BRPI0807152A2 - Agentes que acoplam células contendo antígeno através do receptor asialoglicoproteina de célula dendrítica (dc-asgpr) - Google Patents

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BRPI0807152A2 BRPI0807152-7A BRPI0807152A BRPI0807152A2 BR PI0807152 A2 BRPI0807152 A2 BR PI0807152A2 BR PI0807152 A BRPI0807152 A BR PI0807152A BR PI0807152 A2 BRPI0807152 A2 BR PI0807152A2
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Sangkon Oh
Gerard Zurawski
Sandra Zurawski
Dapeng Li
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Baylor Res Inst
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Description

AGENTES QUE SE LIGAM ÀS CÉLULAS APRESENTADORAS DE ANTÍGENO POR MEIO DO RECEPTOR DE ASIALOGLICOPROTEÍNA DA CÉLULA
DENDRITICA (DC-ASGPR)
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção está relacionada em geral ao campo
dos agentes que se ligam às células apresentadoras de antígeno por meio do receptor de asialoglicoproteína da célula dendrítica (DC-ASGPR).
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Sem limitar o escopo da invenção, seus fundamentos são
descritos em relação à apresentação de antígeno.
As células dendríticas (DC) têm uma participação fundamental no controle da interface da imunidade inata e adquirida ao fornecerem sinais solúveis e intercelulares, 15 seguido pelo reconhecimento de patógenos. Essas funções das DCs são, em grande parte, dependentes da expressão de receptores de superfície especializados, "receptores de reconhecimento-padrão" (PRRs), representados,
principalmente, por receptores toll-like (TLRs) e lectinas
2 0 do tipo C ou receptores lectina-Iike (LLRs) (1-3).
No paradigma atual, um papel importante dos TLRs é alertar as DCs para produzir interleucina 12 (IL-12) e outras citocinas inflamatórias para a iniciação de respostas imunológicas. LLRs do tipo C operam como 25 constituintes do poderoso mecanismo de captura e captação de antígeno de macrófagos e DCs (1) . Comparados com os TLRs, no entanto, os LLRs talvez tenham uma gama mais ampla de funções biológicas que incluem migrações de células (4), interações intercelulares (5) . Essas múltiplas funções dos
3 0 LLRs talvez sejam causadas pelo fato de que os LLRs, diferentemente dos TLRs, podem reconhecer tanto self quanto nonself. No entanto, a complexidade dos LLRs, incluindo a redundância de diversos LLRs expressos em células imunológicas, tem sido um dos maiores obstáculos à 5 compreensão das funções detalhadas de LLRs individuais. Além disso, os ligantes naturais para a maioria desses receptores permanecem não identificados. No entanto, evidências de estudos recentes sugerem que os LLRs, em colaboração com os TLRs, podem contribuir para a ativação 10 de células imunológicas durante infecções microbianas (6- 14) .
Valladeau e cols. (The Journal of Immunologyl 2001, 167: 5.767-5.774) descreveram um novo receptor LLR em células dendríticas humanas imaturas relacionado ao receptor de asialoglicoproteína hepático, e demonstraram que ele medeia eficientemente a endocitose. O mRNA de DC- ASGPR foi observado predominantemente em tecidos imunológicos - na DC e em granulócitos, mas não em células T, B ou NK, ou monócitos. As espécies de DC-ASGPR eram restritas à DC derivada de CD14 obtida de progenitores derivados de CD34, enquanto estavam ausentes no subconjunto derivado de CDla. Tanto a DC derivada de monócito quanto a DC amigdaliana do tipo intersticial expressavam a proteína de DC-ASGPR, enquanto as células do tipo Langerhans não o faziam. Além disso, DC-ASGPR era uma característica da imaturidade, na medida em que a expressão era perdida com a ativação de CD4 0. Concordante com a presença de motivos baseados em tirosina e dileucina no domínio intracitoplasmático, mAb contra DC-ASGPR era rapidamente internalizado pela DC a 37°C. Finalmente, o DC-ASGPR intracelular estava localizado nos endossomos iniciais, sugerindo que o receptor retorna à superfície celular após a internalização de ligante. Esses achados identificaram lectina de DC-ASGPR/macrófago humano como uma 5 característica da DC imatura, e como outra lectina importante para a função especializada de captura de Ag das células dendríticas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Embora DC-ASGPR seja conhecido por ser capaz de 10 dirigir a internalização de antígeno substituto na DC humana, a invenção utiliza novas atividades biológicas de DC-ASGPR para efetuar mudanças particularmente desejáveis no sistema imunológico, algumas no contexto de captação de antígeno (por exemplo, vacinação) , outras por meio da ação 15 única de efetores de DC-ASGPR (isoladamente ou em conjunto com outras moléculas imunes reguladoras) capazes de despertar a sinalização através desse receptor na DC, células B e monócitos. A invenção revela meios para o desenvolvimento de agentes únicos capazes de ativar células
2 0 que abrigam DC-ASGPR, bem como o efeito das mudanças
resultantes em células que recebem esses sinais em relação à ação sobre outras células no sistema imunológico. Esses efeitos (isoladamente ou em conjunto com outros sinais (ou seja, co-estimulação)) são altamente preditivos dos 25 resultados terapêuticos para certos estados de doença ou para aumento dos resultados protetores no contexto de vacinação.
A presente invenção inclui composições e métodos para o aumento da eficácia de apresentação de antígeno por uma
3 0 célula apresentadora de antígeno que expressa DC-ASGPR por isolamento e purificação de um anticorpo específico para DC-ASGPR ou fragmento deste ao qual um agente direcionado está anexado que forma um complexo anticorpo-antígeno, em que o agente é processado e apresentado, por exemplo, por 5 uma célula dendrítica, que foi colocada em contato com o complexo anticorpo-agente. Em uma modalidade, a célula apresentadora de antígeno é uma célula dendrítica e o anticorpo específico para DC-ASGPR ou fragmento deste está ligado à metade de um par de Coesina/Doquerina. 0 anticorpo 10 específico para DC-ASGPR ou fragmento deste também pode estar ligado à metade de um par de Coesina/Doquerina e um antígeno pode estar ligado à metade complementar do par de Coesina/Doquerina para formar um complexo. Exemplos não limitantes de agentes incluem um ou mais peptídeos, 15 proteínas, lipídeos, carboidratos, ácidos nucléicos e combinações destes.
0 agente pode ser uma ou mais citocinas selecionadas de interleucinas, fatores de transformação de crescimento (TGFs), fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs),
2 0 fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento epidérmico (EGFs), peptídeos ativados por tecido conjuntivo (CTAPs), fatores osteogênicos, e análogos, fragmentos e derivados biologicamente ativos desses fatores de crescimento, 25 fatores de diferenciação de células B/T, fatores de crescimento de células B/T, citocinas mitogênicas, citocinas quimiotáticas, fatores de estimulação de colônias, fatores de angiogênese, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, ILl, IL2, IL3, 1L4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, ILlO, ILll, IL12, 30 IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 etc., leptina, miostatina, proteína de estimulação de macrófagos, fator de crescimento derivado de plaquetas, TNF-α, TNF-β, NGF, CD40L, CD137L/4-IBBL, Iinfotoxina-β humana, G-CSFf M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-la, ILl-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, 5 eritropoietina, endostatina, angiostatina, VEGF, a família do supergene de fator de transformação de crescimento (TGF) inclui os fatores de transformação de crescimento beta (por exemplo, TGF-βΐ, TGF^2, TGF^3); proteínas morfogenéticas ósseas (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, 10 BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); fatores de crescimento de ligação de heparina (fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento insulina-Iike (IGF)); Inibinas (por exemplo, 15 Inibina A, Inibina B) ; fatores de diferenciação do crescimento (por exemplo, GDF-I); e Activinas (por exemplo, Activina A, Activina B, Activina AB) . Em outra modalidade, o agente compreende um antígeno que é uma proteína bacteriana, viral, fúngica, de protozoário ou de câncer.
2 0 A presente invenção também inclui composições e
métodos para o aumento da eficácia de apresentação de antígeno por células dendríticas que compreendem a ligação de um anticorpo específico para DC-ASGPR ou fragmento deste ao qual um antígeno é anexado formando um complexo 25 anticorpo-antígeno, em que o antígeno é processado e apresentado por uma célula dendrítica que foi colocada em contato com o complexo anticorpo-antígeno. Outra modalidade é o uso de anticorpos ou outras moléculas de ligação específicas dirigidas ao DC-ASGPR para a liberação de
3 0 antígenos às células apresentadoras de antígeno com a finalidade de despertar respostas imunológicas protetoras ou terapêuticas. 0 uso de reagentes de direcionamento de antígeno específicos para DC-ASGPR para vacinação através da pele; reagentes de direcionamento de antígeno 5 específicos para DC-ASGPR em associação com adjuvante co- administrado ou ligado para vacinação ou uso para fins de direcionamento de antígeno (vacinação) de antígenos específicos que podem ser expressos como proteínas de fusão recombinantes antígeno-anticorpo.
Outra modalidade inclui um método para o aumento da
eficácia de células dendríticas por isolamento de células dendríticas do paciente; exposição das células dendríticas a quantidades ativadoras de anticorpos anti-DC-ASGPR ou fragmentos destes e antígeno, para formar células dendríticas ativadas carregadas de antígeno; e reintrodução das células dendríticas ativadas carregadas de antígeno no paciente. 0 antígeno pode ser uma proteína bacteriana, viral, fúngica, de protozoário ou de câncer. A presente invenção também inclui uma imunoglobulina anti-DC-ASGPR ou porção desta que é secretada por células de mamíferos e um antígeno ligado à imunoglobulina. A imunoglobulina está ligada à metade de um domínio coesina/doquerina, ou ela também pode incluir uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina ligado a um antígeno que forma um complexo com o veículo modular de rAb, ou uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina que é uma proteína de fusão com um antígeno. 0 domínio específico do antígeno pode ser um anticorpo de comprimento total, um domínio da região variável do anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2 e um fragmento Fv, e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fe. A imunoglobulina anti-DC-ASGPR também pode estar ligada a uma toxina selecionada, em que a toxina é selecionada do grupo que consiste em um isótopo radioativo, metal, enzima, 5 botulina, toxina tetânica, ricina, toxina colérica, toxina diftérica, aflatoxinas, toxina de perfringens, micotoxinas, shigatoxina, enterotoxina estafilocócica Β, T2, seguitoxina, saxitoxina, abrina, cianoginosina, alfatoxina, tetrodotoxina, aconotoxina, veneno de cobra e veneno de 10 aranha. 0 antígeno pode ser uma proteína de fusão com a imunoglobulina ou ligado quimicamente de forma covalente ou não.
A presente invenção também inclui composições e métodos para o aumento da eficácia de células dendríticas por isolamento de células dendríticas do paciente, exposição das células dendríticas a quantidades ativadoras de anticorpos anti-DC-ASGPR ou fragmentos destes e antígeno, para formar células dendríticas ativadas carregadas de antígeno; e reintrodução das células dendríticas ativadas carregadas de antígeno no paciente. Os agentes podem ser usados para ligação ao DC-ASGPR, isoladamente ou com agentes de co-ativação, para ativar células apresentadoras de antígeno para aplicações terapêuticas ou protetoras, para ligar DC-ASGPR e/ou agentes de ativação ligados aos antígenos, isoladamente ou com agentes de co-ativação, para vacinação protetora ou terapêutica. Outro uso é o desenvolvimento de seqüências específicas da região V de anticorpo capazes de se ligar e ativar DC-ASGPR, para uso como agentes anti-DC-ASGPR 3 0 ligados a agentes tóxicos para fins terapêuticos no contexto de doenças sabidamente ou suspeitas de serem causadas por ativação inadequada de células imunológicas via DC-ASGPR e como uma vacina com um anticorpo específico para DC-ASGPR ou fragmento deste ao qual um antígeno é 5 anexado formando um complexo anticorpo-antígeno, em que o antígeno é processado e apresentado por uma célula dendrítica que foi colocada em contato com o complexo anticorpo-antígeno.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Para uma compreensão mais completa das características
e vantagens da presente invenção, será feita agora referência à descrição detalhada da invenção, juntamente com as figuras que a acompanham e nas quais:
As Figuras IA a IE demonstram que a sinalização através do receptor lectina-Iike DC-ASGPR ativa DCs, resultando em níveis aumentados de moléculas co- estimuladoras, bem como citocinas e quimiocinas. A Figura IA mostra que DCs GM/IL-4 de três dias e seis dias foram coradas com IgG de cabra anti-camundongo marcada com FITC seguida por camundongo anticorpo monoclonal anti-DC-ASGPR humano. A Figura IB mostra que DCs GM/IL-4 de seis dias foram cultivadas em placas revestidas com os mAbs anti-DC- ASGPR ou de controle (1-2 pg/ml) por 16-18 horas. As células foram coradas com anticorpos anti-CD8 6 e HLA-DR marcados com corantes fluorescentes. As barras abertas e preenchidas nos histogramas representam células ativadas com mAbs de isótipo de controle e mAbs anti-lectina, respectivamente. A Figura IC mostra DCs GM/IL-4 de seis dias que foram cultivadas em placas revestidas com os mAbs 3 0 por 12 horas, e submetidas ao isolamento de RNA e análise com "Af fymetrix Gene Chip", como descrito na seção "Métodos". Os aumentos em número de vezes da expressão gênica por mAbs anti-lectina foram comparados com os níveis de expressão gênica em DCs estimuladas com mAbs de controle. A Figura ID mostra as citocinas e quimiocinas nos sobrenadantes de cultura do experimento mostrado na Figura IB que foram medidas por Luminex. A Figura IE mostra DCs GM/IL-4 de seis dias que foram cultivadas em placas revestidas com mAbs na presença ou ausência de 5 0 ng/ml de CD4 0L solúvel, por 16-18 horas, e depois coradas com anticorpos anti-CD83. As citocinas e quimiocinas nos sobrenadantes de cultura do experimento mostrado na Figura IE foram medidas por Luminex. Os resultados mostrados são representativos de três experimentos independentes que utilizam células de doadores normais diferentes.
As Figuras 2A a 2D mostram que DC-ASGPR expresso em DCs contribui para respostas imunológicas humorais aumentadas. DCs GM/IL-4 de seis dias, 5 x 103/poço, foram incubadas em placas de 96 poços revestidas com mAb anti-DC- ASGPR ou de controle por 16-18 horas, e depois 1 x IO5 células B CD19+ autólogas coradas com CFSE foram co- cultivadas na presença de 20 unidades/ml de IL-2 e 50 nM de CpG. A Figura 2A é uma FACS de células de seis dias coradas com anticorpos marcados de forma fluorescente. As células CD3+ e 7-AAD+ foram separadas. As células CD38+ e CFSE' foram purificadas por classificador FACS e foi feita coloração com Giemsa. A Figura 2B mostra que os sobrenadantes de cultura no décimo terceiro dia foram analisados quanto à IgM, IgG e IgM total por ELISA em 3 0 sanduíche. A Figura IC mostra DCs pulsadas com multiplicidade de infecção (moi) de 5 de vírus influenza inativado por aquecimento (PR8), e cultivadas com células B. O sobrenadante da cultura foi analisado quanto às imunoglobulinas específicas para influenza (Igs) no 13° dia. A Figura ID mostra DC cultivada com mAb anti-DC-ASGPR ou de controle que foram corados quanto à expressão de APRIL na superfície celular e os sobrenadantes testados quanto à APRIL solúvel.
As Figuras 3A a 3D mostram que a expressão na superfície celular de DC-ASGPR em células B contribui para ativação de células B e produção de imunoglobulina. A Figura 3A mostra que PBMCs de capas de leucócitos foram coradas com mAb anti-CD19, anti-CD3 e anti-DC-ASGPR ou de controle. As células CD19+ e CD3+ foram separadas e os níveis de expressão das moléculas em células B CD19+ foram medidos por citometria de fluxo. A Figura 3B mostra células B CD19+ de capas de leucócitos que foram cultivadas em placas revestidas com os mAbs por 12 horas, e submetidas ao isolamento de RNA e à análise com "Affymetrix Gene Chip", como descrito na seção "Métodos". Os aumentos em número de vezes da expressão gênica por mAb anti-DC-ASGPR foram comparados com os níveis de expressão gênica em células B CD19+ estimuladas com mAb de controle. A Figura 3C mostra células B CD19+ que foram cultivadas em placas revestidas com os mAbs por 16-18 horas, e depois os sobrenadantes de cultura foram analisados quanto às citocinas e quimiocinas por Luminex. A Figura 3D mostra 1 x IO5 células B CDl9+ que foram cultivadas em placas revestidas com os mAbs por treze dias. Os níveis totais de Ig foram medidos por ELISA. Os dados são representativos de dois experimentos repetidos com o uso de células de três doadores normais diferentes.
As Figuras 4A a 4D mostram que a proliferação de células T alogênicas purificadas foi significativamente aumentada por DCs estimuladas com mAb específico para DC- 5 ASGPR.
A Figura 5 mostra que certos mAbs anti-DC-ASGPR podem ativar DC. DCs GM-CSF/IL-4 foram incubadas por 24 horas com um mAb de um painel de 12 mAbs anti-ASGPR puros. As células foram então testadas quanto ã expressão de CD8 6 da 10 superfície celular (um marcador da ativação de DC) e os sobrenadantes foram avaliados quanto às citocinas secretadas. Três mAbs (36, 38, 43) do painel de mAbs anti- ASGPR ativaram DC.
