, 예를 들어 gp63, 리포포스포글리칸 및 이의 관련 단백질 및 기타 레이슈마니아 항원 성분; 및 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) 항원, 예를 들어 75-77 kDa 항원, 56 kDa 항원 및 기타 트리파노소마 항원 성분을 포함한다.
본 발명의 rAb를 사용하여 표적될 수 있는 항원은 일반적으로 내화 가능성, 면역 세포 특이성 정도, 표적되는 면역 세포 타입, 면역 세포 성숙 및/또는 활성 수준 등을 포함한 다수의 요인에 기초하여 선택될 수 있다. 수지상 세포의 세포 표면 마커의 예는, 이로 제한됨이 없이, 제I형 MHC, 제II형 MHC, B7-2, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR 및/또는 ASPGR 등을 포함하고, 일부 경우엔 CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD56 및/또는 CD57가 부재한다. 항원 제시 세포에 대한 세포 표면 마커의 예는, 이로 제한됨이 없이, 제I형 MHC, 제II형 MHC, CD40, CD45, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1 및/또는 Fcγ 수용체를 포함한다. T 세포에 대한 세포 표면 마커의 예는, 이로 제한됨이 없이, CD3, CD4, CD8, CD 14, CD20, CD11b, CD16, CD45 및 HLA-DR을 포함한다.
전달을 위한 세포 표면의 표적 항원은, 통상적으로 종양 조직 세포의 세포 표면, 세포질, 핵, 소기관 등으로부터 유도되는, 종양 항원에 특징적인 것들을 포함한다. 본 발명의 항체 부분에 대한 종양 표적물의 예는, 이로 제한됨이 없이, 혈액학적 암, 예를 들어 백혈병 및 림프종, 신경학적 종양, 예를 들어 성상교세포종 또는 교모세포종, 흑색종, 유방암, 폐암, 두경부암, 위장 종양, 예를 들어 위 또는 결장암, 간암, 췌장암, 비뇨생식 종양, 예를 들어 경부, 자궁, 난소암, 질암, 고환암, 전립선암 및 음경암, 골 종양, 혈관 종양, 또는 입술, 코인두, 인두 및 구강, 식도, 직장 및 담낭, 담도계, 후두, 폐 및 기관지, 방광, 신장 및 신경계의 기타 부분, 갑상선의 암, 호지킨 질병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병을 포함한다.
본 발명을 이용하여 항원 제시를 위해 단독으로나 면역 세포와 공동으로 전달될 수 있는 항원의 예는 종양 단백질, 예를 들어 돌연변이된 종양유전자; 종양과 연관된 바이러스 단백질; 및 종양 무신 및 당지질을 포함한다. 항원은 상기된 부류의 바이러스로부터 유도되는 것으로서 종양과 관련된 바이러스 단백질일 수 있다. 특정 항원은 종양에 대해 특징적인 것 일 수 있거나 (하나의 서브세트는 통상적으로는 종양 전구체 세포에 의해 발현되지 않는 단백질), 종양 전구체 세포에서 일반적으로 발현되나 종양에 대해 특징적인 돌연변이를 갖는 단백질일 수 있다. 기타 항원은 변형된 활성 또는 세포하 (subcellular) 분포를 갖는, 일반적인 단백질에 대한 돌연변이 변이체(들), 예를 들어 종양 항원을 발생시키는 유전자 돌연변이를포함한다.
종양 항원에 대한 구체적인 비-제한적 예는 CEA, 전립선 특이적 항원 (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 및 12, MUC (Mucin) (예를 들어, MUC-1, MUC-2 등), GM2 및 GD2 강글리오사이드, ras, myc, 타이로시나제, MART (흑색종 항원), Pmel 17(gp 100), GnT-V 인트론 V 서열 (N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라제 V 인트론 V 서열), 전립선 Ca psm, PRAME (흑색종 항원), β-카테닌, MUM-1-B (흑색종의 편재성 돌연변이된 유전자 생성물), GAGE (흑색종 항원) 1, BAGE (흑색종 항원) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (엡스타인-바르 바이러스 핵 항원) 1-6, gp75, 사람 파필로마 바이러스 (HPV) E6 및 E7, p53, 폐 내성 단백질 (LRP), Bcl-2, 및 Ki-67을 포함한다. 또한, 면역원성 분자는 자가면역 질환 (이의 병리는 관련 표적 기관, 조직 또는 세포에 의해 발현되는 분자에 대해 특이적인 항체의 활성에 주로 기인함), 예를 들어 SLE 또는 MG의 개시 및/또는 증식에 수반되는 자가항원일 수 있다. 이러한 질환에서, 관련 자가항원에 대한 진행중인 항체-매개된 (즉, Th2-타입) 면역 반응을 세포성 (즉, Th1-타입) 면역 반응으로 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 달리, 적합한 자가항원에 대한 Th1 반응을 예방적을 유도함으로써, 관련된 자가면역 질환을 갖지는 않으나 걸리기 쉬운 것으로 의심되는 환자에서 자가항원에 대한 Th2 반응의 발현을 방지하거나 발현 수준을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 중요한 자가항원은, 이로 제한됨이 없이, (a) SLE에 대해, 스미쓰 (Smith) 단백질, RNP 리보핵산단백질 및 SS-A 및 SS-B 단백질; 및 (b) MG에 대해, 아세틸콜린 수용체를 포함한다. 하나 이상의 자가면역 반응에 수반되는 기타 다양한 항원의 예는 내인성 호르몬, 예를 들어 황체형성 호르몬, 여포 자극 호르몬, 테스토스테론, 성장 호르몬, 프로락틴 및 기타 호르몬을 포함한다.
자가면역 질환, 알러지 및 이식 거부에 수반되는 항원이 본 발명의 조성물 및 방법에 이용될 수 있다. 예를 들어, 하기 자가면역 질환 또는 장애 중 하나 이상에 수반되는 항원이 본 발명에 이용될 수 있다: 당뇨병, 진성 당뇨병, 관절염 (류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염을 포함), 다발성 경화증, 중증근무력증, 전신 홍반성 낭창, 자가면역 갑상선염, 피부염 (아토피성 피부염 및 습진성 피부염 포함), 건선, 쇼그렌 증후군 (쇼그렌 증후군에 수반하는 건선각막결막염 포함), 원형탈모증, 절지동물 물림 반응에 기인한 알러지성 반응, 크론 질환, 아프타성 궤양, 홍채염, 결막염, 각막결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알러지성 천식, 피부 홍반성 낭창, 공피증, 질염, 직장염, 약물성 발진, 나병 역전 반응, 나성 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알러지성 뇌척수염, 급성 괴사성 출혈 뇌병증, 특발적 양측 진행성 감각신경성 청력 상실, 재생불량빈혈, 적혈구계빈혈, 특발적 저혈소판증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성 활성 간염, 스티븐스-존슨 (Stevens-Johnson) 증후군, 특발적 스프루, 편평태선, 크론 질환, 그레이브스 (Graves) 안병증, 사르코이드증, 원발성 담관성간경화, 후포도막염 및 간질성 폐 섬유증. 자가면역 질환에 수반되는 항원의 예는 글루탐산 데카복실라제 65 (GAD 65), 선천적 DNA, 마이엘린 기초 단백질, 마이엘린 단백지질 단백질, 아세틸콜린 수용체 성분, 티로글로불린 및 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 수용체를 포함한다. 알러지에 수반되는 항원의 예는 꽃가루 항원, 예를 들어 일본 세다 (Japanese cedar) 꽃가루 항원, 돼지풀 꽃가루 항원, 호밀풀 꽃가루 항원, 동물 유도된 항원, 예를 들어, 먼지 진드기 항원 및 고양이 항원, 조직적합성 항원 및 페니실린 및 기타 치료 약물을 포함한다. 이식 거부에 수반되는 항원의 예는 이식편 수용자로 이식되는 이식편의 항원성 성분, 심장, 폐, 간, 췌장, 신장 및 신경 이식편 성분을 포함한다. 항원은 자가면역 질환을 치료하는데 유용한 변형된 펩타이드 리간드일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "에피토프(들)"은 병원체 DNA 또는 RNA에 의해 암호화되는 다수의 병원체 폴리펩타이드 내에 위치된 에피토프와 유사한 1차, 2차 또는 3차 구조를 포함하는 펩타이드 또는 단백질 항원을 언급한다. 유사 정도는 일반적으로 이러한 폴리펩타이드에 대해 지시되는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 또한 펩타이드 또는 단백질 항원에 결합하거나 반응하거나 달리는 인식하는 정도일 것이다. 다양한 면역검정법, 예를 들어 웨스턴 블롯팅, ELISA, RIA 등 (이들 모두 당해 기술 분야에 공지됨)이 이러한 항체와 함께 이용될 수 있다. 백신에의 이용에 적합한 병원체 에피토프 및/또는 이들의 기능성 등가물의 확인이 본 발명의 일부이다. 에피토프가 일단 분리되고 확인되면, 기능적 등가물을 쉽게 얻을 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,554,101호 (본원에 참조로 삽입됨, 친수성을 기초로 하여 아미노산 서열로부터 에피토프의 확인 및 제조를 교시함)에서 교시되는 바와 같이, 호프 (Hopp)의 방법을 이용할 수 있다. 또한, 수개의 다른 논문에 기술된 방법 및 이에 기초된 소프트웨어 프로그램을 이용하여 에피토프 코어 서열을 확인할 수 있다 [참조: Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; 미국 특허 제4,554,101호]. 이어서, 이들 "에피토프 코어 서열"의 아미노산 서열을 펩타이드 합성 또는 재조합 기술을 적용시켜 펩타이드로 쉽게 삽입할 수 있다.
