CN103110188A - 含有迷迭香提取物的卷烟过滤嘴以及通过使用所述过滤嘴减少由烟雾中有害物质引起的dna 损伤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有迷迭香提取物的卷烟过滤嘴和减少由烟雾中的各种有害物质引起的DNA损伤。更具体地，本发明涉及使用所述过滤嘴通过减少人肺部苯并[a]芘二醇环氧化物-dG（BPDE-dG）加合物来减少人细胞中由苯并[a]芘引起的DNA损伤。

Description

含有迷迭香提取物的卷烟过滤嘴以及通过使用所述过滤嘴减少由烟雾中有害物质引起的DNA 损伤的方法

本申请是申请号为200680056513.8、申请日为2006年11月17日、发明名称为“含有迷迭香提取物的卷烟过滤嘴以及通过使用所述过滤嘴减少由烟雾中有害物质引起的DNA损伤的方法”的中国专利申请的分案申请。 

1．发明领域 

本发明涉及含有迷迭香提取物的卷烟过滤嘴以及减少由烟雾中各种有害物质引起的DNA损伤的方法。更具体地，本发明涉及使用所述过滤嘴通过减少人肺部苯并[a]芘二醇环氧化物-dG（BPDE-dG）加合物来减少人细胞中由苯并[a]芘引起的DNA损伤。 

2．背景 

人肺部苯并[a]芘二醇环氧化物-dG（BPDE-dG）加合物集中于支气管细胞中。目前认为该加合物是由苯并[a]芘引起的肿瘤发生中的关键事件。烟雾是BPDE-dG形成的重要诱因。 

烟草使用是到目前为止暴露于已知致癌物和由癌症引起的死亡之间最普遍的关联，并且因此是了解癌症诱导机理的模型。苯并[a]芘（BP）是存在于排出废气、碳烤食品中的高致癌性多环芳香烃（PAH），烟雾中少量存在，通常低于10ng/烟。BP是肺癌病原学中所涉及的烟雾中60多种致癌物质之一。它通过代谢活化成苯并[a]芘-7,8-二醇-9,10-环氧化物（BPDE），其主要在鸟嘌呤的N²-位置与DNA反应，主要产生N²-鸟嘌呤损伤，例如，苯并[a]芘-7,8-二醇-9,10-环氧化物-N²-脱氧鸟苷（BPDE-dG）加合物。已经最后确定了人组织中BPDE-DNA加合物的存在，并且BPDE-dG加合物专门集中在支气管细胞，并因 此参与人肺癌的开始。 

由于其理想的香味和高抗氧化活性，迷迭香（Rosmarinus officinalis Labiatae）草和油、迷迭香提取物、鼠尾草酸和鼠尾草酚通常用作食品加工中的香料和调味剂。 

然而，在本发明之前，没有认识到在卷烟过滤嘴中使用迷迭香提取物将会减少人细胞中由苯并[a]芘引起的DNA损伤，具体地，苯并[a]芘是人肺部的苯并[a]芘二醇环氧化物-dG（BPDE-dG）加合物，目前认为该加合物是由苯并[a]芘引起的肿瘤发生中的关键事件。 

3．发明概述 

认为BP是涉及吸烟者中肺癌诱导的重要致癌物质并且，如在该研究中所表明，活性氧种类实质性地促进了关键的肺部致瘤加合物的形成。尽管这对于防止对烟上瘾以及提高戒烟和减少吸烟计划的效率都是关键的，但这些方法几乎没有效果。防止BPDE-dG加合物的形成是一种可使减少成瘾吸烟者的肺癌风险降低的方法。 

本发明涉及含有迷迭香提取物的卷烟过滤嘴，以及减少由烟雾中的有害物质引起的DNA损伤的方法。更具体地，本发明提供了使用所述过滤嘴通过减少人肺部苯并[a]芘二醇环氧化物-dG（BPDE-dG）加合物来减少人细胞中由苯并[a]芘引起的DNA损伤。 

已经发现(-)-反-BPDE-dG加合物的量在(+)-BP-7,8二醇的存在下随着烟雾的浓度线性增加。过氧化氢酶和超氧化物岐化酶抑制其超过80%的形成。当用(+)-BP-7,8二醇将MCF-7细胞处理2小时时，烟雾剂量依赖性地增加(-)-反-BPDE-dG的形成，并减少(+)-顺-BPDE的CYP依赖性形成。 

用苯并[a]芘将细胞处理长达一天，然后将其暴露于烟雾2小时。在这2小时期间，发现了由于CYP的活性，与未处理细胞中的水平相比较，用烟雾处理过的细胞中加合物形成增加两倍。因此，发现了烟雾通过其含有的活性氧种类激活了导致BPDE-dG加合物形成的苯并[a]芘代谢途径的第二个步骤。 