A Figura 6 mostra que diferentes antígenos podem ser 15 expressos no contexto de um rAb de DC-ASGPR. Essa proteína de rAb.Doc anti-DC-ASGPR pode simplesmente ser misturada com qualquer proteína de fusão de coesina para a montagem de um complexo não covalente estável [rAb.Doc:Coh.fusão] que funciona exatamente como uma proteína de fusão de rAb. 20 Figura 7 - DCs GM-CSF/IFNoí (5.000/poço) foram
carregadas com 10 ou 1 nM de complexos anti-DC- ASGPR.Doc:Coh.Flu Ml ou hIgG4.Doc:Coh.Flu Ml. Após 6 horas, células T CD8+ autólogas (200.000/poço) foram adicionadas nas culturas. No 8o dia, as células T CD8+ foram analisadas 25 quanto à expansão de células que abrigam TCR específico para um peptídeo imunodominante HLA-A201. As caixas internas indicam a percentagem de células T CD8+ tetrâmero- específicas.
Figura 8 demonstra a reatividade cruzada de anticorpos diferentes com ASGPR de macacos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Embora a produção e a utilização de várias modalidades da presente invenção sejam discutidas abaixo em detalhe, deve-se observar que a presente invenção fornece muitos 5 conceitos inventivos aplicáveis que podem ser utilizados em uma grande variedade de contextos específicos. As modalidades específicas aqui discutidas são meramente ilustrativas de formas específicas de produzir e utilizar a invenção e não delimitam o escopo da invenção.
Para facilitar a compreensão desta invenção, diversos
termos serão definidos abaixo. Os termos aqui definidos possuem os significados normalmente utilizados por aqueles habilitados nas áreas relevantes para a presente invenção. Termos como, por exemplo, "um", "uma", "o" e "a" não se 15 referem apenas à forma no singular, mas incluem a classe geral da qual um exemplo específico pode ser usado para ilustração. A terminologia é aqui usada para descrever modalidades específicas da invenção, mas sua utilização não delimita a invenção, exceto como estabelecido nas 20 reivindicações.
As células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígeno que têm uma participação fundamental na imunidade antígeno-específica (Mellman e Steinman 2001), (Banchereau, Briere e cols. 2000), (Cella, 25 Sallusto e cols. 1997). As DCs capturam antígenos, os processam em peptídeos e os apresentam às células T. Portanto, a liberação de antígenos diretamente à DC é uma área central para o aprimoramento de vacinas. Um exemplo desse tipo é o desenvolvimento de vacinas baseadas em 3 0 células dendríticas com o uso de carga de antígeno ex vivo de DCs autólogas que são então re-administradas aos pacientes (Banchereau, Schuler-Thurner e cols. 2001), (Steinman e Dhodapkar 2001). Outra estratégia para melhorar a eficácia da vacina é o direcionamento específico às DC de 5 antígeno conjugado aos anticorpos contra receptores de internalização DC-específicos. O potencial do
direcionamento de DC para vacinação é realçado por estudos fundamentais em camundongos. In vivo, o direcionamento com um mAb anti-LOX-I acoplado à ovalbumina (OVA) induziu uma 10 resposta protetora de células T CD8 + , por meio da apresentação cruzada de antígeno exógeno em direção à via de MHC da classe I (Delneste, Magistrelli e cols. 2002) . Além disso, OVA conjugada ao mAb anti-DEC2 05 em combinação com um estímulo de maturação de CD4 0L aumentou a 15 apresentação restrita por MHC Classe I por DCs in vivo e levou à formação durável de células T CD8+ efetoras de memória (Bonifaz, Bonnyay e cols. 2004). Ambos esses estudos mostraram um efeito de economia de dose dramático (ou seja, respostas imunológicas fortes em doses de
2 0 antígeno muito baixas) e sugeriram respostas mais amplas do
que as normalmente observadas com outros tipos de imunização com OVA. Um trabalho recente com o direcionamento de antígeno gag de HIV à DC por meio de DEC205 estendeu esses conceitos a um antígeno clinicamente 25 relevante e confirmou as tendências do direcionamento de antígeno à DC - economia de dose dramática, respostas protetoras com uma única vacinação e expansão de células T antígeno-específicas nos compartimentos CD8 e CD4 (TrumpfhelIer, Finkc e cols. 2006) .
3 0 A presente invenção permite a formação de complexos de múltiplos antígenos ou proteínas (projetados, expressos e purificados independentemente pelo mAb primário) de uma forma controlada, multivariável, com um único mAb primário recombinante. Atualmente, existem métodos para o 5 planejamento de sítios de biotinilação sítio-específicos que permitem a adição de diferentes proteínas (cada uma projetada separadamente ligada à estreptavidina) a um mAb primário. No entanto, a presente invenção permite a adição ao mAb primário de múltiplas combinações, em proporções 10 eqüimolares e localizações fixas, de proteínas projetadas separadamente.
Como aqui usado, o termo "veículo modular de rAb" é usado para descrever um sistema de anticorpo recombinante que foi projetado para permitir a adição modular controlada 15 de diversos antígenos, proteínas de ativação ou outros anticorpos a um único anticorpo monoclonal recombinante (mAb) . 0 rAb pode ser um anticorpo monoclonal feito com o uso de técnicas padronizadas de hibridoma, exibição de anticorpo recombinante, anticorpos monoclonais humanizados
2 0 e semelhantes. 0 veículo modular de rAb pode ser usado, por
exemplo, para direcionar (por meio de um anticorpo recombinante primário contra um receptor de internalização, por exemplo, um receptor de célula dendrítica humana) múltiplos antígenos e/ou antígenos e uma citocina de 25 ativação às células dendríticas (DC) . 0 veículo modular de rAb também pode ser usado para unir dois mAbs recombinantes diferentes de ponta a ponta de uma forma controlada e definida.
A porção de ligação de antígeno do "veículo modular de
3 0 rAb" pode ser um ou mais domínios variáveis, um ou mais domínios variáveis e o primeiro domínio constante, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2, e um fragmento Fv, e um fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fc ao qual as porções de ligação 5 modulares cognatas são adicionadas à seqüência de aminoácidos e/ou ligadas. O anticorpo para uso no veículo modular de rAb pode ser de qualquer isótipo ou classe, subclasse ou de qualquer fonte (animal e/ou recombinante).
Em um exemplo não limitante, o veículo modular de rAb 10 é projetado para ter um ou mais domínios modulares de proteína coesina-doquerina para a produção de complexos de proteína específicos e definidos no contexto de mAbs recombinantes geneticamente planejados. O mAb é uma porção de uma proteína de fusão que inclui um ou mais carbóxis dos 15 domínios modulares de proteína coesina-doquerina dos domínios de ligação de antígeno do mAb. Os domínios de proteína coesina-doquerina podem até mesmo ser anexados pós-tradução, por exemplo, com a utilização de vinculadores cruzados químicos e/ou pontes dissulfeto.
0 termo "antígeno", como aqui usado, refere-se a uma
molécula que pode iniciar uma resposta imunológica humoral e/ou celular em um receptor do antígeno. O antígeno pode ser usado em dois contextos diferentes com a presente invenção: como um alvo para o anticorpo ou outro domínio de 25 reconhecimento de antígeno do rAb ou como a molécula que é conduzida a e/ou para dentro de uma célula ou alvo pelo rAb como parte de um complemento da molécula de doquerina/coesina para o veículo modular de rAb. 0 antígeno é normalmente um agente que causa uma doença para a qual
3 0 uma vacinação seria um tratamento vantajoso. Quando o antígeno é apresentado era MHC7 o peptídeo freqüentemente possui um comprimento de cerca de 8 a cerca de 25 aminoácidos. Antígenos incluem qualquer tipo de molécula biológica, incluindo, por exemplo, metabólitos 5 intermediários simples, açúcares, lipídeos e hormônios, além de macromoléculas como, por exemplo, carboidratos complexos, fosfolipídeos, ácidos nucléicos e proteínas. Categorias comuns de antígenos incluem, sem limitação, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos 10 fúngicos, antígenos de protozoários e de outros parasitas, antígenos tumorais, antígenos envolvidos em doença autoimune, alergia e rejeição de enxertos, e outros antígenos diversos.
O veículo modular de rAb é capaz de conduzir qualquer número de agentes ativos, por exemplo, antibióticos, agentes antiinfecciosos, agentes antivirais, agentes antitumorais, antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflaraatórios, agentes terapêuticos para osteoporose, enzimas, citocinas, anticoagulantes, polissacarídeos, colágeno, células, e combinações de dois ou mais dos agentes ativos citados anteriormente. Exemplos de antibióticos para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, tetraciclina, aminoglicosídeos, penicilinas, cefalosporinas, sulfonamida fármacos, succinato sódico de cloranfenicol, eritromicina, vancomicina, lincomicina, clindamicina, nistatina, anfotericina B, amantidina, idoxuridina, ácido p-amino salicílico, isoniazida, rifampina, antinomicina D, mitramicina, daunomicina, adriamicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, procarbazina, imidazol carboxamida, e semelhantes.
Exemplos de agentes antitumorais para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, metotrexato, e 5 semelhantes. Exemplos de antipiréticos e analgésicos incluem aspirina, Motrint, Ibuprofeno®, naprosin, acetaminofeno, e semelhantes.
Exemplos de agentes antiinflamatórios para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, NSAIDS, aspirina, esteróides, dexametasona, hidrocortisona, prednisolona, diclofenaco Na, e semelhantes.
Exemplos de agentes terapêuticos para o tratamento de osteoporose e outros fatores que atuam sobre os ossos e o esqueleto para liberação com o uso da presente invenção 15 incluem, sem limitação, cálcio, alendronato, peptídeo ósseo GLa, hormônio da paratireóide e seus fragmentos ativos, peptideo de formação e proliferação ósseas relacionado à histona H4, e mutações, derivados e análogos destes.
Exemplos de enzimas e enzima co-fatores para liberação
2 0 com o uso da presente invenção incluem, sem limitação,
pancrease, L-asparaginase, hialuronidase, quimiotripsina, tripsina, tPA, estreptoquinase, uroquinase, pancreatina, colagenase, tripsinogênio, quimiotripsinogênio,
plasminogênio, estreptoquinase, adenil ciclase, superóxido dismutase (SOD), e semelhantes.
Exemplos de citocinas para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, interleucinas, fatores de transformação de crescimento (TGFs), fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs), fatores de crescimento
3 0 derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento epidérmico (EGFs), peptídeos ativados por tecido conjuntivo (CTAPs), fatores osteogênicos, e análogos, fragmentos e derivados biologicamente ativos desses fatores de crescimento. Citocinas podem ser fatores de diferenciação 5 de células B/T, fatores de crescimento de células B/T, citocinas mitogênicas, citocinas quimiotáticas, fatores de estimulação de colônias, fatores de angiogênese, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, ILl, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, ILlO, ILll, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 etc., 10 leptina, miostatina, proteína de estimulação de macrófagos, fator de crescimento derivado de plaquetas, TNF-α, NGF, CD40L, CD13 7L/4-1BBL, Iinf otoxina-β humana, G-CSF, M-CSF', GM-CSF, PDGF, IL-la, ILl-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, eritropoietina, endostatina, angiostatina, VEGF, ou 15 quaisquer fragmentos ou combinações destes. Outras citocinas incluem membros da família do supergene de fator de transformação de crescimento (TGF), que incluem os fatores de transformação de crescimento beta (por exemplo, TGF-βΙ, TGF^2, TGF-P3) ; proteínas morfogenéticas ósseas 20 (por exemplo, BMP-I, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP- 7, BMP-8, BMP-9); fatores de crescimento de ligação de heparina (por exemplo, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de 25 crescimento insulina-li-ke (IGF) ) ; Inibinas (por exemplo, Inibina A, Inibina B); fatores de diferenciação do crescimento (por exemplo, GDF-1); e Activinas (por exemplo, Activina A, Activina B, Activina AB).
Exemplos de fatores de crescimento para liberação com
3 0 o uso da presente invenção incluem, sem limitação, fatores de crescimento que podem ser isolados de fontes nativas ou naturais como, por exemplo, de células de mamíferos, ou que podem ser preparados sinteticamente como, por exemplo, por técnicas de DNA recombinante ou por vários processos 5 químicos. Além disso, análogos, fragmentos ou derivados desses fatores podem ser usados, desde que exibam pelo menos um pouco da atividade biológica da molécula nativa. Por exemplo, análogos podem ser preparados por expressão de genes alterados por mutagênese sítio-específica ou por 10 outras técnicas de engenharia genética.
Exemplos de anticoagulantes para liberação com o uso da presente invenção incluem, sem limitação, warfarin, heparina, Hirudina, e semelhantes. Exemplos de fatores que atuam sobre o sistema imunológico para liberação com o uso 15 da presente invenção incluem, sem limitação, fatores que controlam a inflamação e neoplasias malignas, e fatores que atacam microorganismos infecciosos como, por exemplo, peptídeos quimiotáticos e bradicininas.
Exemplos de antígenos virais incluem, sem limitação, 20 por exemplo, antígenos retrovirais, tais como antígenos retrovirais do vírus da imunodeficiência humana (HIV), tais como produtos gênicos dos genes gag, pol e env, a proteína Nef, transcriptase reversa, e outros componentes do HIV ; antígenos virais da hepatite, tais como as proteínas S, Me 25 L do vírus da hepatite Β, o antígeno pré-S do vírus da hepatite B, e outros antígenos de hepatite, por exemplo, componentes virais da hepatite A, B, e C como, por exemplo, RNA viral da hepatite C; antígenos do vírus influenza como, por exemplo, hemaglutinina e neuraminidase, e outros
3 0 componentes do vírus influenza; antígenos do vírus do sarampo como, por exemplo, a proteína de fusão do vírus do sarampo e outros componentes do vírus do sarampo; antígenos virais da rubéola como, por exemplo, as proteínas El e E2, e outros componentes do vírus da rubéola; antígenos do 5 rotavírus como, por exemplo, VP7sc e outros componentes do rotavírus; antígenos do citomegalovírus como, por exemplo, a glicoproteína B do envelope e outros componentes de antígenos do citomegalovírus; antígenos do vírus sincicial respiratório como, por exemplo, a proteína de fusão do RSV, 10 a proteína M2 e outros componentes de antígenos do vírus sincicial respiratório; antígenos do vírus do herpes simples como, por exemplo, proteínas iniciais imediatas, glicoproteína D e outros componentes de antígenos do vírus do herpes simples; antígenos do vírus varicela zoster como, 15 por exemplo, gpl, gpll e outros componentes de antígenos do vírus varicela zoster; antígenos do vírus da encefalite japonesa como, por exemplo, as proteínas E, M-E, M-E-NSl, NSl, NSl-NS2A, 80% E, e outros componentes de antígenos do vírus da encefalite japonesa; antígenos do vírus da raiva 20 como, por exemplo, glicoproteína da raiva, nucleoproteína da raiva e outros componentes de antígenos do vírus da raiva. Veja "Fundamental Virology", Segunda Edição, eds. Fields, Β. N. e Knipe, D. M. (Raven Press, Nova York, 1991) para exemplos adicionais de antígenos virais.
Os alvos antigênicos que podem ser liberados com o uso
das vacinas de rAb-DC/DC-antígeno da presente invenção incluem genes que codificam antígenos como, por exemplo, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos ou antígenos parasíticos. Vírus incluem picornavírus,
3 0 coronavírus, togavírus, flavivírus, rabdovírus, paramixovírus, ortomixovírus, buniavírus, arenavírus, reovírus, retrovírus, papilomavírus, parvovírus,
herpesvírus, poxvírus, hepadnavírus e vírus espongiforme. Outros alvos virais incluem o vírus influenza, vírus do herpes simples 1 e 2, sarampo, dengue, varíola, pólio ou HIV. Patógenos incluem tripanossomos, solitárias, ascárides, helmintos, malária. Marcadores tumorais, tais como antígeno fetal ou antígeno específico da próstata, podem ser direcionados dessa forma. Outros exemplos incluem: proteínas do env de HIV e antígeno de superfície da hepatite B. A administração de um vetor de acordo com a presente invenção para fins de vacinação necessitaria que os antígenos associados ao vetor fossem suficientemente não imunogênicos para permitir a expressão de longo prazo do transgene, para o qual uma forte resposta imunológica seria desejada. Em alguns casos, a vacinação de um indivíduo pode ser necessária apenas raramente, por exemplo, a cada ano ou a cada dois anos, e fornece proteção imunológica de longo prazo contra o agente infeccioso. Exemplos específicos de organismos, alérgenos e seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos para uso em vetores e, em última análise, como antígenos com a presente invenção, podem ser encontrados na Patente U.S. N0 6.541.011, cujas porções relevantes são aqui incorporadas por referência, em particular, as tabelas que combinam organismos e seqüências específicas que podem ser usados com a presente invenção.
