KR20090079926A

KR20090079926A - 파네산과 파네산 유도체 함유 연료 조성물 및 이를 제조하는 방법, 그리고 사용하는 방법

Info

Publication number: KR20090079926A
Application number: KR1020097009520A
Authority: KR
Inventors: 네일 스테펜 레닌저; 데렉 제이. 맥피
Original assignee: 아미리스 바이오테크놀로지스 인코퍼레이티드
Priority date: 2006-10-10
Filing date: 2007-10-10
Publication date: 2009-07-22
Also published as: NI200900047A; HK1127510A1; SV2009003208A; AU2007308137B2; CO6170371A2; CA2665198A1; EP2084249B1; US20080083158A1; AU2007308137A1; US20080098645A1; US7399323B2; MX2009003715A; WO2008045555A9; HN2009000616A; EP2084249A2; WO2008045555A2; JP2010506037A; JP5528110B2; EP2084249A4; KR101543777B1

Abstract

본 발명의 연료 조성물은 파네산 및/또는 파네산 유도체 그리고 통상적인 연료 성분을 포함하는데, 이 연료 성분은 디젤 연료, 제트 연료, 등유 또는 휘발유 중에서 선택한다. 이 파네산 또는 파네산 유도체는 연료 조성물 속의 연료 성분 또는 연료 첨가제로 쓰일 수 있다. 이 연료 조성물은 통상적인 연료 첨가제를 더 함유할 수 있다. 이 연료 조성물을 제조하는 방법과 이용하는 방법도 개시한다.

Description

파네산과 파네산 유도체 함유 연료 조성물 및 이를 제조하는 방법, 그리고 사용하는 방법{Fuel Compositions Comprising Farnesane and Farnesane Derivatives and Method of Making and Using the Same}

본 발명은 다른 내용과 함께 디젤 연료, 제트 연료 등의 연료 조성물을 망라한다. 특히 본 발명은 파네산을 함유하는 조성물과 이 조성물을 제조하고 이용하는 방법을 망라한다. 일부 실시 태양에서 본 발명은 적어도 일부분을 미생물로부터 효율 높게 제조할 수 있는, 파네산을 함유하는 안정적인 연료 조성물을 포함한다. 일부 태양에서 본 발명은 생명공학으로 가공한 파네산을 높은 농도로 함유하는 연료 조성물을 포함한다.

본 출원은 2006년 10월 10일에 출원한 미국 특허 임시 출원 제60/850,881호와 2006년 11월 21일에 출원한 제60/860,854호에 대하여 미국 특허법 제119조(e)에 따른 이익을 주장하는데, 이들 내용 전부는 본 명세서에 포함되어 있다.

유가 상승, 곧 당면할 공급의 제약, 늘어나는 전지구적 이산화탄소 배출에 대한 염려 때문에 생물학적으로 제조한 연료("바이오연료")는 최근 수십년간 상당한 주목을 받아 왔다. 석유와 석탄과 같은 재생 불가능한 천연 에너지원과는 달리, 바이오연료는 재생 가능한 천연 자원으로부터 유래하는데, 이러한 자원은 살아 있는 생명체와 그들의 대사 부산물인 것이 전형적이다.

여태까지 디젤 기관 등의 내연기관 연료로 적합한 바이오연료는 대개 식물성 기름에서 유래하였다. 이른바 제1세대 "바이오디젤"은 전형적으로 식물성 기름의 에스테르 교환 반응에서 형성된 C₁₆~C₁₈ 지방산 메틸 에스테르였다. 최근에는 제2세대 "바이오디젤"을 WO2006/075057에서 개시하는 NExBTL 공정 등의 새로운 공정에 의하여 생산하고 있는데, 이 공정에서는 식물성 기름과 동물성 지방에 수소를 첨가하여 해당하는 알칸 또는 파라핀을 생산한다. 출발 물질의 특성상 두 방법 다 복잡하고 이질적인 생성물들의 혼합물을 낳는데, 이 혼합물은 배치(batch)마다 다를 수 있다. 그 때문에 연료 조성물 제조를 위한 연료 성분과 연료 첨가제에 대한 수요, 그리고 디젤 기관과 제트 기관 등의 내연기관에 쓰일, 신뢰성 있고 재현성 있게 제조할 수 있는 연료 성분에 대한 수요가 남아 있다.

발명의 요약

본 명세서에서는 이소프레노이드와 그 유도체를 함유하는 연료 조성물, 연료 성분 또는 연료 첨가제와 이들을 제조하는 방법, 이용하는 방법을 개시한다. 이들 조성물의 구현예는 전술한 수요를 만족할 수 있다고 믿고 있다. 더 구체적으로 이소프레노이드와 그 유도체를 상기 연료 조성물의 연료 성분으로 쓸 수 있다. 일부 실시 태양에서는 상기 이소프레노이드와 그 유도체를 연료 조성물 그 자체, 상기 연료 조성물의 주성분 또는 보조 성분으로 쓸 수 있다. 이소프레노이드와 그 유도체는 생명공학으로 가공한 미생물을 비롯한 미생물로부터 제조할 수 있다. 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물은 가솔린 기관, 디젤 기관과 제트 기관 등의 내연기관용 연료로 쓰일 수 있다.

몇몇 태양에서 본 발명은 생명공학으로 가공한 연료 성분을 하나 이상 함유하는 디젤 연료를 포함한다. 일부 태양에서는 본 발명이 생명공학으로 가공한 연료 성분을 하나 이상 함유하는 제트 연료를 포함한다. 이러한 구현예에서 상기 생명공학으로 가공한 연료 성분은 생명공학으로 가공한 연료 성분을 생산할 수 있는 어떠한 미생물이 생산한 것이라도 좋은데, 예를 들어 유전공학 처리된 미생물, 야생형 미생물 또는 이들 중 선택된 미생물주(株)가 있다. 몇몇 태양에서는 상기 생명공학으로 가공한 연료 성분이 본 명세서에서 개시하는 이소프레노이드 또는 그 유도체이다.

몇몇 태양에서는 상기 생명공학으로 가공한 연료 성분을 쉽게 입수할 수 있고, 재생 가능한 재료로부터 얻을 수 있다. 놀랍게도, 본 발명은 따라서 쉽게 입수할 수 있고, 재생 가능한 에너지원과 에너지 생산을 위하여 이를 사용하는 방법을 제공한다. 몇몇 태양에서는 상기 생명공학으로 가공한 연료 성분을 단당류(간단한 당) 또는 이당류 등의 당으로부터 얻을 수 있다.

몇몇 다른 태양에서는 상기 생명공학으로 가공한 연료 성분을 쉽게 입수할 수 있는, 아세트산화물이나 글리세롤 등의 비발효성(non-fermentable) 탄소원으로부터 얻을 수 있다.

용어의 정의

ASTM 인터내셔널에서 발행하는 ASTM D 975 규격은 미국에서 쓰이는 서로 다른 등급의 디젤 연료에 대하여 몇 가지 최소 허용 요건을 정하고 있다. 예를 들어, 등급 번호 2-D 초저황 디젤 연료는 최대 황 함량이 (ASTM D 2622 시험에 따를 때) 중량의 0.05%, 최대 재(ash) 함량이 (ASTM D 482 시험에 따를 때) 중량의 0.01%, 최저 세탄가(cetane number)가 (ASTM D 6079 시험에 따를 때) 40, ℃ 40도에서의 점도가 (ASTM D 445 시험에 따를 때), 1.9 cSt to 2.4 cSt이고, 최소 인화점이 52℃일 것을 기대할 수 있다. 일본과 유럽은 비슷한 등급의 디젤 연료에 대하여 미국의 그것과 비슷한 규격을 두고 있다. 예를 들어 일본의 JIS K 2204 등급 번호 2의 디젤 연료는 ℃ 40도에서 최소 점도가 2.0 cSt, 최대 황 함량이 중량의 0.05 %, 최소 세탄가가 45일 것으로 기대할 수 있다. 비교의 대상으로, 유럽의 CEN 590, 등급 A-F인 디젤 연료는 ℃ 40도에서의 점도가 2.0 cSt 내지 4.5 cSt, 최대 황 함량이 중량의 0.05% 이고, 최소 세탄가가 49일 것으로 기대할 수 있다. 몇몇 실시 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물이 상기 모든 특성 전부 또는 그 중 적어도 하나를 만족한다.

ASTM 인터내셔널이 발행하는 ASTM D 1655 규격은 제트 A 연료(jet A)에 대하여 몇 가지 최소 요건을 규정하고 있다.

"재 함량(ash content)"이란 디젤 연료를 ASTM D 482 소정의 조건에서 연소하였을 때의 잔류 함량을 가리킨다.

"바이오디젤"이란 식물성 기름이나 동물 지방 등의 생물학적 연료원에서 유래한 여러 가지 디젤 연료를 가리킨다. 바이오디젤은 주로 지방산 메틸 에스테르를 비롯한 알킬 에스테르의 혼합물인데, 지방산 메틸 에스테르는 기름과 메탄올의 혼합물의 에스테르 교환 반응으로부터 유래한다. 대두유가 가장 큰 디젤 연료원이지만 다른 식물성 기름이나 동물 지방도 연료원이 될 수 있다.

"생명공학으로 가공한 연료 성분(bioengineered fuel component)"이란 적어도 그 일부분이 고세균류, 세균류, 진행세포를 포함하는 숙주세포에 의하여 제조된 연료 성분을 가리킨다.

"바이오연료"란 바이오매스, 즉 최근에 살았던 생명체나 그들의 대사 부산물, 예를 들어 소의 똥에서 유래한 모든 연료를 가리킨다. 바이오연료는 석유, 석탄과 핵연료 등의 다른 천연 자원과 달리 재생 가능 에너지원이다.

"C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질"이란 파네실 피로인산(farnesyl pyrophosphate)("FPP")이거나 FPP에서 유도할 수 있는 화합물을 가리킨다.

"세탄가(cetane number)"란 연료가 ASTM D 613 소정의 조건 하에서 얼마나 쉽게 타기(자기 점화) 시작하느냐의 척도이다. 세탄가가 높은 연료는 기통에 주입 후 곧 연소하기 시작하고 연소 지연 시간이 짧다. 역으로 세탄가가 낮은 연료는 자기 점화에 저항하며 연소 지연 시간이 길다.

"흐림점(cloud point)"이란 ASTM D 2500 소정의 조건 하에서 냉각 중인 연료 시료에서 왁스 결정(wax crystal)의 흐린 기운이 처음 나타나는 온도이다.

"저온 필터 막힘점(cold filter plugging point, CFPP)"이란 연료가 소정의 시간 동안에 와이어 메시(wire mesh)를 지날 수 없게 되는 첫 온도점을 대략적으로 가리키는 척도를 일컫는다. ASTM D 6371 시험은 연료 시스템 속 필터를 통한 식은 연료의 흐름을 모사한다. 따라서 CFPP는 연료의 동역학적 저온 흐름 특성의 척도이다.

"디젤 연료"는 연료를 고압축된 고온의 공기 속에서 점화하는 디젤 기관에 적합한 연료를 가리킨다. 디젤 연료의 등급은 광범위한 분자량에 걸친 탄화수소를 포함한다. 몇몇 태양에서는 본 명세서의 디젤 연료에 적어도 15개의 탄소를 가지는 탄화수소가 포함된다. 다른 태양에서는 이 디젤 연료에 적어도 15개의 탄소를 가지는 탄화수소, 적어도 3개의 탄소를 가지는 알코올, 적어도 10개의 탄소를 가지는 지방산 및 이들의 혼합물이 포함된다. 디젤 연료의 종류에는 석유 디젤, 바이오디젤, 생명공학으로 가공한 디젤 또는 이들의 혼합물이 포함되지만 여기에 한정되지는 않는다. 디젤 연료는 또한 셰일유(shale oil) 등의 합성 연료나 합성 가스 또는 석탄 액화로부터 얻는 것과 같은 피셔-트롭시(Fischer-Tropsch) 연료로부터도 얻을 수 있다.

파네산(farnesane)은 식 (III)의 구조를 지닌 화합물 또는 그 입체이성질체를 일컫는다.

(III)

일부 태양에서 파네산에는 실질적으로 순수한 파네산의 입체이성질체가 포함된다. 다른 태양에서는 파네산에 거울상 이성질체와 부분 입체이성질체 등의 파네산 입체이성질체의 혼합물도 포함된다. 또 다른 실시 태양에서는 파네산 혼합물 속 각 입체이성질체의 양이 서로 독립적으로 파네산 혼합물 총 중량에서 약 0.1 wt% 내지 약 99.9 wt%, 약 0.5 wt% 내지 약 99.5 wt%, 약 1 wt% 내지 약 99 wt%, 약 5 wt% 내지 약 95 wt%, 약 10 wt% 내지 약 90 wt%, 약 20 wt% 내지 약 80 wt%이다.

"알파-파네센(alpha-farnesene)"은 다음 식의 화합물 또는 그 입체이성질체를 일컫는다.

몇몇 태양에서 알파-파네센에는 실질적으로 순수한 알파-파네센의 입체이성질체가 포함된다. 다른 실시 태양에서 알파-파네센에는 입체이성질체의 혼합물, 예를 들어 시스-트랜스 이성질체가 포함된다. 또 다른 태양에서는 알파-파네센 혼합물 속 각 입체이성질체의 양이 서로 독립적으로 알파-파네센 혼합물 총 중량에서 약 0.1 wt% 내지 약 99.9 wt%, 약 0.5 wt% 내지 약 99.5 wt%, 약 1 wt% 내지 약 99 wt%, 약 5 wt% 내지 약 95 wt%, 약 10 wt% 내지 약 90 wt%, 약 20 wt% 내지 약 80 wt%이다.

"베타-파네센(beta-farnesene)"은 다음 식의 화합물 또는 그 입체이성질체를 일컫는다.

몇몇 태양에서 베타-파네센에는 실질적으로 순수한 베타-파네센의 입체이성질체가 포함된다. 다른 실시 태양에서 베타-파네센에는 입체이성질체의 혼합물, 예를 들어 시스-트랜스 이성질체가 포함된다. 또 다른 태양에서는 베타-파네센 혼합물 속 각 입체이성질체의 양이 서로 독립적으로 베타-파네센 혼합물 총 중량에서 약 0.1 wt% 내지 약 99.9 wt%, 약 0.5 wt% 내지 약 99.5 wt%, 약 1 wt% 내지 약 99 wt%, 약 5 wt% 내지 약 95 wt%, 약 10 wt% 내지 약 90 wt%, 약 20 wt% 내지 약 80 wt%이다.

"인화점(flash point)"이란 디젤 연료의 증기에 발화원을 가하여 ASTM D 93 소정의 조건 하에서 발화하는 가장 낮은 온도를 가리킨다.

"연료"는 하나 이상의 탄화수소, 하나 이상의 알코올, 하나 이상의 지방산 또는 이들의 혼합물을 가리킨다. 바람직하게는 액체 탄화수소를 사용한다. 연료는 가역 엔진(예를 들어 가솔린 기관과 디젤 기관), 반켈 기관(Wankel engine), 제트 기관, 일부 로켓 기관, 미사일 기관과 가스 터빈 기관 등의 내연기관을 구동하는데 쓸 수 있다. 몇몇 태양에서는 연료가 전형적으로 알칸, 사이클로알칸과 방향족 탄화수소 등의 탄화수소 혼합물을 포함한다. 몇몇 태양에서는 연료가 본 명세서에서 개시하는 C₁₅ 이소프레노이드 화합물을 하나 이상 함유한다.

"연료 첨가제(fuel additive)"란 연료의 성질을 변화, 예를 들어 엔진 성능, 연료 취급성, 연료 안정성 또는 오염 물질 통제력을 향상시키기 위하여 연료에 부가하는 화학 물질 성분과 같은 보조 성분을 가리킨다. 첨가제의 종류로는 항산화제, 열 안정성 개선제, 세탄가 개선제, 안정제, 저온 흐름 개선제, 연소 개선제, 소포제, 연무(煙霧) 방지제(anti-haze additive), 부식 억제제, 윤활성 개선제, 결빙(icing) 방지제, 인젝터 청정용 첨가제, 연기 억제제, 공기 저항 감소제, 금속 불활성제, 분산제, 세제, 항유화제(demulsifier), 염료, 표지 물질(marker), 정전기 방전제, 살생물제 및 이들의 조합을 들 수 있지만 여기에 한정되지는 않는다. "통상적인 첨가제(conventional additive)"란 앞서 기술한 것 등과 같이 당업자에게 알려져 있는 연료 첨가제를 가리키며 본 발명의 이소프레노이드 화합물이 아닌 것을 말한다.

"연료 조성물"이란 연료 성분을 둘 이상 함유하는 연료를 가리킨다.

"연료 성분(fuel component)"이란 연료 조성물을 조제하는데 쓰이는 모든 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 가리킨다. 여기에는 "주연료 성분"과 "보조 연료 성분"이 있다. 연료 조성물은 주연료 성분을 적어도 부피로 50% 함유하고 있고 보조 연료 성분은 50% 아래로 함유하고 있다. 연료 첨가제는 보조 연료 성분이다. 본 명세서에서 개시하는 이소프레노이드는 단독으로 또는 다른 연료 성분과 섞인 혼합물로서 주성분 또는 보조 성분이 될 수 있다.

"이소프레노이드(isoprenoid)"와 "이소프로노이드 화합물"은 본 명세서에서 서로 바꿔 쓸 수 있고 이소펜텐일 디인산(isopentenyl diphosphate,("IPP"))에서 유도할 수 있는 화합물을 가리킨다.

"초기 끓는점(initial boiling point)"과 "최종 끓는점(final boiling point)"은 시료를 점차 더 높은 온도로 가열하여 뽑아낼 수 있는 시료 분획에 관련된 증류 곡선 상의 점들을 가리킨다. 초기 끓는점은 응축기(condenser)에서 나오는 첫번째 액체 방울의 끓는점이며 최종 끓는점은 응축기에서 나오는 마지막 액체 방울의 끓는점이다. 시료가 한 성분으로 이루어진 경우 초기와 최종 끓는점은 동일하며 "끓는점"이라고 일컫는다. 연료의 증류 곡선을 결정하는 일반적으로 받아들여진 절차는 ASTM 표준 D 86이다.

"제트 연료"는 제트 기관에 쓰기에 적합한 연료를 가리킨다.

"등유(kerosene)"는 ("원유"로도 알려진) 석유의 특정 분별 증류물로서 일반적으로 대기압 하에서 150℃~275℃ 사이인 것을 가리킨다. 원유는 주로 파라핀계, 나프텐계, 방향족 탄화수소로 이루어져 있다.

"윤활성(lubricity)"이란 ASTM D 6079 소정 조건 하에서 고압 굴림 접촉(rolling point contact)하는 금속과 금속 사이의 접촉 도중에 엔진의 구성 요소들을 더 효과적으로 마모로부터 지켜 주는 디젤 연료 능력의 척도를 가리킨다.

"석유 디젤(petrodiesel)"이란 석유의 특정 분별 증류물로서, 일반적으로 대기압 하에서 120℃~380℃ 사이인 것을 가리킨다. 다른 태양에서는 석유 디젤이 1기압 하에서 150℃~370℃ 사이인 분별 증류물을 가리킨다.

"유동점(pour point)"이란 연료를 용기에서 따르거나 꺼낼 수 있는 가장 낮은 온도, 또는 튜브와 관을 통하여 흘려 보낼 수 있는 가장 낮은 온도에 관한 대략적인 척도를 가리키는데, ASTM D 97 소정의 조건 하에서 측정한다. 유동점은 추운 기후권에서 연료의 유용성과 이용 가능성을 결정한다.

"실질적으로 순수한" 화합물인 조성물이란 하나 이상의 다른 화합물을 실질적으로 지니지 않는 조성물, 즉 전체 조성물 중량 기준으로 상기 화합물을 80% 넘게, 90% 넘게, 95% 넘게, 96% 넘게, 97% 넘게, 98% 넘게, 99% 넘게, 99.5% 넘게, 99.6% 넘게, 99.7% 넘게, 99.8% 넘게 혹은 99.9% 넘게 지니는 조성물이거나 상기 하나 이상의 다른 화합물을 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만으로 포함하는 조성물을 가리킨다.

어느 화합물을 "실질적으로 가지지 않는" 조성물이란 전체 조성물 중량 기준으로 상기 화합물을 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만으로 포함하는 조성물을 가리킨다.

전술한 정의에 덧붙여 본 명세서에서 기술하는 몇 가지 화합물은 하나 이상의 이중결합을 가지고 있어서, 시스-이성질체, 트랜스-이성질, E-이성질체, Z-이성질체 등 하나 이상의 입체이성질체로 존재할 수 있다. 몇몇 태양에서는 이러한 화합물이 개별 입체이성질체로서 다른 입체이성질체를 실질적으로 가지지 않는 화합물로 존재한다. 다른 일부 태양에서는 이들 화합물이 여러 가지 입체이성질체의 혼합물이다.

"Tx"는 연료 조성물 원래 부피 중 x%가 ASTM D-86 기준에 따라 증류된 온도를 가리키며, 이 기준은 본 명세서의 참고 문헌이다. 예를 들어, "T10", "T50"과 "T90"은 연료 조성물의 원래 부피 중 각각 10%, 50%, 90%가 ASTM D 86 기준에 ㄸ따라 증류된 증류 온도를 가리킨다. "T10", "T50"과 "T90"은 각각 10 vol% 온도, 50 vol% 온도, 90 vol% 온도로도 알려져 있다.

이하 본 명세서의 기술에서 개시하는 모든 숫자는 "약" 또는 "대략"이라는 단어가 그와 결부되어 있는지를 막론하고 대략적인 값이다. 숫자는 1%, 2%, 5% 혹은 때로는 10에서 20% 변화할 수 있다. 하한값 R^L과 상한값 R^U가 있는 수치 범위를 개시할 때마다 이 범위에 속하는 모든 숫자는 구체적으로 개시된 것이다. 특히 이 범위에 속하는 다음 숫자가 구체적으로 개시된 것인데, R = R^L + k×(R^U-R^L)로서, 여기서 k는 1에서 100% 범위로 1%씩 늘어나는 변수인데, 즉 k는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, ……, 50%, 51%, 52%, ……, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 더욱이 전술한 두 R 값으로 정의하는 수치 범위라면 어떤 것이라도 구체적으로 개시된 것이다.

본 발명의 구현예

본 발명의 구현예는 하나 이상의 C₁₅ 이소프레노이드 화합물을 주 또는 보조 연료 성분으로 함유하는 연료 조성물을 제공한다. 본 명세서에서는 모든 C₁₅ 이소프레노이드 화합물을 쓸 수 있다. 몇몇 태양에서는 각각의 C₁₅ 이소프레노이드 화합물이 다음 화학식 중 한 형태를 취할 수 있다:

(I)과

(II)

여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴(alkaryl) 또는 아랄킬(aralkyl)이다. 몇몇 태양에서는 Z가 O-R 또는 O-C(=O)R이고 R은 C₁-C₆ 알킬이다. 다른 태양에서는 Z가 O-R 또는 O-C(=O)인데, 여기서 R은 메틸이다. 다른 태양에서는 Z가 O-R 또는 O-C(=O)R인데, 여기서 R은 에틸이다. 또 다른 태양에서는 C₁₅ 이소프레노이드 화합물이 파네산, 즉 구조식 (I)과 (II)에서 Z가 H이다.

한 집단의 실시 태양들에서는 상기 이소프레노이드 화합물이

(I)

인데, 여기서 Z는 앞서 정의한 바와 같다.

다른 집단의 실시 태양들에서는 상기 이소프레노이드 화합물이

(II)

인데, 여기서 Z는 앞서 정의한 바와 같다.