因此，烟雾可以这种方式引起关键的肺部致瘤加合物的形成。 

最后，发现了含有迷迭香提取物的改良卷烟过滤嘴使MCF-7细胞中由烟雾引起的BPDE-dG加合物水平降低超过70%。相信这是降低成瘾吸烟者中肺癌风险的重大进展。 

4．附图、方案和表格的简述： 

图1.致癌物质苯并[a]芘的主要代谢途径和DNA结合。苯并[a]芘是可以在体内通过酶或通过氧活性种类转化产生DNA-反应性二氢二醇环氧化物的烟草致癌物质。通过细胞色素p450-依赖性单加氧酶（P450）或活性氧种类的催化从(-)-BP-7,8-二氢二醇立体选择性地产生致突变的(+)-r-7,t-8-二羟基-t-9,10-氧-7,8,9,10-四氢-BP[(+)-反-BPDE]。随后该亲电子的中间产物与基因组DNA的反应在二氢二醇和鸟苷的环外氨基之间产生了稳定的加合物。这种DNA损伤可以转化成以下复制循环内的突变，除非产生这种加合物的修复。 

图2.使用无细胞系统伴随DNA加合作用获得的结果：将2ml水中的6mg小牛胸腺DNA加入5ml具有不同稀释度的CSS中，并在室温与(+)-BP-7,8-二醇反应2小时（终浓度为3.6μM）。如材料和方法中概述的，将DNA水解并测量所释放的BP-四醇I。 

图3.BP-7,8-二醇通过过氧化氢自由基和细胞色素P450环氧化成可以结合DNA的活性种类（反-BPDE和顺-BPDE）的立体化学，和该研究中测量的DNA至BP-四醇的酸水解。(-)-反-BPDE-dG和(-)-顺-BPDE的水解导致BP-四醇I-2和BP-四醇II-1的形成，然而，其是不稳定的并转化成BP-四醇I-1和BP-四醇II-2。 

图4.使用MFC-7细胞获得的结果。用单独的(+)-BP-7,8-二醇（0.2μM）或在不同稀释度的CSS存在下用(+)-BP-7,8-二醇（0.2μM）处理20ml总体积中10×10⁶细胞/150cm²烧瓶2小时。如材料和方法中概述的，分离DNA，水解并测量释放的BP-四醇和测定结合水平。在对应于分别源自(-)-反-BPDE-dG和(+)-顺-BPDE-dG的BP-四醇I和BP-四醇II的色谱图上观察到两个截然不同的峰（参考文献32-34）。 数值表示两个使用3-4次HPLC运行的独立实验的平均值加标准差。图4a，上图，随着CSS稀释，(-)-反-BPDE-dG加合物的增加；图4b，下图，随着CSS的稀释，1/(+)-顺-BPDE-dG的增加。 

图5.暴露于BP2.5μM或BP2.5μM+CS溶液（稀释20倍）所示时间后，MCF-7细胞中的BPDE-dG结合。在暴露于BP期间的最后2小时加入烟雾溶液（方案1）。如材料和方法中所述的进行BPDE-dG的分析。数值表示两个使用4-6次HPLC运行的独立实验的平均值加标准差。孵育12小时后，BPDE-dG值是11.7±0.5（平均值±s.d.）μg加合物/mg DNA，18小时和24小时后，分别为17.6±0.4，26.1±0.9。在分别为12、18和24小时的参照时间后两小时，CYP自发代谢将这些数值提高至17.2±0.5、27.8±0.8和42.2±1.0。烟雾溶液（CSS）的加入诱导了相同两小时的过程中更加剧烈的变化，导致在12、18和24小时后，各自为36.9±1.2、56.7±0.9和80.2±1.2（平均值±s.d.）μg加合物/mg的终BPDE-dG值。 

图6.从标准过滤嘴和含有迷迭香的过滤嘴获得的暴露于BP2.5μM或BP2.5μM+CS溶液后，MCF-7细胞中的BPDE-dG结合。在暴露于BP所示时间期间的最后2小时，加入烟雾溶液（方案1）。如材料和方法中所述的进行BPDE-dG的分析。HPLC运行显示出在对应于源自(+)-反-BPDE-dG的BP-四醇I的色谱图上只存在一个峰。数值表示使用4-6次HPLC运行的两个独立实验的平均值加标准差。 

方案1.用BP将MCF-7细胞处理12小时和18小时，接着用烟雾和BP一起再处理2小时（各自为实验A和B）。该实验的目的是在不同时间激活BP以产生BP-7,8-二醇，此后用烟雾处理细胞并在最后2小时期间观察其效果。对照表示只用BP处理过的细胞。 