Os antígenos bacterianos para uso com a vacina de rAb aqui revelada incluem, sem limitação, por exemplo, antígenos bacterianos como, por exemplo, toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina, FIM2, FIM3, adenilato ciclase e outros componentes de antígeno bacteriano de pertussis; antígenos bacterianos diftéricos como, por exemplo, toxina ou toxóide diftérico e outros componentes de antígeno bacteriano diftérico; antígenos 5 bacterianos tetânicos como, por exemplo, toxina ou toxóide tetânicos e outros componentes de antígeno bacteriano tetânico; antígenos bacterianos estreptocócicos como, por exemplo, proteínas M e outros componentes de antígeno bacteriano estreptocócico; antígenos bacterianos de bacilos 10 gram-negativos como, por exemplo, lipopolissacarídeos e outros componentes de antígenos bacterianos gram-negativos, antígenos bacterianos de Mycobacterium tuberculosis como, por exemplo, ácido micólico, proteína do choque térmico 65 (HSP65), a proteína secretada principal de 30 kDa, antígeno 15 85A e outros componentes de antígenos micobacterianos; componentes de antígenos bacterianos de Helicobacter pylori; antígenos bacterianos pneumocócicos como, por exemplo, pneumolisina, polissacarídeos capsulares pneumocócicos e outros componentes de antígenos bacterianos
2 0 pneumocócicos; antígenos bacterianos de Haemophilus influenza como, por exemplo, polissacarídeos capsulares e outros componentes de antígenos bacterianos de Haemophilus influenza; antígenos bacterianos de antraz como, por exemplo, antígeno protetor de antraz e outros componentes 25 antígenos bacterianos de antraz; antígenos bacterianos de riquétsias como, por exemplo, rompA, e outros componentes de antígenos bacterianos de riquétsias. Também são incluídos com os antígenos bacterianos aqui descritos quaisquer outros antígenos bacterianos, micobacterianos, 30 micoplasmáticos, de riquétsias ou de clamídias. Patógenos parciais ou inteiros também podem ser: Haemophilus influenza; Plasmodium falciparum; Neisseria meningitidis; Streptococcus pneumoniae; Neisseria gonorrhoeae; Salmonella sorotipo typhi; Shigella; Vibrio cholerae; febre da Dengue;
Encefalites; Encefalite Japonesa; doença de Lyme; Yersinia pestis; vírus do Nilo Ocidental; febre amarela; tularemia; hepatite (viral; bacteriana); RSV (vírus sincicial respiratório); HPIV I e HPIV 3; adenovírus; catapora; alergias e cânceres.
Os antígenos fúngicos para uso com composições e
métodos da invenção incluem, sem limitação, por exemplo, componentes de antígenos fúngicos de cândida; antígenos fúngicos de histoplasma como, por exemplo, proteína do choque térmico 60 (HSP60) e outros componentes de antígenos
fúngicos de histoplasma; antígenos fúngicos criptocócicos como, por exemplo, polissacarídeos capsulares e outros componentes de antígenos fúngicos criptocócicos; antígenos fúngicos de coccídeos como, por exemplo, antígenos da esférula e outros componentes de antígenos fúngicos de
2 0 coccídeos; e antígenos fúngicos de tinha como, por exemplo,
tricofitina e outros componentes de antígenos fúngicos de tinha.
Exemplos de antígenos de protozoários e de outros parasitas incluem, sem limitação, por exemplo, antígenos de
Plasmodium falciparum como, por exemplo, antígeno de superfícies de merozoíto, antígenos de superfície de esporozoíto, antígenos de circunsporozoíto, antígenos de superfície de gametócito/gameta, antígeno do estágio sangüíneo pf 155/RESA e outros componentes de antígenos de
3 0 plasmódios; antígenos de toxoplasma como, por exemplo, SAG- 1, p3 0 e outros componentes de antígenos de toxoplasmas; antígenos de esquistossomos como, por exemplo, glutationa- S-transferase, paramiosina e outros componentes de antígeno de esquistossomos; antígenos de Leishmania major e de 5 outras leishmânias como, por exemplo, ÇTP63, lipofosfoglicano e sua proteína associada e outros componentes de antígenos de leishmânias; e antígenos de Trypanosoma cruzi como, por exemplo, o antígeno de 75-77 kDa, o antígeno de 56 kDa e outros componentes de antígenos 10 de tripanossomos.
0 antígeno que pode ser direcionado com o uso do rAb da presente invenção geralmente será selecionado com base em diversos fatores, incluindo: probabilidade de internalização, nível de especificidade da célula 15 imunológica, tipo de célula imunológica visada, nível de maturidade e/ou ativação da célula imunológica, e semelhantes. Exemplos de marcadores da superfície celular para células dendríticas incluem, sem limitação, MHC Classe I, MHC Classe II, B7-2, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, 20 CD54, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR e/ou ASPGR, e semelhantes; embora, em alguns casos, também possuam a ausência de CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD5 6 e/ou CD57. Exemplos de marcadores da superfície celular para células apresentadoras de antígeno incluem, 25 sem limitação, MHC Classe I, MHC Classe II, CD40, CD45, B7- 1, B7-2, receptor de IFN-γ e receptor de IL-2, ICAM-I e/ou receptor Fcy. Exemplos de marcadores da superfície celular para células T incluem, sem limitação, CD3, CD4, CD8, CD14, CD2 0, CDllb, CDl6, CD4 5 e HLA-DR.
Antígenos-alvo em superfícies celulares para liberação incluem aqueles característicos de antígenos tumorais que tipicamente serão derivados da superfície celular, citoplasma, núcleo, organelas, e semelhantes, de células do tecido tumoral. Exemplos de alvos tumorais para a porção de 5 anticorpo da presente invenção incluem, sem limitação, cânceres hematológicos, tais como leucemias e Iinfomas, tumores neurológicos, tais como astrocitomas ou glioblastomas, melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer da cabeça e pescoço, tumores gastrintestinais, tais 10 como câncer gástrico ou do cólon, câncer hepático, câncer pancreático, tumores geniturinários, tais como câncer do cérvice, do útero, câncer ovariano, câncer vaginal, câncer testicular, câncer da próstata ou câncer do pênis, tumores ósseos, tumores vasculares ou cânceres dos lábios, da 15 nasofaringe, da faringe e da cavidade oral, do esôfago, do reto, da vesícula biliar, da árvore biliar, da laringe, pulmão e brônquios, da bexiga, do rim, do cérebro e de outras partes do sistema nervoso, da tireóide, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, mieloma múltiplo e leucemia.
2 0 Exemplos de antígenos que podem ser liberados,
isoladamente ou em combinação, às células imunológicas para apresentação de antígeno com o uso da presente invenção incluem proteínas tumorais, por exemplo, oncogenes mutados; proteínas virais associadas a tumores; e mucinas e 25 glicolipídeos tumorais. Os antígenos podem ser proteínas virais associadas a tumores, que seriam daquelas classes de vírus observadas acima. Certos antígenos podem ser característicos de tumores (um subconjunto sendo formado por proteínas não expressas normalmente por uma célula
3 0 precursora do tumor), ou podem ser uma proteína que é normalmente expressa em uma célula precursora do tumor, mas que possui uma mutação característica de um tumor. Outros antígenos incluem variante(s) mutante(s) da proteína normal que possuem uma atividade alterada ou uma distribuição 5 subcelular, por exemplo, mutações de genes que dão origem aos antígenos tumorais.
Exemplos não limitantes específicos de antígenos tumorais incluem: CEA, antígeno específico da próstata (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 e 12, MUC (Mucina) (por exemplo, MUC-1, MUC-2 etc.), gangliosídeos GM2 e GD2, ras, myc, tirosinase, MART (antígeno de melanoma), Pmel 17(gplOO) , seqüência V do íntron GnT-V (seqüência V do íntron de N-acetilglucoaminiltransferase V) , Ca psm da Próstata, PRAME (antígeno de melanoma) , β- catenina, MUM-I-B (produto gênico mutado ubíquo do melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) I, BAGE (antígeno de melanoma) 2-10, C-ERB2 (Her2/neu), EBNA (antígeno nuclear do vírus de Epstein-Barr) 1-6, gp75, vírus do papiloma humano (HPV) E6 e E7, p53, proteína de resistência do pulmão (LRP), Bcl-2 e Ki-67. Além disso, a molécula imunogênica pode ser um auto-antígeno envolvido na iniciação e/ou propagação de uma doença autoimune, cuja patologia é, em grande parte, causada pela atividade de anticorpos específicos para uma molécula expressa pelo órgão-alvo, tecido ou células relevantes, por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou miastenia grave (MG) . Nessas doenças, pode ser desejável direcionar uma resposta imunológica mediada por anticorpo contínua (ou seja, uma do tipo Th2) ao auto-antígeno relevante em direção a uma 3 0 resposta imunológica celular (ou seja, uma do tipo Thl). Alternativamente, pode ser desejável evitar o surgimento ou diminuir o nível de uma resposta Th2 ao auto-antígeno em um indivíduo que não possui, mas com suspeita de ser suscetível à doença autoimune relevante por indução 5 profilática de uma resposta Thl ao auto-antígeno apropriado. Auto-antígenos de interesse incluem, sem limitação: (a) com relação ao SLE, a proteína de Smith, ribonucleoproteína RNP e as proteínas SS-A e SS-B; e (b) com relação à MG, o receptor de acetilcolina. Exemplos de
outros antígenos diversos envolvidos em um ou mais tipos de resposta autoimune incluem, por exemplo, hormônios endógenos, tais como hormônio luteinizante, hormônio de estimulação folicular, testosterona, hormônio do crescimento, prolactina e outros hormônios.
Antígenos envolvidos em doenças autoimunes, alergia e
rejeição de enxertos podem ser usados nas composições e nos métodos da invenção. Por exemplo, um antígeno envolvido em uma ou mais das seguintes doenças ou distúrbios autoimunes podem ser usados na presente invenção: diabetes, diabetes
melito, artrite (incluindo artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática), esclerose múltipla, miastenia grave, lúpus eritematoso sistêmico, tireoidite autoimune, dermatite (incluindo dermatite atópica e dermatite eczematosa), psoríase,
2 5 síndrome de Sjôgren, incluindo ceratoconjuntivite seca
secundária à síndrome de Sjôgren, alopecia areata, respostas alérgicas causadas por reações à picada de artrópodes, doença de Crohn, úlcera aftosa, irite, conjuntivite, ceratoconjuntivite, colite ulcerativa, asma,
3 0 asma alérgica, lúpus eritematoso cutâneo, esclerodermia, vaginite, proctite, erupções farmacológicas, reações de reversão de lepra, eritema nodoso da lepra, uveíte autoimune, encefalomielite alérgica, encefalopatia hemorrágica necrotizante aguda, perda auditiva 5 neurossensorial idiopática bilateral progressiva, anemia aplásica, anemia pura de células vermelhas, trombocitopenia idiopática, policondrite, granulomatose de Wegener, hepatite crônica ativa, síndrome de Stevens-Johnson, espru idiopático, líquen plano, doença de Crohn, oftalmopatia de 10 Graves, sarcoidose, cirrose biliar primária, uveíte posterior e fibrose pulmonar intersticial. Exemplos de antígenos envolvidos em doenças autoimunes incluem ácido glutâmico descarboxilase 65 (GAD 65) , DNA nativo, proteína básica da mielina, proteína proteolipídica da mielina, 15 componentes do receptor de acetilcolina, tireoglobulina e o receptor do hormônio estimulante da tireóide (TSH). Exemplos de antígenos envolvidos em alergia incluem antígenos do pólen como, por exemplo, antígenos do pólen do cedro japonês, antígenos do pólen da ambrosia, antígenos do
2 0 pólen do azevém, antígenos derivados de animais, tais como antígenos de ácaros e antígenos felinos, antígenos de histocompatibilidade e penicilina e outros fármacos terapêuticos. Exemplos de antígenos envolvidos em rejeição de enxertos incluem componentes antigênicos do enxerto a
2 5 serem transplantados no receptor do enxerto como, por exemplo, componentes de enxerto cardíaco, pulmonar, hepático, pancreático, renal e neural. O antígeno pode ser um ligante peptídico alterado útil no tratamento de uma doença autoimune.
Como aqui usado, o termo "epitopo(s)" refere-se a um antígeno peptídico ou protéico que inclui uma estrutura primária, secundária ou terciária similar a um epitopo localizado dentro de qualquer um entre diversos polipeptídeos do patógeno codificados pelo DNA ou RNA do 5 patógeno. O nível de similaridade geralmente será em um grau tal que anticorpos monoclonais ou policlonais dirigidos contra esses polipeptídeos se ligarão, reagirão ou de algum outro modo reconhecerão o antígeno peptídico ou protéico. Podem ser empregados vários métodos de 10 imunoensaio em conjunto com esses anticorpos, tais como, por exemplo, Western blotting, ELISA, RIA, e semelhantes, todos os quais são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A identificação de epitopos do patógeno e/ou de seus equivalentes funcionais adequados para uso em vacinas 15 é parte da presente invenção. Uma vez isolados e identificados, pode-se obter facilmente os equivalentes funcionais. Por exemplo, pode-se empregar os métodos de Hopp, como ensinado na Patente U.S. N0 4.554.101, aqui incorporada por referência, que ensina a identificação e 20 preparação de epitopos de seqüências de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Os métodos descritos em vários outros trabalhos, e programas de computador neles baseados, também podem ser usados para identificar seqüências epitópicas centrais (veja, por exemplo, Jameson e Wolf, 25 1988; Wolf e cols., 1988; Patente U.S. N0 4.554.101). A seqüência de aminoácidos dessas "seqüências epitópicas centrais" pode então ser facilmente incorporada em peptídeos, por meio da aplicação de síntese peptídica ou por tecnologia recombinante.
3 0 A preparação de composições de vacina que incluem os ácidos nucléicos que codificam antígenos da invenção como o ingrediente ativo pode ser feita como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas à solução, ou suspensão, em um líquido antes da infecção 5 também podem ser preparadas. A preparação pode ser emulsificada, encapsulada em lipossomos. Os ingredientes imunogênicos ativos são freqüentemente misturados com veículos que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo.
0 termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-
se a um veículo que não causa uma reação alérgica ou outro efeito indesejável nos indivíduos aos quais é administrado. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, por exemplo, um ou mais de água, solução salina, solução 15 salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes, e combinações destes. Além disso, se desejado, a vacina pode conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares, tais como agentes umidificantes e emulsificantes, agentes de tamponamento do pH e/ou 20 adjuvantes que aumentam a eficácia da vacina. Exemplos de adjuvantes que podem ser eficazes incluem, sem limitação: hidróxido de alumínio, N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D- isoglutamina, MTP-PE e RIBI, que contém três componentes 25 extraídos de bactérias, monofosforil lipídeo A, trehalose dimicolato e esqueleto da parede celular (MPL + TDM + CWS) em uma emulsão 2% de esqualeno/Tween 80. Outros exemplos de adjuvantes incluem DDA (brometo de
dimetildioctadecilamônio) , adjuvantes completo e incompleto 3 0 de Freund e QuilA. Além disso, substâncias de modulação imune como, por exemplo, linfocina (por exemplo, IFN-γ, IL-
2 e IL-12) ou indutores sintéticos de IFN-γ, tais como poli I:C, podem ser usados em combinação com os adjuvantes aqui descritos.
Os produtos farmacêuticos podem incluir um
polinucleotídeo naked com uma única cópia ou com múltiplas cópias das seqüências de nucleotídeos específicas que se ligam a sítios de ligação de DNA específicos das apolipoproteínas presentes em lipoproteínas plasmáticas 10 como descrito na presente invenção. 0 polinucleotídeo pode codificar um peptídeo biologicamente ativo, RNA anti-senso ou ribozima, e será fornecido em uma forma administrável fisiologicamente aceitável. Outro produto farmacêutico que pode surgir da presente invenção pode incluir uma fração de 15 lipoproteína plasmática altamente purificada, isolada de acordo com a metodologia aqui descrita do sangue dos pacientes ou de outra fonte, e um polinucleotídeo que contém uma única cópia ou múltiplas cópias das seqüências de nucleotídeos específicas que se ligam aos sítios de
2 0 ligação de DNA específicos das apolipoproteínas presentes em lipoproteínas plasmáticas, pré-ligado à fração de lipoproteína purificada em uma forma administrável fisiologicamente aceitável.
Ainda outro produto farmacêutico pode incluir uma 25 fração de lipoproteína plasmática altamente purificada que contém fragmentos de apolipoproteína recombinante que contêm uma única cópia ou múltiplas cópias de motivos de ligação de DNA específicos, pré-ligados a um polinucleotídeo que contém uma única cópia ou múltiplas 30 cópias das seqüências de nucleotídeos específicas, em uma forma administrável fisiologicamente aceitável. Ainda outro produto farmacêutico pode incluir uma fração de lipoproteína plasmática altamente purificada que contém fragmentos de apolipoproteína recombinante que contêm uma 5 única cópia ou múltiplas cópias de motivos de ligação de DNA específicos, pré-ligados a um polinucleotídeo que contém uma única cópia ou múltiplas cópias das seqüências de nucleotídeos específicas, em uma forma administrável fisiologicamente aceitável.
A dosagem a ser administrada depende, em grande parte,
do peso corporal e da condição física do indivíduo que está sendo tratado, bem como da via de administração e da freqüência de tratamento. Uma composição farmacêutica que inclui o polinucleotídeo naked pré-ligado a uma fração de 15 lipoproteína altamente purificada pode ser administrada em quantidades que variam de I pg a 1 mg de polinucleotídeo e
1 pg a 100 mg de proteína.
A administração de um rAb e de complexos de rAb a um paciente irá seguir protocolos gerais para a administração 20 de quimioterápicos, levando-se em conta a toxicidade, se houver, do vetor. Antecipa-se que os ciclos de tratamento seriam repetidos, se necessário. Contempla-se também que várias terapias padronizadas, bem como intervenções cirúrgicas, podem ser aplicadas em combinação com a terapia 25 gênica descrita.
Quando a aplicação clínica de uma terapia gênica é contemplada, será necessário preparar o complexo como uma composição farmacêutica adequada à aplicação desejada. Geralmente isso engloba o preparo de uma composição farmacêutica que é basicamente livre de pirógenos, assim como de outras impurezas que poderiam ser danosas a seres humanos ou animais. Geralmente, também será desejável empregar sais e tampões apropriados para tornar o complexo estável e permitir a captação do complexo pelas células- 5 alvo.
As composições aquosas da presente invenção podem incluir uma quantidade eficaz do composto, dissolvida ou dispersa em um veículo ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável. Essas composições também podem ser denominadas 10 inóculos. O uso desses meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto se quaisquer meios ou agentes convencionais forem incompatíveis com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas será contemplado. Ingredientes 15 ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. As composições da presente invenção podem incluir preparações farmacêuticas clássicas. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas destes, e em óleos. Sob 20 condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microorganismos.