다른 집단의 실시 태양들에서는 상기 이소프레노이드 화합물이 다음 화학식의 화합물들 중 어느 하나 또는 여럿이 된다:

여기서 Z는 앞서 정의한 바와 같다. 화학식 (I-a), (I-b), (I-c)와 (I-d)는 화학식 (I)의 가능한 네 가지 입체이성질체이고, 화학식 (II-a), (II-b), (II-c)와 (II-d)는 화학식 (II)의 가능한 네 가지 입체이성질체이다.

다른 집단의 실시 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물이

(III)

또는 그 입체이성질체이다.

(IV)

또는 그 입체이성질체인데, 여기서 R은 앞서 정의한 바와 같다. 다른 집단의 실시 태양에서는 R이 C₁~C₃ 알킬이다. 다른 집단의 실시 태양에서는 R이 메틸이다. 또 다른 집단의 실시 태양에서는 R이 에틸이다.

(V)

다른 집단의 실시 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물의 화학식이

(III),

(IV)

또는

(V)

인데, 여기서 R은 알킬로서, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3급부틸과 선형 또는 가지친 펜틸, 헬실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실, 아이코실, 도코실 등이다. 다른 실시 태양에서는 R이 C₁~C₃ 알킬이다. 다른 집단의 실시 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물이 호학식 (III), (IV)와 (V)의 혼합물을 함유한다.

다른 집단의 실시 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물이 화학식 (III), (IV) 또는 (V)의 화합물들 중에서 적어도 두 가지

(III),

(IV)

또는

(V)

또는 그 입체이성질체를 함유하는데, 여기서 R은 C₁~C₅ 알킬이고 이 두 화합물들은 전체 연료 조성물 중량 또는 부피 기준으로 각각 적어도 대략 5%로 존재한다.

다른 집단의 실시 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물은 다음 화합물들 중 하나 또는 그 이상인데,

여기서 R은 앞서 정의한 바와 같다. 화학식 (III-a), (III-b), (III-c)와 (III-d)는 화학식 (III)의 가능한 네 가지 입체이성질체이고, 화학식 (IV-a), (IV-b), (IV-c)와 (IV-d)는 화학식 (IV)의 가능한 네 가지 입체이성질체이며, 화학식 (V-a), (V-b), (V-c)와 (V-d)는 화학식 (V)의 가능한 네 가지 입체이성질체이다.

연료 조성물 속 각각의 이소프레노이드 화합물은 산소와 같은 산화제와 호학적으로 반응할 때 에너지를 방출하는 연료 성분으로, 또는 연료 조성물의 성능이나 특성을 바꿀 수 있는 연료 첨가제로 기능할 수 있다. 일부 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물이 전체 연료 조성물 중량 또는 부피 기준으로 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%에 해당하는 양으로 존재한다. 다른 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물이 전체 연료 조성물 중량 또는 부피 기준으로 최대 약 2%, 최대 약 3%, 최대 약 5%, 최대 약 10%, 최대 약 15%, 최대 약 30%, 최대 약 40%, 최대 약 50%, 최대 약 60%, 최대 약 70%, 최대 약 80% 또는 최대 약 90%에 해당하는 양으로 존재한다. 또 다른 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물이 전체 연료 조성물 중량 또는 부피 기준으로 약 2% 내지 약 99%, 약 2.5 wt% 내지 약 95 wt%, 약 5% 내지 약 90%, 약 7.5% 내지 약 85%, 약 10% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 75% 또는 약 25% 내지 약 75%에 해당하는 양으로 존재한다.

몇몇 태양에서는 상기 C₁₅ 이소프레노이드 화합물이 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질로부터 유도된 것이다. 몇몇 태양에서 생명공학으로 가공한 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질은 숙주세포가 탄소원을 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질로 전환하여 제조한 것이다.

다른 태양에서 탄소원은 단당류(단순한 당), 이당류 또는 이들의 한 가지 이상의 조합과 같은 당이다. 몇몇 태양에서는 상기 당이 본 명세서에서 제공하는 세포 한 종류 또는 그 이상의 성장을 지원할 수 있는 단순한 당이다. 이 단순한 당은 당업자에게 알려진 모든 단순한 당일 수 있다. 적절한 단순한 당 또는 단당류의 비제한적인 예로는 포도당, 갈락토오스, 만노오스, 과당, 리보오스와 이들의 조합을 들 수 있다. 적절한 이당류의 비제한적인 예로는 슈크로스, 젖당, 맥아당, 트레할로스, 셀로비오스와 이들의 조합을 들 수 있다.

다른 태양에서는 탄소원이 다당류이다. 적절한 다당류의 비제한적인 예로는 녹말, 글리코겐, 키틴과 이들의 조합을 들 수 있다.

또 다른 실시 태양에서는 탄소원이 비발효성 탄소원이다. 적절한 비발효성 탄소원의 비제한적인 예로는 아세트산화물과 글리세롤을 들 수 있다.

다른 태양에서 연료 조성물은 석유, 석탄, 목재 또는 기타 모든 탄화수소원에서 유래한 통상적인 연료 성분을 더 포함할 수 있다. 통상적인 연료 성분의 예시로는 디젤 연료, 제트 연료, 등유, 휘발유와 피셔-트롭시 유래 연료를 들 수 있다. 몇몇 태양에서는 이 통상적인 연료 성분이 석유나 석탄에서 유래한 것이다. 몇몇 태양에서는 이 연료 성분이 디젤 연료, 제트 연료, 등유, 휘발유 또는 이들의 조합이거나 이들을 함유한다. 다른 태양에서는 이 연료 성분이 증류한 디젤 연료(distillate diesel fuel)이거나 이를 포함한다. 또 다른 태양에서는 이 연료 성분의 양이 전체 연료 조성물의 중량 또는 부피 기준으로 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%이다. 또 다른 태양에서는 이 연료 성분의 양이 전체 연료 조성물의 중량 또는 부피 기준으로 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80% 또는 최대 90%이다.

몇몇 태양에서는 이 연료 조성물이 통상적인 연료 첨가제를 더 포함할 수 있다. 이러한 하나 이상의 연료 첨가제의 성격과 함량은 최종적이 연료 조성물에서 바라는 용도에 달려 있다.

몇몇 태양에서는 이 연료 조성물의 용도를 디젤 기관으로 잡고 있다. 미국 재료 시험 협회(American Society for Testing and Materials, ASTM)는 디젤 연료의 범주를 세 가지 일반적인 군으로 나누고 있다. 이들 연료의 범주를 나눠야 하는 필요성은 디젤 기관의 다양한 용도에서 나타난 결과인데, 디젤 기관은 표준 디젤 연료 중 어느 하나에 대하여 효율적으로 작동하도록 설계된다.

1-D번은 등유와 비슷한 경량의 증류물로서 하중과 속도가 잦은 변화가 필수적인 엔진(예를 들어 트럭, 트랙터용 엔진)에 쓰인다. 이 연료는 인화점이 ℃ 38도보다 더 높고 최소 세탄가가 40이다. 이 연료는 추운 날씨에서 작동하는데 특히 적합하다.

2-D번은 중간 정도의 증류물 연료로서 1-D번보다 휘발성이 낮고 밀도가 높다. 이 연료는 대형 엔진, 예를 들어 기차 엔진에 쓰이는데, 이들은 일정한 속도로 작동하지만 1-D번을 쓰는 경우보다 더 무거운 하중을 싣는다. 인화점은 52℃보다 더 높고 최소 세탄가는 40이다.

4-D번은 중량 증류물로서 세 디젤 연료 중 가장 높은 밀도와 가장 낮은 휘발성을 지닌다. 이 연료는 계속적인 부하가 걸리는 해양용 엔진과 전력 발전 엔진과 같은 저속 또는 중속 엔진에 쓰인다. 인화점은 55℃보다 높고 최소 세탄가가 30이다.

고급 디젤 연료는 미국 도량형 연맹(National Conference on Weights and Measures, NCWM)이나 엔진 제조자 연합(Engine Manufacturers Association)이 정의한 고급 디젤 기준에 부합하거나 이를 상회하는 것이다.

일반적으로 디젤 연료는 수천개의 개별 화합물들의 복잡한 혼합물이다. 이들 화합물 중 대부분은 C₁₀~C₂₂ 탄화수소로서, 일반적으로 파라핀계, 나프텐(사이클로파라핀)계와 방향족계이다. 정상적인 파라핀은 곧은 탄소 사슬의 알칸(탄소와 수소로 이루어진다)을 가리킨다.

디젤 연료는 일반적으로 증류 범위가 1기압 하에서 390 내지 715°F(200 내지 380℃)이고 비중은 0.760에서 0.935에 이른다. 이들 특성 외에 디젤 연료는 황이 1 중량% 미만, 재가 0.1 중량% 미만, 물과 침전물이 0.5 부피% 미만, 그리고 인화점이 55℃를 넘어야 한다.

디젤 연료의 품질은 세탄가로 특징 지울 수 있는데, 세탄가는 대개 30 내지 60이 된다. 높은 세탄가는 엔진을 쉽게 시작하고 부드럽게 가동될 수 있다는 잠재력을 나타낸다. 세탄가는 자동차 엔진의 옥탄가와 유사한 것으로, 세탄(n-헥사데칸, C₁₆H₃₄)에 임의로 100이라는 값을 부여한 것이다. 세탄가 척도의 반대쪽 끝은 세탄 이성질체의 하나인 헵타메틸노난으로 할당받은 세탄가가 0이다. 디젤 연료의 세탄가는 세탄과 헵타메틸노난의 혼합물들과 비교하여 결정한다. 세탄가는 연료와 같은 점화 특성을 가지는 세탄-헵타메틸노난 혼합물 속의 세탄 부피부에 해당한다.

일반적으로 통상적인 디젤 연료는 방향족 함량이 20 중량%를 넘고 황 함량이 몇백 피피엠이나 그 이상이다. 디젤 연료는 추가적으로 산소 및/또는 질소 불순물을 포함할 수 있다. 원하는 디젤 연료를 얻으려면 통상적인 디젤 연료는 그 안에 포함된 방향족 탄화수소를 사이클로파라핀 등의 비방향족 탄화수소로 바꾸는 변환 과정을 거쳐야 하는 것이 전형적인 경우이다. 이는 수소 첨가 촉매의 존재 하에 이러한 통상적인 디젤 연료에 수소를 첨가하여 이룰 수 있는 것이 전형적이다. 다른 변화 과정을 사용할 수도 있다.

원유를 단순 증류하여 제조하는 "직류(straight run)" 디젤 연료는 보통 방향족 탄화수소의 양이 꽤 낮다. 그러나 휘발유와 디젤 생산량을 늘리기 위하여 잔류 원유를 촉매 접촉 분해하면 방향족 함량이 늘어나게 된다. 전형적인 직류 디젤은 부피 기준 방향족 20~25%를 함유할 수 있지만 촉매 접촉 분해한 디젤은 40~50% 방향족을 가지고 있을 수 있다. 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 방향족 탄화수소 함량은 연료 조성물의 전체 부피 기준으로 약 50 부피% 미만, 약 45 부피% 미만, 약 40 부피% 미만, 약 35 부피% 미만, 약 30 부피% 미만, 약 25 부피% 미만 또는 약 20 부피% 미만일 수 있다. 몇몇 태양에서는 이 연료 조성물의 방향족 탄화수소 함량이 연료 조성물의 전체 부피 기준으로 15 부피% 미만, 10 부피% 미만, 5 부피% 미만, 2.5 부피% 미만 또는 1 부피% 미만이다. 다른 태양에서는 이 연료 조성물이 방향족 탄화수소를 실질적으로 가지지 않는다.

방향족 탄화수소는 자기 점화 성질이 나쁘기 때문에 방향족 분획의 양이 많 디젤 연료는 세탄가가 낮기 마련이다. 직류 디젤의 전형적인 세탄가는 50 내지 55의 범위에 있고, 방향족이 다량 포함된 디젤 연료의 세탄가는 전형적으로 40 내지 45의 범위에 있거나 더 낮을 수 있다. 이는 저온에서 엔진 시작할 때 어려움을 더할 수 있고 점화 지연이 길어져서 연소시 소음이 더 커질 수 있다.

본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 황 함량을 줄이기 위해서는 연료 조성물 속 디젤 연료 성분을 줄이기 위한 탈황 공정의 이용 및/또는 고 이소프레노이드 함량 의 조성물 사용이 가능하다. 본 발명 구현예에서는 어떠한 탈황 공정이라도 이용할 수 있다. 원하는 디젤 연료를 얻기 위하여 산소 및/또는 질소를 제거하기 위한 추가적인 단계를 밟을 수도 있다. 미국 특허 제5,611,912호와 5,068,025호, 4,746,420호와 4,675,102호는 수소 첨가 및/또는 탈황 공정을 개시하고 있는데, 이들은 본 발명의 구현예에 쓰일 수 있다. 모든 상기 선행 특허의 개시 내용 전부는 인용에 의하여 본 발명에 포함된다. 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 황 함량은 연료 조성물의 전체 중량 기준으로 약 500 rpm 미만, 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만, 약 30 ppm 미만, 약 20 ppm 미만 또는 약 15 ppm 미만이거나 그렇게 되도록 할 수 있다. 다른 태양에서는 본 연료 조성물의 황 함량이 10 ppm 미만이다. 또 다른 태양에서는 이 연료 조성물이 황을 실질적으로 가지지 않는다.

몇몇 실시 태양에서는 이 연료 조성물의 용도를 제트 기관용으로 잡고 있다. 가장 흔한 제트 연료는 제트 A-1 연료라고 분류하는 등유/파라핀유 기반의 연료인데, 이 연료는 국제 표준 규격에 맞도록 제조한다. 미국에서만은 제트 A-1의 한 형태인 제트 A로 알려진 연료도 쓰인다. 민간 항공에서 흔히 쓰이는 다른 제트 연료는 제트 B라고 일컫는다. 제트 B는 나프타-등유 영역의 더 경질인 연료로서 찬 날씨의 우수한 수행 성능 때문에 쓰인다. 제트 B의 증류 범위는 일반적으로 140 내지 460°F(50 내지 250℃)이다. 제트 A, 제트 A-1과 제트 B는 ASTM 규격 D 1655-68에서 특정하고 있다. 한편으로 전세계의 군부에서는 제트 연료를 JP 값으로 분류한다. 이들 중 일부는 대응 민간용 등급과 동일하고 첨가제 몇 가지에서만 다를 뿐이다. 예를 들어, 제트 A-1은 JP-8과, 제트 B는 JP-4와 비슷하다. 한편으로 제트 연료를 등유형 또는 나프타형으로 분류할 수 있다. 등유형 제트 연료의 비제한적인 예로는 제트 A, 제트 A1, JP-5와 JP-8을 들 수 있다. 나프타형 제트 연료의 비제한적인 예로는 제트 B와 JP-4가 있다. 다른 태양에서는 이 연료 조성물이 화학식 (I)이나 (II)를 함유하고 Z가 H일 때 ASTM 규격 D 1655-68에 따른 제트 B를 함유하지 않는다.

제트 A는 1950년대부터 쓰인 미국의 표준 제트 연료이다. 제트 A는 제트 A-1과 유사한데, 녹는점이 -40℃로 더 높다는 점만이 예외이다. 제트 A-1과 같이 제트 A도 인화점이 최소 38℃로 꽤 높고, 자기 점화 온도는 210℃이다.

몇몇 태양에서는 이 연료 조성물이 적어도 하나의 통상적인 연료 첨가제를 포함한다. 통상적인 연료 첨가제의 비제한적인 예로는 항산화제, 열 안정성 개선제, 세탄가 개선제, 안정제, 저온 흐름 개선제, 연소 개선제, 소포제, 연무 방지제, 부식 억제제, 윤활성 개선제, 결빙 억제제, 인젝터 청정용 첨가제, 연기 억제제, 공기 저항 방지제, 금속 비활성제, 분산제, 세제, 항유화제, 염료, 표지 물질, 정전기 분산제, 살생물제(biocide)와 이들의 조합이 있다. 연료 조성물 속 연료 첨가제의 총량은 연료 조성물의 총 중량 기준으로 0.001 내지 10 중량%에 이를 수 있고 한 실시 태양에서는 0.01 내지 5 중량%이다.

통상적인 연료 첨가제 몇 가지는 Chunsham Song 외, "Chemistry of Diesel Fuel", Taylor & Francis, London, 제1장, 32~36쪽(2000)에서 기재하고 있는데, 이 문헌의 내용 전부는 인용에 의하여 본 명세서에 포함된다. 나아가서 이하의 미국 특허는 본 발명의 구현예에 첨가제로 쓰일 수 있는 다양한 첨가제를 개시한다: 제6,054,420; 6,051,039; 5,997,593; 5,997,592; 5,993,498; 5,968,211; 5,958,089; 5,931,977; 5,891,203; 5,882,364; 5,880,075; 5,880,072; 5,855,629; 5,853,436; 5,743,922; 5,630,852; 5,529,706; 5,505,867; 5,492,544; 5,490,864; 5,484,462; 5,321,172호와 5,284,492호. 상기 모든 미국 특허의 개시 내용 전부는 인용에 의하여 본 명세서에 포함된다.

몇몇 다른 태양에서는 이 연료 조성물이 윤활성 개선제 또는 향상제인 연료 첨가물을 포함한다. 몇몇 태양에서는 윤활성 개선제 하나 이상을 이 디젤 연료와 혼합한다. 전형적으로 연료 속의 윤활성 개선제 농도는 연료 조성물의 전체 중량 기준으로 약 1 ppm 내지 약 50,000 ppm, 약 10 ppm 내지 약 20,000 ppm, 약 25 ppm 내지 약 10,000 ppm 또는 약 50 ppm 내지 약 1000 ppm이다. 적합한 윤활성 개선제의 비제한적인 예를 일부 들면, 모노올레산글리세롤과 아디프산디이소데실 등의 지방산 에스테르, Lubrizol 화학 회사에서 시판하는 것(예를 들어 LZ 539C)과 같은 아미드계 첨가제, 이합체화한 리놀레산, 아미노알킬모르폴린, 디티오인산 디에스테르-디알코올과 적어도 하나의 카르복시기를 지니는 알킬 방향족 화합물이 있다. 적절한 윤활성 개선제 또는 향상제는 WO 95/33805, WO 94/17160, WO 98/01516, 그리고 미국 특허 제 5,484,462호와 5,490,864호 등의 특허 문헌과 Danping Wei와 H. A. Spikes의 논문 "The Lubricity of Diesel Fuels", Wear, III (1986) 217~ 235에서 기재하고 있는데 이들의 내용은 인용에 의하여 본 명세서에서 포함하고 있다. 시중에서 입수할 수 있는 윤활성 개선제의 비제한적인 예를 일부 들면, OLI9000(영국 맨체스터의 Octel Corporation), Paradyne(상표) 655와 Vektron(상표) 6010(뉴저지주 Linden의 Infineum)과 Hitec(상표) E580(버지니아wn Richmond의 Ethyl Corporation)이 있다.

몇몇 다른 태양에서는 이 연료 조성물이 세제인 연료 첨가제를 포함한다. 일반적으로 이 세제 첨가제의 양은 연료 조성물 전체 중량 기준으로 10,000 ppm 미만, 1000 ppm 미만, 100 ppm 미만 또는 10 ppm 미만이다. 적절한 세제의 비제한적인 예를 일부 들면, 폴리이소부틸렌 숙신이미드나 폴리이소부틸렌 아민 숙신미드 등의 폴리올레핀 치환 숙신이미드나 폴리아민의 숙신이미드, 지방족 아민, 만니히 염기 또는 아민 폴리올레핀(예를 들어 폴리이소부틸렌)의 말레산 무수물이 있다. 적절한 숙신이미드 세제는 GB960493, EP0147240, EP0482253, EP0613938, EP0557561과 WO 98/42808에서 기재하고 있는데 이들의 내용은 인용에 의하여 본 명세서에서 포함하고 있다. 몇몇 태양에서는 이 세제가 폴리이소부틸렌 숙신이미드와 같은 폴리올레핀 치환 숙신이미드이다. 시중에서 입수할 수 있는 세제 첨가제의 비제한적인 예를 일부 들면, F7661과 F7685(뉴저지주 Linden의 Infineum)과 OMA 4130D(영국 맨체스터의 Octel Corporation)가 있다.

일부 다른 태양에서는 이 연료 조성물이 세탄가 개선제인 첨가제를 포함한다. 세탄가 개선제의 비제한적인 예를 일부 들면, 과산화물, 질산화물, 아질산화물, 아조 화합물 등이 있다. 질산아밀, 질산헥실과 혼합 질산옥틸, 질산2-메틸-2-니트로페프로필과 질산2-에틸헥실과 같은 질산알킬을 사용할 수 있다. 일부 태양에서는 세탄가 개선제가 질산2-에틸헥실인데, 이는 Associated Octel Company로부터 상표명 Cl-0801로 입수할 수 있다. 세탄가 개선제는 연료 조성물 속에서 조성물 전체 중량 기준으로 약 0.001 내지 5 중량% 농도를 차지할 수 있으며, 한 실시 태양에서는 0.01 내지 2.5 중량%이다.

몇몇 다른 태양에서는 이 연료 조성물이 안정제인 연료 첨가제를 포함한다. 안정제의 비제한적인 예를 일부 들면, 3급알킬 1차 아민이 있다. 많은 안정제는 또한 부식 억제제로도 작용한다. 안정제는 연료 조성물 속에서 조성물 전체 중량 기준으로 약 0.001 내지 2 중량%로 존재할 수 있는데, 한 실시 태양에서는 0.1 내지 1 중량%로 존재한다.

다른 몇몇 태양에서는 이 연료 조성물이 연소 개선제인 연료 첨가제를 포함한다. 연소 개선제의 비제한적인 예를 일부 들면, 페로센(디사이클로펜타디엔일철), 철에 기반한 연소 개선제(예를 미국 텍사스주 Tomball의 Turbotect사의 TURBOTECT ER-18(상표)), 바륨에 기반한 연소 개선제, 세륨에 기반한 연소 개선제와 철과 마그네슘에 기반한 연소 개선제(예를 미국 텍사스주 Tomball의 Turbotect사의 TURBOTECT 703(상표))가 있다. 연소 개선제는 연료 조성물 속에서 조성물 전체 중량 기준으로 약 0.001 내지 1 중량%의 농도로 존재할 수 있고, 한 실시 태양에서는 0.01 내지 1 중량%로 존재한다.

다른 측면에서는 (a) 화학식

(I) 또는

(II)의

이소프레노이드 화합물,

(b) 통상적인 연료 성분과

(c) 연료첨가제를 함유하는 연료 조성물을 제공하는데,

여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이며, 상기 이소프레노이드 화합물의 함량은 적어도 약 1 부피%이고, 상기 통상적인 연료 성분의 양은 적어도 약 5 부피%이며 이 두 가지 함량은 모두 상기 연료 조성물의 전체 부피 기준이다. 그리고 여기서 상기 연료 조성물은 인화점이 38℃ 이상이며 초기 끓는점이 약 100℃ 내지 약 200℃에 있다.

몇몇 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물 속의 상기 이소프레노이드 화합물의 함량이 상기 연료 조성물 전체 부피 기준으로 적어도 2 부피%, 3 부피% 또는 4 부피%이다. 다른 태양에서는 연료 조성물 전체 부피 기준으로 이소프레노이드 화합물 함량이 약 1 부피% 내지 약 90 부피%, 약 2 부피% 내지 약 90 부피%, 약 3 부피% 내지 약 90 부피% 또는 약 4 부피% 내지 약 90 부피%이다.

다른 또 하나의 측면에서는

(a) 화학식

(I) 또는

(II)의

이소프레노이드 화합물,

(b) 통상적인 연료 성분과

(c) 연료 첨가제를 함유하는 연료 조성물을 제공하는데,

여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이며, 상기 이소프레노이드 화합물의 함량은 적어도 약 5 부피%이고, 상기 통상적인 연료 성분의 양은 적어도 약 5 부피%이며 이 두 가지 함량은 모두 상기 연료 조성물의 전체 부피 기준이다. 그리고 여기서 상기 연료 조성물은 인화점이 38℃ 이상이며 초기 끓는점이 약 100℃ 내지 약 200℃에 있다.

