KR20090089974A

KR20090089974A - 헨린을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항염증 효능의화장료 및 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR20090089974A
Application number: KR1020080015173A
Authority: KR
Inventors: 이선주; 부희정
Original assignee: 재단법인 제주하이테크산업진흥원
Priority date: 2008-02-20
Filing date: 2008-02-20
Publication date: 2009-08-25

Abstract

본 발명은 헨린(henryin)을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항염증 효능의 화장료 및 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 헨린은 천연식물에서 유래된 안전한 성분으로, 멜라닌 생합성 억제 효과를 보이며, NO 억제 및 염증 관련 유전자들의 mRNA 발현 억제를 통한 항염증 효과를 가지므로, 헨린을 유효성분으로 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 안전하고 효과적인 미백 및 항염증용 화장료 및 피부 외용제로 사용될 수 있다.

헨린, 미백, 항염증

Description

헨린을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항염증 효능의 화장료 및 피부 외용제 조성물{COSMETIC AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR WHITENING AND ANTIINFLAMMATORY EFFECT COMPRISING HENRYIN}

본 발명은 헨린(henryin)을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항염증 효능의 화장료 및 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는, 멜라닌 생성 억제작용이 우수하여 과다한 색소 침착으로 인한 피부질환에 대한 천연 미백제로서, 그리고 염증으로 유도되는 피부질환, 주름, 색소침착에 대하여 피부 외용제로 사용할 수 있는 헨린을 유효성분으로 함유하는 화장료 및 피부 외용제 조성물과 관련된다.

헨린(henryin)은 식물에서 추출 분리한 디터페노이드(diterpenoid) 화합물로 다음 화학식 1의 구조를 갖는다. 기존에 분리된 디터페노이드에 관해서는 세포독성, 항암, 항균 그리고 항염에 대한 연구 보고(Han-Dong Sun, Sheng-Xiong Huang 및 Quan-Bin Han, "Diterpenoids from Isodon species and their biological actvities", Natural Product Reports, 2006, 23: 673-698)가 있지만, 헨린의 경우 미백 효과나 항염 효능에 대한 연구나 보고는 전무하다.

인간의 피부색이 표현되는 데 결정적인 역할을 하는 것이 피부 표피의 기저층에 있는 멜라닌 형성세포(melanocyte)에서 만들어지는 멜라닌 색소이다. 멜라닌은 동식물계에 널리 존재하는 생체 고분자 물질로서 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는 중요한 역할을 하는데(Y. Mishima, S. Hatta, and Y. Ohyama., “Induction of melanogenesis suppression: cellular pharmacology and mode of differential action”, Pigment Cell Res., 1998, 1, 367; H. Matubara, “Inhibitory effect of lichen metabolites and their synthetic analogues on melanin biosynthesis in cultured B-16 mouse melanoma cells”, Nateral Product Sciences, 1998, 4, 3.), 비정상적으로 과잉 생산되는 경우에는 기미나 주근깨 등 미용상의 문제를 일으키고, 반대로 너무 적게 생산되면 백반증과 같은 피부 병변이 유발된다. 특히, 기미나 주근깨 같은 과색소침착은 표피 내의 멜라닌 생성 및 분포가 증가되면서 나타나는 질환으로, 이를 치료하기 위 한 화장료 또는 약제는 하얀 피부를 선호하는 동양권에서 화장품 시장 및 의료 시장의 큰 부분을 형성하고 있다. 멜라닌 형성세포(melanocyte)는 자외선, 피부의 염증 반응, 호르몬 이상, 유전질환, 화학적 자극 등에 의해 활성화되고, 증식 및 분화하여 멜라닌 색소를 과다하게 만들어 결국 피부 색소 침착을 일으킨다. 특히, 피부의 멜라닌 색소를 증가시키는 대표적인 인자인 자외선에 의한 자극은 최근 환경오염에 따른 오존층의 파괴와 여가활동에 대한 욕구가 많아지면서 더욱 많아지게 되었다.