Estados de doença. Dependendo da doença em particular a ser tratada, a administração de composições terapêuticas 25 de acordo com a presente invenção será feita através de qualquer via comum, desde que o tecido-alvo esteja disponível através daquela via a fim de maximizar a liberação de antígeno a um local para uma resposta imunológica máxima (ou, em alguns casos, mínima). A 30 administração geralmente será por injeção ortotópica, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa. Outras áreas para liberação incluem: via oral, nasal, bucal, retal, vaginal ou tópica. A administração tópica seria particularmente vantajosa para o tratamento de 5 cânceres da pele. Tais composições normalmente seriam administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis que incluem veículos, tampões ou outros excipientes fisiologicamente aceitáveis.
As composições de vacina ou de tratamento da invenção podem ser administradas parenteralmente, por injeção, por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular. Formulações adicionais que são adequadas a outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais ou formulações adequadas à distribuição como aerossóis. No caso das formulações orais, a manipulação de subconjuntos de células T que emprega adjuvantes, envolvimento de antígeno ou a adição de citocinas individuais a várias formulações resulta em vacinas orais aprimoradas com respostas imunológicas otimizadas. Para supositórios, aglutinantes e veículos tradicionais, podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos; esses supositórios podem ser formados por misturas que contêm o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, preferivelmente l%-2%. Formulações orais incluem excipientes normalmente empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, estearato de magnésio de amido, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, e semelhantes. Essas composições assumem a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, 3 0 cápsulas, formulações ou pós de liberação sustentada e contêm 10%-95% de ingrediente ativo, preferivelmente 25- 70%.
Os ácidos nucléicos que codificam antígeno da invenção podem ser formulados nas composições de vacina ou tratamento como formas neutras ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com grupos amino livres do peptídeo) e que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético, oxálico, tartárico, maléico, e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxil livres também podem ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, e semelhantes.
As composições de vacina ou tratamento são administradas de uma forma compatível com a formulação da dosagem, e em tal quantidade que será profilática e/ou 20 terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunológico do indivíduo para sintetizar anticorpos, e o grau de proteção ou tratamento desejado. Faixas de dosagem adequadas são da ordem de 25 várias centenas de microgramas de ingrediente ativo por vacinação, com uma faixa de cerca de 0,1 mg a 1.000 mg, por exemplo, na faixa de cerca de 1 mg a 3 00 mg e, preferivelmente, na faixa de cerca de 10 mg a 50 mg. Os regimes adequados para administração inicial e injeções de
3 0 reforço também são variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial, seguida por inoculações subseqüentes ou outras administrações. As quantidades precisas de ingrediente ativo que precisam ser administradas dependem da avaliação do profissional, e podem ser específicas para 5 cada pessoa. Ficará claro para aqueles habilitados na técnica que a quantidade terapeuticamente eficaz de molécula de ácido nucléico ou de polipeptídeos de fusão desta invenção dependerá, inter alia, da posologia de administração, da dose unitária de antígeno administrada,
de se a molécula de ácido nucléico ou o polipeptídeo de fusão é administrado em combinação com outros agentes terapêuticos, do estado imunológico e da saúde do receptor, e da atividade terapêutica da molécula de ácido nucléico ou do polipeptídeo de fusão em particular.
As composições podem ser dadas em uma posologia de
dose única ou em uma posologia de doses múltiplas. Uma posologia de doses múltiplas é aquela na qual um esquema primário de vacinação pode incluir, por exemplo, 1-10 doses separadas, seguidas por outras doses dadas em intervalos de
2 0 tempo subseqüentes necessários para manter e/ou reforçar a resposta imunológica, por exemplo, em 1-4 meses para uma segunda dose e, se necessário, uma dose(s) subseqüente(s) após vários meses. Reforços periódicos em intervalos de 1-5 anos, normalmente 3 anos, são desejáveis para manter os
2 5 níveis desejáveis de imunidade protetora. A evolução da
imunização pode ser acompanhada por ensaios de proliferação in vitro de linfócitos do sangue periférico (PBLs) co- cultivados com ESAT6 ou ST-CF, e pela medida dos níveis de IFN-γ liberados pelos linfócitos sensibilizados. Os ensaios
3 0 podem ser realizados com a utilização de marcadores convencionais, tais como radionucleotídeos, enzimas, marcadores fluorescentes e semelhantes. Essas técnicas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e podem ser encontradas nas Patentes U.S. Nos 3.791.932, 4.174.384 e 5 3.949.064, cujas porções relevantes são aqui incorporadas por referência.
O veículo modular de rAb e/ou complexo conjugado veículo de rAb-(coesina/doquerina e/ou doquerina-coesina)- antígeno (vacina de rAb-DC/DC-antígeno) pode ser fornecido 10 em uma ou mais "doses unitárias", dependendo de se os vetores de ácido nucléico são usados, das proteínas purificadas finais ou da forma de vacina final usada. A dose unitária é definida como contendo uma quantidade predeterminada da composição terapêutica calculada para 15 produzir as respostas desejadas em associação com sua administração, ou seja, a via e o regime de tratamento apropriados. A quantidade a ser administrada, e a via e formulação em particular, estão dentro dos conhecimentos daqueles habilitados nas técnicas clínicas. 0 indivíduo a
2 0 ser tratado também pode ser avaliado, em particular, o
estado do sistema imunológico do indivíduo e a proteção desejada. Uma dose unitária não precisa ser administrada como uma injeção única, mas pode incluir a infusão contínua ao longo de um período de tempo definido. A dose unitária 25 da presente invenção pode convenientemente ser descrita em termos de DNA/kg (ou proteína/kg) de peso corporal, com faixas entre cerca de 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,5, 1, 10, 50, 100, 1.000 ou mais mg/DNA ou proteína/kg de peso corporal sendo administradas. Da mesma forma, a quantidade
3 0 de vacina de rAb-DC/DC-antígeno liberada pode variar de cerca de 0,2 a cerca de 8,0 mg/kg de peso corporal. Dessa forma, em modalidades particulares, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,8 mg,
1.0 mg, 1,5 mg, 2,0 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 4,0 mg, 5,0 mg, 5,5 mg, 6,0 mg, 6,5 mg, 7,0 mg e 7,5 mg da vacina podem ser
liberados a um indivíduo in vivo. A dosagem de vacina de rAb-DC/DC-antígeno a ser administrada depende, em grande parte, do peso e da condição física do indivíduo que está sendo tratado, bem como da via de administração e da freqüência de tratamento. Uma composição farmacêutica que 10 inclui um polinucleotídeo naked pré-ligado a um vetor de liberação lipossômico ou viral pode ser administrada em quantidades que variam de I pg a 1 mg de polinucleotídeo até 1 pg a 100 mg de proteína. Dessa forma, composições particulares podem incluir entre cerca de 1 pg, 5 pg, 10 15 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg ou 1.000 pg de polinucleotídeo ou proteína que esteja ligada independentemente a 1 pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg,
3.0 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1
mg, 1,5 mg, 5 mg, 10 mg, 2 0 mg, 3 0 mg, 4 0 mg, 5 0 mg, 6 0 mg, 70 mg, 8 0 mg, 90 mg ou 100 mg de vetor.
A presente invenção foi testada em um sistema celular in vitro que mede a estimulação imune de células T humanas 25 Flu-específicas por células dendríticas às quais o antígeno de Flu foi dirigido. Os resultados aqui apresentados demonstram a expansão específica dessas células antígeno- específicas em doses do antígeno que são, por elas próprias, ineficazes nesse sistema.
3 0 A presente invenção também pode ser usada para produzir um veículo modular de rAb, ou seja, por exemplo, um mAb recombinante humanizado (dirigido a um receptor de célula dendrítica humana específico) em complexo com antígenos protetores de Ricina, toxina de Antraz e 5 enterotoxina de estafilococo B. 0 mercado potencial para esse produto é a vacinação de todo o pessoal militar e a vacina armazenada mantida em reserva para ser administrada em grandes centros populacionais em resposta a qualquer ameaça biológica relacionada a esses agentes. A invenção 10 possui uma aplicação ampla para o design de vacinas em geral, para uso tanto em seres humanos quanto em animais. As indústrias de interesse incluem as indústrias farmacêuticas e de biotecnologia.
A presente invenção inclui composições e métodos, incluindo vacinas, que especificamente direcionam (liberam) antígenos às células apresentadoras de antígeno (APCs) com a finalidade de despertar respostas imunológicas potentes e amplas dirigidas contra o antígeno. Essas composições despertam respostas imunológicas protetoras ou terapêuticas contra o agente (patógeno ou câncer) do qual o antígeno foi derivado. Além disso, a invenção cria agentes que são diretamente, ou associados a outros agentes, terapêuticos por meio de sua ligação específica a um receptor denominado DC-ASGPR que é expresso em células apresentadoras de antígeno.
O novo mAb recombinante humanizado (dirigido ao receptor de célula dendrítica humana específico DC-ASGPR) é fundido por meio da cadeia pesada de anticorpo (Ab) aos antígenos sabidamente ou suspeitos de codificarem antígenos protetores. Esses incluem, como exemplos para vacinação contra vários agentes, hemaglutininas de Influenza H5N1; gag de HIV de toxinas atenuadas de Ricina, toxina do antraz e enterotoxina de estafilococo B; "strings" de peptídeos antigênicos de antígenos do melanoma etc. A presente 5 invenção pode ser usada como uma vacinação preventiva ou terapêutica para pacientes em risco ou infectados. A invenção possui uma ampla aplicação para vacinação contra muitas doenças e cânceres, para uso tanto em seres humanos quanto em animais. As indústrias que podem utilizar a 10 presente invenção incluem as indústrias farmacêuticas e de biotecnologia.
A presente invenção pode ser usada para direcionar antígenos às APC para fins de vacinação. Não se sabe qual receptor de internalização de antígeno será o mais bem 15 adequado para essa finalidade. A invenção descreve características particularmente vantajosas de DC-ASGPR para essa finalidade. Além disso, a invenção mostra que a ligação de DC-ASGPR pode ser benéfica, no sentido de ativar o sistema imunológico com benefício terapêutico 20 significativo altamente provável.
A presente invenção inclui o desenvolvimento de anticorpos monoclonais de alta afinidade contra DC-ASGPR humano. Ectodomínio do receptor.hlgG (IgGlFc humano) e proteínas de fusão de AP (fosfatase alcalina placentária 25 humana) foram produzidos para imunização de camundongos e rastreamento de mAbs, respectivamente. Uma construção de expressão para ectodomínio de hDCIR.IgG foi descrita previamente (Bates, Fournier e cols. 1999) e usava o peptídeo sinalizador de camundongo SLAM (mSLAM) para 30 dirigir a secreção (Bendtsen, Nielsen e cols. 2004) . Um É 41/80
vetor de expressão para o ectodomínio de hDCIR.AP foi gerado usando PCR para amplificar os resíduos de AP 133- 1.581 (gb IBC009647 I ) , enquanto se adiciona um sítio proximal in frame de Xho I e um códon de parada distai TGA 5 e um sítio de Not I. Esse fragmento Xho I - Not I substituiu a seqüência codificadora de IgG no vetor ectodomínio de hDCIR.IgG acima. As construções do ectodomínio de DC-ASGPR na mesma série de vetor de Ig e AP continham inserções que codificam (bp 484-1.251, 10 gi153832017) . As proteínas de fusão de DC-ASGPR foram produzidas com o uso do Sistema de Expressão FreeStyle™
2 93 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante (1 mg de DNA de plasmídeo total com 1,3 ml de reagente 293 Fectin/1 de transfecção) . Para a produção de rAb, 15 quantidades iguais de vetor que codifica a cadeia HeL foram co-transfectadas. As células transfectadas são cultivadas por 3 dias, o sobrenadante da cultura foi coletado e meios frescos adicionados com incubação continuada por dois dias. Os sobrenadantes em pool foram 20 clarificados por filtração. 0 ectodomínio do receptor.hlgG foi purificado por cromatografia por afinidade de proteína A HiTrap com eluição por 0,1 M de glicina, pH 2,7, e depois dialisado versus PBS. rAbs (anticorpos recombinantes descritos posteriormente) foram purificados similarmente, 25 por utilização de colunas HiTrap MabSelect™. Foram gerados mAbs de camundongo por tecnologia convencional de fusão de células. Resumidamente, camundongos BALB/c com 6 semanas de idade foram imunizados por via intraperitoneal com 2 0 pg de ectodomínio do receptor.proteína de fusão hlgGFc com
3 0 adjuvante Ribi, e depois com reforços com 2 0 pg de antígeno 10 dias e 15 dias mais tarde. Após 3 meses, os camundongos receberam novamente reforços três dias antes da retirada dos baços. Alternativamente, os camundongos foram injetados no coxim da pata com 1-10 pg de antígeno em adjuvante Ribi 5 a cada 3-4 dias ao longo de um período de 3 0-40 dias. Três a quatro dias após um reforço final, os linfonodos de drenagem foram coletados. As células B do baço ou células do linfonodo foram fundidas com células SP2/0-Ag 14 (Shulman, Wilde e cols. 1978) com a utilização de técnicas
convencionais. ELISA foi usada para avaliar os sobrenadantes de hibridoma contra a proteína de fusão do ectodomínio do receptor comparada com o parceiro de fusão isoladamente, ou versus o ectodomínio do receptor fundido à AP (Bates, Fournier e cols. 1999). Os poços positivos foram
então avaliados em FACS com o uso de células 293F transfectadas transitoriamente com plasmídeos de expressão que codificam cDNAs do receptor de comprimento total. Os hibridomas selecionados foram clonados por célula única e expandidos em frascos CELLine (Intergra). Os sobrenadantes
2 0 do hibridoma foram misturados com um total igual de 1,5 M
de glicina, 3 M de NaCl, PBS lx, pH 7,8, e precipitados com resina MabSelect. A resina foi lavada com tampão de ligação e eluída com 0,1 M de glicina, pH 2,7. Após neutralização com 2 M de Tris, os mAbs foram dialisados versus PBS.
Caracterização de anticorpos monoclonais anti-DC-ASGPR
purificados por ELISA direto. As afinidades relativas de vários mAbs anti-DC-ASGPR por ELISA foram determinadas (ou seja, a proteína de DC-ASGPR.Ig é imobilizada na superfície da microplaca e os anticorpos são testados em uma série de
3 0 titulações de doses quanto à sua habilidade para se ligar a DC-ASGPR.Ig (como detectado por um reagente IgG anti- camundongo.conjugado à HRP. Nesse exemplo, PAB42 e PAB44 mostram afinidade de ligação maior do que outros mAbs. Os mesmos mAbs não conseguem se ligar significativamente à Ig 5 humana ligada à superfície da microplaca. Isso mostra que os mAbs reagem à parte do ectodomínio de DC-ASGPR da proteína de fusão DC-ASGPR.Ig (dados não mostrados).
Caracterização de anticorpos monoclonais anti-DC-ASGPR purificados por ELISA indireto. A seguir, as afinidades 10 relativas de vários mAbs anti-DC-ASGPR foram determinadas por ELISA (ou seja, mAb anti-DC-ASGPR é imobilizado na superfície da microplaca e testado em uma série de titulações de doses quanto ã sua habilidade para se ligar ao reagente DC-ASGPR.AP). Verificou-se que os sobrenadantes 15 dos hibridomas listados como PAB42, PAB4 4 e PAB54 mostraram afinidade de ligação maior do que outros mAbs (dados não mostrados).
Caracterização de mAbs anti-DC-ASGPR por FACS. 0 painel de mAbs também foi testado por FACS versus células 20 293F transfectadas com plasmídeo de expressão que dirigem a síntese de DC-ASGPR da superfície celular. A intensidade de fluorescência media do sinal foi subtraída do sinal análogo versus células 293F não transfectadas. Por esse critério, os mAbs são capazes de se ligar especificamente à 25 superfície de células que abrigam DC-ASGPR. Alguns mAbs, por exemplo, 3 7A7, parecem particularmente vantajosos a esse respeito (dados não mostrados).
As Figuras IA a ID mostram que a sinalização por meio de DC-ASGPR ativa DCs. As DCs são as células imunológicas
3 0 primárias que determinam os resultados de respostas imunológicas, indução ou tolerância, dependendo de sua ativação (15). 0 papel de LLRs na ativação de DC ainda não está claro. Portanto, testamos se o desencadeamento do DC- ASGPR de LLR pode resultar na ativação das DCs. DCs GM/IL-4 cultivados in vitro tanto por três quanto por seis dias expressam LOX-1, ASGPR e CLEC-6 (Fig. IA) . As DCs de seis dias foram estimuladas com mAb específico para DC-ASGPR, e os dados na Fig. IB mostram que os sinais através de DC- ASGPR poderiam ativar DCs, resultando na expressão aumentada de CD8 6 e HLA-DR. 0 desencadeamento de DC-ASGPR em DCs também resultou na produção aumentada de IL-6, MCP- 1, IL-12p40 e IL-8 por DCs (Fig. 1C) . Outras citocinas e quimiocinas, TNFa, IP-10, MIP-la, e IL-10, também foram significativamente aumentadas (dados não mostrados) por sinalização através de DC-ASGPR, sugerindo que DC-ASGPR pode liberar sinais celulares para ativar DCs. Consistentemente, DCs estimuladas com mAb específico para DC-ASGPR expressaram níveis aumentados de múltiplos genes, incluindo moléculas co-estimuladoras, bem como quimiocina e genes relacionados à citocina (Fig. 1D) . A possível contribuição de LLRs na ativação imunológica celular mediada por TLR2 e TLR4 foi descrita previamente (13, 16) . Observamos que os sinais através de DC-ASGPR poderiam ter uma ação sinérgica com o sinal através de CD4 0 para uma ativação adicional das DCs (Fig. 1E) . Isso é importante, pois os LLRs poderiam servir como moléculas co- estimuladoras durante a ativação de DC in vivo. Considerados em conjunto, os dados na Fig. 1 provam que a sinalização através de DC-ASGPR pode ativar DCs, e que DC- ASGPR serve como uma molécula co-estimuladora para a ativação das DCs. A ligação de DC-ASGPR durante a interação CD4 0-CD4 0L resulta na produção dramaticamente aumentada de IL-12p7 0.
