BRPI0622154A2 - filtro de cigarro contendo extrato de alecrim e um mÉtodo de reduzir o dano ao dna causado por agentes nocivos na fumaÇa de cigarro mediante o uso do dito filtro - Google Patents

Abstract

FILTRO DE CIGARRO CONTENDO EXTRATO DE ALECRIM E UM MÉTODO DE REDUZIR O DANO AO DNA CAUSADO POR AGENTES NOCIVOS NA FUMAÇA DE CIGARRO MEDIANTE O USO DO DITO FILTRO. A presente invenção refere-se a um filtro de cigarro contendoextrato de alecrim e um método de reduzir o dano de DNA causado por vários agentes nocivos na fumaça de cigarro. Mais especificamente, a presente invenção refere-se ao uso de dito filtro para reduzir o dano ao DNA causado) por benzo(a)pirenos nas células humanas mediante a redução do aduto de benzo(a)pireno diol epóxido-dG (BPDE-dG) do pulmão humano.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FILTRO DE CIGARRO CONTENDO EXTRATO DE ALECRIM E UM MÉTODO DE RE- DUZIR O DANO AO DNA CAUSADO POR AGENTES NOCIVOS NA FU- MAÇA DE CIGARRO MEDIANTE O USO DO DITO FILTRO"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um filtro de cigarro contendo extrato de alecrim e um método de reduzir o dano ao DNA causado por vá- rios agentes nocivos na fumaça de cigarro. Mais especificamente, a presente invenção refere-se ao uso de dito filtro para reduzir o dano ao DNA causado por benzo(a)pirenos nas células humanas mediante a redução do aduto de benzo(a)pireno diol epóxido-dG (BPDE-dG) no pulmão humano.

Antecedentes

O aduto de benzo(a)pireno diol epóxido-dG (BPDE-dG) no pul- mão humano concentra-se nas células brônquicas. Este aduto agora é reco- nhecido com um evento crítico na tumorigênese pelos benzo(a)pirenos. A fumaça de cigarro é um contribuinte significativo para a formação de BPDE-dG.

O uso de tabaco é por grande diferença a ligação mais generali- zada entre a exposição aos cancerígenos conhecidos e morte de câncer, e é, portanto, um modelo para a compreensão dos mecanismos de indução de câncer. O benzo(a)pireno (BP) é um hidrocarboneto aromático policíclico altamente carcinogênico (PAH) presente em escapamentos de emissão, ali- mento grelhado sobre carvão e em pequena quantidade na fumaça de cigar- ro, tipicamente menos do que 10 ng per cigarro. BP é o único com mais do que 60 cancerígenos na fumaça de cigarro que está envolvido na etiologia do câncer de pulmão. É metabolicamente ativado no benzo(a)pireno-7,8- diol-9,10-epóxido (BPDE) que reage com o DNA predominantemente na po- sição N2 de guanina para produzir principalmente lesões de N2-guanina, por exemplo, aduto de benzo(a)pireno-7,8-diol-9,10-epóxido-N2-deoxiguanosina (BPDE-dG). A presença de adutos de BPDE-DNA nos tecidos humanos tem sido conclusivamente estabelecido e o aduto de BPDE-dG concentrado ex- clusivamente nas células brônquicas e assim implicados no início do câncer de pulmão humano.

A erva e óleo de alecrim (Rosmarinus officinalis Labiatae), extra- tos de alecrim, ácido carnósico e carnosol são comumente usados como condimentos e agentes flavorizantes no processamento de alimentos por seu sabor desejável e alta atividade antioxidante.

No entanto, antes da presente invenção, não existia nenhum reconhecimento de que o uso de um extrato de alecrim em um filtro de cigar- ro reduziria o dano ao DNA causado nas células humanas por ben- zo(a)pirenos especificamente, o aduto de benzo(a)pireno diol epóxido-dG (BPDE-dG) no pulmão humano é agora reconhecido como um evento crítico na tumorigênese por benzo(a)pirenos.

Sumário da Invenção

O BP é considerado ser um cancerígeno significativo envolvido na indução do câncer no pulmão em fumantes e, como é mostrado neste estudo, as espécies reativas ao oxigênio contribuem substancialmente na formação do aduto tumorigênico do pulmão crítico. Embora seja tanto crucial impedir o vício ao tabaco quanto intensificar a eficácia de programas de ces- sação e redução do ato de fumar cigarros, estas abordagens têm tido pouco impacto. A prevenção da formação de aduto de BPDE-dG é um método que pode levar a diminuição do risco de câncer no pulmão em fumantes viciados.

A invenção refere-se a um filtro de cigarro contendo extrato de alecrim e um método de redução do dano ao DNA causado por agentes no- civos na fumaça de cigarro. Mais especificamente, a presente invenção for- nece o uso de dito filtro para reduzir o dano ao DNA causado por ben- zo(a)pirenos nas células humanas mediante a redução do aduto de ben- zo(a)pireno diol epóxido-dG (BPDE-dG) no pulmão humano.

Foi observado que a quantidade de aduto (-)- anti-BPDE-dG aumenta linearmente com a concentração de fumaça de cigarro na presença de (+)-BP-7,8-diol. A catalase e superóxido dismutase inibem sua formação em mais do que 80%. Quando células MCF-7 são tratadas durante 2 horas com o (+)-BP-7,8-diol, a fumaça de cigarro aumenta a dose dependente da formação de (-)-antiBPDE-dG e diminui a CYPs dependente da formação de (+)-syn-BPDE, do aduto.

Tem-se tratado células por até um dia com benzo(a)pireno e de- pois expostas durante 2 horas com fumaça de cigarro. Durante estas 2 ho- ras, descobriu-se que existe duas vezes o aumento na formação de aduto nas células tratadas com fumaça de cigarro em comparação com os níveis nas células não-tratadas devido à atividade de CYPs. Assim tenho observa- do que a fumaça de cigarro ativa a espécie reativa ao oxigênio que contém a segunda etapa da via metabólica de benzo(a)pireno levando à formação do aduto de BPDE-dG.