자외선은 피부에 침투하면서 비타민 D가 합성되어 칼슘의 흡수를 도와 골격과 치아 발육을 촉진하고, 비타민 A의 효과 상승 작용 및 살균 소독 작용 등의 중요한 역할을 하는 반면, 홍반, 색소 침착, 만성 반응으로 나타나는 피부 노화, 피부암의 유발 등 인체에 유해하거나 미용상의 문제를 야기한다. 자외선에 의한 피부색소 증가 경로는 명확하게 밝혀지지는 않았지만 주로 각질형성세포(keratinocyte)에서 분비되는 인자들에 기인한다. 자극된 각질형성세포가 분비하는 인자들로는 ET-1(endothelin-1)(Imokawa G, Kobayashi T, Miyagishi M, Higashi K, Yada Y. “The role of endothelin-1 in epidermal hyperpigmentation and signaling mechanism of mitogenesis and melanogenesis”, Pigment Cell Res. 1997, 10:218-28), α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone), ACTH(adrenocorticotropic hormome)(Brilliant MH, Barsh GS, Anatomy of pigment cell genes acting at a cellular level. In: Nordlund JJ, Boissy RE, Hearing VJ, King RA, Ortonne J-P. The Pigmentation System. Oxford University Press, 1998, 217-229), NO(nitric oxide)(Joshi, M., J. Strandhoy, and W. L. White., “Nitric oxide synthase activity is up-regulated in melanoma cell lines: a potential mechanism for metastases formation”, Melanoma Res. 1996, 6: 121-126)등이 있다.

기능성 미백화장품은 과다하게 생성되는 멜라닌 색소의 억제 및 자외선 차단을 통해 색소 침착을 억제하고, 생성된 멜라닌 색소의 환원작용을 통하여 미백효과를 유도한다. 멜라닌 생성을 억제하는 물질로는 하이드로퀴논(hydroquinone), 레조시놀(resorcinol) 등의 페놀 유도체나, L-아스코르빈산(L-ascorbic acid)와 그 유도체 및 아르부틴(arbutin), 젖산(lactic acid), 글루코사민(glucosamine), 투니카마이신(tunicamycin) 등이 개발되었으나, 피부 자극성이나 안전성에 문제가 있어 극히 제한된 양으로만 사용되는 것들이 많다(Maeda K., “Recent studies of melanogenesis and its control”, Fragrance Journal, 1997, 25(9), 10-18; 박수남, 천연물의 피부 세포에 미치는 영향, 대한화장품학회지, 1999, 25(2); Egawa, M., Sakamoto, T., Kumano, Y., “Whitening effect of vitamin C and its derivatives”, Fragrance Journal, 1997, 25(9):37-42).

자외선에 의해 그 생성이 촉진되어 멜라닌 합성을 활성화시키고 염증과 피부노화를 유도하는 물질 중의 하나인 NO(nitric oxide)는 대기오염 물질이며 담배연기에 포함된 수많은 화학물질 중의 하나로서 독성을 가진 매우 불안한 기체로, 고농도에는 세포의 기질적 손상을 초래하는 자유 라디칼(free radical)의 하나이다. NO는 NOS(nitric oxide synthase)에 의해서 유도되며, 일부 세포에서 LPS, 사이토카인(cytokines) 및 박테리아 독소 같은 특수한 자극제들에 노출되는 경우에만 발 현되는 NOS를 Type Ⅱ인 inducible NOS(iNOS)라고 한다(Nathan, C., and G. W. Xie. “Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controls”, Cell, 1994, 78:915-916). 자극에 의해 유도된 iNOS는 오랜 기간 동안 다량의 NO를 생성하게 되고, 생성된 NO는 구아닐 사이클라제(guanylyl cyclase)의 활성과 동시에 주위 조직에 세포독성을 나타내는 것이 특징이다. NO는 매우 작으면서도 반응성이 있고 전기적으로 중성이기 때문에, 합성된 곳에서 곧바로 확산되어 사방으로 퍼져 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다(Knowles, R. G. and Mocada, S. “Nitric oxide as a signal in blood vessels”, TIBS., 1992, 17: 399). 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 병리적인 원인에 의한 과도한 NO의 형성은 정상세포의 손상을 초래하여 염증을 유발시키며 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다.

