EA015759B1

EA015759B1 - Способ профилактики онкологических заболеваний у курящих

Info

Publication number: EA015759B1
Application number: EA200970484A
Authority: EA
Inventors: Имам Имами
Original assignee: Биозинтек
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2011-12-30
Also published as: NO20091844L; CN101641023A; CA2668939A1; US20110155157A1; BRPI0622154A2; EP2094120A1; JP2010509913A; ZA200903381B; WO2008060286A1; AU2006350735A1; KR20090096444A; KR20130103834A; EP2094120A4; EA200970484A1

Abstract

Изобретение относится к сигаретному фильтру, содержащему экстракт розмарина, и способу снижения повреждения ДНК, вызванного различными вредными веществами в сигаретном дыме. Более конкретно данное изобретение относится к применению указанного фильтра для снижения повреждения ДНК, вызванного бензо(а)пиренами в человеческих клетках снижением аддукта бензо(а)пирендиолэпоксида-dG (BPDE-dG) в легких человека.

Description

Изобретение относится к сигаретному фильтру, содержащему экстракт розмарина, и к способу снижения повреждения ДНК, которое вызвано различными вредными веществами в сигаретном дыме. Более конкретно данное изобретение относится к применению указанного фильтра для снижения повреждения ДНК, вызванного бензо(а)пиренами, в человеческих клетках снижением аддукта бензо(а)пирендиолэпоксида-бО (ВРИЕ-бО) в легких человека.

Предпосылки изобретения

Аддукт бензо(а)пирендиолэпоксида-бО (ВРИЕ-бО) в легких человека концентрируется в бронхиальных клетках. Сейчас этот аддукт признают критическим случаем в онкогенезе бензо(а)пиренами. Сигаретный дым содействует образованию ВРИЕ-бО в значительной степени.

Использование табака, несомненно, является наиболее широко распространенной взаимосвязью между воздействием известных канцерогенов и смертью от рака и поэтому является моделью для понимания механизмов индукции рака. Бензо(а)пирен (ВР) является высококанцерогенным полициклическим ароматическим углеводородом (РАН), который находится в выбросах выхлопных газов, приготовленной на углях пище и в небольшом количестве в сигаретном дыме, типично, менее чем 10 нг на сигарету. ВР является одним из более 60 канцерогенов в сигаретном дыме, который включен в этиологию рака легких. Он метаболически активируется в бензо(а)пирен-7,8-диол-9,10-эпоксид (ВРИЕ), который реагирует с ДНК преимущественно в положении №-гуанина с получением первоначально повреждений №-гуанина, например аддукта бензо(а)пирен-7,8-диол-9,10-эпоксид-№-деоксигуанозина (ВРИЕ-бО). Окончательно установили присутствие аддуктов ВРИЕ-ДНК в человеческих тканях, и аддукт ВРИЕ-бО концентрировали непосредственно в бронхиальных клетках и, таким образом, его непосредственно связывали с инициированием рака легких человека.

Трава и масло розмарина (Ролпаппих οΓΓίοίηαΙίδ ЬаЫа1ае), экстракты розмарина, карнозную кислоту и карнозол обычно применяют как специи и ароматизирующие вещества в пищевой промышленности изза их приятного аромата и высокой антиоксидантной активности.

Тем не менее, до данного изобретения не признавали, что применение экстракта розмарина в сигаретном фильтре будет снижать повреждение ДНК, вызванное в человеческих клетках именно бензо(а)пиренами, аддуктом бензо(а)пирендиолэпоксида-бО (ВРИЕ-бО) в легких человека, который сейчас признали критическим случаем в онкогенезе бензо(а)пиренами.

Краткое описание изобретения

ВР, как рассматривают, является существенным канцерогеном, вовлеченным в индукцию рака легких у курильщиков, и, как показано в данном исследовании, активные формы кислорода значительно способствуют образованию опасного онкогенного аддукта в легких. Несмотря на то что критически важно как предупредить пристрастие к табаку, так и увеличить эффективность прекращения курения и программ снижения, эти подходы оказали незначительное влияние. Предупреждение образования аддукта ВРИЕ-бО является единственным подходом, который может привести к снижению риска рака легких у склонных к курению.

Данное изобретение относится к сигаретному фильтру, содержащему экстракт розмарина, и к способу снижения повреждения ДНК, которое вызвано вредными веществами в сигаретном дыме. Более конкретно, данное изобретение представляет применение указанного фильтра для снижения повреждения ДНК, вызванного бензо(а)пиренами, в человеческих клетках с помощью снижения аддукта бензо(а)пирендиолэпоксида-бО (ВРИЕ-бО) в легких человека.

Обнаружили, что количество (-)-анти-ВРИЕ-бО аддукта линейно увеличивается с концентрацией сигаретного дыма в присутствии (+)-ВР-7,8-диола. Каталаза и супероксиддисмутаза ингибируют его образование на более чем 80%. Когда клетки МСЕ-7 обрабатывают на протяжении 2 ч (+)-ВР-7,8-диолом, сигаретный дым усиливает зависимое от дозы образование (-)-анти-ВРИЕ-бО и снижает зависимое от ЦОГ (цитохром Р450) образование (+)-§уп-ВРИЕ аддукта.

Клетки обрабатывали в течение одного дня бензо(а)пиреном и затем воздействовали на них в течение 2 ч сигаретным дымом. В течение этих 2 ч обнаружили, что в два раза увеличилось образование аддукта в клетках, обработанных сигаретным дымом, по сравнению с уровнями в необработанных клетках вследствие активности ЦОГ. Таким образом, обнаружили, что сигаретный дым активирует активными формами кислорода, которые он содержит, второй этап метаболического пути бензо(а)пирена, ведущий к образованию аддукта ВРИЕ-бО.

Сигаретный дым, таким образом, может отвечать за образование опасного онкогенного аддукта в легких.

В итоге, выяснили, что модифицированный сигаретный фильтр, содержащий экстракт розмарина, снижает на более чем 70% уровень аддуктов ВРИЕ-бО сигаретного дыма в клетках МСЕ-7. Полагают, что это открытие является значительным успехом в снижении риска рака легких у постоянных курильщиков.