表1.清除剂对无细胞系统中由烟雾引起的BPDE-dG水平的影响 

标准CSS系统包括2ml小牛胸腺DNA（3mg/ml）、600μl30μM(+)BaP-7,8-二醇和5ml用pH7.4的PBS稀释（1:19）的CSS，并且在室温孵育2小时。每个数值是从重复两次进行的三个单独的实验获得的。在每个重复两次的实验中，平均误差为约12%。标准的BPDE-dG值是56±6.3（平均值±s.d.）加合物/mg DNA。 

5．详述 

烟雾有原因地与很多人癌症相关。吸烟是到目前为止暴露于已知致癌物和由癌症引起的死亡之间最广泛的关联，并且因此是了解癌症诱导机理的模型。 

苯并[a]芘（BP）是存在于排出废气、碳烤食品中的高致癌多环芳香烃（PAH），烟雾中少量存在，通常低于10ng/烟。BP是肺癌病原学中所涉及的烟雾中60多种致癌物质之一。它通过代谢活化成苯并[a]芘-7,8-二醇-9,10-环氧化物（BPDE），其主要在鸟嘌呤的N²-位置与DNA反应，主要产生N²-鸟嘌呤损伤，例如，苯并[a]芘-7,8-二醇-9,10-环氧化物-N²-脱氧鸟苷（BPDE-dG）加合物。 

已经最后确定了人组织中BPDE-DNA加合物的存在，并且BPDE-dG加合物专门集中在支气管细胞，并因此参与人肺癌的开始。 

这种致癌物质通过I期酶代谢成多种代谢产物，包括苯酚、芳烃氧化物、醌、二氢二醇和二醇环氧化物。图1中呈现了导致(+)-反-BPDE-dG加合物形成的BP代谢途径的概述。 

更详细地，通过两轮细胞色素P450介导的氧化，从BP形成了最终的致癌物质(+)-反-BPDE。该氧化的第一个步骤优先产生(-)-7,8-二氢-7,8-二氢苯并[a]芘[(-)BP-7,8-二醇]。该二醇进一步主要氧化成高致突变的(+)-r-7,t-8-二羟基-t-9,10-氧-7,8,9,10-四氢-BP[(+)-反-BPDE]。各种研究已经清楚地鉴定出[(+)-反-BPDE]为BP的主要致癌代谢产物，在体外和体内呈现出增强的致突变活性。之前大多数关于肺部致癌物质代谢中遗传变异的研究集中于通过各种细胞色素P450的代谢激活，尽管这些酶在肺部的表达通常是低的。BP-7,8-二醇通过肺上皮细胞的 激活不仅仅是由传统的CYP/GST依赖性生物转化过程引起的，而且还涉及CYP以外的几种代谢途径。这些包括，脂加氧酶、脂质-过氧化产物和过氧化物酶依赖性途径，即COX-1和COX-2。 

日益增加的证据表明烟草自由基在吸烟者肺癌诱导中的病因意义。每个烟圈形成烟中存在的超过10兆的自由基，这可能引起肿瘤开始以及促进各种由ROS对细胞大分子的反复攻击所致的各种形式的人癌症。推断主要的自由基种类是半醌、氢醌和醌的平衡混合物。表明这种自由基复合物引起氧化还原循环，从分子氧产生超氧化物阴离子并导致过氧化氢和羟基的形成。这些活性种类造成培养的啮齿动物和人细胞的DNA切口和DNA单链断裂。醌相关的氧化还原循环也参与这些作用；认为氢醌和儿茶酚起着主要作用。 

发现了烟雾通过其氧产生的自由基可以激活导致BPDE-dG加合物形成的BP代谢途径的第二个步骤，推测是因细胞中形成的(-)-BP-7,8-二醇代谢成(+)-r-7,t-8-二羟基-t-9,10-氧-7,8,9,10-四氢-BP[(+)-反-BPDE]（图1）。 

还发现了这种激活比用CYP方法获得的至少高两倍。 

此外，发现了来自烟雾的ROS可能是引起增加的BPDE-dG加合物形成的部分原因。 

还发现了含有配制的迷迭香粉末的过滤嘴可以显著降低由于CS氧产生的自由基引起的BPDE-dG水平，并且该发现可以用于卷烟过滤嘴中，其减少支气管上皮细胞中致癌的BPDE-dG加合物的形成。 

本发明提供了（i）确定与细胞色素P450相比较烟雾中的ROS对BP-7,8-二醇激活的相对作用的手段；（ii）确立烟雾的ROS是否通过有助于导致关键的肺部BPDE-dG形成增加的BP-7,8-二醇代谢而促进致癌过程的手段；（iii）含有能显著减少BPDE-dG形成的烟自由基清除剂的过滤嘴；和（iv）所述过滤嘴显著减少BPDE-dG加合物形成的用途。 