염증이 발생하게 되면 그 후에 일반적으로 과색소 형성이 일어나게 되는데, 자외선이나 세균감염 때 생긴 염증으로 얼굴색이 검게 변하고 기미와 잡티가 생겨나기도 한다. 이때 피부에 존재하는 세포인 림프구(lymphocyte), 대식세포 (macrophage), 내피세포(endothelial cell), 섬유아세포(fibroblast) 등 염증반응과 관련된 세포들이 관여하게 되고(한영숙, 항염증성 천연추출물이 멜라닌 생성에 미치는 영향, 아주대학교, 박사학위논문, 2002), 이 세포들이 LPS (lipopolysaccharide), INF-γ(interferon-γ) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 자극제들에 노출되면 iNOS의 발현이 증가되어 이로 인한 NO 생성이 증가 되면서 염증반응을 촉진할 뿐 아니라 색소 침착과 피부 노화 등을 유도한다.

염증 반응시 생성되는 아라키돈산 대사물과 히스타민과 같은 염증 매개 물질들을 첨가한 멜라닌 세포 배양시 타이로시나제(tyrosinase)의 활성이 증가되고 멜라닌 세포의 성장과 증식이 촉진된다고 보고되어 있다(Tomita Y, Maeda K, Tagami H. “Mechanisms for hyperpigmentation in postinflammatory pigmentation, urticaria pigmentosa and sun burn”, Dermatologica , 1989, 1:49-53; Tomita Y, Maeda K, Tagami H. “Melanocyte-stimulating properties of arachidonic acid metabolites: possible role in post-inflammatory pigmentation”, Pigment Cell Res., 1992, 5(5 Pt2):357-61). 실질적으로 항염증제인 코르티코스테로이드(corticosteroid)나 인도메타신(indomethacin)을 피부에 도포하였을 때 자외선에 의한 홍반이 호전되고, 피부의 과색소침착이 억제된다는 보고가 있다(Takiwaki H, Shirai S, Kohno H, Soh H. “The degrees of UVB-induced erythema and pigmentation correlate linearly and are reduced in a parallel manner by topical anti-inflammatory agents”, J Invest Dermatol, 1994, 103:642-6).

본 발명의 목적은 인체에 무해하고 친환경적인 천연물질을 활용하여 좀 더 안전하고 고기능성인 새로운 미백 및 항염증 효능이 있는 화장료 및 피부 외용제 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 헨린(henryin)을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항염증용 화장료 및 피부 외용제 조성물을 제공한다.

여기에서, 헨린은 조성물 전체 중량에 대하여 0.00001 내지 10 중량%로 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 헨린(henryin)이 미백 효능 및 항염증 활성을 나타내는 활성 물질임을 밝히고, 그 화학적 구조를 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 방법으로 확인하였다.

헨린(henryin)의 미백 효능 및 항염증 효과는 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성 억제와, 대식세포를 통한 NO 생성 억제, 그리고 염증 관련 유전자들의 mRNA 발현 억제 효과를 통하여 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 헨린을 유효성분으로 하는 화장료 및 피부 외용제 조성물에 있어서, 헨린의 함량은 조성물 전체 중량의 0.00001 내지 10 중량%인 것이 바람직하다. 헨린의 함량이 0.00001 중량% 미만이면 원하는 미백 및 항염증 효과를 기대하기 어렵고, 10 중량%를 초과하면 제제화에 문제가 발생한다.

본 발명에 따른 헨린을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항염증용 화장료 및 피부 외용제 조성물은 크림, 로션, 에센스 및 팩 등으로 제형화 할 수 있다. 이들 제형은 통상적으로 그 제형에 사용되는 성분들과 함께, 유효성분으로 헨린을 상기 함량 범위 내에서 적절히 혼합하여 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 및 피부 외용제 조성물에서 유효성분인 헨린은 천연식물에서 유래된 안전한 성분으로, 멜라닌 생합성 억제 효과를 보이며, NO 억제 및 염증 관련 유전자들의 mRNA 발현 억제를 통한 항염증 효과를 갖는다. 따라서, 헨린을 유효성분으로 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 안전하고 효과적인 미백 및 항염증용 화장료 및 피부 외용제로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의거하여 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예만으로 제한되는 것은 아니다.

아래 실시예에서는 식물로부터 헨린을 추출 정제하고, 이와 같은 미백 및 항염증 효과를 가지는 유효성분인 헨린의 구조를 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 사용하여 확인하였다.