DCs estimuladas através de DC-ASGPR induzem respostas 5 imunológicas humorais potentes. DCs têm um papel importante nas respostas imunológicas humorais por fornecimento de sinais para respostas de células B tanto T-dependentes quanto T-independentes (19-22) e por transferência de antígenos às células B (23, 24). Além das DCs, é necessária 10 a sinalização através de TLR9 como um terceiro sinal para respostas de células B eficientes (25, 26).
Portanto, testamos o papel de DC-ASGPR em respostas imunológicas humorais mediadas por DCs na presença de ligante de TLR9, CpG. DCs GM/IL-4 de seis dias foram 15 estimuladas com mAb anti-DC-ASGPR, e depois as células B purificadas foram co-cultivadas. Como mostrado na Fig. 2A, DCs ativadas com mAb anti-DC-ASGPR resultaram em proliferação de células B (diluição de CFSE) e diferenciação de células plasmáticas (CD38+CD20~)
2 0 acentuadamente aumentadas, comparadas com DCs estimuladas
com mAb de controle. As células B CD3 8+CD20~ possuem uma morfologia típica das células plasmáticas, mas não expressam CD13 8. A maioria das células em proliferação não expressou CCR2, CCR4, CCR6 ou CCR7. As quantidades de 25 imunoglobulinas totais (Igs) produzidas foram medidas por ELISA (Fig. 2B) . Consistente com os dados na Fig. 2A, as células B cultivadas com DCs estimuladas anti-DC-ASGPR resultaram na produção significativamente aumentada de IgM, IgG e IgA totais. Além das Igs totais, também observamos
3 0 que DCs ativadas por desencadeamento de DC-ASGPR são mais potentes do que DCs estimuladas com mAb de controle para a produção de IgM, IgG e IgA específicas para o vírus influenza (Fig. 2C) por células B, sugerindo que a ativação de DC mediada por DC-ASGPR contribui para respostas 5 imunológicas humorais tanto totais quanto antígeno- específicas. Testamos o papel de DC-ASGPR em células apresentadoras de antígeno (APCs) ex vivo em respostas imunológicas humorais. Partes de APCs em PBMCs, incluindo células CD19' e CD14+, expressam DC-ASGPR (Fig. 2 10 suplementar). PBMCs de capas de leucócitos foram cultivadas nas placas revestidas com mAb anti-DC-ASGPR, e foram medidas as Igs totais e a proliferação de células B. Consistente com os dados gerados por DCs (Fig. 2A) , APCs estimulados através de DC-ASGPR resultaram em aumento da 15 proliferação de células B e da diferenciação de células plasmáticas na ausência (painéis superiores na Fig. 2d) ou presença (painéis inferiores na Fig. 2D) de ligante de TLR9. As IgM, IgG e IgA totais também estavam significativamente aumentadas quando PBMCs foram cultivadas 20 nas placas revestidas com mAb contra DC-ASGPR (Fig. 2e) . Como mostrado na Fig. I, DCs ativadas por sinalização por meio de DC-ASGPR possuem fenótipos amadurecidos e produzem grandes quantidades de citocinas inflamatórias e quimiocinas, e tanto os fenótipos amadurecidos de DC quanto 25 fatores solúveis de DCs poderiam contribuir para as respostas de células B aumentadas (Fig. 2) . No entanto, proteína estimuladora de linfócito B derivado de DC (BLyS, BAFF) e um ligante indutor de proliferação (APRIL) também são moléculas importantes pelas quais as DCs podem regular
3 0 diretamente a proliferação e função de células B humanas (27-30). Portanto, testamos se os sinais através de DC- ASGPR poderiam alterar os níveis de expressão de BLyS e APRIL. Os dados na Fig. 2d mostram que DCs estimuladas através de DC-ASGPR expressam níveis aumentados de APRIL 5 intracelular, bem como de APRIL secretada, mas não de BLyS (não mostrado). Os níveis de expressão de receptores de BLyS e APRIL em células B nas culturas mistas foram medidos, mas não houve mudanças significativas (não mostrados).
DC-ASGPR contribui para a ativação de células B e
produção de Ig. Células B CD19+ expressam DC-ASGPR (Fig. 3A). Portanto, testamos o papel de DC-ASGPR na ativação de células B. Os dados na Fig. 3B mostram que células B estimuladas através de DC-ASGPR produziram quantidades 15 significativamente maiores de quimiocinas. Além de IL-8 e MIP-Ia, também foram observados ligeiros aumentos em IL-6 e TNFa quando as células B foram estimuladas com o mAb anti- DC-ASGPR, comparado como o mAb de controle. Os Genes relacionados à ativação celular também estavam supra- 20 regulados (Fig. 3C). As células B produziram IgM, IgG e IgA quando foram estimuladas através de DC-ASGPR (Fig. 3D) , sugerindo que DC-ASGPR poderia ter uma participação importante na manutenção dos níveis normais de imunoglobulina in vivo. No entanto, a sinalização através 25 de DC-ASGPR isoladamente não induziu proliferação de células B significativa.
Papel de DC-ASGPR em respostas de células T. DCs estimuladas através de DC-ASGPR expressam níveis aumentados de moléculas co-estimuladoras e produzem quantidades
3 0 aumentadas de citocinas e quimiocinas (veja a Fig. 1), sugerindo que DC-ASGPR contribui para respostas imunológicas celulares, bem como respostas imunológicas humorais. Isso foi testado por uma reação mista de linfócitos (MLR). A proliferação de células T alogênicas 5 purificadas estava significativamente aumentada por DCs estimuladas com mAb específico para DC-ASGPR (Fig. 4A). DCs ativadas através de DC-ASGPR também poderiam sensibilizar células T CD8 Mart-l-específicas mais eficientemente do que DCs estimuladas com mAb de controle (painéis superiores na 10 Fig. 4B) . Mais importante, a sinalização através de DC- ASGPR permitiu que as DCs sensibilizassem de forma cruzada peptídeos de Mart-I para as células T CD8 (painéis inferiores na Fig. 4B) . Isso indica que DC-ASGPR tem um papel importante no aumento da função de DC, resultando em 15 uma melhor sensibilização e sensibilização cruzada de antígenos para as células T CD8. O papel de DC-ASGPR expresso na mistura de APCs em PBMCs na ativação de respostas de células T é mostrado na Fig. 4C, em que PBMCs estimuladas com mAb para DC-ASGPR resultaram em freqüência
2 0 aumentada de células T CD8 específicas para o tetrâmero de
Flu Ml, comparadas com DCs estimuladas com mAb de controle. Essa resposta de células T CD8 antígeno-específica aumentada foi apoiada pelos dados na Fig. 4D, que mostram que DCs estimuladas através de DC-ASGPR aumentam 25 significativamente a proliferação de células T CD4. Materiais e métodos.
Anticorpos e tetrâmeros - Anticorpos (Abs) para a coloração de superfície das DCs e células B, incluindo Abs de controle de isótipo, foram adquiridos de BD Biosciences
3 0 (CA) . Abs para ELISA foram adquiridos de Betil (TX) . Anti- BLyS e anti-APRIL eram de PeproTech (NJ) . Tetrâmeros, HLA- A*0201-GILGFVFTL (Flu Ml) e HLA-A*0201-ELAGIGILTV (Mart-I) foram adquiridos de Beckman Coulter (CA).
Células e culturas - Monócitos (1 x 106/ml) de doadores normais foram cultivados em meios Cellgenics (França) contendo GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (50 ng/ml) (R&D, CA) . Para DCs do 3o dia e do 6o dia, as mesmas quantidades de citocinas foram suplementadas nos meios no Io dia e 3 o dia, respectivamente. As células B foram purificadas com um kit de isolamento negativo (BD). Células T CD 4 e CD8 foram purificadas com glóbulos magnéticos revestidos com anti-CD4 ou CD8 (Milteniy, CA) . PBMCs foram isoladas de capas de leucócitos com a utilização de gradientes Percoll™ (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, GB) por centrifugação por gradiente de densidade. Para a ativação de DC, 1 x IO5 DCs foram cultivadas na placa de 96 poços revestida com mAb por 16-18 horas. mAbs (1-2 1 pg/poço) em tampão de carbonato, pH 9,4, foram incubados por pelo menos 3 horas a 3 7 °C. Os sobrenadantes da cultura foram coletados e citocinas / quimiocinas foram medidas por Luminex (Biorad, CA) . Para análise gênica, DCs foram cultivadas nas placas revestidas com mAbs por 8 horas. Em alguns experimentos, 5 0 ng/ml de CD4 0L solúvel (R&D, CA) ou 5 0 nM de CpG (InVivogen, CA) foram adicionados nas culturas. Nas co-culturas de DCs e célula B, 5 x IO3 DCs ressuspensas em RPMI 1640 com FCS 10% e antibióticos (Biosource, CA) foram inicialmente cultivadas nas placas revestidas com mAbs por pelo menos 6 horas, e depois 1 x IO5 de células B autólogas purificadas marcadas com CFSE (Molecular Probes, OR) foram adicionadas. Em alguns experimentos, DCs foram pulsadas com 5 moi (multiplicidade de infecção) de vírus influenza inativado por aquecimento (A/PR/8 H1N1) por 2 horas, e depois misturadas com células B. para as co-culturas de DCs e 5 célula T, 5 x IO3 DCs foram cultivadas com 1 x IO5 de células T CD8 autólogas purificadas ou células T alogênicas mistas. As células T alogênicas foram pulsadas com 1 pCi/poço de 3[H] -timidina pelas 18 horas finais de incubação, e depois as cpm foram medidas por um contador μ 10 (Wallac, MN) . Cinco x IO5 PBMCs /poço foram cultivadas nas placas revestidas com mAbs. A freqüência de células T CD8 específicas para Mart-I e Flu Ml foi medida por coloração das células com anti-CD8 e tetrâmeros no 10° dia e no 7o dia das culturas, respectivamente. Dez μΜ de peptídeo de 15 Mart-I (ELAGIGILTV) e 20 nM de proteína recombinante contendo peptídeos de Mart-I (veja abaixo) foram adicionados às culturas de DCs e células T CD8. Vinte nM de proteína de Flu Ml recombinante purificada (veja abaixo) foram adicionados às culturas de PBMCs.
2 0 Anticorpos monoclonais - mAbs de camundongo foram
gerados por tecnologia convencional. Resumidamente, camundongos BALB/c com seis semanas de idade foram imunizados i.p. com 20 μg de ectodomínio do receptor.proteína de fusão hlgGFc com adjuvante Ribi, e 25 depois reforços com 20 μg de antígeno dez dias e quinze dias mais tarde. Após três meses, os camundongos receberam novamente um reforço três dias antes da retirada dos baços. Alternativamente, os camundongos foram injetados no coxim da pata com 1-10 μg de antígeno em adjuvante Ribi a cada
3 0 três a quatro dias ao longo de um período de trinta a quarenta dias. Três a quatro dias após um reforço final, os linfonodos de drenagem foram coletados. As células B do baço ou células do linfonodo foram fundidas com células SP2/0-Ag 14. Os sobrenadantes do hibridoma foram avaliados 5 para analisar Abs para a proteína de fusão do ectodomínio do receptor comparada com o parceiro de fusão isoladamente, ou o ectodomínio do receptor fundido à fosfatase alcalina (44). Os poços positivos foram então avaliados em FACS com a utilização de células 293F transfectadas transitoriamente 10 com plasmídeos de expressão que codificam cDNAs do receptor de comprimento total. Os hibridomas selecionados foram clonados por célula única e expandidos em frascos CELLine (Integra, CA) . Os sobrenadantes do hibridoma foram misturados com um total igual de 1,5 M de glicina, 3 M de 15 NaCl, PBS lx, pH 7,8, e precipitados com resina MabSelect. A resina foi lavada com tampão de ligação e eluída com 0,1 M de glicina, pH 2,7. Após neutralização com 2 M de Tris, os mAbs foram dialisados versus PBS.
ELISA - ELISA em sanduíche foi realizada para medir 20 IgM, IgG e IgA totais, bem como imunoglobulinas flu- específicas (Igs). Soro humano-padrão (Betil) contendo quantidades conhecidas de Igs e soro AB humano foi usado como padrão para Igs totais e Igs flu-específicas, respectivamente. As titulações de Ab Flu-específico, em 25 unidades, nas amostras foram definidas como o fator de diluição de soro AB que mostra uma densidade óptica idêntica. As quantidades de BAFF e BLyS foram medidas por kits de ELISA (Bender MedSystem, CA).
Purificação de RNA e análise gênica - 0 RNA total foi
3 0 extraído com colunas RNeasy (Qiagen) e analisado com o Bioanalisador 2100 (Agilent) . Os alvos de cRNA marcado com biotina foram preparados com o uso do kit de marcação "Illumina totalprep" (Ambion) e hibridizados para os "Sentrix Human6 BeadChips" (transcritos de 46 K). Esses 5 microarranjos consistem em sondas de oligonucleotídeo de 5 Omer anexados a glóbulos de 31 μιη que são alojados em micropoços entalhados na superfície de um wafer de silício. Após coloração com Estreptavidina-Cy3, é feita uma imagem da superfície do arranjo com o uso de um scanner de 10 resolução submícron fabricado por Illumina (Beadstation 5 0OX) . Um programa de computador de análise da expressão gênica, GeneSpring, Versão 7.1 (Agilent), foi utilizado para efetuar a análise de dados.
Expressão e purificação de proteínas de Flu Ml e MART- 1 recombinantes - PCR foi usada para amplificar o quadro de leitura aberta (ORF) do gene de Ml de Influenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (HlNl), incorporando o sítio de Nhe I distai ao códon iniciador e um sítio de Not I distai ao códon de parada. 0 fragmento digerido foi clonado em pET- 28b(+) (Novagen), colocando o ORF de MI in frame com um tag His6, codificando, dessa forma, a proteína His.Flu Ml. Um derivado de pET28b (+) que codifica um domínio de coesina do terminal N de 169 resíduos de C. thermocellum (não publicado) inserido entre os sítios de Nco I e Nhe I que expressavam Coh.His. Para expressão de Coesina-Flex-hMART- 1-Peptídeo A-His, a seqüência
GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGA CCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCC TGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATAT
3 0 CCATCACACTGGCGGCCG (SEQ ID N0 3) (que codifica DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHW RP (SEQ ID N0 4)- os resíduos sombreados são o peptídeo imunodominante HLA-A2-restrito e os resíduos sublinhados que circundam o peptídeo são de MART-1) foi inserida entre os sítios de Nhe I e Xho I do vetor acima. As proteínas foram expressas em E. coli cepa BL21 (DE3) (Novagen) ou T7 Express (NEB), desenvolvida em LB a 37°C com seleção para resistência à canamicina (40 μg/ml) e agitação a 200 rodadas/min até o crescimento de fase mid-log, quando 120 mg/l de IPTG foram adicionados. Após três horas, as células foram coletadas por centrifugação e armazenadas a -80°C. Células de E. coli de cada litro de fermentação foram ressuspensas em 30 ml de 50 mM de Tris gelado, I mM de EDTA pH 8,0 (tampão B) com 0,1 ml de Coquetel de inibidor de protease II (Calbiochem, CA) . As células foram sonificadas no gelo 2x por 5 min no ajuste 18 ("Fisher Sonic Dismembrator 60") com um período de repouso de 5 min e depois centrifugadas a 17.000 r.p.m. (Sorvall SA-600) por min a 4°C. Para a purificação de His.Flu Ml, a fração do sobrenadante do lisado celular de 50 ml foi passada através de glóbulos de Q Sefarose de 5 ml e 6,25 ml de Tris 160 mM, imidazol 40 mM, NaCl 4 M, pH 7,9, foram adicionados ao fluxo de Q Sefarose. Essa foi carregada a 4 ml/min sobre uma coluna HP quelante HiTrap de 5 ml carregada com Ni++' A proteína ligada à coluna foi lavada com NaPO4 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7,6 (tampão D), seguida por outra lavagem com H3COONa 100 mM, pH 4,0. A proteína ligada foi eluída com H3COONa 100 mM, pH 4,0. As frações de pico foram reunidas em pool e carregadas a 4 ml/min sobre uma coluna HiTrap S de 5 ml equilibrada com H3COONa 100 mM pH 5,5, e lavada com o tampão de equilíbrio, seguido por eluição com um gradiente de NaCl 0 - I M em NaPO4 50 mM, pH 5,5. As frações de pico que eluem em cerca de 5 00 mM de NaCl foram reunidas em pool. Para a purificação de Coh.Flu Ml.His, células de 2 litros de cultura foram lisadas como acima. Após centrifugação, 2,5 ml de Triton X114 foram adicionados ao sobrenadante com incubação no gelo por 5 min. Após incubação adicional a 250C por 5 min, o sobrenadante foi separado do Triton X114 após centrifugação a 25°C. A extração foi repetida e o sobrenadante foi passado através de 5 ml de glóbulos de Q Sefarose, e 6,25 ml Tris 160 mM, imidazol 40 mM, NaCl 4 M, pH 7,9 foram adicionados ao fluxo de Q Sefarose. A proteína foi então purificada por cromatografia quelante de Ni++, como descrito acima, e eluída com imidazol 0-500 mM em tampão D.