활성 성분으로서 본 발명의 항원을 암호화하는 핵산을 포함하는 백신 조성물의 제조는 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사제로서 제조될 수 있으며, 주사 전 액체 중에 용액 또는 현탁액으로 제조하여 사용하기에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다. 제제는 유화되거나 리포좀에 캡슐화될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 종종 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 혼화성인 담체와 혼합된다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 투여될 피험자에서 알러지 반응 또는 다른 바람직한 작용을 일으키지 않는 담채를 언급한다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어 물, 식염수, 포스페이트 완충된 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 또한, 필요한 경우, 백신은 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제, 유화제, pH 완충제 및/또는 백신의 효율을 증진시키는 애주번트를 포함할 수 있다. 효과적일 수 있는 애주번트의 예는, 이로 제한됨이 없이, 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, MTP-PE 및 RIBI (세균으로부터 추출되는 3개의 성분을 포함), 모노포스포릴 지질 A, 트레할로즈 디미콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS) (2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀젼 중)을 포함한다. 애주번트의 다른 예는 DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드), 프로인트 완전 및 불완전 애주번트 및 QuilA를 포함한다. 또한, 면역 조절 물질, 예를 들어 림포카인 (예를 들어, IFN-γ, IL-2 및 IL-12) 또는 합성 IFN-γ 유도자, 예를 들어 폴리 I:C가 본원에 기술된 애주번트와 병용하여 사용될 수 있다.
아포지단백질의 특정한 DNA-결합 부위에 결합하는 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일 또는 다수 카피를 갖는 나상 (naked) 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 약제학적 생성물이, 본원에 기술되는 바와 같은 혈장 지단백질에 존재한다. 폴리뉴클레오타이드는 생물학적 활성 펩타이드, 안티센스 RNA 또는 리보자임을 암호화할 수 있고, 생리학적으로 허용되는 투여 형태에 제공될 것이다. 본 발명으로부터 발생할 수 있는 또 다른 약제학적 생성물은 환자 혈액 또는 기타 공급원으로부터 본원에 기술된 방법에 따라 분리된 고도 정제의 혈장 지단백질 분획물, 및 생리학적으로 허용되는 투여가능 형태의 정제된 지단백질 분획물에 예비결합된, 혈장 지단백질에 존재하는 아포지단백질의 특정 DNA-결합 부위에 결합하는 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일 또는 다수 카피를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 약제학적 생성물은 생리학적으로 허용되는 투여가능 형태의, 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일 또는 다수 카피를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 예비결합된, 특정 DNA-결합 모티프의 단일 또는 다수 카피를 포함하는 재조합 아포지단백질 단편을 포함하는 고도 정제의 혈장 지단백질 분획물을 포함할 수 있다. 또 다른 약제학적 생성물은 생리학적으로 허용되는 투여가능 형태의, 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일 또는 다수 카피를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 예비결합된, 특정 DNA-결합 모티프의 단일 또는 다수 카피를 포함하는 재조합 아포지단백질 단편을 포함하는 고도 정제의 혈장 지단백질 분획물을 포함할 수 있다.
투여 용량은 처리될 피험자의 체중 및 물리적 상태, 및 투여 경로 및 처리 횟수에 상당히 의존적이다. 고도로 정제된 지단백질 분획물에 예비결합된 나상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 1 μg 내지 1 mg 폴리뉴클레오타이드 및 1 μg 내지 100 mg 단백질의 양으로 투여될 수 있다.
rAb 및 rAb 복합체의 투여는, 존재한다면 벡터의 독성량을 고려하여, 화학치료제의 투여에 대한 일반적 프로토콜을 따를 것이다. 처리는 필요한 경우 반복될 수 있을 것이다. 또한, 다양한 표준 요법 및 외과적 시술이 기술된 유전자 요법과 병행하여 적용될 수 있다.
유전자 치료의 임상 적용이 고려되는 경우, 의도된 적용에 적합한 약제학적 조성물로서 복합체를 제조하는 것이 필요할 것이다. 일반적으로, 발열원, 및 사람 또는 동물에게 해로울 수 있는 모든 다른 불순물이 실질적으로 함유되지 않은 약제학적 조성물을 제조하는 것을 포함할 것이다. 또한, 일반적으로 복합체를 안정하게 하고 표적 세포에 의한 흡수가 가능하도록 염 및 완충액을 사용하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 수성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된 유효량의 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 접종물로서 언급될 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 이용은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 제제가 활성 성분과 비혼화성이지 않는 한, 치료 조성물 중 이의 사용이 고려된다. 또한, 보충적 활성 성분이 조성물에 삽입될 수 있다. 본 발명의 조성물은 통상의 약제학적 제제를 포함할 수 있다. 또한, 분산물은 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 조합 및 오일 중에 제조될 수 있다. 저장 및 사용에 대한 통상의 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 포함한다.
질병 상태. 치료될 특정 질병에 따라, 본 발명에 따른 치료 조성물의 투여는, 최대 (또는 일부 경우엔 최소) 면역 반응을 위해 부위로의 항원 전달을 최대화하도록 표적 조직이 경로에 이용가능한한, 어떠한 통상의 경로를 통해서도 이루어질 수 있을 것이다. 투여는 일반적으로 동소 (orthotopic), 피내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사일 것이다. 전달을 위한 다른 부위는 구강, 비강, 볼, 직장, 질 또는 국소를 포함한다. 국소 투여는 피부암의 치료에 특히 유리할 것이다. 이러한 조성물은 일반적으로 생리학적으로 허용되는 담체, 완충제 또는 기타 부형제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물로서 투여될 것이다.
본 발명의 백신 또는 치료 조성물은 비경구적으로 주사에 의해, 예를 들어 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 다른 방식의 투여에 적합한 추가의 제형은 좌제 및, 일부 경우엔, 경구 제형 또는 에어로졸로서의 분배에 적합한 제형을 포함한다. 경구 제형의 경우, 애주번트를 사용한 T-세포 서브세트의 조작, 항원 패키징 또는 다양한 제형에 개별 사이토카인의 첨가는 최적화된 면역 반응과 함께 개선된 경구 백신을 제공한다. 좌제의 경우, 통상의 결합제 및 담체는, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있으며, 이러한 좌제는 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2% 범위로 활성 성분을 포함하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구 제형은 통상 사용되는 부형제, 예를 들어 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카라이드, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 이러한 조성물은 용액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방제 또는 산제의 형태를 취하고, 활성 성분을 10% 내지 95%, 바람직하게는 25% 내지 70%를 포함한다.
본 발명의 항원 암호화 핵산은 천연 또는 염 형태로서 백신 또는 치료 조성물로서 제형화될 수 있다. 특히 적합한 염은 산부가염 (펩타이드의 유리 아미노기와 함께 형성됨)을 포함하며, 이는 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 말레산 등으로 형성된다. 또한, 유리 카복실기와 함께 형성된 염은 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 (ferric) 하이드로요오다이드, 및 유기 염기, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다.
백신 또는 치료 조성물은 투여 제형에 적합한 방식으로 예방 및/또는 치료에 효과적인 양으로 투여된다. 투여량은, 예를 들어 항체를 합성할 피험자의 면역계의 능력 및 목적하는 예방 또는 치료 정도를 포함하여 처리될 피험자에 따른다. 적합한 용량 범위는 약 0.1 mg 내지 1000 mg의 범위, 예를 들어 약 1 mg 내지 300 mg, 바람직하게는 약 10 mg 내지 50 mg의 범위와 함께 예방접종 당 약 수백 마이크로그램의 활성 성분이다. 또한, 초기 투여 및 부스터 투여를 위한 적합한 요법은 가변적이나 초기 투여 후 후속 접종 또는 기타 투여로 유형화된다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 진료자의 판단에 따르며, 각각의 피험자에 대해 상이할 수 있다. 당업자에게 있어, 본 발명의 핵산 분자 또는 융합 폴리펩타이드의 치료학적 유효량이, 특히 투여 스케줄, 투여되는 항원의 단위 용량, 핵산 분자 또는 융합 폴리펩타이드가 다른 치료제와 함께 투여되는지의 여부, 면역 상태 및 수용자의 건강, 및 특정 핵산 분자 또는 융합 폴리펩타이드의 치료 활성에 기인한다는 것이 명백하다.
