KR20090083940A - 데옥시케토헥소스 아이소머라제 및 그것을 이용한 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법 - Google Patents

데옥시케토헥소스 아이소머라제 및 그것을 이용한 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법 Download PDF

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고도카이샤 기쇼토 세이산 기쥬츠 겐큐쇼
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Abstract

데옥시이즈모링(deoxyizumoring)을 기초로 한 알도헥소스, 케토헥소스, 당 알코올 모두에 대응하는 1- 또는 6-데옥시 화합물 및 이의 체계적인 제조 방법을 제공한다. 슈도모나스 시커리 ST-24(FERM BP-2736) 유래의 데옥시케토헥소스 아이소머라제를 사용하고, 원료로 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스의 3번 위치를 에피머화(epimerization)하여, 목적물로서 대응하는 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 것을 특징으로 하는 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법을 제공한다.

Description

데옥시케토헥소스 아이소머라제 및 그것을 이용한 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법{DEOXYKETOHEXOSE ISOMERASE AND METHOD FOR PRODUCING DEOXYKETOHEXOSE AND DERIVATIVE THEREOF USING THE SAME}
본 발명은 데옥시케토헥소스 아이소머라제 및 이를 이용한 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
수많은 복잡한 탄수화물들은, 예를 들면, 세포 - 세포 인식, 세포 증식 및 세포 분화와 같은 생물학적 인식 과정에 있어 중심적인 역할을 하고 있다(비특허문헌 1). 이들은 혈액형 결정기를 구성하고 있으며(비특허문헌 2), 종양 관련 항원을 형성하고 있다(비특허문헌 3). 식물계에서는, 이들은 호르몬으로서의 조정 기능을 발휘하며(비특허문헌 4), 또 렉틴에 대한 결합 부위를 형성하고 있다(비특허문헌 5).
예를 들면, 데옥시- 및 플루오르당과 같은 수식(修飾) 당 및 천연 당의 에피머는 이들의 상호작용에 관한 연구에 중요한 수단을 제공한다. 단백질 - 탄수화물 상호작용의 일반적인 법칙은, 특이적인 효소 - 기질 상호작용의 경우와 거의 동일한 방식으로 이루어져, 이와 관련된 사항이 주목되고 있다. 즉, 예를 들면, 효소의 활성 중심에 관한 정보는 효소 기질의 연속적인 변화에 의해 수득할 수 있다. 또한, 데옥시 글루코시드도 그것이 수많은 항생 물질내에 존재한다는 사실로 인해 특히 관심이 모아지고 있다(비특허문헌 6).
2-데옥시 글루코스는 암세포에서 당 분해 및 암세포의 증식을 저해하는 것으로 보고되고 있으며, 몇가지 동물 모델에서는 종양 증식을 지연시키는 것도 보고되고 있다. 또한, 다른 사이토카인 및 항암 약물과의 조합도 연구되어 있다(특허문헌 1). 이와 같이, 데옥시케토헥소스는 특히 대사나 생체 신호에 대한 연구에서의 이용이 기대되고 있다.
발명자 중 1인인 이즈모리 켄은, 4탄당, 5탄당, 6탄당에 대한 이즈모링(Izumoring) 연계도를 특허문헌 2에 공표하여 그 유용성을 제시하였다. 즉, 이는 도 4로 나타낸 제조 과정과 분자 구조(D형, L형)로 탄소수 4 내지 6의 단당 모두를 연결한 연계도, 이즈모링(Izumoring)의 전체도이다. 즉, 도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 단당은 탄소수 4, 5, 6 모두가 연결되어 있다. 전체도는 이즈모링 C6 간의 연결, 이즈모링 C5 간의 연결, 이즈모링 C4 간의 연결, 그리고 C4, C5, C6 서로 간의 모든 연결을 나타낸 것이다. 이러한 컨셉이 중요하다. 탄소수의 감소에는 주로 발효법을 이용한다. 탄소수가 다른 단당 모두를 연결짓고 있는 것이 큰 연계도의 특징이다.
탄소수가 6인 단당(헥소스)의 이즈모링에서, 도 4의 하단, 도 5, 또한 도 8에 나타낸 바와 같이, 탄소수가 6인 단당(헥소스)은 전부 34 종이 있는데, 그 중 알도스가 16 종, 케토스가 8 종, 당 알코올이 10 종이다. 희소당은 자연계에 드물게 존재하는 단당(알도스, 케토스) 및 그 유도체(당 알코올)로 정의할 수 있다. 이러한 정의는 당의 구조나 성질에 의한 정의는 아니기 때문에, 애매한 부분이 있다. 즉, 일정량 이하의 존재량을 희소당이라고 하는 등의 양적 정의가 행해지고 있지 않기 때문이다. 그러나, 일반적으로 자연계에 다량 존재하는 알도스로는 D-글루코스, D-갈락토스, D-만노스, D-리보스, D-크실로스, L-아라비노스로 6 종이 있으며, 그 이외 알도스는 희소당으로 정의된다. 케토스로는, D-프럭토스가 존재하며, 그외 케토스는 희소당이라고 할 수 있다. 그외 케토스로는 D-프시코스, D-타가토스, D-소르보스, L-프럭토스, L-프시코스, L-타가토스, L-소르보스를 들 수 있다. 또한, 당 알코올은 단당을 환원하여 제조할 수 있지만, 자연계에는 D-소르비톨이 비교적 많으며, 그 이외의 것은 양적으로는 적기 때문에, 이들도 희소당이라고 할 수 있다.
이들 당은, 산화 환원 효소의 반응, 알도스 아이소머라제의 반응, 알도스 환원 효소의 반응에 의해 변환시킬 수 있다는 것이, 본 발명자들의 연구를 포함한 연구들을 통해 알려져 있다. D-글루코스(포도당)나 D-프럭토스는 자연계에 다량으로 존재하는 당으로, 저렴하지만, 이들로부터 희소당을 합성할 수는 없었다. 그러다가, 신규한 효소가 발견되었다. 이는, 갈락티톨로부터 D-타가토스를 합성하는 효소를 가지는 균의 배양액 중에서, 전혀 예기치 않았던 D-소르보스가 발견된 것으로부터 비롯되었다. 그 원인을 조사한 결과, 이 균이 D-타가토스 3 에피머라제(DTE)라는 효소를 생산하고 있다는 것을 발견하였다(특허문헌 3). 이 DTE는 지금까지 연결되지 않았던 D-타가토스와 D-소르보스의 사이를 잇는 효소임을 알 수 있다. 그리고, 또한 더욱 놀라운 점은, 이 DTE는 모든 케토스의 3번 위치를 에피머화하는 효소이며, 지금까지 합성 연결시킬 수 없었던 D-프럭토스와 D-프시코스, L-소르보스와 L-타가토스, D-타가토스와 D-소르보스, L-프시코스와 L-프럭토스에 작용하는 매우 폭넓은 기질 특이성을 가지는 있는, 즉 매우 폭넓게 기질을 선택할 수 있는 독특한 효소임을 알게 되었다. 이러한 DTE의 발견에 의해, 모든 단당이 링 형으로 연결되어, 단당의 지식의 구조화가 완성되었고, 이를 이즈모링(Izumoring)이라고 명명하였다.
도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 좌측에 L형, 우측에 D형, 한가운데에 DL형이 있고, 또한 링의 중앙(별표)을 중심으로 하여 L형과 D형이 점 대칭으로 되어 있다. 예를 들면, D-글루코스와 L-글루코스는, 중앙의 점을 기준으로 하여 점 대칭으로 되어 있다. 또한, 이즈모링(Izumoring)의 가치는 모든 단당의 제조 설계도가 존재한다는 것이다. 상기의 예로, D-글루코스를 출발점으로 하여 L-글루코스를 제조하려고 한다면, D-글루코스를 이성화 -> 에피머화 -> 환원 -> 산화 -> 에피머화 -> 이성화하여, L-글루코스를 만들 수 있다는 것이 나타나 있다.
탄소수가 6인 단당(헥소스)의 이즈모링(Izumoring)을 사용하여, 자연계에 다량으로 존재하는 당과 미량으로만 존재하는 희소당과의 관계가 설명된다. D-글루코스, D-프럭토스, D-만노스와 우유 중의 유당으로부터 제조할 수 있는 D-갈락토스는, 자연계에 다량 존재하는 것이고, 그 이외의 것은 미량으로만 존재하는 희소당으로 분류된다. DTE의 발견에 의해, D-글루코스로부터 D-프럭토스, D-프시코스를 제조하고, 또한 D-알로스, 알리톨, D-탈리톨을 제조할 수 있게 되었다. 희소당 D-프시코스는 지금까지 입수 자체가 곤란하였지만, 자연계에 다량으로 존재하는 단당 으로부터 희소당을 대량 제조하는 방법이 개발되고 있어, 그러한 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
탄소수가 6인 단당(헥소스)의 이즈모링(Izumoring)의 의의를 정리하면, 제조 과정과 분자 구조(D형, L형)에 따라, 모든 단당이 구조적으로 정리되어 있어(지식의 구조화), 단당의 전체 상을 파악할 수 있다는 점, 연구의 효과적, 효율적인 접근 방안을 선택할 수 있다는 점, 최적 제조 경로를 설계할 수 있다는 점, 누락 부분을 예견할 수 있다는 점을 들 수 있다.
탄소수가 5인 단당(펜토스)의 이즈모링은 도 4의 중간 부분 및 도 6에 나타난 바와 같이, 탄소수 6의 이즈모링보다는 작은 링이다. 그러나, C6의 이즈모링과 같이, 알도스 8개, 케토스 4개 및 당 알코올 4개 모두를 포함한다는 점에서는 차이가 없고, 모두 효소 반응으로 연결된다. 상이한 점은, 산화 환원 반응, 이성화 반응만으로도 링 형태로 모두를 연결할 수 있다는 것이다. 한편, DTE를 사용함으로써, 또한 효율이 양호한 제조 경로를 설계할 수 있음을 알 수 있다. 탄소수 5의 이즈모링의 특징은, 특히 도 6에서 명백해진 바와 같이, 탄소수 6의 이즈모링이 점 대칭 형태로 전체 단당이 배치되어 있는 바와 같이, 좌우가 대칭 형태로 배치되어 있다는 점이 큰 특징이다. 이들 전체 펜토스는, 효소 반응에 의해 연결되어 있으므로, 탄소수 6의 이즈모링의 경우와 거의 동일하게, 모든 펜토스가 구조적으로 정리되어(지식의 구조화), 전체 상을 파악할 수 있다는 점, 연구의 효과적, 효율적인 접근 방안을 선택할 수 있다는 점, 최적 제조 경로를 설계할 수 있다는 점, 누락 부분을 예견할 수 있는 점에 의의가 있다.
탄소수가 4인 단당(테트로스)의 이즈모링은, 도 4의 상단 부분 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 테트로스의 구조적인 특성으로 인해, 링이 완성되지 않는다는 특징이 있다. 탄소수 5의 이즈모링의 상부 절반에 해당되는 구조로 이루어져 있다. 이 링의 경우도, 탄소수 5, 6의 경우와 동일하게, 산화 환원 및 이성화 반응에 의해 연결되어 있다. DTE가 탄소수 4의 케토스에는 반응하지 않기 때문에, 케토스 간의 반응은 현재는 없다. 그러나, 신규한 에피머라제의 존재가 예측되므로, 이에 대한 연구는 현재 연구 중에 있다.
전체 배치는, 탄소수 5와 마찬가지로, 좌우 대칭이며, 알도스 4개, 케토스 2개 및 당 알코올 3개를 모두 포함하고 있다. 즉, 탄소수 5, 6의 이즈모링과 동일한 의의가 있다.
이즈모링 C6의 D-글루코스는, 이즈모링 C5의 D-아라비톨 및 이즈모링 C4의 에리트리톨(erythritol)과 연결된다. 이 선은, 발효 방법에 따라 D-글루코스로부터 D-아라비톨 및 에리트리톨을 제조할 수 있음을 나타낸다. 즉, 이즈모링 C6, 이즈모링 C5 및 이즈모링 C4가 서로 연결되어 있다. 이러한 연결은, 탄소수의 감소라는 주로 발효 방법에 따른 반응으로, D-아라비톨 및 에리트리톨로의 전환 반응의 2가지 방법 이외의 발효 방법에 의해 이즈모링 C6와 이즈모링 C5, C4의 연결이 가능하다. 예를 들면, D-글루코스로부터 D-리보스의 제조도 가능하다.
이와 같이, 3개의 이즈모링에 의해 모든 탄소수 4, 5, 6의 단당(알도스, 케토스, 당 알코올)이 연결되어 있어, 각각의 단당이 전체 단당에서의 존재 위치를 명확하게 확인할 수 있다. 가장 유명한 자일리톨은, 미이용 자원의 목질로부터 제 조할 수 있는 D-크실로스를 환원함으로써 용이하게 제조할 수 있음을 명확하게 확인할 수 있다.
만약 특정한 단당이 생물 반응에 의해 다량으로 얻어지는 경우에는, 그것을 원료로 한 새로운 단당으로의 변환 가능성을 용이하게 찾아낼 수 있다. 즉, 이러한 전체 상으로부터 모든 단당의 원료로서의 위치를 확실하게 잡을 수가 있기 때문에, 유용한 이용법을 설계할 수 있다. 특히, 폐기물이나 부산물로부터 단당을 얻을 수 있는 경우에 이용 방법을 용이하게 추정할 수 있다.
단당류를 환원하면, 알데히드기 및 케톤기는 알코올기가 되어, 탄소 원자의 수가 동수인 다가 알코올, 즉 당 알코올이 된다. 환원당은 식품 등의 분야에서 유용한 것이 많은데, 예를 들면, L-아라비노스는 5탄당으로, 자당에 가까운 맛질을 가지는 난흡수성의 무칼로리 당질이다. 또한, 자당이나 말토스 등의 이당의 체내 흡수시에 작용하는 이당 수분해효소를 저해하는 것으로 알려져 있으며, 다이트용 감미료나 당뇨병 환자용 감미료로서의 이용이 기대되고 있다. 또한, L-아라비노스는 의약품의 합성 원료로서도 유용한 당이다.
환원당을 취득하는 경우, 그 유래를 천연물에서 구하고 있다. 예를 들면, L-아라비노스를 취득하는 수단으로서, 최근에는, 콘 섬유나 아라비아 껌, 비트 펄프 등에 효소나 산을 작용시키는 L-아라비노스의 제조 방법이 개발되어 있다. 원료로 되는 아라비난, 아라비녹시실란, 아라비노갈락탄 등의 조 섬유는 펙틴질이나 불필요한 조 섬유 등과 혼재하여 존재하는 경우가 많고, 이들을 효소 분해나 산 가수분해 처리함으로써 얻어지는 용액 중에는 L-아라비노스 등의 환원당 외에도 펙틴 질이나 조 섬유, 또는 이들의 분해물이 혼재되어 있다. L-아라비노스를 정제하는 방법으로는, L-아라비노스 함유 당액 중의 크실로스 및 올리고당과 목적으로 하는 L-아라비노스를 이온 교환 수지에 의해 크로마토그래피로 분획하는 방법, 다당, 올리고당이나 염 종류와의 분리를 목적으로 한 이온 교환 수지에 의한 크로마토그래피, 또는 막 처리 등이 제안되어 있다.
한편, 단당의 데옥시 화합물에 대해서는, 유효한 제조 방법 및 물질로 인지되어 있는 것이 적어, 제조 방법에 대한 확립이 최우선적으로 요구되고 있다.
특허문헌 1: 일본 특허 공개공보 2006-515883호
특허문헌 2: WO2004/063369호 공보
특허문헌2: 일본 특허 3333969호
비특허문헌 1: G. E. Edelman, Spektrum Wiss.1964(6), 62
비특허문헌 2: V. Ginsburg, Adv. Enzymo1.36, (1972), 131
비특허문헌 3: G. M. W. Cook, E. W. Stoddart, "Surface Carbohydrates of the Eucaryotic Cell", Academic Press, London, 1973
비특허문헌 4: P. Albersheim, A. G. DaNill, Spektrum Wiss.1985(11), 86
비특허문헌 5: T. W. Rademacher, R. B. Parekh, R. A. Dwek, Ann. Rev. Biochem., 57, (1988), 785
비특허문헌 6: T. Reichstein, E. Weiss, Adv. Carbohydr. Chem. 17, (9162[sic]), 65
발명의 공개
발명이 해결하려고 하는 과제
공업적으로 단당의 데옥시 화합물을 제조함에 있어, 가능한 적은 공정의 용이한 제조 방법의 확립이 강하고 요구되고 있다. 그래서, 데옥시 화합물에 대한 이즈모링 구축과 이를 이용한 체계적인 데옥시 화합물의 제조 방법을 확립하였다.
즉, 본 발명은, 케토헥소스의 1- 또는 6-데옥시 화합물에 작용하여, 유리의 데옥시 화합물의 당질로 에피머화함으로써, 3번 위치가 에피머화된 데옥시 화합물을 생성하는, 데옥시케토헥소스 아이소머라제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 상기 효소를 사용하여, 탄소수가 6인 단당(헥소스)의 이즈모링에 대응하는 데옥시이즈모링(Deoxyizumoring)을 완성시키는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 상기 데옥시이즈모링에 따른 알도헥소스, 케토헥소스, 당 알코올 모두에 대응하는 1- 또는 6-데옥시 화합물, 및 이들의 체계적이고 구체적이며 경제적인 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 단당의 데옥시 화합물의 제조 방법을 확립하고자 거듭 연구하였다. 이에 슈도모나스 시커리(Pseudomonas cichorii) ST-24(FERM BP-2736) 유래의 D-타가토스 3-에피머라제가, 6-데옥시케토헥소스(예, 6-데옥시 L-프럭토스)를 기질로 하여 대응되는 6-데옥시케토헥소스(예, 6-데옥시 L-프시코스)를 생성한다는 것을 발견하였다. L-람노스 아이소머라제가, 종래 공지의 L-람노스와 6-데옥시 L-프럭토스 간의 효소 반응 이외에도, 6-데옥시 L-프시코스와 6-데옥시 L-알트로스 간 등의 다른 데옥시 화합물의, 단당의 케토스와 알도스 간의 이성화 반응을 촉매한다는 것을 발견하였다. 또한, 환원, 산화 반응을 조합함으로써, 단당의 1- 또는 6-데옥시 화합물 및 1- 또는 6-데옥시 당 알코올을 제조할 수 있음을 발견하여, 본 발명에 이르게 되었다. 또한, 이로써, 데옥시 화합물에 상당하는 이즈모링(Izumoring)인 데옥시이즈모링을 완성할 수 있었다. 데옥시케토헥소스가 연계된 데옥시이즈모링을 도 1로 나타낸다. 도 1을 구성하는 각 데옥시 당의 명칭이 부여된 데옥시이즈모링은 도 2에 나타낸다. 그리고, 각 데옥시 당에 번호를 부여한 데옥시이즈모링은 도 3에 나타낸다. 도 3에서 번호와 데옥시 당의 명칭은 다음과 같다.