A fumaça de cigarro assim pode desta maneira ser responsável pela formação do aduto tumorigênico do pulmão crítico.

Finalmente, observou-se que o filtro de cigarro modificado con- tendo extrato de alecrim diminui em mais do que 70% o nível de adutos de BPDE-dG devido à fumaça de cigarro nas células MCF-7. Esta descoberta, acredita-se, é um avanço significativo na diminuição do risco de câncer no pulmão em fumantes viciados.

Breve Descrição das Figuras, Esquema e Tabela.

Figura 1. Caminho metabólico principal e ligação ao DNA do benzo(a)pireno cancerígeno. O benzo(a)pireno é um cancerígeno de tabaco que pode ser convertido in vivo enzimaticamente ou por espécies reativas ao oxigênio para produzir di-hidrodiol epóxidos reativos ao DNA. A geração es- tereosseletiva do (+)-r-7,t-8-diidróxi-t-9,10-óxi-7,8,9,10-tetra-hidro-BP [(+)- antiBPDE] a partir do (-)-BP-7,8-di-hidrodiol é catalisada por mono- oxigenases dependentes do citocromo-P450 (P450) ou espécies reativas ao oxigênio. Subsequente reação deste intermediário eletrofílico com o DNA genômico produz aduto estável entre o di-hidrodiol epóxido e o grupo exocí- clico amino de guanosina. Esta espécie de lesão de DNA pode ser converti- da em mutações dentro do seguinte ciclo de replicação a não ser que o re- paro deste aduto seja produzido.

Figura 2. Resultados obtidos mediante o uso de um sistema livre de célula concomitante com a adução de DNA: 6 mg de DNA do timo de be- zerro em 2 ml de água foram adicionados a 5 ml de CSS com diluições dife- rentes e reagidos durante 2 horas em temperatura ambiente com (+)-BP-7,8- diol (concentração final 3,6 μΜ). O DNA foi hidrolisado e o BP-tetrol I libera- do foram medidos como delineado em Materiais e Métodos.

Figura 3. (a) Estereoquímica da epoxidação de (+)-BP-7,8-diol por radicais de peroxila e citocromo P450 para espécies reativas (antiBPDE e syn-BPDE) que podem ligar-se ao DNA1 e (b) hidrólise ácida de DNA em BP-tetróis medida neste estudo. A hidrólise de (-)-antiBPDE-dG e (-)-syn- BPDE leva à formação de BP-tetrol I-2 e BP-tetrol II-1 que, no entanto, são instáveis e são convertidos em BP-tetrol I-face BP-tetrol II-2.

Figura 4. Resultados obtidos usando células MFC-7. 10 χ 106 células/frasco de 150 cm2 em um volume total de 20 ml foram tratadas du- rante 2 h com (+)-BP-7,8-diol (0,2 pm) isoladamente ou na presença de dife- rentes diluições de CSS. O DNA foi isolado, hidrolisado e os BP-tetróis foram medidos e os níveis de ligação determinados como delineado em Materiais e Métodos. Dois picos distintos foram observados nos cromatogramas corres- pondentes para BP-tetrol I e BP-tetrol II derivados de (-)-antiBPDE-dG e (+)- syn-BPDE-dG respectivamente (refs. 32-34). Os valores representam a mé- dia acrescida do padrão de duas experiências independentes com 3 a 4 ope- rações de HPLC. Figura 4a, painel superior, aumentos de adutos (-)- antiBPDE-dG com diluição de CSS; Figura 4b, painel inferior, aumentos de aduto (+)-syn-BPDE-dG com diluição de CSS.

Figura 5. Ligação de BPDE-dG nas células MCF-7 após a expo- sição ao BP 2,5 μΜ ou BP 2,5 μΜ + solução de CS (diluição 20 vezes) du- rante o tempo indicado. A solução de fumaça de cigarro foi adicionada a menos de 2 horas durante a exposição ao BP (Esquema 1). Análise do BP- DE-dG foi executada como descrito em Materiais e Métodos. Os valores re- presentam a média de duas experiências independentes com 4 a 6 operação de HPLC acrescida do Padrão. O valor de BPDE-dG foi de 11,7 ± 0,5 (média ± s.d.)ig de adutos per mg de DNA após 12 horas de incubação e 17,6 ± 0,4, 26,1 ± 0,9 após 18 horas e 24 horas, respectivamente. O metabolismo es- pontâneo CYP aumentou estes valores para 17,2 ± 0,5, 27,8 ± 0,8 e 42,2 ± 1,0 duas horas após o tempo de referência em 12, 18 e 24 horas, respecti- vãmente. A adição de solução de fumaça de cigarro (CSS) induziu uma mu- dança muito mais dramática durante o mesmo período de duas horas levan- do a um valor de BPDE-dG final de 36,9 ± 1,2, 56,7 ± 0,9 e 80,2 ± 1,2 (média ± s.d.)|g de adutos per mg após 12, 18 e 24 horas, respectivamente.

Figura 6. Ligação de BPDE-dG em células MCF-7 após a expo- sição ao BP 2,5 μΜ ou BP 2,5 μΜ + solução de CS obtida do filtro padrão e filtro contendo extrato de alecrim. A solução de fumaça de cigarro foi adicio- nada durante as últimas 2 horas no decurso da exposição ao BP durante o tempo indicado (Esquema 1). A análise do BPDE-dG foi executado como descrito em Materiais e Métodos. As operações de HPLC mostram que exis- te apenas um pico nos cromatogramas que corresponde ao BP-tetrol I deri- vado de (+)-antiBPDE-dG. Os valores representam as médias de duas expe- riências independentes com 4 a 6 operações de HPLC acrescidas do Pa- drão.

Esquema 1. Células MCF-7 foram tratadas com BP durante 12 h e 18 h seguinte com fumaça de cigarro durante mais 2 horas juntamente com BP (experiências AeB respectivamente). O objetivo desta experiência foi ativar em momentos diferentes o BP para produzir BP-7,8-diol e depois tratar as células com fumaça de cigarro e seguir seus efeitos durante as úl- timas 2 horas. O controle representa células tratadas apenas com BP.

