JP5358186B2

JP5358186B2 - デオキシケトヘキソース異性化酵素を用いるデオキシヘキソースおよびその誘導体の製造方法

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Publication number: JP5358186B2
Application number: JP2008545402A
Authority: JP
Inventors: 健何森; 雅明徳田; ウィリアムジョンフリートジョージ; 好夫辻阪; 圭竹下; 桂二津崎; 一裕大隈
Original assignee: Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Izumoring Co Ltd
Current assignee: Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Izumoring Co Ltd
Priority date: 2006-11-20
Filing date: 2007-11-20
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2027-11-20
Also published as: EP2161332B1; EP2161332A1; EP2161332A4; WO2008062780A1; JPWO2008062780A1; US20100105885A1; JP2013237696A; KR20090083940A; US8389248B2; KR101556988B1

Description

本発明は、デオキシケトヘキソース異性化酵素を用いるデオキシヘキソースおよびその誘導体の製造方法に関する。

多くの複雑な炭水化物が、たとえば細胞−細胞認識、細胞増殖および細胞分化のような生物学的認識過程において中心的な役割を果たしている（非特許文献１）。それらは、血液型決定基を構成し（非特許文献２）、腫瘍関連抗原を形成する（非特許文献３）。植物界においては、それらはホルモンとして調整機能を発揮し（非特許文献４）、またレクチンに対する結合部位を形成する（非特許文献５）。

たとえばデオキシ- およびフルオロ糖のような修飾糖ならびに天然糖のエピマーは、これらの相互作用へ向けての研究の重要な手段を提供する。蛋白質−炭水化物相互作用の一般的な法則は、特異的な酵素−基質相互作用の場合と全く同様に、この関連での興味の中心である。すなわち、たとえば酵素の活性中心についての情報は、酵素基質の連続的な改変によって得ることができる。さらに、デオキシグリコシドはそれが多くの抗生物質中に存在するという事実からもとくに興味がもたれる（非特許文献６）。

２- デオキシグルコースはガン細胞における解糖およびガン細胞の増殖を阻害することが報告されており、いくつかの動物モデルでは腫瘍増殖を遅延させることも報告されている。また、他のサイトカインおよび抗ガン薬物との組み合わせも研究されている（特許文献１）。このようにデオキシヘキソースは特に代謝や生体信号に対する研究に対しての利用が期待される。

発明者の一人である何森健は、４炭糖、５炭糖、６炭糖についてのイズモリング（Izumoring）連携図を特許文献２で公表しその有用性を示している。すなわち、図４で示される生産過程と分子構造（D型、L型）により、炭素数４から６の単糖全てをつないだ連携図が、イズモリング（Izumoring）の全体図である。すなわち、図４から理解できることは、単糖は、炭素数４、５、６全てがつながっているということである。全体図は、イズモリングＣ６の中でのつながりと、イズモリングＣ５の中でのつながりと、イズモリングＣ４の中でのつながりと、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６が全てつながっていることである。この考え方は重要である。炭素数を減少させるには主に発酵法を用いる。炭素数の異なる単糖全てをつなぐという大きな連携図であることも特徴である。

炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリングは、図４の下段および図５、さらに図８に示すように、炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある。希少糖とは自然界に希にしか存在しない単糖（アルドース、ケトース）およびその誘導体（糖アルコール）と定義づけることができる。この定義は糖の構造や性質による定義ではないため、あいまいである。すなわち、一定量以下の存在量を希少糖というなどの量の定義はなされていないためである。しかし、一般に自然界に多量に存在するアルドースとしてはＤ- グルコース、Ｄ- ガラクトース、Ｄ- マンノース、Ｄ- リボース、Ｄ- キシロース、Ｌ- アラビノースの６種類あり、それ以外のアルドースは希少糖と定義される。ケトースとしては、Ｄ- フラクトースが存在しており、他のケトースは希少糖といえる。他のケトースとして、Ｄ- プシコース、Ｄ- タガトース、Ｄ- ソルボース、Ｌ- フラクトース、Ｌ- プシコース、Ｌ- タガトース、Ｌ- ソルボースが挙げられる。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはＤ- ソルビトールが比較的多いがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖といえる。
これらの糖は、酸化還元酵素の反応、アルドース異性化酵素の反応、アルドース還元酵素の反応で変換できることは、本発明者らの研究を含めた研究で知られている。Ｄ- グルコース（ブドウ糖）やＤ- フラクトースは自然界に多量に存在する糖であり安価であるが、これらから希少糖を合成することができなかった。ところが、新規な酵素が発見された。それはガラクチトールからＤ- タガトースを合成する酵素を持つ菌の培養液中に、全く予期しなかったＤ- ソルボースが発見されたことに端を発する。その原因を調べた結果、この菌がＤ- タガトース３エピメラーゼ（ＤＴＥ）という酵素を産生していることを発見した（特許文献３）。このＤＴＥはこれまでつながらなかったＤ- タガトースとＤ- ソルボースの間をつなぐ酵素であることがわかる。そしてさらに驚くことに、このＤＴＥは全てのケトースの３位をエピ化する酵素であり、これまで合成接続できなかったＤ- フラクトースとＤ- プシコース、Ｌ- ソルボースとＬ- タガトース、Ｄ- タガトースとＤ- ソルボース、Ｌ- プシコースとＬ- フラクトース、に作用するという非常に幅広い基質特異性を有する、すなわち非常に幅広く基質を選択できるというユニークな酵素であることが分かった。このＤＴＥの発見によって、すべての単糖がリング状につながり、単糖の知識の構造化が完成し、イズモリング（Izumoring）と名付けた。
この図５をよく見てみると、左側にＬ型、右側にＤ型、真ん中にＤＬ型があり、しかもリングの中央（星印）を中心としてＬ型とＤ型が点対称になっていることもわかる。例えば、Ｄ- グルコースとＬ- グルコースは、中央の点を基準として点対称になっている。しかもイズモリング（Izumoring）の価値は、全ての単糖の生産の設計図にもなっていることである。先の例で、Ｄ- グルコースを出発点としてＬ- グルコースを生産しようと思えば、Ｄ- グルコースを異性化→エピ化→還元→酸化→エピ化→異性化するとＬ- グルコースが作れることを示している。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリング（Izumoring）を使って、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係が示されている。Ｄ- グルコース、Ｄ- フラクトース、Ｄ- マンノースと、牛乳中の乳糖から生産できるＤ- ガラクトースは、自然界に多く存在し、それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。ＤＴＥの発見によって、Ｄ- グルコースからＤ- フラクトース、Ｄ- プシコースを製造し、さらにＤ- アロース、アリトール、Ｄ- タリトールを製造することができるようになった。希少糖Ｄ- プシコースは、これまで入手自体が困難であったが、自然界に多量に存在する単糖から希少糖を大量生産する方法が開発されつつあり、その技術を利用して製造することができる。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリング（Izumoring）の意義をまとめると、生産過程と分子構造（Ｄ型、Ｌ型）により、すべての単糖が構造的に整理され（知識の構造化）、単糖の全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できること、が挙げられる。

炭素数が５つの単糖（ペントース）のイズモリングは、図４の中段および図６に示すように、炭素数６のイズモリングよりも小さいリングである。しかし、Ｃ６のイズモリングと同じようにアルドース８個、ケトース４個および糖アルコール４個全てを含むことに変わりは無く、全てが酵素反応で結ばれる。異なる点は、酸化還元反応、異性化反応のみでリング状に全てが連結できることである。一方、ＤＴＥを用いることによって、さらに効率のよい生産経路が設計できることがわかる。炭素数５のイズモリングの特徴は、特に図６から明らかなように、炭素数６のイズモリングが点対象に全単糖が配置されているのに対し、左右が対象に配置されていることが大きな特徴である。これら全ペントースは、酵素反応により連結されていることから、炭素数６のイズモリングの場合と全く同様に、すべてのペントースが構造的に整理され（知識の構造化）、全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できる意義を持っている。
炭素数が４つの単糖（テトロース）のイズモリングは、図４の上段および図７に示すように、テトロースの構造上の特性のため、リングが完成しないという特徴がある。炭素数５のイズモリング上部半分の構造を持っている。このリングの場合も、炭素数５，６の場合と同様の酸化還元および異性化反応によって連結されている。ＤＴＥが炭素数４のケトースに反応しないため、ケトース間の反応は現在のところ存在しない。しかし、新規のエピメラーゼの存在が予測され、この研究は現在研究途上である。
全体の配置は、炭素数５と同様に左右対称であり、アルドース４個、ケトース２個および糖アルコール３個全てを含んでいる。すなわち炭素数５，６のイズモリングと同様の意義が存在する。
イズモリングＣ６のＤ- グルコースは、イズモリングＣ５のＤ- アラビトールおよびイズモリングＣ４のエリスリトールとつながっている。この線は、発酵法によってＤ- グルコースからＤ- アラビトールおよびエリスリトールを生産できることを示している。すなわち、イズモリングＣ６，イズモリングＣ５およびイズモリングＣ４は連結されている。この連結は、炭素数の減少という主に発酵法による反応であり、このＤ- アラビトールおよびエリスリトールへの転換反応の二つ以外の発酵法によるイズモリングＣ６とイズモリングＣ５，Ｃ４との連結は可能である。例えばＤ- グルコースからＤ- リボースの生産も可能である。
このように、３つのイズモリングにより全ての炭素数４，５，６の単糖（アルドース、ケトース、糖アルコール）が連結されたことで、それぞれの単糖が全単糖の中でその存在場所を明確に確認できる。最も有名なキシリトールは、未利用資源の木質から生産できるＤ- キシロースを還元することで容易に生産できることを明確に確認できる。
もしも特定の単糖が生物反応によって多量に得られた場合には、それを原料とした新たな単糖への変換の可能性が容易に見いだすことが可能である。すなわち、この全体像から全ての単糖の原料としての位置を確実につかむことができるため、有用な利用法を設計することができる。特に廃棄物や副産物から単糖が得られた場合の利用方法を容易に推定できるのである。

単糖類を還元すると、アルデヒド基およびケトン基はアルコール基となり、炭素原子と同数の多価アルコール、すなわち糖アルコールとなる。還元糖は食品等の分野で有用なものが多く、例えばＬ- アラビノースは、五炭糖で、蔗糖に近い味質を持ち、難吸収性のノンカロリーな糖質である。また蔗糖やマルトースなどの二糖が体内に吸収される際に作用する二糖水解酵素を阻害することが知られており、ダイエット用甘味料や糖尿病患者用甘味料としての利用が期待されている。また、Ｌ- アラビノースは医薬品の合成原料としても有用な糖である。
還元糖を取得する場合、その由来を天然物に求めることが行われている。例えば、Ｌ- アラビノースを取得する手段として、最近では、コーンファイバーやアラビアガム、ビートパルプなどに酵素や酸を作用させるＬ- アラビノースの製造法が開発されている。原料となるアラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等の粗繊維はペクチン質や不要な粗繊維等と混在して存在する場合が多く、これらを酵素分解や酸加水分解処理することによって得られる溶液の中にはＬ- アラビノース等の還元糖の他に、ペクチン質や粗繊維、またこれらの分解物が混在している。Ｌ- アラビノースを精製する方法に関しては、Ｌ- アラビノース含有糖液中のキシロースおよびオリゴ糖と目的のＬ- アラビノースをイオン交換樹脂によるクロマトグラフィーで分画する方法や、多糖、オリゴ糖や塩類との分離を目的としたイオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、膜処理等が提案されている。
一方、単糖のデオキシ体については、有効な製造法および物質として認知されているものが少なく、製造法についての確立が第一に要望されている。

特表２００６- ５１５８８３号公報ＷＯ２００４／０６３３６９号公報特許３３３３９６９号公報 G.E. Edelman, Spektrum Wiss. １９６４(６)，６２ V. Ginsburg, Adv. Enzymol. ３６，(１９７２)，１３１ G.M.W. Cook, E.W. Stoddart,"Surface Carbohydratesof the Eucaryotic Cell", Academic Press, London, １９７３ P. Albersheim, A.G. Darvill, Spektrum Wiss. １９８５(１１), ８６ T.W.Rademacher, R.B. Parekh, R.A. Dwek, Ann. Rev. Biochem., ５７，(１９８８), ７８５ T. Reichstein, E. Weiss, Adv. Carbohydr. Chem. １７, (９１６２〔sic〕), ６５

工業的に単糖のデオキシ体を製造する上で、できるだけ少ない工程で、容易な製造法の確立が強く望まれる。そこで、デオキシ体に対するイズモリングの構築とそれを利用した体系的なデオキシ体の製造法を確立する。
すなわち、本発明は、ケトヘキソースの１- もしくは６- デオキシ体に作用し、遊離のデオキシ体の糖質のままでエピマー化することによって、３位をエピマー化したデオキシ体を生成するデオキシケトヘキソース異性化酵素の提供することを目的とする。
また、本発明は、該酵素を用いて、炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリングに対応するデオキシイズモリング（Deoxyizumoring）を完成させることを目的とする。
さらにまた、本発明は、該デオキシイズモリングに基づくアルドヘキソース、ケトヘキソース、糖アルコールのすべてに対応する１- または６- デオキシ体、ならびに、それらの体系的、具体的かつ経済的な製造法を提供することを目的とする。

本発明者らは、単糖のデオキシ体の製造法の確立に鋭意研究を行ってきた。その中で、シュードモナスチコリＳＴ−２４（ＦＥＲＭＢＰ−２７３６）由来のＤ- タガトース３- エピメラーゼが、６- デオキシヘキソース(例えば６- デオキシＬ- フラクトース)を基質として対応する６- デオキシヘキソース（例えば６- デオキＬ- プシコース）を生成することを発見した。Ｌ- ラムノースイソメラーゼが、従来公知のＬ- ラムノースと６- デオキシＬ- フラクトース間の酵素反応以外にも、６- デオキシＬ- プシコースと６- デオキシＬ- アルトロース間などの他のデオキシ体の単糖のケトースとアルドース間の異性化反応を触媒することを発見した。さらに、還元、酸化反応を組み合わせることにより、単糖の１- または６- デオキシ体および１- または６- デオキシ糖アルコールを製造できることを発見し本発明に至った。また、これによりデオキシ体に相当するイズモリング（Izumoring）であるデオキシイズモリングが完成できた。デオキシヘキソースが連携したのデオキシイズモリングを図１として示す。図１を構成する各デオキシ糖の名称が付されているデオキシイズモリングを図２として示す。そして各デオキシ糖に番号が付されているデオキシイズモリングを図３として示す。図３中の番号とデオキシ糖の名称は以下の通りである。
１６-デオキシＤ-グリトール
２６-デオキシＤ-ソルボース
３６-デオキシＤ-タガトース
４６-デオキシＤ-タリトール
５１-デオキシＤ-アルトリトール
６１-デオキシＤ-プシコース
７１-デオキシＤ-フラクトース
８１-デオキシＤ-マンニトール
９６-デオキシＤ-マンニトール
１０６-デオキシＤ-フラクトース
１１６-デオキシＤ-プシコース
１２６-デオキシＤ-アルトリトール
１３１-デオキシＤ-タリトール
１４１-デオキシＤ-タガトース
１５１-デオキシＤ-ソルボース
１６１-デオキシＤ-グリトール
１７６-デオキシＬ-グルシトール
１８６-デオキシＬ-フラクトース
１９６-デオキシＬ-プシコース
２０６-デオキシＬ-アルトリトール
２１１-デオキシＬ-タリトール
２２１-デオキシＬ-タガトース
２３１-デオキシＬ-ソルボース
２４１-デオキシＬ-イジトール
２５６-デオキシＬ-イジトール
２６６-デオキシＬ-ソルボース
２７６-デオキシＬ-タガトース
２８６-デオキシＬ-タリトール
２９１-デオキシＬ-アルトリトール
３０１-デオキシＬ-プシコース
３１１-デオキシＬ-フラクトース
３２１-デオキシＬ-グルシトール
３３６-デオキシＤ-イジトール
３４６-デオキシＤ-ガラクチトール
３５１-デオキシＤ-アリトール
３６１-デオキシＤ-グルシトール
３７６-デオキシＤ-グルシトール
３８６-デオキシＤ-アリトール
３９１-デオキシＤ-ガラクチトール
４０１-デオキシＤ-イジトール
４１６-デオキシＬ-マンニトール
４２６-デオキシＬ-アリトール
４３１-デオキシＬ-ガラクチトール
４４１-デオキシＬ-グリトール
４５６-デオキシＬ-グリトール
４６６-デオキシＬ-ガラクチトール
４７１-デオキシＬ-アリトール
４８１-デオキシＬ-マンニトール
４９６-デオキシＤ-グロース
５０６-デオキシＤ-イドース
５１６-デオキシＤ-ガラクトース
５２６-デオキシＤ-タロース
５３６-デオキシＤ-マンノース
５４６-デオキシＤ-グルコース
５５６-デオキシＤ-アロース
５６６-デオキシＤ-アルトロース
５７６-デオキシＬ-グルコース
５８６-デオキシＬ-マンノース
５９６-デオキシＬ-アロース
６０６-デオキシＬ-アルトロース
６１６-デオキシＬ-イドース
６２６-デオキシＬ-グロース
６３６-デオキシＬ-ガラクトース
６４６-デオキシＬ-タロース