조성물은 단일 용량 스케줄 또는 다수 용량 스케줄로 투여될 수 있다. 다수 용량 스케줄은, 예방접종의 1차 코스가 예를 들어 1 내지 10개의 분리된 용량을 포함하고, 기타 용량은 면역 반응을 유지시키고 강화하는데 필요한 후속 시간 간격, 예를 들어 제2 용량 및, 필요한 경우, 수개월 후의 후속 용량(들)에 대해 1 내지 4개월 간격으로 투여되는 것이다. 1 내지 5년, 통상 3년 간격의 주기적 증강이 목적하는 수준의 보호 면역을 유지하는데 바람직할 수 있다. 면역화의 과정 후 ESAT6 또는 ST-CF와 공동-배양된 말초혈 림프구 (PBL)의 시험관내 증식 검정을 수행하고, 프라이밍된 림프구로부터 방출된 IFN-γ의 수준을 측정할 수 있다. 검정은 통상의 표지, 예를 들어 방사성뉴클레오타이드, 효소, 형광 표지 등을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 기술은 당해 기술 분야의 전문가에게 공지되어 있으며, 문헌 [참조: U.S. Pat. Nos. 3,791,932, 4,174,384 및 3,949,064, 관련 부분이 참조로 삽입됨]에서 찾을 수 있다.
모듈방식의 rAb 캐리어 및/또는 접합된 rAb 캐리어-(코헤신/도커린 및/또는 도커린-코헤신)-항원 복합체 (rAb-DC/DC-항원 백신)은, 핵산 벡터, 최종 정제된 단백질 또는 최종 백신 형태가 사용되는 지의 여부에 따라 하나 이상의 "단위 용량"으로 제공될 수 있다. 단위 용량은 이의 투여, 즉 적합한 경로 및 치료 요법과 관련하여 목적하는 반응을 얻도록 계산된 치료학적 조성물의 예정량을 포함하는 것으로 정의되다. 투여될 양 및 특정 경로 및 제형화는 임상 분야의 사람들의 기술 범위에 속한다. 또한, 처리될 피험자는, 특히 피험자의 면역계의 상태 및 목적하는 보호 상태에 대해 평가될 수 있다. 단위 용량이 단일 주사로 투여될 필요는 없으며, 일 세트의 시간 기간에 걸처 연속 주입될 수도 있다. 본 발명의 단위 용량은 편리하게는 DNA/kg (또는 단백질/Kg) 체중으로 기술되며, 약 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.5, 1, 10, 50, 100, 1,000 mg 이상/DNA 또는 단백질/kg 체중의 범위이다. 마찬가지로, 전달되는 rAb-DC/DC-항원 백신의 양은 약 0.2 내지 약 8.0 mg/kg이다. 따라서, 특정 양태에서, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.8 mg, 1.0 mg, 1.5 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 4.0 mg, 5.0 mg, 5.5 mg, 6.0 mg, 6.5 mg, 7.0 mg 및 7.5 mg의 백신이 생체내에서 개체에 전달될 수 있다. 투여될 rAb-DC/DC-항원의 양은 처리되는 피험자의 체중 및 물리적 상태 및 투여 방식 및 처리 횟수에 상당히 의존적이다. 리포좀 또는 바이러스성 전달 벡터에 예비결합된 나상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 1 μg 내지 1 mg 폴리펩타이드 내지 1 μg 내지 100 mg 단백질의 양으로 투여될 수 있다. 따라서, 특정 조성물은 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 100 μg, 150 μg, 200 μg, 250 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg, 1 mg, 1.5 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg 또는 100 mg의 벡터에 독립적으로 결합된 약 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 100 μg, 150 μg, 200 μg, 250 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg 또는 1,000 μg의 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명은 Flu 항원이 표적되었던 수지상 세포에 의한 사람 Flu-특이적 T 세포의 면역 자극을 측정하는 시험관내 세포 시스템에서 시험되었다. 본원에 나타낸 결과는 이러한 시스템에서 혼자로는 효과적이지 않은 항원 투여량으로 항원 특이적 세포의 명확한 증가를 입증한다.
또한, 본 발명은, 예를 들어 리신, 안트락스 독소 및 스타필로코쿠스 B 장독소로부터의 보호적 항원과 복합체를 형성한 (특정한 사람 수지상 수용체에 대해 지시되는) 재조합 사람화 mAb인 모듈방식의 rAb 캐리어를 제조하는데 이용될 수 있다. 이러한 물질의 잠재적 시장은 모든 군인들에 대한 예방접종이며, 저장된 백신은 이러한 제제에 관련된 임의의 생물위험에 대응하여 대규모 인구밀집지역에 투여하기 위해 비축된다. 본 발명은 일반적으로 사람 및 동물 모두에의 사용을 위한 백신의 설계에 광범위한 적용을 갖는다. 관심 산업은 약학 및 생물공학 산업을 포함한다.
본 발명은 항원에 대해 지시되는 강력하고 광범위한 면역 반응을 유도하기 위해 항원 제시 세포 (APC)에 항원을 특이적으로 표적화 (전달)하는, 백신을 포함한, 조성물 및 방법을 포함한다. 이러한 조성물은 항원이 유도되었던 제제 (병원체 또는 암)에 대한 보호적 또는 치료적 면역 반응을 일으킨다. 또한, 본 발명은, 직접적으로 또는 다른 제제와 공동으로, 항원-제시 세포에서 발현되는 DC-ASGPR이라 불리는 수용체의 특이적 유도를 통해 치료효과를 갖는 제제를 제조한다.
(특정 사람 수지상 세포 수용체 DC-ASGPR에 대해 지시되는) 새로운 재조합의 사람화된 mAb를 항체 (Ab) 중쇄를 통해 보호적 항원을 암호화하는 것으로 알려지거나 의심되는 항원에 융합시켰다. 이들은 다양한 제제에 대한 예방접종을 위한 예로서 인플루엔자 H5N1로부터의 헤마글루티닌; 리신, 탄저병 독소 및 스타필로코쿠스 B 장독소로부터의 HIV gag; 흑색종 항원으로부터의 항원성 펩타이드의 '스트링' 등을 포함한다. 본 발명은 위험하거나 감염된 환자에 대한 보호적 또는 치료적 예방접종으로서 이용될 수 있다. 본 발명은 사람 및 동물 모두에 사용되는, 많은 질환 및 암에 대한 예방접종을 위한 광범위한 적용을 갖는다. 본 발명을 이용할 수 있는 산업은 약학 및 생물공학을 포함한다.