Tabela 1. Efeito de descontaminantes sobre o nível de BPDE-dG causado pela fumaça de cigarro em um sistema livre de células.

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O sistema de CSS padrão inclui 2 ml de DNA do timo de bezerro (3 mg/ml), 600 μΙ 30 μΜ (+) BaP-7,8-diol e 5 ml de CSS diluída com PBS 25 (1:19) em pH 7,4, e foi incubada em temperatura ambiente durante 2 h. Ca- da valor foi obtido de três experiências independentes executadas em dupli- cata. O erro médio foi ao redor de 12% em cada experiência duplicada. O valor de BPDE-dG do padrão foi 56 ± 6,3 (média ± s.d.) adutos per mg de DNA.

Descrição Detalhada

O ato de fumar cigarros é causalmente associado a um grande número de cânceres humanos. O uso de tabaco é por grande diferença a ligação mais generalizada entre a exposição aos cancerígenos conhecidos e morte de câncer, e é, portanto, um modelo para a compreensão dos meca- nismos de indução de câncer.

O benzo(a)pireno (BP) é um hidrocarboneto aromático policíclico altamente carcinogênico (PAH) presente em escapamentos de emissão, ali- mento grelhado sobre carvão e em pequena quantidade na fumaça de cigar- ro, tipicamente menos do que 10 ng per cigarro. BP é o único com mais do que 60 cancerígenos na fumaça de cigarro que está envolvido na etiologia do câncer de pulmão. É metabolicamente ativado no benzo(a)pireno-7,8- diol-9,10-epóxido (BPDE) que reage com o DNA predominantemente na po- sição N2 de guanina para produzir principalmente lesões de N2-guanina, por exemplo, aduto de benzo(a)pireno-7,8-diol-9,10-epóxido-N2-deoxiguanosina (BPDE-dG).

A presença de adutos de BPDE-DNA nos tecidos humanos foi conclusivamente estabelecido e o aduto de BPDE-dG concentrado exclusi- vamente nas células brônquicas e é assim implicados no início do câncer de pulmão humano.

O cancerígeno é metabolizado pelas enzimas defase I em um grande número de metabólitos incluindo fenóis, óxidos de areno, quinonas, diidrodióis, e epóxidos de diol. Uma visão geral da via metabólica de BP que leva à formação de aduto (+)-antiBPDE-dG é apresentada na Figura 1.

Com maiores detalhes, o cancerígeno final (+)-antiBPDE-dG é formado de BP em duas etapas de oxidação mediada por citocromo P450. A primeira etapa desta oxidação leva preferencialmente ao (-)-7,8-diidro-7,8- diidrobenzo(a)pireno [(-)BP -7,8-diol]. O diol é ainda oxidado principalmente no (+)-r-7, t-8-diidróxi-t-9,10-óxi-7,8,9,10-tetra-hidro-BP [(+)-antiBPDE] alta- mente mutagênico. Numerosos estudos têm claramente identificado o [(+)- antiBPDE] como o metabólito carcinogênico principal de BP que apresenta atividade mutagênica acentuada in vitro e in vivo. A maioria dos estudos an- teriores de variação genética no metabolismo de cancerígenos do pulmão tem focalizado na ativação metabólica em vários citocromos P450s, embora a expressão destas enzimas no pulmão seja geralmente baixa. A ativação de BP-7,8-diol pelas células epiteliais do pulmão não é causada unicamente pelos processos de biotransformação dependentes de CYPs/GSTs clássi- cos, mas também envolve várias vias metabólicas diferentes de CYPs. Estas incluem, lipo-oxigenase, produtos da peroxidação de Iipideo e caminhos de- pendentes da peroxidase, COX-1 e COX-2.

Crescente evidência sugere o significado causai de radicais li- vres de tabaco na indução de câncer no pulmão em fumantes. Cada Iufada de fumaça forma mais de 10 trilhões de radicais livres presentes na fumaça, que pode contribuir tanto para o início do tumor assim como para a promo- ção de várias formas de câncer humano causado por ataques repetidos de ROS nas macromoléculas celulares. As principais espécies de radical livre são postuladas a serem uma mistura em equilíbrio de semiquinonas, hidro- quinonas e quinonas. É sugerido que este complexo de radicais livres cause oxirredução cíclica que gera ânion superóxido a partir do oxigênio molecular e leva à formação de peróxido de hidrogênio e radical de hidroxila. Estas espécies reativas causam a incisão do DNA e rompe o único filamento no DNA de roedor cultivado e células humanas. A oxirredução cíclica associada com quinona também pode estar envolvida nestes efeitos; a hidroquinona e catecol são supostas de desempenhar um papel importante.

Descobriu-se que a fumaça de cigarro pode ativar em seus radi- cais gerados por oxigênio a segunda etapa do caminho metabólico de BP que leva à formação de aduto de BPDE-dG, presumivelmente pelo metabo- lismo do (-)-BP-7,8-diol formado nas células em (+)-r-7,t-8-diidróxi-7-9, 10- óxi-7,8,9,10-tetra-hidro-BP [(+)-antiBPDE] (figura 1). Também descobriu-se que esta ativação é pelo menos duas ve- zes mais elevada do que esta obtida com o mecanismo CYPs.

Além disso, descobriu-se que o ROS da fumaça de cigarro pode ser em parte responsável pela formação aumentada de aduto de BPDE-dG.

Também observou-se que um filtro contendo um pó de alecrim formulado pode reduzir consideravelmente o nível de BPDE-dG devido ao radical gerado pelo oxigênio da CS, e que tal descoberta pode ser usada para filtros de cigarro que reduzem a formação de aduto de BPDE-dG carci- nogênico nas células epiteliais brônquicas.