1 6-데옥시 D-굴리톨
2 6-데옥시 D-소르보스
3 6-데옥시 D-타가토스
4 6-데옥시 D-탈리톨
5 1-데옥시 D-알트리톨
6 1-데옥시 D-프시코스
7 1-데옥시 D-프럭토스
8 1-데옥시 D-만니톨
9 6-데옥시 D-만니톨
10 6-데옥시 D-프럭토스
11 6-데옥시 D-프시코스
12 6-데옥시 D-알트리톨
13 1-데옥시 D-탈리톨
14 1-데옥시 D-타가토스
15 1-데옥시 D-소르보스
16 1-데옥시 D-굴리톨
17 6-데옥시 L-글루시톨
18 6-데옥시 L-프럭토스
19 6-데옥시 L-프시코스
20 6-데옥시 L-알트리톨
21 1-데옥시 L-탈리톨
22 1-데옥시 L-타가토스
23 1-데옥시 L-소르보스
24 1-데옥시 L-이디톨
25 6-데옥시 L-이디톨
26 6-데옥시 L-소르보스
27 6-데옥시 L-타가토스
28 6-데옥시 L-탈리톨
29 1-데옥시 L-알트리톨
30 1-데옥시 L-프시코스
31 1-데옥시 L-프럭토스
32 1-데옥시 L-글루시톨
33 6-데옥시 D-이디톨
34 6-데옥시 D-갈락티톨
35 1-데옥시 D-알리톨
36 1-데옥시 D-글루시톨
37 6-데옥시 D-글루시톨
38 6-데옥시 D-알리톨
39 1-데옥시 D-갈락티톨
40 1-데옥시 D-이디톨
41 6-데옥시 L-만니톨
42 6-데옥시 L-알리톨
43 1-데옥시 L-갈락티톨
44 1-데옥시 L-굴리톨
45 6-데옥시 L-굴리톨
46 6-데옥시 L-갈락티톨
47 1-데옥시 L-알리톨
48 1-데옥시 L-만니톨
49 6-데옥시 D-굴로오스
50 6-데옥시 D-이도스
51 6-데옥시 D-갈락토스
52 6-데옥시 D-탈로스
53 6-데옥시 D-만노스
54 6-데옥시 D-글루코스
55 6-데옥시 D-알로스
56 6-데옥시 D-알트로스
57 6-데옥시 L-글루코스
58 6-데옥시 L-만노스
59 6-데옥시 L-알로스
60 6-데옥시 L-알트로스
61 6-데옥시 L-이도스
62 6-데옥시 L-굴로오스
63 6-데옥시 L-갈락토스
64 6-데옥시 L-탈로스
본 발명은, 이하의 (1) - (4)의 데옥시케토헥소스 아이소머라제를 요지로 한다.
(1) 케토헥소스의 1- 또는 6-데옥시 화합물에 작용하여 유리의 데옥시 화합물의 당질인 상태로 에피머화함으로써, 3번 위치가 에피머화된 데옥시 화합물을 생성하는 슈도모나스 속에 속하는 세균으로부터 수득되는 데옥시케토헥소스 아이소머라제.
(2) 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응되는 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 생성하는 (1)의 데옥시케토헥소스 아이소머라제.
(3) 하기의 이화학적 성질을 가지는 슈도모나스 속에 속하는 세균으로부터 얻을 수 있는 데옥시케토헥소스 아이소머라제.
1) 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스, 및 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응되는 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스 및 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 생성.
2) D-케토헥소스 3-에피머라제 활성의 최적 pH 및 pH 안정성은 pH 7 - 10에서 최적 pH를 가지며, pH 5 - 10에서 안정.
3) D-케토헥소스 3-에피머라제 활성의 최적 온도 및 열안정성은 약 60 ℃에서 최적 온도를 가지며, 50 ℃ 이하에서 안정.
4) 자외선 흡수스펙트럼 275 내지 280 nm에서의 흡수대를 나타냄.
5) 분자량 41,000 ± 3,000(겔 여과 크로마토그래피에 의한 것임).
(4) 데옥시케토헥소스 아이소머라제가 슈도모나스 시커리 ST-24(FERM BP-2736) 유래의 효소인 (1), (2) 또는 (3)의 데옥시케토헥소스 아이소머라제.
본 발명은, 이하의 (5) - (17)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법을 요지로 한다.
<케토스들 간>
(5) 상기 (1), (2), (3) 또는 (4)의 데옥시케토헥소스 아이소머라제를 사용하여, 원료인 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스의 3번 위치를 에피머화하여, 목적물인, 대응되는 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 것을 특징으로 하는 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
<케토스 -> 환원 -> 당 알코올>
(6) 상기 유도체는 데옥시케토헥소스를 환원한 것이며, 목적물인, 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 환원하여, 그 유도체인 대응되는 1-데옥시 D-당 알코올, 6-데옥시 D-당 알코올, 1-데옥시 L-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 제조하는, (5)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
<케토스 -> 환원 -> 당 알코올 -> 산화 -> 케토스>
(7) 상기 유도체는 데옥시케토헥소스를 환원 및 산화한 것이며, 목적물인, 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 환원하여, 그 유도체인, 대응되는 1-데옥시 D-당 알코올, 6-데옥시 D-당 알코올, 1-데옥시 L-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 제조하고, 상기 1-데옥시 D-당 알코올, 6-데옥시 D-당 알코올, 1-데옥시 L-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 산화하여, 대응되는 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 L-케토헥소스 또는 1-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는, (5)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
< 케토스 -> 알도스(6-데옥시만 존재)>
(8) 상기 유도체는 6-데옥시케토헥소스를 이성화하고 것이고, 목적물인 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스에, 알도스 아이소머라제를 작용시켜, 그 유도체인, 대응되는 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스를 제조하는, (5)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
<케토스 -> 알도스 -> 당 알코올>
(9) 상기 유도체는 데옥시케토헥소스를 이성화하고, 또한 환원한 것이며, 목적물인 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스에, 알도스 아이소머라제를 작용시켜, 그 유도체인, 대응되는 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스를 제조하고, 상기 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스에, 알도스 리덕타제를 작용시켜, 대응되는 6-데옥시 D-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올 제조하는 (5)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
<알도스 -> 이성화 -> 케토스 -> 에피머화 -> 케토스>
(10) 효소를 작용시키는 원료인 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스가, 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스에 알도스 아이소머라제를 작용시켜 대응되는 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스로 제조한 것이며, 이를 에피머화하여, 목적물인, 대응되는 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 (5)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
<당 알코올 -> 산화 -> 케토스 -> 에피머화 -> 케토스>
(11) 원료인 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스가, 1-데옥시 D-당 알코올, 6-데옥시 D-당 알코올, 1-데옥시 L-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 산화하여, 대응되는 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스로 제조한 것이며, 이를 에피머화하여, 목적물인, 대응되는 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는, (5)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
(12) 상기 산화 반응 또는 환원 반응에 폴리올데하이드로게나제를 사용하거나, 또는 라네(Raney) 니켈 등을 촉매로서 사용하는 수소 첨가법을 이용하는 (6), (7) 또는 (11)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
(13) 상기 산화 반응에 탈소수효소 생성능을 가진 엔테로박터 속 균체 IK7(NITE BP-271)를 사용하는 (7) 또는 (11) 방법.
<알도스 -> 환원 -> 당 알코올 -> 산화 -> 케토스 -> 에피머화 -> 케토스>
(14) 원료인 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스, 또는 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스가, 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스에 알도스 리덕타제를 작용시키거나, 또는 유기 화학적인 환원 반응에 의해, 대응되는 6-데옥시 D-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 제조하고, 이것을 산화하여, 대응되는 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스, 또는 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조한 것이며, 이를 에피머화하여, 목적물인, 대응되는 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스, 또는 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 (5)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
(15) 상기 환원 반응에 알도스 리덕타제를 사용하거나 또는 화학적 환원 방법을 이용하는, (9) 또는 (14)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법..
(16) 상기 이성화 반응에 L-람노스 아이소머라제를 사용하는, (8), (9) 또는 (10)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
(17) 상기 이성화 반응에 L-람노스 아이소머라제를 사용하여, 6-데옥시 L-프시코스를 6-데옥시 L-알트로스로에 이성화하는, (8), (9) 또는 (10)의 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
본 발명은, 이하 (18)의 신규 화합물을 요지로 한다.
(18) (5) 내지 (17) 중 어느 하나의 방법으로 제조된 이하의 신규 화합물.
6-데옥시 D-소르보스, 6-데옥시 D-타가토스, 1-데옥시 D-프시코스, 1-데옥시 D-프럭토스, 6-데옥시 D-프럭토스, 6-데옥시 D-프시코스, 1-데옥시 D-타가토스, 1-데옥시 D-소르보스, 6-데옥시 L-프럭토스, 6-데옥시 L-프시코스, 1-데옥시 L-타가토스, 1-데옥시 L-소르보스, 6-데옥시 L-소르보스, 6-데옥시 L-타가토스, 1-데옥시 L-프시코스, 1-데옥시 L-프럭토스, 6-데옥시 D-굴로오스, 6-데옥시 D-이도스, 6-데옥시 D-갈락토스, 6-데옥시 D-탈로스, 6-데옥시 D-만노스, 6-데옥시 D-글루코스, 6-데옥시 D-알로스, 6-데옥시 D-알트로스, 6-데옥시 L-글루코스, 6-데옥시 L-알로스, 6-데옥시 L-알트로스, 6-데옥시 L-이도스, 6-데옥시 L-굴로오스, 6-데옥시 L-탈로스, 1-데옥시 L-글루시톨 또는 6-데옥시 D-굴리톨, 6-데옥시 D-이디톨 또는 1-데옥시 D-이디톨.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명자들은, 데옥시케토헥소스 간에 유리의 데옥시 화합물을 당질인 상태로 용이하게 에피머화할 수 있는 에피머라제의 검색을 거듭 계속하였다. 그 결과, 종래 알려져 있는, D-케토헥소스 3-에피머라제인 D-타가토스 3-에피머라제(일본 특허 제 3333969호)가, 케토헥소스 뿐만 아니라 대응하는 케토헥소스의 1- 또는 6-데옥시 화합물에도 작용하여, 3번 위치가 에피머화된 데옥시 화합물을 수득할 수 있음을 발견하였고, 상기 효소를 이용한 D- 또는 L-데옥시케토헥소스의 변환 방법 및 변환된 D- 또는 L-데옥시케토스의 제조 방법을 확립하였다.
그리고, 에피머라제는 효소 명명(Enzyme Nomenclature)(미국, Academic Press, Inc. 1992년)에 의하면 각종 당질에 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 지금까지 알려져 있는 에피머라제는, 예컨대, 리불로스 인산염 3-에피머라제(EC 5.1.3.1)나 UDP-글루코스 4-에피머라제(EC 5.1.3.2) 등과 같이 주로 인산화된 당질이나 UDP 등과 결합한 당질에 작용하는 것이며, 유리의 중성 당질을 제조하는 공업 용도에는 사용할 수 없었다.
한편, 유리의 당질에 작용하는 에피머라제에 대해서는, 알도스에 작용하는 2가지 예, 알도스 1-에피머라제(EC 5.1.3.3) 및 셀로바이오스 에피머라제(EC 5.1.3.11), 또는 케토스에 작용하는 D-케토헥소스 3-에피머라제가 알려져 있을 뿐이다. 알도스 1-에피머라제는, 알도스의 1번 위치의 α, β 아노머 간의 에피머 화를 촉매하고, 셀로바이오스 에피머라제는, 마찬가지로, 셀로바이오스의 α,β 아노머 간을 촉매하는 효소이다. 또한, D-케토헥소스 3-에피머라제는 케토헥소스의 3번 위치를 촉매하는 효소이지만, 데옥시 화합물에 작용하는지 여부는 알려져 있지 않다.
또한, 본 발명에 기재된 공지의 L-람노스 아이소머라제가 6-데옥시 L-프시코스로부터 6-데옥시 L-알트로스 간을 촉매하는 반응에 대해서는 알려져 있지 않다. 게다가, 본 발명에 기재된 공지의 탈소수효소 생성능을 가진 엔테로박터에 속하는 미생물을 이용한 산화에 의해, 1-데옥시 L-만니톨로부터 1-데옥시 L-프럭토스를 생성하는 반응 및 1-데옥시 D-알리톨로부터 1-데옥시 D-프시코스를 생성하는 반응 등에 대해서도 알려져 있지 않다.
즉, 본 효소(슈도모나스 속에 속하는 세균으로부터 얻을 수 있는 데옥시케토헥소스 아이소머라제, D-케토헥소스 3-에피머라제)는, 이하의 화합물들 간의 반응을 촉매하는 것으로 확인되었다.
(i) 6-데옥시 L-프럭토스의 6-데옥시 L-프시코스로의 에피머화 반응 또는 그 역반응,
(ii) 1-데옥시 L-타가토스의 1-데옥시 L-소르보스로의 에피머화 반응 또는 그 역반응,
(iii) 6-데옥시 L-소르보스의 6-데옥시 L-타가토스로의 에피머화 반응 또는 그 역반응,
(iv) 1-데옥시 L-프시코스의 1-데옥시 L-프럭토스로의 에피머화 반응 또는 그 역반응,
(v) 6-데옥시 D-소르보스의 6-데옥시 D-타가토스로의 에피머화 반응 또는 그 역반응,
(vi) 1-데옥시 D-프시코스의 1-데옥시 D-프럭토스로의 에피머화 반응 또는 그 역반응,
(vii) 6-데옥시 D-프럭토스의 6-데옥시 D-프시코스로의 에피머화 반응 또는 그 역반응,
(viii) 1-데옥시 D-타가토스의 1-데옥시 D-소르보스로의 에피머화 반응 또는 그 역반응.
또한, 알도스 아이소머라제를 사용함으로써, 본 발명에서 제조하는 D- 또는 L-데옥시케토헥소스와 D- 또는 L-데옥시 알도헥소스를 유리의 데옥시 화합물의 당질인 상태로 용이하게 이성화할 수 있다.
따라서, 본 발명은 제조한 데옥시케토헥소스를 대응되는 데옥시알도스로 변환, 또는 데옥시알도스를 데옥시케토헥소스로 변환하는 제조 방법을 확립하였다.
본 효소(알도스 아이소머라제)는 이하의 화합물들 간의 반응을 촉매한다.
(a) 6-데옥시 L-글루코스의 6-데옥시 L-프럭토스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(b) 6-데옥시 L-만노스의 6-데옥시 L-프럭토스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(c) 6-데옥시 L-알로스의 6-데옥시 L-프시코스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(d) 6-데옥시 L-알트로스의 6-데옥시 L-프시코스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(e) 6-데옥시 L-이도스의 6-데옥시 L-소르보스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(f) 6-데옥시 L-굴로오스의 6-데옥시 L-소르보스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(g) 6-데옥시 L-갈락토스의 6-데옥시 L-타가토스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(h) 6-데옥시 L-탈로스의 6-데옥시 L-타가토스로의 이성화 반응 또는 그 역반응.
(i) 6-데옥시 D-글루코스의 6-데옥시 D-프럭토스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(j) 6-데옥시 D-만노스의 6-데옥시 D-프럭토스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(k) 6-데옥시 D-알로스의 6-데옥시 D-프시코스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(l) 6-데옥시 D-알트로스의 6-데옥시 D-프시코스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(m) 6-데옥시 D-이도스의 6-데옥시 D-소르보스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(n) 6-데옥시 D-굴로오스의 6-데옥시 D-소르보스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(o) 6-데옥시 D-갈락토스의 6-데옥시 D-타가토스로의 이성화 반응 또는 그 역반응,
(p) 6-데옥시 D-탈로스의 6-데옥시 D-타가토스로의 이성화 반응 또는 그 역반응.
또한, 폴리올데하이드로게나제를 사용함으로써, 데옥시케토헥소스와 데옥시 당 알코올들을, 유리의 데옥시 화합물의 당질인 상태로 용이하게 환원 또는 산화할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 제조한 데옥시케토헥소스를 대응되는 데옥시 당 알코올로 변환, 또는 데옥시 당 알코올을 데옥시케토스로 변환하는 제조 방법을 확립하였다. 또한, 데옥시케토헥소스로부터 데옥시 당 알코올로의 환원 반응은 화학적 환원 방법에 의해서도 실시할 수 있다.
본 효소(폴리올데하이드로게나제)는, 이하의 화합물들 간에 반응을 촉매한다.
(1) 6-데옥시 L-글루시톨의 6-데옥시 L-프럭토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(2) 6-데옥시 L-만니톨의 6-데옥시 L-프럭토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(3) 6-데옥시 L 알리톨의 6-데옥시 L-프시코스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(4) 6-데옥시 L-아리트리톨의 6-데옥시 L-프시코스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(5) 1-데옥시 L-탈리톨의 1-데옥시 L-타가토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(6) 1-데옥시 L 갈락티톨의 1-데옥시 L-타가토스로의 환원 반응 또는 그 역의 산화 반응,
(7) 1-데옥시 L 글리톨의 1-데옥시 L-소르보스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(8) 1-데옥시 L-이디톨의 1-데옥시 L-소르보스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응.
(9) 6-데옥시 L-이디톨의 6-데옥시 L-소르보스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응.
(10) 6-데옥시 L-굴리톨의 6-데옥시 L-소르보스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(11) 6-데옥시 L 갈락티톨의 6-데옥시 L-타가토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(12) 6-데옥시 L-탈리톨 의 6-데옥시 L-타가토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(13) 1-데옥시 L-아리트리톨의 1-데옥시 L-프시코스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(14) 1-데옥시 L-알리톨의 1-데옥시 L-프시코스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(15) 1-데옥시 L-만니톨의 1-데옥시 L-프럭토스로의 환원 반응 또는 그 역의 산화 반응,
(16) 1-데옥시 L-글루시톨의 1-데옥시 L-프럭토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응.
(17) 6-데옥시 D-굴리톨의 6-데옥시 D-소르보스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(18) 6-데옥시 D-이디톨의 6-데옥시 D-소르보스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(19) 6-데옥시 D-갈락티톨의 6-데옥시 D-타가토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(20) 6-데옥시 D-탈리톨의 6-데옥시 D-타가토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(21) 1-데옥시 D-아리트리톨의 1-데옥시 D-프시코스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(22) 1-데옥시 D-글루시톨의 1-데옥시 D-프럭토스로의 환원 반응 또는 그 역의 산화 반응,
(23) 1-데옥시 D-만니톨의 1-데옥시 D-프럭토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(24) 6-데옥시 D-만니톨의 6-데옥시 D-프럭토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(25) 6-데옥시 D-글루시톨의 6-데옥시 D-프럭토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(26) 6-데옥시 D-알리톨의 6-데옥시 D-프시코스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(27) 6-데옥시 D-알트리톨의 6-데옥시 D-프시코스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(28) 1-데옥시 D-탈리톨의 1-데옥시 D-타가토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(29) 1-데옥시 D-갈락티톨의 1-데옥시 D-타가토스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응,
(30) 1-데옥시 D-이디톨의 1-데옥시 D-소르보스로의 환원 반응 또는 그 역의 산화 반응,
(31) 1-데옥시 D-굴리톨의 1-데옥시 D-소르보스로의 산화 반응 또는 그 역의 환원 반응.
또한, 알도스 리덕타제 또는 화학적 환원 반응을 사용함으로써, 데옥시알도헥소스를 데옥시 당 알코올로, 유리의 데옥시 화합물 당질인 상태로 용이하게 환원할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 제조되는 데옥시 알도헥소스를 대응하는 데옥시 당 알코올로 변환하는 제조 방법을 확립하였다.
본 효소(알도스 리덕타제) 또는 화학적 환원법은, 이하의 화합물들 간의 반응을 촉매한다.
(ㄱ) 6-데옥시 L-글루코스의 6-데옥시 L-글루시톨로의 환원 반응,
(ㄴ) 6-데옥시 L-만노스의 6-데옥시 L-만니톨로의 환원 반응,
(ㄷ) 6-데옥시 L-알로스의 6-데옥시 L-알리톨로의 환원 반응,
(ㄹ) 6-데옥시 L-알트로스의 6-데옥시 L-알트리톨로의 환원 반응,
(ㅁ) 6-데옥시 L-이도스의 6-데옥시 L-이디톨로의 환원 반응,
(ㅂ) 6-데옥시 L-굴로오스의 6-데옥시 L-굴리톨로의 환원 반응,
(ㅅ) 6-데옥시 L-갈락토스의 6-데옥시 L-갈락티톨로의 환원 반응,
(ㅇ) 6-데옥시 L-탈로스의 6-데옥시 L-탈리톨로의 환원 반응.