7．实施例

化学药品。蛋白酶K（EC3.4.21.64，来自白色念球菌（Tritirachium album））购自Sigma（St.Louis，MO），RNA酶T1（EC3.1.21.3，来自米曲霉（Aspergillus oryzae））和RNA酶（无DNA酶，来自牛胰腺的核糖核酸酶的异源混合物）获自Boehringer Mannheim（Mannheim，Germany）。用于分光镜检查的来自E.Merck，Darmstadt，Germany的磷酸盐缓冲盐水（PBS）含有3.0mM KCl、1.5mM KH₂HPO₄、140mM NaCl、8.0mM Na₂HPO₄（pH7.4）、HPLC-级水、MeOH、醚和乙醇。如果没有另外指出，其他化学药品购自Sigma（L’Isle d’Abeau Chesnes，France）、Boehringer Ingelheim（Heidelberg，Germany）和Boehringer Mannheim（Mannheim，Germany）。所有BP代谢产物标准品获自National Cancer Institute（国家癌症研究所），Chemical C arcinogen Reference Standard Repository Midwest Research Institute（化学致癌物参照标准品库中西部研究所）（Kansas City，MO）。 

装置。使用装备有连接Hewlett-Packard集成器的Shimadzu RF-10AXL荧光检测仪的Hewlett-Packard高压等度（isocratic）和梯度系统（Waldborn，Germany）来进行高性能液相色谱（HPLC）。 

烟雾/PBS溶液（CSS）的制备。根据Pryor等进行吸烟，没有使用Cambridge过滤嘴。使用早前由Nakayama等所述的基本上相同的烟收集方法。在水泵产生的恒定真空的帮助下，将3.8分钟过程中从燃烧8cm一支烟（Marlboro）产生的烟通过10ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液起泡，该溶液同时捕获气相和烟焦油化学物质。因为洗瓶壁上不存在水不溶性焦油化合物，来自单支香烟烟雾的大部分水溶性化合物包含于10ml PBS溶液中。在苯并[a]芘或其近似的代谢产物(+)-BaP-7,8-二醇的存在下，将称为烟雾溶液（CSS）的这种水溶液立即与外源DNA反应或加入培养中的MCF-7细胞中。使用不同稀释度的CSS（参见下文）。 

将迷迭香粉末状提取物掺入卷烟过滤嘴中。取下常规卷烟的过滤嘴，并将40mg迷迭香粉末状提取物放置在过滤嘴接近卷烟自身的空 位置中。如此操作之后，将过滤嘴重新装上。通过质谱分析评价该过滤嘴的作用。简而言之，将烟雾在含有3,3,5,5-四甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（TMPO）的有机溶液中起泡，TMPO是一种自旋捕获加合物。然后使用液相色谱、质谱分析定量羟基自由基加合物的含量。在所用的吸烟条件下，观察到羟基自由基减少30%。 

在稀释的烟雾溶液（CSS）存在下，外源DNA与(+)-BP-7,8-二醇的反应。将2ml小牛胸腺DNA（3mg/ml）加入5ml稀释20倍的CSS中，并根据以下的反应在室温与(+)-BP-7,8-二醇（终浓度3.6μM）反应2小时： 

DNA+[(+)-BP-7,8-二醇]+CSS→(-)-反-BPDE-N²-dG 

测量所得到的(-)-反-BPDE-dG加合物的水平（参见下文）。作为对照，进行了没用CSS的实验。 

细胞培养条件和处理。将人乳癌细胞系MCF-7生长于150cm²细胞培养烧瓶中的总体积20ml最小必需培养基E-MEM中，该培养基补充了10%FCS、15mM Hepes缓冲液和抗生素（200单位/ml青霉素、200μg/ml链霉素和25μg/ml氨苄青霉素）。在37℃下在5%CO₂/95%空气气氛中维持和处理细胞。 

MCF-7细胞覆盖烧瓶90%的表面积后，（汇合培养物分裂后2-3天），用20ml含有10%血清的新鲜培养基替换培养基。24小时后，用单独的DMSO或使用溶解于DMSO中的致癌物质（参见下文）和烟雾/PBS（CSS，参见上文）处理接近汇合的细胞，例如，超过90%的G0/G1期细胞。DMSO的终浓度不超过总孵育体积的0.1%。用单独的DMSO处理每个孵育组中包含的对照样品。 

a）用㈩-BP-7，8-二醇和烟雾处理MCF-7细胞。用单独的(+)-BP-7,8-二醇（0.2μM）或在不同稀释度的CSS存在下用(+)-BP-7,8-二醇（0.2μM）将细胞处理2小时。通过从CS和细胞CYP’s产生的ROO°激活(+)-BaP-7,8-二醇，分别形成(-)-反-BPDE-dG和(+)-顺-BPDE-dG。通过BP-四醇I-1和BP-四醇II-2的形成测量它们的水平（参见下文和图3）。 