A invenção fornece (i) um meio de determinar a contribuição re- lativa de ROS na fumaça de cigarro na ativação de BP-7,8-diol em compara- ção com citocromo P450; (ii) um meio de estabelecer se o ROS da fumaça de cigarro promove o processo carcinogênico mediante a contribuição ao metabolismo de BP-7,8-diol resultando em um aumento na formação do BPDE-dG do pulmão crítico; (iii) um filtro contendo um descontaminante de radicais livres de cigarro para significativamente diminuir a formação de BP- DE-dG; e (iv) uso de dito filtro para significativamente diminuir a função dos adutos de BPDE-dG.

Exemplos

Produtos Químicos. Proteinase K (EC 3.4.21.64, da Tritirachium álbum) foi adquirida da Sigma (St. Louis, MO), RNase T1 (EC 3.1.21.3, da Aspergillus oryzae) e RNase (mistura heterogênea livre de DNase de ribonu- cleases do pâncreas bovino) foram obtidas da Boehringer Mannheim (Man- nheim, Germany). A solução salina tamponada de fosfato (PBS) continha 3,0 mM KCI, 1,5 mM KH2HPO4, 140 mM NaCI, 8,0 mM Na2HPO4, (pH 7,4), água de grau de HPLC, MeOH, éter e etanol para espectroscopia da E. Merck, Darmstadt, Germany. Se não mencionado de outra maneira, os outros pro- dutos químicos foram adquiridos da Sigma (L'lsle d'Abreu Chesnes, France), Boehringer Ilngelheim (Heidelberg, Germany) e Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany). Todos os padrões de metabólito BP foram obtidos da National Câncer Institute, Chemical Carcinogen Reference Standard Reposi- tory Midwest Research Institute (Kansas City, MO). Aparelho. Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) foi realizada com um sistema isocrático e gradiente de alta pressão Hewlett- Packard (Waldborn, Germany) equipado com um detector de fluorescência Shimadzu RF-10AXL ligado a um integrador Hewlett-Packard.

Preparação da Solução de Fumaça de Cigarro/PBS (CSS). O ato de fumar foi executado de acordo com Pryor et al sem o filtro Cambridge. Essencialmente o mesmo método de coleta de fumaça foi usado mais no início por Nakayama e outros. A fumaça da queima de 8 cm de um cigarro (MarIboro) durante 3,8 min com o auxílio de vácuo constante gerado de uma bomba de água foi borbulhada através de 10 ml de solução salina tampona- da por fosfato (PBS) que captura os produtos químicos tanto da fase gasosa quanto da fumaça de cigarro de alcatrão. Como não existiu nenhum compos- to de alcatrão insolúvel em água presente nas paredes dos frascos de lava- gem, uma parte principal dos compostos solúveis em água da fumaça de um único cigarro foi contida na solução de PBS em 10 ml. Esta solução aquosa chamada solução de fumaça de cigarro (CSS) foi reagida imediatamente com DNA exógeno ou adicionada em células MCF-7 em cultura na presença de benzo(a)pireno ou seu metabólito próximo (+)-BaP-7,8-diol. Diferentes soluções de CSS foram usadas (ver abaixo).

Incorporação de um Extrato de Pó de Alecrim no Filtro de Cigar- ro. O filtro do cigarro convencional foi removido e 40 mg de um extrato de pó de alecrim, foi introduzido no espaço livre do filtro próximo ao próprio cigarro.

Após esta operação, o filtro foi reinstalado. O efeito deste filtro foi avaliado por espectrometria de massa. Brevemente a fumaça de cigarro foi borbulha- da em uma solução orgânica contendo 3,3,5,5-tetrametil-1-pirrolina-N-óxido (TMPO) um aduto de coleta giratório. A quantidade de aduto de radical de hidroxila foi depois quantificada usando cromatografia líquida, espectrome- tria de massa. Sob as condições do ato de fumar utilizadas uma diminuição de 30% no radical de hidroxila foi observada.

Reação do DNA exógeno com (+)-BP-7,8-Diol na Presença de

Solução de Fumaça de Cigarro Diluída (CSS). 2 ml de DNA do timo de be- zerro (3 mg/ml) foram adicionados a 5 ml de CSS diluída 20 vezes e reagi- dos durante 2 horas em temperatura ambiente com (+)-BP-7,8-diol (concen- tração final 3,6 μΜ) de acordo com a seguinte reação:

DNA + [ (+)-BP-7,8-diol] + CSS^ (- )-antiBPDE-N2-dG O nível do aduto (-)-anti BPDE-dG resultante foi medido (ver abaixo). Como controle uma experiência sem CSS foi executada.

Condições da Cultura Celular e Tratamento. A linhagem celular do carcinoma mamário humano MCF-7 foi desenvolvida em frascos de cultu- ra celular de 150 cm2 em um volume total de 20 ml de meio essencial míni- mo E-MEM suplementado com 10% FCS, 15 mM tampão Hepes, e antibióti- cos (200 unidades/ml de penicilina, 200 pg/ml de estreptomicina, e 25 pg/ml de ampicilina). As células foram mantidas e tratadas em 37 0C com 5% C02/95% ar atmosférico.

Após as células MCF-7 terem coberto 90% da área superficial dos frascos, (2 a 3 dias após a divisão de uma cultura confluente), o meio foi substituído com 20 ml de meio novo contendo 10% de soro. Vinte e quatro horas mais tarde, as células confluentes próximas, mais do que 90% de cé- lulas na fase G0/G1 foram tratadas com DMSO isoladamente ou com cance- rígeno (ver abaixo) dissolvido em DMSO e fumaça de cigarro/PBS (CSS ver acima). A concentração final de DMSO não excedeu a 0,1% do volume de incubação total. As amostras de controle incluídas em cada série de incuba- ção foram tratadas com DMSO isoladamente.

a) Tratamento de Células MCF-7 com (+)-BP-7,8-Diol e Fumaça de Cigarro. As células foram tratadas por 2 horas com (+)-BP-7,8-diol (0,2 μΜ), isolada- mente ou na presença de diferentes diluições de CSS. O (+)-BaP-7,8-diol foi ativado por ROO0 gerado a partir do CS e da célula CYP's para formar (-)- antiBPDE-dG e (+)-syn-BPDE-dG respectivamente. Seus níveis foram medi- dos pela formação de BP-tetrol 1-1 e BP-tetrol II-2 (ver abaixo e Figura 3).