本発明は、以下の（１）〜（１５）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法を要旨とする。
〈ケトース間〉
（１）ケトヘキソースの１- もしくは６- デオキシ体に作用し、遊離のデオキシ体の糖質のままでエピマー化することによって、３位をエピマー化したデオキシ体を生成するシュードモナスチコリＳＴ−２４（ＦＥＲＭＢＰ−２７３６）から得ることのできるデオキシケトヘキソース異性化酵素を用い、原料である１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースの３位をエピマー化し、目的物である、対応する１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造することを特徴とするデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
（２）デオキシケトヘキソース異性化酵素が、１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応する１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを生成する、（１）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
（３）デオキシケトヘキソース異性化酵素が、下記の理化学的性質を有する、（１）または（２）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
記
１）１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソース、および１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応する１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソースおよび１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースを生成する。
２）Ｄ- ケトヘキソース３- エピメラーゼ活性の至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
３）Ｄ- ケトヘキソース３- エピメラーゼ活性の至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
４）紫外線吸収スペクトル２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。
５）分子量４１，０００±３，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）。
〈ケトース→還元→糖アルコール〉
（４）上記誘導体がデオキシケトヘキソースを還元したものであり、目的物である、１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを還元し、その誘導体である、対応する１- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは１- デオキシＬ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコールを製造する（１）、（２）または（３）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
〈ケトース→還元→糖アルコール→酸化→ケトース〉
（５）上記誘導体がデオキシケトヘキソースを還元し、さらに酸化したものであり、目的物である、１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを還元し、その誘導体である、対応する１- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは１- デオキシＬ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコールを製造し、さらにその１- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは１- デオキシＬ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコールを酸化し、対応する６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造する（１）、（２）または（３）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
〈ケトース→アルドース「6デオキシしか存在しない」〉
（６）上記誘導体が６- デオキシケトヘキソースを異性化したもので、目的物である、６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースに、アルドースイソメラーゼを作用させて、その誘導体である、対応する６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースを製造する（１）、（２）または（３）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
〈ケトース→アルドース→糖アルコール〉
（７）上記誘導体がデオキシケトヘキソースを異性化し、さらに還元したものであり、目的物である、６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースに、アルドースイソメラーゼを作用させ、その誘導体である、対応する６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースを製造し、さらにその６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースに、アルドースレダクターゼを作用させて、対応する６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコール製造する（１）、（２）または（３）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
〈アルドース→異性化→ケトース→エピ化→ケトース〉
（８）酵素を作用させる原料である６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースが、６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースにアルドースイソメラーゼを作用させ、対応する６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造したものであり、次いでそれをエピマー化して、目的物である、対応する６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造する（１）、（２）または（３）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
〈糖アルコール→酸化→ケトース→エピ化→ケトース〉
（９）原料である１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースが、１- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは１- デオキシＬ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコールを酸化し、対応する１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造したものであり、次いでそれをエピマー化して、目的物である、対応する１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造する（１）、（２）または（３）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
（１０）上記の酸化反応または還元反応に、ポリオールデヒドロゲナーゼを用いる、またはラネーニッケル等を触媒として用いる水素添加法を用いる（４）、（５）または（９）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
（１１）上記の酸化反応に、脱水素酵素生成能を有するエンテロバクター属菌体ＩＫ７（NITE BP-271）を用いる（５）または（９）の方法。
〈アルドース→還元→糖アルコール→酸化→ケトース→エピ化→ケトース〉
（１２）原料である１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソース、または１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースが、６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースにアルドースレダクターゼを作用させるか、あるいは有機化学的な還元反応により、対応する６- デオキシＤ- 糖アルコール、または６- デオキシＬ- 糖アルコールを製造し、次いでこれを酸化し、対応する１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソース、または１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造したものであり、次いでそれをエピマー化して、目的物である、対応する１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソース、または１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造する（１）、（２）または（３）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
（１３）上記の還元反応に、アルドースレダクターゼを用いる、または化学的還元方法を用いる（７）または（１２）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
（１４）上記の異性化反応に、Ｌ- ラムノースイソメラーゼを用いる（６）、（７）または（８）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
（１５）上記の異性化反応に、Ｌ- ラムノースイソメラーゼを用い、６- デオキシＬ- プシコースを６- デオキシＬ- アルトロースに異性化する（６）、（７）または（８）のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。

本発明により、遊離のケトヘキソースの１- もしくは６- デオキシ体に作用するデオキシケトヘキソース異性化酵素、それを用いる１- または６- デオキシ体の製造方法、並びに、生産された１- または６- デオキシ体を提供することができる。

また、自然界に希にしか存在しない単糖およびその誘導体（アルドース、ケトースおよび糖アルコール）である希少糖について、炭素数が６つの単糖およびその誘導体（ヘキソース）のイズモリング（Izumoring）は、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係、それを得るための出発原料および経路が体系的に示されているが、本発明により、該イズモリングを、炭素数６の単糖およびその誘導体（アルドース、ケトース、糖アルコール）に対応する１- または６- デオキシ体で連結された、デオキシイズモリング（Deoxy-Izumoring）に展開させることができる。
デオキシイズモリングにより、炭素数６の単糖およびその誘導体（アルドース、ケトース、糖アルコール）に対応する１または６デオキシ体、すなわち、デオキシ希少糖（デオキシケトヘキソース、デオキシアルドヘキソース）およびその誘導体であるデオキシ糖アルコール）が酵素的酸化または、酵素的或いは化学的還元、異性化の関係がわかる形で連結されたことで、効率的な生産が可能となる。

デオキシヘキソースが連携したのデオキシイズモリングを示す。デオキシ糖名が付されているデオキシイズモリングを示す。デオキシ糖に番号が付されているデオキシイズモリングを示す。、４糖、５糖、６糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。６糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。５糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。４糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。構造式とセットのイズモリングＣ６の説明図を示す。Ｌ- ラムノースと６- デオキシＬ- フラクトースの平衡比を示した。Ｌ- ラムノースと６- デオキシＬ- フラクトース溶液のHPLC分析結果を示した。Ｌ- ラムノースと６- デオキシＬ- フラクトースと６- デオキシＬ- プシコースの平衡比を示した。Ｌ- ラムノースと６- デオキシＬ- フラクトースと６- デオキシＬ- プシコースの溶液のHPLC分析結果を示した。Ｌ- ラムノースと６- デオキシＬ- フラクトースと６- デオキシＬ- プシコースの各タンクの溶液をHPLC分析した結果を示した。６- デオキシＬ- プシコースと６- デオキシＬ- アルトロースの溶液のHPLC分析結果を示した。生産物である１- デオキシＤ- プシコースの構造を化学合成した１- デオキシD=プシコースと１３C NMRを測定し、比較した結果を示した。生産物である１- デオキシＤ- プシコースの構造を化学合成した１- デオキシD=プシコースとプロトンNMRを測定し、比較した結果を示した。上が化学合成したもの、下が本実験で生産したものである。化学合成した１- デオキシＬ- フラクトースと生産物とをNMRスペクトルを測定して比較した結果を示す。上は１- デオキシＤ- プシコースの^１３C NMRであり、下が本実験で生産した１- デオキシＬ- フラクトースの^１３C NMR である。化学合成した１- デオキシＬ- フラクトースと生産物とをNMRスペクトルを測定して比較した結果を示す。上は１- デオキシＤ- プシコースのプロトンNMRであり、下が本実験で生産した１- デオキシＬ- フラクトースのプロトン NMR である。実施例１０で生産した１- デオキシＤ- タガトースのHPLC分析結果を示した。実施例１０で生産した１- デオキシＤ- タガトースの^１３C NMR である。実施例１０で生産した６- デオキシＤ- タガトースのHPLC分析結果を示した。実施例１０で生産した６- デオキシＤ- タガトースの^１３C NMR である。Ｌ-ラムノースからＬ-ラムノースイソメラーゼおよびＤ- タガトース３- エピメラーゼを用いて６- デオキシＬ- プシコースを生産する反応を示した。６- デオキシＬ- プシコースの１-デオキシＤ-アリトールと、１-デオキシＤ-タリトールへの化学的還元反応を示した。デオキシＤ-アリトールの６- デオキシＬ- プシコースへの生物化学的反応を示した。６- デオキシＬ- プシコースの１-デオキシＤ-アリトールと、１-デオキシＤ-タリトールへの化学的還元反応の時間経過とHPLCクロマトグラフ分析結果を示した。デオキシＤ-アリトールの６- デオキシＬ- プシコースへの生物化学的反応の時間経過とHPLCクロマトグラフ分析結果を示した。実施例１０で生産した６- デオキシＬ- プシコースの結晶を写した図面に変わる写真である。化学合成した６- デオキシＬ- プシコースと実施例１１の生産物とをNMRスペクトルを測定して比較した結果を示す。左は６- デオキシＬ- プシコースの^１３C NMRであり、右が実施例１１で生産した６- デオキシＬ- プシコースの^１３C NMR である。精製された６-デオキシＬ-フラクトースのHPLC分析結果を示した。化学合成した６-デオキシＬ-フラクトース（標準）と生産された６-デオキシＬ-フラクトースのNMRスペクトルを測定して比較した結果を示す。上は標準の^１３C NMRであり、下が本実験で生産した６-デオキシＬ-フラクトースの^１３C NMR である。生産された１-デオキシＬ-プシコースの^１３C NMRスペクトルを示した。Ｌ-ラムノースおよび６-デオキシＬ-マンニトールの^１３C NMRスペクトルを示した。６-デオキシＬ-マンニトール、１-デオキシＬ-フラクトースおよび分離された生産物の^１３C NMRスペクトルを示した。１-デオキシＬ-フラクトース、１-デオキシＬ-プシコースおよび分離された生産物の^１３C NMRスペクトルを示した。Ｌ-ラムノースから６-デオキシＬ-マンニトールおよび１-デオキシＬ-フラクトースを経由して１-デオキシＬ-プシコースを製造する過程を化学反応式で示した。実施例１４の反応混合物である６- デオキシＬ−タガトースと６- デオキシＬ−ソルボースの溶液のHPLC分析結果を示した。実施例１４で生産した６- デオキシＬ- ソルボースのHPLC分析結果を示した。実施例１５の反応混合物である６- デオキシＤ−タガトースと６- デオキシＤ- ソルボースの溶液のHPLC分析結果を示した。実施例１６の反応混合物から分離した１- デオキシＬ- フラクトース（a）および１- デオキシＬ- プシコース（b）のHPLC分析結果を示した。実施例１６で分離した１- デオキシＬ- プシコースの^１３C NMRスペクトルを示した。実施例１７の（a）は反応前の６- デオキシＤ- プシコース、（b）は反応後のＨＰＬＣによる分析結果を示した。実施例１８の（a）は反応前の６- デオキシＬ- タガトース、（b）は反応後のＨＰＬＣによる分析結果を示した。実施例１９の（a）は反応後の反応混合物、（b）は生成した１- デオキシＤ- タガトースのＨＰＬＣ分析の結果を示した。実施例１９で生成した１- デオキシＤ- タガトースの^１３C NMRスペクトルを示した。実施例２０で１- デオキシＬ- タガトースが生産されている途中のＨＰＬＣ分析の結果を示した。実施例２１の（a）は反応後の反応混合物、（b）は分離精製した１- デオキシＤ- タガトースのＨＰＬＣ分析の結果を示した。実施例２１で生成した１- デオキシＤ- タガトースの^１３C NMRスペクトルを示した。実施例２２の（a）はＬ- ラムニトール、（b）は分離精製した１- デオキシＬ- フラクトースのＨＰＬＣ分析の結果を示した。実施例２２で生成した１- デオキシＬ- フラクトースの１３C NMRスペクトルを示した。実施例２３の（ａ）反応前の１- デオキシＬ- アリトールおよび１- デオキシＬ- タリトール混合物、（ｂ）反応後の６- デオキシＤ- プシコースおよび６- デオキシＬ- タガトースの反応混合物、（ｃ）分離精製した６- デオキシＤ- プシコース、（ｄ）分離精製した６- デオキシＬ- タガトースのＨＰＬＣ分析結果を示した。実施例２４の（a）は反応後の反応混合物、（b）は分離精製した６- デオキシＬ- タガトースのＨＰＬＣ分析の結果を示した。実施例２４で生成した６- デオキシＬ- タガトースの１３C NMRスペクトルを示した。実施例２５の（a）は反応後の反応混合物、（b）は分離精製した６- デオキシＤ- タロースのＨＰＬＣ分析の結果、（Ｃ）は分離精製した６- デオキシＤ- タロースの^１３C NMRスペクトルを示した。実施例２６の（ａ）は基質として用いた６- デオキシＤ- プシコース、（ｂ）は反応後の反応混合物のＨＰＬＣ分析の結果を示した。実施例２７は６- デオキシＤ- タガトースにＬ−リボースイソメラーゼを作用した後の６- デオキシＤ- タガトースと６- デオキシＤ- タロースの混合物のＨＰＬＣ分析結果である。実施例２８の（ａ）は還元前のＤ−フコース、（ｂ）は還元後の６- デオキシＬ- ガラクチトールのＨＰＬＣ分析結果を示した。実施例２９で生成した６- デオキシＬ- ガラクチトールの１３C NMRスペクトルを示した。実施例２９の（ａ）は還元前のＬ−フコース、（ｂ）は還元後の６- デオキシＤ- ガラクチトールのＨＰＬＣ分析結果を示した。実施例２９で生成した６- デオキシＤ- ガラクチトールの^１３C NMRスペクトルを示した。実施例３０の（ａ）は還元前のＬ- ラムノース、（ｂ）は還元後のＬ- ラムニトールのＨＰＬＣ分析結果を示した。実施例３１の還元後の１- デオキシＬ- マンニトールと１- デオキシＬ- ソルビトール混合物のＨＰＬＣ分析結果を示した。実施例３２の還元後の１- デオキシＬ- アリトールと１- デオキシＬ- タリトール混合物のＨＰＬＣ分析結果である。図１〜３に示されるデオキシイズモリングで生産可能な、全デオキシ糖（１デオキシケトースが８種、６デオキシケトースが８種、６デオキシアルドースが１６種、１および６デオキシポリオールが１６種）のリストを示した。

本発明者らは、デオキシケトヘキソース間を、遊離のデオキシ体の糖質のままで容易にエピマー化しうるエピメラーゼの検索を鋭意続けてきた。その結果、従来知られているＤ- ケトヘキソース３- エピメラーゼであるＤ- タガトース３- エピメラーゼ（特許第３３３３９６９号）が、ケトヘキソースのみならず、対応するケトヘキソースの１- もしくは６- デオキシ体にも作用し、３位をエピマー化したデオキシ体を得ることができることを発見し、該酵素を利用したＤ- またはＬ- デオキシケトヘキソースの変換方法並びに変換されたＤ- またはＬ- デオキシケトースの製造方法を確立した。