몇몇 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물 속의 상기 이소프레노이드 화합물의 함량이 상기 연료 조성물 전체 부피 기준으로 약 5 부피% 내지 약 90 부피%이다. 다른 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물의 함량이 상기 연료 조성물 전체 부피 기준으로 약 75 부피% 미만, 약 65 부피% 미만, 약 50 부피% 미만 또는 약 45 부피% 미만이다. 다른 태양에서는 연료 조성물 속 이소프레노이드 화합물 함량이 약 5 부피% 내지 약 10 부피이다. 다른 태양에서는 연료 조성물 속 이소프레노이드 화합물 함량이 약 15 부피% 내지 약 25 부피%이다. 또 다른 태양에서는 연료 조성물 속 이소프레노이드 화합물 함량이 약 45 부피% 내지 약 55 부피%이다.

다른 태양에서는 상기 연료 조성물 전체 부피 기준으로 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물 속의 상기 통상적인 연료 성분의 함량이 적어도 약 20%이고 이소프레노이드 화합물 함량이 약 5% 내지 약 75%이다. 일부 태양에서는 연료 조성물 전체 부피 기준으로 상기 통상적인 연료 성분의 함량이 적어도 30%이고 상기 이소프레노이드 화합물의 함량이 약 5% 내지 약 65%이다. 일부 다른 태양에서는 연료 조성물 전체 부피 기준으로 상기 통상적인 연료 성분의 함량이 적어도 40%이고, 이소프레노이드 함량이 약 5% 내지 50%이다. 다른 일부 태양에서는 연료 조성물 전체 부피 기준으로 상기 통상적인 연료 성분의 함량이 적어도 50%이고, 이소프레노이드 화합물 함량이 약 5% 내지 약 45 부피이다.

몇몇 태양에서는 상기 통상적인 연료 성분이 석탄에 기반한 연료이다. 다른 태양에서는 상기 통상적인 연료 성분이 석유 디젤이다. 또 다른 태양에서는 상기 통상적인 연료 성분이 등유이다.

몇몇 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 초기 끓는점이 약 100℃ 이상, 약 110℃ 이상, 약 120℃ 이상, 약 130℃ 이상 또는 약 140℃ 이상이다. 다른 태양에서는 초기 끓는점이 약 100℃ 내지 약 150℃이다.

몇몇 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 최종 끓는점이 약 200℃ 이상이다. 다른 태양에서는 최종 끓는점이 약 225℃ 이상, 약 250℃ 이상, 약 275℃ 이상, 약 300℃ 이상 또는 약 325℃ 이상이다. 나아가 다른 태양에서는 최종 끓는점이 약 350℃ 이상이다. 몇몇 태양에서는 최종 끓는점이 약 375℃ 이상이다.

몇몇 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 T90 증류 온도가 약 270℃ 내지 약 350℃이다. 다른 태양에서는 T90 증류 온도가 약 282℃ 내지 약 338℃이다.

다른 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 T50 증류 온도가 약 175℃ 내지 약 375℃, 약 200℃ 내지 약 350℃, 약 225℃ 내지 약 325℃ 또는 약 250℃ 내지 약 300℃이다.

다른 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 T10 증류 온도가 약 150℃ 내지 약 350℃, 약 175℃ 내지 약 325℃, 약 200℃ 내지 약 300℃ 또는 약 225℃ 내지 약 275℃이다.

몇몇 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 세탄가가 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60 또는 적어도 약 65이다. 또 다른 태양에서는 상기 연료 조성물의 세탄가가 적어도 약 70이다. 몇몇 태양에서는 상기 연료 조성물의 세탄가가 40 내지 90, 40 내지 80 또는 5 내지 70이다.

몇몇 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 흐림점이 0℃ 이하이다. 다른 군의 실시 태양에서는, 연료 조성물의 흐림점이 -5℃ 이하이다. 다른 군의 실시 태양에서는, 연료 조성물의 흐림점이 -10℃ 이하이다. 다른 군의 실시 태양에서는, 연료 조성물의 흐림점이 -15℃ 이하이다. 다른 군의 실시 태양에서는, 연료 조성물의 흐림점이 -20℃ 이하이다. 다른 군의 실시 태양에서는, 연료 조성물의 흐림점이 -25℃ 이하이다.

몇몇 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 황 함량이 낮다. 다른 태양에서는 연료 조성물의 전체 중량 기준으로 연료 조성물의 황 함량이 500 ppm 미만이다. 또 다른 태양에서는 연료 조성물의 전체 중량 기준으로 황 함량이 250 ppm 미만, 150 ppm 미만, 100 ppm 미만, 50 ppm 미만, 25 ppm 미만, 20 ppm 미만, 10 ppm 미만 또는 5 ppm 미만이다. 몇몇 태양에서 이 연료 조성물에는 측정 가능한 양으로 황이 존재하지 않는다.

몇몇 태양에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물이 2번 디젤에 대한 ASTM D 975 규격을 만족한다.

다른 또 하나의 측면에서는 연료 조성물의 전체 부피 기준으로

(a) 적어도 약 1 부피%의 C₂₀ 탄화수소와

(b) 적어도 약 1 부피%의 화학식

(I) 또는

(II)의

이소프레노이드 화합물을 함유하는 연료 조성물을 제공하는데,

여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H 또는 C₁~C₆ 알킬이다. 몇몇 태양에서는 상기 이소프레노이드 화합물의 함량이 적어도 약 2 부피%, 3 부피% 또는 4 부피%이다. 몇몇 태양에서는 이 연료 조성물이 (c) 연료 조성물의 전체 부피 기준으로 적어도 약 1 부피%의 C₁₀ 탄화수소를 더 함유한다.

(a) 적어도 약 1 부피%의 C₂₀ 탄화수소와

(b) 적어도 약 5 부피%의 화학식

(I) 또는

(II)의

여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H 또는 C₁~C₆ 알킬이다. 몇몇 태양에서는 이 연료 조성물이 (c) 연료 조성물의 전체 부피 기준으로 적어도 약 1 부피%의 C₁₀ 탄화수소를 더 함유한다.

몇몇 태양에서는 상기 C₁₀ 탄화수소의 함량이 적어도 약 2 부피%, 3 부피%, 4 부피% 또는 5 부피%이다. 다른 태양에서는 상기 C₂₀ 탄화수소의 함량이 적어도 약 2 부피%, 3 부피%, 4 부피% 또는 5 부피%이다.

몇몇 태양에서는 이 연료 조성물이 C₁₁~C₁₉ 탄화수소를 더 포함하는데, 이 때 C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, C₁₆, C₁₇, C₁₈과 C₁₉ 탄화수소의 각 집합은 연료 조성물 전체 부피 기준으로 적어도 약 1 부피%의 함량으로 존재한다.

본 명세서에서 개시하는 연료 조성물을 이용하여 모든 장치, 예를 들어 비상 발전기나 내연기관과 같이 디젤 연료나 제트 연료 등의 연료가 필요한 장치를 가동할 수 있다. 몇몇 태양에서는 상기 연료 조성물 중 어느 하나 또는 그 이상을 함유하는 비상 연료를 제공한다. 본 명세서의 몇몇 태양에서는 상기 연료 조성물을 비상 연료로 사용하는 방법을 제공한다. "비상 연료"라는 용어는 교통 수단의 기름 탱크가 아닌 용기 속에 일반적으로 저장하는 연료를 가리킨다. 이 연료는 장기간, 예를 들어 6 개월 내지 12 개월 동안 안정하여야 한다. 상기 교통 수단의 연료가 떨어지면 이 비상 연료를 이 교통 수단의 기름 탱크로 보내어 연료를 공급한다. 본 발명의 구현예에 따라 제조한 디젤 연료의 인화점은 일반적으로 140화씨도를 넘기 때문에 디젤 교통 수단의 트렁크 속에 안전하게 보관할 수 있다. 본 연료 조성물은 미국 특허 제6,096,103호에 기술하고 있는 대체 연료로도 쓸 수 있는데, 이 특허는 그 내용 전부가 인용에 의하여 본 명세서에 포함된다.

다른 측면에서는 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물을 포함하는 연료 탱크를 갖춘 연료 시스템을 제공한다. 선택적으로 이 연료 시스탬은 순환하는 엔진 냉매, 상기 연료 탱크와 내연기관을 연결하는 연료관 및/또는 상기 연료관을 따라 배치한 연료 필터를 갖춘 엔진 냉각 시스템을 더 포함할 수 있다. 내연기관 엔진의 비제한적인 예를 일부 들면, 가역 엔진(예를 들어, 가솔린 엔진과 디젤 엔진), 반켈 엔진, 제트 엔진, 일부 로켓 엔진과 가스 터빈 엔진이 있다.

몇몇 태양에서는 이 연료 탱크가 상기 순환하는 엔진 냉매로부터 상기 연료 탱크 속의 연료 조성물로 열을 전달할 수 있도록 상기 냉각 시스템과 연결되어 있다. 다른 태양에서는 이 연료 시스템이 디젤 엔진용 제2 연료를 포함하고 있는 제2 연료 탱크와 상기 제2 연료 탱크를 상기 내연기관에 연결하는 제2 연료관을 더 갖추고 있다. 선택적으로 상기 제1과 제2 연료관에 서로 독립적으로 또는 동시에 열고 닫히는 전자기 작동 밸브들을 붙일 수 있다. 또 다른 태양에서는 이 제2 연료가 석유 디젤이다.

다른 한 측면에서는 엔진 배치를 제공하는데, 이 엔진 배치는 내연기관, 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물을 함유하는 연료 탱크, 상기 연료 탱크와 상기 내연기관을 연결하는 연료관을 갖추고 있다. 선택적으로 이 엔진 배치는 연료 필터 및/또는 순환하는 엔진 냉매를 갖춘 엔진 냉각 시스템을 더 포함할 수 있다. 몇몇 태양에서는 상기 내연기관이 디젤 엔진이다. 다른 태양에서는 이 내연기관이 제트 엔진이다.

본 명세서에서 개시하는 연료 조성물을 사용하는 경우 조성물을 엔진 속으로 분사하기 전에 이 연료 조성물에 있는 입자상 물질을 제거하는 것이 바람직하다. 따라서 본 명세서에서 개시하는 연료 시스템에 쓸 적절한 필터를 선택하는 것이 바람직하다. 연료 속의 물은 소량이라도 내연기관에 사용되면 엔진에 매우 해롭다. 따라서 엔진 속으로 조성물을 분사하기 전에 남아 있는 물을 제거하는 것이 바람직하다. 몇몇 태양에서는 물과 입자상 물질을 터빈 원심분리를 이용한 연료 필터로 제거할 수 있는데, 여기서는 물과 입자상 물질을 연료 조성물로부터 분리해 냄으로써 여과한 연료 조성물을 엔진에 분사해 넣더라도 엔진이 손상의 위험에 처하지 않게 한다. 물 및/또는 입자상 물질을 제거할 수 있는 다른 종류의 엔진 필터도 쓸 수 있다.

다른 한 측면에서는 어떠한 교통 수단을 제공하는데, 이 교통 수단은 내연기관, 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물을 함유하는 연료 탱크, 상기 연료 탱크와 상기 내연기관을 연결하는 연료관을 갖추고 있다. 선택적으로 이 교통 수단은 연료 필터 및/또는 순환하는 엔진 냉매를 갖춘 엔진 냉각 시스템을 더 포함할 수 있다. 교통 수단의 비제한적인 예를 몇 가지 들면, 자동차, 오토바이, 기차, 배와 항공기가 있다.

다른 한 측면에서는 화학식

(I) 또는

(II)의

이소프레노이드 화합물을 제조하는 방법을 제공하는데,

여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이다. 이 방법은

a) C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 생물학적 물질원으로부터 구하는 단계와

b) 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 화학 합성을 이용하여 상기 화합물들로 변환하는 단계를 포함한다.

다른 한 측면에서는 화학식

(I) 또는

(II)의

이소프레노이드 화합물을 제공하는데,

여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이며, 이 화합물은

a) C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 생물학적 물질원으로부터 구하고

b) 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 화학 합성을 이용하여 상기 화합물로 변환함으로써 제조한다.

다른 측면에서는

b) 화학 합성을 이용하여 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 아래 화학식

(I) 또는

(II)의

이소프레노이드 화합물로 변환함으로써 제조한 바이오연료를 제공하는데,

여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이다.

다른 무리의 실시 태양에서는, 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질이

이고

이 출발 물질에 수소를 첨가하여

(III) 또는 그 입체이성질체를 생산한다.

다른 실시 태양에서는, 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질이

인데,

이 출발 물질에 수소를 첨가하여

(IV) 또는 그 입체이성질체를 생산하고,

여기서 R은 알킬이다.

다른 무리의 실시 태양에서는 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질이

인데,

이 출발 물질에 수소를 첨가하고 에스테르화하여

(V) 또는 그 입체이성질체를 생산하며,

여기서 R은 알킬이다.

다른 측면에서는 연료 조성물을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은

(a) C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질의 제조에 적절한 조건 하에서 단순한 당을 상기 C₁₅이소프레노이드 출발 물질을 제조할 수 있는 세포에 접촉시키는 단계,

(b) 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질에 수소를 첨가하여 수소 첨가 C₁₅ 이소프레노이드 화합물을 형성하는 단계 및

(c) 상기 수소 첨가 C₁₅ 이소프레노이드 화합물을 하나 이상의 연료 성분이나 연료 첨가제와 혼합하여 연료 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.

(a) C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질의 제조에 적절한 조건 하에서 비발효성 탄소원을 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 제조할 수 있는 세포에 접촉시키는 단계,

다른 측면에서는 본 발명의 연료, 생명공학으로 가공한 연료 성분 또는 생명공학으로 가공한 연료 첨가제를 제조하기 위한 설비를 제공한다. 몇몇 실시 태양에서 이 설비는 상기 C₁₅ 출발 물질을 생물학적으로 제조할 수 있다. 일부 태양에서 이 설비는 나아가 상기 출발 물질로부터 이소프레노이드 연료 첨가제 또는 연료 성분을 제조하는 것도 가능하다.

이 설비는 미생물을 이용한 상기 C₁₅ 출발 물질의 제조에 유용한 어떠한 구조라도 포함할 수 있다. 일부 태양에서는 이 생물학적 설비가 본 명세서에서 개시하는 세포를 하나 이상 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 생물학적 설비가 적어도 하나의 C₁₅ 출발 물질을 함유하는 세포 배양물을 포함하는데, 이 세포 배양물에는 세포 배양물 전체 중량 기준으로 적어도 1 중량%, 적어도 5 중량%, 적어도 10 중량%, 적어도 20 중량% 또는 적어도 30 중량%의 상기 C₁₅ 출발 물질이 포함된다. 추가적인 실시 태양에서는 이 생물학적 설비가 본 명세서에서 개시하는 세포를 하나 이상 갖춘 발효기(fermentor)를 포함한다.

세포나 세균이 성장하거나 증식할 수 있는 안정적이고 최적인 환경을 제공할 수 있는 어떠한 발효기라도 본 발명에 쓰일 수 있다. 다른 태양에서는이 발효기가 파네실 피로인산(FPP)을 생물학적으로 제조할 수 있는 세포 배양물을 포함한다. 다른 추가적 태양에서는 이 발효기가 이소펜텐일 디인산(IPP)을 생물학적으로 제조할 수 있는 세포 배양물을 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 발효기가 적어도 하나의 C₁₅ 출발 물질을 함유하는 세포 배양물을 갖추고 있는데, 그 함량은 상기 세포 배양물 전체 중량의 적어도 1 중량%, 적어도 5 중량%, 적어도 10 중량%, 적어도 20 중량% 또는 적어도 30 중량%이다.

이 설비는 상기 C₁₅ 출발 물질로부터 연료 성분이나 연료 첨가제를 제조할 수 있는 어떠한 구조라도 더 포함할 수 있다. 이 구조는 상기 C₁₅ 출발 물질에 수소를 첨가하기 위한 수소 부가 장치(hydrogenator)를 갖추고 있을 수도 있다. 이 분야 당업자에게 알려져 있는 조건 하에서 C=C 이중결합을 C-C 단일결합으로 환원할 수 있는 어떠한 수소 부가 장치라도 본 발명에 쓸 수 있다. 이 수소 부가 장치는 본 명세서에서 개시하는 수소 부가 촉매를 갖추고 있을 수 있다. 몇몇 태양에서는 이 구조가 혼합기(mixer), 용기, 수소 부가 단계에서 생긴 수소 첨가 생성물 및 상기 용기 속의 통상적인 연료 첨가제를 더 포함할 수 있다.

숙주 세포

C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질은 생물학적 방법, (생물학적으로 유래한 물질의 사용 없는) 화학 합성 그리고 상기 생물학적, 화학적 방법을 모두 쓰는 혼합 방식을 비롯한 당업자가 알고 있는 모든 방법을 이용하여 제조할 수 있다, 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 생물학적으로 제조한 경우, 한 가지 방법은 원하는 생성물을 제조하도록 변형된 숙주 세포의 사용을 망라하고 있다. 모든 이소프레노이드처럼, C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질은 생화학적으로 공통 중간체인 이소펜텐일 디인산(isopentenyl diphosphate, "IPP")를 거쳐 만들어진다.

이 숙주 세포는 이 분야 당업자가 알고 있는 모든 방식으로 성장시킬 수 있다. 특히 이 숙주 세포는 그에 적합한 배양 배지 속에서 자랄 수 있다. 유리한 실시 태양에서는 이 배양 배지가 쉽게 입수할 수 있는 재생 가능한 성분들을 함유한다. 본 발명은 따라서 쉽게 입수할 수 있고, 재생 가능한 에너지원과 이들을 이용하여 연료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시 태양에서는 숙주 세포의 성장과 C₁₅ 이소프레노이드의 생산에 적합한 조건 하에서 이 숙주 세포를 단순한 당(simple sugar)에 접촉시킨다. 몇몇 태양에서는 이 숙주 세포를 포도당, 갈락토오스, 만노오스, 과당, 리보오스 또는 이들의 조합에 접촉시켜 배양하거나 키울 수 있다. 본 발명은 따라서 단순한 당, 예를 들어, 포도당, 갈락토오스, 만노오스, 과당, 리보오스 또는 이들의 조합에서 유래한 연료 조성물과 이 단순한 당으로부터 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 실시를 위해서 어떠한 적절한 숙주 세포도 쓸 수 있다. 한 실시 태양에서, 이 숙주 세포는 원하는 이소프레노이드 또는 이소프레노이드 유도체를 제조하기 위해서, 혹은 원하는 이소프레노이드나 이소프레노이드 유도체의 수득률을 높이기 위하여 핵산 분자를 삽입, 삭제 또는 변형(즉 돌연변이화한 것, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 삭제, 치환 및/또는 전위에 의한 돌연변이화)한 유전자 조작 숙주 미생물이다. 다른 태양에서는 이 숙주 세포를 액체 성장 배지 속에서 키울 수 있다.

적절한 숙주 세포의 예에는 고세균 세포, 세균 세포와 진핵 세포가 포함된다. 고세균 세포의 몇 가지 비제한적인 예로 다음 속에 속하는 것들이 포함된다: Aeropyrum, Archaeglobus , Halobacterium , Methanococcus , Methanobacterium , Pyrococcus, Sulfolobus과 Thermoplasma. 고세균 균주의 몇 가지 비제한적인 예에는 Aeropyrum pernix , Archaeoglobus fulgidus , Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum , Pyrococcus abyssi , Pyrococcus horikoshii, Thermoplasma acidophilum과 Thermoplasma volcanium 등이 포함된다.

세균 세포의 몇 가지 비제한적인 예로 다음 속에 속하는 것들이 포함된다: Agrobacterium, Alicyclobacillus , Anabaena , Anacystis , Arthrobacter , Azobacter , Bacillus , Brevibacterium, Chromatium , Clostridium , Corynebacterium , Enterobacter , Erwinia , Escherichia, Lactobacillus , Lactococcus , Mesorhizobium , Methylobacterium , Microbacterium , Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter , Rhodopseudomonas , Rhodospirillum , Rhodococcus , Salmonella, Scenedesmun , Serratia , Shigella , Staphlococcus , Strepromyces , Synnecoccus와 Zymomonas .

세균 균주의 몇 가지 비제한적인 예에는 Bacillus subtilis , Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes , Brevibacterium immariophilum , Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii , Escherichia coli , Lactococcus lactis , Mesorhizobium loti , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas mevalonii , Pseudomonas pudica , Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides , Rhodospirillum rubrum , Salmonella enterica , Salmonella typhi , Salmonella typhimurium , Shigella dysenteriae , Shigella flexneri, Shigella sonnei , Staphylococcus aureus 등이 포함된다.

일반적으로 세균 숙주 세포를 사용하면 비병원성 균주를 쓰는 것이 좋다. 비병원성 균주의 몇 가지 비제한적이 예에는 Bacillus subtilis, Escherichia coli , Lactibacillus acidophilus , Lactobacillus helveticus , Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii , Pseudomonas pudita , Rhodobacter sphaeroides, Rodobacter capsulatus , Rhodospirillum rubrum 등이 포함된다.

진핵세포의 몇 가지 비제한적인 예에는 진균 세포가 포함된다. 진균 세포의 몇 가지 비제한적인 예에는 다음 속에 속하는 것들이 포함된다: Aspergillus , Candida, Chrysosporium , Cryotococcus , Fusarium , Kluyveromyces , Neotyphodium , Neurospora, Penicillium , Pichia , Saccharomyces와 Trichoderma.

진핵세포 세포주의 몇 가지 비제한적인 예에는 Aspergillus nidulans , Aspergillus niger , Aspergillus oryzae , Candida albicans , Chrysosporium lucknowense, Fusarium graminearum , Fusarium venenatum , Kluyveromyces lactis , Neurospora crassa , Pichia angusta , Pichia finlandica , Pichia kodamae , Pichia membranaefaciens , Pichia methanolica , Pichia opuntiae, Pichia pastoris , Pichia pijperi , Pichia quercuum , Pichia salictaria , Pichia thermotolerans, Pichia trehalophila , Pichia stipitis , Streptomyces ambofaciens , Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus , Saccaromyces bayanus , Saccaromyces boulardi , Saccharomyces cerevisiae , Streptomyces fungicidicus , Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus , Streptomyces lividans , Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus , Streptomyces tanashiensis , Streptomyces vinaceus와 Trichoderma reesei가 포함된다.

일반적으로 진핵세포를 사용하는 경우, 비병원성 세포주를 쓰는 것이 좋다. 비병원성 세포주의 몇 가지 비제한적인 예에는 Fusarium graminearum , Fusarium venenatum, Pichia pastoris , Saccaromyces boulardi와 Saccaromyces cerevisiae가 있다.

또한 미국 식품의약청에서는 몇 가지 균주 또는 세포주를 일반적으로 안전(Generally Regareded As Safe, GRAS)하다고 지정하였다. 이러한 균주 또는 세포주의 비제한적인 예에는 Bacillus subtilis , Lactibacillus acidophilus , Lactobacillus helveticus와 Saccharomyces cerevisiae가 포함된다.

IPP 경로

IPP와 그 이성질체인 디메틸알릴 피로인산(dimethylallyl pyrophosphate("DMAPP"))를 합성하는 생합성 경로로는 두 가지가 알려져 있다. 식물이 아닌 진핵세포는 메발론산 의존성("MEV") 이소프레노이드 경로만을 사용하여 아세틸 보조효소 A("acetyl-CoA")를 IPP로 변환하는데, IPP는 이어서 DMAPP로 이성질화한다. 일부 예외는 있지만, 원핵세포는 메발론산-무의존성 경로 또는 데옥시자일룰로스 5-인산(deoxyxylulose 5-phosphate("DXP")) 경로를 이용하여 한 분기점을 통하여 IPP와 DMAPP을 별도로 생산한다. 일반적으로 식물은 IPP 합성을 위하여 상기 MEV와 DXP 경로를 모두 사용한다.

