KR20090096444A

KR20090096444A - 로즈마리 추출물을 포함하는 담배 필터 및 상기 필터를 사용하여 담배 연기 내의 유해 물질에 의해 유발되는 ｄｎａ 손상을 감소시키는 방법

Info

Publication number: KR20090096444A
Application number: KR1020097011628A
Authority: KR
Inventors: 아이먼 이마미
Original assignee: 비오신테크
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2009-09-10
Also published as: NO20091844L; CN101641023A; CA2668939A1; US20110155157A1; BRPI0622154A2; EP2094120A1; JP2010509913A; ZA200903381B; WO2008060286A1; AU2006350735A1; KR20130103834A; EA015759B1; EP2094120A4; EA200970484A1

Abstract

본 발명은 로즈마리 추출물을 포함하는 담배 필터 및 담배 연기 내의 다양한 유해 물질에 의해 유발되는 DNA 손상을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간 폐 내 벤조(아)피렌 디올 에폭시드-dG (BPDE-dG) 부가물의 감소에 의해, 인간 세포 내 벤조(아)피렌에 의해 유발되는 DNA 손상을 감소시키는, 상기 필터의 용도에 관한 것이다.

Description

로즈마리 추출물을 포함하는 담배 필터 및 상기 필터를 사용하여 담배 연기 내의 유해 물질에 의해 유발되는 ＤＮＡ 손상을 감소시키는 방법 {A CIGARETTE FILTER CONTAINING ROSEMARY EXTRACT AND A METHOD OF REDUCING DNA DAMAGE CAUSED BY HARMFUL AGENTS IN CIGARETTE SMOKE BY USE OF SAID FILTER}

인간 폐의 벤조(아)피렌 디올 에폭시드-dG (BPDE-dG) 부가물은 기관지 세포에 집중되어 있다. 이 부가물은 현재 벤조(아)피렌에 의한 종양발생에서 결정적인 역할을 하는 것으로 인식되고 있다. 담배 연기는 BPDE-dG 형성에 주요한 기여자이다. 담배는 분명하게도, 공지된 발암원에 대한 노출과 암으로 인한 사망 사이에서 가장 일반적으로 관계되기 때문에, 암 유도 기전을 이해하기 위한 모델로서 사용된 다. 벤조(아)피렌(BP)은 배기 가스, 숯불구이 음식에 존재하고, 담배 연기에 소량, 일반적으로 담배 당 10 ng 미만으로 존재하는, 극히 발암성인 다환식 방향족 탄화수소 (PAH)이다. BP는 폐암의 병인과 관련된 담배 연기 내의 60개 이상의 발암원 중 하나이다. 그것은, 주로 구아닌의 N²-위치에서, DNA와 반응하는 벤조(아)피렌-7,8-디올-9,10-에폭시드 (BPDE)로 대사적으로 활성화되어, 일차적으로 N²-구아닌 병변, 예컨대, 벤조(아)피렌-7,8-디올-9,10-에폭시드-N²-데옥시구아노신 (BPDE- dG) 부가물을 생성한다. 인간 조직에서 BPDE-DNA 부가물의 존재는 확립되어 있고, BPDE-dG 부가물은 기관지 세포에 배타적으로 집중되어 있어서, 인간 폐암의 개시에 영향을 미친다.

로즈마리 (Rosmarinus officinalis Labiatae) 허브 및 오일, 로즈마리 추출물, 카르노스산 및 카르노솔은 원하는 향미와 고 항산화 활성을 목적으로, 향신료 및 향미제로서 식품 가공에서 통상적으로 이용된다.

그러나, 본 발명 이전에, 담배 필터에 로즈마리 추출물을 사용하는 것이, 벤조(아)피렌, 특히, 벤조(아)피렌에 의한 종양발생에서 결정적인 역할을 하는 것으로 인식되고 있는 인간 폐 내 벤조(아)피렌 디올 에폭시드-dG (BPDE-dG) 부가물에 의해, 인간 세포에서 유발되는 DNA 손상을 감소시킬 수 있다는 점은 알려진 바가 없다.

발명의 요약

BP는 본 연구에서 확인할 수 있듯이, 흡연자에서의 폐암 유도와 관련된 주요 발암원으로 인식되며, 활성 산소종은 결정적인 폐암 형성 부가물의 생성에 실질적으로 기여한다. 담배 중독을 방지하고, 흡연 중단 및 감소 프로그램의 효율성을 증가시키는 것 모두가 중요하지만, 이러한 접근법은 효과가 거의 없다. BPDE-dG 부가물의 생성을 방지하는 것이, 중독 흡연자에서 폐암 위험성을 감소시키는 하나의 접근법이 된다.

본 발명은 로즈마리 추출물을 포함하는 담배 필터 및 담배 연기 내의 유해 물질에 의해 유발되는 DNA 손상을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간 폐의 벤조(아)피렌 디올 에폭시드-dG (BPDE-dG) 부가물의 감소에 의해, 인간 세포 내 벤조(아)피렌에 의해 유발되는 DNA 손상을 감소시키는, 상기 필터의 용도를 제공한다.

(-)-안티(anti)-BPDE-dG 부가물의 양은, (+)-BP-7,8-디올의 존재 하에서 담배 연기 농도에 따라 직선적으로 증가한다는 점이 발견되었다. 카탈라제 및 수퍼옥사이드 디스뮤타제는 그의 생성을 80%보다 크게 저해시킨다. MCF-7 세포를 2시간 동안 (+)-BP-7,8-디올로 처리하면, 담배 연기는 (-)-안티-BPDE-dG의 생성을 용량 의존적으로 증가시키며, 부가물인 (+)-신(syn)-BPDE의 생성에 의존적으로 CYP를 감소시킨다.

세포를 1일 동안 벤조(아)피렌으로 처리한 후, 2시간 동안 담배 연기에 노출시켰다. 이 2시간 동안, CYP 활성으로 인해, 비처리 세포와 비교하여, 담배 연기 처리된 세포에서 부가물 생성이 2배나 증가한 것이 발견되었다. 따라서, 담배 연기는 그것이 포함하는 활성 산소종에 의해, BPDE-dG 부가물의 생성에 이르는 벤조(아)피렌의 대사 경로의 제2 단계를 활성화시킨다는 점이 확인되었다.

따라서 담배 연기는 이러한 경로로 결정적인 폐암 형성 부가물의 생성을 초래할 수 있다.