b) Experiências de Exposição Tempo/Dose com BP. Para caracterizar a ex- posição tempo/dose com o nível de BP e BPDE-dG, as células (10 χ 106 cé- lulas /frasco de 150 cm2, volume total de 20 ml) foram tratadas com meio contendo concentração final de 1,25, 2,5 e 5,0 μΜ cada uma durante 6, 12, 18 e 24 horas (dois frascos/dose/ponto de tempo). O aduto de BPDE-dG formado nas células aumenta linearmente em uma maneira dependente da dose e tempo como foi demonstrado também por outros (30). Com base nos resultados obtidos escolheu-se 2,5 μΜ como concentração de trabalho para o BP.

c) Tratamento de Células MCF-7 com a BP e Fumaça de Cigarro. Para ver o efeito da concentração de CS1 a experiência A do esquema N0 1 foi execu- tada com o diferentes diluições de CSS (1:79, 1:39, 1:19, 1:9 vol/vol). Com base nos resultados obtidos a partir desta experiência selecionou-se a dilui- ção de 1:19 (vol/vol) como a concentração de CS de trabalho. Assim, as cé- lulas (ver acima "Cultura e Tratamento Celular") foram tratadas com BP (2,5 μΜ) e CSS (diluição 1:19 vol/vol) de acordo com o Esquema 1 (ver a figura 6 - Esquema 1).

Todas as séries de incubação foram repetidas de 2 a 3 vezes com amostras duplicadas. Ao final do tratamento, as células foram examina- das microscopicamente com relação às mudanças morfológicas, depois co- lhidas por tripsinização com 0,05% tripsina-EDTA (0,05% tripsina, 0,14 M NaCI, 3 mM KCI, 0,1 M Na2HPO4, 1,5 mM K2HPO4, 0,5 mM EDTA). Após a adição de um volume igual de meio contendo 10% FCS, as células foram centrifugadas a 1000 g, lavadas três vezes com PBS, e o glóbulo de célula então armazenado congelado a -200 0C. A viabilidade das células tratadas com BP e fumaça de cigarro ou (+)-BP-7,8-diol e fumaça de cigarro foi de aproximadamente 90% no momento da colheita, conforme determinado por um ensaio de exclusão com Trypan azul. As doses utilizadas não mostraram qualquer citotoxicidade como medido pelo ensaio de atividade de Iactato de- sidrogenase (ELISA Kit, Boehringer, Mannheim).

Preparação e Hidrólise de DNA. O isolamento de DNA dos gló- bulos de células MCF-7 foi realizado mediante o tratamento com RNase1 proteinase K, procedimento de salga (31) e clorofórmio. Resumidamente, os glóbulos de células foram colocados novamente em suspensão em tampão de EDTA-sulfato de sódio dodecila (SDS) [10 mM Tris tampão, 1 mM Na2EDTA1 1% SDS (p/v), pH 8] incubados por 1 h, a 37 °C, com RNase T1 (2000 U/ml) e RNase A (DNase livre; 100 pg/ml) em um agitador (100 rpm). Depois a proteinase K (300 pg/ml) foi adicionada e a incubação continuou durante a noite em 37 0C. Após a digestão, 6M NaCI foi adicionado para ter a concentração final de 1M seguido por uma centrifugação a 10000 g. O DNA no supernal foi precipitado com 2 vol. De etanol, lavado com 70%, 100% de etanol, éter, secado e dissolvido em 10 mM Tris tampão. Novamen- te, RNase A (100 mg/ml) e RNase T1 (2000 U/ml) foram adicionados e a solução incubada a 37 0C durante 1 h. seguido por proteinase K (100 mg/ml) durante mais 2 horas a 37 0C. A solução foi extraída uma vez com clorofór- mio, centrifugada e a solução tornou-se 1M NaCI. O DNA foi precipitado com 2 vol. de etanol frio.

A porção de DNA a ser hidrolisada foi enxaguada com 100% etanol para remover os BP-tetróis não-ligados. O DNA, livre de BP-tetróis não-ligados, foi dissolvido em água e a concentração de DNA foi determina- da pela A26o nm- A pureza foi confirmada pelas relações em A260/A280 e A260/A230. A quantidade de DNA para análise foi hidrolisada como descrito anteriormente por incubação a 90 0C durante 4 horas em uma concentração final de 0,1 N HCI. Isso libera os tetróis (Figura 3) dos adutos de BPDE-DNA com > 9 0% de recuperação. O volume do hidrolisado para injeção tornou-se 700 μl contendo de 5 a 10 mg de DNA.