MEV 경로

MEV 경로의 모식도를 도 1에 나타내었다. 일반적으로 이 경로는 6 단계를 포함한다.

첫째 단계에서는 아세틸-보조효소 A(acetyl-CoA) 두 분자를 효소에 의하여 결합함으로써 아세토아세틸-보조효소 A(acetoacetyl-CoA)를 생성한다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는, 예를 들어 아세틸-CoA 티올라제(thiolase)이다. 이 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 몇 가지 비제한적인 예로는 이하의 GenBank 접속 번호와 이 서열이 유래한 생명체를 들 수 있다: (NC_000913 REGION: 2324131..2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans)과 (L20428; Saccharomyces cerevisiae).

MEV 경로의 둘째 단계에서는 아세토아세틸-CoA를 효소에 의하여 다른 분자의 아세틸-CoA와 축합하여 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA(HMG-CoA)를 생성한다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는, 예를 들어 HMG-CoA 합성 효소이다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 몇 가지 비제한적인 예에는 (NC_001145. complement 19061..20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens)와 (NC_002758, Locus tag SAV2546, GeneID 1122571; Staphylococcus aureus)가 포함된다.

셋째 단계에서 HMG-CoA는 효소에 의하여 메발론산(mevalonate)으로 변환된다. 이 단계를 촉매하는 효소로 알려진 것은, 예를 들어 HMG-CoA 환원 효소이다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 몇 가지 비제한적인 예에는 (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, Locus tag SAV2545, GeneID 1122570; Staphylococcus aureus), (NM_204485; Gallus gallus), (AB015627; Streptomyces sp. KO 3988), (AF542543; Nicotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, providing the sequence encoding a truncated HMGR; Saccharomyces cerevisiae)와 (NC_001145: complement (115734..118898; Saccharomyces cerevisiae)가 포함된다.

넷째 단계에서 메발론산은 효소에 의하여 인산화되어 메발론산 5-인산을 생성한다. 이 단계를 촉매하는 효소로 알려진 것은 예를 들어, 메발론산 키나아제이다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 몇 가지 비제한적인 예에는 (L77688; Arabidopsis thaliana)와 (X55875; Saccharomyces cerevisiae)가 포함된다.

다섯째 단계에서는 메발론산 5-인산에 두번째 인산기를 효소에 의하여 연결함으로써 메발론산 5-피로인산을 생성한다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, 포스포메발론산 키나아제이다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens)와 (NC_001145. complement 712315..713670; Saccharomyces cerevisiae)가 포함된다.

여섯째 단계에서는 메발론산 5-피로인산이 효소에 의하여 IPP로 변환된다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, 메발론산 피로인산 탈카르복시화 효소이다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium)과 (U49260; Homo sapiens)가 포함된다.

IPP가 DMAPP으로 바뀌려면 일곱째 단계가 필요하다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, IPP 이성질화 효소가 있다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (NC_000913, 3031087..3031635; Escherichia coli)와 (AF082326; Haematococcus pluvialis)가 포함된다.

DXP 경로

DXP 경로의 모식도는 도 2에 나타내었다. 일반적으로 DXP 경로는 일곱 단계를 포함한다. 첫째 단계에서 피루브산은 D-글리세르알데히드-3-인산과 함께 축합하여 1-데옥시-D-자일룰로스-5-인산을 생성한다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, 1-데옥시-D-자일루로스-5-인산 합성 효소가 있다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (AF035440; Escherichia coli), (NC_002947, locus tag PP0527; Pseudomonas putida KT2440), (CP000026, locus tag SPA2301; Salmonella enterica Paratyphi , see ATCC 9150), (NC_007493, locus tag RSP_0254; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC_005296, locus tag RPA0952; Rhodopseudomonas palustris CGA009), (NC_004556, locus tag PD1293; Xylella fastidiosa Temecula1)과 (NC_003076, locus tag AT5G11380; Arabidopsis thaliana)가 포함된다.

둘째 단계에서 1-데옥시-D-자일룰로스-5-인산은 2C-메틸-D-에리트리톨-4-인산으로 변환된다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, 1-데옥시-D-자일루로스-5-인산 환원 이성질화 효소가 있다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (AB013300; Escherichia coli), (AF148852; Arabidopsis thaliana), (NC_002947, locus tag PP1597; Pseudomonas putida KT2440), (AL939124, locus tag SCO5694; Streptomyces coelicolor A3(2)), (NC_007493, locus tag RSP_2709; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), 가 (NC_007492, locus tag Pfl_1107; Pseudomonas fluorescens PfO-1)가 포함된다.

셋째 단계에서 2C-메틸-D-에리트리톨-4-인산은 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨로 변환된다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성 효소가 있다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (AF230736; Escherichia coli), (NC_007493, locus_tag RSP_2835; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC_003071, locus_tag AT2G02500; Arabidopsis thaliana )와 (NC_002947, locus_tag PP1614; Pseudomonas putida KT2440)가 포함된다.

넷째 단계에서 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨은 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-인산으로 변환된다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 키나아제가 있다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (AF216300; Escherichia coli)와 (NC_007493, locus_tag RSP_1779; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)가 포함된다.

다섯째 단계에서 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-인산은 2C-메틸-D-에리트리톨-2,4-사이클로디인산으로 변환된다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, 2C-메틸-D-에리트리톨-2,4-사이클로디인산 합성 효소가 있다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (AF230738; Escherichia coli), (NC_007493, locus_tag RSP_6071; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)과 (NC_002947, locus_tag PP1618; Pseudomonas putida KT2440)가 포함된다.

여섯째 단계에서 2C-메틸-D-에리트리톨-2,4-사이클로디인산은 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부텐일-4-디인산으로 변환된다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부텐일-4-디인산 합성 효소가 있다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (AY033515; Escherichia coli), (NC_002947, locus_tag PP0853; Pseudomonas putida KT2440)과 (NC_007493, locus_tag RSP_2982; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)이 포함된다.

일곱째 단계에서 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부텐일-4-디인산은 IPP 또는 그 이성질체인 DMAPP로 변환된다. 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소는 예를 들어, 이소펜틸/디메틸알릴 디인산 합성 효소가 있다. 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 몇 가지 예에는 (AY062212; Escherichia coli)와 (NC_002947, locus_tag PP0606; Pseudomonas putida KT2440)이 포함된다.

몇몇 태양에서는 숙주 세포 고유의 신진대사 과정과 본 발명이 제공하는, IPP 생산에 관련된 과정들 사이에 "누화(漏話 cross-talk)"(또는 간섭)를 최소화하거나 완전히 제거한다. 예를 들어 숙주 미생물이 IPP를 제조하는데 오로지 DXP 경로에만 의존하고 추가적인 IPP의 제조를 위하여 MEV 경로를 도입하였을 때는 누화를 최소화하거나 완전히 제거할 수 있다. 이러한 숙주 생명체는 MEV 경로 효소의 발현을 바꾸거나 이 MEV 경로의 관련 중간체를 처리할 능력이 없을 것이다. DXP 경로에 전적으로 또는 대부분 의존하는 생명체의 예에는 대장균 등이 있다.

몇몇 태양에서는 이 숙주 세포가 MEV 경로를 통하여 전적으로 또는 DXP 경로와 합작하여 IPP를 생산한다. 다른 태양에서는 숙주의 DXP 경로를 기능적으로 불능화하여 이 숙주 세포가 외래적으로 도입된 MEV 경로를 통하여서만 IPP를 생산한다. 이 DXP 경로는 유전자 불현을 불능화하거나 DXP 경로 효소의 기능을 하나 이상 불활성화함으로써 불능화할 수 있다.

C ₁₅ 이소프레노이드 출발 물질

IPP와 마찬가지로 파네실 피로인산("FPP") 또한 생물학적으로 만들 수 있다. 일반적으로 IPP 두 분자와 DMAPP 한 분자가 축합하여 FPP를 생성한다. 몇몇 태양에서는 이 단계를 촉매한다고 알려진 효소, 예를 들어 파네실 피로인산 합성 효소가 이 반응을 촉매할 수 있다.

파네실 피로인산 합성 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 몇 가지 비제한적인 예에는 (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp . nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi), (CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H), (AF019892; Helianthus annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae), (D89104; Schizosaccharomyces pombe), (CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes), (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes), (NC_008022, Locus YP_598856; Streptococcus pyogenes MGAS10270), (NC_008023, Locus YP_600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS10750)과 (MZEFPS; Zea mays)가 있다.

IPP와 FPP를 함께 생물학적으로 제조하는 방법은 WO 2006/014837과 미국 출원 공보 제 2003/0148479, 2004/0005678호와 2006/0079476호를 비롯한 문헌에서 기술한 바 있다. 실시예 1과 2 또한 이러한 화합물을 제조하기 위한 구현예를 제공한다.

FPP는 이어서 여러 가지 C₁₅ 이소프레노이드로 바뀔 수 있다. 일반적으로 고리 없는 (가지친 사슬 또는 곧은 사슬) C₁₅ 이소프레노이드와 고리형 (측쇄가 있거나 없는) C₁₅ 이소프레노이드는 출발 물질로 쓰일 수 있다. 그러나 고리 없는 C₁₅ 이소프레노이드는 본 발명의 실시에 있어서 원하는 화합물을 제조하는 필요한 화학적 단계의 수가 더 적다. 적절한 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질의 비제한적인 예에는

가 있지만 이에 한정되지 않는다.

α- 파네센

α-파네센(α-farnesene)은 그 구조가

이고

개미의 Dufour샘, 사과와 배의 껍질의 피복층을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 생물학적 원료원에서 찾을 수 있다. 생화학적으로 α-파네센은 α-파네센 합성 효소에 의하여 FPP로부터 제조한다. 이 효소를 암호화하는 적절한 뉴클레오티드 서열의 몇 가지 비제한적인 예에는 (DQ309034; Pyrus communis cultivar d'Anjou)와 (AY182241; Malus domestica)가 포함된다. Pechouus 외, Planta 219(1):84~94 (2004)를 보라.

β- 파네센

β-파네센(β-farnesene)은 그 구조가

이고

진드기류와 박하유 등의 정유(精油 essential oil)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 생물학적 원료원에서 찾을 수 있다. 감자 등의 일부 식물에서는 β-파네센을 천연 곤충 퇴치제로 쓰려고 합성한다. 생화학적으로 β-파네센은 β-파네센 합성 효소에 의하여 FPP로부터 제조한다. 이 효소를 암호화하는 적절한 뉴클레오티드 서열의 몇 가지 비제한적인 예에는 (AF024615; Mentha x piperita)와 (AY835398; Artemisia annua)가 포함된다. Picaud 외, Phytochemistry 66(9): 961~967(2005)를 보라.

파네솔

파네솔(farnesol)은 그 구조가

이고,

곤충류와 시트로넬라(citronella), 네롤리(neroli), 시클라멘(cyclamen), 레몬그라스, 월하향(月下香 tuberose), 장미에서 유래한 정유를 비롯한 다양한 생물 원료원에서 찾을 수 있다. 생화학적으로 파네솔은 파네솔 합성 효소와 같은 수산화효소(hydroxylase)에 의하여 FPP로부터 제조한다. 이 효소를 암호화하는 적절한 뉴클레오티드 서열의 몇 가지 비제한적인 예에는 (AF529266; Zea mays)와 (YDR481C; Saccharomyces cerevisiae)가 포함된다. Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149~158(2006)를 보라.

네롤리돌

네롤리돌(nerolidol)은 그 구조가

이고

페루비올(peruviol)로도 알려져 있으며, 네롤리, 생강, 자스민, 라벤더, 차나무와 레몬그라스에서 유래한 정유를 비롯한 다양한 생물 원료원에서 찾을 수 있다. 생화학적으로 네롤리돌은 네롤리돌 합성 효소와 같은 수산화효소에 의하여 FPP로부터 제조한다. 이 효소를 암호화하는 적절한 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 예에는 Zea mays(옥수수; gene tps1)의 AF529266가 포함된다.

몇몇 태양에서는 상기 이소프레노이드 출발 물질을 천연 테르펜(terpene)으로부터 제조하는데, 테르펜은 Copaifera langsdorfii, 구과(毬果) 식물(confiers), 등대풀류(spurges) 등의 다양한 식물과 산호랑나비(swallowtail butterfly), 잎벌레류(leef beetles), 흰개미, 솔잎벌(pine sawfly) 등의 곤충 그리고 바닷말, 해면류, 산호류, 연체동물류와 어류를 비롯한 해양 생물이 생산할 수 있다.

Copaifera langsdorfii 또는 코파이페라(copaifera) 나무는 디젤 나무와 등유 나무로도 알려져 있다. 이 나무는 현지어로 여러 가지 이름이 있는데, kupa'y, cabismo와 copa'uva를 들 수 있다. 코파이페라 나무는 그 목재와 잎에서 다량의 테르펜 탄화수소를 생산할 수 있다. 일반적으로 코파이페라 나무 한 그루는 매년 약 30 내지 약 40 리터의 테르펜을 생산할 수 있다.

테르펜유는 구과 식물과 등대풀류에서 얻을 수도 있다. 구과 식물은 구과 식물문(pinophyta)이나 소나무목(coniferae)에 속하는 식물이며 일반적으로 관다발 조직이 있는 방울(cone) 달린 종자 식물이다. 구과 식물의 대부분은 나무지만 일부는 관목이다. 적절한 구과 식물의 비제한적인 예 몇 가지에는 히말라야 삼나무(cedar), 사이프레스 삼나무(cypress), 더글러스 전나무(douglas-fir), 전나무, 주니퍼 노간주나무(juniper), 카우리소나무(kauri), 낙엽송, 소나무, 미국 삼나무(redwood), 가문비나무속의 나무(spruce)와 주목이 포함된다. 등대풀류는 대극속(euphorbia)의 식물로도 알려져 있는데, 이들은 전세계적으로 광범위한 식물의 속으로서, 대극과(euphorbiaceae)에 속한다. 약 2160 종으로 이루어지는 등대풀류는 식물계에서 가장 큰 속의 하나이다.

상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질은 세스퀴테르펜(sesquiterpene)으로서, 테르펜이라고 불리는 더 큰 화합물군의 일종이다. 크고 다양한 탄화수소의 군으로서, 테르펜은 헤미테르펜(hemiterpene), 모노테르펜, 세스퀘테르펜, 디테르펜, 세스터테르펜(sesterterpene), 트리테르펜, 테트라테르펜과 폴리테르펜을 포함한다. 이 때문에 본 발명에 사용할 테르펜유로부터 적절한 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 분리할 수 있다.

화학 변환

본 명세서에서 개시하는 연료 조성물의 연료 성분은

(I) 또는

(II)

를 포함하는데, 여기서 Z는 앞서 정의한 바와 같다. 생물학적 방법 또는 (생물학적으로 유래한 물질의 사용이 없는) 화학 합성을 비롯한 이 분야에 알려진 모든 방법을 사용하여 화학식 (I)이나 (II)를 제조할 수 있다. 한 실시 태양에서는 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 천연 원료로부터 분리한다. 예를 들어 파네솔은 시트로넬라, 네롤리, 시클라멘, 레몬그라스, 월하향과 장미에서 분리할 수 있다. 다른 태양에서는 이같은 화합물을 생산하거나 천연 존재하는 화합물의 수득률을 높이도록 변형한 숙주 세포를 이용하여 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 생산한다.

원료원과 무관하게, 각각의 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 이 분야에 알려진 모든 환원 방법을 이용하여 연료 성분이나 연료 첨가제로 화학 변환할 수 있는데, 이러한 환원에는 수소 첨가나 환원 반응과 에스테르화의 조합 등이 있다. 몇몇 태양에서는 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 Pd, Pd/C, Pt, PtO₂, Ru(PPh₃)₂Cl₂, Raney 니켈 또는 이들의 조합을 비롯한 촉매를 써서 수소로 환원할 수 있다. 한 실시 태양에서는 이 촉매가 Pd 촉매이다. 다른 태양에서는 이 촉매가 5% Pd/C이다. 추가적인 태양에서는 이 촉매가 고압 용기 속의 10% Pd/C이고 반응은 완료할 때까지 진해한다. 일반적으로 반응 완료 후 반응 혼합물을 세척하고 농축한 다음 건조하여 해당하는 수소 첨가 생성물을 얻을 수 있다. 한편으로 C=C 결합을 C-C 결합으로 환원할 수 있는 어떠한 환원제도 쓸 수 있다. 예를 들어, 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 산소 대기와 촉매, 예를 들어 과염소산 5-에틸-3-메틸루미플라비늄(methyllumifiavinium) 존재하에 히드라진으로 처리하여 수소 첨가하면 해당 수소 첨가 생성물을 얻을 수 있다. 히드라진과의 이 환원 반응은 Imada 외, J. Am . Chem. Soc., 127, 14544~14545 (2005)에서 기재하고 있는데, 이는 본 명세서의 참조 문헌으로 포함하고 있다.

몇몇 태양에서는 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질 속의 C=C 결합을 실온에서 촉매의 수소의 존재하에 수소 첨가하여 해당 C-C 결합으로 환원한다. 나아거 한 태양에서는, 이 촉매가 아래 합성안 1에 나타낸 10% Pd/C이다.

합성안 1에 따라 얻게 되는 완전히 포화된 C₁₅ 알코올을 모든 알려진 에스테르화제를 써서 변형하여 해당 포화 C₁₅ 에스테르를 생산할 수 있는데, 이러한 에스테르화제에는 카르복시산, 카르복시산 염화물(플루오르화물, 염화물, 브롬화물과 요오드화물 등)과 카르복시산 무수물 등이 있다. 이 에스테르화 반응은 당업자가 알고 있는 모든 반응 조건을 이용하여 진행시킬 수 있다. 몇몇 태양에서는 상기 C₁₅ 알코올 출발 물질을 산 또는 염기 촉매의 존재하에서 Fischer 또는 Steglich 에스테르화 조건에 따라 원하는 카르복시산과 반응시켜, 에스테르화한다. 다른 태양에서는 상기 C₁₅ 알코올 출발 물질을 아민이나 피리딘 화합물 등의 염기 촉매 존재하, 또는 부존재하에 원하는 카르복시산 염화물과 반응시켜 에스테르화한다. 다른 태양에서는 상기 C₁₅ 알코올 출발 물질을 아래 합성안 2에 나타낸 것처럼 아민 화합물(트리에틸아민 등) 등의 염기 촉매 존재하에 원하는 카르복시산 무수물과 반응시켜 에스테르화한다. 반응을 마친 반응 혼합물을 농축하고, 씻고 건조하여 해당 에스테르를 얻을 수 있다.

합성안 2

한편으로 상기 포화 C₁₅ 에스테르를 아래 합성안 3에 나타낸 것처럼 상기 포화 C₁₅ 알코올과 원하는 에스테르로부터 에스테르 교환 반응을 통하여 얻을 수도 있다. 이 에스테르 교환 반응은 당업자가 알고 있는 모든 반응 조건에 따라 진행시킬 수 있다. 몇몇 태양에서는 이 에스테르 교환 반응을 알칼리 금속(예를 들어, Li, Na, K, Rb과 Cs)이나 알칼리 토금속(에를 들어 Mg, Ca, Sr과 Ba)의 수산화물, 탄산화물 또는 아세트산화물이나 이들의 조합물 등의 염기성 촉매가 촉매한다.

합성안 3

몇몇 태양에서는 알려진 모든 알킬화제를 이용하여 상기 완전 포화 C₁₅ 알코올을 더 변형하여 해당 에테르를 생산하는데, 이러한 알킬화제로는 R-X가 있으며, 여기서 R은 알킬이고 X는 할로겐, 술폰일, 황산기 등의 좋은 이탈기이다. 이러한 알킬화제의 비제한적인 몇 가지 예에는 할로겐화알킬, 술폰화알킬과 황산알킬이 포함된다. 일반적으로 상기 C₁₅ 알코올을 먼저 염기를 써서 C₁₅ 알콕사이드로 바꾸고, 이어서 이 C₁₅ 알콕사이드를 R-X와 반응시켜 아래 합성안 4에 나타낸 것처럼 해당 에테르를 생성할 수 있는데, 여기서 X는 Cl, Br 또는 I이다. 몇몇 태양에서는 이 염기가 금속 나트륨 등의 활성 금속이거나 수소화나트륨, 수소화알루미늄리튬, 수소화붕소나트륨 등의 금속 수소화물일 수 있다.

합성안 4

또 한편으로 C₁₅ 올레핀성 알코올을 먼저 앞서 설명한 것과 같이 알킬화하거나 에스테르화고 이어서 아래 합성안 5처럼 여기에 수소를 첨가할 수 있는데, 이 때 R'은 R이나 C(=O)R이고, R은 H 또는 알킬이다.

합성안 5

아래 합성안 6에서, 이 에스테르화는 앞서 기술한 것과 같은 방식으로 진행할 수 있다. 후속 수소 첨가 단계는 전술한 것과 같은 방식으로 진행할 수 있다. 한편으로 이중결합에 대한 이 후속 수소 첨가 단계에 -O-C(=O)R 작용기에 영향을 주지 않을 어떠한 수소 첨가 촉매라도 사용하여 선택적 첨가를 할 수 있다. 몇몇 태양에서는 이 수소 첨가 촉매가 황화디페닐을 촉매독으로 사용하는 Pd/C인데, 이 촉매는 Mori 외, Org . Lett ., 8, 3279~3281 (2006)에 기재한 것처럼, O-C(=O)R 작용기의 가수소분해 없이 올레핀 작용기를 선택적으로 환원하며, 이는 본 명세서의 참고 문헌으로 포함되어 있다. 다른 태양에서는 폴리(에틸렌글리콜)과 Adams 촉매, 즉 PtO₂를 용매로 이용하여 1기압의 수소로 이중결합에 선택적으로 수소를 부가할 수 있다. Adams 촉매의 사용은 Mori 외, Org . Lett ., 8, 3279~3281 (2006)에서 기재하고 있는데, 이 내용은 본 명세서의 참고 문헌으로 포함되어 있다.

합성안 6

상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질의 수소 첨가를 로듐-키랄 디포스핀 착물 등의 비대칭 수소 첨가 촉매 존재 하에서 진행하여 다른 입체이성질체가 실질적으로 없는 입체특이적 수소 첨가 생성물을 생성할 수 있다. 상기 비대칭 수소 첨가 촉매의 비제한적인 예로 로듐-DIPAMP 촉매를 들 수 있다. 이 로듐-DIPAMP 촉매와 기타 비대칭 수소 첨가 촉매는 Vineyard 외, J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, (18), 5946; Ryoji Noyori, "Asymmetric Catalysis In Organic Synthesis", John Wiley & Sons Inc., New York, Chapter 2, pp. 16~94(1994)와 Blaser 외, "Asymmetric Catalysis on Industrial Scale : Challenges , Approaches and Solutions", Wiley-VCH, Weinheim, pp. 23~52 (2004)에서 기재하고 있는데, 이들 내용 전부는 본 명세서에서 인용에 의하여 포함하고 있다.

몇몇 태양에서는 비대칭 수소 첨가 촉매의 존재하에 α-파네센과 β-파네센에 수소를 첨가하여 파네산의 네 가지 가능한 입체이성질체 중 하나를 생성할 수 있는데, 이 입체이성질체는 아래 나타낸 화합물 (III-a), (III-b), (III-c)와 (III-d)이다.

이와 비슷하게 비대칭 수소 첨가 촉매의 존재하에 파네솔에 수소를 첨가하여 아래 나타낸 것처럼 3,7,11-트리메틸도데칸-1-올의 네 가지 가능한 입체이성질체 중 하나를 생성할 수 있다.