그리고, 헨린의 미백 효능을 확인하기 위하여 마우스 멜라닌 세포인 melan-a 세포와 B16를 이용하여 멜라닌 생합성 억제 효과를 확인하였다.

또한, 헨린의 항염증 효과를 확인하기 위하여 마우스 대식세포(macrophage)인 RAW 264.7 세포를 LPS로 자극시킨 후 헨린의 NO 생성 억제 효과를 확인하였으 며, iNOS 및 염증 관련 유전자들의 mRNA 발현 억제 효과를 확인하였다.

실시예 1: 헨린(henryin)의 추출 및 정제

산박하(Rabdosia inflexa) 지상부 건조 분말 142 g에 80% 메탄올 15 L를 가하여 실온에서 두 달간 추출하였다. 추출한 시료를 감압여과 장치를 통하여 여액을 취하고 감압 농축하여 80% 메탄올 추출물 20 g을 얻었다. 80% 메탄올 추출물을 증류수 1 L에 현탁시켜 분별 깔대기에서 헥산으로 추출하고 헥산층을 제거한 후, 에틸아세테이트로 다시 추출하여 에틸아세테이트층 4.478 g을 얻었다. 얻어진 에틸아세테이트 농축액을 셀라이트에 흡착시킨 후 칼럼에 충진하여 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 메탄올로 순차적으로 용출하였다. 그중 멜라닌 생합성 억제 효능이 좋은 메틸렌클로라이드 분획물 3.297 g을 가지고 순상 실리카겔 컬럼을 수행하였다. 이때 사용한 용리액으로는 순차적으로 클로로포름에서 100% 메탄올을 통과시켜 총 11개의 분획을 얻어내었고, 이중 분획 fr2 1.53 g을 다시 순상 컬럼(CHCl₃:MeOH=10:1)을 통하여 6개의 분획을 얻었다. 이들 분획 중 fr2-2(0.854 g)을 다시 순상 컬럼(CHCl₃:MeOH=15:1)을 통하여 7개의 분획을 얻고, 분획 fr2-2-3은 다시 prep-HPLC를 실시하여 헨린 5.2 ㎎을 얻었다.

도 1은 헨린의 추출 및 분리 정제 과정을 나타낸 모식도이다.

실시예 2: 헨린(henryin)의 구조 분석 및 확인

NMR 스펙트럼으로 헨린의 구조를 확인하였으며, 문헌(Zhang, Hongjie.; Sun, Handong. "Diterpenoids from Rabdosia flexicaulis, Phytochemistry", 1961, 28:3543-3546)의 결과와 잘 일치하였다.

다음 표 1은 헨린의 NMR 스펙트럼 데이터(CD₃OD 중)를 나타낸 것이다.

헨린의 NMR 스펙트럼 데이터

C No.	δH (multi, J Hz)	δC (ppm)	δC (ppm)	Dept	HMBC (H→C#)
1	3.31 (m)	82.8	81.5	CH	9, 20
2	1.76 (m), 1.64 (m)	32.3	31.6	CH₂	7
3	1.45 (m)	40.8	39.9	CH₂	2, 10
4		33.7	33.1	C
5	1.02 (m)	53.3	52.2	CH	6, 7, 10, 18, 19, 20
6	2.15 (m), 1.29 (m)	30.5	30.2	CH₂	5, 9, 10
7	4.11 (dd, J = 4.4, 12.2Hz)	75.7	74.6	CH	8, 14
8		62.3	61.9	C
9	1.61 (m)	57.2	56.3	CH	1, 8, 11, 12, 14, 20
10		46.7	45.9	C
11	1.38 (m), 1.35 (m)	20.7	20.3	CH₂	9
12	1.95 (m), 1.94 (m)	31.1	30.8	CH₂	5, 9, 10
13	2.97 (m)	47.7	47.0	CH	8, 9, 12
14	4.91 (s)	77.3	76.0	CH	15, 16
15		209.6	208.7	C
16		150	150.0	C
17	6.07 (brs)	117.4	115.9	CH₂	13, 15, 16
	5.38 (brs)				13, 15
18	0.94 (s)	34	33.1	CH₃	3, 4, 5, 19
19	0.88 (s)	21.8	21.5	CH₃	3, 4, 5
20	4.52 (d, J = 13.6Hz)	65.7	64.8	CH₂	1, 5, 9, 10
	4.45 (d, J = 13.6Hz)
OAc		172.3	170.5	C
OAc	2.13 (s)	21.4	21.5	CH₃	21