b）使用BP的时间/剂量暴露实验。为了表征对BP的时间/剂量暴露和BPDE-dG水平，用含有终浓度为1.25、2.5和5.0μM的培养基将细胞（10×10⁶细胞/150cm²烧瓶，总体积20ml）分别处理6、12、18和24小时（两个烧瓶/剂量/时间点）。细胞中形成的BPDE-dG加合物以剂量和时间依赖性方式线性增加，如其他（30）也显示了。基于所获得的结果，选择了2.5μM作为BP的工作浓度。 

c）用BP和烟雾处理MCF-7细胞。为了观察CS浓度的作用，使用不同的CSS稀释度（1:79；1:39；1:19；1:9vol/vol）进行方案N°1的实验A。基于从该实验I获得的结果，选择了1:19（vol/vol）稀释度作为工作CS浓度。因此，根据方案1（参见图6－方案1），用BP（2.5μM）和CSS（稀释度1:19vol/vol）处理细胞（参见上文的“细胞培养和处理”）。 

所有孵育组使用一式两份的样品重复2-3次。在处理结束时，通过显微镜检查细胞的形态学变化，然后使用0.05%胰蛋白酶-EDTA（0.05%胰蛋白酶、0.14M NaCl、3mM KCl、0.1M Na₂HPO₄、1.5mM K₂HPO₄、0.5mM EDTA）通过胰蛋白酶作用来收集。加入等体积的含有10%FCS的培养基后，将细胞在1000g离心，用PBS洗涤三次，然后将细胞沉淀冷冻储存在-20℃。在收集时通过锥虫蓝排除测定法测定了用BP和烟雾或(+)-BP-7,8-二醇和烟雾处理的细胞的存活力大概为90%。所用的剂量没有显示出任何细胞毒性，如通过乳酸脱氢酶活性测定法所测量的（ELISA试剂盒，Boehringer，Mannheim）。 

DNA制备和水解。用RNA酶、蛋白酶K、盐化程序（31）和氯仿处理进行MCF-7细胞沉淀的DNA分离。简而言之，将细胞沉淀重悬浮于EDTA-十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液中[10mM Tris缓冲液、1mM Na2EDTA、1%SDS（w/v），pH8]，在37℃用RNA酶T1（2000U/ml）和RNA酶A（无DNA酶；100μg/ml）在摇床上（100rpm）孵育1小时。然后加入蛋白酶K（300μg/ml），并在37℃继续孵育过夜。消化后，将6M NaCl加入至1M的终浓度，接着在10000g离心。用2体积的乙醇将上清液中的DNA沉淀，用70%、100%的乙醇、醚 洗涤，干燥并溶解于10mM Tris缓冲液中。再次，加入RNA酶A（100μg/ml）和RNA酶T1（2000U/ml），将溶液在37℃孵育1小时，接着加入蛋白酶K（100μg/ml），在37℃再孵育2小时。用氯仿将溶液提取一次，离心，并用1M NaCl制得溶液。用2体积的冷乙醇将DNA沉淀。 

用100%乙醇冲洗待水解的DNA部分，以除去未结合的BP-四醇。将无未结合BP-四醇的DNA溶解于水中，并通过A_260nm测定DNA浓度。通过A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀的比例来确定纯度。将用于分析的一定含量的DNA水解，如之前所述的，在终浓度0.1N HCl中在90℃孵育4小时。这从BPDE-DNA加合物中释放出四醇（图3），具有>90%的回收率。用于注射的水解产物的体积为700μl，含有5-10μgDNA。 