본 발명은 예방접종 목적으로 항원을 APC에 표적하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적에 어떤 항원 내화 수용체가 가장 적합할 것이라는 것이 알려진바 없다. 본 발명은 이러한 목적으로서 DC-ASGPR의 특히 유리한 특징을 기술한다. 또한, 본 발명은 DC-ASGPR을 유도하는 것이 매우 잘 예측되는 중요한 치료적 이점과 함께 면역계를 활성화시킨다는 의미에서 유리할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명은 사람 DC-ASGPR에 대한 고친화성 모노클로날 항체의 개발을 포함한다. 수용체 엑토도메인 (extodomain).hIgG (사람 IgGlFc) 및 AP (사람 태반 알칼리 포스파타제) 융합 단백질을 각각 마우스를 면역화시키고 mAb를 스크리닝하기 위해 생성하였다. hDCIR 엑토도메인.IgG에 대한 발현 제작물은 이전에 기술된 바 있으며 [참조: Bates, Fournier et al. 1999], 분비를 유도하기 위해 마우스 SLAM (mSLAM) 시그널 펩타이드를 사용하였다 [참조: Bendtsen, Nielsen et al. 2004]. hDCIR 엑토도메인.AP에 대한 발현 벡터는, 근위 인-프레임 Xho I 부위 및 원위 TGA 종결 코돈 및 Not I 부위를 첨가하면서, AP 잔기 133-1581 (gb|BC009647|)을 증폭하도록 PCR을 이용하여 제조하였다. 이러한 Xho I-Not I 단편은 상기 hDCIR 엑토도메인.IgG 벡터의 IgG 암호화 서열을 대체시켰다. 동일한 Ig 및 AP 벡터 시리즈에서의 DC-ASGPR 엑토도메인 제작물은 (bp 484-1251, gi|53832017)을 암호화하는 삽입물을 포함하였다. DC-ASGPR 융합 단백질은 제작자의 프로토콜에 따라 (형질감염에 대해 1.3 ml의 293 펙틴 시약/L을 갖는 1 mg의 총 플라스미드 DNA) FreeStyleTM 293 발현 시스템 (Invitrogen)을 이용하여 생성하였다. rAb 제조를 위해, H 및 L 쇄를 암호화하는 등량의 벡터를 공동-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 3일 동안 배양하고, 배양 상청액을 수거한 후, 2일 동안의 연속 항온배양과 함께 신선한 배지를 가하였다. 모은 상청액을 여과시켜 맑게 하였다. 수용체 엑토도메인.hIgG를 0.1 M 글리신 pH 2.7으로 용출시키면서 HiTrap 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제한 후, PBS에 대해 투석하였다. rAb (후에 기술되는 재조합 항체)를 HiTrap MabSelectTM 컬럼을 사용하여 유사하게 정제하였다. 마우스 mAb를 통상의 세포 융합 기술로 제조하였다. 간단히 설명하면, 6주령의 BALB/c 마우스를 Ribi 애주번트와 함께 20 μg의 수용체 엑토도메인.hIgGFc 융합 단백질로 복강내 면역화시키고, 10일 및 15일 후 20 μg의 항원으로 부스팅하였다. 3개월 후, 비장을 취하기 3일 전에 마우스를 다시 부스팅하였다. 달리, 마우스에 30 내지 40일에 걸쳐 3 내지 4일 마다 Ribi 애주번트 중의 1 내지 10 μg 항원을 발바닥에 주사하였다. 최종 부스팅한 지 3 내지 4일 후, 배수 림프절 (draining lymph node)을 수거하였다. 비장 또는 림프절 세포로부터의 B 세포를 통상의 기술로 SP2/O-Ag 14 세포 [참조: Shulman, Wilde et al. 1978]와 융합시켰다. ELISA를 이용하여, 융합 파트너 단독 또는 AP에 융합된 수용체 엑토도메인과 비교하면서, 수용체 엑토도메인 융합 단백질에 대해 하이브리도마 상청액을 스크리닝하였다 [참조: Bates, Fournier et al. 1999]. 이어서, 양성 웰을 전장의 수용체 cDNA를 암호화하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 293F 세포를 사용하여 FACS로 스크리닝하였다. 선별된 하이브리도마를 단일 세포로 클론화하고, CELLine 플라스크 (Intergra)에서 증대시켰다. 하이브리도마 상청액을 동일 용적의 1.5 M 글리신, 3 M NaCl, 1 x PBS, pH 7.8과 혼합하고, MabSelect 수지와 함께 텀블링하였다. 수지를 결합 완충액으로 세척하고, 0.1 M 글리신, pH 2.7로 용출하였다. 2 M 트리스로 중화시킨 후, mAb를 PBS에 대해 투석하였다.
직접적 ELISA에 의한 정제된 항-DC-ASGPR 모노클로날 항체의 특징 분석 및 ELISA에 의한 수개의 항-DC-ASGPR mAb의 상대적 친화도를 측정하였다 (즉, DC-ASGPR.Ig 단백질을 미세플레이트 표면에 고정시키고, 항체를 DC-ASGPR.Ig에 결합하는 능력에 대해 용량 적정 시리즈로 (항-마우스 IgG.HRP 접합체 시약에 의해 검출되는 바와 같이) 시험하였다). 이러한 실시예에서, PAB42 및 PAB44는 다른 mAb보다 높은 친화성을 나타낸다. 동일한 mAb는 미세플레이트 표면에 결합된 사람 Ig에 유의하게 결합하지 못한다. 이는 mAb가 DC-ASGPR.Ig 융합 단백질의 DC-ASGPR 엑토도메인 부분과 반응한다는 것을 나타낸다 (자료 나타내지 않음).
간접적 ELISA에 의한 정제된 항-DC-ASGPR 모노클로날 항체의 특징 분석. 이어서, 수개의 항-DC-ASGPR mAb의 상대적 친화성을 ELISA로 측정하였다 (즉, 항-DC-ASGPR mAb를 미세플레이트 표면에 고정시키고, DC-ASGPR.AP 시약에 결합하는 능력에 대해 용량 적정 시리즈로 시험하였다). PAB42, PAB44 및 PAB54로 열거된 하이브리도마로부터의 상청액이 다른 mAb보다 높은 친화 결합성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (자료 나타내지 않음).
FACS에 의한 항-DC-ASGPR의 특징분석. 또한, 상기 mAb의 패널을 세포 표면 DC-ASGPR의 합성을 지시하는 발현 플라스미드로 형질감염된 293F 세포에 대해 FACS로 시험하였다. 시그널의 평균 형광 강도를 비-감염된 293F 세포에 대한 유사한 시그널로부터 감하였다. 이러한 기준에 의해, mAb는 DC-ASGPR을 갖는 세포의 표면에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 mAb, 예를 들어 37A7은 이에 특히 유리한 것으로 보인다 (자료 나타내지 않음).
도 1A 내지 1D는 DC-ASGPR을 통한 시그널전달이 DC를 활성화시킨다는 것을 나타낸다. DC는 이들의 활성화에 따라 면역 반응의 결과인 유도 (induction) 또는 허용 (tolerance)을 측정하는 1차적 면역 세포이다 (참조문헌 15). DC 활성화에 있어 LLR의 역할은 아직 알려진바 없다. 따라서, 본 발명자들은 LLR DC-ASGPR을 유발 (triggering)시키는 것이 DC를 활성화시킬 수 있는가에 대해 시험하였다. 3일 및 6일 모두에서, 시험관내 배양된 GM/IL-4 DC는 LOX-1, ASGPR, 및 CLEC-6를 발현한다 (도 1A). 6일에 DC를 DC-ASGPR에 특이적인 mAb로 자극하였으며, 도 1B에 나타난 자료는 DC-ASGPR을 통한 시그널이 DC를 활성화시켜 CD86 및 HLA-DR의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 또한, DC 상의 DC-ASGPR의 유발은 DC로부터 IL-6, MCP-1, IL-12p40, 및 IL-8의 생성을 증가시켰다 (도 1C). 다른 사이토카인 및 케모카인 TNFa, IP-10, MIP-1a, 및 IL-10도 또한 DC-ASGPR을 통한 시그널전달에 의해 상당히 증가되었으며, 이는 DC-ASGPR이 DC를 활성화시키도록 세포성 시그널을 전달할 수 있다는 것을 제시한다. 일관되게, DC-ASGPR 특이적 mAb로 자극된 DC는 공동-자극 분자 및 케모카인 및 사이토카인-관련 유전자를 포함하나 다수 유전자의 발현을 증가시켰다 (도 1D). TLR2 및 TLR4-매개된 면역 세포 활성화에 있어 LLR의 가능한 기여는 이미 기술되어 있다 (참조 문헌 13, 16). 본 발명자들은 DC-ASGPR을 통한 시그널이 DC의 추가적 활성화를 위해 CD40을 통한 시그널과 상승작용할 수 있다는 것을 관측하였다 (도 1E). 이러한 사실은, LLR이 생체내 DC 활성화 동안 공동-자극 분자로서 작용할 수 있기 때문에 중요하다. 종합하면, 도 1에 나타난 자료는 DC-ASGPR을 통한 시그널전달이 DC를 활성화시키고, DC-ASGPR이 DC 활성화를 위한 공동-자극 분자로서 작용한다는 것을 입증한다. CD40-CD40L 상호작용 동안 DC-ASGPR의 유도는 IL-12p70의 상당히 증가된 생성을 초래한다.
DC-ASGPR을 통해 자극된 DC는 강력한 체액성 면역 반응을 유도한다. DC는 T-의존적 및 T-독립적 B 세포 반응 모두에 대한 시그널을 제공하고 (참조문헌 19 내지 22), 항원을 B 세포로 전달함으로써 (참조문헌 23, 24) 체액성 면역 반응에 중요한 역할을 한다. DC 이외에, 제3 시그널로서 TLR9를 통한 시그널전달이 효과적인 B 세포 반응에 필요하다 (참조문헌 25, 26).