Determinações do nível de aduto BPDE-N2-dG. Os níveis de a- duto foram determinados por HPLC-FD como anteriormente descrito [32,33] usando r-7, c-9, t-9, t-10-tetraidróxi-7,8,9,10-tetra-hidrobenzo(a)pireno (BP- tetrol 11-1) como um padrão interno [34]. O hidrolisado foi carregado em um módulo de pré-coluna de látex (HD-Germany)1 contendo 5 pm de material de fase reversa Ci8 (Nucleosil 100) equilibrado com 10% MeOH e lavado duran- te 20 minutos com 12 ml de MeOH a 10%. Subseqüentemente, a pré-coluna foi comutada por uma válvula de comutação Valco Instruments para fluir so- bre uma coluna analítica de fase reversa 4,6 mm χ 25 cm 5 pm C18 (Nucleo- sil 100) (Alltech GmbH, Unterhaching, Germany). Os produtos obtidos por hidrólise foram eluídos com o seguinte Me0H/H20 gradiente: 50%, 0 a 17 min; 50 a 60%, 17 a 32 min, 60%, 32 a 42 min; 60 a 100%, 42 a 57 min. Os tempos de retenção do BP tetróis foram: BP tetrol 1-1 (trans-anti-BP-tetrol) (35,2 min); BP-tetrol 11-1 (trans-syn-BP-tetrol), padrão interno (36,9 min); BP tetrol II-2 (cis-syn-BP-tetrol) (42,3 min). A fluorescência foi avaliada em um comprimento de onda de excitação de 344 nm e comprimento de onda de emissão de 398 nm. Como não detectou-se a formação de BP tetrol 11-1 em análise separada das amostras de MCF-7, usei-a como padrão interno (2 pg acrescentado a cada operação de HPLC) para verificação do tempo de re- tenção relativo. O limite de detecção foi de 0,5 pg BP tetrol 1-1 e BP-tetrol Il- 1. O nível de cada BP-tetrol foi determinado mediante o uso de uma curva padrão gerada da área de pico de fluorescência do BP-tetrol autêntico pa- drão analisada imediatamente antes da análise de amostras de MCF-7. O BP-tetrol-l-1 detectado é obtido após a hidrólise de aduto de (+)-antiBPDE- DNA. A hidrólise de (-)-antiBPDE-dG leva à formação de BP-tetrol I-2, que, no entanto, é instável e é convertido em BP-tetrol 1-1 (Figura 3) (38). Assim, o nível do (-)-antiBPDE-dG formado foi medido pela quantidade de BP-tetrol 1-1 encontrado nas operações de HPLC. Com base na constatação de que a reação de BPDE com DNA produz principalmente BPDE-N2-dG (7), adotou- se que o nível de BP-tetrol-l-1 corresponde a este de BPDE-N2-dG. O nível de BPDE ligado ao DNA de MCF-7 foi quantificado em duplicatas. O nível de aduto foi calculado a partir da equitação 1 pmol/mg DNA/3,125 = 1 aduto por 106 nucleotídeos. As operações de HPLC foram quantitativamente reprodutí- veis, e a variabilidade entre os dois ensaios foi inferior a 5%.

O mecanismo de mutagênese por BP é suficientemente bem definido e utilizado como uma "assinatura molecular" para estabelecer a na- tureza causai entre os eventos genéticos particulares no desenvolvimento de tumores exposição carcinogênica (a "arma do tabagismo"). A "assinatura molecular de BP" tem grandes implicações para identificar a fumaça do ta- baco como a causa do câncer do pulmão humano, e para a elaboração de estratégias específicas para minimizar o tabagismo, ou introduzir medidas preventivas. Agentes específicos utilizados na quimioprevenção de câncer parecem agir através da inibição do dano cancerígeno ao DNA, mutagênese, promoção de tumor e/ou progressão do tumor. Tem sido explorado o papel relativo da CS sobre a biotransfor- mação de BP-7,8-diol em BPDE capaz de formar aduto de DNA estável nas células humanas. Numerosos estudos têm demonstrado que os adutos de PAH-DNA estáveis podem conduzir a mutações através de má incorporação de nucleotideos ou supressão. A CS é um aerossol de composição química complexa contendo compostos tanto orgânicos quanto inorgânicos, dos quais 4800 foram identificados até agora. Tanto a fase vapor quanto a fase particulada da fumaça são conhecidas por possuir radicais livres. Embora os radicais de fase gasosa sejam geralmente de curta duração, os radicais na fase particulada são relativamente estáveis e consistem em uma hidroquino- na, semiquinona, complexo de quinona, este complexo é um sistema de oxir- redução ativo capaz de reduzir o oxigênio molecular para produzir superóxi- do, eventualmente levando aos radicais de peróxido de hidrogênio e hidroxi- la. Além disso, pelo menos 60 diferentes cancerígenos de CS foram implica- dos na iniciação e promoção tumoral; o agente cancerígeno mais potente contido na CS é BP e NNK (4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona).

O Efeito da Fumaça de Cigarro em (+)-antiBPDE-dG usando uma Sistema Livre de Célula Concomitante com a adução de DNA. Para elucidar o mecanismo de formação de BPDE-dG dependente de oxigênio ativo gerado da fumaça de cigarro, procurei este aduto no sistema in vitro de livre de célula concomitante com a adução de DNA. A solução de CSS con- tendo a fase gasosa e radicais da fumaça de cigarro de alcatrão foi imedia- tamente reagida com o DNA na presença de (+)-BP-7,8-diol (ver protocolo acima). Os resultados desta experiência mostram que a CS pode oxidar o (+)-BP-7,8 diol em (-)-antiBPDE que, por sua vez, forma o aduto de (-)- antiBPDE-dG. A quantidade de (-)-antiBPDE-dG aumentou linearmente e dependente da dose (ver a Figura 2).

Anteriormente foi observado que grandes quantidades de oxigê- nio ativo tal como H2O2 e O2 foram geradas a partir da fumaça de cigarro após capturar a fumaça em PBS. Este oxigênio ativo gerado a partir da fu- maça de cigarro pode ser responsável pela formação observada de (-)- antiBPDE-dG. Para verificar isso, verificou-se o efeito da catalase e supero- xido dismutase (SOD) sobre o (-)-antiBPDE-dG produzido, e observei que as ambas as enzimas inibiram a formação do aduto. A catalase inativada não mostrou nenhum efeito (Tabela 1). A partir destes resultados concluiu-se que a fumaça de cigarro pode oxidar (+)-BP-7,8-diol, formando assim (-)- antiBPDE-dG, e que tal capacidade pode ser explicada principalmente pela ação do oxigênio gerado da fumaça de cigarro.