Краткое описание фигур, схемы и таблицы

Фиг. 1 - основной метаболический путь и связывание ДНК канцерогеном бензо(а)пиреном. Бензо(а)пирен является табачным канцерогеном, который может быть преобразован ферментами ίη νίνο или

- 1 015759 активными формами кислорода до образования ДНК-активных дигидродиолэпоксидов. Стереоселективное образование мутагенного (+)-т-7,1-8-дигидрокси-1-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидро-ВР |(+)-анти-ВРЭЕ| из (-)-ВР-7,8-дигидродиола катализировано зависимыми от цитохрома-Р450 монооксигеназами (Р450) или активными формами кислорода. Последующая реакция этого электрофильного промежуточного соединения с геномной ДНК дает устойчивый аддукт дигидродиолэпоксида с экзоциклической аминогруппой гуанозина. Этот вид повреждения ДНК может преобразоваться в мутации в следующем репликационном цикле, если не происходит восстановление этого аддукта.

Фиг. 2 - результаты, полученные с помощью бесклеточной системы, сопровождающейся аддукцией ДНК: 6 мг ДНК тимуса теленка в 2 мл воды добавили к 5 мл С88 (раствор сигаретного дыма) с разными разбавлениями, и реакция протекала 2 ч при комнатной температуре с (+)-ВР-7,8-диолом (конечная концентрация 3,6 мкМ). ДНК гидролизировали, а высвобожденный ВР-тетрол измеряли, как изложено в разделе Материалы и способы.

Фиг. 3(а) - стереохимия эпоксидации ВР-7,8-диола пероксильными радикалами и цитохромом Р450 до активных форм (анти-ВРЭЕ и хп-ВРЭЕ). которые могут связываться с ДНК, и (Ь) кислотный гидролиз ДНК до ВР-тетролов, определенный в данном исследовании. Гидролиз (-)-анти-ВРЭЕ-бС и (-)-купВРЭЕ ведет к образованию ВР-тетрола 1-2 и ВР-тетрола ΙΙ-1, которые, тем не менее, неустойчивы и преобразовываются в ВР-тетрол Ι-1 и ВР-тетрол ΙΙ-2.

Фиг. 4 - результаты получены с помощью клеток МГС-7. 10х10⁶ клеток/150 см² сосуде при общем объеме 20 мл обрабатывали в течение 2 ч только (+)-ВР-7,8-диолом (0,2 мкМ) или в присутствии разных разбавлений С88, ДНК выделяли, гидролизировали и измеряли освобожденные ВР-тетролы, а уровни связывания определяли, как изложено в разделе Материалы и способы. На хроматограммах наблюдаются два отдельных пика, соответствующих ВР-тетролу Ι и ВР-тетролу ΙΙ, полученных от (-)-анти-ВРПЕ6С и (+)-8уп-ВРЭЕ-бС соответственно (ссылки 32-34). Значения представляют собой средние значения плюс стандартное отклонение двух независимых экспериментов с 3-4 циклами ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). На фиг. 4а, верхняя часть, показано увеличение (-)-анти-ВРЭЕ-бС аддуктов с разбавлением С88; на фиг. 4Ь, нижняя часть, показано увеличение 1/(+)-8уп-ВРЭЕ-бС аддукта с разбавлением С88.

Фиг. 5 - связывание ВРЭЕ-бС в клетках МСГ-7 после воздействия ВР 2,5 мкМ или ВР 2,5 мкМ + С8 (сигаретный дым) раствора (разбавленного в 20 раз) за указанное время. Раствор сигаретного дыма добавляли в течение 2 ч при воздействии ВР (схема 1). Анализ ВРЭЕ-бС выполнили, как описано в разделе Материалы и способы. Значения представляют собой средние значения двух независимых экспериментов с 4-6 циклами ВЭЖХ плюс стандарт. Значение ВРЭЕ-бС равно 11,7±0,5 (среднее значение ± среднеквадратическое отклонение) мкг аддуктов на мг ДНК после 12 ч инкубации и 17,6±0,4, 26,1±0,9 после 18 ч и 24 ч соответственно. Самопроизвольный метаболизм ЦОГ увеличивал эти значения до 17,2±0,5, 27,8±0,8 и 42,2±1,0 2 ч после начального момента времени в 12, 18 и 24 ч соответственно. Добавление раствора сигаретного дыма (С88) вызывало намного более резкое изменение на протяжении того же двухчасового периода, что привело к окончательному значению ВРЭЕ-бС 36,9±1,2, 56,7±0,9 и 80,2±1,2 (среднее значение ± среднеквадратическое отклонение) мкг аддуктов на мг через 12, 18 и 24 ч соответственно.

Фиг. 6 - связывание ВРЭЕ-бС в клетках МСГ-7 после воздействия 2,5 мкМ ВР или ВР 2,5 мкМ + С8 раствора, полученного из стандартного фильтра и фильтра, содержащего экстракт розмарина. Раствор сигаретного дыма добавляли последние 2 ч воздействия на ВР в течение указанного времени (схема 1). Анализ ВРЭЕ-бС выполнили, как описано в разделе Материалы и способы. Циклы ВЭЖХ показывают, что на хроматограмме есть только один пик, который соответствует ВР-тетролу Ι, происходящему из (+)анти-ВРЭЕ-бС. Значения представляют собой средние значения двух независимых экспериментов с 4-6 циклами ВЭЖХ плюс стандарт.

Схема 1 - клетки МСГ-7 обрабатывали ВР на протяжении 12 и 18 ч, а потом сигаретным дымом еще 2 ч вместе с ВР (эксперименты А и В соответственно). Целью данного эксперимента являлась активация при разном времени ВР для получения ВР-7,8-диола и после обработки клеток сигаретным дымом и продолжение этого эффекта последние 2 ч. Контрольный образец представляет собой клетки, обработанные только ВР.