이와 비슷하게 비대칭 수소 첨가 촉매의 존재하에 네롤리돌에 수소를 첨가하여 아래 나타낸 것처럼 3,7,11-트리메틸도데칸-3-올의 네 가지 가능한 입체이성질체 중 하나를 생성할 수 있다.

이와 비슷하게 비대칭 수소 첨가 촉매의 존재하에 C₁₅ 올레핀성 알코올이나 그들의 알킬화, 에스테르화, 황산화, 인산화, 술폰화 또는 포스폰산화(phosphonated) 생성물에 수소를 첨가하여 해당 입체특이적 수소 첨가 생성물을 생성할 수도 있다.

본 방법의 또 다른 대안에서는 상기 C₁₅ 올레핀성 알코올의 수소 첨가와 알킬화, 에스테르화, 황산화, 술폰화, 인산화 또는 포스폰산화가 동시에 일어날 수 있다.

연료 조성물

본 명세서에서 개시하는 연료 조성물은 경제적이고 환경 친화적인 방식으로 제조할 수 있다. 유리하게도 본 발명에서 제공하는 이소프레노이드 화합물은 하나 이상의 미생물로부터 제조할 수 있다. 이 이소프레노이드 화합물은 디젤이나 제트 연료, 특히 본 발명에서 제공하는 연료 조성물의 재생 가능한 에너지원이 된다. 나아가 이 이소프레노이드 화합물은 연료, 연료 성분 및/또는 연료 첨가제가 재생 불가능한 자원에 의존하는 정도를 줄일 수 있다. 몇몇 태양에서는 본 발명이 생명공학으로 가공한 파네산을 함유하는 연료 조성물을 망라한다.

앞서 설명한 것처럼 본 발명의 실시 태양은 디젤 또는 제트 연료로 특히 쓸 모 있는 여러 가지 연료 조성물을 제공한다. 현재 시중의 디젤과 지방산 메틸 에스테르 유래 바이오디젤 연료와 비교할 때 본 명세서에서 개시하는 연료 조성물은 산화적 분해에 대한 저항성이 더 크며 따라서 저장 수명이 더 길다. 그 결과 몇몇 태양에서는 이 연료 조성물이 적어도 약 1년, 적어도 약 2년, 적어도 약 3년, 적어도 약 4년, 적어도 약 5년, 적어도 약 10년, 적어도 약 15년, 적어도 약 20년 또는 적어도 약 25년의 저장 수명을 가진다. 다른 태양에서는 이 연료 조성물이 적어도 약 50년의 저장 수명을 가진다. 나아가 또 다른 태양에서는, 이 연료 조성물이 50년을 넘는 저장 수명을 가진다.

본 발명을 제한된 수의 실시 태양을 들어 기술하였지만, 어느 한 태양의 특정 요소가 본 발명의 다른 실시 태양에도 해당되는 것은 아니다. 본 발명의 모든 측면을 대표하는 어느 한 실시 태양이란 없다. 몇몇 태양에서는, 본 조성물이나 방법이 본 명세서에서 언급하지 않은 수많은 화합물 또는 단계들을 포함할 수 있다. 다른 실시 태양에서 이 조성물이나 방법은 본 명세서에서 든 화합물 또는 단계들을 아무 것도 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다. 기술한 상기 실시 태양에 대한 변형물이나 변경도 있을 수 있다. 예를 들어, 이 디젤 연료가 정상 파라핀과 가지친 파라핀의 혼합물이어야만 하는 것은 아니다. 이 디젤 연료는 그 방향족 함량이 중량 기준으로 10% 미만이고 황 함량이 100 ppm 미만이기만 하면 어떤 종류의 탄화수소라도 함유할 수 있다. 이 디젤 연료의 방향족 함량이 중량 기준 10% 미만이고 황 함량이 100 ppm 미만인 것이 바람직하지만, 10%를 넘는 방향족 함량 및/또는 100 ppm이 넘는 황 함량을 갖춘 디젤 연료도 어떠한 용도에는 적합하다. 이 디젤 연료의 적용 분야가 디젤 기관에 국한되지 않는다는 것에 유의하여야 한다. 이 디젤 연료는 디젤 연료가 필요한 모든 장치, 예를 들어 비상 발전기에 쓸 수 있다. 비록 모든 디젤 연료의 세탄가는 적어도 40이 될 것을 규제받고 있지만 본 발명의 실시 태양에 따른 디젤 연료가 전부 이러한 규제에 따를 필요는 없다. 즉 세탄가가 40에 못 미치는 디젤 연료도 쓸 수가 있다. 상기 디젤 연료를 제조하고 사용하는 방법을 얼마간의 단계를 들어 설명한 바 있다. 몇몇 실시 태양에서는 이러한 단계를 어떠한 순서로 실시하더라도 무방하다. 몇몇 태양에서는 하나 이상의 단계를 생략하거나 합치더라도 실질적으로 동일한 결과를 얻을 수 있다. 이하 첨부하는 청구항들은 본 발명의 범위에 속하는 모든 이러한 변형물과 변경 사항을 포섭하려는 의도이다.

본 명세서에서 언급한 모든 간행물과 특허 출원은 인용에 의하여 여기서 포함되는바, 그 포함되는 정도는 각각의 간행물이나 특허 출원을 구체적이고 낱낱이 가리켜서 인용에 의하여 포함한다고 하는 경우와 마찬가지이다. 명확한 이해를 위하여 본 발명을 앞서 예시와 도시를 통하여 얼마간 상세히 기술하였지만, 이 분야의 당업자라면 본 발명의 개시 내용에 비추어 볼 때, 이하 첨부하는 청구항의 범위나 취지에 어긋나지 않고도 본 발명 기술 내용에 어떠한 변화와 변형을 줄 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다.

도 1은 이소펜텐일 디인산(isopentenyl diphosphate ("IPP")) 생산을 위한 메발론산(mevalonate)("MEV") 경로의 모식도이다.

도 2는 IPP와 디메틸알릴 피로인산(dimethylallyl pyrophosphate ("DMAPP")) 생산을 위한 DXP 경로의 모식도이다. Dxs는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-인산(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate )이고, Dxr은 1-데옥시-D-자일룰로스-5-인산 환원이성질화효소(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase, IspC로도 알려져 있음)이다. IspD는 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성 효소(4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol synthase)이다. IspE는 44-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성 효소이다. IspF는 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디인산 합성 효소이다. IspG는 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부텐일-4-디인산 합성 효소(IspG)이고 IspH는 이소펜텐일/디메틸알릴 디인산 합성 효소이다.

도 3은 발현 플라스미드 pAM97의 지도를 보여준다.

도 4는 발현 플라스미드 pAM408의 지도를 보여준다.

도 5는 발현 플라스미드 pAM424의 지도를 보여준다.

도 6A~E는 벡터 pAM489의 ERG20-P_GAL-tHMGR 삽입물, 벡터 pAM491의 ERG13-P_GAL-tHMGR 삽입물, 벡터 pAM493의 IDI1-P_GAL-tHMGR 삽입물, 벡터 pAM495의 ERG10-P_GAL-ERG12 삽입물, 벡터 pAM497의 ERG8-P_GAL-ERG19 삽입물을 보여준다.

도 7은 발현 플라스미드 pAM373과 pAM342의 지도를 보여준다.

도 8은 발현 플라스미드 pAM404의 지도를 보여준다.

도 9는 BP사 Whiting 정유 설비에서 얻은 2번 디젤유와 여기에 5%, 20%와 50% 파네산(AMD-200)을 가한 혼합물(blend)의 ASTM D 975 시험 데이터이다.

도 10은 BP사 Carson 정유 설비에서 얻은, 캘리포니아 대기 자원 위원회 요건(CARB 연료)을 만족하는 디젤유와 여기에 파네산(AMD-200) 5%, 20%, 50%와 65%를 가한 혼합물에 대한 ASTM D 975 시험 데이터이다. 이 특정 CARB 시료는 CARB 연료에 흰히 들어가는 윤활도 향상제를 포함하지 않는다.

도 11A~B는 2번 디젤과 CARB 디젤에 다양한 분량의 파네산(AMD-200)을 가한 혼합물의 증류 프로필이다.

본 발명의 실시를 위해서, 달리 규정하지 않는 경우는, 생합성 분야의 통상적인 기술을 사용할 수 있는데, 이러한 기술은 이 분야 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 기술에 대하여 본 명세서에서 완전하게 기술하고 있지 않은 부분은 그에 관한 수많은 과학 기술 문헌을 참조할 수 있다.

이하의 실시예에서 그 안에 있는 숫자(예를 들어 분량, 온도 등)에 관하여서는 정확을 기하려고 노력하였지만, 변이나 편차가 있을 수 있고 본 명세서에 기재하는 숫자에 단순한 오타가 있는 경우에는 이 분야의 당업자는 본 명세서 나머지 부분의 기재로부터 정확한 값을 짐작할 수 있을 것이다. 따로 표시하지 않는 경우 온도는 ℃ 단위이고 압력은 해수면 위 대기압과 같거나 그와 유사하다. 모든 시약 은 달리 표시가 없는 한 시중에서 입수하였다. 이하의 실시예는 예시 목적일 뿐이고, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.

실시예 1

본 실시예는 오페론 단위로 조직된 Saccharomyces cerevisiae MEV 경로의 효소를 비롯한 효소들을 암호화하는 발현 플라스미드를 제조하기 위한방법을 기술한다.

발현 플라스미드 pMevT는 MevT 오페론을 pBAD33 벡터에 삽입하여 생성하였다. 이 MevT 오페론은 체내에 매우 흔한 전구 물질인 아세틸-CoA를 (R)-메발론산(mevalonate)으로 함께 변환하는 MEV 경로의 효소 집단, 즉 아세토아세틸-CoA 티올라제(thiolase), HMG-CoA 합성 효소(synthase), HMG-CoA 환원 효소를 암호화한다. 이 MevT 오페론은 대장균 게놈 DNA로부터 ato B 유전자(GenBank 접속 번호 NC_000913 영역: 2324131..2325315)의 암호화 서열(아세토아세틸-CoA 티올라제 암호화)을, Saccharomyces cerevisiae로부터 ERG13 유전자(GenBank 접속 번호 X96617, 영역: 220..1695)의 암호화 서열(HMG-CoA 합성 효소 암호화)을, Saccharomyces cerevisiae로부터 HMG 1 유전자(GenBank 접속 번호 M22002, 영역: 1660..3165)의 암호화 서열(절단형(truncated) HMG-CoA 환원 효소(tHMGR) 암호화)을 PCR 증폭하여 생성하였다. HMG 1 유전자 조각의 증폭을 위한 상류 방향(upstream) PCR 프라이머는 인위적인 개시 코돈을 포함하였다. 증폭된 이 조각들을 겹침 부위 연장(overlap extension)법으로 이어 붙였는데(SOEing), 그 동안 ato B와 ERG 13 암호화 서열의 뒤에 리보솜 결합 자리를 도입하였다. 3' 돌출 부(overhang)를 붙인 후, MevT 오페론을 TA 클로닝 벡터 pCR4(탤리포니아 Carlsbad의 Invitrogen)에 연결하였다. 이어서 MevT 오페론을 pBAD33 벡터(Guzman 외 (1995) J. Bacteriol . 177(14): 4121~4130)의 XmaI PstI 제한 자리에 연결하였다. 이 오페론을 P_Lac 프로모터의 조절하에 두기 위하여 pBAD33의 araC-P _BAD NsiI-XmaI 조각을 pBBR1MCS의 NsiI - XmaI 조각으로 바꾸어, 발현 벡터 pMevT(미국 특허 제7,192,751호를 보라)를 얻었다.

발현 플라스미드 pAM36-MevT66은 MevT66 오페론을 pAM36 벡터에 삽입하여 얻었다. pAM36 벡터는 AscI - SfiI - AsiSI - XhoI - PacI - FsIl - PmeI 제한 자리를 갖춘 올리고뉴클레오티드 카세트를 pACYC184 벡터(GenBank 접속 번호 XO6403)에 삽입하고, 테트라마이신 저항성 부여 유전자를 pACYC184에서 제거하여 생성하였다. MevT66 오페론은 서열 번호 1을 주형으로 하여 합성하여 제조하였는데, 이 오페론은 대장균 게놈 DNA로부터 ato B 유전자(GenBank 접속 번호 NC_000913 영역: 2324131..2325315), Saccharomyces cerevisiae로부터 온 ERG13 유전자(GenBank 접속 번호 X96617, 영역: 220..1695), Saccharomyces cerevisiae로부터 온 HMG1 유전자(GenBank 접속 번호 M22002, 영역: 1660..3165)의 절단 형태를 갖추고 있는데, 이 세 서열 모두는 대장균 내의 발현을 위하여 코돈 최적화되어 있다. 합성하여 제조한 MevT66 오페론의 양 말단엔 5' EcoRI 제한 자리와 3' HindIII 제한 자리가 있어서 표준적인 pUC나 pACYC 복제 기점(origin) 벡터 등의 클로닝용 벡터에 있는 적합한 제한 자리에 클로닝해 넣을 수 있다. MevT66 오페론은 양 말단의 SfiI과 AsiSI 제한 자리 사이 영역에서 증폭되었는데, 증폭한 DNA 조각을 SfiI과 AsiSI 제한 효소를 이용하여 완전히 소화하였고, 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하여 약 4.2 kb DNA 조각을 겔로부터 겔 정제 키트(캘리포니아 Valencia의 Qiagen)로 추출하고 분리한 DNA 조각을 pAM36 벡터의 SfiI과 AsiSI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pAM36-MevT66을 얻었다.

발현 플라스미드 pAM25는 MevT66 오페론을 pAM29 벡터에 삽입하여 생성하였다. pAM29 벡터는 pZS24-MCS1(Lutz와 Bujard(1997) Nucl Acids Res 25: 1203~1210)로부터 얻은 p15A 복제 기점과 카나마이신 저항성 부여 유전자를 올리고뉴클레오티드로부터 제조한 lacUV5 프로모터와 조립하여 제조하였다. MevT66 오페론(전술한 pAM36-MevT66 내용을 보라)을 함유하는, DNA 합성물을 EcoRI과 HindIII 제한 효소로 완전하게 소화하고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하여, 대략 4.2 kb DNA 조각을 겔로부터 추출하였다. 이 분리한 DNA 조각을 pAM29의 EcoRI과 HindIII 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pAM25를 얻었다.

발현 플라스미드 pMevB-Cm은 MevB 오페론을 pBBR1MCS-1 벡터에 삽입하여 생성하였다. MevB 오페론은 (R)-메발론산을 IPP로 함께 변환하는 효소들의 한 무리를 암호화하는데, 즉 메발론산 키나아제, 포스포메발론산 키나아제, 메발론산 피로인산 카르복시화 효소이다. MevB 오페론은 Saccharomyces cerevisiae 게놈 DNA 로부터 ERG12 유전자(GenBank 접속 번호 X55875, 영역: 580..1911)(메발론산 키나아제 암호화), ERG8 유전자(GenBank 접속 번호 Z49939, 영역: 3363..4718)(포스포메발론산 키나아제 암호화)와 MVD1 유전자(GenBank 접속 번호 X97557, 영역: 544..1734)(메발론산 피로인산 카르복시화 효소 암호화)의 암호화 서열을 PCR 증폭하고, 이 PCR 조각들을 겹침부 연장함(SOEing)으로써 생성하였다. 적절한 프라이머 서열을 골라 증폭 도중 ERG12와 ERG8의 종료 코돈을 TAA로부터 TAG로 바꾸어 리보솜 결합 자리를 도입하였다. 3' A 돌출부를 붙인 다음, MevB 오페론을 TA 클로닝 벡터 pCR4(캘리포니아 Carlsbad의 Invitrogen)에 연결하였다. 클론한 이 유전자 구조물을 PstI 제한 효소로 완전하게 소화하여 MevB 오페론을 잘라 내었고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하고, 대략 4,2 kb DNA 조각을 겔에서 추출한 다음, 이 분리한 DNA 조각을 pBBR1MCS-1(Kovach 외, Gene 166(1): 175~176 (1995))의 PstI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pMevB-Cm을 얻었다.

플라스미드 pMBI는 MBI 오페론을 pBBR1MCS-3 벡터에 삽입하여 생성하였다. MevB 오페론의 효소 외에 MBI 오페론은 또한 IPP가 DMAPP로 변화되는 것을 촉매화하는 이소펜텐일 피로인산 이성질화효소도 암호화한다. MBI 오페론은 5' 말단에 XmaI 제한 자리를 가지는 프라이머를 이용하여 대장균 게놈 DNA에서 idi 유전자(GenBank 접속 번호 AF119715)의 암호화 서열을 증폭하고, 이 증폭한 DNA 조각을 XmaI 제한 효소로 완전하게 소화한 다음, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하고, 겔로부터 약 0.5 kb 조각을 추출한 다음 분리한 DNA 조각을 pMevB-Cm 발현 플라스미드의 XmaI 제한 자리에 연결함으로써 MevB 오페론의 3' 말단에 idi를 놓아 생성하였다. 이 MBI 오페론을 벡터 pBBR1MCS-3(Kovach 외., Gene 166(1): 175~176 (1995))의 SalI SacI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pMBI를 얻었다(미국 특허 제7,192,751호를 보라).

발현 플라스미드 pMBIS는 ispA 유전자를 pMBI에 삽입하여 생성하였다. ispA 유전자는 파네실 피로인산 합성 효소를 암호화하는데, 이 효소는 IPP 두 분자가 한 분자의 DMAPP와 축합하여 FPP를 생성하는 반응을 촉매한다. ispA 유전자(GenBank 접속 번호 D00694, 영역: 484..1383)의 암호화 서열은 대장균 게놈 DNA로부터 SacII 제한 자리를 가지는 정방향 프라이머와 SacI 프라이머를 가지는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 이 증폭한 PCR 생성물을 SacII과 SalI 제한 효소로 완전하게 소화한 다음, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하고, 겔로부터 약 0.9 kb 조각을 추출한 다음 분리한 DNA 조각을 pMBI의 SalI SacI 제한 자리에 연결하여 ispA 유전자를 idi와 MevB 오페론의 3'에 놓아 발현 플라스미드 pMBIS를 얻었다(미국 특허 제7,192,751호를 보라).

발현 플라스미드 pAM45는 MBIS 오페론을 pAM36-MevT66에 삽입하고 lacUV5 프로모터를 상기 MBIS와 MevT66 오페론의 앞에 더하여 생성하였다. 이 MBIS 오페론은 5' XhoI 제한 자리와 3' PacI 제한 자리를 함유하는 프라이머를 이용하여 pMBIS로부터 PCR 증폭하였다. 이 증폭한 PCR 생성물을 XhoI과 PacI 제한 효소로 완전하게 소화한 다음, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하고, 겔로부터 약 5.4 kb 조각을 추출한 다음 분리한 DNA 조각을 pAM36-MevT66의 XhoI과 PacI 제한 자리에 연결함으로써 발현 플라스미드 pAM43을 얻었다. lacUV5 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 한 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드로부터 합성한 다음, 이를 pAM43의 AscI SfiI과 AsiSI XhoI 제한 자리에 서브클로닝하여 발현 플라스미드 pAM45를 얻었다.

실시예 2

본 실시예는 오페론 단위로 조직된 Staphylococcus aureus MEV 경로의 효소를 비롯한 효소들을 암호화하는 발현 플라스미드를 제조하기 위한 방법을 기술한다.

발현 플라스미드 pAM41은 절단형 Saccharomyces cerevisiae HMG-CoA 환원 효소를 암호화하는 HMG1 유전자의 암호화 서열을 Staphylococcus aureus HMG-CoA 환원 효소(GenBank 접속 번호 BA000017, 영역: 2688925..2687648)를 암호화하는 mvaA 유전자의 암호화 서열로 대체하여 pAM25 발현 플라스미드로부터 유도하였다. mvaA 유전자의 암호화 서열은 Staphylococcus aureus subsp. aureus(ATCC 70069) 게놈 DNA로부터 4-49 mvaA SpeI(서열 번호: 13)과 4-49 mvaAR XbaI(서열 번호: 14)의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였고, 이 증폭한 DNA 조각을 SpeI 제한 효소로 완전하게 소화한 다음, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하고, 겔로부터 약 1.3 kb 조각을 추출하였다. HindIII 제한 효소를 이용하여 pAM25 플라스미드를 완전하게 소화함으로써 HMG1의 암호화 서열을 pAM25로부터 제거하였다. 이렇게 하여 얻은 선형 DNA의 말단 돌출부를 T4 DNA 중합효소를 이용하여 둔화(blunt)하였다. 이 DNA 조각을 SpeI 제한 효소로 부분 소화한 다음, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하고, 겔로부터 약 4.8 kb 조각을 추출하였다. 이 분리한 DNA 조각을 상기 SpeI -소화한 mvaA PCR 생성물에 연결하여 발현 플라스미드 pAM41을 얻었다.

발현 플라스미드 pAM52는 절단형 Saccharomyces cerevisiae HMG-CoA 합성 효소를 암호화하는 ERG13 유전자의 암호화 서열을 Staphylococcus aureus HMG-CoA 합 성 효소(GenBank 접속 번호 BA000017, 영역: 2689180..2690346)를 암호화하는 mvaS 유전자의 암호화 서열로 대체하여 pAM41 발현 플라스미드로부터 유도하였다. mvaS 유전자의 암호화 서열은 Staphylococcus aureus subsp. aureus(ATCC 70069) 게놈 DNA로부터 HMGS 5'Sa mvaS -S(서열 번호: 15)와 HMGS 3'Sa mvaS -AS(서열 번호: 16)의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였고, 이 증폭한 DNA 조각을 PCR 프라이머로 이용하여 pAM41의 HMG1 유전자의 암호화 서열을 Geiser 외(BioTechniques 31:88~92(2001))의 방법에 따라 대체하여 발현 플라스미드 pAM52를 얻었다. pAM52 속의 atoB(opt):mvaS : mvaA 오페론의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:2이다.

발현 플라스미드 pAM97은 발현 플라스미드 pAM52의 (atoB(opt):mvaS : mvaA) 오페론으로 MevT66 오페론을 대체함으로써 pAM45 발현 플라스미드로부터 유도하였다. 발현 플라스미드 pAM45를 AsiSI와 SfiI 제한 효소로 완전하게 소화한 다음 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하여 MevT66 오페론을 가지고 있지 않은 약 8.3 kb의 DNA 조각을 겔로부터 추출하였다. 19-25 atoB SfiI-S(서열 번호: 17)와 19-25 mvaA-AsiSI-AS(서열 번호: 18)의 프라이머들을 이용하여 pAM52의 (atoB(opt):mvaS:mvaA) 오페론을 PCR 증폭하고 이 PCR 생성물을 AsiSI와 SfiI 제한 효소로 완전하게 소화한 다음, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하여 약 3.8 kb의 DNA 조각을 겔로부터 추출하였다. 이 분리한 DNA 조각을 발현 플라스미드 pAM45의 AsiSI와 SfiI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pAM97(플라스미드 지도를 위해서는 도 3을 보라)을 얻었다.

실시예 3

본 실시예는 오페론 단위로 조직된 대장균 DXP 경로의 효소를 비롯한 효소들을 암호화하는 발현 플라스미드를 제조하기 위한 방법을 기술한다.