마지막으로, 로즈마리 추출물을 포함하는 변형된 담배 필터는, MCF-7 세포에서 담배 연기로 인한 BPDE-dG 부가물의 수준을 70%보다 많이 감소시킨다는 점이 발견되었다. 이러한 발견은 중독 흡연자에서 폐암의 위험을 감소시키는데 현저한 진보를 가져온 것으로 생각된다.

실험안 및 표의 간단한 설명

실험안 1. MCF-7 세포를 12시간 및 18시간 동안 BP로 처리한 후, 추가적인 2시간 동안 BP와 함께 담배 연기로 처리하였다 (각각 시험 A 및 B). 이 시험의 목적은 BP를 상이한 정도로 활성화시켜, BP-7,8-디올을 생성하고, 세포를 담배 연기로 처리한 후 마지막 2시간 동안 일어나는 효과를 알아보기 위한 것이다. 대조군은 BP로만 처리된 세포로 하였다.

표 1. 무세포 시스템(cell-free system)에서, 담배 연기에 의해 유발되는 BPDE-dG에 대한 스카벤저(scavenger)의 효과

처리	% 표준 CS에 대한 BPDE-dG
표준 CSS	100
+ 수퍼옥사이드 디스뮤타제 SOD (20μg)	16
+ 카탈라제 (4 μg)	12
+ 불활성 카탈라제 (4 μg)	100
표준 CSS 대신 로즈마리로 여과한 CSS	42

표준 CSS 시스템은 2 ml의 송아지 흉선 DNA (3 mg/ml), 600 μl 30 μM (+) BaP-7,8-디올 및 pH 7.4에서 PBS로 희석한 5 ml CSS (1:19)를 포함하여, 2시간 동안 실온에서 배양시켰다. 각 수치는 2회 수행된 3개의 독립적인 실험에서 얻은 것이다. 평균 오차는 각 2회 시험에서 약 12%였다. 표준 CSS의 BPDE-dG 값은 mg DNA 당 56 ± 6.3 (mean ± s.d.)의 부가물이었다.

발명의 상세한 설명

담배 연기는 다수의 인간암의 원인과 관련이 있다. 담배는 분명하게도, 공지된 발암원에 대한 노출과 암으로 인한 사망 사이에서 가장 일반적으로 관계되기 때문에, 암 유도 기전을 이해하기 위한 모델로서 사용된다.

벤조(아)피렌(BP)은 배기 가스, 숯불구이 음식에 존재하고, 담배 연기에 소량, 일반적으로 담배 당 10 ng 미만으로 존재하는, 극히 발암성인 다환식 방향족 탄화수소 (PAH)이다. BP는 폐암의 병인과 관련된 담배 연기 내의 60개 이상의 발암원 중 하나이다. 그것은, 주로 구아닌의 N²-위치에서, DNA와 반응하는 벤조(아)피렌-7,8-디올-9,10-에폭시드 (BPDE)로 대사적으로 활성화되어, 일차적으로 N²-구아닌 손상, 예컨대, 벤조(아)피렌-7,8-디올-9,10-에폭시드-N²-데옥시구아노신 (BPDE- dG) 부가물을 생성한다.

인간 조직에서 BPDE-DNA 부가물의 존재는 확립되어 있고, BPDE-dG 부가물은 기관지 세포에 배타적으로 집중되어 있어서, 인간 폐암의 개시에 영향을 미친다.

이 발암원은 I상 효소에 의해 대사되어, 페놀, 아렌 옥사이드(arene oxide), 퀴논, 디하이드로디올 및 디올 에폭시드를 포함하는 다수의 대사산물을 생성한다. (+)-안티-BPDE-dG 부가물을 생성하는 BP 대사 경로에 대한 개략도를 도 1에 나타내었다.

더욱 상세하게는, 2회에 걸친 시토크롬 P450-매개 산화에 의해 BP로부터, 최종 발암원인 (+)-안티-BPDE가 생성되었다. 이 산화의 제1 단계는 바람직하게는 (-)-7,8-디하이드로-7,8-디하이드로벤조(아)피렌 [(-)BP-7,8-디올]을 생성하는 것이다. 상기 디올은 일차적으로 매우 돌연변이성인 (+)-r-7,t-8-디히드록시-t-9,10-옥시-7,8,9,10-테트라하이드로-BP [(+)-안티-BPDE]로 산화된다. 다양한 연구에서, [(+)-안티-BPDE]가, 생체내 및 시험관내에서 개선된 돌연변이 활성을 나타내는 BP의 일차 발암성 대사산물이라는 것이 확인되었다. 폐 발암원의 대사에서 유전적 변이에 대한 대부분의 이전 연구들은, 폐에서 시토크롬 P450의 발현이 일반적으로 낮음에도 불구하고, 다양한 시토크롬 P450에 의한 대사 활성에 초점을 맞추었다. 폐의 상피세포에 의한 BP-7,8-디올의 활성화는, 고전적인 CYPs/GSTs 의존적 생체변환 과정에 의해 일어날뿐만 아니라, CYPs 이외의 다른 대사 경로와도 관련이 있다. 이것은 리포옥시게나제, 지질-과산화물 및 퍼옥시다제-의존적 경로, COX-I 및 COX-2를 포함한다.

많은 증거들을 통해, 흡연자의 폐암 유도에서 담배 자유 라디칼의 인과적 중요성이 제안되고 있다. 담배 연기를 한번 불 때마다 10조 이상의 자유 라디칼이 형성되며, 이는 종양의 개시뿐만 아니라 세포 거대분자 상의 ROS로 인한 반복적인 공격에 의해 야기되는 다양한 형태의 인간암의 촉진에도 기여할 수 있다. 주요 자유 라디칼종은 세미퀴논, 하이드로퀴논 및 퀴논의 평형 혼합물일 것이 요구된다. 이 자유 라디칼 혼합물은, 분자 산소로부터 수퍼옥사이드 음이온을 생성하고, 수소 퍼옥사이드 및 하이드록실 라디칼을 형성하는, 산화환원 사이클을 일으키는 것으로 생각된다. 이러한 반응종들은 배양된 설치류 및 인간 세포에서 DNA의 단일쇄 파괴 및 DNA 닉킹(nicking)의 원인이 된다. 퀴논-관련 산화환원 사이클은 또한 이들 효과와 관계가 있을 수 있다; 하이드로퀴논 및 카테콜이 주요한 역할을 하는 것으로 생각된다.