O Efeito da Fumaça de Cigarro sobre o Aduto de (-)-antiBPDE- dG Formado nas Células MCF-7 Tratadas com (+)-BP-7,8-diol. Dois cami- nhos independentes foram mostrados para participar no metabolismo de BP- 7,8-diol em BPDE (Figura 3). O metabolismo dependente do citocromo P450 do (+)-enantiômero leva preferencialmente ao (+)-syn-BPDE visto que o ca- minho que envolve as proteínas contendo sangue em conjunto com um pe- róxido (por exemplo, peróxido lipídico) preferencialmente resulta em (-)- antiBPDE. O (-)-BP-7, 8-diol, por outro lado, pode ser metabolizado por am- bos os caminhos e resulta na formação de (+)-antiBPDE, a forma final de BP, e (-)-syn-BPDE. Os diferentes caminhos podem ser distinguidos pela análise de HPLC visto que os tetróis derivados de anti- e syn-BPDE respec- tivamente são claramente separados sob as minhas condições.

Para investigar ainda mais o papel da epoxidação dependente da fumaça de cigarro de (+)-BP-7,8-diol que leva à formação de (-)- antiBPDE que forma com o aduto de DNA (-)-antiBPDE-dG, a linhagem celu- lar mamária humana MCF-7 foi utilizada. A razão pela qual usou-se células MCF-7 para ver o efeito da fumaça de cigarro ROS sobre a ativação de (+)- BP-7,8 diol foi a de que estas células têm pouca atividade de peroxidase. As células foram tratadas com o (+)-BP-7, 8-diol, uma sonda estereoquímica que pode distinguir os adutos formados pelos caminhos dependentes de ROS e CYPs (Figura 3). Foram observados dois picos distintos sobre os cromatogramas correspondentes aos BP-BP-tetrol I e BP-tetrol Il derivados de (-)-antiBPDE dG e (+)-syn-BPDE-dG, respectivamente (refs. 32 a 34). A fumaça de cigarro aumentou de forma linear e dependente da dose a forma- ção de dependente de ROS de (-)-antiBPDE-dG (figura 4a) e diminuiu a for- mação de dependente de CYPs de aduto de (+)-syn-BPDE-dG medido pela formação de BP-tetrol II. Esta diminuição também é dependente da dose e o inverso de adutos de DNA aumentou linearmente com a concentração de fumaça de cigarro (4b). O efeito inibidor da CS sobre a formação dependen- te de CYPs de (+)-syn-BPDE-dG e aumento da formação do aduto de (-)- antiBPDE-dG confirmam o papel do oxigênio gerado a partir de fumaça de cigarro na formação de (-)-antiBPDE-dG.

Outros estudos mostraram que a atividade de CYPs induzida foi prejudicada pela contestação oxidativa. O mecanismo subjacente tal como um fenômeno pode ser uma infrarregulação do gene de citocromo P4501A1. Tendo pouca atividade de peroxidase pode levar as células de MCF sob condições de "estresse" ao dano aumentado do DNA e capacidade de repa- ração reduzida. Consequentemente isto pode causar um aumento de adutos de BPDE-DNA independentemente da ativação de BP-7,8-diol.

O Efeito da Fumaça de Cigarro sobre o Aduto de BPDE-dG Formado nas Células Tratadas com BP. Estudos anteriores com culturas celulares MCF-7 revelaram que estas células possuem atividade P4501B1 e P4501A1 induzível. A presença de movimento metabólico catalisado por P450 de BP e a ausência de atividade de peroxidase detectável nas células MCF-7, permitiu a avaliação dos radicais de oxigênio da fumaça de cigarro sobre a ativação de BP em culturas de células humanas. As células MCF-7 têm alta atividade enzimática CYP1A1 para a ativação metabólica de BP levando à formação de (-)-BP-7,8-diol e consequentemente ao (+)- antiBPDE-dG (Figura 1). O nível de formação de aduto em 6 horas foi consi- deravelmente mais baixo ao que a observada após 12 e 24 horas de exposi- ção. Após o tratamento com 2,5 μΜ de BP durante 6 horas aproximadamen- te 2000 pg de adutos por mg de DNA foram formados, enquanto mais do que 11000 pg e mais do que 20000 pg de adutos por mg de DNA estavam presentes após 12 horas e 24 horas respectivamente (Wilcoxon Rank Sum Test fornece ρ = 0,0022).

As células foram tratadas durante 12 e 18 horas com BP para induzir a formação de (-)-BP-7,8 diol que é o substrato para ROS. A confir- mação indireta para a formação preferencial de (-)-BP-7,8-diol é a ausência de BP-tetrol Il derivado de syn-BPDE em operações de HPLC em que o pre- cursor é (+)-BP-7,8-diol (Figura 3). As células foram então expostas durante 2 horas com CSS da fumaça de cigarro juntamente com BP. As operações de HPLC mostram que existe apenas um pico nos cromatogramas que cor- respondem aos derivados de BP-tetrol I de (+)-antiBPDE-dG. A diferença entre as células tratadas com CSS e aquelas não-tratadas (controle) é apre- sentada na Figura 5. Como mencionado acima, a linha celular utilizada neste estudo manteve a capacidade de diminuir a expressão de CYP1A1 após a contestação oxidativa pela CS. A supressão do citocromo P450 presumivel- mente diminui a ativação de BP para (-)-BP-7,8-diol e (+)-antiBPDE. Assim, a diferença aumentada pela CS é devida ao metabolismo aumentado de (-)- BaP-7,8 diol por ROS gerado a partir da CS. Wilcoxon Rank Sum Test for- nece ρ = 0,0022 para os tratados com CS vs controles durante 14 horas e 20 horas respectivamente. Recentemente o dano dramático pelo BP do DNA ocorreu nas células epiteliais brônquicas humanas formando aduto de BP- DE-dG que pode ser considerado "crítico" para o início do células epiteliais brônquicas do câncer de pulmão humano. Assim, espécies ativas ao oxigê- nio geradas na fumaça do cigarro podem desempenhar um papel importante na formação desse aduto "crítico" nas células epiteliais brônquicas (Figura 1).

O Efeito do Filtro Contendo Extrato de Alecrim na Formação de Aduto de BPDE-dG.