- 2 015759

Таблица 1 Влияние поглотителей на уровень ΒΡΌΕ-άΟ, вызванный сигаретным дымом в бесклеточной системе

Обработка	% ΒΡΌΕ-άΟ относительно стандарта С8
Стандарт С88	100
+супероксиддисмутаза 8ΟΌ (20 мкг)	16
+ каталаза (4 мкг)	12
+ инактивированная каталаза (4 мкг)	100
Отфильтрованный на розмарине С88 вместо стандартного С88	42

Система стандартного С88 включает 2 мл ДНК тимуса теленка (3 мг/мл), 600 мкл 30 мМ (+)антиΒΡΌΕ и 5 мл разбавленного ФБС С88 (1:19) при рН 7,4, ее инкубировали при комнатной температуре 2 ч. Каждое значение получали из трех независимых экспериментов, выполненных в двух повторностях. Средняя погрешность составляла приблизительно 12% в каждой повторности эксперимента. Значение ΒΡΌΕ-άΟ стандарта составило 56±6,3 (среднее ± среднеквадратическое отклонение) аддуктов на мг ДНК.

Подробное описание

Курение сигарет причинно связано с большим количеством случаев рака у человека. Использование табака является, безусловно, самой широкораспространенной связью между воздействием известных канцерогенов и смертностью из-за рака и, таким образом, является моделью для понимания механизмов индукции рака.

Бензо(а)пирен (ΒΡ) является высококанцерогенным полициклическим ароматическим углеводородом (РАН), присутствующим в выбросах выхлопных газов, приготовленной на угле пище и в небольшом количестве в сигаретном дыме, обычно менее чем 10 нг на сигарету. ΒΡ является одним из более 60 канцерогенов в сигаретном дыме, который включен в этиологию рака легких. Он метаболически активируется в бензо(а)пирен-7,8-диол-9,10-эпоксиде (ΒΡΌΕ), который реагирует с ДНК преимущественно в Ν²положении гуанина с образованием первоначально повреждений А-гуанина, например аддукта бензо(а)пирен-7,8-диол-9,10-эпоксидЖ-деоксигуанозина (ΒΡΌΕ-άΟ).

Присутствие аддуктов ΒΡΌΕ-ДНК в человеческих тканях было окончательно установлено, и ΒΡΌΕάΟ аддукт концентрировался исключительно в бронхиальных клетках и, таким образом, был вовлечен в инициацию рака легких человека.

Этот канцероген метаболизируется ферментами фазы I до большого количества метаболитов, включая фенолы, ареноксиды, хиноны, дигидродиолы и диолэпоксиды. Обзор метаболического пути ВР, ведущий к образованию (+)-анти-ΒΡ^Ε-άΟ аддукта, представлен на фиг. 1.

Более подробно, окончательный канцероген (+)-анти-ΒΡ^Ε образован из ΒΡ двумя этапами опосредованного цитохромом Ρ450 окисления. Первый этап этого окисления предпочтительно приводит к (-)7,8-дигидро-7,8-дигидробензо(а)пирен[(-)ΒΡ-7,8-диолу]. Диол далее окисляется в первую очередь до высоко мутагенного (+)-^-7,ΐ-8-дигидрокси-ΐ-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидро-ΒΡ [(+)-анти-ΒΡ^Ε]. Многочисленные исследования четко определили [(+)-анти-ΒΡ^Ε] как первичный канцерогенный метаболит ВР, проявляющий повышенную мутагенную активность ίη νίίτο и ίη νίνο. Большинство предыдущих исследований генетического изменения в метаболизме канцерогенов легких направлено на метаболическую активацию различными цитохромами Ρ450, несмотря на то, что экспрессия этих ферментов в легких, как правило, низкая. Активация ΒΡ-73-диола эпителиальными клетками легких не вызывается исключительно классическими процессами биотрансформации зависимыми от ЦОГ/ΟδΤ, а также включает несколько путей метаболизма кроме ЦОГ. Они включают липооксигеназу, продукты перокисления липидов и зависимые от пероксидазы пути метаболизма, СОХ-1 и СОХ-2.

Увеличение свидетельств позволяет предположить причинное значение свободных радикалов табака в индукции рака легких у курильщиков. Каждая затяжка дыма образует более чем 10 триллионов свободных радикалов, присутствующих в дыме, которые могут содействовать как образованию опухоли, так и стимуляции различных форм рака человека, вызванных повторными воздействиями КО8 (активные формы кислорода) на клеточные макромолекулы. Предполагают, что главные формы свободных радикалов являются равновесной смесью семихинонов, гидрохинонов и хинонов. Предложено, что этот свободнорадикальный комплекс вызывает окислительно-восстановительный цикл, который образует анион супероксида из молекулярного кислорода и приводит к образованию пероксида водорода и гидроксильного радикала. Эти активные формы вызывают одноцепочечный разрыв в ДНК и однонитевый разрыв ДНК в культивируемых клетках грызунов и человека. Связанный с хиноном окислительно-восстановительный цикл также может быть включен в данные эффекты; гидрохинон и катехол, как полагают, играют главную роль.

Обнаружили, что сигаретный дым может активизировать образованными кислородом радикалами второй этап метаболического пути ВР, ведущий к образованию аддукта ΒΡΌΕ-άΟ, вероятно, метаболиз

- 3 015759 мом образованного в клетках (-)-ВР-7,8-диола в (+)-г-7,!-8-дигидрокси-!-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидроВР |(-)-ан1и-ВРОЕ| (фиг. 1).

Также обнаружили, что эта активация по меньшей мере в два раза выше, чем полученная с механизмом ЦОГ.

Кроме того, обнаружили, что КО8 из сигаретного дыма может частично отвечать за увеличенное образование ВРЭЕ-άΟ аддукта.

Также обнаружили, что фильтр, содержащий сформулированный порошок розмарина, может значительно снизить уровень ВРЭЕ-άΟ из-за радикала, образованного кислородом в С8, и что это открытие можно применять для сигаретных фильтров, которые снижают образование канцерогенного аддукта ВРЭЕ-άΟ в бронхиальных эпителиальных клетках.

Данное изобретение обеспечивает (ί) средство для определения относительной доли ΚΌ8 в сигаретном дыме в активацию ВР-7,8-диола по сравнению с цитохромом Р450; (й) средство для установления вызывает ли ΚΌ8 сигаретного дыма канцерогенный процесс путем содействия метаболизму ВР-7,8диола, приводя к увеличению образования опасного ВРЭЕ-бС в легких; (ш) фильтр, содержащий поглотитель свободных радикалов сигареты для существенного снижения образования ВРЭЕ-бС; и (ίν) применение указанного фильтра для значительного снижения функции ВРЭЕ-бС аддуктов.