Somente mAbs anti-DC-ASGPR específicos possuem propriedades de ativação de DC - A invenção revela que a ativação de DC não é uma propriedade geral de anticorpos anti-DC-ASGPR, e somente certos mAbs anti-DC-ASGPR possuem 20 essa função. A Figura 5 mostra que apenas certos mAbs ativam DCS através do DC-ASGPR, o que deve ser caracterizado por avaliação contra DCs reais.
Seqüências específicas que correspondem às regiões variáveis L e H de mAbs anti-DC-ASGPR - A invenção engloba 25 seqüências de aminoácidos específicas mostradas abaixo que correspondem aos anticorpos monoclonais anti-DC-ASGPR que são componentes desejáveis (no contexto, por exemplo, de anticorpos recombinantes humanizados) de produtos terapêuticos ou protetores. A seguir, serão apresentadas
3 0 seqüências desse tipo no contexto de anticorpos recombinantes quiméricos da região V de camundongo - região C humana.
[mAnti-ASGPR 49C11 7H-LV-hIgG4H-C] é DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTN 5 YNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASWGQGTLVTVSAA KTTGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID N°: 5). A seqüência acima é uma quimera entre a região V da cadeia H do mAb 49C11 (mostrado em amarelo) e a região C de hIgG4. [mAnti-ASGPR_49Cll_7K-LV-hIgGK-C] é a quimera da cadeia L
correspondente -
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSHMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSRLASGVPA RFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSHPWSFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N°: 6).
[mAnti-ASGPR_4G2.2_Hv-V-hIgG4H-C] é
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQVPGKGLRWMGWMDTFTGEPT
YADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINSLKNEDTATYFCARGGILRLNYFDYWGQGTTLTV
SSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEG
2 5 GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
FNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID N0: 7).
[mAnti-ASGPR_4G2.2_Kv-V-hIgGK-C] é
3 0 DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNRLGWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVP SRFSGSGSGKDYALSITSLQTEDLATYYCQQCWTS PYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0: 8). [mAnti-ASGPR_5F10H-LV-hIgG4H-C] é EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNYGDTF YNQKFEGKATLTVDKSSRTAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDVWGAGTTVTVSSA KTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLLSLGKAS (SEQ ID N0: 9).
[mAnti-ASGPR_5F10K-LV-hIgGK-C] é
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVP DRFTGSGSGTDFTLTINNVQSEDLADYFCQQYSSNPYMFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0: 10).
[mAnti-ASGPRIHllH-V-hIgG4H-C] é QLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVRQSHGKSLEWIGGINPINGGPTYN 20 QKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWDYGSRDVMDYWGQGTSVTVSS AKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE
2 5 EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID N0: 11).
[mAnti-ASGPRIHllK-LV-hIgGK-C] é NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQRPEQSPKLLIYGASNRYTGVP DRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQTYSYIFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIF
3 0 PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKS FNRGEC (SEQ ID N0: 12). A invenção contempla que essas seqüências da região V e seqüências relacionadas modificadas por aqueles habilitados na técnica para, por exemplo, aumentar a afinidade por DC- 5 ASGPR e/ou integradas em seqüências da região estrutural da região V humana, sejam projetadas em vetores de expressão para dirigir a expressão de formas de proteína que possam se ligar ao DC-ASGPR em células apresentadoras de antígeno.
Proteínas de fusão recombinantes criadas geneticamente 10 de anticorpo recombinante anti-DC-ASGPR - antígeno (rAb.antígeno) são protótipos de vacinas eficazes in vitro - Podem ser construídos vetores de expressão com diversas seqüências codificadoras de proteínas, por exemplo, fundidas in frame à seqüência codificadora da cadeia H. Por 15 exemplo, antígenos como, por exemplo, HA5 de Influenza, Ml de Influenza, gag de HIV, ou peptídeos imunodominantes de antígenos de câncer ou citocinas, podem ser expressos subseqüentemente como proteínas de fusão rAb.antígeno ou rAb.citocina, o que, no contexto desta invenção, pode ter 20 uma utilidade decorrente da utilização da seqüência da região V anti-DC-ASGPR para levar o antígeno ou citocina (ou toxina) diretamente à superfície da célula apresentadora de antígeno que abriga DC-ASGPR. Isso permite a internalização, por exemplo, de antígeno - algumas vezes
2 5 associado à ativação do receptor e assegurando a iniciação de ação terapêutica ou protetora (por exemplo, por meio da iniciação de uma resposta imunológica potente, ou por meio da morte da célula-alvo). Um protótipo de vacina exemplar baseado nesse conceito poderia usar um vetor de cadeia H 30 como, por exemplo, [mAnti-ASGPR_5F10H-LV-hIgG4H-C-Flex-F luHA5-l-6xHis] OU
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNYGDTF YNQKFEGKATLTVDKS SRTAYMQLN S LTS EPSAVYY CGRGDYGYFDVWGAGTTVTVS SA KTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
5 GLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTDQICIGYHANNS 10 TEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFI NVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLG VSSACPYQGKSSFFKNWWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTK LYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFI APEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVK 15 SNRLVLAHHHHHH (SEQ ID N°: 13). A seqüência acima corresponde à cadeia H quimérica mostrada já fundida por meio de uma seqüência vinculadora flexível (mostrada sublinhada) ao domínio HA-I de HA5 de Flu aviária (mostrada em cinza). Essa pode ser co-expressa com a seqüência 20 quimérica da cadeia L correspondente já mostrada acima. Similarmente, a seqüência [mAnti-ASGPR 49Cll_7H-LV-hIgG4H- C-Doquerina]
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTN YNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASWGQGTLVTVSAA 25 KTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR
I-”---:-“Ί
3 0 WQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLS LS LGKASNS PQNEVLYGDVNDDGKVNS TDLTLL ί-----:--:---Ί
KRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPID (SEQ ID NO. : 14) pode ser usada para expressar, por meio da co- transfecção da seqüência da cadeia L correspondente já mostrada acima, uma proteína de fusão rAb.Doquerina.
5 A Figura 6 mostra que diferentes antígenos podem ser
expressos no contexto de um rAb de DC-ASGPR. Essa proteína rAb anti-DC-ASGPR.Doc pode ser simplesmente misturada com qualquer proteína de fusão de coesina para montar um complexo estável não covalente [rAb.Doc:Coh.fusão] que funciona exatamente como um rAb.proteína de fusão. A Figura
6 mostra que esse complexo [rAb.Doc:Coh.fusão] pode concentrar antígeno na superfície de células que expressam DC-ASGPR. A figura também mostra que complexos anti-DC- ASGPR . Doc: Coh. Flu Ml liberam Ml de Flu na superfície de 15 células 293F transf ectadas com cDNA de DC-ASGPR. Um pg/ml (painel da direita) de rAb anti-DC-ASGPR.Doc (mostrado em verde) ou rAb hIgG4.Doc de controle (mostrado em azul) foi incubado com Coh.Flu Ml biotinilado (2 μ g/ml) por 1 hora em temperatura ambiente. Células 293F transfectadas foram
2 0 adicionadas, e a incubação continuou por 2 0 min no gelo. As células foram então lavadas e coradas com Estreptavidina marcada com PE. As células foram então analisadas quanto à fluorescência de PE.
RAb anti-DC-ASGPR em complexo com Ml de Flu por meio 25 da interação DoquerinarCoesina direciona o antígeno às DCs humanas e resulta na expansão de células T CD8+ Ml de Flu- específicas - a utilidade potencial de rAbs anti-DC-ASGPR como dispositivos para liberar antígenos a, por exemplo, DCs, é mostrada na figura abaixo. A Figura 7 mostra que a 30 expansão dramática de células CD8+ Ml de Flu-específicas é altamente preditiva da potência de um agente desse tipo como uma vacina destinada a despertar respostas protetoras imunológicas contra Ml de Flu.
A Figura 8 demonstra a reatividade cruzada dos 5 anticorpos diferentes com ASGPR de macaco. Para pIRES_ ASGPR-mon (macaco) foi clonado pela inserção do produto PCR em locais NheI-NotI do vetor do pIRES. A seqüência do produto final é baseada no clone 5S10. A maioria dos outros clone são tanto similares a este com uma diferença aa ou 10 idênticos a este. Entretanto, um clone, 5S1, tem um deleção de A perto da extremidade 3, o que gera um término encurtado e diferente de C e talvez use como uma segunda variante. Para clonar o ASGPR do macaco, os seguintes oligos foram usados: DC-ASGPR_MoN:
gaa11 cgc tage CACCATGACATATGAAAACTTCCAAGACTTGGAGAGTGAGGAGAAAG TCCAAGGGG (SEQ ID N°: 15); e DC-ASGPR_Mo: CGAATTCGCGGCCGCTCAGTGACTCTCCTGGCTGGCCTGGGTCAGACCAGCCTCGCAGA CCC (SEQ ID N°: 16), que é um complemente reverso de GGGTCTGCGAGGCTGGTCTGACCCAGGCCAGCCAGGAGAGTCACTGAGCGGCCGCGAAT 20 TCG (SEQ ID N°: 17). Comparações das seqüências indicam que as regiões prováveis de sobreposição e, por conseguinte, de reatividade cruzada, como é conhecido por aqueles versados na técnica.
A tabela a seguir demonstra a ligação de DC-ASGPR 334998 200μg/ml 12.05.07 cfg#558 anti-Humano IgG PE
Avg StDev SEM w/o w/o w/o N0 de Max & Max & Max & glicano Mome de Glicano Min Min Min %CV 82 GalNAcal- 3(Fueal-2)Galpl-4GlcNAep-Sp8 52930 10265 5132 19 210 Neu5Aca2-3 (GalNAcpi-4 ) Galpl-4GleNAep-Sp8 49937 4969 2484 10 86 GalNAeal-3Galp-Sp8 49067 4672 2336 10 89 GalNAepi-3(Fueal-2)Gaip-Sp8 47375 5453 2726 12 84 GalNAcal-3(Fueal-2)Gaip-Sp8 46555 6618 3309 14 209 Neu5Aca2-3(GalNAepi-4)Gaipi-4GleNAeP-SpO 46169 2121 1060 5 175 GlcNAcpi-6GalNAca-Sp8 44809 1939 969 4 301 GalNAeal- 3(Fueal-2)Gaip-Spl8 44147 6003 3002 14 211 Neu5Aca2-3(GalNAcpi-4)Gaipi-4Glep-Sp0 43603 3517 1759 8 10 a-GalNAe-Sp8 43514 2476 1238 6 128 Gaipi-3GalNAepl- 4(Neu5Aea2-3)Galpl-4Glep- 43152 13339 6669 31 SpO 151 Gaipi-4GleNAepi-6GaINAea-Sp8 42871 2466 1233 6 92 GalNAepl-4GleNAcp-Sp0 42845 3394 1697 8 93 GalNAepi-4GleNAcp-Sp8 41764 7340 3670 18 87 GalNAeal-4(Fueal-2)Gaipi-4GlcNAep-Sp8 41584 2925 1462 7 79 GalNAeal- 3(Fueal-2)Galpl-3GleNAcp-SpO 41406 14134 7067 34 20 P-GalNAc-Sp8 40803 2388 1194 6 206 Neu5Aea2-8Neu5Aea2- 3(GalNAepl- 4)Galp1- 38720 2736 1368 7 4Glcp-SpO 242 Neu5Aea2-6GalNAea-Sp8 37500 1934 967 5 91 GalNAepi-4(Fucal-3)GleNAep-SpO 37286 5046 2523 14 204 Neu5Aca2-8Neu5Aea2-8Neu5Aca2- 3(GalNAepi- 37237 995 497 3 4)Gaipi-4Glcp-SpO 203 NeuAea2-8NeuAea2-8NeuAca2-8NeuAea2- 36746 2399 1200 7 3(GalNAcpi- 4)Gaipi-4Glep-SpO 243 Neu5Aea2-6GalNAcpl-4GleNAep-SpO 36375 1661 830 5 59 Fucal-2Gaipi-3GalNAcpi- 4(Neu5Aea2- 35701 6903 3452 19 3)Gaipi-4Glep-SpO 90 GalNAcpi-3Galal-4Gaipi-4GleNAeP-SpO 34350 760 380 2 83 GalNAcal-3(Fucal-2)Galpl-4Glcp-Sp0 28846 9844 4922 34 302 GalNAcpl-3GalP-Sp8 28745 15727 7864 55 300 GalNAca-Spl5 18125 18847 9424 104 127 Gaipi-3GalNAcpi-3GaIal-4Gaipi-4Glcp-SpO 17999 9798 4899 54 85 GalNAeal-3GalNAep-Sp8 12643 10843 5422 86 173 GlcNAcpl-4GlcNAcpl-4GlcNAcp-Sp8 8673 940 470 11 81 GalNAcal- 3(Fueal-2)Gaipi-4GlcNAcp-SpO 7672 12937 6469 169 30 [30S03]Gaipi-4(60S03)GlCP-Sp8 7394 292 146 4 120 Galpl-3(Galpl-4GlcNAcpi- 6)GalNAea-Sp8 5664 1311 655 23 80 GalNAcal- 3(Fueal-2)Gaipi-4(Fueal- 5444 907 454 17 3)GlcNAcp-SpO 147 Gaipi-4GlcNAcpi-3Galpl-4GlcNAcp-SpO 4927 410 205 8 29 [30S03]Galpl-4(60S03)Glcp-SpO 4871 908 454 19 101 Galal-3GalNAea-Sp8 4815 3163 1581 66 214 Neu5Aea2-3GalNAca-Sp8 4109 569 284 14 287 [30S03] [40S03]Galpl-4GlcNacp-SpSpO 3959 1646 823 42 40 [40S03]Gaipi-4GleNAeP-Sp8 3848 673 337 17 45 [60S03]Gaipi-4 [60S03]Glep-Sp8 3790 993 497 26 166 GleNAepi-3Gaipi-4GlcNAcpi-3Galpl- 3720 435 218 12 4GleNAep-SpO 227 Neu5Aea2-3Gaipi-4[60S03]GlcNAcp-Sp8 3576 793 397 22 218 NeuAea2-3Gaipi-3(Fueal-4)GlcNAcpi-3Gaipi- 3360 104 52 3 4(Fueal-3)GleNAeP SpO 240 Neu5Aea2-3Galpl-4Glep-Sp8 3313 976 488 29 149 Gaipi-4GlcNAcpi-3Gaipi-4Glep-Sp8 3233 263 132 8 244 Neu5Aca2-6Gaipi-4[60S03]GlcNAep-Sp8 3195 757 379 24 270 Fueal-2Gaipi-4 [60S03]GleNAe-Sp8 3161 2563 1282 81 42 [60S03]Gaipi-4Glcp-SpO 3084 529 264 17 271 Fucoíl-2 [60S03] Gaipi-4 [60S03] Glc-SpO 3063 377 188 12 172 (GlcNAcpi- 4)5p-Sp8 3032 1058 529 35 47 [60S03]GlcNAcp-Sp8 3008 159 80 5 143 Neu5Aea2-3Galpl-4GleNAepi-2Manal- 3008 309 155 10 3(Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNAcpi-2Manal- 6)Manpl-4GlcNAcpi-4GlcNAcp-Spl2 265 [30S03]Gaipi-4(Pucal-3)(60S03)Glc-SpO 2995 1841 921 61 139 Gaipi-4[60S03]Glcp-SpO 2988 1070 535 36 27 [30S03] [60S03]Gaipi-4GlcNAcp-SpO 2930 317 158 11 273 Fucal-2-Galpl-4 [60S03]Glc-SpO 2919 495 247 17 319 Neu5Aca2-6Galpl-4GlcNAcpi-2Manal-3(Galpl- 2730 993 497 36 4GleNAepi-2Manal-6)Manpi-4GleNAepl- 4GleNAcP-Spl2 35 [30S03]Gaipi-4[60S03]GleNAep-Sp8 2722 516 258 19 28 [30S03]Gaipi-4Glep-Sp8 2674 197 98 7 38 [30S03]Galp-Sp8 2652 1680 840 63 253 Neu5Aea2-8Neu5Aea2-3Gaipi-4Glep-Sp0 2631 1136 568 43 289 6-H2PO3Glep-Spl0 2611 674 337 26 26 [30S03][60S03]Gaipi-4[60S03]GleNAcp-SpO 2550 153 76 6 266 [30S03]Gaipi-4(Fueal-3)Gle-SpO 2529 444 222 18 54 Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAcpi-2Manal- 2476 300 150 12 3(Neu5Aca2-6Gaipi-4GleNAepi-2Manal- 6)Manpi-4GlcNAepi-4GleNAcp-Sp8 303 GleApi-3GlcNAep-Sp8 2463 130 65 5 32 [30S03]Galpl-3GalNAea-Sp8 2461 622 311 25 53 Neu5Aea2-6Galpl- 