A erva e o óleo de alecrim (Rosmarinus officinalis Labiatae) são comumente usados como condimentos e agentes flavorizantes no proces- samento de alimentos por seu sabor desejável e alta atividade antioxidante. Aplicação tópica de extrato de alecrim, carnasol ou ácido ursólico na pele de camundongo inibiu a ligação covalente do benzo(a)pireno no DNA epidérmi- ca, início de tumor em 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA), promoção de tumor induzido por TPA, atividade ornitina descarboxilase e inflamação. Os extratos de alecrim foram comprovados serem eficientes não apenas na fase da promoção, mas também na fase inicial. Os extratos de alecrim, ácido car- nósico e carnosol fortemente inibem a enzima de fase I, as atividades de CYP 450 e induzem a expressão da enzima de fase II, glutationa S- transferase (GST) e atividades de quinona redutase. Carnosol inibe a produ- ção de óxido nítrico (NO) nos macrófagos ativados. A propriedade antioxi- dante foi referida como a base mecanistica de seus efeitos protetores.

Com o objetivo de remover os radicais livres e espécies reativas ao oxigênio na fumaça do cigarro uma pequena quantidade de pó de alecrim foi incorporada em um filtro padrão (ver Materiais). A diminuição nos radicais livres no condensado induzido pelos filtros que incorporam um extrato de alecrim foi estimada pela quantificação do teor de radical de hidroxila da CSS com uma coleta giratória (TMPO) utilizando LC-ESI-MS/MS. Sob as condições utilizadas do ato de fumar, uma diminuição de 30% no radical hi- droxila foi observada. Devido à eficiência deste filtro para reduzir o nível dos radicais livres na fumaça de cigarro, em comparação com um filtro de padrão Marlboro de comparável sem o aditivo, comparou-se o efeito da CS passada através deste filtro em comparação com o filtro padrão sobre a formação de BPDE-dG utilizando células MCF-7.

Os resultados apresentados na Figura 6 foram obtidos quando as células MCF-7 foram tratados com BP. Dois grupos de experiências fo- ram realizados (A e B). As células foram tratadas com BP durante 12 e 18 horas respectivamente seguindo com CSS dos dois filtros por mais 2 horas, juntamente com a BP (Esquema 1). Para avaliar o aumento dependente de CYP do aduto durante estas últimas 2 horas, dois controles para cada grupo foram realizados: 12 e 14 horas para o grupo A, 18 e 20 horas para o grupo Β. A CSS do filtro padrão dobrou o nível de ligação obtido durante 14 e 20 horas.

No entanto, o filtro de alecrim fortemente impede o aumento ob- tido pelo filtro padrão, mais do que 70% nos dois grupos (Figura 6). O filtro modificado descontamina ROS e consequentemente diminui a ativação de (- )-BP-7,8-diol (Figura 3). Além da redução dos radicais livres, o pó de alecrim também pode ter outros mecanismos para reduzir a formação de BPDE-dG.

Usando todo o extrato de alecrim (6 pg.ml"1) também inibe se a atividade de CYPIAI e a formação de aduto de DNA em 80% após 6 horas de coincubação com 1,5 μΜ de BP nas células epiteliais brônquicas huma- nas (BEAS-2B). Desta maneira, o uso de filtros que diminuem a quantidade de radicais livres para reduzir a formação crítica do aduto tumorogênico é um benefício significativo para os fumantes viciados.

O filtro de cigarro de alecrim da invenção, portanto, é um candi- dato promissor para programas quimiopreventivos com o objetivo de reduzir o BPDE-dG nas células epiteliais brônquicas.

Ficará entendido que a descrição acima da presente invenção é suscetível a várias modificações, alterações e adaptações, e as mesmas destinam-se a serem compreendidas dentro do significado e faixa de equiva- lentes das reivindicações anexas. A modificação mais óbvia, por exemplo, é a utilização de vários materiais de gel como a composição eletrorresponsiva da matéria.

Assim, será visto que os objetos apresentados acima, entre a- queles que se tornaram evidentes da descrição precedente, são eficazmente alcançados e, visto que certas alterações podem ser feitas na realização do método acima (processo) sem se afastar do espírito e do escopo da inven- ção, pretende-se que todas as matérias contidas na descrição acima serão interpretadas como ilustrativas e não em um sentido limitativo.

Também deve ficar entendido que as seguintes reivindicações são destinadas a cobrir todos os aspectos genéricos e específicos da inven- ção aqui descrita e todas as declarações do escopo da invenção que, como uma questão de linguagem, podem ser situadas entre elas.

Claims (10)

1. Método para reduzir os adutos de benzo(a)pireno diol epóxi- do-dG (BPDE-dG) do pulmão humano da fumaça de cigarro gerada pelo ato de fumar um cigarro tendo um filtro, dito método compreendendo as etapas de passar a fumaça de cigarro através do filtro em que dito filtro é impregna- do por um extrato de uma planta da família Labiatae em que dito extrato compreende compostos de polifenol ou seus derivados.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a planta é alecrim.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o extrato é gerado pela extração com um solvente alcoólico ou um solvente alcoólico aquoso.

4. Método para reduzir os adutos de benzo(a)pireno diol epóxi- do-dG (BPDE-dG) do pulmão humano da fumaça de cigarro gerada pelo ato de fumar um cigarro tendo um filtro, o dito método compreendendo as eta- pas de passar a fumaça de cigarro através do filtro em que dito filtro é im- pregnado por uma mistura que compreende pelo menos um composto de polifenol ou seu derivado.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a mistura compreende pelo menos um composto de polifenol ou um derivado do mes- mo selecionado do grupo consistindo em carnasol, rosmanol, ácido rosmarí- nico e ácido carnósico.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a mistura compreende carnosol, ácido carnósico, ácido rosmarínico e rosemanol.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a mistura compreende ácido carnósico ou carnosol.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o filtro com- preende de 0,5 g a 0,1 mg de pelo menos um composto de polifenol ou seu derivado.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o filtro com- preende 0,01 g de pelo menos um composto de polifenol ou seu derivado.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o pelo me nos um polifenol ou seu derivado é acoplado a um portador polimérico ou está em uma matriz de microcápsula ou é adicionado nas fibras de um filtro.