본 발명에서, 담배 연기는 그것의 산소 생성 라디칼에 의해, 생각컨대, 세포에서 (-)-BP-7,8-디올로부터 (+)-r-7,t-8-디히드록시-t-9,10-옥시-7,8,9,10-테트라하이드로-BP [(+)-안티-BPDE]로의 대사에 의해, BPDE-dG 부가물의 생성에 이르는 BP 대사 경로의 제2 단계를 활성화시킬 수 있다는 것이 발견되었다 (도 1).

또한, 상기 활성화는 CYPs 장치에서 얻어지는 것에 비해 적어도 2배 이상 촉진된다는 것이 밝혀졌다.

또한, 담배 연기 유래의 ROS는 부분적으로 증가된 BPDE-dG 부가물 생성의 원인이 될 수 있음이 확인되었다.

또한 본 발명에서, 로즈마리 분말 제형을 포함하는 필터는 CS 산소 생성 라디칼로 인한 BPDE-dG의 수준을 유의성 있게 감소시킬 수 있으며, 이러한 발견은 기관지 상피 세포에서 발암원인 BPDE-dG 부가물의 생성을 감소시키는 담배 필터에 적용될 수 있는 것으로 확인되었다.

본 발명은 (i) BP-7,8-디올의 활성화에서, 시토크롬 P450과 비교되는 담배 연기 내 ROS의 상대적인 기여도를 측정하는 수단; (ii) 담배 연기의 ROS가, 치명적인 폐내 BPDE-dG의 생성을 증가시키는 BP-7,8-디올의 대사에 기여함으로써, 발암 경로를 촉진하는지 여부를 확인하기 위한 수단; (iii) BPDE-dG의 생성을 유의성있게 감소시키는, 담배 자유 라디칼의 스카벤저를 포함하는 필터; 및 (iv) BPDE-dG 부가물의 기능을 유의성 있게 감소시키는, 상기 필터의 용도를 제공한다.

도 1. 발암원 벤조(아)피렌의 주요 대사 경로 및 DAN 결합: 벤조(아)피렌은 생체내에서 효소적으로 또는 산소 활성종에 의해 전환되어, DNA-반응성 디하이드로디올 에폭시드를 생성하는, 담배의 발암원이다. (-)-BP-7,8-디하이드로디올로부터, 돌연변이성 (+)-r-7,t-8-디히드록시-t-9,10-옥시-7,8,9,10-테트라하이드로-BP [(+)-안티-BPDE]의 입체선택적인 생성은, 시토크롬-P450-의존성 모노옥시게나제 (P450) 또는 활성 산소종에 의해 촉매된다. 이러한 친전자성 중간체를 게놈 DNA와 반응시키는 이후의 반응은 구아노신의 고리밖(exocyclic) 아미노기 및 디하이드로 디올 에폭시드 간의 안정한 부가물을 형성한다. 이러한 종류의 DNA 병변(lesion)은, 상기 부가물의 복구가 이루어지지 않는 한, 다음에 오는 복제 사이클에서 돌연변이로 전환될 수 있다.

도 2. DNA 부가를 수반하는, 무세포 시스템을 이용하여 얻어진 결과: 물 2 ml 중 6 mg의 송아지 흉선 DNA를 희석률이 다른 5 ml CSS에 가하고, 2시간 동안 실온에서 (+)-BP-7,8-디올(최종 농도 3.6 μM)과 반응시켰다. DNA를 가수분해하고 유출된 BP-테트롤 I를 하기 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 측정하였다.

도 3. (a) 과산화 라디칼 및 시토크롬 P450에 의한, BP-7,8-디올에서 DNA에 결합가능한 활성종(안티-BPDE 및 신-BPDE)으로의 에폭시화에 따른 입체 화학 및 (b) 본 연구에서 측정된 DNA의 BP-테트롤로의 산 가수분해. (-)-안티-BPDE-dG 및 (-)-신-BPDE를 가수분해하면 BP-테트롤 I-2 및 BP-테트롤 II-l이 생성되지만 이들은 불안정하여 BP-테트롤 I-l 및 BP-테트롤 II-2로 전환된다.

도 4. MFC-7 세포를 이용하여 얻어진 결과. 총 부피 20 ml의 10 x 10⁶ 세포/150 cm² 플라스크를 2시간 동안 (+)-BP-7,8-디올(0.2 μM) 단독 또는 CSS의 다른 희석물의 존재 하에서 처리하였다. DNA를 분리 및 가수분해한 후, 유출된 BP-테트롤을 측정하고, 하기 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 결합 수준을 측정하였다. 2개의 상이한 피크는, 각각 (-)-안티-BPDE-dG 및 (+)-신-BPDE-dG로부터 유래한 BP-테트롤 I 및 BP-테트롤 II에 상응하는 크로마토그램에서 관찰되었다 (참조 32-34). 수치는 3-4 HPLC로 분석한 2개의 독립적인 실험에서 평균 + Std를 나타낸다. 도 4a, 상부 패널, CSS 희석에 따른 (-)-안티-BPDE-dG 부가물의 증가; 도 4b, 하부 패널, CSS 희석에 따른 1/(+)-신-BPDE-dG 부가물의 증가

도 5. 정해진 시간 동안 BP 2.5 μM 또는 BP 2.5 μM + CS 용액 (20배 희석)에 노출시킨 후의 MCF-7 세포 내 BPDE-dG 결합. 담배 연기 용액을 BP에 노출하는 마지막 2시간 동안 가하였다 (실험안 1). BPDE-dG 분석을 하기 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 수치는 4-6 HPDC로 분석한 2개의 독립적인 실험에서의 평균 + 표준편차를 나타낸다. BPDE-dG 값은 배양한지 12시간 후에, mg DNA당 11.7 ± 0.5 (평균 ± s.d.) Dg의 부가물이였고, 18 시간 및 24 시간 후에, 각각 17.6 ± 0.4, 26.1 ± 0.9였다. 12, 18 및 24시간의 각각의 기준 시간 후 2시간 동안, CYP의 자발적인 대사로 인해 이들 값이 17.2 ± 0.5, 27.8 ± 0.8, 및 42.2 ± 1.0로 증가하였다. 담배 연기 용액(CSS)의 추가는 각각 12, 18 및 24시간 후 동일한 2시간 동안 BPDE-dG의 최종값을 mg당 36.9 ± 1.2, 56.7 ± 0.9 및 80.2 ± 1.2 (평균 ± s.d.)의 부가물로 증가시켜, 더욱 극적인 변화를 유도하였다.