4GleNAeP1-2Manal- 2455 283 142 12 3(Neu5Aca2-6Gaipi-4GleNAeP1-2Manal- 6)Manpi-4GleNAepi-4GleNAep-Spl3 181 Glcpi-6Glcp-Sp8 2455 154 77 6 267 [30S03]Gaipi-4 [Fucal-3] [60S03]GlcNAc-Sp8 2447 1065 532 44 293 Galpl-3(Neu5Aca2-3Gaipi-4(Fucal- 2359 648 324 27 3)GlcNAcpi- 6)GalNAc-Spl4 202 Neu5Aca2-3Gaipi-3GalNAca-Sp8 2349 928 464 40 163 GlcNAcpl-3Gaipi-3GalNAca-Sp8 2347 375 188 16 I Neu5Aca2-8Neu5Aca-Sp8 2339 1539 769 66 31 [30S03]Galpl-3(Fucal- 4)GlcNAcP~Sp8 2332 319 160 14 230 Neu5Aca2-3Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcp-SpO 2306 164 82 7 286 [30S03]Gaipi-4[60S03]GlcNAcp-SpO 2290 472 236 21 318 Neu5Aca2-3Gaipi-4GleNAcpi-2Manal- 2262 246 123 11 3(Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAcpi-2Manal- 6)Manpi-4GlcNAcpl-4GlcNAcp-Spl2 199 Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAcpi-2Manal- 2217 138 69 6 3(Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNAcpi-2Manal- 6)Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcp-Spl2 39 [40S03] [60S03]Gaipi-4GlcNAcp-SpO 2215 619 310 28 77 Fucal-4GlcNAcp-Sp8 2207 83 42 4 285 Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNAcpl-3Gaipi- 2193 1679 839 77 3GlcNAcp-SpO 262 Neu5Gca2-6GalNAca-SpO 2192 734 367 33 216 Neu5Aca2-3Gaipi-3(60S03)GlcNAc-Sp8 2163 1062 531 49 43 [60S03]Galpl-4Glcp-Sp8 2149 700 350 33 297 Galpl-4GlcNAcpi- 3(GlcNAcpi- 6)Gaipi- 2141 983 491 46 4GlcNAc-SpO 224 NeuAca2-3Gaipi-3GlcNAcpi-3Gaipi-4GlcNAcp- 2133 1208 604 57 SpO 3 Neu5Aca2-8Neu5Aca2-8Neu5Acp-Sp8 2117 611 306 29 171 (GlcNAcpi-4)6p-Sp8 2112 302 151 14 316 Neu5Aca2-3Galpi-3(Neu5Aca2- 6)GalNAc-Spl4 2105 1171 585 56 15 a-Neu5Ae-Spll 2099 250 125 12 52 Galpl-4GlcNAepl-2Manal- 3(Gaipi-4GlcNAcpi- 2092 429 215 21 2Manal-6)Manpl-4GlcNAcpl-4GlcNAcp-Spl3 268 [30S03]Gaipi-4[Fucal-3]GlcNAc-SpO 2085 955 477 46 313 Manal-2Manal-2Manal- 3(Manai-2Manal- 2020 812 406 40 6(Manal-3)Manal-6)Mana-Sp9 225 Neu5Aca2-3Gaipi-3GlcNAcp-SpO 2019 1052 526 52 36 [30S03]Gaipi-4GlcNAcp-SpO 2012 389 194 19 263 Neu5Gca2-6Gaipi- 4GlcNAcP-SpO 1999 664 332 33 141 Gaipi-4GaINAcal- 3(Fueal-2)Galpl-4GlcNAcp- 1968 772 386 39 Sp 8 274 Gaipi-3(Fucal-4)GlcNAcpl-3Gaipi-3(Fucal- 1961 78 39 4 4)GlcNAcp-SpO 275 Gaipi-3-(Gaipi-4GlcNacpi-6)GalNAe-Spl4 1953 409 205 21 7 a-D-Gal-Sp8 1925 636 318 33 41 6-H2P03Mana-Sp8 1919 223 111 12 247 Neu5Aea2-6Gaipi-4GlcNAcpl-3Gaipi-4(Fucal- 1914 169 85 9 3)GlcNAcpi-3Galpl-4(Fucal- 3)GlcNAcp-SpO 311 Manal-6Manp-SplO 1906 522 261 27 205 Neu5Aea2-8Neu5Aca2-8Neu5Aca2-3GalP1- 1902 222 111 12 4Glcp-SpO 280 Gaipi-4[Fucal-3] [60S03]GlcNAc-SpO 1881 982 491 52 152 Gaipi-4GleNAcp-SpO 1868 924 462 49 113 Galal-6Glcp-Sp8 1864 321 161 17 115 Gaipi-3(Fucal- 4)GlcNAcpi-3Gaipi- 4(Fucal- 1855 338 169 18 3)GlcNAcp-SpO 251 Neu5Aca2-6Gaip-Sp8 1842 316 158 17 116 Gaipi-3(Fucal-4)GlcNAcpi-3Gaipi-4GleNAcp- 1836 798 399 43 SpO 194 Manal-2Manal-2Manal-3(Manai-2Manal- 1829 176 88 10 3(Manai-2Manal-6)Manal-6)Manpi-4GlcNAcpl- 4GlcNAcp-Spl2 33 [30S03]Gaipi-3GlcNAcp-Sp8 1812 889 445 49 272 Fucal-2-(60S03)-Gaipi-4Glc-SpO 1805 86 43 5 207 Neu5Aca2-8Neu5Aca2-8Neu5Aca-Sp8 1804 454 227 25 74 Fucal-2Gaip-Sp8 1796 648 324 36 213 Neu5Aca2-3(Neu5Aca2-6)GalNAca-Sp8 1768 312 156 18 234 Neu5Aca2-3Galpl-4GlcNAepl-3Gaipi-4(Fucal- 1767 178 89 10 3)GlcNAc-SpO 50 Manal-3 (Manai-6)Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcP - 1759 553 277 31 Spl3 111 Galal-4Gaipi-4Glep-SpO 1740 635 318 36 291 Galal-3GaINAea-Spl6 1738 1090 545 63 296 Gal pi-4GlcNAepi- 3(Gaipi-4GlcNAepi- 1726 850 425 49 6)Gaipi-4GlcNAc-SpO 154 Galpl-4Glep-SpO 1725 457 229 27 56 Fueal-2Gaipi-3GalNAepl-3Galal-4Gaipi- 1719 384 192 22 4Glep-Sp9 66 Fueal-2Gaipi-4(Fucal-3)GleNAepi-3Gaipi- 1703 224 112 13 4(Fucal-3)GleNAepi-3Gaipi-4(Fueal- 3)GlcNAcp-SpO 299 Galpl-4GlcNAcpl-6Gaipi-4GleNAcp-SpO 1658 820 410 49 44 [60S03]Gaipi-4GlcNAcp-Sp8 1632 242 121 15 237 Neu5Aca2-3Galpl-4GlcNAcp-Sp8 1632 1049 524 64 233 Neu5Aca2-3Galpl-4(Fucal-3)GlcNAcpi- 1620 862 431 53 3Gaipi-4GlcNAcp-Sp8 192 Manal-6 (Manai-2Manal-3)Manal- 1608 903 452 56 6(Mana2Manal- 3)Manpi-4GlcNAepi-4GlcNAcp- Spl2 64 Fucal-2Gaipi-3GlcNAcp-Sp8 1602 625 313 39 62 Fucal-2Gaipi-3GleNAcpi-3Gaipi-4Glcp-Sp8 1580 417 208 26 148 Gaipi-4GlcNAcpi-3Galpl-4Glcp-Sp0 1568 617 308 39 295 Gaipi-4GlcNAcpi-2Manal-3(Neu5Aca2-6Gaipi- 1556 190 95 12 4GlcNAcpi-2Manal-6)Manpi-4GlcNAcpi- 4GlcNAcp-Spl2 137 Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcpl-4Gaipi- 4(Fucal- 1552 1313 656 85 3)GlcNAcp-SpO 17 P-D-Gal-Sp8 1544 871 435 56 168 GlcNAcpi-4MDPLys 1542 345 172 22 254 Neu5Acp2-6GalNAca-Sp8 1541 688 344 45 231 Neu5Aca2-3Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcp-Sp8 1534 257 129 17 125 Gaipi-3GalNAca-Sp8 1483 1025 512 69 269 Fucal- 2[60S03]Galpi-4GlcNAc-SpO 1473 191 96 13 182 G-ol-Sp8 1471 264 132 18 37 [30S03]Galpl-4GlcNAcP-Sp8 1462 1187 593 81 229 Neu5Aca2-3Galpl-4(Fucal-3)GlcNAcpi- 1451 333 167 23 3Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcpl-3Gaipi-4(Fucal- 3)GlcNAcp-SpO 315 Neu5Aca2-3Gaipi-3(Neu5Aca2-3Gaipi- 1448 1476 738 102 4GlcNAcp1- 6)GalNAc-Sp14 65 Fucal-2Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcpi-3Galpl- 1442 748 374 52 4(Fucal-3)GlcNAcp-SpO 164 GlcNAcpi-3Gaipi-4GlcNAcp-SpO 1436 1332 666 93 305 GlcNAcpi-2Manal- 3(GlcNAcpi-2Manal- 1428 288 144 20 6)Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcp-Spl2 304 GlcNAcpi-2Manal-3(Neu5Aca2-6Gaipi- 1428 499 249 35 4GlcNAcpi-2Manal-6)Manpl- 4GlcNAcpl- 4GlcNAcp-Spl2 145 Gaipi-4GlcNAcpi-3Gaipi-4(Fucal- 1422 323 162 23 3)GleNAepi-3Gaipi- 4(Fucal-3)GlcNAcp-SpO 117 Gaipi-3(Fucal-4)GlcNAc-SpO 1407 681 341 48 193 Manal-2Manal- 6(Manai- 3)Manal- 1404 285 142 20 6(Mana2Mana2Manal-3)Manfl-4GleNAepi- 4GleNAcP-Spl2 19 β-D-Man-Sp8 1389 635 317 46 176 GlcNAepi-6Gaipi-4GleNAep-Sp8 1383 1000 500 72 232 Neu5Aea2-3Gaipi-4(Fucal-3)GleNAepi-3Gaip- 1355 374 187 28 Sp8 219 Neu5Aea2-3Gaipi-3(Neu5Aea2-3Gaipi- 1350 753 377 56 4)GleNAep-Sp8 123 Galβΐ- 3(Neu5Aep2- 6)GalNAca-Sp8 1350 852 426 63 276 Gaipi-3(GleNacpi-6)GalNAc-Spl4 1345 353 176 26 208 Neu5Aca2-3(6-0-Su)Galpl-4(Fucal- 1341 642 321 48 3)GleNAep-Sp8 55 Fueal-2Galpl-3GalNAepi-3Gala-Sp9 1331 466 233 35 257 Neu5Gea2-3Gaipi-3(Fueal-4)GlcNAcp-SpO 1315 108 54 8 201 Fucal-3(Gaipi-4)GleNAepi-2Manal-3(Fucal- 1294 289 144 22 3(Gaipi- 4)GleNAepi-2Manal- 6)Manpi- 4GlcNAepi- 4GleNAeβ-Sp2O 97 Galal-3(Fueal-2)Gaipi-4GlcNAc-SpO 1282 583 291 45 150 Galpl-4GlcNAcpi-6(Gaipi-3)GaINAea-Sp8 1265 778 389 62 60 Fueal-2Galpl-3GalNAcpi- 4(Neu5Aea2- 1261 738 369 59 3)Gaipi-4Glcp-Sp9 317 Neu5Aea2-3Gaipi-3GalNAc-Spl4 1239 780 390 63 23 P-GleN(Gc)-Sp8 1219 436 218 36 279 Gaipi-3GlcNAePl-3Gaipi-3GlcNAcp-SpO 1219 570 285 47 190 Manal-2Manal-3(Manal-2Manal-6)Mana-Sp9 1217 1305 653 107 178 Glcal-4Glca-Sp8 1216 560 280 46 146 Galpl-4GlcNAcpl-3Gaipi-4GlcNAcpl-3Galpl- 1211 1315 658 109 4GlcNAcp-Sp0 292 Galpl-3GalNAca-Spl6 1198 370 185 31 221 Neu5Acoc2-3Gaipi-3 (Neu5Aca2-6) GalNAca-Sp8 1194 238 119 20 99 Galal-3(Fueal-2)Gaip-Sp8 1189 767 383 64 309 HOOC(CH3)CH-3-O-GlcNAc p1- 4 G1cNAc β-Sp10 1186 1108 554 93 248 Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAcpi-3Galpl- 1181 334 167 28 4GlcNAcp-SpO 107 Galal-3Gaip-Sp8 1148 688 344 60 236 Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNAcp-SpO 1148 441 220 38 320 Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAcpl-2Manal- 1142 55 27 5 3 (GlcNAcpi-2Manal-6)Manpi-4GlcNAcpi- 4GlcNAcP-Sp12 197 Manal-6(Manai-3)Manal-6(Mana2Manal- 1134 200 100 18 3)ManPl-4GlcNAcpl-4GlcNAcp-Spl2 185 GlcApl-3Gaip-Sp8 1133 470 235 42 34 [30S03]Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcp-Sp8 1117 980 490 88 109 Galal-4Gaipi-4GlcNAcp-SpO 1094 499 250 46 235 Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNAcpl-3Gaipi- 1092 1077 539 99 4GlcNAcpi-3Gaipi-4GlcNAcp-SpO 228 Neu5Aca2-3Galpl-4(Fucal-3)(60S03)GlcNAcp- 1090 771 385 71 Sp 8 184 GlcAP-Sp8 1072 476 238 44 282 Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcpi-3Gaipi-3(Fucal- 1062 239 120 23 4)GlcNAcP-SpO 2 Neu5Aca2-8Neu5Acp-Spl7 1060 84 42 8 174 GlcNAcpl- 6(Gaipi- 3)GaINAca-Sp8 1039 913 456 88 261 Neu5Gca2-3Galpl-4Glcp-SpO 1034 440 220 43 18 P-D-Glc-Sp8 1024 335 167 33 217 Neu5Aca2-3GalβI- 3(Fucal- 4)GlcNAcp-Sp8 1023 646 323 63 260 Νβϋ5ΰεα2-3θ3ΐβ1-461εΝΑοβ-3ρ0 1020 208 104 20 104 Galal-363ΐβ1-3Θ1εΝΑεβ-SpO 1017 297 149 29 245 Neu5Aca2-βΰβίβΐ- 4GlcNAcβ-SpO 1010 394 197 39 14 a-Neu5Ac-Sp8 998 1046 523 105 283 ΰβίβΐ-4ΰ1εΝΑοβ1 - 3Ga^l - 3ΰ1εΝΑοβ-3ρΟ 978 514 257 53 156 GlcNAeal-3Gaipi-4σΐεΝΑοβ-3ρ8 969 276 138 29 310 Manal-3(Manal-6)Μ3ηβ1-4β1οΝΑεβ1-4σΐεΝΑεβ- 965 238 119 25 Sp 12 183 GlCAa-Sp8 960 463 232 48 138 Ga^l-4(Fucal-3)σΐοΝΑοβΙ - 4Ga^l - 4(Fueal- 948 595 297 63 3)01εΝΑσβ1-463ΐβ1-4(Fucal- 3)βΙσΝΑεβ-ΞρΟ 96 Galal-3(Fueal-2)Galβΐ-4(Fueal-3)GlcNAeβ- 948 260 130 27 SpO 6 Νθυ5Αοα2-603ΐβ1-401εΝΑεβ1-2Μ3ηα1- 943 351 176 37 3(Neu5Aca2-6Galβΐ-4β1εΝΑεβ1-2Manal- 6)Μ3ηβ1-401εΝΑεβ1-401εΝΑεβ-3ρ12 306 σΐεΝΑοβ1-3Μβη-3ρ10 938 153 77 16 121 Ga^l-3(61οΝΑοβ1-6)GalNAca-Sp8 936 748 374 80 258 Νβυ5Οε32-363ΐβ1-3σΐεΝΑοβ-3ρ0 932 375 188 40 246 Neu5Aca2-6Ga^l- 4GlcNAeβ-Spe 931 635 317 68 200 Μβηβΐ-4σΐσΝΑοβ-3ρ0 920 322 161 35 78 Ρυεβ1-3σΐοΝΑοβ-3ρ8 911 464 232 51 94 Galal-2Ga^-Sp8 911 393 197 43 256 Galβΐ-4σΐοΝΑεβ1-2Manal- 3(Neu5Aca2-6Galβΐ- 909 428 214 47 4σΐοΝΑοβ1-2Μ3ηα1-6) ΜβηβΙ^ΟΙοΝΑσβΙ- 4σΐσΝΑσβ-3ρ21 95 Galal-3(Fucal-2)Galβ1-3ΰ1εΝΑεβ-SpO 908 245 123 27 8 a-D-Glc-Sp8 904 417 209 46 103 Galal-3Gaipi-4 (Fuccxl-3) GlcNAcP~Sp8 893 445 222 50 118 Gaipi-3 (Fucoí1-4) GlcNAc-Sp8 890 624 312 70 9 a-D-Man-Sp8 881 403 201 46 16 p-Neu5Ac-Sp8 876 935 468 107 119 Galpl-3(Fucal-A)GlcNAcp-Sp8 872 283 141 32 278 Gaipi-3GalNAc-Sp14 851 144 72 17 187 KDNoí2 - 3Gal βΐ - 3GlcNAcp-Sp0 839 386 193 46 69 Fucal-2Galpl- 4GlcNAcpi- 3Gal βΐ -4GlcNAc-SpO 837 328 164 39 76 Fucal-3GlcNAcp-Sp8 836 276 138 33 108 Galal-4 (Fucal-2)Gaipi-4GlcNAcp-Sp8 819 58 29 7 212 NeuAca2-3(NeuAca2-3Gaipi-3GalNAcpl- 818 1442 721 176 4)Galpl-4Glcp-SpO 132 Gaipi-3GlcNAcpi-3Galpl-4Glcp-SplO 816 353 176 43 105 Galal-3Gaipi-4GlcNAcp-Sp8 806 184 92 23 308 GlcNAcpi-4GlcNAcp-Spl2 796 360 180 45 160 GlcNAcpi-3(GlcNAcpi-6)Gaipi-4GlcNAcp-Sp8 794 416 208 52 284 Neu5Aca2-3Gaipi-3GlcNAcpi-3Gaipi- 777 491 245 63 3GlcNAcp-SpO 188 KDNa2-3Gaipi-4GlcNAcp-SpO 774 320 160 41 215 Neu5Aca2-3GalNAcpl-4GlcNAcp-SpO 762 252 126 33 294 Gaipi-3Gaipi-4GlcNAcp-Sp8 746 255 128 34 196 Manal- 3(Manai-2Manal-2Manal- 6)Mana-Sp9 744 177 88 24 189 Manal-2Manal-2Manal-3Mana-Sp9 743 207 103 28 25 GlcNAcpl- 3(GlcNAcpi-4) (GlcNAcpi-6)GlcNAc- 735 270 135 37 Sp 8 131 Galpl-3GlcNAcpi-3Gaipi-4GlcNAcp-SpO 728 290 145 40 277 Gaipi-3-(Neu5Aa2-3Gaipi-4GlcNacpi- 722 324 162 45 6)GalNAc-Spl4 136 Gaipi-4(Fucal- 3)GlcNAcp-Sp8 718 93 46 13 72/80
70 Fueal-2Gaipi-4GleNAepi-3Galpi-4GlcNAepi- 713 861 430 121 3Gaipi-4GlcNAep-SpO HO Galal-4Galpl-4GleNAep-Sp8 712 183 91 26 129 Gaipi-3GalNAepl-4Gaipi-4Glep-Sp8 702 224 112 32 71 Fucal-2Gaipi- 4GlcNAcP-SpO 686 160 80 23 169 GleNAepi- 4(GlcNAepl- 6)GaINAca-Sp8 686 229 115 33 122 Gaipi-3(Neu5Aca2-6)GalNAca-Sp8 679 157 79 23 106 Galal-3Gaipi-4Glcp-SpO 678 137 69 20 255 Neu5Aep2-6Gaipi-4GlcNAcp-Sp8 671 153 76 23 130 Galpl-3Gaip-Sp8 668 285 143 43 144 Galpl-4GleNAepi-3GaINAea-Sp8 663 227 113 34 13 a-L-Rha-Sp8 662 245 123 37 22 p-GlcNAe-Sp8 655 313 157 48 72 Fueal-2Gaipi-4GleNAep-Sp8 646 95 47 15 157 GleNAcal-6Gaipi-4GlcNAep-Sp8 644 323 162 50 307 GleNAcpl-4GleNAcp-SplO 640 336 168 53 180 Glcpi-4Glcp-Sp8 608 316 158 52 191 Manal-2Manal-3Mana-Sp9 607 104 52 17 134 Gaipi-3GleNAcp-Sp8 603 103 51 17 21 β-GleNAc-SpO 595 285 142 48 24 (Galpl-4GleNAcP)2-3,6-GalNAea-Sp8 590 240 120 41 223 NeuAea2- 3Gaipi-3GaINAepi-3Galal-4Gaipi- 580 191 95 33 4Glcp-SpO 162 GleNAcpi-3Gaip-Sp8 577 435 217 75 135 Galpl-4(Fueal-3)GlcNAep-SpO 561 139 70 25 249 Neu5Aea2-6Gaipi-4Glep-SpO 560 377 189 67 48 9NAeNeu5Aea-Sp8 556 470 235 85 158 GlcNAepl-2Gaipi-3GalNAea-Sp8 550 417 208 76 264 Neu5Gea-Sp8 550 305 152 55 46 NeuAca2-3[60S03]Gaipi-4GlcNAcp-Sp8 545 363 182 67 68 Fucal-2Galpl- 4(Fucal-3)GlcNAcp-Sp8 541 208 104 38 222 Neu5Aca2-3Gaip-Sp8 526 277 139 53 298 Gaipi-4GleNAcal-6Gaipi-4GlcNAcp-Sp0 494 335 167 68 98 Galal-3(Fucal-2)Gaipi-4Glcp-Sp0 482 112 56 23 312 Manal-6(Manai-3)Manal-6(Manai-3)Manp-SplO 453 292 146 64 133 Gaipi-3GlcNAcp-SpO 452 165 82 36 57 Fucal-2Gaipi-3(Fucal-4)GlcNAcp-Sp8 450 268 134 60 114 Gaipi-2Gaip-Sp8 449 324 162 72 198 Manal-6(Manai-3)Manal-6(Manai-3)Manpi- 448 204 102 45 4GlcNAcpl-4 GlcNAcp-Spl2 161 GlcNAcpi-3GalNAca-Sp8 442 156 78 35 281 Gaipi-4[Fucal-3][60S03]Glc-SpO 439 144 72 33 259 Neu5Gca2-3Galpi- 4(Fucal-3)GlcNAcp-SpO 433 357 179 83 67 Fucal-2Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcp-SpO 420 94 47 22 12 a-L-FuC-Sp9 410 303 151 74 159 GlcNAepl-3(GlcNAcpi-6)GaINAca-Sp8 407 88 44 22 75 Fucal-3GleNAep-Sp8 399 182 91 46 239 Neu5Aea2-3Gaipi-4Glcp-SpO 395 156 78 39 290 Galal-3(Fucal-2)Gaip-Spl8 389 246 123 63 11 a-L-Fuc-Sp8 387 231 115 60 51 GIcNAcP1-2Manal- 3(GlcNAcpl-2Manal- 383 164 82 43 6)Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAep-Spl3 5 Galpl-3GleNAepi-2Manal- 3(Gaipi-3GleNAcpi- 381 529 265 139 2Manal-6)Manpi-4GlcNAcpl-4GleNAep-Spl9 63 Fucal-2Galpl-3GleNAep-SpO 362 187 93 52 241 Gaipi-4GleNAcpi-2Manal- 3(Fucal-3(Gaipi- 352 68 34 19 4)GlcNAepl-2Manal-6)Manpl-4GleNAcpi- 4GleNAcp-Sp20 155 Gaipi-4Glep-Sp8 315 105 53 33 126 Gaipi-3GalNAep-Sp8 288 265 132 92 195 Manal-3(Manai-6)Mana-Sp9 269 92 46 34 88 GalNAcpl-3GalNAca-Sp8 262 107 54 41 252 Neu5Aca2-8Neu5Aca-Sp8 260 214 107 82 167 GlcNAepl-3Gaipi-4Glep-Sp0 257 129 64 50 140 Gaipi-4[60S03]Glcp-Sp8 256 345 172 135 177 Gleal-4Glcp-Sp8 246 113 57 46 179 Gleal-6Gleal-6Glep-Sp8 225 380 190 168 314 Manal-2Manal-2Manal- 3(Manai-2Manal- 221 329 165 149 6(Manai-2Manal- 3)Manal- 6)Mana-Sp9 238 Neu5Aea2-3Gaipi-4GlcNAcpi-3Gaipi- 212 200 100 94 4GlcNAcp-Sp0 220 Neu5Aea2-3Gaipi-3[60S03]GalNAea-Sp8 210 153 77 73 142 Galpl-4GalNAepi-3(Fueal- 2)Gaipi-4GleNAep- 204 126 63 62 Sp 8 61 Fucal-2Gaipi-3GlcNAcpi-3Gaipi-4Glcp-Spl0 196 67 34 34 102 Galal-3GalNAeP-Sp8 188 198 99 105 170 GlcNAepl-4Gaipi-4GleNAep-Sp8 184 127 64 69 124 Gaipi-3(Neu5Aca2-6)GlcNAcpi-4Gaipi-4Glcp- 173 146 73 84 SplO 100 Galal-3(Galai-4)Gaipi- 4GlcNAcp-Sp8 168 112 56 66 186 GlcApi-6Gaip-Sp8 158 171 86 108 4 Neu5Gep2-6Gaipi-4GlcNAe-Sp8 152 96 48 63 73 Fueal-2Gaipi-4Glep-Sp0 148 205 103 139 49 9NAcNeu5Aca2-6Galpl-4GlcNAcp-Sp8 146 159 79 108 58 Fueal-2Gaipi-3GalNAea-Sp8 136 171 86 126 250 Neu5Aea2-6Gaipi-4Glcp-Sp8 122 144 72 119 112 Galal- 4GleNAcp-Sp8 115 82 41 72 165 GlcNAcpi-3Gaipi-4GlcNAcp-Sp8 84 68 34 81 226 Neu5Aca2-3Gaipi-3GlcNAcp-Sp8 76 85 42 112 288 [60S03]Gaipi-4[60S03]GlcNacp-SpO 72 130 65 180 153 Galpl'4GlcNAcp-Sp8 48 58 29 120 Contempla-se que qualquer modalidade discutida nesta especificação pode ser implementada com relação a qualquer método, kit, reagente ou composição da invenção, e vice- versa. Além disso, as composições da invenção podem ser usadas para obtenção dos métodos da invenção.