Примеры

Химикаты. Протеиназу К (ЕС 3.4.21.64, из ТгШгасЫиш а1Ьиш) закупили у 81дша (8ΐ. Ьошз, МО), РНКазу Т1 (ЕС 3.1.21.3, из АзрегдШиз огухас) и РНКазу (без ДНКазы, гетерогенная смесь рибонуклеаз из бычьей поджелудочной железы) получили у Воейпидег Маппйе1ш (Маппйе1ш, Оегшаиу). Фосфатносолевой буфер (ФСБ) содержал 3,0 мМ КС1, 1,5 мМ КН₂НРО₄, 140 мМ ЫаС1, 8,0 мМ Ыа₂НРО₄, (рН 7,4), воду, отвечающую требованиям ВЭЖХ, МеОН, эфир и этанол для спектроскопии от Е. Мегск, ЭагтЛаФ. Оегшаиу. Если не заявлено иное, другие химикаты были закуплены у 8щта (Ь 'Ше б'АЬеаи Сйезиез, Егаисе), Воейпидег 1идеШе1ш (Не1бе1Ьегд, Оегшаиу) и Воейпидег Маиийет (МаииНет, Оегшаиу). Все ВР стандарты метаболитов получили из Ыа!юиа1 Саисег тейШе, Сйешюа1 Сагсшодеи ВеЕегеисе 8!аийагй ВероДЮгу МПтеез! Везеагсй ЕъШШе (Каизаз Сйу, МО).

Аппаратура. Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили при помощи изократичных и градиентных систем Нете1ей-Раскагй высокого давления (^аИЬоги, Оегшаиу), оснащенных детектором флуоресценции 81ιίιηηάζιι ВЕ-10АХЬ, связанным с интегратором Нете1ей-Раскагй.

Получение сигаретного дыма/раствора ФСБ (С88). Курение выполняли согласно Ргуог е! а1. без Кембридж фильтра. По существу, тот же способ сбора дыма ранее применяли Ыакауаша е! а1. Дым от одной горящей 8 см сигареты (Маг1Ього) в течение 3,8 мин при помощи постоянного вакуума, полученного водяным насосом, барботировали через 10 мл раствора фосфатно-солевого буфера (ФСБ), который захватывает как газообразную фазу, так и химические вещества смолы сигаретного дыма. Поскольку никаких не растворимых в воде соединений смолы не присутствовало на стенках промывалок, основная часть растворимых в воде соединений дыма одной сигареты содержалась в 10 мл раствора ФСБ. Этот водный раствор, называемый раствором сигаретного дыма (С88), непосредственно реагировал с экзогенной ДНК, или его добавляли в клетки МСЕ-7 в культуре в присутствии бензо(а)пирена или его непосредственного метаболита (+)-ВаР-7,8-диола. Применяли различные разбавления С88 (см. ниже).

Включение порошкообразного экстракта розмарина в сигаретный фильтр.

Фильтр обычной сигареты извлекли и в свободное от фильтра место возле самой сигареты ввели 40 мг порошкообразного экстракта розмарина. После этого фильтр установили заново. Эффект этого фильтра оценивали масс-спектрометрией. Кратко, сигаретный дым барботировали в органический раствор, содержащий аддукт спиновой ловушки 3,3,5,5-тетраметил-1-пирролин-Ы-оксида (ТЫРО). Затем определяли количество аддукта гидроксильного радикала с помощью жидкостной хроматографии, массспектрометрии. При используемых условиях курения наблюдалось 30% уменьшение гидроксильного радикала.

Реакция экзогенной ДНК с (+)-ВР-7,8-диолом в присутствии разбавленного раствора сигаретного дыма (С88). 2 мл ДНК тимуса теленка (3 мг/мл) добавили к 5 мл разбавленного в 20 раз С88 и подвергали реакции на протяжении 2 ч при комнатной температуре с (+)-ВР-7,8-диолом (конечная концентрация 3,6 мкМ) согласно следующему уравнению реакции:

ДНК + [(+)-ВР-7,8-диол] + С88 (-)-анти-ВРПЕ-Ы²-йО.

Измеряли уровень образовавшегося (-)-анти ВРЭЕ-йС аддукта (см. ниже). В качестве контроля эксперимент провели без С88.

Условия клеточной культуры и обработка. Человеческую линию клеток карциномы груди МСЕ-7 выращивали в 150-см² матрасе клеточной культуры при общем объеме 20 мл минимальной поддерживающей среды Е-МЕМ, дополненной 10% ЕС8 (фетальная телячья сыворотка), 15 мМ буфера Нерез (N-2гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфоновая кислота) и антибиотиками (200 ед./мл пенициллина, 200 мкг/мг стрептомицина и 25 мкг/мл ампициллина). Клетки выдерживали и обрабатывали при 37°С в атмосфере СО₂ 5%/95% воздуха.

После того как клетки МСЕ-7 покрыли 90% площади поверхности матрасов (через 2-3 дня после

- 4 015759 разъединения слитой культуры), среду заменили 20 мл свежей среды, содержащей 10% сыворотки. Через 24 ч клетки около слитого слоя, например более 90% клеток в фазе 60/61, обработали только ΌΜ8Θ (диметилсульфоксид) или канцерогеном (см. ниже), растворенным в ΌΜ8Θ и сигаретном дыме/ФСБ (С88 см. выше). Конечная концентрация ΌΜ8Θ не превышала 0,1% общего инкубационного объема.