なお、エピメラーゼは、エンザイムノメンクレイチャー（ＥｎｚｙｍｅＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（アメリカ合衆国、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９２年）によると、各種の糖質に作用することが知られている。しかしながら、これまでに知られているエピメラーゼは、例えば、リブロースリン酸塩３- エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．１）やＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．２）などのように主としてリン酸化された糖質やＵＤＰなどと結合した糖質に作用するものであり、遊離の中性の糖質を製造する工業用途には、使えないものであった。
一方、遊離の糖質に作用するエピメラーゼについては、アルドースに作用する二例、アルドース１- エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．３）およびセロピオースエピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．１１）または、ケトースに作用するＤ- ケトヘキソース３- エピメラーゼが知られているのみである。アルドース１- エピメラーゼは、アルドースの１位のα、βアノマー間のエピマー化を触媒し、セロビオースエピメラーゼは、同様に、セロビオースのα、βアノマー間を触媒する酵素である。また、Ｄ- ケトヘキソース３- エピメラーゼはケトヘキソースの3位を触媒する酵素であるが、デオキシ体に作用するかどうかは知られていなかった。
また、本発明記載の公知であるＬ- ラムノースイソメラーゼが、６- デオキシＬ- プシコースから６- デオキシＬ- アルトロース間を触媒する反応については知られていなかった。さらに、本発明記載の公知である脱水素酵素生成能を有するエンテロバクターに属する微生物を用いる酸化により、１- デオキシＬ- マンニトールから１- デオキシＬ- フラクトースを生成する反応および１- デオキシＤ- アリトールから１- デオキシＤ- プシコースを生成する反応などについては知られていなかった。

すなわち、本酵素（シュードモナス属に属する細菌から得ることのできるデオキシケトヘキソース異性化酵素、Ｄ- ケトヘキソース３- エピメラーゼ）は、以下の化合物間の反応を触媒することを発見した。
（ｉ）６- デオキシＬ- フラクトースの６- デオキシＬ- プシコースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
（ii）１- デオキシＬ- タガトースの１- デオキシＬ- ソルボースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
（iii）６- デオキシＬ- ソルボースの６- デオキシＬ- タガトースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
（iv）１- デオキシＬ- プシコースの１- デオキシＬ- フラクトースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
（ｖ）６- デオキシＤ- ソルボースの６- デオキシＤ- タガトースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
（vi）１- デオキシＤ- プシコースの１- デオキシＤ- フラクトースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
（vii）６- デオキシＤ- フラクトースの６- デオキシＤ- プシコースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
（viii）１- デオキシＤ- タガトースの１- デオキシＤ- ソルボースへのエピマー化反応もしくはその逆反応。

また、アルドースイソメラーゼを用いることによって、本発明で生成したＤ- またはＬ- デオキシケトヘキソースとＤ- またはＬ- デオキシアルドヘキソース間を、遊離のデオキシ体の糖質のままで容易に異性化することができる。
よって、本発明は、製造したデオキシケトヘキソースを対応するデオキシアルドースに変換もしくは、デオキシアルドースをデオキシケトヘキソースに変換する製造方法を確立した。
本酵素（アルドースイソメラーゼ）は、以下の化合物間の反応を触媒する。
（a）６- デオキシＬ- グルコースの６- デオキシＬ- フラクトースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（b）６- デオキシＬ- マンノースの６- デオキシＬ- フラクトースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（c）６- デオキシＬ- アロースの６- デオキシＬ- プシコースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（d）６- デオキシＬ- アルトロースの６- デオキシＬ- プシコースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（e）６- デオキシＬ- イドースの６- デオキシＬ- ソルボースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（f）６- デオキシＬ- グロースの６- デオキシＬ- ソルボースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（g）６- デオキシＬ- ガラクトースの６- デオキシＬ- タガトースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（h）６- デオキシＬ- タロースの６- デオキシＬ- タガトースへの異性化反応もしくはその逆反応。
（i）６- デオキシＤ- グルコースの６- デオキシＤ- フラクトースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（j）６- デオキシＤ- マンノースの６- デオキシＤ- フラクトースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（k）６- デオキシＤ- アロースの６- デオキシＤ- プシコースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（l）６- デオキシＤ- アルトロースの６- デオキシＤ- プシコースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（m）６- デオキシＤ- イドースの６- デオキシＤ- ソルボースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（n）６- デオキシＤ- グロースの６- デオキシＤ- ソルボースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（o）６- デオキシＤ- ガラクトースの６- デオキシＤ- タガトースへの異性化反応もしくはその逆反応、
（p）６- デオキシＤ- タロースの６- デオキシＤ- タガトースへの異性化反応もしくはその逆反応。

また、ポリオールデヒドロゲナーゼを用いることによって、デオキシケトヘキソースとデオキシ糖アルコール間を、遊離のデオキシ体の糖質のままで容易に還元もしくは酸化できる。
よって、本発明は、製造したデオキシケトヘキソースを対応するデオキシ糖アルコールに変換もしくは、デオキシ糖アルコールをデオキシケトースに変換する製造方法を確立した。また、デオキシケトヘキソースからデオキシ糖アルコールの還元反応は化学的還元法によっても実施できる。
本酵素（ポリオールデヒドロゲナーゼ）は、以下の化合物間の反応を触媒する。
（ア）６- デオキシＬ- グルシトールの６- デオキシＬ- フラクトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（イ）６- デオキシＬ- マンニトールの６- デオキシＬ- フラクトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ウ）６- デオキシ Lアリトールの６- デオキシＬ- プシコースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（エ）６- デオキシＬ- アリトリトールの６- デオキシＬ- プシコースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（オ）１- デオキシＬ- タリトールの１- デオキシＬ- タガトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（カ）１- デオキシ Lガラクチトールの１- デオキシＬ- タガトースへの還元反応もしくはその逆の酸化反応、
（キ）１- デオキシ Lグリトールの１- デオキシＬ- ソルボースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ク）１- デオキシＬ- イジトールの１- デオキシＬ- ソルボースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応。
（ケ）６- デオキシＬ- イジトールの６- デオキシＬ- ソルボースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応。
（コ）６- デオキシ L- グリトールの６- デオキシＬ- ソルボースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（サ）６- デオキシ Lガラクチトールの６- デオキシＬ- タガトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（シ）６- デオキシＬ- タリトールの６- デオキシＬ- タガトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ス）1- デオキシＬ- アリトリトールの1- デオキシＬ- プシコースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（セ）1- デオキシ L- アリトールの１- デオキシＬ- プシコースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ソ）１- デオキシＬ- マンニトールの１- デオキシＬ- フラクトースへの還元反応もしくはその逆の酸化反応、
（タ）１- デオキシＬ- グルシトールの１- デオキシＬ- フラクトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応。
（チ）６- デオキシＤ- グリトールの６- デオキシＤ- ソルボースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ツ）６- デオキシＤ- イジトールの６- デオキシＤ- ソルボースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（テ）６- デオキシＤ- ガラクチトールの６- デオキシＤ- タガトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ト）６- デオキシＤ- タリトールの６- デオキシＤ- タガトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ナ）１- デオキシＤ- アリトリトールの１- デオキシＤ- プシコースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ニ）１- デオキシＤ- グルシトールの１- デオキシＤ- フラクトースへの還元反応もしくはその逆の酸化反応、
（ヌ）１- デオキシＤ- マンニトールの１- デオキシＤ- フラクトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ネ）６- デオキシＤ- マンニトールの６- デオキシＤ- フラクトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ノ）６- デオキシＤ−グルシトールの６- デオキシＤ- フラクトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ハ）６- デオキシＤ- アリトールの６- デオキシＤ- プシコースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ヒ）６- デオキシＤ- アルトリトールの６- デオキシＤ- プシコースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（フ）１- デオキシＤ- タリトールの１- デオキシＤ- タガトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ヘ）１- デオキシＤ- ガラクチトールの１- デオキシＤ- タガトースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応、
（ホ）１- デオキシＤ- イジトールの１- デオキシＤ- ソルボースへの還元反応もしくはその逆の酸化反応、
（マ）１- デオキシＤ- グリトールの１- デオキシＤ- ソルボースへの酸化反応もしくはその逆の還元反応。

また、アルドースレダクターゼもしくは、化学的還元反応を用いることによって、デオキシアルドヘキソースをデオキシ糖アルコールに、遊離のデオキシ体の糖質のままで容易に還元できる。
よって、本発明は、製造したデオキシアルドヘキソースを対応するデオキシ糖アルコールに変換する製造方法を確立した。
本酵素(アルドースレダクターゼ)もしくは化学的還元法は、以下の化合物間の反応を触媒する。
(あ)６- デオキシＬ- グルコースの６- デオキシＬ- グルシトールへの還元反応、
(い)６- デオキシＬ- マンノースの６- デオキシＬ- マンニトールへの還元反応、
(う)６- デオキシＬ- アロースの６- デオキシＬ- アリトールへの還元反応、
(え)６- デオキシＬ- アルトロースの６- デオキシＬ- アルトリトールへの還元反応、
(お)６- デオキシＬ- イドースの６- デオキシＬ- イジトールへの還元反応、
(か)６- デオキシＬ- グロースの６- デオキシＬ- グリトールへの還元反応、
(き)６- デオキシＬ- ガラクトースの６- デオキシＬ- ガラクチトールへの還元反応、
(く)６- デオキシＬ- タロースの６- デオキシＬ- タリトールへの還元反応。
(け)６- デオキシＤ- アルトロースの６- デオキシＤ- アルトリトールへの還元反応、
(こ)６- デオキシＤ- アロースの６- デオキシＤ- アリトールへの還元反応、
(さ)６- デオキシＤ- グルコースの６- デオキシＤ- グルシトールへの還元反応、
(し)６- デオキシＤ- マンノースの６- デオキシＤ- マンニトールへの還元反応、
(す)６- デオキシＤ- タロースの６- デオキシＤ- タリトールへの還元反応、
(せ)６- デオキシＤ- ガラクトースの６- デオキシＤ- ガラクチトールへの還元反応、
(そ)６- デオキシＤ- イドースの６- デオキシＤ- イジトールへの還元反応、
(た)６- デオキシＤ- グロースの６- デオキシＤ- グリトールへの還元反応。

本発明は、上記いずれの１- または６- Ｄ- デオキシヘキソース、または１- または６- Ｌ- デオキシヘキソースを原料として、上記4酵素および化学的還元法を組み合わせて用いることによって、いずれの１- または６- Ｄ- デオキシヘキソース、または１- または６- Ｌ- デオキシヘキソースを製造する製造方法を確立し、提供する。

本発明のデオキシヘキソースの製造方法は、Ｄ- ケトヘキソース３- エピメラーゼが、デオキシケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応するデオキシケトヘキソースを生成する活性を有することを新たに発見し、アルドースイソメラーゼ、ポリオールデヒドロゲナーゼ、アルドースレダクターゼ、化学的還元法を系統立てて用いることにより全てのデオキシヘキソースを製造できる手段を提供する。
用いるＤ- ケトース３- エピメラーゼは、Ｄ- デオキシケトヘキソースの３位をエピマー化するものが選ばれるが、特許３３３３９６９号に記載のものが、反応活性が高く好ましい。また、アルドースイソメラーゼは、デオキシケトヘキソースとデオキシアルドヘキソース間の異性化を触媒する酵素であれば良いが、WO2004／063369号記載のＬ- ラムノースイソメラーゼが特に好ましい。また、デオキシケトヘキソースおよびデオキシアルドヘキソースの還元反応は、ラネーニッケル等を触媒とする接触還元、アルドースレダクターゼ、ポリオールデヒドロゲナーゼなどにより実施することができる。また糖アルコールの酸化は、ポリオールデヒドロゲナーゼなどにより実施することができる。

本発明に用いられるＤ- タガトース３- エピメラーゼの主な理化学的性質は、特許第３３３３９６９号明細書に記載されているが、デオキシ体に対する性質を下記に示す。
（１）作用および基質特異性Ｄ- またはＬ- または、１- または６- デオキシケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応するＤ- またはＬ- または、１- または６- デオキシケトヘキソースを生成する。
（２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
（３）至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。

本発明のＤ- タガトース３- エピメラーゼすなわちＤ- ケトヘキソース３- エピメラーゼは、通常、特許第３３３３９６９号明細書で開示されている方法でシュードモナスチコリＳＴ−２４（ＦＥＲＭＢＰ−２７３６）およびその変異種などを用いることにより生産できる。

すなわちシュードモナスチコリＳＴ−２４（ＦＥＲＭＢＰ−２７３６）を、常法に従って、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなどを含有する栄養培地に１〜５日間程度培養、望ましくは、液体培地に通気撹拌などにより好気的条件下で培養し、得られる菌体または培養液上清などの培養物からＤ- タガトース３- エピメラーゼを抽出する。通常、培養物を粗Ｄ- ケトヘキソース３- エピメラーゼとして利用することができる。必要ならば、培養物を濾過、遠心分離、塩析、透析、濃縮、凍結乾燥など公知の方法で部分精製して利用することができる。さらにイオン交換体への吸着溶出、ゲル濾過、等電点分画、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体への吸着溶出などを組合せて高度に精製したものも利用することも可能である。このようにして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に、単一にバンドを示すまで精製したＤ- タガトース３エピメラーゼは、Ｄ- ケトヘキソースの３位のＯＨ基をエピマー化する。また、驚くことに、本酵素は、１- または６- Ｄ- デオキシヘキソース、または１- または６- Ｌ- デオキシヘキソースに対しても、エピメラーゼ活性を示すことがわかった。

また、本発明の変換反応、すなわち、Ｄ- またはＬ- デオキシケトヘキソースから選ばれる１種以上のケトースから、該ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ- またはＬ- デオキシケトヘキソースなどを生成する変換反応において、本発明のＤ- デオキシケトヘキソース３- エピメラーゼを公知の方法により固定化して、反応に繰り返し利用することも、連続反応に利用することも有利に実施できる。

この変換反応は、通常、次の条件で行なわれる。基質濃度は１〜６０ｗ／ｖ％、望ましくは約５〜５０ｗ／ｖ％、反応温度は１０〜７０℃、望ましくは約３０〜６０℃、反応ｐＨは５〜１０、望ましくは約７〜１０、酵素活性は基質グラム当り１単位以上、望ましくは、５０〜５，０００単位の範囲から選ばれる。反応時間は、適宜選択できるが、経済性との関係で、バッチ反応の場合には、通常、５〜５０時間の範囲が選ばれる。
なお上記の酵素活性単位は、タガトース３- エピメラーゼ活性に対する酵素単位とし、次のようにして測定される。
すなわち、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００ μｌ、４０ｍＭＤ- タガトースを５０μｌおよび酵素液５０ μｌ含む溶液（または懸濁液）を３０ ℃で６０分間インキュベートし、生成物であるＤ- ソルボースをＨＰＬＣにより測定した。酵素活性１単位は１分間に１μｍｏｌのＤ- タガトースをエピマー化し、Ｄ- ソルボースを生成する酵素量とした。

このようにして変換させた反応溶液は、原料のデオキシケトースと新たに生成したデオキシケトース（原料のエピマー）とを含有しており、必要ならば、この濃縮液を、例えば、アルカリ金属型またはアルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、新たに生成したデオキシケトースと原料デオキシケトースとを分離精製し、新たに生成したデオキシケトース高含有画分を濃縮し、シラップ状製品を得ることができる。また、結晶化が可能である場合には、晶出させて結晶状製品を得ることも有利に実施できる。また、この分離された原料のデオキシケトースを、再度、変換反応の原料に用いることもできる。

本発明で使用する異性化を触媒する酵素、１- または６- デオキシケトヘキソースと１- または６- デオキシアルドヘキソース間の異性化反応を触媒するアルドースイソメラーゼの種類は特に限定されないが、WO2004/063369または特許公開２００６- １５３５９１号記載のＬ- ラムノースイソメラーゼを好ましいものとして例示される。
WO2004/063369記載のＬ−ラムノースイソメラーゼは、「Pseudomonas stutzeri LL172」の培養液から得られるＬ−ラムノースから6−デオキシＬ−フラクトースへの異性化反応、ならびに、6−デオキシＬ−フラクトースからＬ−ラムノースへの異性化を触媒する酵素として知られる異性化酵素である。なお、菌株 Pseudomonas stutzeri LL172 は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に２００４年１月６日に国際寄託している（IPOD FERM BP-08593）
本酵素の性質は、以下の通りである。
（イ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
作用ｐＨは７．０〜１０．０であり、至適ｐＨは９．０である。
（ロ）ｐＨ安定性
種々のｐＨで４℃、１時間保持した場合、ｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定である。
（ハ）作用温度および至適温度
作用温度は４０〜６５℃であり、至適温度は６０℃である。
（ニ）温度安定性
４０℃、１０分では安定しており、５０℃、１０分でも９０％以上残存している。
（ホ）キレート剤の影響
キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを活性測定時に共存させても、ほとんど活性は阻害されない。
（ヘ）金属イオンの影響
１ｍＭのコバルトイオンにより約３０％阻害される。
（ト）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量
約４３，０００である。