발현 플라스미드 pAM408은 pAM29 벡터에 "꼭대기(top)" DXP 경로의 효소들을 암호화하는 유전자를 삽입하여 생성하였다. "꼭대기" DXP 경로의 효소들에는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-인산 합성 효소(대장균 dxs 유전자가 암호화), 1-데옥시-D-자일룰로스-5-인산 환원 이성질화 효소(대장균 dxr 유전자가 암호화), 4-디인산시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성 효소(대장균 ispD 유전자가 암호화)와 4-디인산시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성 효소(대장균 ispE 유전자가 암호화)가 포함되는데, 이들은 함께 피루브산과 D-글리세르알데히드-3-인산을 4-디인산시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-인산으로 변환한다. "꼭대기" DXP 경로의 효소들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 조각들은 대장균 균주 DH1(ATCC #33849)로부터 dxs(GenBank 접속 번호 U00096 영역: 437539..439401), dxr (GenBank 접속 번호 U00096 영역: 193521..194717), ispD (GenBank 접속 번호 U00096 영역: 2869803..2870512)과 ispE (GenBank 접속 번호 U00096 REGION 1261249..1262100) 유전자의 암호화 서열을 PCR 증폭하여 제조하였는데, 이들 서열에는 최적 Shine Dalgarno 서열을 보태었고, SEQ ID NOS: 19~26에 나타낸 프라이머를 이용하여 5'과 3' 제한 자리를 붙여 주었다. 이 PCR 생성물을 겔 전기 영동으로 분리하고, 겔을 추출한 다음, 적절한 제한 효소(dxs 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 XhoI과 KpnI, dxrD 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 KpnI과 ApaI , ispD 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 ApaI과 NdeI, ispD 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 ApaI과 NdeI, ispE 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 NdeI과 MluI)로 완전하게 소화하고, 이를 PCR 정제 키트(캘리포니아주 Valencia의 Qiagen)로 정제하였다. 각 PCR 생성물을 대략 같은 몰 수로 연결 반응 혼합물에 부가하여 개별 유전자들을 한 오페론으로 이었다. 이 연결 반응으로부터 반응 혼합물 1 μL를 이용하여 별도의 유전자 카세트 두 개, 즉 dxs - dxr과 ispD - ispE 유전자 카세트를 PCR 증폭하였다. 이 dxs - dxr 카세트는 프라이머 67-1A-C(서열번호:19)와 67-1-D-C(서열 번호:22)로, ispD - ispE 카세트는 67-1E-C(서열 번호:23)와 67-1H-C(서열 번호:26)로 PCR 증폭하였다. 이 두 개의 PCR 생성물을 겔 전기 영동으로 분리하고 겔을 추출하였다. dxs - dxr 유전자 카세트를 함유하는 PCR 생성물은 XhoI과 KpnI으로 완전하게 소화시켰고, ispD - ispE 유전자 카세트를 함유하는 PCR 생성물은 ApaI과 NdeI, ispD 유전자를 포함하는 PCR 생성물은 ApaI과 MluI 제한 효소로 완전하게 소화시켰다. 이 두 PCR 생성물을 정제하고, 이 정제한 DNA 조각들을 pAM29 벡터의 SalI MluI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pAM408(플라스미드 지도는 도 4를 보라)을 얻었다.

발현 플라스미드 pAM409는 pAM369 벡터에 "바닥(bottom)" DXP 경로의 효소들을 암호화하는 유전자를 삽입하여 생성하였다. "바닥" DXP 경로의 효소들에는 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디인산 합성 효소(대장균 ispF 유전자가 암호화), 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부텐일-4-디인산 합성 효소(대장균 ispG 유전자가 암호화)와 이소펜텐일/디메틸알릴 디인산 합성 효소(대장균 ispH 유전자가 암호화) 가 포함되는데, 이들은 함께 4-디인산시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-인산을 IPP와 DMAPP로 변환한다. IPP는 또한 이소펜텐일 디인산 이성질화 효소(대장균의 idi 유 전자가 암호화)의 활성에 의하여 DMAPP으로 변환된다. DMAPP은 나아가 파네실 디인산 합성 효소(대장균 ispA 유전자가 암호화)의 활성에 의하여 FPP로 변환될 수 있다. "바닥" DXP 경로의 효소뿐 아니라 파네실 디인산 합성 효소와 이소펜텐일 디인산 이성질화 효소를 암호화하는 오페론을 대장균 균주 DH1(ATCC #33849)로부터 ispF (GenBank 접속 번호 U00096 영역: 2869323..2869802), ispG (GenBank 접속 번호 U00096 영역: 2638708..2639826), ispH (GenBank 접속 번호 U00096 영역: 26277..27227), idi (GenBank 접속 번호 AF119715)와 ispA (GenBank 접속 번호 D00694 영역: 484..1383) 유전자의 암호화 서열을 PCR 증폭하여 제조하였는데, 이들 서열에는 최적 Shine Dalgarno 서열을 보태었고, SEQ ID NOS: 27~36에 나타낸 프라이머를 이용하여 5'과 3' 제한 자리를 붙여 주었다. 이 PCR 생성물을 겔 전기 영동으로 분리하고, 겔을 추출한 다음, 적절한 제한 효소(ispF 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 BamHI과 ApaI, ispG 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 KpnI과 ApaI , ispH 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 SalI과 KpnI, idi 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 SalI과 HindIII, ispA 유전자를 포함하는 PCR 생성물에는 HindIII와 NcoI)로 완전하게 소화하고, 이를 정제하였다. 각 PCR 생성물을 대략 같은 몰 수로 연결 반응 혼합물에 부가하여 개별 유전자들을 한 오페론으로 이었다. 이 연결 반응으로부터 반응 혼합물 1 μL를 이용하여 별도의 유전자 카세트 두 개, 즉 ispF - ispG와 ispH - idi - ispA 유전자 카세트를 PCR 증폭하였다. 이 ispF - ispG 유전자 카세트는 프라이머 67-2A-C(서열번호:27)와 67-2-D-C(서열 번호:30)로, ispH - idi - ispA 카세트는 67-2E-C(서열 번호:31)와 67-2J-C(서열 번호:36)로 PCR 증폭하였다. 이 두 개의 PCR 생성물을 겔 전기 영동으로 분리하고 겔을 추출하였다. ispF - ispG 유전자 카세트를 함유하는 PCR 생성물은 BamHI과 KpnI으로 완전하게 소화시켰고, ispH - idi - ispA 유전자 카세트를 함유하는 PCR 생성물은 KpnI과 NcoI 제한 효소로 완전하게 소화시켰다. 이 두 PCR 생성물을 정제하였다. 벡터 pAM369는 pAM29의 p15A 복제 기점과 pZE12-luc(Lutz와 Bujard (1997) Nucl Acids Res . 25:1203~1210)로부터의 앰피실린 저항성을 위한 베타-락탐 분해 효소 유전자를 올리고뉴클레오티드에서 생성한 lacUV5 프로모터와 조립하여 제조하였다. "바닥" DXP 경로의 오페론을 함유하는 이 두 개의 분리한 PCR 생성물을 pAM369 벡터의 BamHI NcoI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pAM409를 얻었다.

발현 플라스미드 pAM409의 유도체이며, 광범위한 숙주 범위를 가지는 RK2 복제 기점을 포함하는 발현 플라스미드 pAM424는 lacUV5 프로모터와 pAM409의 ispFGH-idi-ispA 오페론을 pAM527로 옮겨 생성하였다. pAM257 벡터를 다음과 같이 생성하였다: 9-156A(서열 번호:37)와 9-156B(서열 번호:38) 프라이머를 이용하여 RK2의 par 위치를 RK2 플라스미드 DNA(Meyer 외, (1975) Science 190:1226~1228)로부터 PCR 증폭한 다음, AstII와 XhoI 제한 효소로 이 2.6 kb PCR 생성물을 완전하게 소화하고, 이 DNA 조각을 p15 복제 기점과 pZE12-luc(Lutz와 Bujard (1997) Nucl Acids Res . 25:1203~1210)로부터의 클로암페니콜 저항성 부여 유전자를 함유하는 플라스미드에 여결하여 플라스미드 pAM37-par를 얻었다. pAM37-par를 SacI과 HindIII 제한 효소로 완전하게 소화하고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분해한 다음, RK2 par 위치와 클로암페니콜 저항성 유전자를 포함하는 이 DNA 조각을 겔로부터 추출하였다. 이 분리한 DNA 조각을 미니 RK2 복제 단위(replicon) pRR10(Roberts 외. (1990) J Bacteriol. 172:6204~6216)의 SacI HindIII 자리에 연결하여 pAM133 벡터를 얻었다. pAM133을 BglIII와 HindIII 제한 효소로 완전하게 소화하고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분해한 다음, 앰피실린 저항성 유전자와 oriT 결합성 기점(conjugative origin)을 가지고 있지 않은 약 6.4 kb의 DNA 조각을 겔로부터 추출하였다. 이 분리한 DNA 조각을 PciI XhoI 제한 자리를 비롯한 다중 클로닝 자리를 함유하는, 합성으로 제조한 DNA 조각에 연결하여 벡터 pAM257을 얻었다. 발현 플라스미드 pAM409를 XhoI과 PciI 제한 효소로 완전하게 소화하고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하고 약 4.4 kb인 DNA 조각을 겔로부터 추출한 다음, 이 분리한 DNA 조각을 pAM257 벡터의 XhoI PciI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pAM424를 얻었다(플라스미드 지도는 도 5를 보라).

실시예 4

본 실시예는 MEV 경로의 효소를 비롯한 효소들을 암호화하는 핵산을 Saccharomyces cerevisiae의 염색체의 특정 유전자 자리(locus)에 표적 지향 통합(targeted integration)하기 위한 벡터의 제조 방법을 제공한다.

Saccharomyces cerevisiae 균주 Y002(CEN.PK2 유전 배경(background); MATa; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2), Y007 (S288C 유전　MATa trp1Δ63), Y051(S288C 유전 배경; MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 P_GAL1-HMG1¹⁵⁸⁶ ^-3323 P_GAL1-upc2-1 erg9::P_MET3-ERG9::HIS3 P_GAL1-ERG20 P_GAL1-HMG1¹⁵⁸⁶ ^-3323)과 EG123(MATa ura3; trp1; leu2; his4 can1)으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 이 균주들을 1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤(Bacto-peptone)과 2% 덱스트로스(YPD 배지)를 함유하는 액체 배지 속에서 밤새 배양하였다. 10 mL 액체 배양물로부터 세포를 3,100 rpm 원심분리하고 세포 펠렛을 10 mL의 초순수로 씻은 다음 다시 원심분리하였다. 게놈 DNA를 제조사가 설명하는 절차에 따라 Y-DER 효소 DNA 추출 키트(일리노이주 Rockford의 Pierce Biotechnologies)로 추출하였다. 추출한 게놈 DNA를 100 μL의 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 속에 재현탁하고, OD₂₆₀ _/280를 ND-1000 분광광도계(델라웨어주 Wilmington의 NanoDrop Technologies)로 측정하여 게놈 DNA 농도와 순도를 측정하였다.

중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 DNA 증폭은 Phusion 고충실도 DNA 중합 효소 시스템(핀란드 Espoo의 Finnzymes OY)을 이용하여 제조사에서 제시하는 실험 방법에 따라 Applied Biosystems 2720 Thermocycler(캘리포니아주 Foster City의 Applied Biosystems Inc) 장비로 이루어졌다. TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터(캘리포니아주 Carlsbad의 Invitrogen)에 삽입할 DNA 조각의 PCR 증폭을 마친 후, 1 μL의 Qiagen Taq 중합 효소(캘리포니아주 Valencia의 Qiagen)를 상기 반응 혼합물에 가하여 추가적으로 72℃의 PCR 사슬 연장 단계를 10분 동안 진행하고, 이어서 4℃로 식혀 A 뉴클레오티드 돌출부를 만들었다. PCR 증폭을 마친 후, 50% 글리세롤 용액 8 μL를 반응 혼합물에 가하고, 이 전체 혼합물을 0.5 ㎍/mL 브롬화에티듐을 함유하는 1% TBE(0.89 M 트리스, 0.89 M 붕산, 0.02 M EDTA 나트륨 염) 아가로스 겔 속 에 가하였다.

아가로스 겔 전기 영동은 120 V, 400 mA에서 30분 동안 행하였고, DNA 띠를 자외선으로 시각화하였다. 무균 면도날로 DNA 띠를 겔로부터 잘라내고, 이 잘라낸 DNA를 제조사에서 제시하는 설명에 따라 Zymoclean Gel DNA 회수 키트(캘리포니아주 Orange의 Zymo Research)로 겔 정제하였다. 이 정제한 DNA를 초순수 10 μL로 용리하고 ND-1000 분광 광도계로 OD₂₆₀ _/280 측정하여 DNA 농도와 순도를 측정하였다.

DNA 연결 반응은 정제한 PCR 생성물 100~500 ㎍과 High Concentration T4 DNA 연결 효소(매사추세츠주 Ipswich의 New England Biolabs)를 써서 제조사가 제시하는 방법에 따라 수행하였다. 플라스미드 전파를 위해서 제조사가 제시하는 방식에 따라 연결한 DNA 구조들로 대장균 DH5알파 화학 처리 형질전환 가능(competent) 세포(캘리포니아주 Carlsbad의 Invitrogen)를 형질전환하였다. 양성 전환주들을 1.5% 박토아가(bacto agar), 1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl과 50 ㎍/mL의 적절한 항생제를 함유하는 고형 배지 위에서 선별하였다. 분리한 전환주들을 50 ㎍/mL의 카베니실린(carbenicillin) 또는 카나마이신 항생제를 함유하는 37℃의 액체 LB 배지 속에서 16시간 동안 배양하고 플라스미드를 QIAprep Spin Miniprep 키트(캘리포니아주 Valencia의 Qiagen)로 제조사가 제시하는 절차에 따라 정제하였다. 이 DNA 구조들을 진단용 제한 효소 소화하고 아가로스 겔 위에서 분리하고 가시화하여 확인하였다. 선택한 DNA 구조들은 DNA 서열 분석으로도 확인하였는데, 서열 분석은 Elim Biopharmaceuticals Inc.(캘리포니아주 Hayward) 에서 수행하였다.

플라스미드 pAM489는 벡터 pAM471의 ERG20-P_GAL-tHMGR 삽입부를 벡터 pAM466에 삽입함으로써 생성하였다. 벡터 pAM471은 ERG20-P_GAL-tHMGR DNA 조각을 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터(캘리포니아주 Carlsbad의 Invitrogen)에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 ERG20(ERG20 뉴클레오티드 위치 1 내지 1208; ATG 개시 코돈의 A 뉴클레오티드가 1)의 해독틀(ORF)인 (ERG20), 서로 다른 방향인(divergent) GAL1과 GAL10 프로모터(GAL1 뉴클레오티드 위치 -1 내지 -668)를 갖춘 게놈 자리(genomic locus)인 P_GAL과 HMG1(HMG1 뉴클레오티드 위치 1586 내지 3323)의 절단형 ORF인 (tHMGR)를 포함하고 있다. 벡터 pAM466은 TRP1^-856 ^to ⁺⁵⁴⁸DNA 조각을 TOPO TA pCR2.1(캘리포니아주 Carlsbad의 Invitrogen)에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 뉴클레오티드 위치 -856 내지 548에 걸쳐 있는 Saccharomyces cerevisiae의 야생형 TRP1 유전자 자리의 한 단편을 포함하고 있고, 또한 내부에 천연 유래가 아닌 XmaI 제한 자리를 염기 -226과 -225 사이에 두고 있다. ERG20-P_GAL-tHMGR과 TRP1^-856 ^to ⁺⁵⁴⁸ DNA 조각들은 표 1에 나타낸 PCR 증폭에 의하여 제조하였다. pAM489의 제조를 위하여 pAM471 400 ng과 pAM466 100 ng을 XmaI 제한 효소(매사추세추주 Ipswich의 New England Biolabs)로 완전하게 소화하고, ERG20-P_GAL-tHMGR 삽입물과 선형화한 pAM466 벡터에 해당하는 DNA 조각들을 겔로 정제하였다. 이어서 4 몰 당량의 상기 정제된 삽입물을 1 몰 당량의 정제된 선형화 벡터에 연결 시켜 pAM489(지도는 도 6A를, ERG20-P_GAL-tHMGR의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 3 을 보라)를 얻었다.

pAM489의 제조를 위한 PCR 증폭

PCR 차수	주 형	프라이머 1	프라이머 2	PCR 생성물
1	Y051 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK001-G (서열 번호: 39)	61-67-CPK002-G (서열 번호: 40)	TRP1^-856 ^to ^-226
	Y051 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK003-G (서열 번호: 41)	61-67-CPK004-G (서열 번호: 42)	TRP1^-225- ^to ⁺⁵⁴⁸
	EG123 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK025-G (서열 번호: 62)	61-67-CPK050-G (서열 번호: 70)	ERG20
	Y002 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK051-G (서열 번호: 71)	61-67-CPK052-G (서열 번호: 72)	P_GAL
	Y002 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK053-G (서열 번호: 73)	61-67-CPK031-G (서열 번호: 63)	tHMGR
2	TRP1^-856 ^to ^-226과 TRP1^-225- ^to ⁺⁵⁴⁸정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK001-G (서열 번호: 39)	61-67-CPK004-G (서열 번호: 42)	TRP1^-856 ^to ⁺⁵⁴⁸
2	ERG20과 P_GAL 정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK025-G (서열 번호: 62)	61-67-CPK052-G (서열 번호: 72)	ERG20-P_GAL
3	ERG20-P_GAL과 tHMGR 정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK025-G (서열 번호: 62)	61-67-CPK031-G (서열 번호: 63)	ERG20-P_GAL-tHMGR

플라스미드 pAM491은 벡터 pAM472의 ERG13-P_GAL-tHMGR 삽입부를 벡터 pAM467에 삽입함으로써 생성하였다. 벡터 pAM472는 ERG13-P_GAL-tHMGR DNA 조각을 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터의 XmaI 제한 자리에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 ERG13(ERG13 뉴클레오티드 위치 1 내지 1626)의 해독틀(ORF)인 ERG13, 서로 다른 방향인(divergent) GAL1과 GAL10 프로모터(GAL1 뉴클레오티드 위치 -1 내지 -668)를 갖춘 게놈 자리인 P_GAL과 HMG1(HMG1 뉴클레오티드 위치 1586 내지 3323)의 절단형 ORF인 tHMGR를 포함하고 있다. 벡터 pAM467은 URA3^-723 ^to ⁷⁰¹DNA 조각을 TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 뉴클레오티드 위치 -723 내지 -224에 걸쳐 있는 Saccharomyces cerevisiae의 야생형 URA3 유전자 자리의 한 단편을 포함하고 있고, 또한 내부에 천연 유래가 아닌 XmaI 제한 자리를 염기 -224과 -223 사이에 두고 있다. ERG13-P_GAL-tHMGR과 URA3^-723 ^to ⁷⁰¹ DNA 조각들은 표 2에 나타낸 PCR 증폭에 의하여 제조하였다. pAM491의 제조를 위하여 pAM472 400 ng과 pAM467 100 ng을 XmaI 제한 효소로 완전하게 소화하고, ERG13-P_GAL-tHMGR 삽입물과 선형화한 pAM467 벡터에 해당하는 DNA 조각들을 겔로 정제하였다. 이어서 4 몰 당량의 상기 정제된 삽입물을 1 몰 당량의 정제된 선형화 벡터에 연결시켜 pAM491(지도는 도 6B를, ERG13-P_GAL-tHMGR의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 4를 보라)를 얻었다.

pAM491의 제조를 위한 PCR 증폭

PCR 차수	주 형	프라이머 1	프라이머 2	PCR 생성물
1	Y051 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK005-G (서열 번호: 43)	61-67-CPK006-G (서열 번호: 44)	URA3^-723 ^to ^-224
	Y051 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK007-G (서열 번호: 45)	61-67-CPK008-G (서열 번호: 46)	URA3^-223 ^to ⁷⁰¹
	Y002 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK032-G (서열 번호: 64)	61-67-CPK054-G (서열 번호: 74)	ERG13
		61-67-CPK052-G (서열 번호: 72)	61-67-CPK055-G (서열 번호: 75)	P_GAL
		61-67-CPK031-G (서열 번호: 63)	61-67-CPK053-G (서열 번호: 73)	tHMGR
2	URA3^-723 ^to ^-224와 URA3^-223 ^to ⁷⁰¹정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK005-G (서열 번호: 43)	61-67-CPK008-G (서열 번호: 46)	URA3^-723 ^to ⁷⁰¹
2	ERG13과 P_GAL 정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK032-G (서열 번호: 64)	61-67-CPK052-G (서열 번호: 72)	ERG13-P_GAL
3	ERG13-P_GAL과 tHMGR 정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK031-G (서열 번호: 63)	61-67-CPK032-G (서열 번호: 64)	ERG13-P_GAL-tHMGR

플라스미드 pAM493은 벡터 pAM473의 IDI1-P_GAL-tHMGR 삽입부를 벡터 pAM468에 삽입함으로써 생성하였다. 벡터 pAM4732는 IDI1-P_GAL-tHMGR DNA 조각을 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 IDI1(IDI1 뉴클레오티드 위치 1 내지 1017)의 해독틀(ORF)인 IDI1, 서로 다른 방향인(divergent) GAL1과 GAL10 프로모터(GAL1 뉴클레오티드 위치 -1 내지 -668)를 갖춘 게놈 자리인 P_GAL과 HMG1(HMG1 뉴클레오티드 위치 1586 내지 3323)의 절단형 ORF인 tHMGR를 포함하고 있다. 벡터 pAM468은 ADE1^-825 ^to ⁶⁵³DNA 조각을 TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 뉴클레오티드 위치 -225 내지 -653에 걸쳐 있는 Saccharomyces cerevisiae의 야생형 ADE1 유전자 자리의 한 단편을 포함하고 있고, 또한 내부에 천연 유래가 아닌 XmaI 제한 자리를 염기 -226과 -225 사이에 두고 있다. IDI1-P_GAL-tHMGR과 ADE1^-825 ^to ⁶⁵³ DNA 조각들은 표 3에 나타낸 PCR 증폭에 의하여 제조하였다. pAM493의 제조를 위하여 pAM473 400 ng과 pAM468 100 ng을 XmaI 제한 효소로 완전하게 소화하고, IDI1-P_GAL-tHMGR 삽입물과 선형화한 pAM468 벡터에 해당하는 DNA 조각들을 겔로 정제하였다. 이어서 4 몰 당량의 상기 정제된 삽입물을 1 몰 당량의 정제된 선형화 벡터에 연결시켜 pAM493(지도는 도 6C를, IDI1-P_GAL-tHMGR 삽입부의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 5를 보라)를 얻었다.

pAM493 제조를 위한 PCR 증폭

PCR 차수	주 형	프라이머 1	프라이머 2	PCR 생성물
1	Y007 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK009-G (서열 번호: 47)	61-67-CPK010-G (서열 번호: 48)	ADE1^-825 ^to ^-226
	Y007 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK011-G (서열 번호: 49)	61-67-CPK012-G (서열 번호: 50)	ADE1^-225 ^to ⁶⁵³
	Y002 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK047-G (서열 번호: 69)	61-67-CPK064-G (서열 번호: 84)	IDI1
		61-67-CPK052-G (서열 번호: 72)	61-67-CPK065-G (서열 번호: 85)	P_GAL
		61-67-CPK031-G (서열 번호: 63)	61-67-CPK053-G (서열 번호: 73)	tHMGR
2	ADE1^-825 ^to ^-226과 ADE1^-225 ^to ⁶⁵³정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK009-G (서열 번호: 47)	61-67-CPK012-G (서열 번호: 50)	ADE1^-825 ^to ⁶⁵³
2	IDI1과 P_GAL 정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK047-G (서열 번호: 69)	61-67-CPK052-G (서열 번호: 72)	IDI1-P_GAL
3	IDI1-P_GAL과 tHMGR 정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK031-G (서열 번호: 63)	61-67-CPK047-G (서열 번호: 69)	IDI1-P_GAL-tHMGR