Контрольные образцы, включенные в каждую серию инкубации, обработали только ΌΜ8Θ.

a) Обработка клеток Μ6Ρ-7 (+)-ВР-7,8-диолом и сигаретным дымом. Клетки обрабатывали на протяжении 2 ч только (+)-ВР-7,8-диолом (0,2 мкМ) или в присутствии С88 с разными разбавлениями. (+)ВаР-7,8-диол активировали при помощи РОО°. полученного из С8 и ЦОГ клеток, для образования (-)анти-ВРЭЕ-б6 и (+)-5уп-ВРЭЕ-б6 соответственно. Их уровни определяли при помощи образования ВРтетрола 1-1 и ВР-тетрола ΙΙ-2 (см. ниже и фиг. 3).

b) Эксперименты воздействия времени/дозы на ВР. Для характеристики воздействия времени/дозы на уровни ВР и ВРЭЕ-66 клетки (10х10⁶ клеток/150 см² матрас, общий объем 20 мл) обрабатывали средой, содержащей конечную концентрацию 1,25, 2,5 и 5,0 мкМ, каждые 6, 12, 18 и 24 ч (два матраса/доза/момент времени). ВРЭЕ-66 аддукт, образованный в клетках, увеличивается линейно в зависимости от дозы и времени, что также было показано другими (30). На основании полученных результатов выбрали значение 2,5 мкМ в качестве рабочей концентрации для ВР.

c) Обработка Μ6Ε-7 клеток ВР и сигаретным дымом. Чтобы увидеть эффект концентрации С8, опыт А по схеме № 1 выполнили при различных разбавлениях С88 (1:79; 1:39; 1:19; 1:9 об./об.). На основании результатов, полученных в данном эксперименте I, разбавление 1:19 (об./об.) выбрали как рабочую концентрацию С8. Таким образом, клетки (см. выше Клеточная культура и обработка) обработали ВР (2,5 мкМ) и С88 (разбавление 1:19 об./об.) по схеме 1 (см. фиг. 6 - схема 1).

Все серии инкубации повторили 2-3 раза с двойными образцами. В конце обработки клетки исследовали микроскопически по морфологическим изменениям, затем собрали трипсинизацией с 0,05% трипсин-ΕΌΤΑ (0,05% трипсина, 0,14М ИаС1, 3 мМ КС1, 0,1М Иа₂НРО₄, 1,5 мМ К₂НРО₄, 0,5 мМ ΕΌΤΑ). После добавления равного объема среды, содержащей 10% РС8 клетки центрифугировали при 1000 г, промывали трижды ФСБ и затем дебрис хранили замороженным при -20°С. Жизнеспособность клеток, обработанных ВР и сигаретным дымом или (+)-ВР-7,8-диолом и сигаретным дымом, составляла приблизительно 90% собранных, как определено при помощи метода освобождения трипанового синего. Применяемые дозы не показывали никакой цитотоксичности при измерении с помощью анализа активности лактатдегидрогеназы (набор ЕЫ8А, ВоеЕппдег, ΜаηηЕе^т).

Получение и гидролиз ДНК. Выделение ДНК из дебрисов Μ6Ρ-7 проводили при помощи обработки РНКазой, протеиназой К, метода засаливания (31) и хлороформа. Кратко, дебрисы повторно суспендировали в буфере ΕΌΤΑ-додецилсульфата натрия (8Ό8) [10 мМ Τηκ буфера, 1 мМ ΝτΕΌΤΑ, 1% 8Ό8 (вес./об.), рН 8], инкубировали в течение 1 ч при 37°С с РНКазой Τ1 (2000 ед./мл) и РНКазой А (без ДНКазы; 100 мкг/мл) на шейкере (100 грт). Затем добавили протеиназу К (300 мкг/мл) и инкубацию продолжали в течение ночи при 37°С. После расщепления добавили 6М ИаС1 до конечной концентрации 1М с последующим центрифугированием при 10000 д. ДНК в супернатанте осадили с 2 об. этанола, промыли 70%, 100% этанолом, эфиром, высушили и растворили в 10 мМ ΤγΕ буфере. Снова добавили РНКазу А (100 мкг/мл) и РНКазу Τ1 (2000 ед./мл) и раствор инкубировали при 37°С 1 ч, а затем с протеиназой К (100 мкг/мл) еще 2 ч при 37°С. Раствор экстрагировали один раз с хлороформом, центрифугировали и растворили 1М №1С1. ДНК осадили 2 об. холодного этанола.

Часть ДНК для гидролиза промыли 100% этанолом для удаления несвязанных ВР-тетролов. ДНК, без несвязанных ВР-тетролов, растворили в воде и концентрацию ДНК определяли при помощи спектрофотометрии с длиной волны А₂₆₀ нм. Чистоту устанавили при помощи соотношений при А₂₆₀/А₂₈₀ и А₂₆₀/А₂₃₀. Количество ДНК для анализа гидролизировали, как описано ранее, инкубацией при 90°С в течение 4 ч при конечной концентрации 0,1Ν НС1. Это высвобождает тетролы (фиг. 3) из аддуктов ВРЭЕДНК с >90% восстановлением. Объем изготовленного гидролизата для инъекций был равен 700 мкл, содержащий 5-10 мкг ДНК.

Определения уровня аддукта ВРИЕ-А-б6. Уровни аддукта определяли при помощи ВЭЖХ-ΡΌ, как описано ранее [32, 33], с применением г-7,с-9Д-8Д-10-тетрагидрокси-7,8,9,10-тетрагидробензо(а)пирен (ВР-тетрол ΙΙ-1) в качестве внутреннего стандарта [34]. Гидролизат загрузили в блок предколонки Ьа1ех (НИ-6егтапу), содержащий 5 мкм обратно фазового материала С₁₈ 0ис1ео811 100), уравновесили 10% ΜеОН и промыли в течение 20 мин 12 мл 10% ΜеОН. Затем предколонку переключили посредством клапана переключателя измерительного прибора Уа1со для протекания через 4,6 ммх25 см 5 мкм С₁₈ обратно фазовую аналитическую колонку 0ис1еоы1 100) (А1ЕесЕ 6тЬН, ИШегЕасЕшд, 6егтапу). Продукты, полученные гидролизом, элюировали следующим градиентом ΜеОН/Н₂О: 50%, 0-17 мин; 50-60%, 17-32 мин; 60%, 32-42 мин; 60-100%, 42-57 мин. Время удерживания ВР тетролов составляло: ВР тетрол Ι-1 (1гап8-анти-ВР-тетрол) (35,2 мин); ВР-тетрол ΙΙ-1 (1гап8-8уп-ВР-тетрол), внутренний стандарт (36,9 мин); ВР тетрол ΙΙ-2 (с18-8уп-ВР-тетрол) (42,3 мин). Флуоресценцию оценивали при длине волны возбуждения 344 нм и длине волны излучения 398 нм. Поскольку не определили образование ВР тетрола ΙΙ-1 при сепаратном анализе образцов Μ6Ε-7, его применяли как внутренний стандарт (2 пг добавили в каж