本発明に使われるポリオールデヒドロゲナーゼ（ポリオール脱水素酵素）は、１- または６- またはＤ- またはＬ- デオキシケトヘキソースと対応するヘキソースの糖アルコール間の反応を触媒する酵素で、公知の酵素のものから選択できる。

本発明に使用されるアルドースレダクターゼとは、６- デオキシＤ- またはＬ- アルドヘキソースと対応する糖アルコール間の酸化還元反応を触媒する酵素であり、公知のものが使える。

本発明において６- デオキシＤ- またはＬ- アルドヘキソース、または、１- または６- デオキシまたはＤ- またはＬ- ケトヘキソースを還元し対応する糖アルコールを製造する工程においては、化学的な還元反応を使用することもできる。
有機化学的な還元反応としては、ニッケル、ルテニウム、白金およびパラジウム等の、周期律表第８族の元素から選ばれる金属を含有する触媒の存在下、水素添加（接触還元）することによりなされる。
目的のデオキシヘキソースの製造には、上述の反応の組み合わせによりいずれのデオキシヘキソースからでも製造できるが、自然界に存在するＬ- フコースもしくは、Ｌ- ラムノースを出発原料として用いるのが、最も安価である。
上記により製造されたデオキシヘキソースは、特に代謝や生体信号に対する研究に対しての利用が期待されることから、化学品、医薬品や中間原料、研究試薬として好適であり、発酵用炭素源、飲食物、飼料、餌料、歯みがき、口中香錠、舌下錠、内服薬など経口摂取物の甘味付け、嗜好性向上などに有利に利用できる。また、医薬用物質の中間体として利用できる。

以下、幾つかの実施例により本発明の詳細を述べるが、これらの実施例により、本発明が限定されることはない。

［６- デオキシＬ- プシコースのＬ- ラムノースからの生産］
Ｌ- ラムノースをＬ- ラムノースイソメラーゼを用いてＬ- ラムニュロース（６- デオキシＬ- フラクトースへ異性化し、それをＤ- タガトース３- エピメラーゼを用いてエピマー化することによって、６- デオキシＬ- プシコースを生産した。

［Ｄ- タガトース３- エピメラーゼの調製］
Pseudomonas cichorii ST24株（ＦＥＲＭＢＰ−２７３６）由来Ｄ- タガトース３- エピメラーゼの遺伝子を大腸菌に形質転換し、組み換え大腸菌を培養して、Ｄ- タガトース３- エピメラーゼを得た。
組換え大腸菌の大量培養後、得られた菌体を−８０℃で冷凍保存した。冷凍保存された菌体を氷中に３０分間放置し表面を解凍し、５０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を用いて懸濁した。懸濁液２００mLを超音波ホモジナイザー SONIFIER２５０（ブランソン株式会社）を用い、４℃に保ちながら６分間破砕した。これを２度繰り返した。この液を４℃、１１５００rpmで２０分間遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。粉砕したポリエチレングリコール♯６０００を粗酵素液に重量に対して５％を、氷水浴中でマグネチックスターラーを用いて撹拌しながら徐々に添加し、添加後から１時間撹拌した。これを４℃、１１５００rpmで1時間遠心分離して上清を回収した。再びポリエチレングリコール♯６０００を上清の重量に対して２５％を、同様の操作で添加し、添加後から1時間撹拌した。これを４℃、１１５００rpmで1時間遠心分離して沈殿を回収した。この沈殿物に少量（菌体重量のおよそ５倍）の５０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を加えて懸濁した。（これを、部分精製Ｄ- タガトース３- エピメラーゼとした。）

［Ｄ- タガトース３- エピメラーゼの活性測定］
Ｄ- タガトース３- エピメラーゼの活性測定はＤ- タガトースを基質として反応を行い、生じたＤ- ソルボースの量をHPLC分析によって定量した。酵素反応は表１に示した組成で３０℃、１０、２０、３０分間反応させ、熱湯で２分間加熱することにより反応を停止し生じたＤ- ソルボース量を求め、１分間で１μmolのＤ- ソルボースを生産するＤ- タガトース３- エピメラーゼ量を１Ｕ（単位）とした。

得られた部分精製Ｄ- タガトース３- エピメラーゼの性質は以下の通りであった。
（１）作用および基質特異性は、１- または６- デオキシまたはＤ- またはＬ- ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応する１- または６- デオキシまたはＤ- またはＬ- ケトヘキソースを生成する。
（２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
（３）至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。

［Ｄ- タガトース３- エピメラーゼの固定化］
Ｄ- タガトース３- エピメラーゼの固定化をキトパールBCW２５１０を用いて行った。まず、５０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を用いてキトパール樹脂を洗浄し、冷蔵庫内で一晩放置して平衡化を行った。次に上述の部分精製したＤ- タガトース３- エピメラーゼ２００Ｕを１mL(湿重量約１g)のキトパール樹脂と混合し、時々撹拌しながら冷蔵庫内で２日間放置して酵素を固定化させた。同緩衝液にてキトパールを洗浄し、これを固定化酵素とした。
以下の実施例には、この固定化酵素を使って、デオキシケトヘキソースのエピマー化反応を実施した。

［Ｌ- ラムノースイソメラーゼの製造］
［Ｌ- ラムノースイソメラーゼの特性］
Pseudomonas stutzeri LL172（IPOD FERM BP-08593）由来Ｌ- ラムノースイソメラーゼの遺伝子を大腸菌に形質転換し、組み換え大腸菌を培養して、Ｌ- ラムノースイソメラーゼを得た。
組換え大腸菌の大量培養後、得られた菌体を−80℃で冷凍保存した。冷凍保存された菌体を氷中に３０分間放置し表面を解凍し、１０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０を用いて懸濁した。懸濁液２００mLを超音波ホモジナイザー SONIFIER２５０（ブランソン株式会社）を用い、４℃に保ちながら６分間破砕した。これを２度繰り返した。この液を４℃、１１５００rpmで２０分間遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。粉砕したポリエチレングリコール♯６０００を粗酵素液の重量に対して５%を、氷水浴中でマグネチックスターラーを用いて撹拌しながら徐々に添加し、添加後から１時間撹拌した。これを４℃、１１５００rpmで1時間遠心分離して上清を回収した。再びポリエチレングリコール♯６０００を上清の重量に対して２５％を、同様の操作で添加し、添加後から１時間撹拌した。この沈殿物に少量（菌体重量のおよそ５倍）の１０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０を加えて懸濁した。（これを、部分精製Ｌ- ラムノースイソメラーゼとした。）

［Ｌ- ラムノースイソメラーゼの活性測定］
Ｌ- ラムノースイソメラーゼの活性測定はＬ- ラムノースを基質として反応させ、生じた６- デオキシＬ- フラクトースの量をシステインカルバゾール法によって定量した。酵素反応は表２に示した組成で３０℃、１０分間反応させ、反応の停止は１０％のＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を５０μl加えて行った。システインカルバゾール法は表３に示したように酵素反応後のサンプル０．５mlに１．５％システイン溶液１００μL、７０％硫酸３mlを順次加えた後、撹拌して水中に置き、０．１２％カルバゾール溶液１００μLを加え撹拌して、３５℃で２０分間反応させた。反応終了後、紫外可視分光光度計Ｖ５３０（日本分光株式会社）を用いて、５４０nmの吸光度を測定した。なお、１分間あたりに１μmolの６- デオキシＬ- フラクトースを生産する酵素量を１Ｕと定義した。

部分精したＬ- ラムノースイソメラーゼの性質を以下のとおりであった。
（１）Ｌ- ラムノースと６- デオキシＬ- フラクトースの異性化反応を触媒する。
（２）６- デオキシＬ- プシコースと６- デオキシＬ- アルトロースの反応を触媒する。
（３）温度安定性は４０℃以下で、最適温度は６０℃である。ｐＨ７．０〜９．０で安定であり、最適ｐＨはｐＨ９．０である。

［Ｌ- ラムノースイソメラーゼの固定化］
Ｌ- ラムノースイソメラーゼの固定化にはキトパールＢＣＷ２５１０を用いた。まず、１０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０を用いてキトパール樹脂を洗浄し、冷蔵庫内で一晩放置して平衡化を行った。次に部分精製したＬ- ラムノースイソメラーゼ５０Ｕを１mL(湿重量約１g)のキトパール樹脂と混合し、時々撹拌しながら冷蔵庫内で２日間放置して酵素を固定化させた。同緩衝液にてキトパールを洗浄し、これを固定化酵素とした。

［固定化Ｌ- ラムノースイソメラーゼによるＬ- ラムノースの異性化］
Ｌ- ラムノースをBrix３０％になるように調製し、その溶液２５０mLを５００mL容量の三角フラスコに移した。そこに固定化Ｌ- ラムノースイソメラーゼを１００mL（５０００Ｕ相当）と１M トリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０を５mL（終濃度約１０mM）添加し、４２℃、１２０rpmの条件で撹拌しながら反応した。１時間毎に反応液１０μL採取し、２９０μLの水で希釈（３０倍希釈）し、熱湯で２分間加熱し酵素を失活させた後、１２０００rpmで５分間遠心して上清を回収した。それに脱塩樹脂（ＩＲＡ４１１：ＳＫＩＢ＝２：１の割合で混合し乾燥させたもの）少量添加して転倒混和した。１時間後、この液を０．４５μmのフィルターを用いてろ過し、ＨＰＬＣに供した。反応の平衡比はＬ- ラムノース５５％、６- デオキシＬ- フラクトース４５％であった（図９）。また、反応が平衡に達するまでに必要な時間は約10時間であった。平衡に達した溶液のHPLC分析結果を示した（図１０）。

［Ｄ- タガトース３- エピメラーゼによる６- デオキシＬ- フラクトースの異性化（エピマー化）］
Ｌ- ラムノースと６- デオキシＬ- フラクトースの混合糖液をＢｒｉ×３０％、２５０mLになるように調製し、５００mL容量の三角フラスコに移した。そこに固定化Ｄ- タガトース３- エピメラーゼ２５mL（５０００Ｕ相当）と１M トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を４０mL（終濃度約５０mM）添加し、４２℃、１２０rpmの条件で撹拌しながら反応させた。
１時間毎に反応液１０μL採取し、２９０μLの水で希釈（３０倍希釈）した。熱湯で２分間加熱した後、１２０００rpmで5分間遠心して上清を別のエッペンドルフチューブに移す。それに少量の脱塩樹脂（ＩＲＡ４１１：ＳＫＩＢ＝２：１の割合で混合し乾燥させたもの）を添加して転倒混和した。１時間後、この液を０．４５μmのフィルターを用いてろ過し、ＨＰＬＣに供試した。平衡比はＬ- ラムノース５５％、６- デオキシＬ- フラクトース３６％、６- デオキシＬ- プシコース９％であった（図１１）。また、反応が平衡に達するまでに必要な時間は約９６時間であった。平衡に達した溶液のＨＰＬＣ分析結果を示した（図１２）。

［６- デオキシＬ- プシコースの分離］
異性化反応後、ろ過により固定化酵素を除去した。脱塩樹脂（ＩＲＡ４１１（４０mL）とＳＫＩＢ（２０mL））を混合してオープンカラムに充填し、少しずつ糖液を流し込んで脱塩を行った。脱塩後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。その後、０．２２μmのフィルターを用いてろ過し、ろ液をＢｒｉ×３０％に調製した。ワンパス方式クロマト分離装置を用いて６- デオキシＬ- プシコースを分離した（表４）。分離後、各タンクの溶液をＨＰＬＣ分析した結果を図１３に示した。また、Ｌ- ラムノースからの理論上の収量はおよそ８％であった。図１３はワンパスカラムを用いた分離の図であり、タンクＡはほとんど糖はなく、タンクＢにはＬ- ラムノースとＬ- ラムニュロース、タンクＣは少量の６- デオキシＬ- フラクトース、タンクＤには、６- デオキシＬ- フラクトースが主に溶出され、純粋に分離できている。すなわち、ピークは、tankＡは極少量のＬ- ラムノースとＬ- ラムニュロース、tankＢはＬ- ラムノースとＬ- ラムニュロース、tankＣは少量の６- デオキシＬ- フラクトース、tankＤは６- デオキシＬ- フラクトースである。

［６- デオキシＬ- プシコースの構造解析］
２０〜３０mg（¹³Ｃ-ＮＭＲ用）および１０〜１５mg（¹Ｈ-ＮＭＲ）の６- デオキシＬ- プシコースをエッペンドルフチューブに入れ、６００μL の重水を添加した。チューブの口をパラフィルムで覆い、爪楊枝で３箇所ほど開け、ディープフリーザーで凍結させた。これを凍結乾燥し、再び６００μLの重水を添加し、凍結乾燥した。乾燥後、予めＴＳＰ（３- methylsilyl propionic 2,2,3,3- d4 acid）を１％になるように調製した６００μLの重水を添加して溶解した。これをＮＭＲのガラス管に入れて測定を行った。参考資料としてＬ- ラムノースおよびＤ- プシコースも分析した。それぞれの¹³Ｃ-ＮＭＲシフトを帰属し、互変体の構造を表５、表６および表７に示した。この表の空欄はシフトが存在しなかったことを示しす。これらのことから、６- デオキシ‐Ｌ- プシコースの生成が確認され、６- デオキシ‐Ｌ- フラクトースと６- デオキシ‐Ｌ- プシコースの平衡比は、８０：２０であった。

［６- デオキシＬ- アルトロースの６- デオキシＬ- プシコースからの生産］
実施例１で得た６- デオキシＬ- プシコースを基質として、Ｌ- ラムノースイソメラーゼを用いて異性化することによって、６- デオキシＬ- アルトロースを生産した。

Ｌ- ラムノースイソメラーゼは実施例1と同様に精製した。

［固定化Ｌ- ラムノースイソメラーゼを用いたバイオリアクターによる６- デオキシＬ- プシコースの異性化］
固定化Ｌ- ラムノースイソメラーゼ１５０mL(７５００Ｕ相当)をジャケット付カラムに充填し、ジャケットに42℃の水を流して保温した。そこにBrix２％となるよう調製した６- デオキシＬ- プシコースを０．５mL/minの速さで下から上に流した。なお、基質には１M トリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０を終濃度約１０mMになるよう予め添加した。平衡比は６- デオキシ‐Ｌ- プシコース94%、６- デオキシＬ- アルトロース６％であった。平衡に達した溶液のＨＰＬＣ分析結果を示した（図１４）。６- デオキシＬ- プシコースと６- デオキシＬ- アルトロースの平行比は９４：６であった。

［６- デオキシＬ- アルトロースの分離］
異性化反応後、ろ過することで固定化酵素を除去した。脱塩樹脂（ＩＲＡ４１１（４０mL）とＳＫＩＢ（２０mL））を混合してオープンカラムに充填し、少しずつ糖液を流し込んで脱塩を行った。脱塩後、ロータリーエバポレーターにて濃縮後、０．２２μLのフィルターを用いてろ過し、ろ液をＢｒｉ×３０％に調製した。ワンパス方式クロマト分離装置を用いて６- デオキシＬ- アルトロースを分離した。Ｌ- ラムノースからの収量はおよそ０．４８％であった。

［６- デオキシＬ- アルトロースの構造解析］
２０〜３０mg（¹³C-NMR用）および１０〜１５mg（¹H-NMR）の６- デオキシＬ- アルトロースをエッペンドルフチューブに入れ、600μLの重水を添加した。これを凍結乾燥し、再び６００μLの重水を添加し、凍結乾燥した。乾燥後、予めTSP（３- methylsilyl propionic 2,2,3,3- d4 acid）を１％になるように調製した６００μLの重水を添加して溶解した。これをNMRのガラス管に入れて測定を行った。参考資料としてＤ- アルトロースも供試した。６- デオキシＬ- アルトロースの互変体はα-、β-ピラノースおよびα-、β-フラノースの４種類であると推測された。それぞれの¹³C-NMRシフトを帰属し、互変体の構造を表８と表９に示した。これらのことから、６- デオキシ‐Ｌ- アルトロースの生成が確認された。