도 6. 표준 필터 및 로즈마리 추출물 함유 필터로부터 수득한, BP 2.5 μM 또는 BP 2.5 μM + CS 용액에 노출시킨 후, MCF-7 세포 내 BPDE-dG 결합. 담배 연기 용액을 BP에 노출하는 지정된 시간의 마지막 2시간 동안 가하였다 (실험안 1). BPDE-dG의 분석을 하기 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 수행하였다. HPLC 분석 결과, (+)-안티-BPDE-dG 유래의 BP-테트롤 I에 대응되는 크로마토그램에서, 하나의 피크만이 나타났다. 수치는 4-6 HPLC로 분석한 2개의 독립적인 실험에서의 평균 + Std를 나타낸다.

화합물질. 프로테이나제 K (EC 3.4.21.64, 트리티라치움 알붐(Tritirachium album) 유래)를 Sigma (미주리주 세인트루이스)로부터 입수하고, RNase Tl (EC 3.1.21.3, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 유래) 및 RNase (DNase free, 소 췌장 유래의 리보뉴클레아제의 비균질 혼합물)를 Boehringer Mannheim (Mannheim, 독일)로부터 입수하였다. 인산-완충 식염수(PBS)는 E. Merck, Darmstadt, 독일에서 입수한 분광용으로, 3.0 mM KCl, 1.5 mM KH₂HPO₄, 140 mM NaCl, 8.0 mM Na₂HPO₄, (pH 7.4), HPLC-등급 수, MeOH, 에테르 및 에탄올을 포함하였다. 달리 언급되지 않는 한, 다른 화합물질들은 Sigma (L'Isle d'Abeau Chesnes, 프랑스) , Boehringer Ingelheim (독일 하이델베르크) 및 Boehringer Mannheim (독일 만하임)에서 입수하였다. 모든 BP 대사산물 표준품은 국립암연구소, Chemical Carcinogen Reference Standard Repository Midwest Research Institute (미주리주 캔자스 시티)로부터 입수하였다.

장치. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는, Hewlett-Packard 적분기와 연결된 Shimadzu RF-10AXL 형광 검출기가 장착되어 있는 Hewlett-Packard 고압 동용매(isocratic) 및 기울기(gradient) 시스템 (Waldborn, 독일)을 사용하여 수행하였다.

담배 연기/PBS 용액 (CSS)의 제조. 흡연은 캠브리지 필터(Cambridge filter) 없이 Pryor 등에 따라 수행되었다. 원칙적으로 Nakayama 등에 의해, 동일한 연기 수집 방법이 사용되었다. 물 펌프에서 형성되는 지속적인 진공의 도움을 받아, 3.8분 동안 담배(Marlboro) 하나당 8 cm 타는 동안 형성되는 연기가, 가스상 및 타르 담배 연기 물질 모두를 잡아내는 10 ml의 인산-완충 식염수 (PBS) 용액을 통하여 거품이 일도록 하였다. 물병의 벽면에는 수-불용성 타르 화합물이 존재하지 않기 때문에, 하나의 담배 연기로부터 유래한 수용성 화합물의 대부분은 10 ml PBS 용액 중에 포함되었다. 담배 연기 용액 (CSS)으로 명명한 이 수용액을, 벤조(아)피렌 또는 그의 유사한 대사산물인 (+)-BaP-7,8-디올이 존재하는 배양물 내 MCF-7 세포에 가하거나, 외인성 DNA와 즉각적으로 반응시켰다. CSS는 희석률을 달리하여 사용되었다 (하기 참조) .

로즈마리 분말 추출물의 담배 필터로의 혼입. 일반적인 담배 필터를 제거하고, 로즈마리 분말 추출물 40 mg을 담배에 인접한 필터가 제거된 위치에 도입하였다. 그 후, 필터를 재장착하였다. 필터의 효능은 질량 분광법을 이용하여 평가하였다. 담배 연기는 3,3,5,5-테트라메틸-l-피롤린-N-옥사이드(TMPO) 스핀 트랩 부가물을 포함하는 유기 용매 중에서 거품이 일도록 하였다. 그리고 나서, 하이드록실 라디칼 부가물의 양을 액체 크로마토그래피, 질량 분광법을 이용하여 정량하였다. 담배 연기 조건에서, 하이드록실 라디칼이 30% 감소한 것으로 관찰되었다.

희석된 담배 연기 용액 (CSS)의 존재하에서 (+)-BP-7,8-디올과 외인성 DNA의 반응. 2 ml의 송아지 흉선 DNA (3 mg/ml)를 5 ml의 20배 희석된 CSS에 가하고, 하기 반응식과 같이 (+)-BP-7,8-디올 (최종 농도 3.6 μM)과 실온에서 2시간 동안 반 응시켰다:

DNA + [(+)-BP-7,8-디올] + CSS → (-)-안티-BPDE-N²-dG

생성된 (-)-안티 BPDE-dG 부가물의 농도를 측정하였다 (후술함). 대조군으로, CSS 없이 시험을 수행하였다.

세포 배양 조건 및 처리. 10% FCS, 15 mM Hepes 완충액, 및 항생제(200 units/ml 페니실린, 200 μg/ml 스트렙토마이신 및 25 μg/ml 암피실린)가 보충된 총부피 20 ml의 E-MEM(minimal essential medium) 배지 내 150-cm² 세포 배양 플라스크에서 인간 유방암 세포주 MCF-7을 배양하였다. 세포를 유지하면서, 37 ℃, 5% CO₂/95% 대기 하에서, 처리하였다.

MCF-7 세포가 플라스크 면적의 90%를 차지하게 되면(융합성 배양물을 분리한지 2-3일 후), 배지를 10% 혈청을 포함하는 신선한 배지 20 ml로 교체하였다. 24시간 후, 거의-융합성인 세포, 예컨대, GO/Gl상의 세포 90% 이상을 DMSO 단독으로, 또는 DMSO 및 담배 연기/PBS (전술한 CSS)에 용해된 발암원과 함께 처리하였다. DMSO의 최종 농도는 총 배양 부피의 0.1%를 초과하지 않았다. 각 배양 세트에 포함된 대조 시료는 DMSO 단독으로 처리하였다.

a) (+)-BP-7,8-디올 및 담배 연기로 MCF-7 세포를 처리. 세포를 (+)-BP-7,8-디올 (0.2 μM)만으로 또는 상이한 CSS 희석액의 존재 하에서 2시간 동안 처리하였다. (+)-BaP-7,8-디올을 CS 및 세포 CYP's로부터 생성된 R00°로 활성화시켜, 각각 (-)-안티-BPDE-dG 및 (+)-신-BPDE-dG를 생성하였다. 이들 농도는 BP-테트롤 I-1 및 BP-테트롤 II-2의 형성으로 측정하였다 (하기 및 도 3 참조).