BPDE-N²-dG加合物水平的测定。按照之前所述的[32，33]通过HPLC-FD测定加合物水平，使用r-7,c-9,t-8,t-10-四羟基-7,8,9,10-四氢苯并[a]芘（BP-四醇II-1）作为内标[34]。将水解产物装载于Latex顶柱模块（HD-Germany）上，该模块含有5μm用10%MeOH平衡的C₁₈反相材料（Nucleosil100），并用12ml10%MeOH洗涤20分钟。随后，通过Valco Instruments开关阀将顶柱打开，以流过4.6mm×25cm5μm C₁₈反相材料（Nucleosil100）分析柱（Alltech GmbH，Unterhaching，Germany）。用以下MeOH/H₂O梯度洗脱由水解获得的产物：50%，0-17分钟；50至60%，17-32分钟；60%，32-42分钟；60至100%，42-57分钟。BP四醇的停留时间为：BP四醇I-1（反-反-BP四醇）（35.2分钟）；BP-四醇II-1（反-顺-BP-四醇），内标（36.9分钟）；BP四醇II-2（顺-顺-BP-四醇）（42.3分钟）。在344nm的激发波长和398nm的发射波长测定荧光。因为在分开的MCF-7样品分析中没有检测到BP四醇II-1的形成，因此使用其作为内标（每个HPLC运行加入2pg），用于确定相对停留时间。检测极限是0.5pgBP四醇I-1和BP-四醇II-1。通过从就在分析MCF-7样品之前分析的可信BP-四醇标准品的荧光峰面积产生的标准曲线来测定每种BP-四醇的水平。(+)-反-BPDE-DNA加合物水解后，产生BP-四醇-I-1。(-)- 反-BPDE-dG的水解导致BP-四醇I-2的形成，然而，这是不稳定的，并且转变成BP-四醇I-1（图3）（38）。因此，通过HPLC运行中发现的BP-四醇I-1定量来测量所形成的(-)-反-BPDE-dG的水平。基于BPDE与DNA反应主要产生BPDE-N²-dG的发现（7），推定BP-四醇-I-1水平对应于BPDE-N²-dG的水平。一式两份地定量结合MCF-7DNA的BPDE水平。从等式1pmol/mg DNA/3.125=1加合物/10⁶核苷酸计算加合物水平。HPLC运行是定量可再现的，并且两个测试之间的可变性低于5%。 

通过BP诱变的机理已经得到了充分确定，并用作“分子标记”来建立肿瘤发展中特定遗传事件和致癌物质暴露之间的因果性（“确凿证据”）。“BP分子标记”对于确定烟雾是人肺癌的诱因，以及对于确立最小化烟雾的特定策略或引入预防性方法具有显著意义。癌症化疗中所用的特定药剂似乎是通过抑制致癌物质对DNA的损伤、突变发生、肿瘤助长和/或肿瘤进展来起作用的。 

已经研究了CS对BP-7,8-二醇生物转化成能够在人细胞中形成稳定DNA加合物的BPDE的相对作用。各种研究已经证明了稳定的PAH-DNA加合物可以通过核苷酸的错误结合或删除导致突变。CS是同时含有有机和无机化合物的复杂化学混合物的气雾剂，迄今为止已经鉴定了其中有4800种化合物。已知烟雾的汽相和颗粒相都具有自由基。而气相自由基通常是短寿的，颗粒相中的自由基相对稳定的，并且由氢醌、半醌、醌复合物组成，该复合物是活性氧化还原体系，能够将分子氧还原产生过氧化物，最终形成过氧化氢和羟基。此外，至少60种不同的CS致癌物质参与肿瘤开始和助长；CS中所含的最有效力的致癌物质是BP和NNK（4-(甲基硝基氨)-1-(3-吡啶)-1-丁酮）。 

烟雾对(+)-反-BPDE-dG的作用，使用伴随DNA加合的无细胞系统。为了说明BPDE-dG形成的机理依赖于烟雾所产生的活性氧，在伴随DNA加合的体外无细胞体统中寻找这种加合物。在(+)-BP-7,8-二醇的存在下，将含有气相和烟雾焦油的CSS溶液与DNA立即反应（参见以上的方案）。从该实验的结果表明CS可以将(+)-BP-7,8-二醇 氧化成(-)-反-BPDE，其随后形成(-)-反-BPDE-dG加合物。(-)-反-BPDE-dG的含量线性增加，并且是剂量依赖性的（参见图2）。 

之前发现了将烟雾捕获在PBS中后，从烟雾产生了大量活性氧，如H₂O₂和O₂ ^-。这种从烟雾产生的活性氧可能引起了所观察到的(-)-反-BPDE-dG的形成。为了证实这一点，检查了过氧化氢酶和超氧化物岐化酶（SOD）对所产生的(-)-反-BPDE-dG的作用，并发现了两种酶都抑制加合物的形成。失活的过氧化氢酶显示出没有作用（表1）。从这些结果推断出烟雾可以氧化(+)-BP-7,8-二醇，因此形成(-)-反-BPDE-dG，并且大体上可以通过从烟雾产生的氧的作用来解释这种活性。 

烟雾对用(+)-BP-7,8-二醇处理的MCF-7细胞中形成的(-)-反-BPDE-dG加合物的作用。已经表明有两条独立的途径参与BP-7,8-二醇代谢成BPDE（图3）。(+)-对映异构体的细胞色素P450依赖性代谢优先形成(+)-顺-BPDE，而涉及含血红素蛋白的途径连同过氧化物（例如，脂质过氧化物）优先形成(-)-反-BPDE。另一方面，(-)-BP-7,8-二醇可以通过这两条途径代谢，并导致(+)-反-BPDE和(-)-顺-BPDE的形成，(+)-反-BPDE是BP的最终形式。可以通过HPLC分析区分不同的途径，因为在本发明的条件下，能清楚地分开分别从反-和顺-BPDE产生的四醇。 