［Ｌ- ラムノース（６- デオキシＬ- マンノース）の還元反応による６- デオキシＬ- マンニトールの製造］
６- デオキシＬ- マンノースを化学反応によって、６デオキシＬ- マンニトールを生産した。

［ラネーニッケルを触媒とした還元反応］
５０％ラネーニッケル（和光純薬工業（株）製）１０ｇに対し、２０％ＮａＯＨ水溶液を１００ｇ添加した。添加後９０℃、１時間の加温を行った。気泡の発生が止まったことを確認した後、デカンテーションにより蒸留水で触媒を洗浄した。洗浄は、洗浄液がｐＨ９．２になるまで行った。
撹拌器、温度計を備えた１Ｌガラスオートクレーブに、１００ｇの６- デオキシＬ- マンノースを含む水溶液３００ｇに上記の方法により得られたラネーニッケル２４ｇを加えたものを添加した後、さらに水を加えて全反応液量を６００ｇに調整した。その際、反応液のｐＨを７に調整するため、炭酸カルシウムを添加した。５０℃に温度を、１２ｋｇ／ｃｍ^２（ゲージ圧）に水素圧を、７００ｒｐｍに攪拌速度を保ち反応を行った。反応液の分析はＨＰＬＣを用いて行った。その結果、８時間の反応で６- デオキシＬ- マンノースは１％まで減少がみられ、６- デオキシＬ- マンニトールを生産することができた。

［1-デオキシＬ−マンニトールの酸化による1-デオキシＬ−フラクトースの生産］
エンテロバクター・エアロジェネスIK7を用いる微生物反応によって、実施例３で調製した１−デオキシＬ−マンニトールを酸化し1-デオキシＬ−フラクトースを生産した。
上記菌株は、香川県木田郡三木町を流れる河川土壌から単離されたものである。
本菌株から抽出された１６ＳｒＲＮＡを配列決定し、他の微生物から得た既知の複数の１６ＳｒＲＮＡと比較した。このデータはEnterobacter aerogenesからの配列に対し９９％の同一性を示した。このエビデンスならびに下記のその他の生理学的特徴に基づき、本菌株がEnterobacter aerogenesに該当するものであるとの結論を得た。なおＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、公知の方法、例えば、サンガー法(Molecular Cloning、第２巻、１３．３頁、１９８９年）、ＰＣＲをベースにした方法等によって行うことができる。
通常は、Beckman Coulter社のGenomeLab DTCS Quick Start Kit（蛍光ダイデオキシタミネーターを含有するシークエンシングキット）等を使って反応を行い、Beckman Coulter社の自動シークエンサー（CEQ 8000等）で塩基配列を決定する。
［生理学的特徴］
グラム染色陰性
運動性なし
生育温度 37度（４〜４０まで生育可能、37度が望ましい）
酸素要求性通性嫌気性であるが酸素を供する形態が望ましい
形状桿菌
ウレア分解性陰性
オルニチンデカルボキシラーゼ陽性
生育状態コロニー円形、凸状、乾燥、透明、クリーム白色
［培地］
（培養のｐＨは例えば５〜９であり、好ましくは６〜８．５である。培養は振とうあるいは通気撹拌などの好気条件下で行う。）
１．TSB（トリプティックソイブロース）培地１〜２％
ＴＳＢ：Becton, Dickinson Company製
２．肉エキス培地
（肉エキス（和光純薬工業(株)製）0.5％、ポリペプトン（和光純薬工業(株)製）0.5％、塩化ナトリウム0.5％、ｐＨ7.0）
３．酵母エキス培地
（酵母エキス（和光純薬工業(株)製）0.5％、ポリペプトン0.5％（和光純薬工業(株)製）、塩化ナトリウム0.5％、ｐＨ7.0）
寒天培地の場合は寒天を終濃度2％添加する。
本発明者らが単離したＩＫ７株は、Enterobacter属に属する新規微生物であり、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に２００６年１０月１９日に受託番号（NITE P-Ｌ- フコース）として国内寄託されている。その後、原寄託（NITE P-271）を上記の原寄託をした国際寄託当局に移管請求をし、２００７年３月２２日に該国際寄託当局より原寄託についての受託証（NITE BP-271）が発行された。

［糖アルコール脱水素酵素を含む菌体の製造］
滅菌した液体培地（２％TSB（trypsin soy broth：Becton Dickinson company）をベースとし炭素源として１％Ｄ- マンニトール）にエンテロバクターエアロジェネスIK7を植菌し、３７℃、２４時間、１２０ｒｐｍで振とう培養して糖アルコール脱水素酵素を多く含む微生物菌体を製造した。
培養終了後、遠心分離し、回収した菌体を適当量の一次交換水で2回洗浄したのちに50mMTris-HCl (pH9.0)緩衝液で適当量に懸濁した。（これを糖アルコール脱水素酵素を含む菌体溶液）とした。

調製した糖アルコール脱水素酵素活性を有する菌体溶液を用いて１- デオキシＬ- マンニトールから１- デオキシ-Ｌ- フラクトースを製造した。
Ｌ字管（容量３０ｍｌ）に５０mMTris-HCl (pH9.0)緩衝液と糖アルコール脱水素酵素を含む菌体溶液（最終菌体濃度は、吸光度６００ｎｍの値がＯＤ値で２０）と１- デオキシＬ- マンニトール（最終濃度１０％）を吸光度６００ｎｍの値がＯＤ値で５０になるように調整し、３７℃に保温して、好気条件になるように、軽く振とうした。生成物の確認は得られる反応液を遠心分離して不溶物を除去し、上清を高速液体クロマトグラフィーで分析した。
１８時間で最高の１- デオキシ-Ｌ- フラクトースが得られ、１- デオキシＬ- マンニトールの約８０％の１- デオキシ-Ｌ- フラクトースが得られた。

［１- デオキシＬ- フラクトースからＤ- タガトース３- エピメラーゼによるエピマー化による１- デオキシＬ- プシコースの生産］
Ｄ- タガトース３- エピメラーゼを用いて、実施例４で調製した１- デオキシＬ- フラクトースから１- デオキシＬ- プシコースを生産した。

Ｄ- タガトース３- エピメラーゼは実施例１と同様の方法で調製した。

１- デオキシＬ- フラクトースは実施例４と同様にして調製したものを用い、そのエピ化反応は同様に実施例１の方法で行った。

［生産物である１- デオキシＬ- プシコースの構造解析]
反応液を実施例１ど同様のHPLC分析によって、１- デオキシＬ- フラクトースから１- デオキシＬ- プシコースが生産されていることを確認できた。

クロマトグラフィーを用いて得たサンプルを、NMRを用いてその構造を確認した。標準となる１- デオキシＤ- プシコースの^１３C NMR およびプロトンNMRを用いて測定した。一般に糖のD型とL型とのNMRは一致する。測定の結果同一であったことから、生産物が１- デオキシＬ- プシコースであることを確認した。
この結果は１- デオキシケトヘキソースをＤ- タガトース３- エピメラーゼが基質とすることを示している。

[１- デオキシＤ- プシコースの６- デオキシＬ- プシコースからの生産]
６- デオキシＬ- プシコースは実施例１で示したように、Ｌ- ラムノースから生産した。それを還元し６- デオキシＬ- アリトールへと変換し、それを酸化することで、１- デオキシＤ- プシコースを生産した。

６- デオキシＬ- プシコースを化学還元し、６- デオキシＬ- アルトリトールと６- デオキシＬ- アリトールを生産した。それを各種糖質の分離に用いているカルシウムイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィーを用いて分離した。この方法によって６- デオキシＬ- アリトールを得た。

６- デオキシＬ- アリトールを実施例４と同様の微生物を用いることで１- デオキシＤ- プシコースへ酸化した。

[構造解析]
生産物である１−デオキシＤ−プシコースの構造を化学合成した１- デオキシD - プシコースと^１３C NMRおよびプロトンNMRを測定し、比較した。その結果を図１５，１６に示した。
図１５の上が化学合成した１- デオキシD- プシコースの^１３C NMRスペクトルであり、下が本実験で生産した１- デオキシD- プシコースの^１３C NMRスペクトルである。このように完全に一致している。

[１- デオキシＤ- フラクトースの１- デオキシＤ- プシコースからの生産]
実施例６で生産した１- デオキシＤ- プシコースを基質として、Ｄ- タガトース３- エピメラーゼを用いて１- デオキシＤ- フラクトースを生産した。

１- デオキシＤ- プシコースを基質として、実施例１と同じ方法で生産したＤ- タガトース３- エピメラーゼを用いて３位をエピメー化した。反応生産物を上述のクロマトクロマトグラフィーを用いて分離し、純粋な標品を得た。

[構造決定]
化学合成した１- デオキシＬ- フラクトースと生産物とをNMRスペクトルを測定して比較した。化学合成した１- デオキシＤ- フラクトースは容易に得られないので、１- デオキシＤ- プシコースを比較対象とした。Ｄ- 型糖とＬ- 型糖とはNMRは一致するので、比較する標準物質としては用いることが可能である。
図１７において、上は１- デオキシＬ- フラクトースの^１３C NMRであり、下が本実験で生産した１- デオキシＤ- フラクトースの^１３C NMR である。
図１８には、上は１- デオキシＬ- フラクトースのプロトンNMRであり、下が本実験で生産した１- デオキシＤ- フラクトースのプロトン NMR である。完全に一致している。

[１−デオキシＤ−タガトースから１−デオキシＤ−ソルボースの生産]
化学合成した１−デオキシＤ−タガトースを基質として、Ｄ−タガトース３−エピメラーゼを用いて１−デオキシＤ−ソルボースを生産した。

実施例１と同様の方法で生産したＤ- タガトース３- エピメラーゼを、化学合成した１- デオキシＤ- タガトースに常法に従って反応し生産物をクロマトグラフィーによって確認した。その結果、１- デオキシＤ- ソルボースと１- デオキシＤ- タガトースのピークが確認され、分離することで生産可能であった。

[６- デオキシＬ- ソルボースのＬ- フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）からの生産]
Ｌ- フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）をＤ- アラビノースイソメラーゼを用いて６- デオキシＬ- タガトースへ異性化し、さらにそれをＤ- タガトース３- エピメラーゼを用いてエピマー化することで６- デオキシＬ- ソルボースを生産した。

Ｌ- フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）を基質としてKlebsiella pneumoniae ST. 40BXX の生産するＤ- アラビノースイソメラーゼを用いて反応した。HPLCで分析した結果、１０％の６- デオキシＬ- ガラクトースが６- デオキシＬ- タガトースへ変換して平衡に達した。その平衡混合物から６- デオキシＬ- タガトースを常法どおりのクロマトグラフィーを用いて純粋な標品を得た。

６- デオキシＬ- タガトースを基質とし、実施例１と同様の方法で調製したＤ- タガトース３- エピメラーゼを用いて酵素反応を行った。その結果６- デオキシＬ- タガトースの約８０％が６- デオキシＬ- ソルボースへ変換された時点で平衡混合物が得られた。

[生物化学的反応を用いた１- デオキシおよび６- デオキシＤ- タガトースのＬ- フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）およびその鏡像体であるＤ- フコース（６- デオキシＤ- ガラクトース）からの生産]
まず、Ｌ- フコースおよびＤ- フコースを出発原料とし、ラネーニッケルを用いた化学的還元法（圧力１．２Ｍｐａ、撹拌７００ｒｐｍ、温度５０℃）により、それぞれから６- デオキシＬ- ガラクチトールおよび６- デオキシＤ- ガラクチトールを得た。次にガラクチトールを酸化しＤ- タガトース生産能を有するエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans） 221e 株（ＦＥＲＭＢＰ−４７００）〔培地：エリスリトール１．０ｗ／ｖ％、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、食塩０．５ｗ／ｖ％及びグリセロール１．０ｗ／ｖ％からなる液体培地（ｐＨ７．０）で３０℃で培養し、集菌し洗浄したもの〕を用いてそれぞれのデオキシ糖アルコールを基質に洗浄菌体反応〔菌体反応組成物：菌体４０（ＯＤ_６００）、Tris-HCl 緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、基質１％）〕で行った（特開平08-056659号公報参照）。
ＨＰＬＣ分析の結果より、本菌は、６- デオキシＬ- ガラクチトールを酸化し１- デオキシＤ- タガトースに転換し、６- デオキシＤ- ガラクチトールを酸化し６- デオキシＤ- タガトースに転換できることがわかった。
本菌株を用いた６- デオキシＬ- ガラクチトールおよび６- デオキシＤ- ガラクチトールの酸化した結果より、１位、６位のメチル基の存在にかかわらず糖構造を認識し転換を行うことができ、優先的にＤ体のタガトースへと転換することがわかった。

［反応生産物の精製]
反応混合物を脱イオン、脱色、濾過、蒸発を経て結晶を得た。

［生産物である１- デオキシＤ- タガトースの構造解析]
HPLC分析によって、６- デオキシＬ- ガラクチトールから１- デオキシＤ- タガトースが生産されていることを確認できた。その結果を図１９に示した。

得られたサンプルを、NMRを用いてその構造を確認した。その結果を図２０に示した。

［生産物である６- デオキシＤ- タガトースの構造解析]
HPLC分析によって、６- デオキシＤ- ガラクチトールから６- デオキシＤ- タガトースが生産されていることを確認できた。その結果を図２１に示した。

得られたサンプルを、NMRを用いてその構造を確認した。その結果を図２２に示した。

本実施例の生物化学的反応を用いた１- デオキシおよび６- デオキシＤ- タガトースのＬ- フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）およびその鏡像体であるＤ- フコース（６- デオキシＤ- ガラクトース）からの生産は化１および化２によってその反応が示される。

[生物・化学的手法による１- デオキシＤ- プシコースのＬ- ラムノースからの生産]
まず、図２３に示すように、６- デオキシＬ- プシコースをＬ-ラムノースからＬ-ラムノースイソメラーゼおよびＤ-Ｄ- タガトース３- エピメラーゼを用いて調製した（日本農芸化学学会２００７粘度大会）。これに高圧条件下でニッケル触媒を用いて水素添加した結果、１-デオキシＤ-アリトール（６-デオキシーＬ-アリトール）と、１-デオキシＤ-タリトール（６-デオキシーＬ-タリトール）の混合物が得られた（図２４、図２６）。この混合物を基質としてエンテロバクター属菌体ＩＫ７（NITE BP-271）による菌体反応を行ったた（図２５、図２７）。その結果、１-デオキシＤ-アリトールのみが選択的に１- デオキシＤ- プシコースへと酸化された。エンテロバクター属菌体ＩＫ７による両基質総量の減少はほとんど無く、１- デオキシＤ-アリトールからの１- デオキシＤ- プシコース生産率は約９０％であった。この反応物を分離した結果、１- デオキシＤ- プシコースと１- デオキシＤ- タリトールをそれぞれ純品として得た。得られた６- デオキシＬ- プシコースの結晶の写真を図２８に示す。生産物の同定は化学合成した１- デオキシＤ- プシコースと比較し、両者の^１３ＣＮＭＲスペクトル（図２９）および旋光度が一致したことにより確認した。
旋光度［α］^２０(conc.1.00%,H₂O)
標準(authentic) ＋1.0
生成物＋1.１
なお、標準(authentic)は、文献（Jones,N.A. and et al. Synthesis of and NMR studies on the four diasteromeric 1-deoxy-d-ketohexoses.,Tetrahedron:Asymmetry(2007)）に依る。

［６-デオキシＬ-グルコースおよび６-デオキシＬ-フラクトースの生産］
Ｌ- ラムノース（１０％ wt/volume）をラネーニッケル触媒の存在下、温度５０℃、圧力１．２Ｍｐａで完全に還元し、６-デオキシＬ-マンニトールを生産した。得られた６-デオキシＬ-マンニトールを基質として６-デオキシＬ-フラクトースを製造した。新しく分離したエンテロバクターｓｐ．２３０Ｓが６-デオキシＬ-マンニトールの第２炭素で選択的酸化し６-デオキシＬ-フラクトースにするのに用いられた。微生物はＤ-ソルビトール（０．８％ wt/volume）およびグリセロール（０．２％ wt/volume）を加えた鉱物塩培地で温度３０℃、３００ｒｐｍで撹拌下、２４時間培養した。培養物は１２０００ｒｐｍで３０分遠心分離して集菌し、５０ｍＭ Tris-HCl 緩衝液（ｐＨ１０）で２回洗浄した。洗浄した菌体は同一の緩衝液に懸濁させて６-デオキシＬ-マンニトールから６-デオキシＬ-フラクトースへの転換に用いた。反応は、菌体ＯＤ（600nm）、操作用量、撹拌速度、空気流速、および温度がそれぞれ、４０，０．５ｌ，２００rpm,０．２liter/min および３０℃を用いて、５ｌバイオリアクター（ABLE DPL-2,Japan）の中で種々の基質濃度で行った。