도 2는 헨린의 ¹H-NMR 스펙트럼(CD₃OD 중), 도 3은 헨린의 ¹³C-NMR 스펙트럼(CD₃OD 중), 도 4는 헨린의 DEPT 스펙트럼(CD₃OD 중), 도 5는 헨린의 HMBC 스펙트럼(CD₃OD 중), 그리고 도 6은 헨린의 선택된 key HMBC correlations(H → C)를 보여주는 모식도이다.

실시예 3: 헨린( henryin) 의 멜라닌 생성 억제 효과

(1) 멜라닌 생성 억제 실험

melan-a 세포는 비-발암성 멜라닌 세포주(non-tumorigenic mouse melanocyte cell line)로서, 정상 마우스 멜라닌 세포의 성질을 대부분 가지고 있으면서도 불멸화(immortalization)되어 실험에 용이하게 사용할 수 있다. 따라서, melan-a 세포를 이용하여 시료 추출물의 멜라닌 생성 억제 정도를 측정하였다.

Melan-a 세포를 RPMI 배지를 이용하여 24-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/mL로 플레이팅 한 후, 시료를 처리하여 37 ℃, 10 % CO₂ 항온기에서 3 일간 배양하였다. 플레이트의 배지를 제거하고 세포를 수확하여 1 mM의 1N NaOH로 세포를 완전히 녹인 후 450 nm에서 ELISA 판독기(multiwell microplate reader)로 측정하여 대조군과 비교하였다.

합성 멜라닌을 이용하여 표준용액을 만들고 샘플과 표준용액을 96-웰 플레이트에 넣고 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌으로 작성된 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다.

시료 추출물이 멜라닌 암세포인 B16 마우스 멜라닌세포에도 유의한 효과가 나타나는지 확인하기 위하여, B16 세포에서의 멜라닌 생성 억제 정도를 측정하였다. B16 멜라닌세포를 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM) 배지를 이용하여 6-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰로 플레이팅 한 후, 시료를 처리하여 37 ℃, 5 % CO₂ 항온기에서 3 일간 배양하였다. 플레이트의 배지를 제거하고 세포를 수확하여 1N NaOH로 세포를 완전히 녹인 후 450 nm에서 ELISA 판독기로 측정하여 대조군과 비교하였다.

* 세포의 Viability 측정(MTT assay)

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 정량은 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다. 멜라닌 양 측정 시 플레이트를 이중으로 하여 똑같은 방법으로 시료를 처리하고 배양 후 MTT(50 ㎎/mL) 시약을 처리(0.1 ㎎)하였으며, 형성된 포르마잔(formazan)을 DMSO로 녹인 후 540 nm에서 ELISA 판독기로 측정하여 대조군과 비교하였다.

다음 표 2는 마우스 피부세포의 멜라닌 생성량에 대한 헨린의 영향을 보여주는 것이다.

마우스 피부세포의 멜라닌 생성량에 대한 헨린의 영향

세포 타입	헨린 처리 농도(㎍/mL)	멜라닌 생성량 저해(%)	MTT(%)
Melan-a	2	64.5±0.2	5±2.7
	1	44.2±1.1	0.5±0.7
	0.5	23.8±2.4	-0.5±0.7
	아르부틴(100)	31.6±0.7	-1.4±1.2
B16F10	2	44.8±0.7	0.8±0.2
	1	24.7±5.6	0.4±0.4
	0.5	8±1.2	-5.8±0.7
	아르부틴(100)	18.8±3.8	-11.2±0.6

위 표 2에서 보듯이, 헨린은 세포 증식에 영향을 미치지 않으면서도, melan-a 및 B16 세포 모두에서 처리 농도에 비례하여 대조군으로 사용된 아르부틴 (arbutin)에 비해 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었다.