(ㅈ) 6-데옥시 D-알트로스의 6-데옥시 D-알트리톨로의 환원 반응,
(ㅊ) 6-데옥시 D-알로스의 6-데옥시 D-알리톨로의 환원 반응,
(ㅋ) 6-데옥시 D-글루코스의 6-데옥시 D-글루시톨로의 환원 반응,
(ㅌ) 6-데옥시 D-만노스의 6-데옥시 D-만니톨로의 환원 반응,
(ㅍ) 6-데옥시 D-탈로스의 6-데옥시 D-탈리톨로의 환원 반응,
(ㅎ) 6-데옥시 D-갈락토스의 6-데옥시 D-갈락티톨로의 환원 반응,
(ㄲ) 6-데옥시 D-이도스의 6-데옥시 D-이디톨로의 환원 반응,
(ㄸ) 6-데옥시 D-굴로오스의 6-데옥시 D-굴리톨로의 환원 반응.
본 발명은, 상기한 임의의 1- 또는 6-D-데옥시케토헥소스, 또는 1- 또는 6-L-데옥시케토헥소스를 원료로 하고, 상기 4가지 효소 및 화학적 환원법을 조합 사용함으로써, 임의의 1- 또는 6-D-데옥시케토헥소스, 또는 1- 또는 6-L-데옥시케토헥소스를 제조하는 제조 방법을 확립하고, 제공한다.
본 발명의 데옥시케토헥소스의 제조 방법은, D-케토헥소스 3-에피머라제가 데옥시케토헥소스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 데옥시케토헥소스를 생성하는 활성을 가진다는 것을 새롭게 발견하고, 알도스 아이소머라제, 폴리올데하이드로게나제, 알도스 리덕타제, 화학적 환원법을 계통에 입각하여 사용함으로써 모든 데옥시케토헥소스를 제조할 수 있는 수단을 제공한다.
사용하는, D-케토스 3-에피머라제는 D-데옥시케토헥소스의 3번 위치를 에피머화하는 것으로 선택되며, 특허 3333969호에 기재된 것이 반응 활성이 높아 바람직하다. 또한, 알도스 아이소머라제는 데옥시케토헥소스와 데옥시알도헥소스 간의 이성화를 촉매하는 효소일 수 있지만, WO 2004/063369호 기재되어 있는 L-람노스 아이소머라제가 특히 바람직하다. 또한, 데옥시케토헥소스 및 데옥시알도헥소스의 환원 반응은, Raney 니켈 등을 촉매로 하는 접촉 환원, 알도스 리덕타제, 폴리올데하이드로게나제 등에 의해 실시할 수 있다. 또한, 당 알코올의 산화는 폴리올데하이드로게나제 등에 의해 실시할 수 있다.
본 발명에 사용되는, D-타가토스 3-에피머라제의 주된 이화학적 성질은, 일본 특허 제 3333969호의 명세서에 기재되어 있지만, 데옥시 화합물에 대한 성질을 하기에 나타낸다.
(1) 작용 및 기질 특이성: D- 또는 L-, 또는, 1- 또는 6-데옥시케토헥소스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응되는, D- 또는 L-, 또는, 1- 또는 6-데옥시케토헥소스를 생성한다.
(2) 최적 pH 및 pH 안정성: pH7 - 10에서 최적 pH이고, pH5 - 10에서 안정함.
(3) 최적 온도 및 열안정성: 약 60 ℃에서 최적 온도이고, 50 ℃ 이하에서 안정함.
본 발명의 D-타가토스 3-에피머라제, 즉 D-케토헥소스 3-에피머라제는, 통상적으로, 일본 특허 제 3333969호의 명세서에 개시되어 있는 방법으로, 슈도모나스 시커리 ST-24(FERM BP-2736) 및 그 변이종 등을 사용함으로써 생산할 수 있다.
즉, 슈도모나스 시커리 ST-24(FERM BP-2736)를, 통상적인 방법에 따라 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민 등이 포함된 영양 배지에서 1 - 5일간 정도 배양하고, 바람직하게는, 액체 배지에서 통기 교반 등에 의해 호기적 조건 하에서 배양하고, 수득되는 균체 또는 배양액 상청액 등의 배양물로부터 D-타가토스 3-에피머라제를 추출한다. 통상, 배양물을 조 D-케토헥소스 3-에피머라제로서 이용할 수 있다. 필요에 따라, 배양물을 여과, 원심분리, 염석, 투석, 농축, 동결건조 등의 공지된 방법으로 부분 정제하여 이용할 수 있다. 또한, 이온 교환체에서의 흡착 용출, 겔 여과, 등전점 분획, 전기영동, 고속 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 단일 클론 항체에 흡착 용출 등을 조합하여, 고도로 정제한 것도 이용할 수 있다. 이같이 하여, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로, 단일 밴드로 나타낼 때까지 정제한 D-타가토스 3 에피머라제는, D-케토헥소스의 3번 위치의 OH기를 에피머화한다.
또한, 놀라는 점은, 본 효소가 1- 또는 6-D-데옥시케토헥소스, 또는 1- 또는 6-L-데옥시케토헥소스에 대해서도, 에피머라제 활성을 나타낸다는 것을 확인한 것이다.
또한, 본 발명의 변환 반응, 즉 D- 또는 L-데옥시케토헥소스로부터 선택되는 1종 이상의 케토스로부터, 상기 케토스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응되는, D- 또는 L-데옥시케토헥소스 등을 생성하는 변환 반응에 있어서, 본 발명의 D-데옥시케토헥소스 3-에피머라제를 공지의 방법에 의해 고정화하여, 반응에 반복 이용하거나 연속 반응에 이용하는데 유리하게 실시할 수 있다.
이러한 변환 반응은, 통상, 다음의 조건으로 행해진다. 기질 농도는 1 - 60 w/v%, 바람직하게는 약 5 - 50 w/v%이고, 반응 온도는 10 - 70 ℃, 바람직하게는 약 30 - 60 ℃이고, 반응 pH는 5 - 10, 바람직하게는 약 7 - 10이고, 효소 활성은 기질 g 당 1단위 이상, 바람직하게는, 50 - 5,000단위의 범위로부터 선택된다. 반응 시간은 적당히 선택할 수 있지만, 경제적 성과를 고려하여, 배치 반응의 경우에는 통상 5 - 50 시간의 범위가 선택된다.
그리고, 상기한 효소 활성 단위는, 타가토스 3-에피머라제 활성에 대한 효소 단위로 하며, 다음과 같이 측정된다.
즉, 50 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5) 100 ㎕, 40 mM D-타가토스 50 ㎕ 및 효소액 50 ㎕ 함유 용액(또는 현탁액)을 30 ℃에서 60분간 인큐베이션하고, 생성물 D-소르보스를 HPLC로 측정하였다. 효소 활성 1단위는 1분간 1 μmol의 D-타가토스를 에피머화하여, D-소르보스를 생성하는 효소의 양으로 한다.
이와 같이하여 변환시킨 반응 용액은, 원료의 데옥시케토스와 새롭게 생성된 데옥시케토스(원료의 에피머)를 함유하고 있어, 필요에 따라, 이 농축액을, 예를 들면, 알칼리 금속형 또는 알칼리 토금속형 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해, 새롭게 생성된 데옥시케토스와 원료인 데옥시케토스를 분리 정제하고, 새롭게 생성된 데옥시케토스 고함유 분획을 농축하여, 시럽상 제품을 수득할 수 있다. 또한, 결정화가 가능한 경우에는, 창출하여 결정상 제품을 수득하는 방법도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 분리된 원료 데옥시케토스를 다시 변환 반응의 원료로 사용할 수도 있다.
본 발명에 사용되는 이성화를 촉매하는 효소, 1- 또는 6-데옥시케토헥소스와1- 또는 6-데옥시 알도헥소스 간의 이성화 반응을 촉매하는 알도스 아이소머라제 종류는 특별히 한정되지 않지만, WO 2004/063369 또는 특허 공개 2006-153591호에 기재된 L-람노스 아이소머라제가 바람직한 것으로서 예시된다.
WO 2004/063369에 기재된 L-람노스 아이소머라제는, 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri 11172)의 배양액으로부터 얻어지는, L-람노스의 6-데옥시 L-프럭토스로의 이성화 반응, 및 6-데옥시 L-프럭토스의 L-람노스로의 이성화를 촉매하는 효소로서 알려져 있는, 아이소머라제이다. 그리고, 균주 슈도모나스 스투체리 i11172는 일본 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터1(일본국 이바라키현 츠쿠바시동 1-1-1 중앙 제6)에 2004년 1월 6일자로 국제 기탁된 것이다(IPOD FERM BP-08593).
본 효소의 성질은 다음과 같다.
(i) 작용 pH 및 최적 pH
작용 pH는 7.0 - 10.0이고, 최적 pH는 9.0이다.
(ii) pH 안정성
여러가지 pH에서 4 ℃로 1시간 유지할 경우, pH 6.0 - 11.0 범위에서 안정하다.
(iii) 작용 온도 및 최적 온도
작용 온도는 40 - 65 ℃이고, 최적 온도는 60 ℃이다.
(iv) 온도 안정성
40 ℃에서 10분간 안정하며, 50 ℃ 10분에서도 90% 이상 잔존한다.
(vi) 킬레이트제의 영향
킬레이트제인 EDTA, EGTA를 활성 측정시에 공존시켜도 거의 활성은 저해되지 않는다.
(vii) 금속 이온의 영향
1 mM의 코발트 이온에 의해 약 30% 저해된다.
(viii) SDS-PAGE 법에 따른 분자량
약 43,000이다.
본 발명에 사용되는 폴리올데하이드로게나제(폴리올 탈수소효소)는, 1- 또는 6- 또는 D- 또는 L-데옥시케토헥소스와 대응되는 헥소스의 당 알코올 간의 반응을 촉매하는 효소로, 공지된 효소들 중에서 선택할 수 있다.
본 발명에 사용되는 알도스 리덕타제는 6-데옥시 D- 또는 L-알도헥소스와 대응되는 당 알코올 간의 산화 환원 반응을 촉매하는 효소로, 공지된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 6-데옥시 D- 또는 L-알도헥소스, 또는 1- 또는 6-데옥시 또는 D- 또는 L-케토헥소스를 환원한 대응되는 당 알코올을 제조하는 공정에서는, 화학적인 환원 반응을 사용할 수도 있다.
유기 화학적인 환원 반응으로는, 니켈, 루테늄, 백금 및 팔라듐 등의 주기율표 제8족의 원소로부터 선택되는 금속을 포함하는 촉매의 존재 하에, 수소 첨가(접촉 환원)함으로써 행해진다.
목적으로 하는 데옥시케토헥소스의 제조에는, 전술한 반응의 조합에 의해 임의의 데옥시케토헥소스로부터 제조할 수 있지만, 자연계에 존재하는 L-푸코스 또는 L-람노스를 출발 원료로서 사용하는 것이 가장 저렴하다.
상기와 같이 제조된 데옥시케토헥소스는, 특히 대사나 생체 신호에 대한 연구에서의 이용이 기대될 뿐만 아니라 화학품, 의약품이나 중간 원료, 연구 시약으로서도 매우 적합하고, 발효용 탄소원, 음식물, 사료, 사료(餌料), 치약, 구강향정, 설하정(舌下錠), 내복약 등 경구 섭취물의 감미 부여, 기호성 향상 등에 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 의약용 물질의 중간체로서 이용할 수 있다.
발명의 효과
본 발명에 의해, 유리의 케토헥소스의 1- 또는 6-데옥시 화합물에 작용하는 데옥시케토헥소스 아이소머라제, 이것을 사용한 1- 또는 6-데옥시 화합물의 제조 방법, 및 제조된 1- 또는 6-데옥시 화합물을 제공할 수 있다.
또한, 자연계에 드물게 존재하는 단당 및 그 유도체(알도스, 케토스 및 당 알코올)인 희소당에 대하여, 탄소수가 6인 단당 및 그 유도체(헥소스)의 이즈모링(Izumoring)에는 자연계에 다량으로 존재하는 당과 미량으로만 존재하는 희소당과의 관계, 이를 얻기 위한 출발 원료 및 경로가 체계적으로 나타나 있지만, 본 발명에 의해, 상기 이즈모링을 탄소수 6의 단당 및 그 유도체(알도스, 케토스, 당 알코올)에 대응되는 1- 또는 6-데옥시 화합물과 연결시킨 데옥시이즈모링(Deoxy-Izumoring)으로 전개시킬 수 있다.
데옥시이즈모링에 의해, 탄소수 6의 단당 및 그 유도체(알도스, 케토스, 당 알코올)에 대응되는 1 또는 6-데옥시 화합물, 즉 데옥시 희소당(데옥시케토헥소스, 데옥시 알도헥소스) 및 그 유도체인 데옥시 당 알코올)가, 효소적 산화, 또는 효소적 또는 화학적 환원, 이성화의 관계를 알 수 있는 형태로 연결되어, 효율적으로 제조될 수 있다.
도 1은 데옥시케토헥소스가 연계된 데옥시이즈모링이다.
도 2는 데옥시 당 명칭이 기재된 데옥시이즈모링이다.
도 3은 데옥시 당에 번호가 기재된 데옥시이즈모링이다.
도 4는 4당, 5당, 6당이 연계된 이즈모링의 제조 경로를 나타낸 것이다.
도 5는 6당이 연계된 이즈모링의 제조 경로를 나타낸 것이다.
도 6은 5당이 연계된 이즈모링의 제조 경로를 나타낸 것이다.
도 7은 4당이 연계된 이즈모링의 제조 경로를 나타낸 것이다.
도 8은 구조식과 세트 이즈모링 C6의 설명도를 나타낸 것이다.
도 9는 L-람노스와 6-데옥시 L-프럭토스의 평형비를 나타낸 것이다.
도 10은 L-람노스와 6-데옥시 L-프럭토스 용액의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 L-람노스, 6-데옥시 L-프럭토스 및 6-데옥시 L-프시코스의 평형비를 나타낸 것이다.
도 12는 L-람노스, 6-데옥시 L-프럭토스 및 6-데옥시 L-프시코스의 용액의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 L-람노스, 6-데옥시 L-프럭토스, 6-데옥시 L-프시코스의 각 탱크의 용액을 HPLC 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 6-데옥시 L-프시코스와 6-데옥시 L-알트로스 용액의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 생산물인 1-데옥시 D-프시코스의 구조를 화학 합성한 1-데옥시 D-프시코스와 13C NMR를 측정하여, 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 생산물인 1-데옥시 D-프시코스의 구조를 화학 합성한 1-데옥시 D-프시코스와 proton NMR 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이다. 상단 그래프는 화학 합성한 것이고 하단 그래프는 본 실험에서 제조한 것이다.
도 17은 화학 합성한 1-데옥시 L-프럭토스와 생산물을 NMR 스펙트럼을 측정 하여 비교한 결과를 나타낸 것이다. 상단 그래프는 1-데옥시 D-프시코스의 13C NMR이고, 하단 그래프는 본 실험으로 제조한 1-데옥시 L-프럭토스의 13C NMR이다.
도 18은 화학 합성한 1-데옥시 L-프럭토스와 생산물을 NMR 스펙트럼으로 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이다. 상단 그래프는 1-데옥시 D-프시코스의 proton NMR이며, 하단 그래프는 본 실험으로 제조한 1-데옥시 L-프럭토스의 proton NMR이다.
도 19는 실시예 10에서 제조한 1-데옥시 D-타가토스의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 실시예 10에서 제조한 1-데옥시 D-타가토스의 13C NMR이다.
도 21은 실시예 10에서 제조한 6-데옥시 D-타가토스의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 실시예 10에서 제조한 6-데옥시 D-타가토스의 13C NMR이다.
도 23은 L-람노스로부터 L-람노스 아이소머라제 및 D-타가토스 3-에피머라제를 사용하여 6-데옥시 L-프시코스를 제조하는 반응을 나타낸 것이다.
도 24는 6-데옥시 L-프시코스의 1-데옥시 D-알리톨과 1-데옥시 D-탈리톨로의 화학적 환원 반응을 나타낸 것이다.
도 25는 데옥시 D-알리톨의 6-데옥시 L-프시코스로의 생물화학적 반응을 나타낸 것이다.
도 26은 6-데옥시 L-프시코스의 1-데옥시 D-알리톨과 1-데옥시 D-탈리톨로의 화학적 환원 반응의 시간 경과와 HPLC 크로마토 그래프 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 데옥시 D-알리톨의 6-데옥시 L-프시코스로의 생물화학적 반응의 시간 경과와 HPLC 크로마토 그래프 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 실시예 10에서 제조한 6-데옥시 L-프시코스의 결정을 촬영한 도면으로 바뀌는 사진이다.
도 29는 화학 합성한 6-데옥시 L-프시코스와 실시예 11의 생산물을 NMR 스펙트럼으로 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이다. 좌측은 6-데옥시 L-프시코스의 13C NMR이며, 우측은 실시예 11에서 제조한 6-데옥시 L-프시코스의 13C NMR이다.
도 30은 정제된 6-데옥시 L-프럭토스의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 화학 합성한 6-데옥시 L-프럭토스(표준)와 제조한 6-데옥시 L-프럭토스의 NMR 스펙트럼을 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이다. 상단 그래프는 표준의 13C NMR이며, 하단 그래프는 본 실험에서 제조한 6-데옥시 L-프럭토스의 13C NMR이다.
도 32는 제조한 1-데옥시 L-프시코스의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 33은 L-람노스 및 6-데옥시 L-만니톨의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 34는 6-데옥시 L-만니톨, 1-데옥시 L-프럭토스 및 분리한 생산물의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 35는 1-데옥시 L-프럭토스, 1-데옥시 L-프시코스 및 분리한 생산물의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 36은 L-람노스로부터 6-데옥시 L-만니톨 및 1-데옥시 L-프럭토스를 통하여 1-데옥시 L-프시코스를 제조하는 과정을 화학 반응식으로 나타낸 것이다.
도 37은 실시예 14의 반응 혼합물인 6-데옥시 L-타가토스와 6-데옥시 L-소르보스 용액의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 실시예 14에서 제조한 6-데옥시 L-소르보스의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 실시예 15의 반응 혼합물인 6-데옥시 D-타가토스와 6-데옥시 D-소르보스 용액의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 40은 실시예 16의 반응 혼합물로부터 분리한 1-데옥시 L-프럭토스(a) 및1-데옥시 L-프시코스(b)의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 실시예 16에서 분리한 1-데옥시 L-프시코스의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 42는 실시예 17에서 (a)는 반응 전의 6-데옥시 D-프시코스, (b)는 반응 후의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 43은 실시예 18에서 (a)는 반응 전의 6-데옥시 L-타가토스, (b)는 반응 후의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 44는 실시예 19에서 (a)는 반응한 후의 반응 혼합물, (b)는 생성된 1-데옥시 D-타가토스의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 45는 실시예 19에서 생성한 1-데옥시 D-타가토스의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 46은 실시예 20에서 1-데옥시 L-타가토스의 제조 중의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 47은 실시예 21에서 (a)는 반응한 후의 반응 혼합물, (b)는 분리 정제한 1-데옥시 D-타가토스의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 48은 실시예 21에서 생성한 1-데옥시 D-타가토스의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 49는 실시예 22에서 (a)는 L-람니톨, (b)는 분리 정제한 1-데옥시 L-프럭토스의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 50은 실시예 22에서 생성한 1-데옥시 L-프럭토스의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 51은 실시예 23에서 (a)는 반응 전의 1-데옥시 L-알리톨 및 1-데옥시 L-탈리톨 혼합물, (b)는 반응 후의 6-데옥시 D-프시코스 및 6-데옥시 L-타가토스의 반응 혼합물, (c)는 분리 정제한 6-데옥시 D-프시코스, (d)는 분리 정제한 6-데옥시 L-타가토스의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 52는 실시예 24에서 (a)는 반응한 후의 반응 혼합물, (b)는 분리 정제한 6-데옥시 L-타가토스의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 53은 실시예 24에서 생성한 6-데옥시 L-타가토스의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 54는 실시예 25에서 (a)는 반응한 후의 반응 혼합물, (b)는 분리 정제한 6-데옥시 D-탈로스의 HPLC 분석 결과이고, (c)는 분리 정제한 6-데옥시 D-탈로스의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 55는 실시예 26에서 (a)는 기질로서 사용한 6-데옥시 D-프시코스, (b)는 반응한 후의 반응 혼합물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 56은 실시예 27에서 6-데옥시 D-타가토스에 L-리보스 아이소머라제를 작용시킨 후 6-데옥시 D-타가토스와 6-데옥시 D-탈로스의 혼합물의 HPLC 분석 결과이다.