本発明らはすでにK.pneumonia 40bXX がＬ-フラクトースからＬ-グルコースへの転換を触媒することを発表している。同様の方法で６-デオキシＬ-フラクトース（前段階の生産物）から６-デオキシＬ-グルコースを製造することを試みている。K.pneumonia 40bXXは、ＭｎＣｌ_２（１ｍＭ）を補ったポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、食塩０．５ｗ／ｖ％を含有する培地で培養した。２４時間インキュベーションの後、菌体は１２００xgで１０分間遠心分離して回収した、回収した菌体は５０ｍＭグリシン-ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）で２回洗浄し、１２００xgで１０分間遠心分離した。洗浄した菌体はモーターで破壊し、活性化されたアルミナを加えてすりつぶして粗酵素を得る。部分精製した酵素Ｄ-ＡＩ（400U）があらかじめ５０ｍＭグリシン-ＮａＯＨでつり合わされ、反応に使われるChitopearl BCW 2510 の３０ｇ（湿った重量）に固定される。転位反応は４０℃で、１％６-デオキシＬ-フラクトース、固定化Ｄ-ＡＩ（40U）、５０ｍＭ Tris-HCl 緩衝液（ｐＨ９．０）およびＭｎＣｌ_２（最終濃度：１ｍＭ）を含有するＬ-チューブの中で行われた。

［分離方法］
６-デオキシＬ-マンニトールの場合、転換率として１００％に近く、それゆえ、分離工程は反応混合物から濾過でラネーニッケルを除くだけである。

６-デオキシＬ-フラクトースは、２３０Ｓの残りの菌体を用いて、６-デオキシＬ-マンニトールを酸化して製造された。表面に浮かんだものは一昼夜活性炭素で処理し、最終的には活性炭はセルロースフィルターを通過させる吸引濾過により取り除かれた。濾液はDiaion SK1B(H^＋型)およびアンバーライトIRA-411(CO₃ 2-型)の混合物で脱イオン化した。濾液の容量は回転真空エバポレーターに丁度良い量であり、そして濃縮された濾液はＣａ^２＋型のDowex 50W-X2 カラムに適応された。カラムは蒸留水で溶離され、溶離された画分は集められ、HPLC分析をした。

［同定］
６-デオキシＬ-マンニトールおよび６-デオキシＬ-フラクトースはHPLC分析（図３０）、旋光度測定、および^１３C NMR 測定により同定された。
精製された６-デオキシＬ-フラクトースのHPLC分析結果を図３０に示した。また、生産された６-デオキシＬ-フラクトースの旋光度は＋１２．９、文献で報告されている公知の旋光度は＋１３．６。また、生産された６-デオキシＬ-フラクトースの^１３C NMRは標準の６-デオキシＬ-フラクトースと完全に一致している（図３１）。

［結果］
６-デオキシＬ-マンニトールは６-デオキシＬ-マンノースの化学還元で容易に製造することができる。６-デオキシＬ-マンノースは９９％に近い生産率で完全に６-デオキシＬ-マンニトールに変換する。６-デオキシＬ-マンニトールの初期濃度が３％、４％および５％の時それぞれ、６-デオキシＬ-マンニトールのほとんど９０％、７０％および６５％が洗浄菌体反応を用いて６-デオキシＬ-フラクトースおよび１-デオキシＬ-フラクトースを生産する。
反応混合物の中の６-デオキシＬ-フラクトースの１-デオキシＬ-フラクトースに対する最終の割合は約８：２であった。バイオリアクターの中で、約１０時間で、６-デオキシＬ-マンニトール（30g/l）は６-デオキシＬ-フラクトースおよび１-デオキシＬ-フラクトースを生産するのに完全に使い果たされ、種々の精製工程経て、６-デオキシＬ-マンニトールからの６-デオキシＬ-フラクトースの最終生産率は約５０％である。
固定化Ｄ-アラビノースイソメラーゼによる６-デオキシＬ-フラクトースの６-デオキシＬ-グルコースへの異性化の場合、６-デオキシＬ-グルコースのHPLCピークは酵素の非常に低い活性のために、検出できなかった。そして、それゆえ６-デオキシＬ-グルコースの分離および同定は今回は行わなかった。
６-デオキシＬ-フラクトースは６-デオキシＬ-マンノースから、Ｌ-ラムノースイソメラーゼを用いても製造することができる。しかし、等量混合物のHPLCピークが重なっているために、６-デオキシＬ-フラクトースおよび６-デオキシＬ-マンノースの分離は全く困難であり現実的でない。本実験では６-デオキシＬ-マンノースからの６-デオキシＬ-フラクトースを、化学的方法および生物化学的方法を結合して使用することで約５０％の生産率で製造し精製することができた。

［Ｌ-ラムノースから６-デオキシＬ-マンニトールおよび１-デオキシＬ-フラクトースを経由して１-デオキシＬ-プシコースの新規な生物化学的製造方法］
［原料および方法］
［試薬など］
Ｌ-ラムノースおよび他の生化学製品はSigma Chemical Co.(MO,USA)および和光純薬工業（株）（大阪、日本）から、すべて試薬グレードが保証されたものを購入した。Ｌ-ラムノースの酸化に使用した５０ｍＭ tris-HCl 緩衝液は、１．０ＮＨＣｌでｐＨ９．０にしたトリス（ハイドロオキシメチル）アミノエタンＨ_２ＮＣ(ＣＨ_２ＯＨ)_３から調製した。Ｌ-ラムノース水素添加はＴＥＭ-１０００Ｍ水素添加装置（Taitasu Techno Co.Ltd,Japan）の中で行われた。微生物の培養および酸化反応はTAKASUGI SEISAKUSHO Co.Ltd.からのバイオリアクター（ＴＳ-Ｍ-１５Ｌ発酵槽およびＴＳ-Ｍ-５Ｌ発酵槽）の中で行われた。反応混合物中のポリオール酸化およびケトース蓄積は紫外可視分光光度計（U.V.-1700 pharmaspec 島津製作所、京都）を用いるNelson-Somogyi法により決定される。^１３C NMR スペクトル（Burker AMX500,126MHz）は初期標準としてアセトンを用いてＤ_２Ｏの中で記録される。旋光度は１dm. の経路長さの脱イオン化されたＨ_２Ｏ旋光計の中で２０℃でJasco R1030 旋光計,Ｎａ^＋ランプ（Jasco 東京日本）の上で記録される。濃度はｇ１００ｍＬ^-１までで使用される。生産物は高感度液体クロマトクラフィ（Hitach GL-611 colum,Tokyo,JapanおよびShimadzu RID-6A refractive index detector,Kyoto<Japan）により６００℃で分析され、１０^-４ＭＮａＯＨで流速1．０ml/minで溶離させた。

［Ｌ-ラムノースの６-デオキシＬ-マンニトールへの化学的還元］
ラネーニッケル（触媒）が水（３００ｍｌ中のＬ-ラムノース（５０ｇ）の溶液に加えられた；反応は全量５００ｍｌにして１．２ＭＰａ水素圧下にある反応容器に入れて行われた。それから反応容器は５０℃に８時間加熱され、Ｌ-ラムノースを６-デオキシＬ-マンニトールへにする。

［６-デオキシＬ-マンニトールの１-デオキシＬ-フラクトースへの酸化］
エンテロバクター属菌体ＩＫ７（NITE BP-271）が６-デオキシＬ-マンニトールの１-デオキシＬ-フラクトースへの生物化学的転換に使用する。菌株は菌体反応で１-デオキシＬ-フラクトースを生産するために、１％のＤ-マンニトールを添加した２％ＴＢＳ培地、３７℃で培養した。転換反応は５．０Ｌバイオリアクターの中で３７℃で撹拌速度１２０ｒｐｍ、空気流速０．５l/minで１２時間行われた。反応混合物の組成物は以下の通りであった：５０ｇ（５％ w/v）１-デオキシＬ-マンニトール、菌体密度５０（Ａ６００）洗浄菌体がtris-HCl緩衝液（１０００ml,５０mM, ｐＨ９.０）に懸濁された。

［１-デオキシＬ-フラクトースの１-デオキシＬ-プシコースへの異性化］
Pseudomonas cichorii ST24株（ＦＥＲＭＢＰ−２７３６）由来のＤ- タガトース３- エピメラーゼ（Ｄ-ＴＥ）が１-デオキシＬ-フラクトースの１-デオキシＬ-プシコースへの異性化に用いられた。組換え大腸菌より得られたＤ-ＴＥは部分精製しバイオリアクタを構築するためにキトパールBCW２５１０を用いて固定化を行った。tris-HCl緩衝液（１０００ml,５０mM, ｐＨ７.５）に溶解した１-デオキシＬ-フラクトース（５％）はバイオリアクターに４２℃で流した。

［分離方法］
各工程で得られた表面に浮かんだものは活性炭で処理し脱色され、処理された活性炭を取り除くために濾過された。濾液はDiaion SK1B(H^＋型；三菱化学、東京)およびアンバーライトIRA-411(CO₃ 2-型Muromachi Tecynos、東京)イオン交換樹脂の混合物で脱イオン化した。脱イオン化したものは４０℃で蒸発され、濃縮された。濃縮後、混合物は２つのポンプで結合した８カラムからなり、各カラムには２．５ＬのＵＫＢ-５５５イオン交換樹脂（Ｃａ^２＋）型、三菱化学、東京）が充填さている、ワンパス分離システムにより分離された。分離された画分は５０％まで濃縮され、濃縮物は結晶化のためデシケータの中で保持された。

［同定］
各工程で得られた生成物は、HPLC分析、旋光度測定、および^１３C NMR 測定により同定された。
生産された１-デオキシＬ-プシコースの^１３C NMRスペクトルを図３２に示した。また、生産された１-デオキシＬ-プシコースの旋光度は下記の通りであった。
旋光度１-デオキシＬ-プシコース(ｐ) -1.0
１-デオキシＤ-プシコース＋1.１５

［結果］
Ｌ-ラムノースの６-デオキシＬ-マンニトールへの化学的還元
水中のＬ-ラムノースは、１０％ｗ/ｖのＬ-ラムノースが基質に使われた時、ニッケル触媒を用いて１．２ＭＰａの圧力、５０℃で、水素添加により収率１００％でＬ-ラムニトールになる。この方法はいかなる分離方法も必要でない。図３３にHPLC分析結果を示す。
６-デオキシＬ-マンニトールの１-デオキシＬ-フラクトースへの酸化
エンテロバクター属菌体ＩＫ７（NITE BP-271）により菌体反応で６-デオキシＬ-マンニトールは５％ｗ/ｖの６-デオキシＬ-マンニトールが基質に使われた時、酸化されて収率９０％で１-デオキシＬ-フラクトースになる。１-デオキシＬ-フラクトースは上記の下方法で分離される。図３４にHPLC分析結果を示す。
１-デオキシＬ-フラクトースの１-デオキシＬ-プシコースへの異性化
１-デオキシＬ-フラクトースは、５％ｗ/ｖの１-デオキシＬ-フラクトースが基質に使われた時、バイオリアクターの中の固定化Ｄ-ＴＥにより、収率２５％で１-デオキシＬ-プシコースに異性化された。図３５にHPLC分析結果を示す。

［結論］
Ｌ-ラムノースから６-デオキシＬ-マンニトールおよび１-デオキシＬ-フラクトースを経由して１-デオキシＬ-プシコースの新規な生物化学的製造方法は図３６で示される。

［実験結果が示す成果のまとめ］
（１）Ｄ- タガトース３- エピメラーゼは全ての１- および６- デオキシケトヘキソースの３位をエピマー化することを示している。
（２）６- デオキシアルドースはアルドースイソメラーゼの基質となり、対応する６- デオキシアルドースを生産することが可能である。
（３）１- あるいは６- デオキシのＤ- あるいはＬ- ケトヘキソースを還元することで、対応する１- あるいは６- デオキシの炭素数６の糖アルコールを生産することが可能である。また６- デオキシアルドースを還元することで、６- デオキシ糖アルコールを生産可能である。
（４）１- あるいは６- デオキシ糖アルコールを基質として用いて、微生物を用いる酸化反応によって、それぞれ対応する１- あるいは６- デオキシケトヘキソースを生産可能である。

［全デオキシヘキソースの生産戦略デオキシイズモリングの構築］
上記の成果（１）〜（４）を用いることで、全デオキシヘキソースの生産戦略としてデオキシイズモリングを構築することができた。（図１〜３）
図中に示される大きなリングは、８種全ての１- デオキシケトースおよび８種全ての６- デオキシケトヘキソースがＤ- タガトース３- エピメラーゼによって対応するデオキシヘキソースと連結され、２種のデオキシケトヘキソースが８グループとして配置されている。それぞれのグループを酸化およに還元という反応として共通の生産物および基質となる、１- および６- デオキシヘキシトールが連結している。その原理を図１の下に摘記して示す。
摘記したものは、左からＬ- ラムノース（６- デオキシＬ- マンノース）を異性化して生産される６- デオキシＬ- プシコースをＤ- タガトース３- エピメラーゼによって６- デオキシＬ- プシコースへエピマー化する（実施例１）。それを化学的還元反応で６- デオキシグルシトールへ還元し、これは上下を逆にすると１- デオキシグリトールと同一である。その１- デオキシグリトールを酸化することで１- デオキシＤ- ソルボースを生産できる。さらに１- デオキシＤ- ソルボースをＤ- タガトース３- エピメラーゼによって１- デオキシＤ- タガトースが生産できる（実施例８）。これは一例を示しており、大きなリングはこの方式を繰り返すことで全体が連携できることを示している。この原理によって全ての１- および６- デオキシの１６種類のケトヘキソースが生産できる基本骨格ができあがっている。
また、この周囲には１６種類の全ての６- デオキシケトヘキソースが６- デオキシケトヘキソースと繋がっている。アルドースイソメラーゼによって６- デオキシケトヘキソースはへ転換できる。６- デオキシＬ- フラクトースから６- デオキシアルトロースの生産をしめしている（実施例１）。このように全ての１６種類の６- デオキシアルドースが周囲に結合されているのである。
このように、図１〜３で示されるデオキシイズモリングは、全ての１- および６- デオキシヘキソースが酵素反応で連結できることを示しており、全デオキシヘキソースの生産戦略を示している。またその配置は右側に全てのＤ- 型のデオキシヘキソースが、左側にＬ- 型のデオキシヘキソースが配置されており、全１- および６- デオキシヘキソースを明確に配置できており生産法を一目瞭然理解することが可能である。なお、構造を見ると理解できるが、図中に点線の矢印で示したものは、上下を反転すると重ねることのできる、すなわち同一の１- デオキシおよび６- デオキシのヘキシトールを示している。この点線は、図中のリングに沿った合成のみならずバイパスのような役割を果たして効率のよい合成法を示唆しているのである。
現在自然界に比較的多く存在している、デオキシアルドースである、Ｌ- ラムノース（６- デオキシＬ- マンノース）あるいは、Ｌ- フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）を出発原料とすることで、このデオキシイズモリングを用いた生産が可能であり、これらの新しいデオキシヘキソースの生産に有効に利用できる。

以上のまとめをさらに前進させて、デオキシ糖に番号が付されているデオキシイズモリングを図３として示したが、新しいデオキシヘキソースの生産について、実施例番号１４以下の実施例において図３に基づき具体的に説明する。
図３には、図１，２と同様に下記のＡ〜Ｄの反応が異なる表示の矢印で示されている。
ＡＤＴＥエピ化
Ｂポリオールの酸化反応
Ｃ異性化反応（アルドースケトース間の異性化）
Ｄニッケル触媒還元（ケトース、アルドースのポリオールへの還元）