따라서, 본 발명자들은 TLR9 리간드인 CpG의 존재 하에 DC-매개된 체액성 면역 반응에서 DC-ASGPR의 역할을 시험하였다. 6일에, GM/IL-4 DC를 항-DC-ASGPR mAb로 자극하고, 정제된 B 세포를 공동-배양하였다. 도 2A에 나타난 바와 같이, 항-DC-ASGPR mAb로 활성화된 DC는, 대조 mAb로 자극된 DC와 비교하여, B 세포 증식 (CFSE 희석) 및 형질세포 분화 (CD38+CD20-)를 현저하게 증가시켰다. CD38+CD20- 세포는 형질세포의 전형적 형태를 가지나, CD138을 발현하지 않는다. 대부분의 증식 세포는 CCR2, CCR4, CCR6 또는 CCR7를 발현하지 못했다. 생성된 총 면역글로불린 (Ig)의 양을 ELISA로 측정하였다 (도 2B). 도 2A의 자료와 일치하게, 항-DC-ASGPR 자극된 DC와 배양된 B 세포는 총 IgM, IgG 및 IgA의 생성을 상당히 증가시켰다. 총 Ig 이외에, 본 발명자들은 또한 DC-ASGPR을 유발함으로써 활성화된 DC가 B 세포에 의한 인플루엔자 바이러스-특이적 IgM, IgG 및 IgA (도 2C)의 생성에 대해 대조 mA로 자극된 DC 보다 강력하다는 것을 관측하였으며, 이는 DC-ASGPR-매개된 DC 활성화가 전체 및 항원 특이적 체액성 면역 반응 모두에 기여한다는 것을 제시한다. 본 발명자들은 체액성 면역 반응에 있어 생체외 항원 제시 세포 (APC)에서의 DC-ASGPR의 역할을 시험하였다. CD19+ 및 CD14+ 세포를 포함한 PBMC 중의 APC의 부분들은 DC-ASGPR을 발현한다 (보충 도 2). 연막으로부터의 PBMC를 항-DC-ASGPR mAb로 코팅된 플레이트에서 배양하고, 총 Ig 및 B 세포 증식을 측정하였다. DC로부터 얻은 자료와 일치하게 (도 2A), DC-ASGPR을 통해 자극된 APC는 TLR9 리간드의 부재 (도 2D의 상단 패널) 또는 존재 (도 2D의 하단 패널) 하에 B 세포 증식 및 형질세포 분화를 증가시켰다. 또한, 총 IgM, IgG 및 IgA는, PBMC를 DC-ASGPR에 대한 mAb로 코팅된 플레이트에서 배양하는 경우, 상당히 증가하였다 (도 2E). 도 1에 나타난 바와 같이, DC-ASGPR을 통한 시그널전달에 의해 활성화된 DC는 성숙된 표현형을 갖고, 다량의 염증성 사이토카인 및 케모카인을 생성하며, 성숙된 DC 표현형 및 DC로부터의 가용성 인자 모두 향상된 B 세포 반응에 기여할 수 있었다 (도 2). 그러나, DC-유도된 B 림프구 자극자 단백질 (BLyS, BAFF) 및 증식-유도된 리간드 (APRIL)가 또한 이에 의해 DC가 사람 B 세포 증식 및 기능을 직접적으로 조절할 수 있는 중요한 분자이다 (참조문헌 27 내지 30). 따라서, 본 발명자들은 DC-ASGPR을 통한 시그널이 BLyS 및 APRIL의 발현 수준을 변화시킬 수 있는지의 여부를 시험하였다. 도 2D의 자료는 DC-ASGPR을 통해 자극된 DC가 세포내 APRIL 및 분비되는 APRIL의 수준은 증가시키나 BLyS는 증가시키지 않는다는 것을 나타낸다 (자료 나타내지 않음). 혼합된 배양물 중 B 세포 상의 BLyS 및 APRIL 수용체의 발현 수준을 측정하였으나, 유의한 변화는 없었다 (자료 나타내지 않음).
DC-ASGPR은 B 세포 활성화 및 Ig 생성에 기여한다. CD19+ B 세포는 DC-ASGPR을 발현한다 (도 3A). 따라서, 본 발명자들은 B 세포 활성화에서의 DC-ASGPR의 역할을 시험하였다. 도 3B의 자료는 DC-ASGPR을 통해 자극된 B 세포가 상당히 많은 양의 케모카인을 생성하였다는 것을 나타낸다. IL-8 및 MIP-1a 이외에도, B 세포가 항-DC-ASGPR mAb로 자극되는 경우, 대조 mAb와 비교하여, IL-6 및 TNFα에서도 약간의 증가가 관측되었다. 세포 활성화에 관련된 유전자도 또한 상향-조절되었다 (도 3C). B 세포는 DC-ASGPR을 통해 자극되는 경우, IgM, IgG 및 IgA를 생성하였으며 (도 3D), DC-ASGPR이 생체 내에서 정상적인 면역글로불린의 유지에 중요한 역할을 할 수 있었다는 것을 제시한다. 그러나, DC-ASGPR 단독을 통한 시그널전달은 유의한 B 세포 증식을 유도하지 못했다.
T 세포 반응에서 DC-ASGPR의 역할. DC-ASGPR을 통해 자극된 DC는 증가된 수준의 공동-자극 분자를 발현하며, 증가된 양의 사이토카인 및 케모카인을 생성하며 (도 1), 이는 DC-ASGPR이 세포성 면역 반응 및 체액성 면역 반응에 기여한다는 것을 제시한다. 이를 혼합된 림프구 반응 (MLR)에 의해 시험하였다. 정제된 동종이형 T 세포의 증식이 DC-ASGPR에 특이적인 mAb로 자극된 DC에 의해 상당히 증가하였다 (도 4A). 또한, DC-ASGPR을 통해 활성화된 DC도 대조 mAb로 자극된 DC보다 효율적으로 Mart-1-특이적 CD8 T 세포를 프라이밍할 수 있었다 (도 4B의 상단 패널). 보다 중요하게는, DC-ASGPR을 통한 시그널전달은, DC가 CD8 T 세포에 대한 Mart-1 펩타이드를 교차-프라이밍하게 하였다 (도 4B의 하단 패널). 이는 DC-ASGPR이 DC 기능을 향상시키는데 중요한 역할을 하여, CD8 T 세포에 대한 항원의 보다 우수한 프라이밍 및 교차-프라이밍이 가능하다는 것을 나타낸다. T 세포 반응의 활성화에서 PBMC 중의 APC의 혼합물 상에 발현되는 DC-ASGPR의 역할이 도 4C에 나타나 있으며, 여기서 DC-ASGPR에 대한 mAb로 자극된 PBMC는, 대조 mAb로 자극된 DC와 비교하여, Flu M1 4량체 특이적 CD8 T 세포의 빈도를 증가시켰다. 이러한 증진된 항원 특이적 CD8 T 세포 반응은 도 4D의 자료에 의해 지지되며, 이는 DC-ASGPR을 통해 자극된 DC가 CD4 T 세포 증식을 상당히 증가시킨다는 것을 나타낸다.
재료 및 방법
이소타입 대조군 Ab를 포함한, DC 및 B 세포의 표면 염색을 위한 항체 및 4량체-항체 (Ab)를 BD Biosciences (CA)로부터 구입하였다. ELISA를 위한 Ab는 Bethyl (TX)로부터 구입하였다. 항-BLyS 및 항-APRIL은 PeproTech (NJ)으로부터 구입하였다. 4량체 HLA-A*0201-GILGFVFTL (서열번호 1) (Flu M1) 및 HLA-A*0201-ELAGIGILTV (서열번호 2) (Mart-1)는 Beckman Coulter (CA)로부터 구입하였다.
세포 및 배양 - 정상 공여자로부터의 단핵구 (1 x 106개/ml)를 GM-CSF (100 ng/ml) 및 IL-4 (50 ng/ml) (R&D, CA)를 포함하는 Cellgenics (France) 배지에서 배양하였다. 3일 및 6일에, DC, 동일량의 사이토카인을 각각 1일 및 3일에 배지로 보충하였다. B 세포를 네가티브 분리 키트 (BD)로 정제하였다. CD4 및 CD8 T 세포를 항-CD4 또는 CD8 (Milteniy, CA)로 코팅된 자석 비드로 정제하였다. PBMC는 밀도 구배 원심분리에 의해 PercollTM 구배 (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 연막으로부터 분리하였다. DC 활성화를 위해, 1 x 105개 DC를 16 내지 18시간 동안 mAb-코팅된 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 카보네이트 완충액, pH 9.4 중의 mAbs (1 내지 2 μg/웰)을 37 ℃에서 적어도 3시간 동안 항온처리하였다. 배양 상청액을 수거하고, 사이토카인/케모카인을 Luminex (Biorad, CA)로 측정하였다. 유전자 분석을 위해, DC를 8시간 동안 mAb로 코팅된 플레이트에서 배양하였다. 일부 실험에서, 가용성의 50 ng/ml의 CD40L (R&D, CA) 또는 50 nM CpG (InVivogen, CA)를 배양물에 가하였다. DC 및 B 세포 공동-배양물에서, 10% FCS 및 항생제를 갖는 RPMI 1640 (Biosource, CA)에 재현탁된 5 x 103개의 DC를 적어도 6시간 동안 mAb로 코팅된 플레이트에서 배양한 후, CFSE (Molecular Probes, OR)로 표지된 1 x 105개의 정제된 자가 B 세포를 가하였다. 일부 실험에서, DC를 2시간 동안 열-불활성화된 인플루엔자 바이러스 (A/PR/8 H1N1)의 5 moi (multiplicity of infection)로 펄스처리한 후, B 세포와 혼합하였다. DC 및 T 세포 공동-배양을 위해, 5 x 103개의 DC를 1 x 105개의 정제된 자가 CD8 T 세포 또는 혼합된 동종이형 T 세포와 함께 배양하였다. 동종이형 T 세포를 최종 18시간의 항온배양 동안 1 μCi/웰 3[H]-티미딘으로 펄스처리한 후, μ-카운터 (Wallac, MN)로 cpm을 측정하였다. 5 x 105개의 PBMC/웰을 mAb로 코팅된 플레이트에서 배양하였다. Mart-1 및 Flu M1 특이적 CD8 T 세포의 빈도를 각각 배양 10일 및 7일에 항-CD8 및 4량체로 세포를 염색함으로써 측정하였다. Mart-1 펩타이드 (하기 참조)를 포함하는 10 μM의 Mart-1 펩타이드 (ELAGIGILTV) (서열번호 2) 및 20 nM의 재조합 단백질을 DC 및 CD8 T 배양물에 가하고, 20 nM 정제된 재조합 Flu M1 단백질 (하기 참조)를 PBMC 배양물에 가하였다.