b) BP를 이용한 시간/용량 노출 시험. BP 및 BPDE-dG 농도에 대한 시간/용량 노출을 특성화하기 위하여, 세포 (1Ox10⁶ 세포 /150 cm² 플라스크, 총부피 20 ml)를 각 6, 12, 18 및 24 시간에 대해 최종 농도 1.25, 2.5 및 5.0 μM (2개의 플라스크/용량/시간)을 포함하는 배지로 처리하였다. 세포에서 생성된 BPDE-dG 부가물은 다른 경우와 동일하게(30), 용량- 및 시간-의존적인 형태로 직선적으로 증가하였다. 이러한 결과를 기초로, BP에 대한 실시 농도로 2.5 μM이 선택되었다.

c) BP 및 담배 연기로 MCF-7 세포를 처리. CS 농도에 따른 효능을 확인하기 위하여, CSS 희석률을 달리하여(1:79; 1:39; 1:19; 1:9 vol/vol) 실험안 l의 시험 A를 수행하였다. 이 시험 결과를 기초로, CS 실시 농도로, 1:19 (vol/vol)의 희석률을 선택하였다. 따라서, 세포 (상기 "세포 배양 및 처리" 참조)는 실험안 1 (도 6 - 실험안 1 참조)에 따라 BP (2.5 μM) 및 CSS (1:19 vol/vol 희석률)로 처리하였다.

모든 배양 과정은 중복 시료를 사용하여 2-3회 반복되었다. 처리의 최종 단계에서, 세포의 형태학적 변화를 현미경으로 관찰한 후, 0.05% 트립신-EDTA (0.05% 트립신, 0.14 M NaCl, 3 mM KCl, 0.1 M Na₂HPO₄, 1.5 mM K₂HPO₄, 0.5 mM EDTA)로 트립신화하여 수집하였다. 10% FCS 함유 배지와 동일한 부피로 첨가한 후, 세포를 1000 g에서 원심분리하고, PBS로 3회 세정한 후, 세포 펠렛을 -20℃에서 동결시켰다. BP 및 담배 연기 또는 (+)-BP-7,8-디올 및 담배 연기로 처리한 세포의 생존력 은, 트립판 블루 배제 분석에 의해 측정된 바와 같이, 수집 시점에서, 대략 90%였다. 락테이트 데하이드로게나제 활성 분석(ELISA Kit, Boehringer, 만하임)에 의해 측정된 바와 같이, 사용된 용량에서 어떠한 세포독성도 보이지 않았다.

DNA 제작 및 가수분해. RNase, 프로테이나제 K, 염 공정 (31) 및 클로로포름으로 처리하여 MCF-7 세포 펠렛으로부터 DNA를 분리하였다. 간략히 말하면, 진탕기(100 rpm)에서 RNase Tl (2000 U/ml) 및 RNase A (DNase 없음; 100 μg/ml)를 사용하여 1시간동안 37℃에서 배양한, EDTA-소듐 도데실 설페이트 (SDS) 완충액 [10 mM 트리스 완충액, 1 mM Na₂EDTA, 1% SDS (w/v), pH 8]에서 세포 펠렛을 재현탁시켰다. 그 후, 프로테이나제 K (300 μg/ml)를 가하고, 밤새 37℃에서 배양을 유지하였다. 소화시킨 후, 6M NaCl을 가하여, 최종 농도가 1M이 되도록 하고, 10000 g으로 원심분리하였다. 상등액 내 DNA를 2 vol. 에탄올로 침강시키고, 70%, 100% 에탄올, 에테르로 세척 후, 건조하고, 10 mM 트리스 버퍼로 용해시켰다. 또한, KNase A (100 μg/ml) 및 RNase Tl (2000 U/ml)을 가하고, 용액을 37℃에서 1시간 동안 배양 후, 37℃에서 추가 2시간 동안 프로테이나제 K (100 μg/ml)를 가하여 배양하였다. 용액을 클로로포름으로 1회 추출한 후, 원심분리하고, 용액을 1M NaCl로 하였다. DNA를 2 vol.의 차가운 에탄올로 침강시켰다.

가수분해된 DNA 부분을 100% 에탄올로 세정하여, 비결합 BP-테트롤을 제거하였다. 비결합 BP-테트롤이 제거된 DNA를 물에 용해시키고, DNA 농도를 A₂₆₀ nm로 측정하였다. 순도는 A₂₆₀/A₂₈₀ 및 A₂₆₀/A₂₃₀ 비율로 확인하였다. 분석을 위해 소정의 DNA를, 전술한 바와 같이, 0.1N HCl의 최종 농도에서 4시간 동안 90℃에서 배양하여, 가수분해하였다. 이로써, > 90% 회복률로 BPDE-DNA 부가물로부터 테트롤(도 3)이 유리되었다. 주입용 가수분해물의 부피는 5-10 μg DNA을 함유하여 700 μl로 하였다.