도 57은 실시예 28에서 (a)는 환원 전의 D-푸코스, (b)는 환원 후의 6-데옥시 L-갈락티톨의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 58은 실시예 29에서 생성한 6-데옥시 L-갈락티톨의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 59는 실시예 29에서 (a)는 환원 전의 L-푸코스, (b)는 환원 후의 6-데옥시 D-갈락티톨의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 60은 실시예 29에서 생성한 6-데옥시 D-갈락티톨의 13C NMR 스펙트럼이 다.
도 61은 실시예 30에서 (a)는 환원 전의 L-람노스, (b)는 환원 후의 L-람니톨의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 62는 실시예 31에서 환원 후의 1-데옥시 L-만니톨과 1-데옥시 L-소르비톨 혼합물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 63은 실시예 32에서 환원 후의 1-데옥시 L-알리톨과 1-데옥시 L-탈리톨 혼합물의 HPLC 분석 결과이다.
도 64는 도 1 - 3에 나타낸 데옥시이즈모링으로 제조가능한, 전체 데옥시 당(1-데옥시케토스가 8종, 6-데옥시케토스가 8종, 6-데옥시알도스가 16종, 1- 및 6-데옥시폴리올이 16종)의 리스트이다.
이하, 몇가지 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
[L-람노스로부터 6-데옥시 L-프시코스의 제조]
L-람노스를 L-람노스 아이소머라제를 사용하여 L-람뉴로스(6-데옥시 L-프럭토스로 이성화하고, 이를 D-타가토스 3-에피머라제를 사용하여 에피머화함으로써, 6-데옥시 L-프시코스를 제조하였다.
[D-타가토스 3-에피머라제의 제조]
슈도모나스 시커리 ST24주(FERM BP-2736) 유래 D-타가토스 3-에피머라제의 유전자를 대장균에 형질전환하고, 재조합 대장균을 배양하여, D-타가토스 3-에피머라제를 수득하였다.
재조합 대장균을 대량으로 배양한 후, 얻어진 균체를 -80 ℃에서 냉동 보존하였다. 냉동 보존된 균체를 수중에 30분간 방치해 표면을 해동시키고, 50 mM 트리스 염산 완충액 pH 8.0을 사용하여 현탁하였다. 현탁액 20O mL을 초음파 호모게나이저 SONIFIER250(브론슨 주식회사)을 사용하여, 4 ℃로 유지하면서 6분간 파쇄 하였다. 이것을 2번 반복하였다. 이 액을 4 ℃, 11500 rpm으로 20분간 원심분리하고, 얻어진 상청액을 조 효소액으로 하였다. 분쇄한 폴리에틸렌 글리콜 6000을 조 효소액에 중량 대비 5%의 양으로 빙수조내 마그네틱 스티러를 사용하여 교반하면서 서서히 첨가하고, 첨가 후 1시간 교반하였다. 이것을 4 ℃, 11500 rpm으로 1시간 원심분리하여, 상청액을 회수하였다. 다시 폴리에틸렌 글리콜 6000을 상청액의 중량에 대해 25%로 동일한 조작으로 첨가하고, 첨가 후 1시간 교반하였다. 이를 4 ℃, 11500 rpm으로 1시간 원심분리해 침전물을 회수하였다. 이 침전물에 소량(균체 중량의 대략 5배)의 50 mM 트리스 염산 완충액 pH8.0을 부가하여 현탁하였다. (이것을 부분 정제 D-타가토스 3-에피머라제라 함).
[D-타가토스 3-에피머라제의 활성 측정]
D-타가토스 3-에피머라제의 활성 측정은 D-타가토스를 기질로 하여 반응을 행하고, 생성된 D-소르보스의 양을 HPLC 분석에 의해 정량하였다. 효소 반응은 표 1에 나타낸 조성으로 30 ℃에서 10, 20, 30분간 반응시키고, 열탕으로 2분간 가열함으로써 반응을 정지시킨 다음 생성된 D-소르보스 양을 구하고, 1분간 1 μmo1의 D-소르보스를 제조하는 D-타가토스 3-에피머라제 양을 1 U(단위)으로 하였다.
[표 1]
D-타가토스 3-에피머라제의 활성 측정의 반응 조성
50 mM Tris-HCl 완충액(pH8.0) + DTE 효소액 100 ㎕
200 mM 타가토스 100 ㎕
수득되는 부분 정제된 D-타가토스 3-에피머라제의 성질은 이하와 같다.
(1) 작용 및 기질 특이성은 1- 또는 6-데옥시, 또는 D- 또는 L-케토헥소스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응되는 1- 또는 6-데옥시 또는 D- 또는 L-케토헥소스를 생성한다.
(2) 최적 pH 및 pH 안정성: 최적 pH는 pH7 - 10이고, pH5 - 10에서 안정함.
(3) 최적 온도 및 열안정성: 최적 온도는 60 ℃ 부근이고, 50 ℃ 이하에서 안정.
[D-타가토스 3-에피머라제의 고정화]
D-타가토스 3-에피머라제의 고정화를 Chitopearl BCW2510을 사용하여 행하였다. 먼저, 50 mM 트리스 염산 완충액 pH 8.0을 사용하여 Chitopearl 수지를 세정하고, 냉장고 내에서 하룻밤 방치하여 평형화를 행하였다. 다음으로, 전술한 부분 정제한 D-타가토스 3-에피머라제 20OU를 1 mL(습중량 약 1 g)의 Chitopearl 수지와 혼합하고, 때때로 교반하면서 냉장고 내에서 2일간 방치하여 효소를 고정화시켰다. 동 완충액으로 Chitopearl을 세정하고, 이것을 고정화 효소로 하였다.
이하의 실시예에서는 상기 고정화 효소를 사용하여, 데옥시케토헥소스의 에피머화 반응을 실시하였다.
[L-람노스 아이소머라제의 제조]
[L-람노스 아이소머라제의 특성]
슈도모나스 스투체리 11172(IPODFERM BP-08593) 유래의 L-람노스 아이소머라제 유전자를 대장균에 형질전환하고, 재조합 대장균을 배양하여, L-람노스 아이소머라제를 얻었다. 재조합 대장균을 대량 배양한 후, 얻어진 균체를 -80 ℃에서 냉동 보존하였다. 냉동 보존된 균체를 수중에 30분간 방치해 표면을 해동하고, 10 mM 트리스 염산 완충액 pH9.0을 사용하여 현탁하였다. 현탁액 20O mL을 초음파 호모게나이저 SONIFIER250(브론슨 주식회사)을 사용하여, 4 ℃로 유지하면서 6분간 파쇄 하였다. 이를 2회 반복하였다. 이 액을 4 ℃에서 11500 rpm으로 20분간 원심분리하고, 얻어진 상청액을 조 효소액으로 하였다. 분쇄한 폴리에틸렌 글리콜 6000을 조 효소액의 중량에 대해 5%로, 빙수조 중 마그네틱 스티러를 사용하여 교반하면서 서서히 첨가하고, 첨가 후 1시간 교반하였다. 이것을 4 ℃에서 11500 rpm으로 1시간 원심분리해 상청액을 회수하였다. 다시 폴리에틸렌 글리콜 6000을 상청액의 중량에 대해 25%로 동일한 조작으로 첨가하고, 첨가 후 1시간 교반하였다. 이 침전물에 소량(균체 중량의 대략 5배)의 10 mM 트리스 염산 완충액 pH 9.0을 첨가하여 현탁하였다. (이것을 부분 정제 L-람노스 아이소머라제로 함).
[L-람노스 아이소머라제의 활성 측정]
L-람노스 아이소머라제의 활성 측정은 L-람노스를 기질로 반응시켜, 생성된 6-데옥시 L-프럭토스의 양을 시스테인 카르바졸 방법에 따라 정량하였다. 효소 반응은 표 2에 나타낸 조성으로 30 ℃에서 10분간 반응시고, 반응의 정지는 10%의 TCA(트리클로로 초산)를 50 ㎕ 첨가하여 행하였다. 시스테인 카르바졸 방법은 표 3에 나타낸 바와 같이 효소 반응 후의 샘플 O.5 ml에 1.5% 시스테인 용액 10O ㎕, 7O% 황산 3 ml을 순차 첨가한 후, 교반하여 수중에 두고, O.12% 카르바졸 용액 100 ㎕를 첨가하여 교반하여, 35 ℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 자외 가시 분광 광도계 V530(일본 분광 주식회사)을 사용하여, 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그리고, 1분간 1 μmo1의 6-데옥시 L-프럭토스를 제조하는 효소량을 1 U로 정의하였다.
[표 2]
L-람노스 아이소머라제의 활성 측정의 반응 조성 및 반응기건
100 mM Tris-HCl 완충액 (pH 9.0) 350 ㎕ LRI 효소액 50 ㎕ 50 mM L-람노스 50 ㎕ ↓ 30 ℃, 10분간 인큐베이션 10% 트리클로로초산 50 ㎕
합계 500 ㎕
[표 3]
시스테인 카르바졸 방법
시료 500 ㎕ │ 시스테인 용액 100 ㎕ │ 70% 황산 3000 ㎕ │ 카르바졸 용액 100 ㎕ ↓ 30 ℃, 20분간 인큐베이션 540 nm에서 흡광도 측정
부분적으로 정제한 L-람노스 아이소머라제의 성질은 이하와 같다.
(1) L-람노스와 6-데옥시 L-프럭토스의 이성화 반응을 촉매한다.
(2) 6-데옥시 L-프시코스와 6-데옥시 L-알트로스의 반응을 촉매한다.
(3) 온도 안정성은 40 ℃ 이하이며, 최적 온도는 60 ℃이다. pH7.0 - 9.0에서 안정하며, 최적 pH는 pH 9.0이다.
[L-람노스 아이소머라제의 고정화]
L-람노스 아이소머라제의 고정화에는 Chitopearl BCW2510을 사용하였다. 먼저, 10 mM 트리스 염산 완충액 pH 9.0을 사용하여 Chitopearl 수지를 세정하고, 냉장고 내에서 하룻밤 방치하여 평형화를 행하였다. 다음으로, 부분 정제한 L-람노스 아이소머라제 50 U를 1 mL(습중량 약 1 g)의 Chitopearl 수지와 혼합하고, 때때로 교반하면서 냉장고 내에서 2일간 방치하여 효소를 고정화시켰다. 동일한 완충액으로 Chitopearl를 세정하고, 이것을 고정화 효소로 하였다.
[고정화 L-람노스 아이소머라제에 의한 L-람노스의 이성화]
L-람노스를 Brix 30%가 되도록 조제하고, 그 용액 250 mL를 50O mL 용량의 삼각 플라스크로 옮겼다. 여기에, 고정화 L-람노스 아이소머라제 100 mL(500O U에 상당)과 1 M 트리스 염산 완충액 pH 9.0을 5 mL(최종 농도 약 10 mM) 첨가하고, 42에서 120 rpm의 조건으로 교반하면서 반응시켰다. 1시간마다 반응액 10 ㎕를 채취하고, 290 ㎕의 물로 희석(30배 희석)한 다음 열탕으로 2분간 가열하여 효소를 실활한 후, 12000 rpm으로 5분간 원심하여 상청액을 회수하였다. 여기에, 탈염수지(IRA411:SKIB = 2:1의 비율로 혼합하고 건조시킨 것)를 소량 첨가하여 전도 혼화(轉倒混和)하였다. 1시간 후, 이 액을 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과한 다음, HPLC에 제공하였다. 반응의 평형비는 L-람노스 55%, 6-데옥시 L-프럭토스 45%였다(도 9). 또한, 반응이 평형에 이르기까지 필요한 시간은 약 10시간이었다. 평 형에 이른 용액의 HPLC 분석 결과를 나타낸다(도 10).
[D-타가토스 3-에피머라제에 의한 6-데옥시 L-프럭토스의 이성화(에피머화)]
L-람노스와 6-데옥시 L-프럭토스의 혼합 당액을 Brix 30%, 250 mL이 되도록 조제하고, 500 mL 용량의 삼각 플라스크로 옮겼다. 여기에 고정화 D-타가토스 3-에피머라제 25 mL(5000 U에 상당)과 1 M 트리스 염산 완충액 pH 8.0을 40 mL(최종농도 약 50 mM) 첨가하여, 42 ℃에서 120 rpm의 조건으로 교반하면서 반응시켰다.
1시간마다 반응액 10 ㎕를 채취하고, 290 ㎕의 물로 희석(30배 희석)하였다. 열탕으로 2분간 가열한 후, 12000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상청액을 다른 에펜드로프 튜브로 옮겼다. 여기에, 소량의 탈염수지(IRA411:SKIB = 2:1의 비율로 혼합하고 건조시킨 것)를 첨가하여 전도 혼화하였다. 1시간 후, 이 액을 0.45 ㎛의 필터를 사용하여 여과하고, HPLC에 제공하였다. 평형비는 L-람노스 55%, 6-데옥시 L-프럭토스 36%, 6-데옥시 L-프시코스 9%였다(도 11). 또한, 반응이 평형에 이르기까지 필요한 시간은 약 96시간이었다. 평형에 이른 용액의 HPLC 분석 결과를 나타낸다(도 12).
[6-데옥시 L-프시코스의 분리]
이성화 반응 후, 통과에 의해 고정화 효소를 제거하였다. 탈염수지(IRA411(40 mL)과 SKIB(20 mL))를 혼합하여 오픈 컬럼에 충전하고, 조금씩 당액을 흘려 보내 탈염을 행하였다. 탈염 후, 로터리 증발기로 농축하였다. 그 후, 0.22 ㎛의 필터를 사용하여 여과하고, 액을 Brix 30%로 조제하였다. 원 패스 방식의 크로마토 분리장치를 사용하여 6-데옥시 L-프시코스를 분리하였다(표 4). 분리 후, 각 탱크의 용액을 HPLC 분석한 결과를 도 13에 나타내었다. 또한, L-람노스로부터의 이론상 수득한 양은 대략 8%였다. 도 13은 원 패스 컬럼을 사용한 분리의 도이며, 탱크 A는 거의 당이 없고, 탱크 B에는 L-람노스와 L-람뉴로스, 탱크 C에는 소량의 6-데옥시 L-프럭토스, 탱크 D에는 6-데옥시 L-프럭토스가 주로 용출되어 순수하게 분리할 수 있었다. 즉, 피크는, 탱크 A는 극소량의 L-람노스와 L-람뉴로스, 탱크 B는 L-람노스와 L-람뉴로스, 탱크 C는 소량의 6-데옥시 L-프럭토스, 탱크 D는 6-데옥시 L-프럭토스이다.
[표 4]
원 패스 방식의 크로마토에서의 6-데옥시 L-프시코스의 분리 방법
샘플 양 300 ml 유속 60 ml/min 평형화 90 min 탱크 A 30 min 탱크 B 70 min 탱크 C 20 min 탱크 D 90 min
[6-데옥시 L-프시코스의 구조 해석]
20 - 30 mg(13C-NMR용) 및 10 - 15 mg(1H-NMR)의 6-데옥시 L-프시코스를 에펜드로프 튜브에 넣어 600 ㎕의 중수(重水)를 첨가하였다. 튜브의 입구를 파라필름으로 덮어, 이쑤시개로 3군데 정도 구멍을 만들어, Deep freezer에서 동결시켰다. 이것을 동결건조한 다음, 다시 600 ㎕의 중수를 첨가하고, 동결건조하였다. 건조 후, 미리 TSP(3-메틸실릴 프로피온 2,2,3,3-d4 산)를 1%가 되도록 제조한 6OO ㎕의 중수를 첨가하여 용해하였다. 이것을 NMR 유리관에 넣어 측정하였다. 참고 자료 로서 L-람노스 및 D-프시코스도 분석하였다. 각각의 13C-NMR 시프트를 측정하여, 호변체의 구조를 표 5, 표 6 및 표 7에 나타내었다. 표의 공란은 시프트가 존재하지 않음을 나타낸다. 이들로부터, 6-데옥시-L-프시코스의 생성이 확인되어. 6-데옥시-L-프럭토스와 6-데옥시-L-프시코스의 평형비는 80 : 20이었다.
[표 5]
L-람노스의 13C-NMR 케미컬 시프트 호변이성형
C1 C2 C3 C4 C5 C6
α-피라노스 96.32 74.16 73.65 72.80 74.67 19.58
β-피라노스 96.81 74.85 75.03 71.16 75.59 19.63
α-퓨라노스
β-퓨라노스
[표 6]
D-프시코스의 13C-NMR 케미컬 시프트 호변이성형
C1 C2 C3 C4 C5 C6
α-피라노스 65.97 100.48 67.92 74.53 68.69 60.82
β-피라노스 66.87 101.22 71.82 73.01 73.20 67.00
α-퓨라노스 66.14 106.06 68.40 73.20 85.56 64.20
β-퓨라노스 65.27 108.40 77.57 73.83 85.56 65.62
[표 7]
6-데옥시 L-프시코스의 13C-NMR 케미컬 시프트 호변이성형
C1 C2 C3 C4 C5 C6
α-피라노스
β-피라노스
α-퓨라노스 65.38 105.76 78.02 78.84 73.17 20.53
β-퓨라노스 66.35 108.06 81.34 80.78 73.17 22.16
실시예 2
[6-데옥시 L-프시코스로부터 6-데옥시 L-알트로스의 제조]
실시예 1에서 수득한 6-데옥시 L-프시코스를 기질로 하여 L-람노스 아이소머라제를 사용하여 이성화함으로써, 6-데옥시 L-알트로스를 제조하였다.
L-람노스 아이소머라제는 실시예 1과 동일하게 정제하였다.
[고정화 L-람노스 아이소머라제를 이용한 바이오 반응기에 의한 6-데옥시 L-프시코스의 이성화]
고정화 L-람노스 아이소머라제 150 mL(750O U에 상당)을 쟈켓식 컬럼(jacketed column)에 충전하고, 쟈켓에 42 ℃의 물을 흘려주어 보온하였다. 여기에, Brix 2%가 되도록 제조한 6-데옥시 L-프시코스를 0.5 mL/min의 속도로 아래에서 위로 흘려 주었다. 그리고, 기질에는 1 M 트리스 염산 완충액 pH 9.0을 최종농도 약 10 mM가 되도록 미리 첨가하였다. 평형비는 6-데옥시-L-프시코스 94%, 6-데옥시 L-알트로스 6%였다. 평형에 이른 용액의 HPLC 분석 결과를 나타내었다(도 14). 6-데옥시 L-프시코스와 6-데옥시 L-알트로스의 평행 비는 94:6이었다.
[6-데옥시 L-알트로스의 분리]
이성화 반응 후, 통과시켜 고정화 효소를 제거하였다. 탈염 수지(IRA411(40 mL)와 SKIB(20 mL))를 혼합하여 오픈 컬럼에 충전하고, 조금씩 당액을 흘려 주어 탈염을 행하였다. 탈염 후, 로터리 증발기로 농축한 후, O.22 ㎛의 필터를 사용하여 여과하고, 액을 Brix 30%로 조제하였다. 원 패스 방식의 크로마토 분리 장치를 사용하여 6-데옥시 L-알트로스를 분리하였다. L-람노스로부터 수득한 양은 대략 048%였다.