(2) UV B 조사에 따른 멜라닌 생성 억제 효과 측정

RPMI 배지를 이용하여 melan-a 세포를 24-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/mL로 플레이팅한 후 시료를 처리하여 37 ℃, 10 % CO₂ 항온기에서 하루 동안 배양하였다. 다음 날부터 이틀 동안 UV B 10 mJ/㎠로 조사한 후 시료가 들어있는 새 배지로 교환하고 하루 동안 더 배양하였다. 플레이트의 배지를 제거하고 세포를 수확하여 1N NaOH로 세포를 완전히 녹인 후 450 nm에서 ELISA 판독기로 측정하여 대조군과 비교하였다.

다음 표 3은 UV B 조사 후 마우스 피부세포의 멜라닌 생성량에 대한 헨린의 영향을 보여주는 것이다.

UV B 조사 후 마우스 피부세포의 멜라닌 생성량에 대한 헨린의 영향

세포 타입	헨린 처리 농도(㎍/mL)	멜라닌 생성량 저해(%)	MTT(%)
Melan-a	2	70±0.1	35.7±0.6
	1	57.7±0.2	12±0.1
	0.5	53.9±4.8	6.7±0.1
	아르부틴(100)	49.4±10.9	-17±5.6
B16F10	2	14.2±0.5	6.3±1.7
	1	8.7±1.5	5.7±3
	아르부틴(100)	8.4±1.6	10.8±1

위 표 3에 나타난 바와 같이, UV B 조사 후 생성되는 과색소 형성에 대한 헨린의 멜라닌 생성 억제 효과를 볼 때, melan-a 세포에서는 1 및 0.5 ㎍/mL 농도에서 세포 증식에 큰 영향을 미치지 않으면서 대조군인 아르부틴에 비해 다소 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 보였으며, B16 세포에서는 모든 처리 농도에서 세포 증식에 영향을 미치지 않으면서 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었다.

실시예 4: 헨린(henryin)의 NO 생성 억제 효과

(1) NO(nitric oxide) 분석

RAW 264.7 세포에서 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 생성된 NO의 양은 Griess 시약으로 측정하였다. RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵ 세포/mL로 조절한 후 24-웰 플레이트에 접종하고, 실험물질과 LPS(1 ㎍/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약[2.5 %(v/v) 인산에 1 %(w/v) 설파닐아마이드와 0.1 %(w/v) 나프틸에틸렌디아민] 100 ㎕를 혼합하여 96-웰 플레이트에서 10 분 동안 반응시킨 후 ELISA 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 아질산나트륨(NaNO₂)을 단계 희석하여 얻었다(1-100 μM).

(2) 세포독성 평가

RAW 264.7 세포(1.5×10⁵ 세포/mL)를 함유하는 DMEM 배지에 실험물질과 LPS(1 ㎍/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 배양 배지를 얻어 12,000 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. LDH(lactate dehydrogenase) 활성을 비방사성 세포독성 검사 키트(non-radioactive cytotoxicity assay kit, Promega, USA)를 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트에 원심분리하여 얻은 배양 배지 50 μL와 재구성된 기질 혼합물(reconstituted substrate mix) 50 μL를 넣고 실온에서 30 분 반응시킨 후, 50 μL의 반응 정지 용액(stop solution)을 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH 대조군, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.

다음 표 4는 헨린의 NO 생성 억제 및 세포독성 측정 결과를 보여주는 것이다.

헨린의 NO 생성 억제 및 세포독성 측정 결과

샘플(㎍/mL)	NO(uM)	억제(%)	LDH 활성(%)
LPS(-)	-	100	-
LPS(+)	31.76	0	-
헨린 (5)	0.67	97.88±0.6	33±0.5
헨린 (2.5)	3.04	90.44±0.3	8.2±0.8
헨린 (1)	8.13	74.41±1.1	-5.3±2.5

위 표 4에 나타낸 바와 같이, 헨린은 2.5 ㎍/mL와 1 ㎍/mL의 농도에서는 세포독성 없이 우수한 NO 생성 억제 효능을 보였다.