BPDE-N ² -dG 부가물 농도의 측정. 내부 표준[34]으로 r-7,c-9,t-8,t-10-테트라하이드록시-7,8,9,10-테트라하이드로벤조(아)피렌 (BP-테트롤 Il-l)을 사용하여, 전술한 바와 같이 [32,33], HPLC-FD로 부가물 농도를 측정하였다. 10% MeOH로 평형화시키고, 20분간 12 ml 10% MeOH로 세정한, 5 μm C₁₈ 역상 물질 (뉴클레오실 100) 함유 라텍스 프리-컬럼 모듈 (HD-Germany) 상에 가수분해물을 올려 놓았다. 이어서, 프리-컬럼을 Valco Instruments 스위치 밸브로 켜서, 4.6 mm x 25 cm의 5 μm C₁₈ 역상 (뉴클레오실 100) 분석 컬럼 (Alltech GmbH, Unterhaching, 독일)으로 흐르게 했다. 가수분해로 얻어진 산물을 다음의 MeOH/H₂O 농도 구배로 용출하였다: 50%, 0-17 분; 50 내지 60%, 17-32 분; 60%, 32-42 분; 60 내지 100%, 42-57 분. BP 테트롤의 잔류 시간은 다음과 같다: BP 테트롤 I-1 (트랜스-안티-BP-테트롤) (35.2 분); BP-테트롤 II-l (트랜스-신-BP-테트롤), 내부 표준 (36.9 분); BP 테트롤 II-2 (시스-신-BP-테트롤) (42.3 분). 344 nm의 여기 파장 및 398 nm의 방출 파장에서 형광을 측정하였다. MCF-7 시료에 대한 각 분석에서 BP 테트롤 II-l의 생성이 검출되지 않았기 때문에, 상대적인 잔류 시간을 검증하는데 BP 테트롤 II-l를 내부 표준으로 (각 HPLC 분석에 2 pg 첨가됨) 사용하였다. 검출 한도는 BP 테 트롤 I-1 및 BP-테트롤 II-l 0.5 pg였다. MCF-7 시료의 분석 직전에 분석한, 확증된 BP-테트롤 표준의 형광 피크 면적으로부터 도출한 표준 곡선을 이용하여, 각 BP-테트롤의 수준을 측정하였다. (+)-안티-BPDE-DNA 부가물의 가수분해 이후에, BP-테트롤-I-1가 유도되어 검출되었다. (-)-안티-BPDE-dG가 가수분해되면, BP-테트롤 I-2를 형성하지만, 이것은 불안정하여 BP-테트롤 I-1로 전환된다 (도 3) (38). 따라서, 생성된 (-)-안티-BPDE-dG의 수준은 HPLC 분석에서 확인된 BP-테트롤 I-1의 양으로 측정하였다. DNA와 반응하는 BPDE가 일차적으로 BPDE-N²-dG (7)를 생성한다는 발견에 기초하여, BP-테트롤-I-1 수준은 BPDE-N²-dG의 수준에 상당하는 것으로 가정하였다. MCF-7 DNA에 결합하는 BPDE의 수준은 이중으로 정량하였다. 부가물의 수준은 1 pmol/mg DNA / 3.125 = 10⁶ 뉴클레오티드 당 1 부가물의 식으로부터 계산되었다. HPLC 분석은 정량적으로 재생산가능하며, 2가지 분석 간의 변화도는 5%보다 낮았다.

BP에 의한 돌연변이 기전은 충분히 잘 정의되어 있으며, 암 발달에 대한 특정 유전적 사건과 발암원 노출 ("결정적 증거") 간의 인과적인 특성을 정립하는데 있어, "유전자 발현 패턴(molecular signature)"으로 사용된다. 이러한 "BP 유전자 발현 패턴"은, 인간 폐암의 원인으로 담배 연기를 정확히 지목하고, 담배 연기를 최소화하거나 예방적인 수단을 도입하기 위한 특정 전략들을 만드는데, 중요한 관련성을 가진다. 암 화학예방법에서 사용되는 특정 물질들은, DNA, 돌연변이, 종양 촉진 및/또는 종양 진행에 대한 발암원의 손상을 저해함으로써, 작용하는 것으 로 보인다.

본 발명에서는, BP-7,8-디올로부터, 인간 세포에서 안정한 DNA 부가물을 생성할 수 있는 BPDE로 생체변환하는데 있어서, CS의 상대적인 역할을 조사하였다. 다양한 연구들에서, 안정한 PAH-DNA 부가물이 뉴클레오티드의 잘못된 삽입 또는 결실로 인해 돌연변이를 일으킬 수 있는 것으로 입증되었다. CS는 현재까지 4800개로 확인된, 유기 및 무기 화합물 모두를 포함하는 복합 화학 조성물의 에어로졸이다. 연기의 증기 상 및 미립자 상 모두가 자유 라디칼을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 가스 상 라디칼은 일반적으로 수명이 짧은 반면 미립자 상의 라디칼은 상대적으로 안정하며, 하이드로퀴논, 세미퀴논, 퀴논 복합체로 구성되고, 이 복합체는, 분자적 산소를 감소시켜, 수퍼옥사이드를 생성하고, 궁극적으로는 수소 퍼옥사이드 및 하이드록실 라디칼을 형성할 수 있는 활성 산화환원계이다. 또한, 적어도 60개의 다른 CS 발암원이 종양 개시 및 촉진에 관련되었다; CS에 포함된 가장 강력한 발암 물질은 BP 및 NNK (4-(메틸니트로스아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논)이다.

DNA 부가를 수반하는 무세포 시스템(Cell-Free System)을 이용한, (+)-안티-BPDE-dG에 대한 담배의 효과.

담배 연기로부터 생성된 활성 산소 의존적 BPDE-dG의 생성 기전을 밝히기 위하여, DNA 부가를 수반하는 시험관내 무세포 시스템에서 이 부가물을 관찰하였다. 가스상 및 타르 담배 연기 라디칼을 포함하는 CSS 용액은 (+)-BP-7,8-디올의 존재 하에서 DNA와 즉각적으로 반응하였다 (상기 프로토콜 참조). 이 시험 결과는, CS 가 (+)-BP-7,8-디올을 (-)-안티-BPDE로 산화시킨다는 것, 바꾸어 말하면 (-)-안티-BPDE-dG 부가물을 형성한다는 것을 보여준다. (-)-안티-BPDE-dG의 양은 직선적이고 용량 의존적으로 증가하였다 (도 2 참조).

이전에, H₂O₂ 및 O₂ ^-와 같은 과량의 활성 산소가, PBS 내에 포집된 담배 연기로부터 생성된다는 것이 확인되었다. 담배 연기로부터 생성된 이러한 활성 산소는 (-)-안티-BPDE-dG의 생성을 초래할 수도 있다. 이것을 증명하기 위해, 생성된 (-)-안티-BPDE-dG에 대한 카탈라제 및 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD)의 효과를 조사한 결과, 두가지 효소 모두가 부가물의 생성을 저해한다는 점이 확인되었다. 불활성 카탈라제는 효과가 없었다 (표 1). 이러한 결과로부터, 본 발명자는, 담배 연기가 (+)-BP-7,8-디올을 산화시켜, (-)-안티-BPDE-dG를 생성하며, 그러한 능력은 주로 담배 연기로부터 생성된 산소의 활성에 의해 설명될 수 있는 것으로 결론내렸다.

(+)-BP-7,8-디올로 처리한 MCF -7 세포에서 생성된 (-)- 안티 - BPDE - dG 부가물에 대한 담배 연기의 효과.