[6-데옥시 L-알트로스의 구조 해석]
20 - 30 mg(13C-NMR용) 및 10 - 15 mg(1H-NMR)의 6-데옥시 L-알트로스를 에펜드로프 튜브에 넣어 600 ㎕의 중수를 첨가하였다. 이것을 동결건조하고, 다시 600 ㎕의 중수를 첨가하고, 동결건조하였다. 건조 후, 미리 TSP(3-메틸실릴프로피온 2,2,3,3-d4 산)를 1%가 되도록 제조한 600 ㎕의 중수를 첨가하여 용해하였다. 이것을 NMR의 유리관에 넣어 측정하였다. 참고 자료로서 D-알트로스도 시험하였다. 6-데옥시 L-알트로스의 호변체는 α-, β-피라노스 및 α-,β-퓨라노스 4 종인 것으로 추측되었다. 각각의 13C-NMR 시프트를 취하여, 호변체의 구조를 표 8 및 표 9에 나타내었다. 이로부터 6-데옥시-L-알트로스의 생성이 확인되었다.
[표 8]
D-알트로스의 13C-NMR 케미컬 시프트 호변이성형
C1 C2 C3 C4 C5 C6
α-피라노스 98.17 73.17 73.04 68.03 74.09 63.41
β-피라노스 93.30 79.42 73.36 67.09 76.91 64.41
α-퓨라노스 104.13 84.24 78.74 86.10 74.49 65.19
β-퓨라노스 96.56 79.42 77.94 83.93 75.45 65.23
[표 9]
6-데옥시 L-알트로스의 13C-NMR 케미컬 시프트 호변이성형
C1 C2 C3 C4 C5 C6
α-피라노스 97.80 72.25 71.21 70.51 73.16 18.81
β-피라노스 94.46 72.74 72.54 69.76 73.87 20.67
α-퓨라노스 103.80 87.28 78.29 89.19 73.40 20.12
β-퓨라노스 95.92 79.54 77.12 84.39 73.72 20.24
실시예 3
[L-람노스(6-데옥시 L-만노스)의 환원 반응에 의한 6-데옥시 L-만니톨의 제조]
6-데옥시 L-만노스를 화학 반응에 의해, 6-데옥시 L-만니톨로 제조하였다.
[Raney 니켈을 촉매로 한 환원 반응]
50% Raney 니켈(와코 순약공업(주) 제품) 10 g에, 20% NaOH 수용액 100 g을 첨가하였다. 첨가한 후 90 ℃에서 1시간 가온하였다. 기포의 발생이 멈춘 것을 확인한 후, 디켄테이션에 의해 증류수로 촉매를 세정하였다. 세정은, 세정액이 pH 9.2가 될 때까지 행하였다.
교반기와 온도계가 구비된 1 L 유리 자동멸균기에, 100 g의 6-데옥시 L-만노스를 포함하는 수용액 300 g에 상기한 방법으로 수득한 Raney 니켈 24 g을 첨가한 것을, 첨가한 후, 또한 물을 첨가하여 전체 반응액 양을 600 g으로 조정하였다. 이 때, 반응액의 pH를 7로 조정하기 위해, 탄산칼슘을 첨가하였다. 50 ℃의 온도, 12 kg/cm2(게이지압)의 수소압, 7 OOrpm의 교반 속도를 유지하면서 반응을 행하였다. 반응액의 분석은 HPLC를 사용하여 행하였다. 그 결과, 8시간의 반응으로, 6-데옥시 L-만노스는 1%로 감소되어, 6-데옥시 L-만니톨이 제조됨을 할 수 있었다.
실시예 4
[1-데옥시 L-만니톨의 산화에 의한 1-데옥시 L-프럭토스의 제조]
엔테로박터 에어로게네스 IK7를 이용하는 미생물 반응을 통해 실시예 3에서 제조한 1-데옥시 L-만니톨을 산화시켜 1-데옥시 L-프럭토스를 생산하는 상기 균주는, 카가와현 키타군 미키쵸에 흐르는 하천 토양으로부터 분리한 것이다.
상기 균주로부터 추출한 16 SrRNA의 서열을 결정하고, 다른 미생물로부터 수득한 기존의 복수개의 16 SrRNA와 비교하였다. 이 데이터는 엔테로박터 에어로게네스 서열과 99%의 동일성을 보였다. 이 입증 자료와 그 외 생리학적 특징을 기초로, 본 균주가 엔테로박터 에어로게네스라는 결론을 내렸다. 그리고, DNA 단편의 염기 서열의 결정은, 공지된 방법, 예를 들면, 생거 방법(Molecular Cloning, 제2권, 13.3 페이지, 1989년), PCR를 기초로 한 방법 등으로 행할 수 있다.
통상적으로, Beckman Coulter 사의 GenomeLab DTCS Quick Start Kit(형광 다이 데옥시 터미네이터를 포함하는 시퀀싱 키트) 등을 사용하여 반응을 행하고, Beckman Coulter 사의 자동 시퀀서(CEQ 8000 등)로 염기 서열을 결정한다.
[생리학적 특징]
그람 염색 음성
운동성 없음
생육온도 37 ℃(4- 40 ℃에서 생육가능하지만, 37 ℃가 바람직함)
산소 요구성 통성 혐기성이지만 산소를 제공하는 형태가 바람직 함
형상 간균
우레아 분해성 음성
오르니틴 카르복실라제 양성
생육상태 콜로니 원형, 볼록형, 건조, 투명, 크림 백색
[배지]
(배양시 pH는 예컨대 5 - 9이며, 바람직하게는 6 - 8.5이다. 배양은 진탕 또는 통기 교반 등의 호기 조건 하에서 행한다.)
1. TSB(트립틱 소이프로스) 배지 1 - 2%
TSB: Becton, Dickinson Company 사 제품
2. 육류 엑기스 배지
(육류 엑기스(와코 순약공업 주식회사 제품) 0.5%, 폴리펩톤(와코 순약공업 주식회사 제품) 0.5%, 염화나트륨 0.5%, pH 7.0)
3. 효모 엑기스 배지
(효모 엑기스(와코 순약공업 주식회사 제품) 0.5%, 폴리펩톤 0.5%(와코 순약공업 주식회사 제품), 염화나트륨 0.5%, pH 7.0)
한천 배지의 경우에는, 한천을 최종 농도 2%로 첨가한다.
본 발명자들이 분리한 IK7주는 엔테로박터 속에 속하는 신규 미생물이며, 일본국 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 일본국 지바현 기사라즈시 가즈사 카마타리 2-5-8에 2006년 10월 19일에 국내 기탁하였다. 그 후, 원기탁(NITEP-271)을 상기 운기탁한 국제 기탁 당국에 이관 청구하고, 2007년 3월 22일에 상기 국제 기탁 당국으로부터 원기탁에 대한 수탁증(NITE P-271)을 발행받았다.
[당 알코올 탈수소효소를 포함하는 균체의 제조]
멸균한 액체 배지(2% TSB(트립신 소이 브로스: Becton Dickinson company)를 기본으로 하여 탄소원으로서 1% D―만니톨을 포함함)에 엔테로박터 에어로게네스 IK7을 접종하고, 37 ℃에서 24시간 동안, 120 rpm로 진탕 배양하여, 당 알코올 탈수소효소를 다량 포함하는 미생물 균체를 제조하였다.
배양을 종료한 후, 원심분리하고, 회수한 균체를 적당량의 1차 교환수로 2회 세정한 후, 50 mM Tris-HCl(pH 9.0) 완충액으로 적당량 현탁하였다. 이 현탁액을 당 알코올 탈수소효소를 포함하는 균체 용액으로 하였다.
제조한 당 알코올 탈수소효소 활성을 보이는 균체 용액을 사용하여, 1-데옥시 L-만니톨로부터 1-데옥시-L-프럭토스를 제조하였다.
L자 관(용량 30 ml)에, 50 mM Tris-HCl(pH 9.0) 완충액과 당 알코올 탈수소효소를 포함하는 균체 용액(최종 균체 농도는 흡광도 600 nm에서의 값이 20임) 및1-데옥시 L-만니톨(최종 농도 10%)을, 흡광도 60 0nm에서의 O.D 50으로 조정하고, 37 ℃로 보온하면서 호기 조건이 되도록 가볍게 진탕하였다. 생성물의 확인은 수득되는 반응액을 원심분리를 통해 불용물을 제거한 다음, 상청액을 고속 액체 크로마토그래피로 분석하여 수행하였다.
18시간에 1-데옥시-L―프럭토스를 최대로 수득할 수 있었으며, 1-데옥시 L― 만니톨의 약 80%를 1-데옥시-L―프럭토스로 수득할 수 있었다.
실시예 5
[1-데옥시 L-프럭토스로부터 D-타가토스 3-에피머라제를 이용한 에피머화에 의한 1-데옥시 L-프시코스의 제조]
D-타가토스 3-에피머라제를 사용하여, 실시예 4에서 제조한 1-데옥시 L-프럭토스로부터 1-데옥시 L-프시코스를 제조하였다.
D-타가토스 3-에피머라제는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
1-데옥시 L-프럭토스는 실시예 4와 동일하게 제조한 것을 사용하고, 에피머화 반응은 동일하게 실시예 1의 방법으로 행하였다.
[생산물인 1-데옥시 L-프시코스의 구조 해석]
반응액을 실시예 1과 동일한 HPLC 분석에 의해, 1-데옥시 L-프럭토스로부터1-데옥시 L-프시코스가 제조됨을 확인할 수 있었다.
크로마토그래피를 사용하여 얻은 샘플을, NMR로 그 구조를 확인하였다. 표준이 되는 1-데옥시 D-프시코스의 13C NMR 및 proton NMR을 측정하였다. 일반적으로, 당의 D형과 L형의 NMR는 일치한다. 측정 결과와 동일하였기에, 생산물이 1-데옥시 L-프시코스인 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 1-데옥시케토헥소스를 D-타가토스 3-에피머라제가 기질로 사용함을 나타낸다.
실시예 6
[6-데옥시 L-프시코스로부터 1-데옥시 D-프시코스의 제조]
6-데옥시 L-프시코스는 실시예 1에 나타낸 바와 같이, L-람노스로부터 제조하였다. 그것을 환원하여 6-데옥시 L-알리톨로 변환하고, 다시 산화함으로써, 1-데옥시 D-프시코스를 제조하였다.
6-데옥시 L-프시코스를 화학 환원하여 6-데옥시 L-알트리톨과 6-데옥시 L-알리톨을 제조하였다. 이를 각종 당질의 분리에 사용하는 칼슘 이온 교환 수지가 충전된 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다. 이러한 방법으로 6-데옥시 L-알리톨을 수득하였다.
6-데옥시 L-알리톨을 실시예 4와 동일한 미생물을 사용하여 1-데옥시 D-프시코스로 산화하였다.
[구조 해석]
생산물인 1-데옥시 D-프시코스의 구조를 화학 합성한 1-데옥시 D-프시코스와 13C NMR 및 proton NMR로 측정하여 비교하였다. 그 결과는 도 15 및 16에 나타내었다.
도 15의 상단 그래프가 화학 합성한 1-데옥시 D-프시코스의 13C NMR 스펙트럼이고, 하단 그래프는 본 실험에서 제조한 1-데옥시 D-프시코스의 13C NMR 스펙트럼이다. 이와 같이 완전히 일치되었다.
실시예 7
[1-데옥시 D-프시코스로부터 1-데옥시 D-프럭토스의 제조]
실시예 6에서 제조한 1-데옥시 D-프시코스를 기질로 하여서 D-타가토스 3-에피머라제를 사용함으로써 1-데옥시 D-프럭토스를 제조하였다.
1-데옥시 D-프시코스를 기질로 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 D-타토스 3-에피머라제를 사용함으로써 3번 위치를 에피머화하였다. 반응 생산물을 전술한 크로마토 크로마토그래피로 분리하여, 순수한 표제 물질을 수득하였다.
[구조 결정]
화학 합성한 1-데옥시 L-프럭토스와 생산물을 NMR 스펙트럼으로 측정하여 비교하였다. 화학 합성한 1-데옥시 D-프럭토스는 용이하게 수득할 수 없으므로, 1-데옥시 D-프시코스를 비교 대상으로 하였다. D-형 당과 L-형 당은 NMR이 일치하므로, 비교하는 표준 물질로서는 사용하는 것이 가능하다.
도 17에서, 상단 그래프는 1-데옥시 L-프럭토스의 13C NMR이며, 하단 그래프는 본 실험에서 제조한 1-데옥시 D-프럭토스의 13C NMR이다.
도 18에서, 상단 그래프는 1-데옥시 L-프럭토스의 proton NMR이며, 하단 그래프는 본 실험에서 제조한 1-데옥시 D-프럭토스의 proton NMR이다. 이들은 완전히 일치되었다.
실시예 8
[1-데옥시 D-타가토스로부터 1-데옥시 D-소르보스의 제조]
화학 합성한 1-데옥시 D-타가토스를 기질로 하고 D-타가토스 3-에피머라제를 사용하여 1-데옥시 D-소르보스를 제조하였다.
실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 D-타가토스 3-에피머라제를, 화학 합성한 1-데옥시 D-타가토스에 통상적인 방법에 따라 반응시키고, 생산물을 크로마토그래피에 의해 확인하였다. 그 결과, 1-데옥시 D-소르보스와 1-데옥시 D-타가토스의 피크가 확인되어, 분리함으로써 생산가능하게 되었다.
실시예 9
[ L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)로부터 6-데옥시 L-소르보스의 제조]
L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)를 D-아라비노스 아이소머라제를 사용하여 6-데옥시 L-타가토스로 이성화하고, 이를 D-타가토스 3-에피머라제를 사용하여 에피머화함으로써, 6-데옥시 L-소르보스를 제조하였다.
L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)를 기질로 하고, 클랩시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) ST. 40 BXX에서 생산되는 D-아라비노스 아이소머라제를 사용하여 반응시켰다. HPLC로 분석한 결과, 10%의 6-데옥시 L-갈락토스가 6-데옥시 L-타가토스로 변환되어 평형화되었다. 그 평형 혼합물로부터 6-데옥시 L-타가토스를 통상적인 방법으로 크로마토그래피를 사용하여 순수한 표제 화합물을 수득하였다.
6-데옥시 L-타가토스를 기질으로 하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 D-타가토스 3-에피머라제를 사용하여 효소 반응을 행하였다. 그 결과, 6-데옥시 L-타가토스의 약 80%가 6-데옥시 L-소르보스로 변환된 시점에서 평형 혼합물을 수득할 수 있었다.
실시예 10
[생물화학적 반응을 이용한, L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스) 및 그 거울상 이성체(鏡像體)인 D-푸코스(6-데옥시 D-갈락토스)로부터 1-데옥시 및 6-데옥시 D-타가토스의 제조]
먼저, L-푸코스 및 D-푸코스를 출발 원료로 하고, Raney 니켈을 사용한 화학적 환원법(압력 1.2 Mpa, 교반 700 rpm, 온도 50 ℃)에 의해, 각각으로부터 6-데옥시 L-갈락티톨 및 6-데옥시 D-갈락티톨을 수득하였다. 다음으로, 갈락티톨을 산화하는 D-타가토스 생산능을 가진 엔테로박터 어글로메란스(Enterobacter agglomerans) 221 e주(FERM BP-4700)[배지: 에리트리톨 1.0 w/v%, 효모 엑기스 0.5 w/v%, 폴리 펩톤 0.5 w/v%, 식염 0.5 w/v% 및 글리세롤 1.0 w/v%로 이루어진 액체 배지(pH7.0)에서 30 ℃에서 배양하고, 집균해 세정한 것]을 사용하여 각각의 데옥시 당 알코올을 기질로 하여, 세정 균체 반응[균체 반응 조성물: 균체 40(OD600), Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 50 mM, 기질 1%)]으로 행하였다(일본 특허 평08-056659호 공보 참조).
HPLC 분석의 결과로부터, 본균은 6-데옥시 L-갈락티톨을 산화하여 1-데옥시 D-타가토스로 전환하고, 6-데옥시 D-갈락티톨을 산화하여 6-데옥시 D-타가토스로 전환시킴을 알 수 있었다.
본 균주를 사용한 6-데옥시 L-갈락티톨 및 6-데옥시 D-갈락티톨의 산화 결과로부터, 1번 위치, 6번 위치의 메틸기의 존재와는 관계없이, 당 구조를 인식하여 전환할 수 있으며, 우선적으로 D형의 타가토스로 전환되는 것을 알 수 있었다.
[반응 생산물의 정제]
반응 혼합물을 탈이온, 탈색, 여과, 증발을 거쳐 결정을 수득하였다.
[생산물인 1-데옥시 D-타가토스의 구조 해석]
HPLC 분석에 의해, 6-데옥시 L-갈락티톨로부터 1-데옥시 D-타가토스가 제조됨을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 19에 나타낸다.
수득되는 샘플을 NMR를 사용하여 그 구조를 확인하였다. 그 결과를 도 20에 나타낸다.
[생산물인 6-데옥시 D-타가토스의 구조 해석]
HPLC 분석에 의해, 6-데옥시 D-갈락티톨로부터 6-데옥시 D-타가토스가 생산됨을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 21에 나타낸다.
수득되는 샘플을 NMR를 사용하여 그 구조를 확인하였다. 그 결과를 도 22에 나타낸다.
본 실시예의 생물화학적 반응을 사용한, L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스) 및 그 거울상 이성체인 D-푸코스(6-데옥시 D-갈락토스)로부터 1-데옥시 및 6-데옥시 D-타가토스의 생산을 화학식 1 및 화학식 2로 그 반응이 나타내었다.
(화학식 1)
Figure 112009037347917-PCT00001
(화학식 2)
Figure 112009037347917-PCT00002
실시예 11
[생물·화학적 방법에 따른 L-람노스로부터 1-데옥시 D-프시코스의 제조]
먼저, 도 23에 나타낸 바와 같이, L-람노스로부터 L-람노스 아이소머라제 및 D-D-타가토스 3-에피머라제를 사용하여 6-데옥시 L-프시코스를 제조하였다(일본 농예화학 학회 2007 점도 대회). 이에 고압 조건 하에서 니켈 촉매를 사용하여 수소 첨가한 결과, 1-데옥시 D-알리톨(6-데옥시 L-알리톨)과 1-데옥시 D-탈리톨(6-데옥시 L-탈리톨)의 혼합물을 얻을 수 있었다(도 24, 도 26). 이 혼합물을 기질로 하여 엔테로박터 속 균체 IK7(NITE BP-271)에 의한 균체 반응을 행하였다(도 25, 도 27). 그 결과, 1-데옥시 D-알리톨만 선택적으로 1-데옥시 D-프시코스로 산화되었다. 엔테로박터 속 균체 IK7에 의한 2가지 기질의 총량의 감소는 거의 없었으며, 1-데옥시 D-알리톨에서의 1-데옥시 D-프시코스로의 생산율은 약 90%였다. 이 반응물을 분리한 결과, 1-데옥시 D-프시코스와 1-데옥시 D-탈리톨을 각각 순품으로 수득하였다. 수득된 6-데옥시 L-프시코스의 결정 사진을 도 28에 나타내었다. 생산물의 확인은 화학 합성한 1-데옥시 D-프시코스와 비교하여, 양 화합물의 13C NMR 스펙트럼(도 29) 및 선광도 일치에 의해 확인하였다.
선광도[α]20(conc.1.00%, H2O)
표준(authentic) + 1.O
생성물 + 1.1
그리고, 표준(authentic)은 문헌(Jones, N. A. and et al. Synthesis of and NMR studies on the four diasteromeric 1-deoxy-d-ketohexoses., Tetrahedron: Asymmetry(2007))에 따른다.