모노클로날 항체 - 마우스 mAb를 통상의 기술에 의해 생성하였다. 간략히 설명하면, 6주령의 BALB/c 마우스를 Ribi 애주번트와 함께 20 μg의 수용체 엑토도메인.hIgGFc 융합 단백질로 복강내 면역화시키고, 10일 및 15일 후 20 μg의 항원으로 부스팅하였다. 3개월 후, 비장을 취하기 3일 전에 마우스를 다시 부스팅하였다. 달리, 마우스에 30 내지 40일에 걸쳐 3 내지 4일 마다 Ribi 애주번트 중의 1 내지 10 μg 항원을 발바닥에 주사하였다. 최종 부스팅한 지 3 내지 4일 후, 배수 림프절 (draining lymph node)을 수거하였다. 비장 또는 림프절 세포로부터의 B 세포를 SP2/O-Ag 14 세포와 융합시켰다. 하이브리도마 상청액을 스크리닝하여, 융합 파트너 단독 또는 알칼리 포스파타제에 융합된 수용체 엑토도메인과 비교하여, 수용체 엑토도메인 융합 단백질에 대한 Ab를 분석하였다 (참조문헌 44). 이어서, 양성 웰을 전장의 수용체 cDNA를 암호화하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 293F 세포를 사용하여 FACS로 스크리닝하였다. 선별된 하이브리도마를 단일 세포로 클론화하고, CELLine 플라스크 (Integra, CA)에서 증대시켰다. 하이브리도마 상청액을 동일 용적의 1.5 M 글리신, 3 M NaCl, 1 x PBS, pH 7.8과 혼합하고, MabSelect 수지로 텀블링하였다. 수지를 결합 완충액으로 세척하고, 0.1 M 글리신, pH 2.7로 용출하였다. 2 M 트리스로 중화시킨 후, mAb를 PBS에 대해 투석하였다.
ELISA - 샌드위치 ELISA를 수행하여 총 IgM, IgG 및 IgA, 및 flu-특이적 면역글로불린 (Ig)를 측정하였다. 공지된 양의 Ig 및 사람 AB 혈청을 포함하는 표준 사람 혈청 (Bethyl)을 각각 총 Ig 및 flu-특이적 Ig에 대한 표준물로서 사용하였다. 샘플 중 flu 특이적 Ab 역가 (유니트)는 동일한 흡광 밀도를 보이는 AB 혈청의 희석 계수로서 정의되었다. BAFF 및 BLyS의 양은 ELISA 키트 (Bender MedSystem, CA)로 측정하였다.
RNA 정제 및 유전자 분석 - 총 RNA를 RNeasy 컬럼 (Qiagen)으로 추출하고, 2100 Bioanalyser (Agilent)로 분석하였다. 바이오틴-표지된 cRNA 표적물을 Illumina totalprep 표지 키트 (Ambion)를 사용하여 제조하고, Sentrix Human6 BeadChips (46K 전사물)에 하이브리드화하였다. 이들 마이크로어레이는 실리콘 웨이퍼의 표면에 에칭된 마이크로웰에 박힌 3 μm 비드에 부착된 50량체 올리고뉴클레오타이드 프로브로 구성된다. 스트렙타비딘-Cy3으로 염색한 후, 어레이 표면을 Illumina (Beadstation 500 X)에 의해 제작된 서브-마이크론 해상도 스캐너를 사용하여 영상화한다. 자료를 분석하기 위해 유전자 발현 분석 소프트웨어 프로그램 GeneSpring, 버젼 7.1 (Agilent)을 사용하였다.
재조합 Flu M1 및 MART-1 단백질의 발현 및 정제 - PCR을 이용하여, 개시 코돈에 대해 멀리 Nhe I 부위 및 종결 코돈에 대해 멀리 Not I 부위를 삽입하면서, Influenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1) M1 유전자의 ORF를 증폭시켰다. 분해된 단편을, M1 ORF 인-프레임에 His6 태그를 배치시켜 His.Flu M1 단백질을 암호화하는, pET-28b(+) (Novagen)에 클로닝하였다. Nco I과 Nhe I 부위 사이에 삽입된 씨.써모셀룸 (C. thermocellum) (미공개)으로부터의 N-말단 169개 잔기 코헤신 도메인을 암호화하는 pET28b (+) 유도체는 Coh.His를 발현하였다. Cohesin-Flex-hMART-1-PeptideA-His의 발현을 위해, 서열
Figure 112009053990515-PCT00001
(
Figure 112009053990515-PCT00002
를 암호화함 - 음영된 잔기는 면역우세 HLA-A2-제한된 펩타이드이고, 펩타이드 주위의 밑줄그은 잔기는 MART-1으로부터의 것이다)을 상기 벡터의 Nhe I과 Xho I 부위 사이에 삽입하였다. 단백질을 37 ℃의 LB 중에서 성장되는 이.콜라이 균주 BL21 (DE3) (Novagen) 또는 T7 Express (NEB)에서 발현시켰다 (카나마이신 내성 (40 μg/ml)에 대한 선별 및 200회 회전/분으로 진탕, 120 mg/L IPTG가 첨가되는 경우 중간 대수기 성장). 3시간 후, 세포를 원심분리시켜 수거하고, -80 ℃에서 저장하였다. 각각 1 L 발효로부터의 이.콜라이를 0.1 ml의 프로테아제 억제제 Cocktail II (Calbiochem, CA)를 갖는 30 ml 빙-냉각된 50 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0 (완충액 B)에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 5분의 휴식 기간을 갖는 세팅 18 (Fisher Sonic Dismembrator 60)로 2 x 5분 초음파처리한 후, 4 ℃에서 20분 동안 17,000 r.p.m. (Sorvall SA-600)으로 회전시켰다. His.Flu M1 정제를 위해, 50 ml 세포 용해 상청액 분획을 5 ml Q Sepharose 비드에 통과시키고, 6.25 ml 160 mM Tris, 40 mM 이미다졸, 4 M NaCl pH 7.9를 Q Sepharose 플로우 쓰로우에 가하였다. 이를 Ni++로 하전된 5 ml HiTrap 킬레이팅 HP 컬럼에 4 ml/분으로 로딩하였다. 컬럼-결합된 단백질을 20 mM NaPO4, 300 mM NaCl pH 7.6 (완충액 D)로 세척한 후, 100 mM H3COONa pH 4.0로 또 다른 세척을 수행하였다. 결합된 단백질을 100 mM H3COONa pH 4.0로 용출시켰다. 피크 분획물을 모으고, 100 mM H3COONa pH 5.5로 평형화된 5 ml HiTrap S 컬럼에 4 ml/분으로 로딩한 후, 평형 완충액으로 세척하고, 50 mM NaPO4 pH 5.5 중 0 내지 1 M NaCl의 구배로 용출하였다. 약 500 mM NaCl로 용출하는 피크 분획을 모았다. Coh.Flu M1.H 정제를 위해, 2 L의 배양물로부터의 세포를 상기와 같이 용해시켰다. 원심분리 후, 2.5 ml의 Triton X114를 5분 동안의 얼음 상에서의 항온처리와 함께 상청액에 가하였다. 25 ℃에서 5분 동안 추가로 항온처리하고, 25 ℃에서 원심분리한 후 상청액을 Triton X114로부터 분리하였다. 추출을 반복하고, 상청액을 5 ml의 Q Sepharose 비드에 통과시킨 후, 6.25 ml 160 mM Tris, 40 mM 이미다졸, 4 M NaCl pH 7.9을 Q Sepharose 플로우 쓰로우에 가하였다. 이어서, 단백질을 상술된 바와 같이 Ni++ 킬레이트화 크로마토그래피로 정제하고, 완충액 D 중의 0 내지 500 mM 이미다졸로 용출하였다.
특정 항-DC-ASGPR mAb만이 DC 활성화 특징을 갖는다 - 본 발명은 DC 활성화가 항-DC-ASGPR 항체의 일반적 특징이 아니고 단지 특정 항-DC-ASGPR mAb만이 이러한 기능을 갖는다는 것을 기술한다. 도 5는 단지 특정 mAb만이 DC-ASGPR을 통해 DC를 활성화시킨다는 것을 나타내며, 이는 실제 DC에 대해 스크리닝함으로써 특징분석되어야 한다.