BP-7,8-디올로부터 BPDE로의 대사에 참여하는 2가지 독립적인 경로를 도 3에 나타내었다. (+)-에난티오머의 시토크롬 p450 의존적 대사는 우선적으로 (+)-신-BPDE을 생성하는 반면, 과산화물 (예컨대, 지질 과산화물)과 결합된 햄(haem)-함유 단백질이 연루된 경로는 우선적으로 (-)-안티-BPDE를 생성한다. 한편 (-)-BP-7,8-디올은 2가지 경로를 통해 대사되어, BP의 최종 형태인 (+)-안티-BPDE 및 (-)-신- BPDE를 생성할 수 있다. 각각 안티- 및 신-BPDE 유래의 테트롤은 본 조건 하에서 명백히 분리되기 때문에, 별개의 경로는 HPLC 분석에 의해 구별될 수 있다.

DNA와 함께 (-)-안티-BPDE-dG 부가물을 형성하는 (-)-안티-BPDE의 생성을 초래하는, (+)-BP-7,8-디올의 담배 연기 의존적 에폭시화의 역할을 더욱 연구하기 위하여, 인간 유방암 세포주 MCF-7을 사용하였다. (+)-BP-7,8 디올의 활성에 대한 담배 연기 ROS의 효과를 확인하기 위한 목적으로 MCF-7 세포를 이용한 이유는, 이들 세포가 거의 과산화물 활성을 가지지 않기 때문이다. 이 세포를, ROS 및 CYPs 의존적 경로로 형성된 부가물을 구별할 수 있는 입체화학적 프로브인 (+)-BP-7,8-디올로 처리하였다 (도 3). 각각 (-)-안티-BPDE-dG 및 (+)-신-BPDE-dG 유래의 BP-테트롤 I 및 BP-테트롤 II에 대응되는 크로마토그램에서 2개의 상이한 피크가 관찰되었다 (참고 32-34). 담배 연기는, BP-테트롤 II의 형성으로 측정된 (+)-신-BPDE-dG 부가물의 CYPs 의존적인 생성을 감소시켰고, (-)-안티-BPDE-dG의 ROS 의존적인 생성을 직선적이고 용량 의존적으로 증가시켰다(도 4a). 상기 감소 역시 용량 의존적이며, DNA 부가물의 역수는 담배 연기 농도에 대해 직선적으로 증가하였다(4b). (+)-신-BPDE-dG의 CYPs 의존적 형성 및 (-)-안티-BPDE-dG 부가물의 형성 증가에 대한 CS의 저해 효과는, (-)-안티-BPDE-dG 부가물의 형성 시 담배 연기로부터 생성되는 산소의 역할을 확인시켜 준다.

다른 연구들에서, 유도된 CYPs 활성이 산소 부하에 의해 저하되는 것으로 나타났다. 그러한 현상의 근원이 되는 기전은 시토크롬 P4501A1 유전자의 하향조절일 수 있다. 과산화물의 활성이 거의 나타나지 않으면, "스트레스" 상태의 MCF 세 포가 DNA 손상 증가 및 복구능 감소를 초래할 수 있다. 결과적으로 BP-7,8-디올 활성과는 무관하게 BPDE-DHA 부가물이 증가될 수 있다.

BP로 처리한 세포에서 형성된 BPDE-dG 부가물에 대한 담배 연기의 효과

MCF-7 세포 배양물을 대상으로 한 이전 연구에서, 이들 세포가 유도가능한 P4501B1 및 P4501A1 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. BP의 P450 촉매 대사적 전환의 존재 및 MCF-7 세포에서 검출가능한 과산화물 활성의 부재는, 인간 세포 배양물에서 BP 활성에 대한 담배 연기 산소 라디칼의 역할이 평가되도록 하였다. MCF-7 세포는, (-)-BP-7,8-디올을 형성하고 그 결과 (+)-안티-BPDE-dG을 형성하는, BP의 대사 활성에 대하여, 높은 CYPlAl 효소 활성을 가진다 (도 1). 6시간째 부가물 형성의 수준은 노출한지 12시간 및 24시간 이후에 관찰된 수준에 비해 현저히 낮았다. 6시간 동안 2.5 μM BP로 처리한 후에는 mg DNA 당 약 2000 pg 부가물이 형성되었지만, 12시간 및 24시간 후에는 각각 mg DNA 당 11000 pg 및 20000 pg보다 많은 부가물이 존재하였다 (윌콕슨 순위합 검정(Wilcoxon Rank Sum Test)에 따르면 p=0.0022).

상기 세포를 12 및 18시간 동안 BP로 처리하여, ROS의 기질인 (-)-BP-7,8 디올의 형성을 유도하였다. (+)-BP-7,8-디올을 전구물질로 한 HPLC 분석에서 신-BPDE으로부터 유도된 BP-테트롤 II의 부재는, (-)-BP-7,8-디올의 선택적 형성을 간접적으로 확인시켜 준다 (도 3). 그 후 세포를 BP와 함께 담배 연기의 CSS로 2시간 동안 노출시켰다. HPLC 분석 결과, (+)-안티-BPDE-dG 유래의 BP-테트롤 I에 상응하는 크로마토그램 상에는 하나의 피크만이 관찰되었다. CSS 처리된 세포와 비 처리된 세포 (대조군) 간의 차이는 도 5에 나타내었다. 전술한 바와 같이, 본 연구에서 사용된 세포주는 CS에 의한 산소 부하 후에도 CYPlAl 발현을 감소시키는 능력을 보유하였다. 시토크롬 P450의 억제는 (-)-BP-7,8-디올 및 (+)-안티-BPDE에 대한 BP의 활성을 저하시키는 것으로 생각된다. 따라서 CS에 따른 차이가 커지는 것은, CS로부터 생성된 ROS에 의해 (-)-BaP-7,8 디올의 대사가 증가되기 때문이다. 윌콕슨 순위합 검정에 따르면 각각 14시간 및 20시간 동안 CS 대 대조군으로 처리한 경우 p=0.0022이다. 최근에 인간 폐암 기관지 상피세포의 개시에 "결정적인" 것으로 간주될 수 있는, BPDE-dG 부가물을 형성하는 인간 기관지 상피세포에서 BP에 의한 DNA의 극적인 손상이 발생하였다. 따라서, 담배 연기에서 생성되는 활성 산소종은 기관지 상피세포에서 이 "결정적인" 부가물의 형성에 중요한 역할을 담당할 수 있다 (도 1).

BPDK-dG 부가물의 형성에서 로즈마리 추출물 함유 필터의 효과.