［６- デオキシＬ- ソルボースの生産］
この反応は、６- デオキシＬ- タガトースのＤ-ＴＥによる６- デオキシＬ- ソルボースへのエピマー化であり、図３の番号２７−２６のＡの反応である。
下記反応条件でＬ- ラムノースから生産した６- デオキシＬ- タガトースにＤＴＥを作用させた。
〈反応条件〉
基質：６- デオキシＬ- タガトース
酵素：固定化Ｄ- タガトース３- エピメラーゼ
緩衝液：５０mM Tris-HCl (pH７．５)
温度：４０℃
反応のできをＨＰＬＣで確認したところ、図３７のように６- デオキシＬ- ソルボースの生産が確認された。平衡は６- デオキシＬ- タガトース：６- デオキシＬ- ソルボースは、およそ１：３であった。
それを下記方法で分離し純粋な６- デオキシＬ- ソルボースを得た（図３８）。その旋光度は−４８．５度であった。
〈分離方法〉
Dowex 50W X2
ワンパス分離システム
本実施例の６- デオキシＬ- タガトースからの６- デオキシＬ- ソルボースの生産は化３によってその反応が示される。

［６- デオキシＤ- ソルボースの生産］
この反応は、６- デオキシＤ−タガトースの６- デオキシＤ- ソルボースへのエピマー化であり、図３の番号３−２のＡの反応である。
Ｌ−フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）を出発原料とし、ラネーニッケルを用いた化学的還元法により得た６- デオキシＤ−ガラクチトールを酸化し転換した６- デオキシＤ−タガトースに、下記反応条件でＤＴＥを作用させた。
〈反応条件〉
基質：６- デオキシＤ- タガトース
酵素：固定化Ｄ- タガトース３- エピメラーゼ
緩衝液：５０mM Tris-HCl (pH７．５)
温度：４０℃
〈分離方法〉
Dowex 50W X2
反応のできをＨＰＬＣで確認したところ、図３９のように６- デオキシＤ- ソルボースの生産が確認された。平衡は６- デオキシＬ−タガトース：６- デオキシＬ−ソルボースの場合と同じであり、およそ１：３であった。
本実施例の６- デオキシＤ−タガトースからの６- デオキシＤ- ソルボースの生産は化４によってその反応が示される。

［１- デオキシＬ- プシコースの生産］
この反応は、１- デオキシＬ- フラクトースのＤＴＥによる１- デオキシＬ- プシコースへのエピマー化であり、図３の番号１８−１９のＡの反応である。
Ｌ−ラムノースから生産した１- デオキシＬ- フラクトースにＤＴＥを反応させた。
Ｌ-ラムノースから６-デオキシＬ-マンニトールを経由して１-デオキシＬ-フラクトースを製造した。
Ｌ−ラムノースから生産した１- デオキシＬ- フラクトースにＤＴＥを反応させた。反応条件は、下記のとおりである。
〈反応条件〉
基質：１- デオキシＬ- フラクトース
固定化Ｄ-ＴＥ：１００００Ｕ
（キトパールBCW２５１０）
温度：４２℃
撹拌：９０ｒｐｍ
容量：１００ｍｌ
時間：２４時間
変換率：７５（Ｆ）：２５（Ｐ）
ＤＴＥの作用により１- デオキシＬ- プシコースの生産が確認され、平衡は１- デオキシＬ- フラクトース：１- デオキシＬ- プシコースは、７５：２５であった。反応液後の液をワンパスクロマトによって分離した。分離条件は、下記のとおりである。
〈分離条件〉
システム：ワンパス分離システム
試料：３０％１- デオキシＬ- フラクトースおよび
１- デオキシＬ- プシコース混合物
容量：１００ｍＬ
流速：６０ｍｌ／ｍｉｎ
Wait time：９０ｍｉｎ
画分：タンク-Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ
結果：純粋な１- デオキシＬ- プシコースを得た。
反応混合物から分離した１- デオキシＬ- フラクトース（a）および１- デオキシＬ- プシコース（b）のHPLCによる純度は、図４０に示すごとく純粋であった。１- デオキシＬ- プシコースの１３C NMRスペクトルが図４１である。これは図３２と同一であることが確認された。

［６- デオキシＤ- フラクトースの生産］
この反応は、６- デオキシＤ- プシコースにＤＴＥに作用させて６- デオキシＤ- フラクトースに異性化する、図３の番号１１−１０のＡの反応である。
１- デオキシＬ- フラクトースにＤＴＥを作用させて作成した１- デオキシＬ- プシコースを還元し、１- デオキシＬ- アリトールを得た。それを微生物酸化（ＩＫ７）を行い、６- デオキシＤ- プシコースを生産した。このようにして生産した１- デオキシＤ- プシコースにＤＴＥに作用させた。反応条件は、下記のとおりである。
〈反応条件〉
緩衝液： Tris (ｐＨ７．５) ５００μｌ
基質：１．５％６- デオキシＤ- プシコース
Ｄ-ＴＥ：〜１００ units
温度：４０℃
時間：１２時間
変換率：５０（Ｓ）：５０（Ｐ）
反応後の溶液中には、６- デオキシＤ- フラクトースが５０％の平衡で生産されることを確認した。図４２の（a）は反応前の６- デオキシＤ- プシコースであり、（b）は反応後の反応混合物のＨＰＬＣによる分析である。

［６- デオキシＬ- ソルボースの生産］
この反応は、６- デオキシＬ- タガトースにＤＴＥに作用させて６- デオキシＬ- ソルボースに異性化する、図３の番号２２−２３のＡの反応である。
１- デオキシＬ-フラクトースにＤＴＥを作用させて作成した１- デオキシＬ- プシコースを還元し、１- デオキシＬ- タリトールを得た。それを微生物酸化（４０ｂ）を行い、１- デオキシＬ- タガトースを生産した。このようにして生産した１- デオキシＬ- タガトースにＤＴＥに作用させた。反応条件は、下記のとおりである。
〈反応条件〉
緩衝液： Tris (pH７．５) ５００μｌ
基質：１．０％６- デオキシＬ- タガトース
Ｄ-ＴＥ：〜１００ units
温度：４２℃
時間：１２時間
変換率：２０（Ｓ）：８０（Ｐ）
反応後の溶液中には、６- デオキシＬ- ソルボースが生産された。基質と生産物との比は、１：４であった。図４３の（a）は基質である６- デオキシＬ- タガトース、（b）は反応後の反応混合物のＨＰＬＣ分析の結果である。

［１- デオキシＤ- タガトースの生産］
この反応は、６- デオキシＬ- ガラクチトールを微生物を用いる酸化により１- デオキシＤ- タガトースを生成する、図３の番号４６＝３９−１３のＢの反応である。
Ｌ−フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）を還元し、Ｌ−フシトール（６デオキシＬ- ガラクチトール）をE.agglomerans 221eによる微生物酸化反応〔菌体反応組成物：菌体３０（ＯＤ_６００）、Tris-HCl 緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、基質６デオキシＬ- ガラクチトール１％〕を３０℃、６時間行った。１- デオキシＤ- タガトースのみが生産された。図４４の（a）は反応後の反応混合物、（b）は生成した１- デオキシＤ- タガトースのＨＰＬＣ分析の結果である。旋光度は＋１４．０であった。その^１３C NMRスペクトルを図４５に示した。
本実施例の６- デオキシＬ- ガラクチトールからの１- デオキシＤ- タガトースの生産は化５によってその反応が示される。

［１- デオキシＬ- タガトースの生産］
この反応は、６- デオキシＤ- ガラクチトールを微生物を用いる酸化により１- デオキシＬ- タガトースを生成する、図３の番号３４＝４３−２２のＢの反応である。
Ｌ−フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）を還元し、Ｌ−フシトール（６- デオキシＬ- ガラクチトール）を生産し、それを基質として３０℃で K.pneumoniae 40b による微生物酸化反応〔菌体反応組成物：菌体３０（ＯＤ_６００）、Tris-HCl 緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、基質１％〕を行った。図４６は１- デオキシＬ- タガトースが生産されている途中のＨＰＬＣ分析の結果であり、１- デオキシＬ- タガトースを生産できることを示している。
本実施例の６- デオキシＤ- ガラクチトールからの１- デオキシＬ- タガトースの生産は化６によってその反応が示される。

［６- デオキシＤ- タガトースの生産］
この反応は、６- デオキシＤ- ガラクチトールを微生物酸化反応により６- デオキシＤ- タガトースを生成する、図３の番号３４−３のＢの反応である。
Ｄ−フコース（６- デオキシＤ- ガラクトース）を還元し、Ｄ−フシトール（６- デオキシＤ- ガラクチトール）を生産し、それを基質として３０℃で E.agglomerans 221eによる微生物酸化反応〔菌体反応組成物：菌体３０（ＯＤ_６００）、Tris-HCl 緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、基質６デオキシＤ- ガラクチトール１％〕を行った。図４７の（a）は反応後の反応混合物のＨＰＬＣであり、（b）は分離精製した１- デオキシＤ- タガトースのＨＰＬＣのである。旋光度は−０．８度であり、図４８は^１３C NMRスペクトルである。
本実施例の６- デオキシＤ- ガラクチトールからの６- デオキシＤ- タガトースの生産は化７によってその反応が示される。

［１- デオキシＬ- フラクトースの生産］
この反応は、Ｌ- ラムニトール（６- デオキシＬ- マンニトール）を微生物酸化反応により１- デオキシＬ- フラクトースを生成する、図３の番号４１＝４８−３１のＢの反応である。
下記反応条件でＬ- ラムニトールを基質としてエンテロバクター属菌体ＩＫ７（（NITE BP-271）による脱水素酵素反応を行った。
〈反応条件〉
基質：５％Ｌ- ラムニトール
緩衝液：５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ９．０）
菌体濃度：Ａ６００_−４０
温度：３７℃
撹拌：１２０ｒｐｍ
空気流速：１．０Ｌ/ｍｉｎ
時間：１２時間
容量：１．０Ｌ
変換率：９０％
分離精製は下記分離条件で行った。
〈分離条件〉
システム：ワンパス分離システム
試料：３０％Ｌ- ラムニトールおよび１- デオキシＬ- フラクトース混合物
容量：３００ｍＬ
流速：６０ｍｌ／ｍｉｎ
Wait time：１２０ｍｉｎ
画分：タンク-Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ
結果：二つのRUNで純粋な１- デオキシＬ- フラクトースを得た。
図４９の（a）はＬ- ラムニトール、（b）は分離精製した１- デオキシＬ- フラクトースのＨＰＬＣ分析の結果である。図５０は分離精製した１- デオキシＬ- フラクトースの^１３C NMRスペクトルである。

［６- デオキシＤ- プシコースおよび６- デオキシＬ- タガトースの生産］
この反応は、１- デオキシＬ- アリトールおよび１- デオキシＬ- タリトールを微生物酸化反応により６- デオキシＤ- プシコースおよび６- デオキシＬ- タガトースを生成する、図３の番号４７＝３８−１１，２９＝２８−２７
６- デオキシＤ- プシコースと６- デオキシＬ- タガトースを生産するを行った。まず、１- デオキシＬ- プシコースを還元し１- デオキシＬ- アリトールと１- デオキシＬ- タリトールへ還元した〔図５１の（ａ）〕。これを分離しないで下記の反応条件でエンテロバクター属菌体ＩＫ７（NITE BP-271）を用いて酸化反応を行った。
〈反応条件〉
緩衝液： Tris（ｐＨ９．０）
基質：１％１- デオキシＬ- アリトールおよび
１- デオキシＬ- タリトール混合物
菌体：３０（Ａ_６００）
温度：３７℃
撹拌：１００ｒｐｍ
時間：１２時間
容量：１００ｍｌ
変換率：１００％
分離精製は下記分離条件で行った。
〈分離条件〉
システム：Dowex 50Ｃａ^＋2
column 100cm X2
試料：２０％１- デオキシＬ- アリトールおよび
１- デオキシＬ- タリトール反応混合物
容量：１０ｍｌ
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
Wait time：９０ｍｉｎ
画分：２．０ｍｌ／tube
結果：純粋な６- デオキシＤ- プシコースおよび６- デオキシＬ- タガトースを得た。
図５１のＨＰＬＣ分析結果が示すように、（ａ）１- デオキシＬ- アリトールおよび１- デオキシＬ- タリトールから、（ｂ）６- デオキシＤ- プシコースおよび６- デオキシＬ- タガトースをそれぞれから生産することができた。それぞれの分離精製した６- デオキシＤ- プシコース（ｃ）、６- デオキシＬ- タガトース（ｄ）のＨＰＬＣを示した。

［６- デオキシＬ- タガトースの生産］
この反応は、６- デオキシＬ- ガラクトースを異性化することにより６- デオキシＬ- タガトースを生成する、図３の番号６３−２７のＣの反応である。
Ｌ- フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）を下記反応条件でＤ−アラビノースイソメラーゼで異性化することにより、６- デオキシＬ- タガトースを生産した。
〈反応条件〉
基質：１０％Ｌ- フコース（６- デオキシＬ- ガラクトース）
酵素：固定化Ｄ−アラビノースイソメラーゼ
緩衝液：５０ｍＭグリシン-ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）
イオン：１ｍＭＭｎＣｌ_２
温度：４０℃
分離は下記方法で行った。
〈分離方法〉
Dowex 50W X2
ワンパス分離システム
図５２の（ａ）は反応後のＨＰＬＣであり、（ｂ）は分離精製したもの（６- デオキシＬ- タガトース）である。旋光度は＋０．９であった。その^１３C NMRスペクトルを図５３に示した。
本実施例の６- デオキシＬ- ガラクトースからの６- デオキシＬ- タガトースの生産は化８によってその反応が示される。

［６- デオキシＬ- タロースの生産］
この反応は、６- デオキシＬ- タガトースを異性化することにより６- デオキシＬ- タロースを生成する、図３の番号２７−６４のＣの反応である。
Ｌ−フコースから生産した６- デオキシＬ- タガトースにＬ−ラムノースイソメラーゼを作用させることで、６- デオキシＬ- タロースを生産した。
〈反応条件〉
基質：６- デオキシＬ- タガトース
酵素：固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼ
緩衝液：５０ｍＭグリシン-ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）
イオン：１ｍＭＭｎＣｌ_２
温度：４０℃
分離は下記方法で行った。
〈分離方法〉
クロマトグラフィー分離
図５４の（ａ）は反応後の反応混合物のＨＰＬＣであり、（ｂ）は分離精製したもの（６- デオキシＤ- タロース）である。（Ｃ）は分離精製した６- デオキシＤ- タロースの^１３C NMRスペクトルである。Ｌ−ラムノースイソメラーゼによって６- デオキシＬ- タロースを生産可能であった。
本実施例の６- デオキシＬ- タガトースからの６- デオキシＬ- タロースの生産は化９によってその反応が示される。

［６- デオキシＤ- アロースおよび６- デオキシＤ- アルトロースの生産］
この反応は、６- デオキシＤ- プシコースを異性化することにより６- デオキシＤ- アロースおよび６- デオキシＤ- アルトロースを生成する、図３の番号１１−５５，１１−５６のＣの反応である。
６- デオキシＤ- アリトールから生産した６- デオキシＤ- プシコースを原料として、下記反応条件の異性化反応によって６- デオキシアルドースを生産した。
〈反応条件〉
基質：１．０％６- デオキシＤ- プシコース
５００μｌ
緩衝液：５０ｍＭグリシン-ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）
５００μｌ
Ｌ−ラムノースイソメラーゼ：１００ｕｎｉｔｓ
ＭｎＣｌ_２：５０μｌ
温度：４２℃
時間：２４時間
変換率：４０（ｓ）：６０（ｐｓ）
図５５の（ａ）は基質として用いた６- デオキシＤ- プシコースであり、（ｂ）はＬ−ラムノースイソメラーゼを作用した後のＨＰＬＣである。この結果は、６- デオキシＤ- プシコースから、６- デオキシＤ- アルトロース、６- デオキシＤ- アロースを生産できることができた。

［６- デオキシＤ- タロースの生産］
この反応は、６- デオキシＤ- タガトースを異性化することにより６- デオキシＤ- タロースを生成する、図３の番号３−５２のＣの反応である。
Ｄ−フコースから生産した６- デオキシＤ- タガトースにＬ−リボースイソメラーゼを作用することで、６- デオキシＤ- タロースを生産することが明らかになった。
〈反応条件〉
基質：６- デオキシＤ- タガトース
酵素：固定化Ｌ−リボースイソメラーゼ
緩衝液：５０ｍＭグリシン-ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）
イオン：１ｍＭＭｎＣｌ_２
温度：３０℃
異性化反応の比は、６- デオキシＤ- タガトース：６- デオキシＤ- タロースは２：３であった。図５６はＬ−リボースイソメラーゼを作用した後の反応混合物のＨＰＬＣ分析結果である。
本実施例の６- デオキシＤ- タガトースからの６- デオキシＤ- タロースの生産は化１０によってその反応が示される。