항-DC-ASGPR mAb의 L 및 H 가변 영역에 상응하는 특정 서열 - 본 발명은 치료적 또는 보호적 생성물의 (예를 들어 사람화된 재조합 항체에 대한) 바람직한 성분인 항-DC-ASGPR 모노클로날 항체에 상응하는 하기에 나타낸 특정 아미노산 서열을 포함한다. 하기는 키메릭 마우스 V 영역 - 사람 C 영역 재조합 항체에 대한 서열이다. [mAnti-ASGPR_49C11_7H-LV-hIgG4H-C]는
Figure 112009053990515-PCT00003
이다. 상기 서열은 mAb 49C11의 H 쇄 V-영역 (밑줄 표시)과 hIgG4의 C 영역 사이의 키메라이다. [mAnti-ASGPR_49C11_7K-LV-hIgGK-C]는 상응하는 L 쇄 키메라
Figure 112009053990515-PCT00004
이다. [mAnti-ASGPR_4G2.2_Hv-V-hIgG4H-C]는
Figure 112009053990515-PCT00005
이다. [mAnti-ASGPR_4G2.2_Kv-V-hIgGK-C]는
Figure 112009053990515-PCT00006
이다. [mAnti-ASGPR_5F10H-LV-hIgG4H-C]는
Figure 112009053990515-PCT00007
이다. [mAnti-ASGPR_5F10K-LV-hIgGK-C]는
Figure 112009053990515-PCT00008
이다. [mAnti-ASGPR1H11H-V-hIgG4H-C]는
Figure 112009053990515-PCT00009
이다. [mAnti-ASGPR1H11K-LV-hIgGK-C]는
Figure 112009053990515-PCT00010
이다. 본 발명은 항원 제시 세포 상의 DC-ASGPR에 결합할 수 있는 단백질 형태의 발현을 지시하기 위해 V-영역 서열 및 관련된 서열을, 예를 들어 DC-ASGPR에 대한 친화성을 향상시키기 위해 당해 기술 분야의 전문가에 의해 변형시키고/시키거나 발현 벡터로 조작되는 사람 V-영역 골격 서열로 통합하는 고려한다.
조작된 재조합 항-DC-ASGPR 재조합 항체-항원 융합 단백질 ((rAb.항원)은 시험관내에서 효과적인 원형 (prototype) 백신이다 - 발현 벡터를, 예를 들어 H 쇄 암호화 서열에 인-프레임 융합된 다양한 단백질 암호화 서열을 사용하여 제작할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 HA5, 인플루엔자 M1, HIV gag, 또는 암 항원으로부터의 면역-우세 펩타이드 또는 사이토카인을 rAb.항원 또는 rAb.사이토카인 융합 단백질로서 발현시킬 수 있으며, 이는 본 발명과 관련하여 항-DC-ASGPR V-영역 서열을 사용하는 것으로부터 유도되는 유용성을 지녀 DC-ASGPR을 갖는 항원 제시 세포의 표면에 직접적으로 항원 또는 사이토카인 (또는 독소)를 가져오게 할 수 있다. 이는, 예를 들어 항원 - 때때로 수용체의 활성화와 관련됨-의 내화를 가능하게 하고 (예를 들어, 강력한 면역 반응의 개시를 통해 또는 표적된 세포의 사멸을 통한) 후속하는 치료적 또는 보호적 작용의 개시를 가능하게 한다. 이러한 개념에 기초한 예시적인 원형 백신은 [mAnti-ASGPR_5F10H-LV-hIgG4H-C-Flex-FluHA5-1-6xHis] 또는 -
Figure 112009053990515-PCT00011
와 같은 H 쇄 벡터를 사용할 수 있었다. 상기 서열은 유연성 링커 서열 (이탤릭체로 표시)을 통해 조류 Flu HA5 (굵게 표시)의 HA-1 도메인에 융합된 키메라 H 쇄에 상응한다. 이는 이미 상기에서 나타낸 상응하는 L 쇄 키메라 서열과 공동-발현될 수 있다. 유사하게, 서열 [mAnti-ASGPR_49C11_7H-LV-hIgG4H-C-Dockerin]
Figure 112009053990515-PCT00012
는 이미 상기 나타낸 상응하는 L 쇄 서열의 공동-형질감염을 통해 rAb.도커린 융합 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다.
도 6은 상이한 항원이 DC-ASGPR rAb와 관련하여 발현될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 항-DC-ASGPR rAb.Doc 단백질은 임의의 코헤신.융합 단백질과 단순 혼합함으로써 마치 rAb.융합 단백질과 같이 작용하는 안정한 비-공유 [rAb.Doc:Coh.융합] 복합체를 어셈블링할 수 있다. 도 6은 이러한 [rAb.Doc:Coh.융합] 복합체가 DC-ASGPR를 발현하는 세포의 표면에 항원을 집중시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 이 도면은 항-DC-ASGPR.Doc:Coh.Flu M1 복합체가 DC-ASGPR cDNA로 형질감염된 293F 세포의 표면에 Flu M1을 전달한다는 것을 나타낸다. 1 μg/ml (우측 패널)의 항-DC-ASGPR.Doc rAb (녹색 표시) 또는 대조 hIgG4.Doc rAb (청색 표시)를 실온에서 1시간 동안 바이오티닐화된 Coh.Flu M1 (2 μg/ml)와 함께 항온처리하였다. 형질감염된 293F 세포를 가하고, 얼음 상에서 20분 동안 계속 항온처리하였다. 이어서, 세포를 세척하고, PE-표지된 스트렙타비딘으로 염색하였다. 이어서, 세포를 PE 형광에 대해 분석하였다.
도커린:코헤신 상호작용을 통해 Flu M1에 복합체를 형성한 항-DC-ASGPR rAb는 사람 DC에 대한 항원을 표적하며, Flu M1-특이적 CD8+ T 세포를 증대시킨다 - 예를 들어 DC에 대해 항원을 전달하기 위한 디바이스로서 항-DC-ASGPR의 잠재적인 이용이 하기 표에 나타나 있다. 도 7은 Flu M1-특이적 CD8+ 세포의 극적 증가가 Flu M1에 대한 보호적 면역 반응을 유도하도록 지시되는 백신과 같은 제제의 효능에 대해 매우 예측적이라는 것을 나타낸다.
도 8은 원숭이 ASGPR과의 상이한 항체의 교차 반응성을 입증하였다. PCR 생성물을 pIRES 벡터의 NheI-NotI 부위로 삽입함으로써 pIRES_ASGPR-mon (원숭이)을 클로닝하였다. 최종 생성물의 서열은 클론 5S10에 기초한다. 대부분의 다른 클론은 이것과 유사하거나 하나의 아미노산이 차이 나거나 동일하다. 그러나, 하나의 클론 5S1은 3' 말단 근처에서 A 결실을 갖고, 이는 단축되고 상이한 C' 말단을 생성하였으며, 제2의 변이체로서 사용될 수 있다. 원숭이 ASGPR을 클론화하기 위해, 하기 올리고를 사용하였다: DC-ASGPR_MoN:
Figure 112009053990515-PCT00013
; 및
DC-ASGPR_Mo:
Figure 112009053990515-PCT00014
[
Figure 112009053990515-PCT00015
의 역방향 상보체]. 서열 비교는 가능한 겹침 영역 및, 당업자에게 공지된 바와 같은, 이에 따른 교차-반응성을 나타낸다.
하기 표는 DC-ASGPR 334998 200 μg/ml 12.05.07 cfg#558 항-사람 IgG PE의 결합을 입증하였다.
Figure 112009053990515-PCT00016
Figure 112009053990515-PCT00017
Figure 112009053990515-PCT00018
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Figure 112009053990515-PCT00027
Figure 112009053990515-PCT00028
Figure 112009053990515-PCT00029
본원에서 논의되는 임의의 양태는 본 발명의 어떠한 방법, 키트, 시약 또는 조성물에 대해서도 수행될 수 있을 것이며, 역 또한 같다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 특정 양태는 설명을 위한 것이지, 본 발명을 제한하고자 제시된 것이 아니라는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 양태로 사용될 수 있다. 당업자는 통상적인 수준의 실험을 사용하여 본원에 기재된 구체적 방법과 등가적인 수많은 방법을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위에 속하며, 청구범위에 의해 보호되는 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가의 기술 수준을 나타내는 것이다. 모든 간행물 및 특허 출원은, 개개의 간행물 또는 특허 출원 각각이 구체적으로, 개별적으로 참조로서 인용되는 것임을 나타내는 것과 같은 정도로 본원에 참조로 인용된 것이다.