- 5 015759 дый цикл ВЭЖХ) для подтверждения относительного времени удерживания. Предел обнаружения составлял 0,5 пг ВР тетрола 1-1 и ВР-тетрола ΙΙ-1. Уровень каждого ВР-тетрола определяли с помощью стандартной кривой, полученной по площади пика флуоресценции подлинного стандарта ВР-тетрола, который анализировали как раз перед анализом образцов МСЕ-7. Определенный ВР-тетрол-1-1 получен после гидролиза (+)-анти-ВРБЕ-ДНК аддукта. Гидролиз (-)-анти-ВРБЕ-бС приводит к образованию ВРтетрола Ι-2, который, тем не менее, является неустойчивым и превращается в ВР-тетрол Ι-1 (фиг. 3) (38). Таким образом, уровень образованного (-)-анти-ВРБЕ-бО измеряли количеством ВР-тетрола Ι-1, выявленного в циклах ВЭЖХ. В результате выяснили, что ВРБЕ при реакции с ДНК дает в первую очередь ВРБЕ-Ы²-бО (7), полагают, что уровень ВР-тетрол-Ы соответствует этому ВРБЕ-А-бС. Уровень ВРБЕ, что связывается с ДНК МСЕ-7, определяли количественно в двух повторностях. Уровень аддукта рассчитывали по уравнению 1 пмоль/мг ДНК/3,125 = 1 аддукт на 10⁶ нуклеотида. Циклы ВЭЖХ воспроизвели количественно и изменчивость между двумя испытаниями составили менее 5%.

Механизм мутагенеза при помощи ВР достаточно хорошо известен и назван молекулярная сигнатура для установления причинных отличий между определенными генетическими событиями в развитии опухолей и канцерогенным воздействием (дымящееся оружие). Молекулярная сигнатура ВР имеет главное значение для точного определения табачного дыма как причины рака легких человека и для разработки конкретных принципов для минимизации курения табака или для введения мер предосторожности. Специфические средства, применяемые в хемопрофилактике рака, очевидно, действуют путем ингибирования повреждения ДНК канцерогеном, мутагенеза, активации опухолей и/или распространения опухолей.

Объяснили относительную роль С8 на биотрансформацию ВР-7,8-диола до ВРБЕ, который способен образовывать устойчивый аддукт ДНК в клетках человека. Многочисленные исследования показали, что устойчивые аддукты РАН-ДНК могут привести к мутациям через ошибку включения нуклеотидов или делеции. С8 представляет собой аэрозоль сложной химической композиции, содержащей как органические, так и неорганические соединения, из которых пока было идентифицировано только 4800. Известно, что и газообразная фаза, и фаза частичек дыма несет свободные радикалы. В то время как радикалы в газовой фазе в основном быстро распадаются, радикалы в фазе с частичками дыма относительно устойчивы и состоят из гидрохинона, семихинона, комплекса хинона, этот комплекс является активной окислительно-восстановительной системой, которая способна восстанавливать молекулярный кислород до супероксида, что в результате дает перекись водорода и гидроксильные радикалы. Кроме того, по меньшей мере 60 различных канцерогенов С8 были вовлечены в инициацию и развитие опухоли; самым сильным канцерогенным агентом, содержащимся в С8, является ВР и ΝΝΚ (4-(метилнитрозамино)-1-(3пиридил)-1-бутанон).

Влияние сигаретного дыма на (+)-анти-ВРБЕ-бО с применением бесклеточной системы, сопровождающееся аддукцией ДНК. Для объяснения механизма образования ВРБЕ-бО, зависимого от активного кислорода, образованного из сигаретного дыма, искали этот аддукт в бесклеточной системе ίη νίίτο, которая сопровождается аддукцией ДНК. Раствор С88, содержащий газообразную фазу и радикалы смолы сигаретного дыма, реагировал непосредственно с ДНК в присутствии (+)-ВР-7,8-диола (см. протокол выше). Результаты этого эксперимента показали, что С8 может окислять (+)-ВР-7,8 диол до (-)-антиВРБЕ, который, в свою очередь, образует (-)-анти-ВРБЕ-бО аддукт. Количество (-)-анти-ВРБЕ-бО повысилось линейно и в зависимости от дозы (см. фиг. 2).

Ранее обнаружили, что большие количества активного кислорода, такого как Н₂О₂ и О^- ₂, были образованы из сигаретного дыма после улавливания дыма в ФСБ. Этот активный кислород, образованный из сигаретного дыма, мог быть причиной наблюдаемого образования (-)-анти-ВРБЕ-бО. Для подтверждения этого, проверили влияние каталазы и супероксиддисмутазы (8ОБ) на полученный (-)-анти-ВРБЕ-бО, и обнаружили, что оба фермента ингибируют образование аддукта. Инактивированная каталаза не показала никакого влияния (табл. 1). В результате этого пришли к выводу, что сигаретный дым может окислять (+)-ВР-7,8-диол, образуя, тем самым, (-)-анти-ВРБЕ-бО, и что такую способность можно объяснить в основном действием кислорода, образованного из сигаретного дыма.

Влияние сигаретного дыма на аддукт (-)-анти-ВРБЕ-бО, образованный в клетках МСЕ-7, обработанных (+)-ВР-7,8-диолом. Показали, что два независимых пути метаболизма принимают участие в метаболизме ВР-7,8-диола до ВРБЕ (фиг. 3). Зависимый от цитохрома Р450 метаболизм (+)-энантиомера предпочтительно приводит к (+)-§уп-ВРБЕ, тогда как путь метаболизма, включающий гемм-содержащие белки в конъюгации с пероксидом (например, пероксид липида) предпочтительно дает в результате (-)анти-ВРБЕ. С другой стороны, (-)-ВР-7,8-диол может быть метаболизирован по обоим путям метаболизма и приводить к образованию (+)-анти-ВРБЕ, конечной формы ВР, и (-)-§уп-ВРБЕ. Разные пути метаболизма можно отличить анализом ВЭЖХ, поскольку тетролы, полученные из анти- и куп-ВРБЕ соответственно, четко разделяются при условиях данного эксперимента.