실시예 12
[6-데옥시 L-글루코스 및 6-데옥시 L-프럭토스의 제조]
L-람노스(10% wt/volume)를 Raney 니켈 촉매의 존재 하에서 온도 50 ℃, 압력 1.2 Mpa에서 완전히 환원시켜 6-데옥시 L-만니톨을 제조하였다. 수득되는 6-데옥시 L-만니톨을 기질로 하여 6-데옥시 L-프럭토스를 제조하였다. 새롭게 분리한 엔테로박터 sp.230S를 6-데옥시 L-만니톨의 제2 탄소로 선택적으로 산화하여 6-데옥시 L-프럭토스를 제조하는데 이용할 수 있었다. 미생물은 D-소르비톨(0.8% wt/volume) 및 글리세롤(0.2% wt/volume)을 첨가한 미네랄염 배지에서, 온도 30 ℃, 300 rpm으로 교반하면서 24시간 배양하였다. 배양물은 12000 rpm으로 30분간 원심분리하여 집균하고, 50 mM Tris-HCl 완충액(pH10)으로 2회 세정하였다. 세정한 균체는 동일한 완충액에 현탁하여, 6-데옥시 L-만니톨을 6-데옥시 L-프럭토스로 전환하는데 사용하였다. 반응은, 균체 OD(600 nm), 조작 용량, 교반 속도, 공기 유속 및 온도가 각각, 40, 0.51, 200 rpm, 0.21 L/min 및 30 ℃에서 실시하였고, 5l 바이오 반응기(ABLEDPL-2, Japan)에서 여러가지 기질 농도로 수행하였다.
본 발명에서는 이미 클랩시엘라 뉴모니아 40bXX가 L-프럭토스에서 L-글루코스로의 전환을 촉매함을 발표하였다. 동일한 방법으로, 6-데옥시 L-프럭토스(전 단계의 생산물)의 6-데옥시 L-글루코스로의 제조를 시도한다. 클랩시엘라 뉴모니아 40bXX는 MnCl2(1 mM)가 보충된 폴리 펩톤 0.5 w/v%, 효모 엑기스 0.5 w/v%, 식염 0.5 w/v%를 함유하는 배지에서 배양하였다. 24시간 인큐베이션한 다음, 균체는 1200 xg로 10분간 원심분리하여 회수하고, 회수한 균체는 50 mM 글리신-NaOH 완충액(pH9.0)으로 2회 세정하고, 1200 xg로 10분간 원심분리하였다. 세정한 균체는 모터로 파괴하고, 활성화된 알루미나를 첨가하여 분쇄하여 조 효소를 수득하였다. 부분 정제한 효소 D-AI(400 U)는 미리 50 mM 글리신-NaOH에 합쳐져 반응에 사용되는 chitopearl BCW 2510 30 g(습중량)에 고정하였다. 전위 반응은 40 ℃에서, 1% 6-데옥시 L-프럭토스, 고정화 D-AI(40 U), 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0) 및 MnCl2(최종 농도: 1 mM)를 포함하는 L-튜브에서 수행되었다.
[분리 방법]
6-데옥시 L-만니톨의 경우, 전환율이 100%에 가까우므로, 분리 공정은 반응 혼합물로부터 여과로 Raney 니켈을 제외하는 것뿐이다.
6-데옥시 L-프럭토스는, 230S의 나머지의 균체를 사용하여 6-데옥시 L-만니톨을 산화하여 제조하였다. 표면에 떠오른 것은 하룻밤 동안 활성탄소를 처리하고, 최종적으로는 활성탄은 셀룰로오스 필터를 통과시켜 흡인여과에 의해 제거하였다. 여액 Diaion SK1B(H+ 형) 및 엠버라이트 IRA-411(CO3 2 -형)의 혼합물로 탈 이온화하였다. 여액의 용량은 회전 진공 증발기에 적합한 양이었으며, 농축한 여액은 Ca2+ 형의 Dowex 50W-X2 컬럼에 적용하였다. 컬럼은 증류수로 용출시키고, 용출된 분획을 모아 HPLC 분석하였다.
[동정]
6-데옥시 L-만니톨 및 6-데옥시 L-프럭토스가 HPLC 분석(도 30), 선광도 측정, 및 13C NMR 측정에 의해 동정되었다.
정제된 6-데옥시 L-프럭토스의 HPLC 분석 결과를 도 30에 나타내었다. 또한, 제조된 6-데옥시 L-프럭토스의 선광도는 +12.9이었고, 문헌에 나타난 공지의 선광도는 +13.6이었다. 또한, 제조된 6-데옥시 L-프럭토스의 13C NMR은 표준 6-데 옥시 L-프럭토스와 완전히 일치하였다(도 31).
[결과]
6-데옥시 L-만니톨은 6-데옥시 L-만노스의 화학 환원으로 용이하게 제조할 수 있다. 6-데옥시 L-만노스는 99%에 가까운 생산율로 완전하게 6-데옥시 L-만니톨로 변환한다. 6-데옥시 L-만니톨의 초기 농도가 3%, 4% 및 5%일때 각각 6-데옥시 L-만니톨의 거의 90%, 70% 및 65%가 세정 균체 반응에 의해 6-데옥시 L-프럭토스 및 1-데옥시 L-프럭토스로 제조되었다.
반응 혼합물 내 6-데옥시 L-프럭토스의 1-데옥시 L-프럭토스에 대한 최종 비율은 약 8:2였다.
바이오 반응기 내에서, 약 10시간 동안 6-데옥시 L-만니톨(30 g/l)은 6-데옥시 L-프럭토스 및 1-데옥시 L-프럭토스의 제조를 위해 완전히 다 소모되었고, 여러가지 정제 공정 거친 6-데옥시 L-만니톨의 6-데옥시 L-프럭토스로의 최종 생산율은 약 50%였다..
고정화 D-아라비노스 아이소머라제에 의해 6-데옥시 L-프럭토스를 6-데옥시 L-글루코스로 이성화하는 경우, 6-데옥시 L-글루코스의 HPLC 피크는 효소의 매우 낮은 활성으로 인해 검출할 수 없었다. 따라서, 6-데옥시 L-글루코스의 분리 및 동정은 이번에는 수행하지 않았다.
6-데옥시 L-프럭토스는 6-데옥시 L-만노스로부터 L-람노스 아이소머라제를 사용해서도 제조할 수 있다. 그러나, 등량 혼합물의 HPLC 피크가 겹치기 때문에, 6-데옥시 L-프럭토스 및 6-데옥시 L-만노스의 분리는 매우 곤란하며 비현실적이다.
본 실험에서는 6-데옥시 L-만노스로부터 6-데옥시 L-프럭토스를, 화학적 방법 및 생물화학적 방법을 결합하여 사용함으로써 약 50%의 생산율로 제조해 정제할 수 있었다.
실시예 13
[L-람노스로부터 6-데옥시 L-만니톨 및 1-데옥시 L-프럭토스를 경유한 1-데옥시 L-프시코스의 신규한 생물화학적 제조 방법]
[원료 및 방법]
[시약 등]
L-람노스 및 다른 생화학 제품은 Sigma Chemical Co. (MO, USA) 및 와코 순약공업(주)(오사카, 일본) 사로부터 모두 시약 등급이 보증된 것을 구입하였다. L-람노스의 산화에 사용한 50 mM tris-HCl 완충액은 1.0 N HCl로 pH 9.0로 조정한 트리스(하이드로 옥시 메틸) 아미노 에탄 H2NC(CH2OH)3로부터 제조하였다. L-람노스 수소 첨가는 TEM-1000 M 수소 첨가 장치(Taitasu Techno Co. Ltd, Japan)에서 수행하였다. 미생물의 배양 및 산화 반응은 TAKASUGI SEISAKUSHO Co.Ltd. 사의 바이오 반응기(TS-M-15 L 발효조 및 TS-M-5 L 발효조)에서 수행하였다. 반응 혼합물 내 폴리올 산화 및 케토스 축적은 자외 가시 분광 광도계(U.V. -1700 pharmaspec 시마즈 제작소, 쿄토)를 사용하여 Nelson-Somogyi 방법으로 결정하였다. 13C NMR 스펙트럼(Burker AMX500, 126 MHz)은 초기 표준으로서 아세톤을 사용하여 D2O 중에 서 기록하였다. 선광도는 1 dm.의 경로 길이로 탈 이온화된 H2O 선광계에서 20 ℃에서 Jasco R1030 선광계, Na+ 램프(Jasco 도쿄 일본) 상에서 기록하였다. 농도는 g1OO mL-1까지 사용하였다. 생산물은 고감도 액체 크로마트그래피(Hitach GL-611 colum, Tokyo, Japan 및 Shimadzu RID-6 refractive index detector, Kyoto, Japan)로 600 ℃에서 분석하고, 10-4 M NaOH로 유속 1.0 mL/min로 용출시켰다.
[L-람노스의 6-데옥시 L-만니톨로의 화학적 환원]
Raney 니켈(촉매)을 물(300 ml 중의 L-람노스(50 g)의 용액에 첨가하고; 반응은 전량 500 mL로 하여 1.2 MPa 수소압력 하에 있는 반응 용기에 넣어 수행하였다. 그리고, 반응 용기는 50 ℃로 8시간 가열하여, L-람노스가 6-데옥시 L-만니톨로 제조한다.
[6-데옥시 L-만니톨의 1-데옥시 L-프럭토스로의 산화]
엔테로박터 속 균체 IK7(NITE BP-271)를 6-데옥시 L-만니톨의 1-데옥시 L-프럭토스로의 생물화학적 전환에 사용한다. 균주는 균체 반응으로 1-데옥시 L-프럭토스를 생산하기 위해, 1%의 D-만니톨을 첨가한 2% TBS 배지에서 37 ℃에서 배양하였다. 전환 반응은 5.0 L 바이오 반응기에서 37 ℃에서 교반 속도 120 rpm, 공기 유속 0.5l/min으로 12시간 행해진다. 반응 혼합물의 조성물은 이하와 같다:
50 g(5% w/v) 1-데옥시 L-만니톨, 균체 밀도 50(A600), 세정 균체는 트리스-HCl 완충액(1000 ml, 50 mM, pH9.0)에 현탁되었다.
[1-데옥시 L-프럭토스의 1-데옥시 L-프시코스로의 이성화]
슈도모나스 시커리 ST 24주(FERM BP-2736) 유래의 D-타가토스 3-에피머라제(D-TE)를 1-데옥시 L-프럭토스의 1-데옥시 L-프시코스로의 이성화에 이용하였다. 재조합 대장균으로부터수득되는 D-TE를 부분 정제하여 바이오 반응기를 구축하기 위해, Chitopearl BCW2510을 사용하여 고정화를 행하였다. 트리스-HCl 완충액(1000 ml, 50 mM, pH7.5)에 용해한 1-데옥시 L-프럭토스(5%)는 바이오 반응기에 42 ℃로 흘려 주었다.
[분리 방법]
각 공정에서 수득되는 표면에 부유하는 것은 활성탄 처리해 탈색하고, 처리한 활성탄을 없애기 위해 여과하였다. 여액은 Diaion SK1B(H+ 형; 미쓰비시가가쿠, 도쿄) 및 엠버라이트 IRA-411(CO3 2 - 형 Muromachi Tecynos, 도쿄) 이온 교환 수지의 혼합물로 탈 이온화하였다. 탈 이온화한 것을 40 ℃에서 증발시켜 농축하였다. 농축 후, 혼합물은 2개의 펌프가 결합되어 있는 8개의 컬럼로 이루어져 있으며 각 컬럼에는 2.5 L의 UKB-555 이온 교환 수지(Ca2 + 형, 미쓰비시가가쿠, 도쿄)가 충전되어 있는, 원 패스 분리 시스템에 의해 분리하였다. 분리된 분획 50%까지 농축되어 농축물은 결정화를 위해 데시케이터 안에 둥ㅆ다.
[동정]
각 공정에서 수득되는 생성물은 HPLC 분석, 선광도 측정, 및 13C NMR 측정에 의해 동정하였다.
제조된 1-데옥시 L-프시코스의 13C NMR 스펙트럼을 도 32에 나타낸다.
또한, 제조된 1-데옥시 L-프시코스의 선광도는 하기와 같다.
선광도 1-데옥시 L-프시코스(p) -1.0
1-데옥시 D-프시코스 +1.15
[결과]
L- 람노스의 6- 데옥시 L- 만니톨로의 화학적 환원
수중의 L-람노스는, 10% w/v의 L-람노스가 기질로 하고, 니켈 촉매를 사용하여 1.2 MPa의 압력, 50 ℃ 하, 수소 첨가에 의해 수율 100%로 L-람니톨이 된다. 이 방법은 어떠한 분리 방법도 필요하지 않다. 도 33에 HPLC 분석 결과를 나타내었다.
6- 데옥시 L- 만니톨의 1- 데옥시 L- 프럭토스로의 산화
엔테로박터 속 균체 IK7(NITE BP-271)에 의한 균체 반응으로, 6-데옥시 L-만니톨은 5% w/v의 6-데옥시 L-만니톨을 기질로 하여 산화되어, 수율 90%로 1-데옥시 L-프럭토스가 된다. 1-데옥시 L-프럭토스는 상기 방법으로 분리된다. 도 34에 HPLC 분석 결과를 나타내었다.
1- 데옥시 L- 프럭토스의 1- 데옥시 L- 프시코스로의 이성화
1-데옥시 L-프럭토스는, 5% w/v의 1-데옥시 L-프럭토스을 기질로 하여, 바이오 반응기에서 고정화 D-TE에 의해, 수율 25%로1-데옥시 L-프시코스로 이성화되었 다. 도 35에 HPLC 분석 결과를 나타내었다.
[결론]
L-람노스로부터 6-데옥시 L-만니톨 및 1-데옥시 L-프럭토스를 경유하여 1-데옥시 L-프시코스의 신규한 생물화학적 제조 방법을 도 36에 나타내었다.
[실험 결과가 나타내는 성과의 정리]
(1) D-타가토스 3-에피머라제는 모든 1- 및6-데옥시케토헥소스의 3번 위치를 에피머화한다.
(2) 6-데옥시알도스는 알도스 아이소머라제의 기질이 되어, 대응되는 6-데옥시알도스를 제조할 수 있다.
(3) 1- 또는 6-데옥시의 D- 또는 L-케토헥소스를 환원하여, 대응되는 1- 또는 6-데옥시의 탄소수 6의 당 알코올을 제조할 수 있다. 또, 6-데옥시알도스를 환원하여 6-데옥시 당 알코올을 제조할 수 있다.
(4) 1- 또는 6-데옥시 당 알코올을 기질로서 사용하여, 미생물을 이용한 산화 반응에 의해, 각각 대응되는 1- 또는 6-데옥시케토헥소스를 제조할 수 있다.
[전체 데옥시케토헥소스의 생산 전략 데옥시이즈모링의 구축]
상기한 성과(1) - (4)를 이용하여 전체 데옥시케토헥소스의 생산 전략으로서 데옥시이즈모링을 구축할 수 있었다.(도 1 - 3)
도면에 나타낸 큰 링은, 8종 모든 1-데옥시케토스 및 8종 모든 6-데옥시케토헥소스가 D-타가토스 3-에피머라제에 의해 대응되는 데옥시케토헥소스와 연결되어 있으며, 2종의 데옥시케토헥소스가 8그룹으로서 배치되어 있다. 각각의 그룹은, 산화 또는 환원 반응에 공통적인 생산물 및 기질이 되는, 1- 및 6-데옥시헥시톨과 연결되어 있다. 그 원리를 도 1에 기재하여 나타내었다.
적기한 사항, 좌측으로부터 L-람노스(6-데옥시 L-만노스)를 이성화하여 제조되는 6-데옥시 L-프시코스를 D-타가토스 3-에피머라제에 의해 6-데옥시 L-프시코스로 에피머화한다(실시예 1). 이를 화학적 환원 반응으로 6-데오키시글루시톨로 환원하고, 이를 상하 반대로 하면 1-데옥시 글리톨과 동일하다. 이 1-데옥시 글리톨을 산화하면 1-데옥시 D-소르보스를 생산할 수 있다. 또한, 1-데옥시 D-소르보스를 D-타가토스 3-에피머라제에 의해 1-데옥시 D-타가토스로 제조할 수 있다(실시예 8). 이는 일 예이며, 큰 링은 이ㄹ한 방식을 반복함으로써 전체를 연계할 수 있음을 나타내고 있다. 이러한 원리에 의해 모든 1- 및 6-데옥시, 16종의 케토헥소스를 제조할 수 있는 기본 골격이 완성되었다.
또한, 그 주위에는 16종의 모든 6-데옥시케토헥소스가 6-데옥시케토헥소스와 연결되어 있다. 알도스 아이소머라제에 의해 6-데옥시케토헥소스로 전환할 수 있다. 6-데옥시 L-프럭토스로부터 6-데옥시 알트로스의 제조를 적시하였다(실시예 1). 이와 같이 모두 16종의 6-데옥시알도스가 주위에 결합되어 있다.
이와 같이, 도 1 - 3에 나타낸 데옥시이즈모링은, 모든 1- 및 6-데옥시케토헥소스를 효소 반응으로 연결시킬 수 있음을 나타내고 있으며, 전체 데옥시케토헥소스의 생산 전략을 보여준다. 또한, 그러한 배치는, 우측에 모든 D-형의 데옥시케토헥소스가, 좌측에 L-형의 데옥시케토헥소스가 배치되어 있고, 전체 1- 및 6-데옥시케토헥소스가 명확하게 배치되어 있어 생산법을 일목 요연하게 이해할 수 있 다. 그리고, 구조를 보면 이해할 수 있지만, 도면에 점선의 화살표로 나타낸 것은, 상하를 반전시키면 중첩됨을, 즉 동일한 1-데옥시 및 6-데옥시의 헥시톨을 나타낸 것이다. 이 점선은, 도면에서 링에 따른 합성 뿐만 아니라 바이 패스와 같은 역할을 하는 양호한 효율의 합성 방법을 시사하고 있는 것이다.
현재 자연계에 비교적 많이 존재하고 있는 데옥시알도스인, L-람노스(6-데옥시 L-만노스) 또는 L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)를 출발 원료로 하여, 이 데옥시이즈모링을 이용하여 생산할 수 있으며, 이들의 새로운 데옥시케토헥소스의 생산에 유효하게 이용할 수 있다.
이상의 정리와 더욱 전진시켜, 데옥시 당에 번호가 기재되어 있는 데옥시이즈모링을 도 3에 나타내었고, 새로운 데옥시케토헥소스의 제조에 대해서는 실시예 번호 14 이하의 실시예에서 도 3을 기초하여 구체적으로 설명한다.
도 3에는, 도 1 및 2와 마찬가지로, 하기의 A - D의 반응이 상이한 표시의 화살표이 나타나 있다.
A DTE 에피머화
B 폴리올의 산화 반응
C 이성화 반응(알도스 케토스 간의 이성화)
D 니켈 촉매 환원(케토스, 알도스의 폴리올로의 환원)
실시예 14
[6-데옥시 L-소르보스의 제조]
이 반응은, 6-데옥시 L-타가토스의 D-TE에 의한 6-데옥시 L-소르보스로의 에피머화이며, 도 3의 번호 27-26의 A 반응이다.
하기 반응 조건으로 L-람노스로부터 제조한 6-데옥시 L-타가토스에 DTE를 작용시켰다.
(반응 조건)
기질: 6-데옥시 L-타가토스
효소: 고정화 D-타가토스 3-에피머라제
완충액: 50 mM Tris-HCl(pH7.5)
온도: 40 ℃
반응의 성과를 HPLC로 확인하였고, 도 37과 같이 6-데옥시 L-소르보스의 생산이 확인되었다. 평형은 6-데옥시 L-타가토스 : 6-데옥시 L-소르보스가 대략 1:3이었다.
이를 하기 방법으로 분리하여 순수한 6-데옥시 L-소르보스를 수득하였다(도 38). 그 선광도는 -48.5도였다.
(분리 방법)
Dowex 50W X2
원 패스 분리 시스템
본 실시예의 6-데옥시 L-타가토스로부터 6-데옥시 L-소르보스의 제조는 화학식 3에 그 반응을 나타내었다.