플라스미드 pAM495는 벡터 pAM474의 ERG10-P_GAL-ERG12 삽입부를 벡터 pAM469에 삽입함으로써 생성하였다. 벡터 pAM474는 ERG10-P_GAL-ERG12 DNA 조각을 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 ERG10(ERG10 뉴클레오티드 위치 1 내지 1347)의 해독틀(ORF)인 ERG10, 서로 다른 방향인(divergent) GAL1과 GAL10 프로모터(GAL1 뉴클레오티드 위치 -1 내지 -668)를 갖춘 게놈 자리인 P_GAL과 ERG12(ERG12 뉴클레오티드 위치 1 내지 1482)의 해독틀인 ERG12를 포함하고 있다. 벡터 pAM469는 HIS3^-32 ^to ^-1000-HISMX-HIS3^-504 ^to ^-1103 DNA 조각을 TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 뉴클레오티드 위치 32 내지 -1000과 504 내지 1103에 걸쳐 있는 Saccharomyces cerevisiae의 야생형 HIS3 유전자 자리의 두 단편과 HISMX 표지(marker)를 포함하고 있고, 또한 내부에 천연 유래가 아닌 XmaI 제한 자리를 HIS⁵⁰⁴ ^to ^-1103서열과 HISMX 표지 사이에 두고 있다. ERG10-P_GAL-ERG12와 HIS3^-32 ^to ^-1000-HISMX-HIS3^-504 ^to ^-1103 DNA 조각들은 표 4에 나타낸 PCR 증폭에 의하여 제조하였다. pAM495의 제조를 위하여 pAM474 400 ng과 pAM469 100 ng을 XmaI 제한 효소로 완전하게 소화하고, ERG10-P_GAL-ERG12 삽입물과 선형화한 pAM469 벡터에 해당하는 DNA 조각들을 겔로 정제하였다. 이어서 4 몰 당량의 상기 정제된 삽입물을 1 몰 당량의 정제된 선형화 벡터에 연결시켜 pAM495(지도는 도 6D를, ERG10-P_GAL-ERG12 삽입부의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 6을 보라)를 얻었다.

pAM495 제조를 위한 PCR 증폭

PCR 차수	주 형	프라이머 1	프라이머 2	PCR 생성물
1	Y007 게놈 DNA 100 ng씩	61-67-CPK013-G (서열 번호: 51)	61-67-CPK014alt-G (서열 번호: 52)	HIS3^-32 ^to ^-1000
		61-67-CPK017-G (서열 번호: 54)	61-67-CPK018-G (서열 번호: 55)	HIS3⁵⁰⁴ ^to ^-1103
		61-67-CPK035-G (서열 번호: 65)	61-67-CPK056-G (서열 번호: 76)	ERG10
		61-67-CPK057-G (서열 번호: 77)	61-67-CPK058-G (서열 번호: 78)	P_GAL
		61-67-CPK040-G (서열 번호: 66)	61-67-CPK059-G (서열 번호: 79)	ERG12
	플라스미드 pAM330 DNA^** 10 ng	61-67-CPK015alt-G (서열 번호: 53)	61-67-CPK016-G (서열 번호: 92)	HISMX
2	HIS3⁵⁰⁴ ^to ^-1103과 HISMX- 미정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK015alt-G (서열 번호: 53)	61-67-CPK018-G (서열 번호: 55)	HISMX- HIS3⁵⁰⁴ ^to ^-1103
2	ERG10과 P_GAL 미정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK035-G (서열 번호: 65)	61-67-CPK058-G (서열 번호: 78)	ERG10-P_GAL
3	HIS3^-32 ^to ^-1000과 HISMX- HIS3⁵⁰⁴ ^to ^-1103 미정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK013-G (서열 번호: 51)	61-67-CPK018-G (서열 번호: 55)	HIS3^-32 ^to ^-1000-HISMX- HIS3⁵⁰⁴ ^to ^-1103
3	ERG10-P_GAL과 ERG12 미정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK035-G (서열 번호: 65)	61-67-CPK040-G (서열 번호: 66)	ERG10-P_GAL-ERG12
** pAM330의 HISMX 표지는 van Dijken 외, ((2000) Enzyme Microb . Technol . 26(9~10):706~714)에 기재한 것처럼 pFA6a-HISMX6-PGAL1에서 유래하였다.

플라스미드 pAM497은 벡터 pAM475의 ERG8-P_GAL-ERG19 삽입부를 벡터 pAM470에 삽입함으로써 생성하였다. 벡터 pAM475는 ERG8-P_GAL-ERG19 DNA 조각을 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 ERG8(ERG8 뉴클레오티드 위치 1 내지 1512)의 해독틀(ORF)인 ERG8, 서로 다른 방향인(divergent) GAL1과 GAL10 프로모터(GAL1 뉴클레오티드 위치 -1 내지 -668)를 갖춘 게놈 자리인 P_GAL과 ERG19(ERG19 뉴클레오티드 위치 1 내지 1341)의 해독틀인 ERG19를 포함하고 있다. 벡터 pAM470은 LEU2^-100 ^to ^-450-HISMX-LEU2¹⁰⁹⁶ ^to ¹⁷⁷⁰DNA 조각을 TOPO TA pCR2.1 클로닝 벡터에 삽입하여 생성하였는데, 이 DNA 조각은 뉴클레오티드 위치 -100 내지 450과 1096 내지 1770에 걸쳐 있는 Saccharomyces cerevisiae의 야생형 LEU2 유전자 자리의 두 단편과 HISMX 표지(marker)를 포함하고 있고, 또한 내부에 천연 유래가 아닌 XmaI 제한 자리를 LEU2^-100 ^to ⁴⁵⁰서열과 HISMX 표지 사이에 두고 있다. ERG8-P_GAL-ERG19와 LEU2^-100 ^to ⁴⁵⁰-HISMX-LEU2¹⁰⁹⁶ ^to ¹⁷⁷⁰ DNA 조각들은 표 5에 나타낸 PCR 증폭에 의하여 제조하였다. pAM497의 제조를 위하여 pAM475 400 ng과 pAM470 100 ng을 XmaI 제한 효소로 완전하게 소화하고, ERG8-P_GAL-ERG19 삽입물과 선형화한 pAM470 벡터에 해당하는 DNA 조각들을 겔로 정제하였다. 이어서 4 몰 당량의 상기 정제된 삽입물을 1 몰 당량의 정제된 선형화 벡터에 연결시켜 pAM497(지도는 도 6E를, ERG8-P_GAL-ERG19 삽입부의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 7을 보라)를 얻었다.

pAM497 제조를 위한 PCR 증폭

PCR 차수	주 형	프라이머 1	프라이머 2	PCR 생성물
1	Y007 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK019-G (서열 번호: 56)	61-67-CPK020-G (서열 번호: 57)	LEU2^-100 ^to ⁴⁵⁰
	Y007 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK023-G (서열 번호: 60)	61-67-CPK024-G (서열 번호: 61)	LEU2¹⁰⁹⁶ ^to ¹⁷⁷⁰
	플라스미드 pAM330 DNA^** 10 ng	61-67-CPK021-G (서열 번호: 58)	61-67-CPK022-G (서열 번호: 59)	HISMX
	Y002 게놈 DNA 100 ng	61-67-CPK041-G (서열 번호: 67)	61-67-CPK060-G (서열 번호: 80)	ERG8
		61-67-CPK061-G (서열 번호: 81)	61-67-CPK062-G (서열 번호: 82)	P_GAL
		61-67-CPK046-G (서열 번호: 68)	61-67-CPK063-G (서열 번호: 83)	ERG19
2	LEU2¹⁰⁹⁶ ^to ¹⁷⁷⁰과 HISMX 미정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK021-G (서열 번호: 58)	61-67-CPK024-G (서열 번호: 61)	HISMX-LEU2¹⁰⁹⁶ ^{to 1770}
2	ERG8과 P_GAL 미정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK041-G (서열 번호: 67)	61-67-CPK062-G (서열 번호: 82)	ERG8-P_GAL
3	LEU2^-100 ^to ⁴⁵⁰과 HISMX- LEU2¹⁰⁹⁶ ^to ¹⁷⁷⁰ 미정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK019-G (서열 번호: 56)	61-67-CPK024-G (서열 번호: 61)	LEU2^-100 ^to ⁴⁵⁰-HISMX- LEU2¹⁰⁹⁶ ^to ¹⁷⁷⁰
3	ERG8-P_GAL과 ERG19 미정제 PCR 생성물 100 ng씩	61-67-CPK041-G (서열 번호: 67)	61-67-CPK046-G (서열 번호: 68)	ERG8-P_GAL-ERG19
** pAM330의 HISMX 표지는 van Dijken 외, ((2000) Enzyme Microb . Technol . 26(9~10):706~714)에 기재한 것처럼 pFA6a-HISMX6-PGAL1에서 유래하였다.

실시예 5

본 실시예에서는 FPP를 변환하는 효소들을 암호화하는 발현 플라슴;드의 제조 방법에 대하여 기술한다.

발현 플라스미드 pAM373은 대장균에서 발현하도록 코돈 최적화한 Artemis annua의 β-파네센 합성 효소(GenBank 접속 번호 AY835398)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 pTrc99A 벡터에 삽입하여 생성하였다. β-파네센 합성 효소를 암호화하는 이 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 8 주형으로부터 합성하여 생성하였고, 그 DNA 합성 생성물을 프라이머 A(서열 번호: 86)와 프라이머 B(서열 번호: 87)로 PCR 증폭하였다. β-파네센 합성 효소 암호화 서열을 포함하는 이 PCR 생성물에 선도(leader) NcoI 제한 자리를 만들기 위하여 원 폴리펩티드 서열에서 두 번째 아미노산을 암호화하던 코돈(세린을 암호화하던 TCG)을 5' PCR 프라이머에서 아스파르트산을 암호화하는 코돈(GAC)으로 바꾸었다. 이렇게 생긴 PCR 생성물을 NcoI 제한 효소로 부분 소화한 다음, SacI 제한 효소로 완전히 소화하고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하여 β-파네센 합성 효소 서열을 포함하는 약 1.7 kb의 DNA 조각을 겔로부터 추출하였다. 이 분리한 DNA 조각을 pTrc99A 벡터의 NcoI SacI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pAM373(플라스미드 지도는 도 7을 보라)을 얻었다.

발현 플라스미드 pAM342는 대장균에서 발현하도록 코돈 최적화한 Picea abies의 α-파네센 합성 효소(GenBank 접속 번호 AY473627)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 pTrc99A 벡터에 삽입하여 생성하였다. α-파네센 합성 효소를 암호화하는 이 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 9 주형으로부터 합성하여 생성하였고, 그 DNA 합성 생성물을 프라이머 C(서열 번호: 88)와 프라이머 D(서열 번호: 89)로 PCR 증폭하였다. 이렇게 생긴 PCR 생성물을 NcoI과 SacI 제한 효소로 완전히 소화하고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하여 α-파네센 합성 효소 서열을 포함하는 약 1.7 kb의 DNA 조각을 겔로부터 추출하였다. 이 분리한 DNA 조각을 pTrc99A 벡터의 NcoI SacI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pAM342(플라스미드 지도는 도 7을 보라)를 얻었다.

발현 플라스미드 pAM341과 pAM353은 pRS425-Gal1 벡터(Mumberg 외, (1994) Nucl. Acids . Res . 22(25): 5767~5768)에 α-파네센 합성 효소 또는 β-파네센 합성 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하여 생성하였다. 이 뉴클레오티드 서열 삽입부들은 Picea abies의 α-파네센 합성 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(GenBank 접속 번호 AY473627, 영역: 24..1766) 또는 Artemis annua의 β-파네센 합성 효소(GenBank 접속 번호 AY835398)를 암호화하는 서열을 주형으로 삼아 합성하였는데, 양 서열 모두 Saccharomyces cerevisiae에서의 발현을 위하여 코돈 최적화(각각 SEQ ID NOS: 11과 10)하였다. 이 합성한 뉴클레오티드 서열은 5' BamHI과 3'XhoI 제한 자리들로 둘러싸여 있으므로 표준 pUC나 pACYC 기원 벡터 등의 클로닝 벡터의 적합한 제한 자리에 들어 맞는다. 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하여 α-파네센 합성 효소 또는 β-파네센 합성 효소의 암호화 서열을 포함하는 대략 1.7 kb DNA 조각을 겔에서 추출하고, 이 분리한 DNA 조각을 pRS425-Gal1 벡터의 BamHI과 XhoI 제한 자리에 연결하여, 발현 플라스미드 pAM341 또는 pAM353을 각각 얻었다.

발현 플라스미드 pAM404는 Saccharomyces cerevisiae에서 발현하도록 코돈 최적화한 Artemis annua의 β-파네센 합성 효소(GenBank 접속 번호 AY835398)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 pAM178 벡터에 삽입하여 생성하였다. β-파네센 합성 효소를 암호화하는 이 뉴클레오티드 서열은 pAM353으로부터 GW-52-84 pAM326 BamHI(서열 번호: 90)과 GW-52-84 pAM326 NheI(서열 번호: 91) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 이렇게 생긴 PCR 생성물을 BamHI과 NheI 제한 효소로 완전히 소화하고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분리하여 β-파네센 합성 효소 서열을 포함하는 약 1.7 kb의 DNA 조각을 겔로부터 추출하였다. 이 분리한 DNA 조각을 pAM178 벡터의 BamHI과 NheI 제한 자리에 연결하여 발현 플라스미드 pAM404(플라스미드 지도는 도 8을 보라)를 얻었다.

실시예 6

이 실시예에서는 본 발명에 유용한 대장균 숙주세포 균주를 생성하는 방법에 대하여서 기술한다.

표 6에 자세히 나타낸 것과 같이 상기 화학 처리로 형질전환 가능하게 된 대장균 모세포를 상기 실시예 1 내지 3과 실시예 5의 발현 플라스미드 하나 이상으로 형질전환하여 숙주 균주(host strain)을 제조하였다.

대장균 숙주 균주들

숙주 균주	대장균 모체 균주	발현 플라스미드	선택용 항생제
B526	DH1	pAM97 pAM373	100 ㎍/mL 카르베니실린 34 ㎍/mL 클로암페니콜
B552		pMevT pMBIS pAM373	100 ㎍/mL 카르베니실린 34 ㎍/mL 클로암페니콜 5 ㎍/mL 테트라사이클린
B592		pMevT pMBIS pAM342	100 ㎍/mL 카르베니실린 34 ㎍/mL 클로암페니콜 5 ㎍/mL 테트라사이클린
B650	DH10B	pAM373	100 ㎍/mL 카르베니실린
B651		pAM408 pAM373	100 ㎍/mL 카르베니실린 50 ㎍/mL 카나마이신
B652		pAM424 pAM373	100 ㎍/mL 카르베니실린 35 ㎍/mL 클로암페니콜
B653		pAM408 pAM424 pAM373	100 ㎍/mL 카르베니실린 50 ㎍/mL 카나마이신 35 ㎍/mL 클로암페니콜

숙주 세포 형질전환주를 항생제 함유 Luria-Bertani(LB) 한천 배지 위에서 선별하였다. 단일 콜로니를 LB 한천으로부터 항생제와 LB 액체 배지 5 mL를 함유하는 시험관으로 옮겼다. B526, B552와 B592 숙주 세포 형질전환주를 37℃로 회전 교반기에서 250 rpm으로 정상기(stationary phase)에 이를 때까지 배양하였다. B650, B651, B652와 B653 숙주 세포 형질전환주를 30℃로 회전 교반기에서 250 rpm으로 30 시간 동안 배양하였다. 이 세포들을 0.8% 포도당과 항생제를함유하는 M9-MOPS 배지(M9-MOPS 배지의 조성에 대해서는 표 7을 보라)에 4 내지 5회 연속으로 계대하여 최소 배지에 적응시켰다. 50% 글리세롤 400 μL와 액체 배양물 600 μL로 이루어진 1 mL의 저장용 분량씩 이 세포를 -80℃의 냉각 비알 속에 갈무리하였다.

M9-MOPS 배양 배지의 조성

성 분 명	(리터 당) 수 량
Na₂HPO₄ 7H₂O	12.8 g
KH₂PO₄	3 g
NaCl	0.5 g
NH₄Cl	1 g
MgSO₄	2 mmol
CaCl₂	0.1 mmol
티아민	0.1 ㎍
MOPS 완충액 pH 7.4	100 mmol
(NH₃)₆Mo7O₂₄ 4H₂O	3.7 ㎍
H₃BO₄	25 ㎍
CoCl₂	7.1 ㎍
CuSO₄	2.4 ㎍
MnCl₂	16 ㎍
ZnSO₄	2.9 ㎍
FeSO₄	0.28 mg

실시예 7

이 실시예에서는 본 발명에 유용한 Saccharomyces cerevisiae 균주를 생성하는 방법에 대하여서 기술한다.

Saccharomyces cerevisiae 균주 Y141과 Y140을 마련하기 위하여 Saccharomyces cerevisiae 균주 EPY224(Ro 외(2006)Nature 440: 940~943; PCT 특허 공보 WO2007/005604)에서 온 발현 플라스미드를 다영양 배지(rich medium) 속에서 배양하여 제거함으로써 균주 EPY300을 얻었다. EPY300 균주를 발현 플라스미드 pHM341이나 pAM353으로 형질전환하여 숙주 균주 Y141 또는 Y140을 각각 얻었다. 숙주 세포 형질전환주를 2% 포도당과 류신을 제외한 모든 아미노산을 함유하는 합성 규정 배지(synthetic defined medium)(SM-glu) 위에서 선별하였다. 단일 콜로니를 류신을 결여한 SM-glu 액체 5 mL를 담은 배양 비알로 옮기고 이 비알 속 세포 배양물을 정상기에 이를 때까지 30℃로 교반하면서 배양하였다. 50% 글리세롤 400 μL와 액체 배양물 600 μL로 이루어진 1 mL의 저장용 분량씩 이 세포를 -80℃의 냉각 비알 속에 갈무리하였다.

Saccharomyces cerevisiae Y258 균주를 마련하기 위하여, Saccharomyces cerevisiae 균주 CEN.PK2-1C(Y002)(MATa; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2)와 CEN.PK2-1D(Y003)(MATα; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2)(van Dijken 외. (2000) Enzyme Microb . Technol . 26(9~10):706~714)을 마련하였는데, 이는 ERG9 프로모터를 Saccharomyces cerevisiae MET3 프로모터로 바꾸고, ADE1 ORF를 Candida glabrata LEU2 유전자(CgLEU2)로 대체하여 MEV 경로의 유도성 유전자를 도입하기 위함이었다. 이 작업은 내재적 프로모터인 ERG9에 상동성이 있는 45 염기쌍을 포함하고 있는 50-56-pw100-G(서열 번호: 93)와 50-56-pw101-G(서열 번호: 94) 프라이머로 pAM328(서열 번호: 12) 벡터의 KanMX-PMET3 부위를 PCR 증폭하고, 이렇게 얻은 PCR 생성물 10 ㎍으로 대수 성장기에 있는 Y002와 Y003 세포를 형질전환함으로써 이루어졌는데, 형질전환에는 40% w/w 폴리에틸렌글리콜 3350(미주리주 세인트루이스의 Sigma-Aldrich), 100 mM 아세트산리튬(미주리주 세인트루이스의 Sigma-Aldrich)과 10 ㎍의 연어 정자 DNA(캘리포니아주 Carlsbad의 Invitrogen Corp.)를 이용하였고 이 세포를 30℃에서 30분 동안 배양한 다음 42℃에서 30분 동안 열 쇼크를 가하였다(Schiestl과 Gietz. (1989) Curr. Genet . 16, 339~346). 양성 재조합 균주가 0.5 ㎍/mL 제네티신(캘리포니아주 Carlsbad의 Invitrogen Corp.)을 함유하는 다영양 배지에서 자랄 수 있다는 점으로부터 이들을 선별하고, 선별한 콜로니를 진단용 PCR로 확인하였다. 이렇게 얻은 클론을 Y93(MAT a)과 Y94(MAT α)로 표시하였다. ADE1 ORF 좌우의 서열에 상동성이 있는 염기쌍 50개를 포함하고 있는 프라이머들인 61-67-CPK066-G(서열 번호: 95)와 61-67-CPK067-G(서열 번호: 96)를 이용하여 상기 3.5 kb의 CgLEU2 게놈 자리를 Candida glabrata 게놈 DNA(버지니아주 Manassas의 ATCC)로부터 증폭하고, 이 PCR 생성물 10 ㎍을 대수 성장 중인 Y93과 Y94 세포로 옮겼다. 양성 재조합 균주를 류신 보충 없이 자랄 수 있느냐 여부에 따라 선택하고 이를 진단용 PCR로 확인하였다. 이렇게 얻은 클론은 Y176(MAT a)과 Y177(MAT α)로 표시하였다.

이어서 Y188 균주를 생성하였는데, pAM491과 pAM495 플라스미드 DNA 2 ㎍을 PmeI 제한 효소(매사추세츠주 Beverly의 New England Biolabs)로 완전하게 소화하고 정제한 DNA 삽입부를 대수 성장 중인 Y176 세포에 도입하여 생성하였다. 양성 재조합 균주는 유라실과 히스티딘을 결여한 배지 위에서 성장할 수 있느냐로 선택하였고, 정확한 게놈 자리로 도입이 일어났는지는 진단용 PCR로 확인하였다.

이어서 Y189 균주를 생성하였는데, pAM489와 pAM497 플라스미드 DNA 2 ㎍을 PmeI 제한 효소로 완전하게 소화하고 정제한 DNA 삽입부를 대수 성장 중인 Y177 세포에 도입하여 생성하였다. 양성 재조합 균주는 트립토판과 히스티딘을 결여한 배지 위에서 성장할 수 있느냐로 선택하였고, 정확한 게놈 자리로 도입이 일어났는지는 진단용 PCR로 확인하였다.

다음 Y238 균주는 Y188과 Y189 균주로부터 세포 약 1×10⁷개를 YPD 배지 판 위에 실온에서 6시간 동안 섞어 주어 성접합이 일어나도록 하고, 이어서 이 혼합 세포 배양물을 히스티딘, 유라실과 트립토판이 없는 배지로 옮겨 이배체 세포의 성장 여부로 선별하였다. 이어서 pAM493 플라스미드 DNA 2 ㎍를 PmeI 제한 효소로 완전하게 소화하고 이 정제한 DNA 삽입부를 대수 성장 중인 상기 이배체 세포에 도입함으로써 이배체 세포를 형질전환하였다. 양성 재조합 균주는 아데닌이 없는 배지 위에서 자라는지 여부로 선별하였고, 정확한 게놈 자리 삽입이 일어났는지는 진단용 PCR로 확인하였다.

반배체 균주 Y211(MAT α)은 다음과 같이 생성하였는데, Y238 균주를 2% 아세트산칼륨과 0.02% 라피노스 액체 배지 속에서 포자 형성시키고, Singer Instruments사(영국 Somerset 소재)의 MSM300 series micromanipulator로 유전 4분체(tetrad) 약 200개를 단리하여 내고, 아데닌, 히스티딘, 유라실과 트립토판 없이도 성장할 수 있느냐 여부로 도입한 유전 물질을 적절한 유전자 보족체(complement)로 갖추고 있는 독립적인 유전적 단리물(isolate)들을 확인한 다음 모든 도입 DNA의 통합 여부를 진단용 PCR로 확인하여 이루어졌다.

마지막으로 숙주 균주 Y258은 Y211 균주를 pAM404 플라스미드 DNA로 형질전환하여 생성하였다. 숙주 세포 형질전환주를 2% 포도당과 류신을 제외한 모든 아미노산을 함유하는 합성 규정 배지(SM-glu)에서 선별하였다. 단일 콜로니를 류신을 결여한 액상 SM-glu 5 mL가 담긴 배양 비알로 옮기고 이 배양물을 교반하면서 정상기에 이를 때까지 30℃에서 배양하였다. 50% 글리세롤 400 μL와 액체 배양물 600 μL로 이루어진 1 mL의 저장용 분량씩 이 세포를 -80℃의 냉각 비알 속에 갈무리하였다.