Для исследования дополнительной роли зависимой от сигаретного дыма эпоксидации (+)-ВР-7,8диола, приводящей к образованию (-)-анти-ВРБЕ, что образует с ДНК (-)-анти-ВРБЕ-бО аддукт, использовали человеческую линию клеток груди МСЕ-7. Причиной, по которой применяли клетки МСЕ-7, чтобы увидеть влияние сигаретного дыма КО8 на активацию (+)-ВР-7,8 диола, являлось то, что эти клетки

- 6 015759 имели небольшую активность пероксидазы. Клетки обработали (+)-ВР-7,8-диолом, стереохимическая проба которого может распознать аддукты, образованные зависимыми от ΚΌ3 и ЦОГ путями метаболизма (фиг. 3). На хроматограммах наблюдали два отдельных пика, соответствующих ВР-тетролу I и ВРтетролу II, происходящим от (-)-анти-ВРПЕ-бС и (+)-куп-ВРОЕ-бС соответственно (см. 32-34). Сигаретный дым увеличил линейно и в зависимости от дозы зависимое от ΚΌ3 образование (-)-анти-ВРПЕ-бС (фиг. 4а) и снизил зависимое от ЦОГ образование аддукта (+)-куп-ВРОЕ-бС, измеренного образованием ВР-тетрола II. Это увеличение также зависит от дозы, и обращение аддуктов ДНК повышалось линейно с концентрацией сигаретного дыма (4Ь). Ингибиторный эффект СЗ на зависимое от ЦОГ образование (+)куп-ВРЭЕ-бС и повышенное образование (-)-анти-ВРЭЕ-бС аддукта подтверждает роль кислорода, образованного из сигаретного дыма при образовании(-)-анти-ВРПЕ-бС аддукта.

Другие изучения показали, что повышенная активность ЦОГ ослаблялась окислительными проверками. Механизм, лежащий в основе такого феномена, может быть понижающим регуляцию гена цитохрома Р4501А1. Наличие небольшой активности пероксидазы может привести клетки МСЕ к состояниям нагрузки для повышенного повреждения ДНК и пониженной емкости производительности. Следовательно, это может являться причиной увеличения аддуктов ВРОЕ-ЭНА независимо от активации ВР-7,8диола.

Влияние сигаретного дыма на аддукт ВРЭЕ-бС. образованный в клетках, обработанных ВР. В предыдущих исследованиях с клеточными культурами МСЕ-7 выявили, что эти клетки обладают индуцируемой Р4501В1 и Р4501А1 активностью. Присутствие Р450 катализированного метаболического обмена ВР и отсутствие поддающейся обнаружению пероксидазной активности в клетках МСЕ-7 позволяют оценить роль радикалов кислорода сигаретного дыма на активацию ВР в культурах клеток человека. Клетки МСЕ-7 имеют высокую активность ферментов ЦОГ1А1 для метаболитической активации ВР, что ведет к образованию (-)-ВР-7,8-диола и вследствие этого к (+)-анти-ВРЭЕ-бС (фиг. 1). Уровень образования аддукта за 6 ч был значительно ниже, чем наблюдаемый через 12 и 24 ч воздействия. После обработки 2,5 мкМ ВР в течение 6 ч образовалось приблизительно 2000 пг аддуктов на мг ДНК, поскольку более чем 11000 пг и более чем 20000 пг аддуктов на мг ДНК присутствовали через 12 и 24 ч соответственно (критерий суммы рангов Вилкоксона дал р=0,0022).

Клетки обрабатывали в течение 12 и 18 ч ВР для индукции образования (-)-ВР-7,8-диола, который является субстратом для КОЗ. Непрямым подтверждением предпочтительного образования (-)-ВР-7,8диола являлось отсутствие ВР-тетрола II, происходящего из куп-ЕРЭЕ, в циклах ВЭЖХ, предшественником которого является (+)-ВР-7,8-диол (фиг. 3). Затем клетки подвергали 2-часовой обработке С88 сигаретного дыма вместе с ВР. Циклы ВЭЖХ показали, что существует только один пик на хроматограммах, который отвечает ВР-тетролу I, происходящему из (+)-анти-ВРЭЕ-бС. Отличие между клетками, обработанными С88 и необработанными (контроли), представлено на фиг. 5. Как упоминалось выше, линия клеток, применяемая в данном исследовании, поддерживала способность к более низкой экспрессии ЦОГ1А1 после окислительной стимуляции С8. Подавление цитохрома Р450 предположительно снижает активацию ВР к (-)-ВР-7,8-диолу и (+)-анти-ВРЭЕ. Таким образом, усиленный отличительный признак посредством С8 происходит из-за усиленного метаболизма (-)-ВаР-7,8-диола при помощи ΚΌ8, образованного от С8. Критерий суммы рангов Вилкоксона дал р=0,0022 для обработки С8 против контролей на протяжении 14 ч и 20 ч соответственно. Последнее опасное повреждение ВР ДНК происходит в бронхиальных эпителиальных клетках человека с образованием ВРЭЕ-бС аддукт, который можно рассматривать как критический для инициирования раковых бронхиальных эпителиальных клеток легких человека. Таким образом, активные формы кислорода, образованные в сигаретном дыме, могут играть важную роль в образовании этого критического аддукта в бронхиальных эпителиальных клетках (фиг. 1).