［６- デオキシＬ- ガラクチトールの生産］
この反応は、６- デオキシＬ- ガラクトースを還元することにより６- デオキシＬ- ガラクチトールを生成する、図３の番号６３−４６のＤの反応である。
Ｄ−フコース（６- デオキシＤ−ガラクトース）を還元して〔Ｄ−フコース１％、ラネーニッケル触媒２０ｍｌ、全部で５００ｍｌの組成物〕、Ｄ−フシトール（６- デオキシＤ−ガラクチトール）を生産した。図５７の（ａ）は還元前のＤ−フコース、（ｂ）は還元後の６- デオキシＬ- ガラクチトールのＨＰＬＣ分析結果である。６- デオキシＬ- ガラクチトールの旋光度は＋１．７であった。６- デオキシＬ- ガラクチトールのの^１３C NMRスペクトルを図５８に示した。
本実施例の６- デオキシＬ- ガラクトースからの６- デオキシＬ- ガラクチトールの生産は化１１によってその反応が示される。

［６- デオキシＤ- ガラクチトールの生産］
この反応は、６- デオキシＤ- ガラクトースを還元することにより６- デオキシＤ- ガラクチトールを生成する、図３の番号５１−３４のＤの反応である。
Ｌ−フコース（６- デオキシＬ−ガラクトース）を還元して〔Ｌ−フコース１％、ラネーニッケル触媒２０ｍｌ、全部で５００ｍｌの組成物〕、Ｌ−フシトール（６- デオキシＬ−ガラクチトール）を生産した。図５９の（ａ）は還元前のＬ−フコース、（ｂ）は還元後の６- デオキシＤ- ガラクチトールのＨＰＬＣ分析結果である。６- デオキシＬ- ガラクチトールの旋光度は−１．７であった。６- デオキシＤ- ガラクチトールのの^１３C NMRスペクトルを図６０に示した。
本実施例の６- デオキシＤ- ガラクトースからの６- デオキシＤ- ガラクチトールの生産は化１２によってその反応が示される。

［Ｌ- ラムニトールの生産］
この反応は、Ｌ- ラムノースを水素添加法で還元することによりＬ- ラムニトールを生成する、図３の番号５８−４１のＤの反応である。
下記反応条件でＬ- ラムノース（６- デオキシＬ−マンノース）を還元して、Ｌ- ラムニトール（６- デオキシＬ−マンニトール）を生産した。
〈反応条件〉
基質：５％Ｌ- ラムノース
触媒：ニッケル
Ｈ_２圧：１．２ＭPa
温度：５０℃
撹拌：７００ｒｐｍ
時間：１２時間
容量：５００ｍｌ
変換率：１００％
図６１の（ａ）は還元前のＬ- ラムノース、（ｂ）は還元後のＬ- ラムニトールのＨＰＬＣ分析結果である。このように容易にＬ- ラムニトールを生産できることができた。

［Ｌ- ラムニトールの生産］
この反応は、１- デオキシＬ- フラクトースを水素添加法で還元することにより１- デオキシＬ- マンニトールと１- デオキシＬ- ソルビトールを生成する、図３の番号３１−３２、３１−４８のＤの反応である。
下記反応条件で１- デオキシＬ- フラクトースを還元して、１- デオキシＬ- マンニトールと１- デオキシＬ- ソルビトールの生産を行った。常法どおりのラネーニッケルによる方法によって、容易に両ポリオールをほぼ等量生産できることができた。
〈反応条件〉
基質：５％１- デオキシＬ- フラクトース
触媒：ニッケル
Ｈ_２圧：１．２ＭPa
温度：５０℃
撹拌：７００ｒｐｍ
時間：７時間
容量：５００ｍｌ
変換率：１００％
図６２は還元後の１- デオキシＬ- マンニトールと１- デオキシＬ- ソルビトール混合物のＨＰＬＣ分析結果である。このように容易にＬ- ラムニトールを生産できることができた。

［１- デオキシＬ- アリトールおよび１- デオキシＬ- タリトールの生産］
この反応は、１- デオキシＬ- プシコースを水素添加法で還元することにより１- デオキシＬ- アリトールおよび１- デオキシＬ- タリトールを生成する、図３の番号１９−４２、１９−２０のＤの反応である。
１- デオキシＬ- フラクトースをエピ化して生産した、１- デオキシＬ- プシコースを下記反応条件で還元して、１- デオキシＬ- アリトールと１- デオキシＬ- タリトールの生産を行った。常法どおりのラネーニッケルによる方法によって、容易に両ポリオールをほぼ等量生産することができた。図６３は還元後の１- デオキシＬ- アリトールと１- デオキシＬ- タリトール混合物のＨＰＬＣ分析結果である。
〈反応条件〉
基質：５％１- デオキシＬ- プシコース
触媒：ニッケル
Ｈ_２圧：１．２ＭPa
温度：５０℃
撹拌：７００ｒｐｍ
時間：８時間
容量：５００ｍｌ
変換率：１００％
両デオキシポリオールをそのままを基質として、酢酸菌による酸化によって１- デオキシＬ- プシコースおよび６- デオキシＤ- タガトースを生産することができた。

本発明で対象としているものは、単糖、である。単糖の工業的利用においては各種の食品、化粧品、医薬品産業における、素材として広く利用されている。単糖における研究開発の現状をみると、自然界に存在量の多い、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フラクトースなどを利用することが主である。そのため、この分野の新しい発展を進めるためには、これまでその存在量が少ない「希少糖」の生産が求められていた。それを可能にしたのが、図４で示されているイズモリングを戦略とした全単糖の生産法の確立であった。

単糖は図４で示されているように、アルドース、ケトース、およびポリオールの全体の総数は５９である。その中で十分量を生産可能であり、工業的に利用可能な単糖の数は限られている。単糖の優位性は、炭素に結合しているＯＨ基の配位がそれぞれ特有の構造をもっており、キラルな構造を持つ医薬品等の有用な化合物の合成原料として大変重要であることである。その有用性は理解されているが、その生産法が確立されていないということが大きな障害となっている。有機化学的にはキラルな構造を持つことが優位であるが、有機化学的手法によって、特定のキラルな構造を持つものを合成することは極めて困難であるという関係にある。すなわち、有機化学的な医薬品等の合成には重要であるということは、有機化学的な手法ではキラルな特定の構造を持つ単糖を合成することが非常に困難であることを意味している。

これらの単糖の研究開発における現状を背景に、バイオテクノロジーの手法を駆使して図４のイズモリングの戦略によってＤ−プシコース、Ｄ−アロースをはじめとした希少糖の生産が可能となっている。これまで利用できなかった単糖の特定のキラル構造を、有機化学的な原料として利用可能となって来ている。

本発明においては、従来の図４において対象とした５９種の単糖ではなく、新たに図１に示した炭素数６のヘキソースの１あるいは６をデオキシ化した総数４８の新しい糖を対象としている。図６４にデオキシイズモリングで生産可能な、全デオキシ糖のリストを示した。１デオキシケトースが８種、６デオキシケトースが８種、６デオキシアルドースが１６種、１および６デオキシポリオールが１６種（ポリオールの場合は図６４に示したように、二種類の名前として表示しているが１８０度回転させると重なることからも同一物質である）であり総計４８種である。これらのデオキシ糖は従来の単糖よりも、さらに有機化学的な手法による方法では合成が困難である。それらをデオキシイズモリングの戦略を用いて、全部を反応で連結し合成することができたものである。

本発明のデオキシイズモリングの反応を以下に整理して示す。イズモリングの反応と同様に、エピ化、酸化反応、異性化反応、還元反応をデオキシイズモリングにおいても用いる反応を行うので、それぞれに関してデオキシ糖に関する結果を説明する。
１）エピメラーゼ反応
この図４において示しているように、ケトースの炭素３位のＯＨ基をエピ化することで新しい単糖をはじめて生産可能としたＤＴＥ（Ｄ−タガトース３−エピメラーゼ）を用いることで全５９種の政略を確立できた。本発明においての最大の課題の一つが、このＤＴＥが、１あるいは６デオキシケトースに活性を持つかどうかであった。研究の結果、ＤＴＥは１および６デオキシケトースの全部に作用することを確認した。このことが、本発明における重要な発見となった。これらの反応は図３における、番号２−３、番号６−７、番号１０−１１、番号１４−１５、番号１８−１９、番号２２−２３、番号２６−２７、および番号３０−３２の８つのエピ化反応である。これらの反応に関しては全て反応することを確認できた。
２）酸化反応
イズモリングをリングとして完成し、全単糖を生産するにはポリオールが大きな役割を果たす。すなわちポリオールを微生物によって、その２位を酸化することでケトースを生産する工程が必須である。本発明すなわちデオキシイズモリングによるデオキシ糖の生産においても、１および６デオキシポリオールを微生物反応を用いて酸化することによって、１および６デオキシケトースを生産することが必要である。この反応は微生物反応であるので、デオキシポリオールが微生物の菌体内に入り、そこで主にポリオール脱水素酵素によって対応するデオキシケトースへと酸化反応が行われる必要である。この過程がイズモリングと同様に、デオキシイズモリングにおいても反応が進行することが必須である。種々の検討の結果、１位がデオキシ化されたポリールを基質として用いること、さらに適切な微生物を選択し、反応条件を確立することでそれぞれ、１あるいは６デオキシケトースを生産できることを確認することができた。この反応は全く新しい反応であり、微生物が１および６デオキシを特異的に酸化する経路、すなわち、デオキシポリオールを菌体内に取り込み、ポリオール脱水素酵素によって２位あるいは５位を特異的に酸化することで、１あるいは６デオキシケトースを生産する経路が存在することを確認できた。このことによって、デオキシポリオールを基質として、１あるいは６デオキシケトースをデオキシイズモリング戦略に従って生産可能であることを確認することができた。
３）異性化反応
イソメラーゼ反応はアルドースの炭素１と炭素２の間における、酸化還元反応であり、従来のイソメラーゼ反応においてはケトースから各種のアルドースを生産することが可能であった。本発明においては、ＤＴＥにおいて記載したとおりにイソメラーゼが、６位がデオキシ化されたアルドースおよびケトースに作用するかどうかが重要な鍵となっていた。本発明において、種々の６デオキシケトースを用いたイソメラーゼ反応を検討した結果、イズモリングにおいて用いた各種イソメラーゼがデオキシイズモリングにおいてもその活性を持つことが確認できた。このことによって各種の６デオキシアルドースを６デオキシケトースから生産できることも明らかにすることが可能となった。
４）還元反応
ケトースをポリオールへ還元する反応は、イズモリングにおいては酵母を用いた方法および、水素を用いた有機化学的な反応が利用できる。工業的な利用および確実な反応としては、現在のところニッケル触媒を用いた水素を用いた方法を用いて、１および６デオキシケトースの還元が可能であれば有利である。このニッケル触媒を用いた還元反応について、本発明においては確認した。従来の方法による水素添加法による、１および６デオキシケトースから、それぞれに対応する１６種類の糖アルコールへと還元できることを明らかにできた。また、６デオキシアルドースの還元反応についても、同様に効率よく進行することを確認できた。

この結果が示すように、ＤＴＥが１および６デオキシケトースに反応すること、微生物がデオキシポリオールを目的とするデオキシケトースへ酸化できること、イソメラーゼが６デオキシケトースを対応する活性を持ち６デオキシアルドースへ異性化できること、還元反応が通常のケトースと同様に１および６デオキシケトースの生産へ適用できることを確認することができた。

これらの結果は、これまで有機化学的手法では非常に困難であった、１および６デオキシ糖がイズモリングの手法によって生産することが可能であることを確認できたことを明確に示している。すなわち、これは多くのキラルな構造を持つ単糖をデオキシイズモリングという新たな生産戦略によって、これまで生産することも、また、性質さえも全く不明であった多くのデオキシ糖を、体系的に全てを生産できる方法を確立できたことを示している。

本発明によって得られた成果は、食品産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。

Claims

ケトヘキソースの１- もしくは６- デオキシ体に作用し、遊離のデオキシ体の糖質のままでエピマー化することによって、３位をエピマー化したデオキシ体を生成するシュードモナスチコリＳＴ−２４（ＦＥＲＭＢＰ−２７３６）から得ることのできるデオキシケトヘキソース異性化酵素を用い、原料である１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースの３位をエピマー化し、目的物である、対応する１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造することを特徴とするデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
デオキシケトヘキソース異性化酵素が、１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応する１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを生成する、請求項１のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
デオキシケトヘキソース異性化酵素が、下記の理化学的性質を有する、請求項１または２のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
記
（１）１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソース、および１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応する１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソースおよび１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースを生成する。
（２）Ｄ- ケトヘキソース３- エピメラーゼ活性の至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
（３）Ｄ- ケトヘキソース３- エピメラーゼ活性の至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
（４）紫外線吸収スペクトル２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。
（５）分子量４１，０００±３，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）。
上記誘導体がデオキシケトヘキソースを還元したものであり、目的物である、１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを還元し、その誘導体である、対応する１- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは１- デオキシＬ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコールを製造する請求項１、２または３のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
上記誘導体がデオキシケトヘキソースを還元し、さらに酸化したものであり、目的物である、１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを還元し、その誘導体である、対応する１- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは１- デオキシＬ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコールを製造し、さらにその１- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは１- デオキシＬ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコールを酸化し、対応する６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造する請求項１、２または３のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
上記誘導体が６- デオキシケトヘキソースを異性化したもので、目的物である、６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースに、アルドースイソメラーゼを作用させて、その誘導体である、対応する６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースを製造する請求項１、２または３のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
上記誘導体がデオキシケトヘキソースを異性化し、さらに還元したものであり、目的物である、６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースに、アルドースイソメラーゼを作用させ、その誘導体である、対応する６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースを製造し、さらにその６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースを還元して、対応する６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコール製造する請求項１、２または３のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
酵素を作用させる原料である６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースが、６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースにアルドースイソメラーゼを作用させ、対応する６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造したものであり、次いでそれをエピマー化して、目的物である、対応する６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造する請求項１、２または３のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
原料である１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースが、１- デオキシＤ- 糖アルコールまたは６- デオキシＤ- 糖アルコールまたは１- デオキシＬ- 糖アルコールまたは６- デオキシＬ- 糖アルコールを酸化し、対応する１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造したものであり、次いでそれをエピマー化して、目的物である、対応する１- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＤ- ケトヘキソースまたは１- デオキシＬ- ケトヘキソースまたは６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造する請求項１、２または３のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
上記の酸化反応または還元反応に、ポリオールデヒドロゲナーゼを用いる、またはラネーニッケル等を触媒として用いる水素添加法を用いる請求項４または５または９のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
上記の酸化反応に、脱水素酵素生成能を有するエンテロバクター属菌体ＩＫ７（（NITE BP-271）を用いる請求項５または９の方法。
原料である１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソース、または１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースが、６- デオキシＤ- アルドヘキソースまたは６- デオキシＬ- アルドヘキソースにアルドースレダクターゼを作用させるか、あるいは有機化学的な還元反応により、対応する６- デオキシＤ- 糖アルコール、または６- デオキシＬ- 糖アルコールを製造し、次いでこれを酸化し、対応する１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソース、または１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造したものであり、次いでそれをエピマー化して、目的物である、対応する１- または６- デオキシＤ- ケトヘキソース、または１- または６- デオキシＬ- ケトヘキソースを製造する請求項１、２または３のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
上記の還元反応に、アルドースレダクターゼを用いる、または化学的還元方法を用いる請求項５または１０のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
上記の異性化反応に、Ｌ- ラムノースイソメラーゼあるいはその他のアルドースイソメラーゼを用いる請求項６、７または８のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。
上記の異性化反応に、Ｌ- ラムノースイソメラーゼあるいはその他のアルドースイソメラーゼを用い、６- デオキシＬ- プシコースを６- デオキシＬ- アルトロースに異性化する請求項６、７または８のデオキシケトヘキソースおよびその誘導体の製造方法。