(화학식 3)
Figure 112009037347917-PCT00003
6-데옥시-L-타가토스 6-데옥시 L-소르보스
실시예 15
[6-데옥시 D-소르보스의 제조]
이 반응은, 6-데옥시 D-타가토스의 6-데옥시 D-소르보스로의 에피머화 반응이며, 도 3의 번호 3-2의 A 반응이다.
L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)를 출발 원료로 하고, Raney 니켈을 사용한 화학적 환원법에 의해 수득한 6-데옥시 D-갈락티톨을 산화 전환한 6-데옥시 D-타가토스에, 하기 반응 조건으로 DTE를 작용시켰다.
(반응 조건)
기질: 6-데옥시 D-타가토스
효소: 고정화 D-타가토스 3-에피머라제
완충액: 50 mM Tris-HCl(pH7.5)
온도: 40도
(분리 방법)
Dowex 50W X2
반응의 성과를 HPLC로 확인하여, 도 39와 같이 6-데옥시 D-소르보스의 생산이 확인되었다. 평형은 6-데옥시 L-타가토스 : 6-데옥시 L-소르보스의 경우와 같으며, 대략 1:3이었다.
본 실시예의 6-데옥시 D-타가토스로부터 6-데옥시 D-소르보스의 제조는 화학식 4로 그 반응을 나타내었다.
(화학식 4)
Figure 112009037347917-PCT00004
6-데옥시-L-타가토스 6-데옥시 L-소르보스
실시예 16
[1-데옥시 L-프시코스의 제조]
이 반응은, 1-데옥시 L-프럭토스의 DTE에 의한 1-데옥시 L-프시코스로의 에피머화 반응이며, 도 3의 번호 18-19의 A 반응이다.
L-람노스로부터 제조한 1-데옥시 L-프럭토스를 DTE와 반응시켰다.
L-람노스로부터 6-데옥시 L-만니톨을 경유하여 1-데옥시 L-프럭토스를 제조 하였다.
L-람노스로부터 제조한 1-데옥시 L-프럭토스에 DTE를 반응시켰다.
반응 조건은 하기와 같다.
(반응 조건)
기질: 1-데옥시 L-프럭토스
고정화 D-TE: 10000 U (Chitopearl BCW2510)
온도: 42 ℃
교반: 90 rpm
용량: 100 ml
시간: 24시간
변환율: 75(F):25(P)
DTE의 작용에 의한 1-데옥시 L-프시코스의 생산이 확인되었으며, 평형은 1-데옥시 L-프럭토스 : 1-데옥시 L-프시코스는 75:25였다. 반응액 후, 용액을 원 패스 크로마토로 분리하였다. 분리 조건은 하기와 같다.
(분리 조건)
시스템: 원 패스 분리 시스템
시료: 30% 1- 데옥시 L-프럭토스 및 1-데옥시 L-프시코스 혼합물
용량: 100 mL
유속: 60 ml/min
Wait time: 90 min
분획: 탱크-A, B, C 및 D
결과: 순수한 1-데옥시 L-프시코스가 수득됨
반응 혼합물로부터 분리한 1-데옥시 L-프럭토스(a) 및 1-데옥시 L-프시코스(b)의 HPLC에 의한 순도는, 도 40에 나타낸 바와 같이 순수하였다. 1-데옥시 L-프시코스의 13C NMR 스펙트럼은 도 41이다. 이는 도 32와 동일한 것으로 확인되었다.
실시예 17
[6-데옥시 D-프럭토스의 제조]
이 반응은 6-데옥시 D-프시코스에 DTE를 작용시켜 6-데옥시 D-프럭토스로 이성화하는, 도 3의 번호 11-10의 A 반응이다.
1-데옥시 L-프럭토스에 DTE를 작용시켜 제조한 1-데옥시 L-프시코스를 환원하여 1-데옥시 L-알리톨을 수득하였다. 이를 미생물 산화(IK7)를 행하여 6-데옥시 D-프시코스로 제조하였다. 이렇게 제조한 1-데옥시 D-프시코스를 DTE와 작용시켰다. 반응 조건은 하기와 같다.
(반응 조건)
완충액: Tris(pH7.5) 500 ㎕
기질: 5% 6-데옥시 D-프시코스
D-TE: ~ 100 units
온도: 40 ℃
시간: 12시간
변환율: 50(S):50(P)
반응한 후 용액 중에 6-데옥시 D-프럭토스가 50%의 평형으로 생산되는 것을 확인하였다. 도 42의 (a)는 반응 전의 6-데옥시 D-프시코스이고, (b)는 반응한 후의 반응 혼합물의 HPLC 분석 결과이다.
실시예 18
[6-데옥시 L-소르보스의 제조]
이 반응은 6-데옥시 L-타가토스에 DTE에 작용시켜 6-데옥시 L-소르보스로 이성화하는, 도 3의 번호 22-23의 A 반응이다.
1-데옥시 L-프럭토스에 DTE를 작용시켜 제조한 1-데옥시 L-프시코스를 환원하여 1-데옥시 L-탈리톨을 수득하였다. 이를 미생물 산화(40b)에 의해 1-데옥시 L-타가토스로 제조하였다. 이렇게 제조한 1-데옥시 L-타가토스에 DTE를 작용시켰다. 반응 조건은 하기와 같다.
(반응 조건)
완충액: Tris(pH7.5) 500 ㎕
기질: 1.0% 6-데옥시 L-타가토스
D-TE: ~ 100 units
온도: 42 ℃
시간: 12시간
변환율: 20(S):80(P)
반응한 후의 용액 중에서 6-데옥시 L-소르보스가 생산되었다. 기질과 생산물과의 비는 1:4였다. 도 43의 (a)는 기질인 6-데옥시 L-타가토스, (b)는 반응한 후의 반응 혼합물의 HPLC 분석 결과이다.
실시예 19
[1-데옥시 D-타가토스의 제조]
이 반응은 6-데옥시 L-갈락티톨을 미생물을 이용한 산화에 의해 1-데옥시 D-타가토스로 제조하는, 도 3의 번호 46=39-13의 B 반응이다.
L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)를 환원하고, L-푸시톨(6-데옥시 L-갈락티톨)을 E. agglomerans 221e에 의한 미생물 산화 반응(균체 반응 조성물: 균체 30(OD600), Tris-HCl 완충액(pH8.0) 50 mM, 기질 6-데옥시 L-갈락티톨 1%)을 30 ℃에서 6시간 수행하였다. 1-데옥시 D-타가토스만 생산되었다. 도 44의 (a)는 반응한 후의 반응 혼합물, (b)는 제조된 1-데옥시 D-타가토스의 HPLC 분석 결과이다. 선광도는 +14.0이었다. 이의 13C NMR 스펙트럼을 도 45에 나타낸다.
본 실시예의 6-데옥시 L-갈락티톨로부터 1-데옥시 D-타가토스의 제조는 화학식 5로 그 반응을 나타내었다.
(화학식 5)
Figure 112009037347917-PCT00005
L-푸시톨(6-데옥시 L-갈락티톨) 1-데옥시 D-타가토스
실시예 20
[1-데옥시 L-타가토스의 제조]
이 반응은, 6-데옥시 D-갈락티톨을 미생물을 이용한 산화에 의해 1-데옥시 L-타가토스를 제조하는, 도 3의 번호 34=43-22의 B 반응이다.
L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)를 환원하여, L-푸시톨(6-데옥시 L-갈락티톨)를 제조하고, 이를 기질로 하여 30 ℃에서 K. pneumoniae 40b에 의한 미생물 산화 반응(균체 반응 조성물: 균체 30(OD600), Tris-HCl 완충액(pH8.0) 50 mM, 기질 1%)을 행하였다. 도 46은 1-데옥시 L-타가토스를 제조하는 동안의 HPLC 분석 결과이며,1-데옥시 L-타가토스가 제조됨을 나타낸다.
본 실시예의 6-데옥시 D-갈락티톨로부터 1-데옥시 L-타가토스의 제조는 화학식 6으로 그 반응을 나타내었다.
(화학식 6)
Figure 112009037347917-PCT00006
D-푸시톨(6-데옥시 D-갈락티톨) 1-데옥시 L-타가토스
실시예 21
[6-데옥시 D-타가토스의 제조]
이 반응은, 6-데옥시 D-갈락티톨을 미생물 산화 반응에 의해 6-데옥시 D-타가토스로 제조하는, 도 3의 번호 34-3의 B 반응이다.
D-푸코스(6-데옥시 D-갈락토스)를 환원하여 D-푸시톨(6-데옥시 D-갈락티톨)를 제조하고, 이를 기질로 하여 30 ℃에서 E. agglomerans 221e에 의한 미생물 산화 반응(균체 반응 조성물: 균체 30(OD600), Tris-HCl 완충액(pH8.0) 50 mM, 기질 6데옥시 D-갈락티톨 1%)을 행하였다. 도 47의 (a)는 반응한 후의 반응 혼합물의 HPLC이며, (b)는 분리 정제한 1-데옥시 D-타가토스의 HPLC 결과이다. 선광도는 -O.8도이며, 도 48은 13C NMR 스펙트럼이다.
본 실시예의 6-데옥시 D-갈락티톨로부터 6-데옥시 D-타가토스의 제조는 화학식 7로 그 반응을 나타내었다.
(화학식 7)
Figure 112009037347917-PCT00007
D-푸시톨(6-데옥시 D-갈락티톨) 6-데옥시 D-타가토스
실시예 22
[1-데옥시 L-프럭토스의 제조]
이 반응은, L-람니톨(6-데옥시 L-만니톨)을 미생물 산화 반응에 의해 1-데옥시 L-프럭토스로 제조하는, 도 3의 번호 41=48-31의 B 반응이다.
하기 반응 조건으로 L-람니톨을 기질로 하여 엔테로박터 속 균체 IK7(NITE BP-271)에 의한 탈수소산소 반응을 행하였다.
(반응 조건)
기질: 5% L-람니톨
완충액: 50 mM Tris-HCl(pH9.0)
균체 농도: A600 -40
온도: 37 ℃
교반: 120 rpm
공기 유속: 1.0 L/min
시간: 2시간
용량: 1.0 L
변환율: 90%
분리 정제는 하기 분리 조건으로 행하였다.
(분리 조건)
시스템: 원 패스 분리 시스템
시료: 30% L-람니톨 및 1-데옥시 L-프럭토스 혼합물
용량: 300 mL
유속: 60 ml/min
Wait time: 120 min
분획: 탱크-A, B, C 및 D
결과: 2번의 RUN으로 순수한 1-데옥시 L-프럭토스가 수득됨.
도 49의 (a)는 L-람니톨, (b)는 분리 정제한 1-데옥시 L-프럭토스의 HPLC 분석 결과이다. 도 50은 분리 정제한 1-데옥시 L-프럭토스의 13C NMR 스펙트럼이다.
실시예 23
[6-데옥시 D-프시코스 및 6-데옥시 L-타가토스의 제조]
이 반응은 1-데옥시 L-알리톨 및 1-데옥시 L-탈리톨을 미생물 산화 반응에 의해 6-데옥시 D-프시코스 및 6-데옥시 L-타가토스로 제조하는, 도 3의 번호 47=38-11, 29=28-27이다.
6-데옥시 D-프시코스와 6-데옥시 L-타가토스를 생산하는 반응을 행하였다. 먼저, 1-데옥시 L-프시코스를 환원한 1-데옥시 L-알리톨과 1-데옥시 L-탈리톨을 환원한다(도 51의 (a)). 이를 분리하지 않고, 하기의 반응 조건으로 엔테로박터 속 균체 IK7(NITEBP-271)를 사용하여 산화 반응을 수행한다.
(반응 조건)
완충액: Tris(pH 9.0)
기질: 1% 1-데옥시 L-알리톨 및 1-데옥시 L-탈리톨 혼합물
균체: 30(A600)
온도: 37 ℃
교반: 10O rpm
시간: 12시간
용량: 100 ml
변환율: 100%
분리 정제는 하기 분리 조건으로 행하였다.
(분리 조건)
시스템: Dowex 50Ca+2
column 100cm X 2
시료: 20% 1-데옥시 L-알리톨 및 1-데옥시 L-탈리톨 반응 혼합물
용량: 10 ml
유속: 0.5 ml/min
Wait time: 90 min
분획: 2.0 ml/tube
결과: 순수한 6-데옥시 D-프시코스 및 6-데옥시 L-타가토스가 수득됨
도 51의 HPLC 분석 결과에서 나타난 바와 같이, (a) 1-데옥시 L-알리톨 및 1-데옥시 L-탈리톨로부터, (b) 6-데옥시 D-프시코스 및 6-데옥시 L-타가토스를 각각 생산할 수 있었다. 각각의 분리 정제한 6-데옥시 D-프시코스(c), 6-데옥시 L-타가토스(d)의 HPLC를 나타내었다.
실시예 24
[6-데옥시 L-타가토스의 제조]
이 반응은, 6-데옥시 L-갈락토스를 이성화하여 6-데옥시 L-타가토스를 제조하는, 도 3의 번호 63-27의 C 반응이다.
L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)를 하기 반응 조건으로 D-아라비노스 아이소머라제를 이용하여 이성화함으로써 6-데옥시 L-타가토스로 제조하였다.
(반응 조건)
기질: 10% L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)
효소: 고정화 D-아라비노스 아이소머라제
완충액: 50 mM 글리신-NaOH 완충액(pH9.0)
이온: 1 mM MnCl2
온도: 40 ℃
분리는 하기 방법으로 행하였다.
(분리 방법)
Dowex 50W X2
원 패스 분리 시스템
도 52의 (a)는 반응 후의 HPLC이며, (b)는 분리 정제한 화합물(6-데옥시 L-타가토스)이다. 선광도는 +0.9였다. 이의 13C NMR 스펙트럼을 도 53에 나타내었다.
본 실시예의 6-데옥시 L-갈락토스로부터 6-데옥시 L-타가토스의 제조는 화학식 8로 그 반응을 나타내었다.
(화학식 8)
Figure 112009037347917-PCT00008
L-푸코스(6-데옥시-L-갈락토스) 6-데옥시-L-타가토스
실시예 25
[6-데옥시 L-탈로스의 제조]
이 반응은 6-데옥시 L-타가토스를 이성화하여 6-데옥시 L-탈로스를 제조하는, 도 3의 번호 27-64의 C 반응이다.
L-푸코스로부터 제조한 6-데옥시 L-타가토스에 L-람노스 아이소머라제를 작용시켜 6-데옥시 L-탈로스를 제조하였다.
(반응 조건)
기질: 6-데옥시 L-타가토스
효소: 고정화 L-람노스 아이소머라제
완충액: 50 mM 글리신-NaOH 완충액(pH9.0)
이온: 1 mM MnCl2
온도: 40 ℃
분리는 하기 방법으로 행하였다.
(분리 방법)
크로마토그래피 분리
도 54의 (a)는 반응한 후의 반응 혼합물의 HPLC이며, (b)는 분리 정제한 화합물(6-데옥시 D-탈로스)이다. (c)는 분리 정제한 6-데옥시 D-탈로스의 13C NMR 스펙트럼이다. L-람노스 아이소머라제에 의해 6-데옥시 L-탈로스를 생산할 수 있었다.
본 실시예의 6-데옥시 L-타가토스로부터 6-데옥시 L-탈로스의 제조는 화학식 9로 그 반응을 나타내었다.
(화학식 9)
Figure 112009037347917-PCT00009
6-데옥시-L-타가토스 6-데옥시-L-탈로스
실시예 26
[6-데옥시 D-알로스 및 6-데옥시 D-알트로스의 제조]
이 반응은, 6-데옥시 D-프시코스를 이성화하여 6-데옥시 D-알로스 및 6-데옥시 D-알트로스를 제조하는, 도 3의 번호 11-55, 11-56의 C 반응이다.
6-데옥시 D-알리톨로부터 제조한 6-데옥시 D-프시코스를 원료로 하고, 하기 반응 조건의 이성화 반응에 의해 6-데옥시 알도스를 제조하였다.
(반응 조건)
기질:1.0% 6-데옥시 D-프시코스
500 ㎕
완충액: 50 mM 글리신-NaOH 완충액(pH9.0)
500 ㎕
L-람노스 아이소머라제: 100 units
MnCl2: 50 ㎕
온도: 42 ℃
시간: 24시간
변환율: 40(s):60(ps)
도 55의 (a)는 기질로 사용한 6-데옥시 D-프시코스이고, (b)는 L-람노스 아이소머라제를 작용시킨 후의 HPLC이다. 이 결과로, 6-데옥시 D-프시코스로부터 6-데옥시 D-알트로스, 6-데옥시 D-알로스를 생산할 수 있었다.
실시예 27
[6-데옥시 D-탈로스의 제조]
이 반응은 6-데옥시 D-타가토스를 이성화하여 6-데옥시 D-탈로스를 제조하는, 도 3의 번호 3-52의 C 반응이다.
D-푸코스로부터 제조한 6-데옥시 D-타가토스에 L-리보스 아이소머라제를 작용시켜 6-데옥시 D-탈로스를 제조하는 것이 확인되었다.
(반응 조건)
기질: 6-데옥시 D-타가토스
효소: 고정화 L-리보스 아이소머라제
완충액: 50 mM 글리신-NaOH 완충액(pH9.0)
이온: 1 mM MnCl2
온도: 30 ℃
이성화 반응의 비는, 6-데옥시 D-타가토스: 6-데옥시 D-탈로스 = 2:3이었다. 도 56은 L-리보스 아이소머라제를 작용시킨 후의 반응 혼합물의 HPLC 분석 결과이다.
본 실시예의 6-데옥시 D-타가토스로부터 6-데옥시 D-탈로스의 제조는 화학식 10으로 그 반응을 나타내었다.
(화학식 10)
Figure 112009037347917-PCT00010
6-데옥시 D-타가토스 6-데옥시 D-탈로스
실시예 28
[6-데옥시 L-갈락티톨의 제조]
이 반응은 6-데옥시 L-갈락토스를 환원하여 6-데옥시 L-갈락티톨을 제조하는, 도 3의 번호 63-46의 D 반응이다.
D-푸코스(6-데옥시 D-갈락토스)를 환원하여(D-푸코스 1%, Raney 니켈 촉매 20 ml, 전체 500 ml의 조성물), D-푸시톨(6-데옥시 D-갈락티톨)을 제조하였다. 도 57의 (a)는 환원 전의 D-푸코스, (b)는 환원 후의 6-데옥시 L-갈락티톨의 HPLC 분 석 결과이다. 6-데옥시 L-갈락티톨의 선광도는 +1.7이었다. 6-데옥시 L-갈락티톨의 13C NMR 스펙트럼을 도 58에 나타내었다.
본 실시예의 6-데옥시 L-갈락토스로부터 6-데옥시 L-갈락티톨의 제조는 화학식 11로 그 반응을 나타내었다.
(화학식 11)
Figure 112009037347917-PCT00011
L-푸코스(6-데옥시-L-갈락토스) L-푸시톨(6-데옥시-L-갈락티톨)
실시예 29
[6-데옥시 D-갈락티톨의 제조]
이 반응은 6-데옥시 D-갈락토스를 환원하여 6-데옥시 D-갈락티톨을 제조하는, 도 3의 번호 51-34의 D 반응이다.
L-푸코스(6-데옥시 L-갈락토스)를 환원하여(L-푸코스 1%, Raney 니켈 촉매 20 ml, 총 500 ml의 조성물), L-푸시톨(6-데옥시 L-갈락티톨)을 제조하였다. 도 59의 (a)는 환원 전의 L-푸코스, (b)는 환원 후의 6-데옥시 D-갈락티톨의 HPLC 분석 결과이다. 6-데옥시 L-갈락티톨의 선광도는 -1.7이었다. 6-데옥시 D-갈락티톨 의 13C NMR 스펙트럼을 도 60에 나타내었다.
본 실시예의 6-데옥시 D-갈락토스로부터 6-데옥시 D-갈락티톨의 제조는 화학식 12로 그 반응을 나타내었다.