为了研究导致(-)-反-BPDE形成的(+)-BP-7,8-二醇的烟雾依赖性环氧化的更多作用，使用了人乳房细胞系MCF-7，(-)-反BPDE与DNA形成(-)-反-BPDE-dG加合物。使用MCF-7细胞来观察烟雾ROS对(+)-BP-7,8二醇激活的作用的原因是这些细胞具有很低的过氧化物酶活性。用(+)-BP-7,8-二醇处理细胞，(+)-BP-7,8-二醇是可以区分由ROS和CYP依赖性途径形成的加合物的立体化学探针（图3）。在对应于分别源自(-)-反-BPDE-dG和(+)-顺-BPDE-dG的BP-四醇I和BP-四醇II的色谱图上观察到截然不同的峰（参考文献32-34）。烟雾线性和剂量依赖性地增加了(-)-反-BPDE-dG的ROS依赖性形成（图4a）并减少了(+)-顺-BPDE-dG加合物的CYP依赖性形成，通过BP-四醇II 的形成来测量。这种减少也是剂量依赖性的，并且DNA加合物的倒数随着烟雾浓度线性增加（4b）。CS对(+)-顺-BPDE-dG的CYP依赖性形成的抑制作用和增加的(-)-反-BPDE-dG加合物形成进一步证实从烟雾产生的氧在(-)-反-BPDE-dG加合物形成中的作用。 

其他研究表明所诱导的CYP活性受到氧化攻击的削弱。作为这种现象的基础的机理是细胞色素P4501A1基因的下调。几乎没有过氧化物酶活性可能致使处于“应激”条件下的MCF细胞具有提高的DNA损伤和降低的修复能力。因此，这可能引起与BP-7,8-二醇激活无关的BPDE-DNA加合物的增加。 

烟雾对用BP处理的细胞中形成的BPDE-dG加合物的作用。之前使用MCF-7细胞培养物的研究揭示这些细胞具有可诱导的P4501B1和P4501A1活性。P450催化的BP代谢回转的存在和MCF-7细胞中可检测过氧化物酶活性的不存在，使得可以评价烟雾氧自由基对人细胞培养物中的BP激活的作用。MCF-7细胞具有高CYP1A1酶活性，用于BP的代谢激活，导致(-)-BP-7,8-二醇的形成，随后导致(+)-反BPDE-dG的形成（图1）。6小时时，加合物形成的水平显著低于暴露12小时和24小时后观察到的。用2.5μM BP处理6小时后，大约形成2000pg加合物/mg DNA，而在12小时和24小时后，分别存在超过11000pg和超过20000pg加合物/mgDNA（Wilcoxon Rank Sum Test，获得p=0.0022）。 

用BP将细胞处理12和18小时，以诱导(-)-BP-7,8二醇的形成，这是ROS的底物。对(-)-BP-7,8-二醇的优先形成的间接确认是HPLC运行时不存在源自顺-BPDE的BP-四醇II，其前体物质是(+)-BP-7,8-二醇（图3）。然后将细胞暴露于烟雾的CSS和BP下2小时。HPLC运行显示对应于源自(+)-反-BPDE-dG的BP-四醇I的色谱图上只存在一个峰。图5中呈现了用CSS处理的细胞和那些未处理的（对照）之间的差异。如上所述，该研究所用的细胞系在由CS引起的氧化攻击后维持降低CYP1A1表达的能力。细胞色素P450的抑制可能减少了BP活化成(-)-BP-7,8二醇和(+)-反-BPDE。因此，由CS引起的提高的 差异是由于从CS产生的ROS引起的提高的(-)-BaP-7,8-二醇代谢所引起的。对于用CS与对照处理14小时和20小时，Wilcoxon Rank Sum Test分别获得p=0.0022。最近，由DNA的BP引起的剧烈损伤发生在形成BPDE-dG加合物的人支气管上皮细胞中，认为该加合物对于人支气管上皮细胞肺癌的开始是“关键的”。因此，烟雾中产生的活性氧物质在支气管细胞中的这种“关键”加合物的形成中起着重要作用（图1）。 

含有迷迭香提取物的过滤嘴对BPDE-dG加合物形成的作用。由于其理想的香味和高抗氧化活性，迷迭香（Rosmarinus officinalis Labiatae）草和油通常用作食品加工中的香料和调味剂。迷迭香提取物、鼠尾草酚或熊果酸对小鼠皮肤的局部应用抑制了苯并[a]芘与上皮DNA的共价结合、由7,12-二甲基苯并蒽（DMBA）引起的肿瘤开始、TPA诱导的肿瘤助长、鸟氨酸脱羧酶活性和炎症。迷迭香提取物被证明不仅在促进期有效，而且在起始期也有效。迷迭香提取物、鼠尾草酸和鼠尾草酚强烈抑制I期酶、CYP450活性并诱导II期酶、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和醌还原酶活性的表达。鼠尾草酚抑制激活的巨噬细胞中一氧化氮（NO）产生。已经将抗氧化特性称为保护性作用的机械论基础。 