로즈마리 (Rosmarinus officinalis Labiatae) 허브 및 오일은 원하는 향미와 고 항산화 활성을 목적으로, 향신료 및 향미제로서 식품 가공에서 통상적으로 이용된다. 로즈마리 추출물, 카르나솔 또는 우르솔산(ursolic acid)을 마우스 피부에 국소적으로 적용하면, 표피 DNA에 대한 벤조(아)피렌의 공유 결합, 7,12-디메틸벤즈(아)안트라센(DMBA)에 의한 종양 개시, TPA-유도 종양 촉진, 오르니틴 데카르복실라제 활성 및 염증이 저해된다. 로즈마리 추출물은 촉진 상뿐만 아니라 개시 상에서도 효과적인 것으로 증명되었다. 로즈마리 추출물, 카르노스산(carnosic acid) 및 카르노솔은 I상 효소인 CYP 450 활성을 강하게 저해하며, II상 효소인 글 루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)의 발현과 퀴논 환원효소의 활성을 유도한다. 카르노솔은 활성 마크로파지에서 산화질소(NO)의 생성을 저해한다. 항산화 특성이 그들의 보호 작용의 기계적인 기초를 이루는 것으로 여겨진다.

담배 연기에서 자유 라디칼 및 활성 산소종을 제거할 목적으로, 소량의 로즈마리 분말을 표준 필터에 포함시켰다 (재료 부분 참조). 로즈마리 추출물을 포함한 필터에 의해 유도된 농축물에서 자유 라디칼의 감소는, LC-ESI-MS/MS를 이용한 스핀 트랩 (TMPO)으로 CSS의 하이드록실 라디칼 함량을 측정함으로써 평가되었다. 흡연 조건하에서, 하이드록실 라디칼이 30% 감소한 것으로 관찰되었다. 첨가물이 없는 표준 Marlboro 필터와 비교하여 담배 연기 내 자유 라디칼 수준이 감소된 상기 필터의 효능에 기인하여, 표준 필터와 비교하여 상기 필터를 통과하였을 경우, MCF-7 세포를 사용한 BPDE-dG의 형성에 대한 CS 효과를 비교하였다.

MCF-7 세포를 BP로 처리한 경우, 도 6에 나타난 것과 같은 결과가 얻어졌다. 2그룹의 시험이 수행되었다 (A 및 B). 세포를 각각 12시간 및 18시간 동안 BP로 처리한 후, 추가 2시간 동안 BP와 함께 2개의 필터 유래의 CSS로 처리하였다 (실험안 1). 상기 추가 2시간 동안 부가물의 증가에 따른 CYPs를 평가하기 위하여, 각 그룹에 대해 2개의 대조군을 사용하였다 : 그룹 A에 대해 12 및 14시간, 그룹 B에 대해 18 및 20 시간. 표준 필터 유래의 CSS의 경우, 14 및 20시간동안 얻어진 결합 수준이 2배였다.

그러나, 로즈마리 필터는 표준 필터에서 얻어진 증가 수준을 2 그룹에서 70% 보다 많게 방해하였다 (도 6). 결과적으로 변형된 필터 스카벤저인 ROS는 (-)-BP- 7,8-디올의 활성을 감소시킨다 (도 3). 자유 라디칼의 환원 이외에도, 로즈마리 분말은 BPDE-dG 형성을 감소시키는 다른 기전을 가지고 있을 수도 있다.

또한 전체 로즈마리 추출물 (6 μg.ml^-1)을 사용하면, 인간 기관지 상피세포 (BEAS-2B)에서 1.5 μM BP로 공-배양한지 6시간 후에, CYPlAl 활성 및 DNA 부가물의 형성이 80%까지 저해된다. 따라서 자유 라디칼의 양을 감소시켜 결정적인 발암성 부가물의 형성을 감소시키는 필터의 사용은, 중독 흡연자에게 매우 유익하다.

그러므로 본 발명에 따른 로즈마리 담배 필터는, 기관지 상피세포에서 BPDE-dG를 감소시키는 것을 목적으로 하는 화학예방적 프로그램에서 장래성 있는 후보 물질이 된다.

본 발명의 상기 기재는 다양한 변형, 변경 및 적용이 가능하며, 청구의 범위에서 청구되는 발명의 균등물의 범위 내에서 동일한 것을 포함하는 것으로 해석될 것이다. 가장 명백한 변형의 예로는 다양한 겔 물질을 전기반응성 조성물로서 사용하는 것이다.

따라서, 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않는 범위에서 상기 방법(공정)의 실시에 대한 변경이 이루어지기 때문에, 상기 기재로부터 명백한 것들로부터 전술한 목적이 효과적으로 달성될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 모든 실시예는 예시적 목적으로 기재된 것으로 해석되어야 하며 결코 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아닌 것으로 이해될 것이다.

또한 하기 청구의 범위는 본 명세서에 기재된 모든 포괄적이고 고유한 특성 및 언어적인 문제로 간과된 본 발명의 범위에 포함되는 모든 내용을 포함하는 것으로 이해된다.

Claims

필터가 있는 담배를 피울 때 생성되는 담배 연기로부터 유래된, 인간 폐 내 벤조(아)피렌 디올 에폭시드-dG (BPDE-dG) 부가물을 감소시키는 방법으로서,

꿀풀과(Labiatae) 식물의 추출물로 포화된 필터를 통해 상기 담배 연기를 통과시키는 단계를 포함하며, 상기 추출물은 폴리페놀 화합물 또는 그의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 식물은 로즈마리인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 추출물은 알콜성 용매 또는 수성-알콜성 용매로 추출하여 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
필터가 있는 담배를 피울 때 생성되는 담배 연기로부터 유래된, 인간 폐 내 벤조(아)피렌 디올 에폭시드-dG (BPDE-dG) 부가물을 감소시키는 방법으로서,

적어도 하나의 폴리페놀 화합물 또는 그의 유도체를 포함하는 혼합물로 포화된 필터를 통해 상기 담배 연기를 통과시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서,

상기 혼합물은 카르노솔, 로즈마놀(rosmanol), 로즈마린산 및 카르노스산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리페놀 화합물 또는 그의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서,

상기 혼합물은 카르노솔, 카르노스산, 로즈마린산 및 로즈마놀을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,

상기 혼합물은 카르노스산 또는 카르노솔을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 필터는 0.5 g 내지 0.1 mg의 적어도 하나의 폴리페놀 화합물 또는 그의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 필터는 0.01 g의 적어도 하나의 폴리페놀 화합물 또는 그의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 적어도 하나의 폴리페놀 화합물 또는 그의 유도체는 고분자 담체에 결합하거나, 마이크로캡슐 매트릭스에 포함되거나, 필터의 섬유에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.