(화학식 12)
Figure 112009037347917-PCT00012
D-푸코스(6-데옥시-D-갈락토스) D-푸시톨(6-데옥시-D-갈락티톨)
실시예 30
[L-람니톨의 제조]
이 반응은 L-람노스를 수소 첨가법으로 환원하여 L-람니톨을 제조하는, 도 3의 번호 58-41의 D 반응이다.
하기 반응 조건으로 L-람노스(6-데옥시 L-만노스)를 환원하여, L-람니톨(6-데옥시 L-만니톨)을 제조하였다.
(반응 조건)
기질: 5% L-람노스
촉매: 니켈
H2 압: 1.2 MPa
온도: 50 ℃
교반: 700 rpm
시간: 12시간
용량: 500 ml
변환율: 100%
도 61의 (a)는 환원 전의 L-람노스, (b)는 환원 후의 L-람니톨의 HPLC 분석 결과이다. 이와 같이 용이하게 L-람니톨을 생산할 수 있었다.
실시예 31
[L-람니톨의 제조]
이 반응은 1-데옥시 L-프럭토스를 수소 첨가법으로 환원하여 1-데옥시 L-만니톨과 1-데옥시 L-소르비톨을 제조하는, 도 3의 번호 31-32, 31-48의 D 반응이다.
하기 반응 조건으로 1-데옥시 L-프럭토스를 환원하여 1-데옥시 L-만니톨과 1-데옥시 L-소르비톨의 제조를 실시하였다. 통상적인 방법으로 Raney 니켈에 의한 방법에 따라 용이하게 2가지 폴리올을 대략 등량 생산할 수 있었다.
(반응 조건)
기질: 5% 1- 데옥시 L-프럭토스
촉매: 니켈
H2 압: 1.2 MPa
온도: 50 ℃
교반: 700 rpm
시간: 7시간
용량: 500 ml
변환율: 100%
도 62는 환원 후의 1-데옥시 L-만니톨과 1-데옥시 L-소르비톨 혼합물의 HPLC 분석 결과이다. 이와 같이, 용이하게 L-람니톨을 생산할 수 있었다.
실시예 32
[1-데옥시 L-알리톨 및 1-데옥시 L-탈리톨의 제조]
이 반응은 1-데옥시 L-프시코스를 수소 첨가법으로 환원하여 1-데옥시 L-알리톨 및 1-데옥시 L-탈리톨을 제조하는, 도 3의 번호 19-42, 19-20의 D 반응이다.
1-데옥시 L-프럭토스를 에피머화하여 제조한 1-데옥시 L-프시코스를, 하기 반응 조건으로 환원하여, 1-데옥시 L-알리톨과 1-데옥시 L-탈리톨의 제조를 실시하였다. 통상적인 방법으로 Raney 니켈에 의한 방법에 따라 용이하게 2가지 폴리올을 대략 등량 생산할 수 있었다. 도 63은 환원 후의 1-데옥시 L-알리톨과 1-데옥시 L-탈리톨 혼합물의 HPLC 분석 결과이다.
(반응 조건)
기질: 5% 1- 데옥시 L-프시코스
촉매: 니켈
H2 압: 1.2 MPa
온도: 50 ℃
교반: 700 rpm
시간: 8시간
용량: 500 ml
변환율: 100%
2가지 데옥시폴리올을 그대로 기질로 사용하여, 초산균에 의한 산화를 통해 1-데옥시 L-프시코스 및 6-데옥시 D-타가토스로 제조할 수 있었다.
본 발명의 대상은 단당이다. 단당의 공업적 이용에 있어, 각종 식품, 화장품, 의약품 산업에서의 소재로 널리 이용되고 있다. 단당의 연구 개발 현상을 살펴보면, 자연계에 다량으로 존재하는 D-글루코스, D-만노스, D-갈락토스, D-프럭토스 등을 이용하는 것이 대세이다. 이에, 이 분야에서 새로운 발전을 이루기 위해, 아직까지 그 존재량이 낮은 희소당의 생산이 요구되고 있다. 이를 가능하게 하는 방법은 도 4에 나타낸 이즈모링을 전략으로 한 전체 단당의 생산 방법을 확립하는 것이다.
단당은 도 4에 나타낸 바와 같이, 알도스, 케토스 및 폴리올의 총 수가 59이 다. 그 중, 충분한 양으로 생산가능하며, 공업적으로 이용가능한 단당의 수는 한정되어 있다. 단당의 우위성은, 탄소에 결합되어 있는 OH기의 배위가 각각 특유의 구조를 가지고 있어, 키랄 구조를 가지는 의약품 등의 유용한 화합물의 합성 원료로서 매우 중요하다는 것이다. 그 유용성이 이해되어 있지만, 그 생산법이 확립되어 있지 않아 큰 장애가 되고 있다. 유기 화학적으로 키랄 구조를 갖는 것이 우선시되고 있지만, 유기 화학적인 방법으로 특정한 키랄인 구조를 가지는 것을 합성하는 것은 매우 곤란한 관계에 놓여 있다. 즉, 유기 화학적인 의약품 등의 합성에 중요하다는 것은, 유기 화학적인 방법으로는 특정한 키랄 구조를 가지는 단당을 합성하는 것이 매우 곤란함을 의미한다.
이들 단당의 연구개발에서 나타나는 현상을 배경으로, 바이오테크놀러지 방법을 구사한 도 4의 이즈모링 전략에 의해, D-프시코스, D-알로스를 시작으로 한 희소당의 생산이 가능해지고 있다. 지금까지 이용할 수 없었던 단당의 특정한 키랄 구조를, 유기 화학적인 원료로서 이용 가능해지고 있다.
본 발명에서는, 종래의 도 4를 대상으로 한 59종의 단당이 아닌, 새롭게 도 1에 나타낸 탄소수 6의 헥소스의 1 또는 6을 데옥시화한 총 48종의 새로운 당을 대상으로 한다. 도 64에 데옥시이즈모링으로 생산 가능한, 전체 데옥시 당의 리스트를 나타내었다. 1-데옥시케토스가 8종, 6-데옥시케토스가 8종, 6-데옥시알도스가 16종, 1- 및 6-데옥시폴리올이 16종(폴리올의 경우는 도 64에 나타낸 바와 같이, 2가지 이름으로서 표시되지만 180도 회전시키면 겹쳐지는 동일 물질임)인, 총 48종이다. 이들 데옥시 당은 종래의 단당에 비해 더욱 유기 화학적인 방법으로는 합성 이 곤란하였다. 이에, 이것을 데옥시이즈모링 전략을 사용하여, 전부 반응으로 연결시켜 합성할 수 있다.
본 발명의 데옥시이즈모링의 반응을 이하 정리하여 기술한다. 이즈모링 반응과 마찬가지로, 에피머화, 산화 반응, 이성화 반응, 환원 반응을 데옥시이즈모링에서도 채택되는 반응을 실시하며, 각각에 대해 데옥시 당에 관한 결과를 설명한다.
1) 에피머라제 반응
도 4에 나타낸 바와 같이, 케토스의 탄소 3번 위치의 OH기를 에피머화하는 것으로, 새로운 단당을 처음으로 생산가능하게 한 DTE(D-타가토스 3-에피머라제)를 사용함으로써 전체 59종의 정략(政略)을 확립할 수 있었다. 본 발명에서의 최대 과제 중 한가지는, 이 DTE가 1- 또는 6-데옥시케토스에 활성을 가지는지 여부였다. 연구 결과, DTE는 1- 및 6-데옥시케토스 모두에 작용함을 확인하였다. 이는, 본 발명에 중요한 발견이 되었다. 이들의 반응은 도 3에서 번호 2-3, 번호 6-7, 번호 10-11, 번호 14-15, 번호 18-19, 번호 22-23, 번호 26-27 및 번호 30-32의 8가지의 에피머화 반응이다. 이들의 반응에 대해, 모두 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
2) 산화 반응
이즈모링을 링으로서 완성시키며, 전체 단당을 생산하는데에는 폴리올이 큰 역할을 담당한다. 즉, 폴리올을 미생물에 의해 그 2번 위치를 산화하여 케토스를 제조하는 공정이 필수적이다. 본 발명, 즉 데옥시이즈모링에 의한 데옥시 당의 제조에서도, 1- 및 6-데옥시폴리올을 미생물 반응에 의해 산화함으로써, 1- 및 6-데 옥시케토스를 생산하는 것이 필요하다. 이 반응은 미생물 반응이므로, 데옥시폴리올이 미생물의 균체내로 들어가, 거기서 주로 폴리올 탈수소효소에 의해 대응되는 데옥시케토스로 산화 반응이 행해질 필요가 있다. 이러한 과정은 이즈모링과 마찬가지로, 데옥시이즈모링에서도 반응의 진행이 필수적이다. 여러가지를 검토한 결과, 1번 위치가 데옥시화된 폴리올을 기질로 사용하고, 또한 적절한 미생물을 선택하여, 반응 조건을 확립함으로써, 각각 1- 또는 6-데옥시케토스를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 반응은 완전히 새로운 반응이며, 미생물이 1- 및 6-데옥시를 특이적으로 산화하는 경로, 즉 데옥시폴리올을 균체내로 취하여 폴리올 탈수소효소에 의해 2번 또는 5번 위치를 특이적으로 산화함으로써 1- 또는 6-데옥시케토스를 제조하는 경로가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이로써, 데옥시폴리올을 기질로 하여 1- 또는 6-데옥시케토스를 데옥시이즈모링 전략에 따라 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.
3) 이성화 반응
아이소머라제 반응은 알도스의 탄소 1과 탄소 2 사이의 산화 환원 반응이며, 종래의 아이소머라제 반응으로 케토스로부터 각종 알도스를 생산하는 것이 가능하였다. 본 발명에서는, DTE에서 기술한 바와 같이, 아이소머라제가 6번 위치가 데옥시화된 알도스 및 케토스에 작용하는지의 여부가 중요한 과제였다. 본 발명에서는, 여러가지 6-데옥시케토스를 사용한 아이소머라제 반응을 검토한 결과, 이즈모링에서 사용되는 각종 아이소머라제가 데옥시이즈모링에서도 그 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 이로써, 여러가지 6-데옥시알도스를 6-데옥시케토스로부 터 생산할 수 있음을 분명히 할 수 있다.
4) 환원 반응
케토스를 폴리올로 환원하는 반응은, 이즈모링에서 효모를 이용하는 방법 및 수소를 이용한 유기 화학적인 반응을 이용할 수 있다. 공업적인 이용과 확실한 반응으로서는, 현재의 니켈 촉매를 이용하는 수소를 이용한 방법으로 1- 및 6-데옥시케토스로의 환원이 가능하다면 유리하다. 이러한 니켈 촉매를 이용한 환원 반응에 대해 본 발명에서 확인하였다. 종래의 방법에 의한 수소 첨가법에 따라, 1- 및 6-데옥시케토스로부터, 각각에 대응되는 16종의 당 알코올로 환원됨을 확인할 수 있었다. 또한, 6-데옥시알도스의 환원 반응에 대해서도, 마찬가지로 효율적으로 진행되는 것을 확인할 수 있었다.
상기한 결과에서 알 수 있듯이, DTE가 1- 및 6-데옥시케토스에 반응하며, 미생물이 데옥시폴리올을 목적으로 하는 데오키시케토스로 산화할 수 있으며, 아이소머라제가 6-데옥시케토스를 대응하는 활성을 가져 6-데옥시알도스로 이성화할 수 있으며, 환원 반응이 통상의 케토스와 동일하게 1- 및 6-데옥시케토스의 제조에 적용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는, 지금까지 유기 화학적 방법에서는 매우 곤란했던, 1- 및 6-데옥시을 이즈모링의 방법에 따라 생산 가능함을 확인하였음을 명확하게 나타내고 있다. 즉, 이는 많은 키랄 구조를 가진 단당을 데옥시이즈모링라는 새로운 생산 전략에 의해, 지금까지 생산하고 있는, 또한 성질도 완전히 불분명했던 많은 데옥시 당을, 체계적으로 모두 생산할 수 있는 방법을 확립하였음을 나타내고 있다.
본 발명에 의해 수득한 성과는 식품 산업 뿐만 아니라 이와 관련된 식품, 화장품, 의약품 산업에서의 공업적 의의가 매우 크다.

Claims (18)

  1. 케토헥소스의 1- 또는 6-데옥시 화합물에 작용하여 유리의 데옥시 화합물을 당질인 상태로 에피머화함으로써, 3번 위치가 에피머화된 데옥시 화합물을 제조하는 슈도모나스 속에 속하는 세균으로부터 수득되는 데옥시케토헥소스 아이소머라제.
  2. 제1항에 있어서, 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응되는 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 아이소머라제.
  3. 하기의 이화학적 성질을 가지는 슈도모나스 속에 속하는 세균으로부터 수득되는 데옥시케토헥소스 아이소머라제:
    (1) 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스 및 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응되는 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스 및 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조;
    (2) D-케토헥소스 3-에피머라제 활성의 최적 pH 및 pH 안정성은 pH7 - 10에서 최적 pH를 가지며 pH5 - 10에서 안정함;
    (3) D-케토헥소스 3-에피머라제 활성의 최적 온도 및 열안정성은 약 60 ℃에 최적 온도를 가지며, 50 ℃ 이하에서 안정함;
    (4) 자외선 흡수스펙트럼 275 내지 280 nm에서의 흡수대를 나타냄;
    (5) 분자량 41,000 ± 3,000(겔 여과 크로마토그래피에 의해 측정).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 데옥시케토헥소스 아이소머라제가 슈도모나스 시커리(Pseudomonas cichorii) ST-24(FERM BP-2736) 유래의 효소인 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 아이소머라제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 따른 데옥시케토헥소스 아이소머라제를 사용하여, 원료인 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스의 3번 위치를 에피머화함으로써, 목적물인 대응되는 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유도체는 데옥시케토헥소스를 환원한 것이며, 목적물인 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 환원하여 그 유도체인 대응되는 1-데옥시 D-당 알코올, 6-데옥시 D-당 알코올, 1-데옥시 L-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 제조하 는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 유도체는 데옥시케토헥소스를 환원 및 산화한 것이며, 목적물인 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 환원하여 그 유도체인 대응되는 1-데옥시 D-당 알코올, 6-데옥시 D-당 알코올, 1-데옥시 L-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 제조한 다음, 상기 1-데옥시 D-당 알코올, 6-데옥시 D-당 알코올, 1-데옥시 L-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 산화하여 대응되는 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 L-케토헥소스 또는 1-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 유도체는 6-데옥시케토헥소스를 이성화한 것이며, 목적물인 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스에 알도스 아이소머라제를 작용시켜, 그 유도체인 대응되는 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스를 제조하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 유도체가 데옥시케토헥소스를 이성화 및 환원한 것이며, 목적물인 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스에 알도스 아이소머라제를 작용시켜, 그 유도체인 대응되는 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스를 제조한 다음, 상기 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스를 환원하여, 대응되는 6-데옥시 D-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올 제조하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  10. 제5항에 있어서, 효소를 작용시키는 원료인 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스는, 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스에 알도스 아이소머라제를 작용시켜 대응되는 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스로 제조한 것이며, 이어 이를 에피머화하여, 목적물인 대응되는 6-데옥시 D-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  11. 제5항에 있어서, 원료인 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스는, 1-데옥시 D-당 알코올, 6-데옥시 D-당 알코올, 1-데옥시 L-당 알코올 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 산화하여 대응되는 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스로 제조한 것이며, 이어 이를 에피머화하여, 목적물인 대응되는 1-데옥시 D-케토헥소스, 6-데옥시 D-케토헥소스, 1-데옥시 L-케토헥소스 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  12. 제6항, 제7항 또는 제 11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 산화 반응 또는 환원 반응에 폴리올데하이드로게나제를 사용하거나 또는 Raney 니켈 등을 촉매로서 사용하는 수소 첨가법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  13. 제7항 또는 제11항에 있어서, 상기 산화 반응에 탈소수효소 생성능을 가진 엔테로박터 속 균체 IK7(NITE BP-271)를 사용하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  14. 제5항에 있어서, 원료인 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스, 또는 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스는, 6-데옥시 D-알도헥소스 또는 6-데옥시 L-알도헥소스에 알도스 리덕타제를 작용시키거나, 또는 유기 화학적인 환원 반응에 의해, 대응되는 6-데옥시 D-당 알코올, 또는 6-데옥시 L-당 알코올을 제조한 다음, 이를 산화하여 대응되는 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스, 또는 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스로 제조한 것이며, 이어 이를 에피머화하여, 목적물인 대응되는 1- 또는 6-데옥시 D-케토헥소스, 또는 1- 또는 6-데옥시 L-케토헥소스를 제조하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  15. 제9항 또는 제14항에 있어서, 상기 환원 반응에 알도스 리덕타제를 사용하거나, 또는 화학적 환원 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  16. 제8항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 상기 이성화 반응에 L-람노스 아이소머라제 또는 그 외 알도스 아이소머라제를 사용하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  17. 제8항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 상기 이성화 반응에 L-람노스 아이소머라제 또는 그 외 알도스 아이소머라제를 사용하여 6-데옥시 L-프시코스를 6-데옥시 L-알트로스로 이성화하는 것을 특징으로 하는, 데옥시케토헥소스 및 그 유도체의 제조 방법.
  18. 제5항 내지 제17항 중 어느 하나의 방법으로 제조된, 이하의 신규 화합물:
    6-데옥시 D-소르보스,
    6-데옥시 D-타가토스,
    1-데옥시 D-프시코스,
    1-데옥시 D-프럭토스,
    6-데옥시 D-프럭토스,
    6-데옥시 D-프시코스,
    1-데옥시 D-타가토스,
    1-데옥시 D-소르보스,
    6-데옥시 L-프럭토스,
    6-데옥시 L-프시코스,
    1-데옥시 L-타가토스,
    1-데옥시 L-소르보스,
    6-데옥시 L-소르보스,
    6-데옥시 L-타가토스,
    1-데옥시 L-프시코스,
    1-데옥시 L-프럭토스,
    6-데옥시 D-굴로오스,
    6-데옥시 D-이도스,
    6-데옥시 D-갈락토스,
    6-데옥시 D-탈로스,
    6-데옥시 D-만노스,
    6-데옥시 D-글루코스,
    6-데옥시 D-알로스,
    6-데옥시 D-알트로스,
    6-데옥시 L-글루코스,
    6-데옥시 L-알로스,
    6-데옥시 L-알트로스,
    6-데옥시 L-이도스,
    6-데옥시 L-굴로오스,
    6-데옥시 L-탈로스,
    1-데옥시 L-글루시톨 또는 6-데옥시 D-굴리톨,
    6-데옥시 D-이디톨 또는 1-데옥시 D-이디톨,
    6-데옥시 D-갈락티톨 또는 1-데옥시 L-갈락티톨
    6-데옥시 D-탈리톨 또는 1-데옥시 D-알트리톨,
    1-데옥시 D-알리톨 또는 6-데옥시 L-알리톨,
    1-데옥시 D-글루시톨 또는 6-데옥시 L-굴리톨,
    1-데옥시 D-만니톨 또는 6-데옥시 D-만니톨,
    6-데옥시 D-글루시톨 또는 1-데옥시 L-굴리톨,
    6-데옥시 D-알리톨 또는 1-데옥시 L-알리톨,
    6-데옥시 D-알트리톨 또는 1-데옥시 D-탈리톨,
    1-데옥시 D-갈락티톨 또는 6-데옥시 L-갈락티톨,
    1-데옥시 D-굴리톨 또는 6-데옥시 L-글루시톨,
    6-데옥시 L-만니톨 또는 1-데옥시 L-만니톨,
    6-데옥시 L-알트리톨 또는 1-데옥시 L-탈리톨,
    1-데옥시 L-이디톨 또는 6-데옥시 L-이디톨,
    6-데옥시 L-탈리톨 또는1-데옥시 L-알트리톨.
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