Será subentendido que modalidades particulares aqui descritas são mostradas como forma de ilustração, e não como limitações da invenção. As características principais desta invenção podem ser empregadas em várias modalidades, 10 sem se afastar do escopo da invenção. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de constatar com o uso apenas de experimentação de rotina, numerosos equivalentes aos procedimentos específicos aqui descritos. Esses equivalentes são considerados como incluídos no 15 escopo desta invenção e são cobertos pelas reivindicações.
Todas as publicações e os pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível de conhecimento daqueles habilitados na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e os pedidos de 20 patente são aqui incorporados por referência no mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
0 uso da palavra "um" ou "uma", quando usada em conjunto com o termo "que compreende" nas reivindicações e/ou na especificação, pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais do que um" . 0 uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou", a menos que explicitamente indicado para se referir somente às 5 alternativas, ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a revelação suporte uma definição de que se refere apenas às alternativas e "e/ou" Ao logo de todo este pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação de erro inerente para o 10 dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre os indivíduos do estudo.
Como usado nesta especificação e nas reivindicações, as palavras "que compreende" (e qualquer forma de "que 15 compreende", por exemplo, "compreende" e "compreendendo"), "que possui" (e qualquer forma de "que possui", por exemplo, "possuem" e "possui"), "incluindo" (e qualquer forma de "incluindo", por exemplo, "incluem" e "inclui") ou "contendo" (e qualquer forma de "contendo", por exemplo, 20 "contém" e "contêm") são inclusivas ou de sentido amplo, e não excluem elementos ou etapas do método adicionais, não citadas.
0 termo "ou combinações destes", como aqui usado, refere-se a todas as permutações e combinações dos itens 25 listados que precedem o termo. Por exemplo, "A, B, C ou combinações destes" visa incluir pelo menos um de: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC e, se a ordem é importante em um contexto em particular, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. Continuando com este exemplo, são expressamente 3 0 incluídas as combinações que contêm repetições de um ou mais itens ou termos, por exemplo, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, e assim por diante. Aqueles habilitados na técnica compreenderão que tipicamente não há limite no número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que de outra forma evidente pelo contexto.
Todas as composições e/ou os métodos aqui revelados e reivindicados podem ser feitas e executadas sem experimentação desnecessária à luz da presente revelação. Embora as composições e os métodos desta invenção tenham 10 sido descritos em termos de modalidades preferidas, ficará evidente para aqueles habilitados na técnica que podem ser aplicadas variações às composições e/ou aos métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método aqui descrito, sem se afastar do conceito, espirito e do escopo da 15 invenção. Todas essas substituições e modificações similares evidentes para aqueles habilitados na técnica são consideradas como dentro do espírito, do escopo e do conceito da invenção, como definida pelas reivindicações em anexo.
2 0 REFERÊNCIAS
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Claims (30)

1. Método para aumentar a eficácia de apresentação de antIgeno, caracterizado por compreender a etapa de isolamento e purificação de um anticorpo específico para DC-ASGPR ou fragmento deste, ao qual um antígeno é anexado, formando um complexo anticorpo-antígeno, em que o antígeno é processado e apresentado por uma célula dendrítica que foi colocada em contato com o complexo anticorpo-antígeno.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula apresentadora de antígeno é uma célula dendrítica.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico para DC-ASGPR ou fragmento deste está ligado à metade de um par de Coesina/Doquerina.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico para DC-ASGPR ou fragmento deste está ligado à metade de um par de Coesina/Doquerina e um antígeno está ligado à metade complementar do par de Coesina/Doquerina para formar um complexo.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antígeno é selecionado de um peptídeo, uma proteína, um lipídeo, um carboidrato, um ácido nucléico, e combinações destes.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio específico do antígeno é específico para uma proteína da superfície de uma célula imunológica selecionada de MHC Classe I, MHC Classe II, CDl, CD2, CD3, CD4, CD8, CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC- ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manose, Langerina, DECTIN-1, Β7-1, Β7-2, receptor de IFN-γ e receptor de IL-2, ICAM-I, receptor Fcy ou outro receptor relativamente expresso especificamente por células apresentadoras de antígeno.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antígeno compreende uma proteína bacteriana, viral, fúngica, de protozoário ou de câncer.
8. Método para aumentar a eficácia de apresentação de antígeno por células dendríticas, caracterizado por compreender a ligação de um anticorpo específico para DC- ASGPR ou fragmento deste ao qual um antígeno é anexado formando um complexo anticorpo-antígeno, em que o antígeno é processado e apresentado por uma célula dendrítica que foi colocada em contato com o complexo anticorpo-antígeno.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a eficácia aumentada das células dendríticas é determinada com o uso de células T CD8+ alogênicas.
10. Uso de anticorpos ou outras moléculas de ligação específicas dirigidas ao DC-ASGPR, caracterizado por ser para a liberação de antígenos às células apresentadoras de antígeno com a finalidade de despertar respostas imunológicas protetoras ou terapêuticas.
11. Uso de reagentes de direcionamento de antígeno específicos ao DC-ASGPR, caracterizado por ser para vacinação através da pele.
12. Uso de reagente de direcionamento de antígeno específicos ao DC-ASGPR, caracterizado por estar em associação com adjuvante co-administrado ou ligado para vacinação.
13. Uso de antígenos específicos caracterizado por ser para fins de direcionamento de antígeno (vacinação), onde antígenos específicos podem ser expressos como proteínas de fusão recombinantes antígeno-anticorpo.
14. Imunoglobulina anti-DC-ASGPR antígeno-específica ou fragmento desta, caracterizada por ser secretada por células de mamíferos e um antígeno ligado à imunoglobulina.
15. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o antígeno é uma proteína de fusão com a imunoglobulina.
16. Imunoglobulina, de acordo coma reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o antígeno compreende uma proteína bacteriana, viral, fúngica, de protozoário ou de câncer.
17. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a imunoglobulina está ligada à metade de um domínio coesina/doquerina.
18. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por compreender ainda uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina ligado a um antígeno que forma um complexo com o veículo modular de rAb.
19. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por compreender ainda uma metade complementar do par de ligação de coesina-doquerina que é uma proteína de fusão com um antígeno.
20. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o domínio específico do antígeno compreende um anticorpo de comprimento total, um domínio da região variável do anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2, e fragmento Fv, e fragmento Fabc e/ou um fragmento Fab com porções do domínio Fe.
21. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a imunoglobulina está ligada a uma toxina selecionada, em que a toxina é selecionada do grupo que consiste em um isótopo radioativo, metal, enzima, botulina, toxina tetânica, ricina, toxina colérica, toxina diftérica, aflatoxinas, toxina de perfringens, micotoxinas, shigatoxina, enterotoxina estafilocócica B, T2, seguitoxina, saxitoxina, abrina, cianoginosina, alfatoxina, tetrodotoxina, aconotoxina, veneno de cobra e veneno de aranha.
22. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o antígeno é uma proteína de fusão com a imunoglobulina.
23. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o antígeno compreende uma proteína bacteriana, viral, fúngica, de protozoário ou de câncer.
24. Imunoglobulina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o antígeno compreende uma célula de câncer, ou porção desta, selecionada de doenças Iinfo-proliferativas de células TeB, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas, câncer gastrintestinal, câncer de mama, câncer de próstata ou câncer de pulmão de células não pequenas.
25. Método para aumentar da eficácia de células dendríticas, caracterizado por compreender: isolamento de células dendríticas do paciente; exposição das células dendríticas a quantidades ativadoras de anticorpos anti-DC-ASGPR ou fragmentos destes e antígeno, para formar células dendríticas ativadas carregadas de antígeno; e reintrodução das células dendríticas ativadas carregadas de antígeno no paciente.
26. Uso de agentes que se ligam a DC-ASGPR, isoladamente ou com agentes de co-ativação, caracterizado por ser para ativar células apresentadoras de antígeno para aplicações terapêuticas ou protetoras.
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que os agentes de ativação e/ou de ligação do DC-ASGPR são ligados aos antígenos, isoladamente ou com agentes de co-ativação para vacinação protetora ou terapêutica.
28. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as seqüências específicas da região V de anticorpo são capazes de se ligar a e ativar os DC-ASGPR.
29. Uso de agentes anti-DC-ASGPR ligados a agentes tóxicos, caracterizado por ser para fins terapêuticos no contexto de doenças sabidas ou suspeitas de resultarem da ativação inadequada de células imunológicas via DC-ASGPR.
30. Vacina caracterizada por compreender um anticorpo específico ao DC-ASGPR, ou fragmento deste, ao qual um antígeno é anexado formando um complexo anticorpo-antígeno, em que o antígeno é processado e apresentado por uma célula dendrítica que foi colocada em contato com o complexo anticorpo-antígeno. <formula>formula see original document page 88</formula> <formula>formula see original document page 89</formula> <formula>formula see original document page 90</formula> <formula>formula see original document page 91</formula> <formula>formula see original document page 92</formula> <formula>formula see original document page 93</formula> <formula>formula see original document page 94</formula> <formula>formula see original document page 95</formula> <formula>formula see original document page 96</formula> <formula>formula see original document page 97</formula> <formula>formula see original document page 98</formula> <formula>formula see original document page 99</formula> <formula>formula see original document page 100</formula> <formula>formula see original document page 101</formula> <formula>formula see original document page 102</formula> <formula>formula see original document page 103</formula> <formula>formula see original document page 104</formula> <formula>formula see original document page 105</formula> <formula>formula see original document page 106</formula> <formula>formula see original document page 107</formula> <formula>formula see original document page 108</formula>
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