Влияние фильтра, содержащего экстракт розмарина, на образование ВРЭК-бС аддукта. Траву и масло розмарина (Коктатшик оГПешаНк ЬаЫакае) обычно применяют как специи и ароматизирующие средства в пищевой промышленности из-за их приятного аромата и высокой антиоксидантной активности. Местное нанесение экстракта розмарина, карназола или урсоловой кислоты на кожу мыши ингибирует ковалентное связывание бензо(а)пирена с эпидермальной ДНК, инициацию опухоли 7,12диметилбенз(а)антраценом (ЭМВА), активацию ТРА-индуцированной опухоли, активность орнитин декарбоксилазы и воспаление. Доказали, что экстракты розмарина являлись эффективными не только в фазе активации, а также в фазе инициации. Экстракты розмарина, карнозная кислота и карнозол сильно ингибируют фермент фазы I, активности ЦОГ 450 и индуцируют экспрессию фермента фазы II, активности глутатион 8-трансферазы (С8Т) и хинон-редуктазы. Карнозол ингибирует продуцирование окиси азота (N0) в активированном макрофаге. Антиоксидантное свойство упоминалось как механистическая основа их защитных эффектов.

С целью удаления свободных радикалов и активных форм кислорода в сигаретном дыме небольшое количество порошкообразного розмарина включили в стандартный фильтр (см. Материалы). Уменьшение свободных радикалов в конденсате, вызванное фильтрами, включающими экстракт розмарина, оценивали количественное содержание гидроксильного радикала С88 со спиновой ловушкой (ΤΝΓ0) с помощью ЬС-ЕЗЬМЗ/МЗ. При используемых условиях курения наблюдали 30% снижение гидроксильных радикалов. Благодаря эффективности этого фильтра для снижения уровня свободных радикалов в

- 7 015759 сигаретном дыме по сравнению с сопоставимым стандартным фильтром Мат1Ьото без добавки, сравнивали влияние С8, проходящего через этот фильтр, со стандартным фильтром на образование ΒΡΌΕ-бС с помощью клеток МСЕ-7.

Результаты, представленные на фиг. 6, получили, когда клетки МСЕ-7 обработали ΒΡ. Выполнили две группы экспериментов (А и Β). Клетки обрабатывали ΒΡ в течение 12 и 18 ч соответственно, а затем С88 из двух фильтров еще 2 ч вместе с ΒΡ (схема 1). Для оценки зависимого от ЦОГ увеличения аддукта в течение этих последних 2 ч выполнили два контроля для каждой группы: 12 и 14 ч для группы А, 18 и 20 ч для группы Β. С88 из стандартного фильтра удваивает связывающий уровень, полученный за 14 и 20 ч.

Тем не менее, фильтр с розмарином сильно препятствует увеличению, полученному при стандартном фильтре, на более чем 70% в двух группах (фиг. 6). Модифицированный фильтр поглощает ΚΌ8 и, следовательно, снижает активацию (-)-ΒΡ-7,8-диола (фиг. 3). Помимо уменьшения свободных радикалов, порошкообразный розмарин также может иметь другие механизмы для снижения образования ΒΡΌΕ-6Ο.

Применение всего экстракта розмарина (6 мкг-мл^-1) также ингибирует активность ЦОГ1А1 и образование аддукта ДНК до 80% через 6 ч совместной инкубации с 1,5 мкМ ΒΡ в бронхиальных эпителиальных клетках человека (ΒΕΑ8-2Β). Таким образом, применение фильтров, которые снижают количество свободных радикалов для снижения образования опасного онкогенного аддукта, является значительным преимуществом для постоянных курильщиков.

Сигаретный фильтр с розмарином по данному изобретению, таким образом, является перспективным кандидатом для хемопредупреждающих программ с целью снижения ΒΡΌΕ-бС в бронхиальных эпителиальных клетках.

Будет понятно, что вышеизложенное описание данного изобретения допускает различные модификации, изменения и адаптации, которые охватываются значениями и диапазоном эквивалентов приложенной формулы изобретения. Самой очевидной модификацией, например, является применение различных гелевых материалов в качестве электрочувствительной композиции веществ.

Таким образом, будет видно, что вышеизложенные цели, среди тех, что очевидны из предыдущего описания, эффективно достигнуты, и, так как определенные изменения могут быть сделаны при проведении вышеописанного способа (процесса) без отклонения от сущности и объема изобретения, предполагается, что содержание описанного выше должно толковаться как иллюстрирование, а не ограничение.

Также следует понимать, что следующая формула изобретения предназначена охватить все основные и специфические признаки данного изобретения, описанные тут, и все положения объема данного изобретения, которые, как можно сказать, попадают туда.

Claims

1. Способ профилактики онкологических заболеваний у курящих, включающий снижение аддуктов бензо(а)пирендиолэпоксида-бС (ΒΡΌΕ-бС) в легких человека из сигаретного дыма, образованных при курении сигареты, имеющей фильтр, причем указанный способ включает этапы, на которых пропускают сигаретный дым через фильтр, где указанный фильтр пропитан экстрактом растения семейства ЬаЫа1ае, где указанный экстракт включает полифенольные соединения или их производные.

2. Способ по п.1, где растением является розмарин.

3. Способ по п.1, где экстракт получают экстракцией из спиртового растворителя или водноспиртового растворителя.

4. Способ профилактики онкологических заболеваний у курящих, включающий снижение аддуктов бензо(а)пирендиолэпоксида-бС (ΒΡΌΕ-бС) в легких человека из сигаретного дыма, образованных при курении сигареты, имеющей фильтр, причем указанный способ включает этапы, на которых пропускают сигаретный дым через фильтр, где указанный фильтр пропитан смесью, включающей по меньшей мере одно полифенольное соединение или его производные.

5. Способ по п.4, где смесь включает по меньшей мере одно полифенольное соединение или его производное, выбранное из группы, включающей карнозол, розманол, розмариновую кислоту и карнозную кислоту.

6. Способ по п.5, где смесь включает карнозол, карнозную кислоту, розмариновую кислоту и розманол.

7. Способ по п.6, где смесь включает карнозную кислоту или карнозол.

8. Способ по п.7, где фильтр включает от 0,5 г до 0,1 мг по меньшей мере одного полифенольного соединения или его производного.

9. Способ по п.7, где фильтр включает 0,01 г по меньшей мере одного полифенольного соединения или его производного.

10. Способ по п.7, где по меньшей мере один полифенол или его производное соединен с полимерным носителем, или находится в матрице микрокапсулы, или добавлен к волокнам фильтра.