为了除去烟雾中的自由基和活性氧种类，将少量迷迭香粉末掺入标准过滤嘴中（参见材料）。通过掺入迷迭香提取物的过滤嘴诱导的浓缩物中自由基的减少通过CSS的羟基含量的定量来估算由掺入迷迭香提取物的过滤嘴所诱导的浓缩物中自由基的减少，使用旋转捕获（TMPO），使用LC-ESI-MS/MS。在所用的吸烟条件下，观察到羟基30%的减少。由于这种过滤嘴降低烟雾中自由基水平的效率，如与相当的不含添加剂的标准Marlboro过滤嘴相比，使用MCF-7细胞比较了通过这种过滤嘴与标准过滤嘴的CS对BPDE-dG形成的作用。 

用BP处理MCF-7细胞时，获得了图6中呈现的结果。进行了两组实验（A和B）。用BP将细胞分别处理12和18小时，接着用来自两种过滤嘴的CSS和BP一起再处理2小时（方案1）。为了评价 这最后2小时过程中，加合物的CYP依赖性增加，每组进行了两个对照：A组为12和14小时，B组为18和20小时。来自标准过滤嘴的CSS使14和20小时时获得的结合水平加倍。 

然而，迷迭香过滤嘴强烈地阻止由标准过滤嘴获得的增加，在这两个组中超过70%（图6）。改良的过滤嘴清除了ROS并随后减少了(-)-BP-7,8-二醇的活化（图3）。除了自由基的减少，迷迭香粉还具有减少BPDE-dG形成的其他机理。 

使用完整的迷迭香提取物（6μg.ml^-1）与1.5μM BP共同孵育6小时后，还将人支气管上皮细胞中的CYP1A1活性和DNA加合物形成抑制了80%（BEAS-2B）。因此，使用减少自由基的量以减少关键致癌加合物的形成的过滤嘴对于成瘾的吸烟者是重要的益处。 

因此，本发明的迷迭香卷烟过滤嘴对于目的在于减少支气管上皮细胞中的BPDE-dG的化学预防性计划是一种具有前景的候选物。 

应理解本发明的以上描述易于受到各种改进、改变和变化，并且这些意欲包括在所附权利要求的等价含义和范围之内。例如，最明显的改进是使用各种凝胶材料作为物质的电响应组合物。 

因此，将看到能有效达到以上所列的从之前的描述变得清楚的目的，因为可以在实施上述方法（过程）中进行某些改变，而不脱离本发明的精神和范围，以上描述中所含的所有物质都将被解释为说明性的，而非是限制意义的。 

还应理解以下的权利要求旨在涵盖在此所述的本发明的所有一般的和特定的特征和按照表述可被认为落入其间的本发明范围的所有陈述。 

Claims (10)

1.通过抽吸带有过滤嘴的卷烟来减少人肺部的来自所产生的烟雾的苯并[a]芘二醇环氧化物-dG（BPDE-dG）加合物的方法，所述方法包括使烟雾通过过滤嘴的步骤，其中所述过滤嘴用唇形科（Labiatae）植物的提取物浸渍过，其中所述提取物包括多酚化合物或其衍生物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述植物是迷迭香。

3.根据权利要求1的方法，其中通过用醇溶剂或水醇溶剂提取来产生提取物。

4.通过抽吸带有过滤嘴的卷烟来减少人肺部的来自所产生的烟雾的苯并[a]芘二醇环氧化物-dG（BPDE-dG）加合物的方法，所述方法包括使烟雾通过过滤嘴的步骤，其中所述过滤嘴用含有至少一种多酚化合物或其衍生物的混合物浸渍过。

5.根据权利要求4的方法，其中所述混合物包含至少一种选自鼠尾草酚、迷迭香酚、迷迭香酸和鼠尾草酸的多酚化合物或其衍生物。

6.根据权利要求5的方法，其中所述混合物包含鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酸和迷迭香酚。

7.根据权利要求6的方法，其中所述混合物包含鼠尾草酸或鼠尾草酚。

8.根据权利要求7的方法，其中所述过滤嘴包含0.5g至0.1mg的至少一种多酚化合物或其衍生物。

9.根据权利要求7的方法，其中所述过滤嘴包含0.01g的至少一种多酚化合物或其衍生物。

10.根据权利要求7的方法，其中将所述至少一种多酚或其衍生物与聚合载体偶联或置于微胶囊基质中或加入到过滤嘴的纤维中。

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