실시예 5: 염증 관련 유전자들의 mRNA 발현 억제 효과

RT-PCR

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵ 세포/mL로 조절한 후 24-웰 플레이트에 접종하고, 실험물질과 LPS(1 ㎍/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 배지를 깨끗이 제거한 후 TRIzol(Invitrogen, USA) 을 이용하여 RNA를 추출하였다. 1 μL의 총 RNA를 oligo(dT)18 프라이머, dNTP(0.5 μM), 1 unit RNase 억제제, M-MuLV reverse transcriptase(2U)로 70 ℃ 5 분, 4 ℃ 5 분, 37 ℃ 60 분, 그리고 70 ℃에서 10 분간 처리하여 cDNA를 합성하였다.

합성된 cDNA로부터 프라이머들을 증폭시키기 위하여 다음과 같이 PCR(polymerase chain reaction)을 실시하였다: 2 μL cDNA, 10×완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% 트리톤 X-100), 250 μM dNTP, 1 unit Taq polymerase(Promega, USA)를 증류수로 전체를 25 μL로 맞춘 후 94 ℃에서 30 초간 변성, 58 ℃에서 30 초간 어닐링, 72 ℃에서 40 초간 연장을 30 사이클 수행하여 증폭시켰다. 사용된 프라이머는 다음 표 5와 같다.

유전자 발현 측정을 위한 증식 프라이머

유전자	프라이머 서열(5'-3')	단편 크기(bp)
β-Actin	R: TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C F: TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G	603
iNOS	F: CCC TTC CGA AGT TTC TGG CAG CAG C R: GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT TTG G	496
COX-2	F: CAC TAC ATC CTG ACC CAC TT R: ATG CTC CTG CTT GAG TAT GT	696
TNF-α	F: TTG ACC TCA GCG CTG AGT TG R: ATG CTC CTG CTT GAG TAT GT	364
IL-6	F: GTA CTC CAG AAG ACC AGA GG R: TGC TGG TGA CAA CCA CGG CC	308
IL-1β	F: CAG GAT GAG GAC ATG AGC ACC R: CTC TGC AGA CTC AAA CTC CAC	447

도 7은 헨린이 iNOS와 COX-2 mRNA 발현에 미치는 영향을 보여주는 RT-PCT 결과를 나타낸 사진이다. 여기에서 보면, LPS에 의하여 iNOS는 현저하게 증가하였으며, 헨린은 iNOS의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 억제하고 있음을 확인할 수 있다. 또한, 헨린은 COX-2의 mRNA 발현도 농도 의존적으로 억제하였다.

한편, 사이토카인 mRNA 발현에 대한 억제 효과를 조사하기 위하여 LPS와 헨린을 함께 처리하여 RT-PCR을 시행하였다.

도 8은 헨린이 pro-inflammation의 mRNA 발현에 미치는 영향을 보여주는 RT-PCT 결과를 나타낸 사진이다. 여기에서 보면, 헨린을 처리하였을 때 TNF-α, IL-6, IL-1β의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제되었고, 특히 IL-6의 mRNA 발현이 가장 강하게 억제된 것을 확인할 수 있다.

도 1은 헨린의 추출 및 분리 정제 과정을 나타낸 모식도.

도 2는 헨린의 ¹H-NMR 스펙트럼(CD₃OD 중).

도 3은 헨린의 ¹³C-NMR 스펙트럼(CD₃OD 중).

도 4는 헨린의 DEPT 스펙트럼(CD₃OD 중).

도 5는 헨린의 HMBC 스펙트럼(CD₃OD 중).

도 6은 헨린의 선택된 key HMBC correlations(H → C)를 보여주는 모식도.

도 7은 헨린이 iNOS와 COX-2 mRNA 발현에 미치는 영향을 보여주는 RT-PCT 결과를 나타낸 사진.

도 8은 헨린이 pro-inflammation의 mRNA 발현에 미치는 영향을 보여주는 RT-PCT 결과를 나타낸 사진.

Claims

헨린(henryin)을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항염증용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 헨린은 조성물 전체 중량에 대하여 0.00001 내지 10 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 미백 및 항염증용 화장료 조성물.
헨린(henryin)을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항염증용 피부 외용제 조성물.
제 3 항에 있어서, 헨린은 조성물 전체 중량에 대하여 0.00001 내지 10 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 미백 및 항염증용 피부 외용제 조성물.