청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이란 용어와 함께 사용된 부정관사는 "하나"를 의미할 수도 있으나, "하나 또는 이상", "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 의미일 수도 있다. 청구범위 중에 사용된 "또는"이란 용어는, 비록 본원이 단지 양자택일 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지지하더라도, 명시적으로 양자택일을 말하거나, 양자택일이 상호 간에 배제되는 경우가 아닌 한, "및/또는"을 의미하기 위하여 사용된 것이다. 본원 전반에 걸쳐서, "약"이란 용어는, 수치 값이 당해 수치를 측정하기 위하여 사용되는 장치 및 방법에 대한 오차의 고유 편차 또는 연구 대상 중에 존재하는 편차를 포함한다는 것을 나타내기 위하여 사용된 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된, 용어들, "포함하는" (및 "포함한다"와 같은 "포함하는"의 모든 형태), "갖는" (및 "갖는다"와 같은 "갖는"의 모든 형태), 또는 "함유하는" (및 "함유한다"와 같은 "함유하는"의 모든 형태)는 포괄적이거나 개방적이며, 인용되지 않은 추가적 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 "이의 조합"이란 용어는, 당해 용어에 선행하는 열거된 사항의 모든 순열 및 조합을 말하는 것이다. 예를 들면, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중의 하나 이상을 포함하고자 하는 것이며, 만일 순서가 중요한 경우에는, BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB을 또한 포함하고자 하는 것이다. 상기 예에서, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복, 예를 들어 BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, 등을 함유하는 조합도 명백히 포함된다. 당업자는, 달리 명시되지 않는 한, 통상적으로, 모든 조합 중에 항목 또는 용어의 수에 제한이 없음을 이해할 것이다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본원에 개시된 내용에 근거하여 과도한 실험 없이 제조하고 실행할 수 있다. 비록 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서, 당해 조성물 및 방법, 및 본원에 기재된 조성물 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 한정된 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 여겨진다.
참조문헌
Figure 112009053990515-PCT00030
Figure 112009053990515-PCT00031
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Ile Val Lys Lys Gly 705 710 715 720 Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr 725 730 735 Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His 740 745 750 Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser 755 760 765 Asn Arg Leu Val Leu Ala His His His His His His 770 775 780 <210> 14 <211> 521 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically Synthesized Peptide <400> 14 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Leu Phe Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala Ser Asn Ser 435 440 445 Pro Gln Asn Glu Val Leu Tyr Gly Asp Val Asn Asp Asp Gly Lys Val 450 455 460 Asn Ser Thr Asp Leu Thr Leu Leu Lys Arg Tyr Val Leu Lys Ala Val 465 470 475 480 Ser Thr Leu Pro Ser Ser Lys Ala Glu Lys Asn Ala Asp Val Asn Arg 485 490 495 Asp Gly Arg Val Asn Ser Ser Asp Val Thr Ile Leu Ser Arg Tyr Leu 500 505 510 Ile Arg Val Ile Glu Lys Leu Pro Ile 515 520 <210> 15 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide <400> 15 gaattcgcta gccaccatga catatgaaaa cttccaagac ttggagagtg aggagaaagt 60 ccaagggg 68 <210> 16 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide <400> 16 cgaattcgcg gccgctcagt gactctcctg gctggcctgg gtcagaccag cctcgcagac 60 cc 62 <210> 17 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide <400> 17 gggtctgcga ggctggtctg acccaggcca gccaggagag tcactgagcg gccgcgaatt 60 cg 62

Claims (30)

  1. 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편을 분리 및 정제하는 단계를 포함하며, 상기 항원은 상기 항체-항원 복합체와 접촉되었던 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시되는, 항원 제시의 효율을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포인 방법.
  3. 제1항에 있어서, DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편이 코헤린/도커린 (Coherin/Dockerin) 쌍의 절반에 결합되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편이 코헤린/도커린 쌍의 절반에 결합되고, 항원이 코헤린/도커린 쌍의 상보적 절반에 결합되어 복합체를 형성하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 항원이 펩타이드, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 항원 특이적 도메인이 제I형 MHC, 제II형 MHC, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체 또는 항원 제시 세포에 의해 상대적으로 특이적으로 발현되는 기타 수용체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 면역 세포 표면 단백질에 대해 특이적인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 항원이 세균, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 암 단백질을 포함하는 방법.
  8. 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편을 결합하는 단계를 포함하며, 상기 항원은 상기 항체-항원 복합체와 접촉되었던 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시되는, 수지상 세포에 의한 항원 제시의 효율을 증가시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 수지상 세포의 증가된 효율을 동종이형의 CD8+ T 세포를 사용하여 측정하는 방법.
  10. 항원을 항원-제시 세포에 전달하기 위해 DC-ASGPR에 대해 지시되는 항체 또는 다른 특이적 결합 분자의, 보호적 또는 치료적 면역 반응을 유도하기 위한 용 도.
  11. DC-ASGPR에 대해 특이적인 항원-표적화 시약의, 피부를 통한 예방접종을 위한 용도.
  12. DC-ASGPR에 대해 특이적인 항원-표적화 시약의, 공동-투여되거나 연결된 애주번트와의 예방접종을 위한 용도.
  13. 재조합 항원-항체 융합 단백질로서 발현될 수 있는 특이적 항원의 항원-표적화 (예방접종) 목적을 위한 용도.
  14. 포유동물 세포로부터 분비되는 항원 특이적 항-DC-ASGPR 면역글로불린 또는 이의 단편 및 면역글로불린에 결합된 항원.
  15. 제14항에 있어서, 항원이 면역글로불린과의 융합 단백질인 면역글로불린.
  16. 제14항에 있어서, 항원이 세균, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 암 단백질을 포함하는 면역글로불린.
  17. 제14항에 있어서, 면역글로불린이 코헤신/도커린 도메인의 절반에 결합된 면 역글로불린.
  18. 제14항에 있어서, 모듈방식의 rAb 캐리어와 복합체를 형성하는 항원에 결합된 코헤신-도커린 결합쌍의 상보적 절반을 추가로 포함하는 면역글로불린.
  19. 제14항에 있어서, 항원과의 융합 단백질인 코헤신-도커린 결합쌍의 상보적 절반을 추가로 포함하는 면역글로불린.
  20. 제14항에 있어서, 항원 특이적 도메인이 전장의 항체, 항체 가변 영역 도메인, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편, 및 Fv 단편, 및 Fabc 단편 및/또는 Fc 도메인의 부분들을 갖는 Fab 단편을 포함하는 면역글로불린.
  21. 제14항에 있어서, 면역글로불린이 방사성 동위원소, 금속, 효소, 보툴린, 테타누스, 리신, 콜레라, 디프테리아, 아플라톡신, 퍼프린겐 독소, 미코톡신, 시가톡신, 스타필로코쿠스 장독소 B, T2, 세구이톡신, 삭시톡신, 아브린, 시아노기노신, 알파톡신, 테트로도톡신, 아코노톡신, 뱀독 및 거미독으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 독소에 결합되는 면역글로불린.
  22. 제14항에 있어서, 항원이 면역글로불린과의 융합 단백질인 면역글로불린.
  23. 제14항에 있어서, 항원이 세균, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 암 단백질을 포함하는 면역글로불린.
  24. 제14항에 있어서, 항원이 T- 및 B 세포 림프세포증식 질환, 난소암, 췌장암, 두경부암, 편평세포암, 위장암, 유방암, 전립선암 또는 비-소세포성 폐암으로부터 선택되는 암세포 또는 이의 일부를 포함하는 면역글로불린.
  25. 환자의 수지상 세포를 분리시키고,
    상기 수지상 세포를 활성화 양의 항-DC-ASGPR 항체 또는 이의 단편 및 항원에 노출시켜 항원-로딩되고 활성화된 수지상 세포를 형성하며,
    상기 항원-로딩되고 활성화된 수지상 세포를 상기 환자에게 재도입함을 포함하여, 수지상 세포의 효율을 증가시키는 방법.
  26. 항원-제시 세포를 활성화시키도록 단독으로나 공동-활성화제와 함께 DC-ASGPR을 유도하는 제제의, 치료적 또는 보호적 적용을 위한 용도.
  27. 제25항에 있어서, DC-ASGPR 결합제 및/또는 활성화제가 단독으로나 공동-활성화제와 함께 보호적 또는 치료적 예방접종을 위해 항원에 연결되는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 특정 항체 V-영역 서열이 DC-ASGPR에 결합하여 이를 활성 화시킬 수 있는 방법.
  29. 독성제에 연결된 항-DC-ASGPR 제제의, DC-ASGPR을 통한 면역 세포의 부적절한 활성화로부터 유발되는 것으로 알려지거나 의심되는 질환에 대한 치료학적 이용을 위한 용도.
  30. 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DC-ASGPR-특이적 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 상기 항원은 상기 항체-항원 복합체와 접촉되었던 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시되는, 백신.
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