실시예 8

이 실시예에서는 대장균 숙주 균주 속 MEV 경로를 통한 α-파네센과 β-파네센의 생산에 대하여 기술한다.

M9-MOPS 25 mL, 포도당 0.8%, 효모 추출물 0.5%와 표 6에 나타낸 것과 같이 항생제를 함유하는 각각의 125 mL 플라스크에 B552와 B592 숙주 균주의 저장용 분량(stock aliquot)을 각각 가하고, 이 세포들을 밤새 배양함으로써 숙주 균주의 파종 배양물(seed culture)을 수립하였다. 이 파종 배양물을 이용하여 M9-MOPS 40 mL, 포도당 2%, 효모 추출물 0.5%와 항생제를 함유하는 각각의 250 mL 플라스크를 약 0.05의 초기 OD₆₀₀로 접종하였다. 배양하는 세포는 회전 교반기로 30℃에서 250 rpm으로 세포의 OD₆₀₀가 약 0.2에 달할 때까지 배양하였고, 이 시점에서 40 μL의 1 M IPTG를 배양 배지에 가하여 숙주 세포가 파네센을 생산하도록 유도하였다. 유도 시점에서 파네센을 포획하기 위하여 이 배양물 위에 유기층(organic overlay) 8 mL를 가해 주었다. 내부 표준 물질로서 트랜스카리오필렌(trans-caryophyllene)을 더한 아세트산 1 mL를 담고 있는 깨끗한 유리 비알에 상기 유기층 2~10 μL를 옮김으로써 시료를 24시간마다 채취하였다.

상기 아세트산에틸 시료를 Agilent 5975 질량 분석기 (GC/MS) (캘리포니아주 Palo Alto의 Agilent Technologies Inc.)를 장착한 Agilent 6890N 기체 크로마토그래피 장치에서 최대 스캔 모드(full scan mode)(50~500 m/z)로 분석하였다. 각 시료 1 μL 속의 화합물들을 HP-5MS 컬럼(캘리포니아주 Palo Alto의 Agilent Technologies Inc.), 헬륨 운반 기체 및 이하의 온도 프로그램을 써서 분리하였다: 150℃로 3분 동안 유지, 분당 25℃로 200℃까지 승온, 분당 60℃로 300℃까지 승온, 300℃로 1분 동안 유지. 이 실험 방법에 따를 때, β-파네센은 보류 시간이 4.33분이라고 밝혀진 바 있다. 파네센 농도는 트랜스-카리오필렌을 가해준 아세트산에틸 속의 정제된 β-파네센(미주리주 세인트루이스의 Sigma-Aldrich)의 정량 검정 곡선과 실험에서 나타난 피크의 넓이를 비교하여 계산하였다.

B592 숙주 균주는 120시간째에 α-파네센을 대략 120 mg/L(3개의 독립 클론의 평균, 0시간째에 유도) 생산하였고, 최대 특이적 생산량이 46 mg/L/OD₆₀₀(1개의 대표 클론)이었다. B552 숙주 균주는 120시간째에 β-파네센을 대략 1.1 g/L(3개의 독립 클론의 평균, 0시간째에 유도) 생산하였고, 최대 특이적 생산량이 96 mg/L/OD₆₀₀(1개의 대표 클론)이었다.

실시예 9

이 실시예에서는 대장균 숙주 균주의 DXP 경로를 통한 β-파네센 생산에 관하여 기술한다.

M9-MOPS 25 mL, 포도당 0.8%, 효모 추출물 0.5%와 표 6에 나타낸 것과 같이 항생제를 함유하는 각각의 125 mL 플라스크에 B650, B651, B652와 B592 숙주 균주의 저장용 분량(stock aliquot)을 각각 가하고, 이 세포들을 밤새 배양함으로써 숙주 균주의 파종 배양물(seed culture)을 수립하였다. 이 파종 배양물을 이용하여 M9-MOPS 40 mL, 티아민 45 ㎍/mL, 미세 영양소, FeSO₄ 1.00×10^-5 mol/L, MOPS 0.1 M, 포도당 2%, 효모 추출물 0.5%와 항생제를 함유하는 각각의 250 mL 플라스크를 약 0.05의 초기 OD₆₀₀로 접종하였다. 배양하는 세포는 회전 교반기로 30℃에서 250 rpm으로 세포의 OD₆₀₀가 약 0.2 내지 0.3에 달할 때까지 배양하였고, 이 시점에서 40 μL의 1 M IPTG를 배양 배지에 가하여 숙주 세포가 파네센을 생산하도록 유도하였다. 유도 시점에서 β-파네센을 포획하기 위하여 이 배양물 위에 유기층(organic overlay) 8 mL를 가해 주었다. 깨끗한 튜브에 상기 유기층 100 μL를 옮김으로써 시료를 다양한 시점에서 채취하였다. 이 튜브를 원심분리하여 남아 있는 세포나 배지를 모두 없앤 다음, 상기 유기층 10 μL를 내부 표준 물질로서 베타- 또는 트랜스-카리오필렌(trans-caryophyllene)을 더한 아세트산 500 μL를 담고 있는 깨끗한 유리 비알에 옮겼다. 이 혼합물을 30초간 보르텍스 처리하고 실시예 8에 기재한 것처럼 분석하였다.

B653 균주는 β-파네센을 DCW g 당 대략 7 mg 생산하였다(DCW는 건조 세포 중량이다).

실시예 10

이 실시예에서는 Saccharomyces cerevisiae 숙주 균주에서 α-파네센과 β-파네센의 생산에 관하여 기술한다.

류신이 없는 SM-glu 25 mL를 함유하는 각각의 125 mL 플라스크에 Y141, Y140과 Y2582 숙주 균주의 저장용 분량(stock aliquot)을 각각 가하고, 이 세포들을 밤새 배양함으로써 숙주 균주의 파종 배양물(seed culture)을 수립하였다. 이 파종 배양물을 이용하여 포도당 0.2%, 갈락토오스 1.8%를 함유하고 류신이 없는 40 mL의 합성 규정 배지를 함유하는 각각의 250 mL 돌기 달린(baffled) 플라스크에 약 0.05의 초기 OD₆₀₀로 접종하였다. 배양하는 세포는 회전 교반기로 30℃에서 250 rpm으로 배양하였다. 이 Y141과 Y140 세포 배양물에 도데칸 8 mL를 가하여 덮었다. 상기 Y258 배양물은 미리스트산이소프로필 8 mL를 가하여 덮었다. 상기 Y141과 Y140 배양물을 24시간마다 120시간째까지 한번씩 채취하였고, Y258 배양물은 유도 후 72시간째에 상기 유기층 2 내지 10 μL를, 내부 표준 물질로서 베타- 또는 트랜스-카리오필렌(trans-caryophyllene)을 더한 아세트산 500 μL를 담고 있는 깨끗한 유리 비알에 옮김으로써 채취하였다. 상기 Y141과 Y140 시료는 실시예 8에 기재한 것처럼 분석하였고, Y258 시료는 실시예 11에 기재한 것처럼 분석하였다.

Y141 숙주 균주는 120시간째에 α-파네센을 대략 9.8 mg/L(3개의 독립 클론의 평균, 0시간째에 유도) 생산하였고, 최대 특이적 생산량이 3 mg/L/OD₆₀₀(1개의 대표 클론)이었다. Y140 숙주 균주는 120시간째에 β-파네센을 대략 56 mg/L(3개의 독립 클론의 평균) 생산하였고, 최대 특이적 생산량이 20 mg/L/OD₆₀₀(1개의 대표 클론)이었다. Y258 숙주 균주는 72시간째에 β-파네센을 대략 762 mg/L(3개의 독립 클론의 평균) 생산하였고, 최대 특이적 생산량이 145 mg/L/OD₆₀₀(1개의 대표 클론)이었다.

실시예 11

이 실시예에서는 호기성, 질소 제한성인 회분식 유가 배양(fed-batch cultivation)에서 대장균의 β-파네센 생산에 대하여 기술한다.

M9-MOPS 50 mL와 항생제를 함유하는 250 mL 플라스크에 B526 숙주 균주의 저장용 분량(stock aliquot)을 가하고, 이 세포를 밤새 배양함으로써 숙주 균주의 파종 배양물(seed culture)을 수립하였다. 이 파종 배양물을 이용하여 M9-MOPS 40 mL와 항생제를 함유하는 250 mL 플라스크에 약 1의 초기 OD₆₀₀로 접종하였다. 이 배양물을 OD₆₀₀가 3 내지 5로 될 때까지 다시 37℃의 회전 교반기에서 250 rpm으로 배양하였다.

표 8은 070522-1(과량 질소)과 070522-5(질소 제한)의 두 발효 회차에서의 최종 배지 조성을 나타낸다. 두 생물반응기(2L Applikon Bioconsole ADI 1025 with ADI 1010 controllers, 캘리포니아주 Foster City의 Applikon Biotechnology)에서 배치 배지는 121℃에서 30분 동안 열 멸균하였다. 멸균 후 부가물(post sterile addition, PSA)과 항생제(최종 농도 100 ㎍/L의 카베니실린과 34 ㎍/L의 클로암페니콜)를 저장 용액 형태로 여과 무균 처리하고 이를 각 생물반응기에 상판(head plate)를통하여 주사하였다. 모든 흔적 금속은 미리 이를 모아서 농축 용액(표 9)으로 만든 다음 PSA나 투입 배지(feed medium)에 보태어 주었다. 각 발효 회차의 시작 부피는 1 L였다. 모든 회차는 파종 배양물 50 mL를 상판을 통하여 주사(5% (v/v))함으로써 접종하였다.

발효 배지의 조성

성 분 명	배치 배지 (리터 당)	PSA (리터 당)	070522-1 회차의 투입 용액 (질소 과량) (리터 당)	070522-5회차의 투입 용액 (질소 제한) (리터 당)
포도당	-	15 g	650 g	650 g
KH₂PO₄	4.2 g	-	-	-
K₂HPO₄ 3H₂O	15.7 g	-	-	-
시트르산	1.7 g	-	-	-
(NH₄)₂SO₄	2 g	-	10.7 g	-
MgSO₄ 7H₂O	-	1.2 g	12 g	12 g
EDTA	8.4 mg	-	13 g	13 g
티아민 HCl	-	4.5 mg	-	-
배치 흔적 금속 용액	-	10 mL	-	-
투입 흔적 금속 용액	-	-	10 mL	10 mL

흔적 금속 용액의 조성

성 분 명	배치 흔적 금속 용액 (리터 당)	투입 흔적 금속 용액 (리터 당)
CoCl₂ 6H₂O	0.25 mg	0.4 mg
MnCl₂ 4H₂O	1.5 mg	2.35 mg
CuCl₂ 2H₂O	0.15 mg	0.25 mg
H₃BO₄	0.3 mg	0.5 mg
Na₂MoO₄ 2H₂O	0.25 mg	0.4 mg
Zn(CH₃COO)₂ 2H₂O	1.3 mg	1.6 mg
시트르산철(III) 수화물	10 mg	4.0 mg

배증 시간을 6 시간으로 하는 대수 성장용 포도당 투입(exponential glucose feed)은 초기 포도당괴(glucose bolus, 15 g)가 소진되고 용존 산소를 섞어 줌으로써 개시되었다. 최대값을 31 g/시간으로 하여 발효 반응기 소프트웨어(캘리포니아주 Foster City의 Applikon Biotechnology사 BioXpert)가 다음 방정식에 따라 투입 속도(feed rate)를 계산하도록 프로그램하였는데,

여기서 m _s 는 기질의 질량 흐름 속도(substrate mass flow rate)(g/시간), μ는 비성장률(specific growth rate), t ₀ 는 초기 포도당괴가 고갈된 시각이고 S ₀ 는 초기 기질 농도이며, hr은 시간(60분)이다. 최대 속도에 이르면 포도당 투입을 11.7 g/시간의 비율로 늦추고 발효 회차의 나머지 기간 동안 이 비율을 유지하였다.

발효는 30℃로 낮춘 온도에서 진행하였고, 생물반응기의 공기 흐름은 1 vvm으로 설정하였다. 초기 교반 속도는 700 rpm으로 하였고, 거품은 Biospumex 소포제 200 K로 조절하였다. 용존 산소 농도(tension)는 교반 연계(agitation cascade)(700~1200 rpm)와 농축 산소를 이용하여 40%로 하였고, pH는 9.9 N NH₄OH(농축 NH₄OH 2부에 대하여 H₂O 1부)를 써서 7로 유지하였다. 암모니아는 NOVA Bioprofile 300 Analyzer(매사추세츠주 Waltham의 Nova Biomedical Corp.)로 제조사의 설명에 따라 측정하였다.

숙주 세포의 β-파네센 생산은 1 M IPTG 1 mL를 배양 배지에 OD₆₀₀가 대략 30일 때 첨가하여 유발하였다. 휘발성인 β-파네센은 200 mL 헵탄올을 담은 기체 세척기(gas-washer)를 통하여 배출 기체(off-gas)를 배기함으로써 포획하였다. 이어서 이 헵탄올 용액을 아세트산에틸(희석률 100×)로 희석하였다. 발효액 50 μL와 HPLC 등급 메탄올 950 μL를 합하여 가용성 β-파네센을 발효액으로부터 추출하고, Fisher Vortex Genie 2(상표) 믹서(뉴욕주 Bohemia의 Scientific Industries, Inc.)로 이 시료를 최대 속도에서 약 30분 동안 흔들어주고, 시료의 세포 잔해를 14,000×g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛으로 가라앉혔다. 이 아세토니트릴 용액을 유리 HPLC 비알 속의 HPLC 등급 아세트산에틸 990 μL로 희석하였다.

아세트산에틸 시료는 불꽃 이온화 검출법(flame ionization detection)을 써서 Agilent 6890N Network 기체 크로마토그래피 시스템(캘리포니아주 Palo Alto의 Agilent Technologies, Inc.)으로 분석(GCFID)하였다. 각 시료 1 μL 분량을 주입하고 각 시료 속의 화합물을 DB1-MS 컬럼(30 m×250 ㎛×0.25 ㎛, 캘리포니아주 Palo Alto의 Agilent Technologies, Inc.), 헬륨 운반 기체와 이하의 온도 프로그램을 이용하여 분리하였다: 200℃로 1분 동안 유지, 분당 10℃로 230℃까지 승온, 분당 40℃로 300℃까지 승온, 300℃로 1분 동안 유지. 이 실험 방법에 따를 때, β-파네센은 보류 시간이 4.33분이라고 밝혀진 바 있다. 파네센 농도는 트랜스-카리오필렌을 가해준 아세트산에틸 속의 정제된 β-파네센(미주리주 세인트루이스의 Sigma-Aldrich)의 정량 검정 곡선과 실험에서 나타난 피크의 넓이를 비교하여 계산하였다.

070522-5(질소 제한) 회차의 발효는 070522-1(질소 과량) 회차 경우보다 세포 배양 밀도가 낮았고 β-파네센의 농도는 더 높았다. 070522-5 회차 발효(질소 제한)는 발효 배지의 모든 암모늄을 50시간째까지 소모한데 비하여 070522-1 회차 발효(질소 과량)은 모든 시료 채취 시점에서 과량의 암모늄을 포함하였다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 양 발효 회차는 배양액 속에 생산된 β-파네센의 대부분을 포함하였다.

생물반응기와 기체 세척기 사이의 파네센 분포

발효 회차	위 치	부피 (L)	농도 (g/L)	β-파네센(g)	전체 중 %
070522-1 (N 과량)	발효액	2	14.3	28.7	97.2%
070522-1 (N 과량)	헵탄올	0.2	4.1	0.8	2.8%
070522-5 (N 제한)	발효액	2	23.6	47.2	98.1%
070522-5 (N 제한)	헵탄올	0.2	4.5	0.9	1.9%

실시예 12

이 실시예에서는 배양한 대장균 숙주 균주 속의 β-파네센 분포를 결정하는 것에 대하여 기술한다.

65.5 시간 동안 진행한 발효 회차 070522-1로부터 얻은 냉동 전체 세포액(whole cell broth, WCB)을 주변 온도에서 녹였다. 대략 1.4 mL의 WCB를 스냅식 뚜껑(snap-cap)이 붙은 눈금 달린 2 mL 튜브에 넣고 10분 동안 무고정 로터(swinging cup rotor)를 써서 10,600 rcf로 원심분리하였다. 원심분리 후, xqm에서 세 개의 구별되는 층이 눈에 띄었는데, 세포 펠렛, 상청액과 유기산(가벼운 고체)의 층이었다. 튜브를 기울이자, 상기 유기산 위로 또 하나의 액체층(가벼운 액체)이 눈에 들어 왔다(상기 가벼운 고체를 뚫고 온 상청액일 수 있음). 이 가벼운 액체를 별도의 튜브에 피펫질로 옮기고, 가벼운 고체를 피펫 팁을 써서 별도의 튜브로 옮기고 무게를 재었다. 상기 상청액을 별도의 튜브에 따라 넣고 다시 원심분리하여 모든 세포 잔해를 없앴다. 이 세포 펠렛을 탈이온수에 1.4 mL 부피로 재현탁한 다음, GCFID 분석을 위하여 각 층을 HPLC 등급 메탄올로 표 11에 나타낸 것처럼 추출하였다.

배양으로 생산한 β-파네센 중 약 50%가 상기 가벼운 고체로 존재하며, 생산한 β-파네센 중 32%는 상기 여러 층들 중에 존재하지 않는 것으로 드러났는데, 이는 아마도 작은 부피를 취급하는 어려움 때문에 생긴 결과로 보인다.

추출 비율과 생성물 분포

위 치	메탄올 희석	아세트산에틸 희석	β-파네센 (mg/mL)	부 피	β-파네센 (mg)
WCB	20	100	24.10	1.4 mL	33.74
가벼운 액체	20	400	12.14	0.01 mL	0.12
세포 펠렛	20	25	3.64	1.4 mL	5.09
가벼운 고체 (중량 기준)	19.5	1000	326.75	0.0514 g	16.79
상청액	20	10	0.90	1.07 mL	0.97

실시예 13

이 실시예는 α-파네센에 수소를 첨가하여 파네산을 얻는 것에 대하여 기술한다.

10% Pd/C(5 g, α-파네센 중량의 5%)를 담고 있는 500 mL Parr 고압 용기에 α-파네센(204 g, 1 몰, 255 mL)을 첨가하였다. 이 반응 용기를 밀봉하고 자체 제조한 방식으로 5분 동안 진공 처리한 다음 반응 혼합물을 35 psi의 수소로 25℃에서 가압하였다. 더 이상 수소 압력의 저하가 일어나지 않을 때까지(애략 16시간) 이 반응 혼합물을 흔들어 주었다. 이 과량의 수소 기체를 자체 제조 진공으로 제거하고 질소 대기하에서 배기하였다. 얇은막 크로마토그래피("TLC", Rf=0.95, 헥산, p-아니스알데히드 염색 또는 요오드)는 반응물이 완전히 사라졌음을 가리켰다. 이 반응 혼합물을 실리카겔(Aldrich사 60Å) 패드로 진공 여과하고 이 실리카겔을 헥산(2 L)으로 씻었다. 이 여과물을 회전 증발기로 농축하였다. 이 분리한 생성물을 고진공에서 더 건조하여 남아 있을 수 있는 헥산을 완전히 없애어 무색의 액체로 파네산을 얻었다(195 g, 244 mL, 95%): %). ¹H-NMR (CDCl₃, 500MHz): δ1.56-1.11(m, 17H), 0.88-0.79 (서로 겹치는 t&d, 15H).

실시예 14

이 실시예에서는 3,7,11-트리메틸도데칸-2,6,10-트리엔-1-올 또는 파네솔에 수소 첨가하여 3,7,11-트리메틸도데칸-1-올을 얻은 것에 대하여 기술한다.

10% Pd/C(23 g, 파네솔 중량의 4%)를 담고 있는 500 mL Parr 고압 용기에 파네솔(farnesol, 572 g, 2.58몰, 650 mL)을 첨가하였다. 이 반응 용기를 밀봉하고 자체 제조한 방식으로 5분 동안 진공 처리한 다음 반응 혼합물을 1000 psi의 수소로 가압하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 교반한 다음, 12시간이 지나자 얇은막 크로마토그래피("TLC", Rf=0.32, 90:10 헥산:아세트산에틸) 상으로 반응이 완료된 것으로 판단되었다. 이 반응 용기의 압력을 진공하에서 줄이고, 질소 대기하에서 배기하였다. 이 반응 내용물을 실리카겔(Aldrich사 60Å) 패드로 진공 여과하고 이 실리카겔을 아세트산에틸("EtOAc", 3 L)로 씻었다. 이 여과물을 회전 증발기로 농축하였다. 이 분리한 생성물을 고진공에서 더 건조하여 남아 있을 수 있는 EtOAc을 완전히 없애어 옅은 노란색을 띤 점성 있는 액체로 3,7,11-트리메틸도데칸-1-올을 얻었다. ¹H-NMR (CDCl₃, 500MHz): δ3.71(m, 2H), 1.65-1.05(m, 17H), 0.89-0.83(서로 겹치는 t&d, 12H).

실시예 15

이 실시예에서는 3,7,11-트리메틸도데칸-1-올로부터 아세트산 3,7,11-트리메틸도데실을 합성하는 것에 대하여 기술한다.

CH₂Cl₂(1500 mL) 속 3,7,11-트리메틸도데칸-1-올(542 g, 2.38 몰) 용액에 교반과 함께 25℃에서 아세트산 무수물(267 g, 2.63 몰, 247 mL)을 가하고 이어서 트리에틸아민(360 g, 3.57 몰, 497 mL)을 가하여 무색의 용액을 얻었다. 주변 온도에서 약 12시간 동안 교반해 주었더니 짙게 녹슨 빛깔의 용액을 얻었다. TLC(Rf=0.32, 96:4 헥산:아세트산에틸) 분석 결과 반응이 끝난 것으로 판단되었다. 이 반응을 종료하고 다음과 같이 후처리 하였다. 반응 내용물을 회전 교반기로 농축하여 CH₂Cl₂를 제거하고 EtOAc(2 L)로 희석하였다. 이 유기층을 물(3회, 1 L)로 씻고 이어서 에를른마이어 플라스크에 따른 다음 탈색용 활성탄(20 g)을 가하고 15분 동안 저어 준 다음 셀라이트(Celite) 층(bed) 위에서 걸러 주었다. 이를 EtOAc(2 L)로 씻어 밝은 노란색 여과물을 얻었다. 이 여과물을 회전 교반기로 농축하고 진공 하에서 더 건조하여 아세트산 3,7,11-트리메틸도데실을 점성이 있는 밝은 노란색 액체로 얻었다. ¹H-NMR (CDCl₃, 500MHz): δ4.11(t, 2H), 2.04(s, 3H), 1.62-1.09(m, 17H ) 0.91-0.83(서로 겹치는 t&d, 12H).

실시예 16

이 실시예에서는 미생물 유래한 β-파네센을 파네산으로 바꾸는 수소 첨가에 대하여 기술한다.

500 mL 유리 압력 플라스크(KJF-41-120-05와 KJF-41-120-06 5.014 g) 에 β-파네센을 넣고 여기에 10% 팔라듐을 담지한 탄소(Sigma-Aldrich #205699-50G) 101 mg을 가하였다. 이 플라스크에 10분간 진공을 건 다음 흔들어 주면서 55 psi의 수소(Airgas UHP)로 가압하였다. 8분 뒤 이 수소가 고갈되자, 이 용기를 53 psi 수소로 가압하였고, 이는 다시 16분 뒤 고갈되었다. 플라스크 흔들어 주기를 멈추고 플라스크를 53 psi하의 4 L 수소 실린더에 48시간 노출하였다. Fene-Fane-Split100 분석법을 이용한 GC/MS 분석 결과 반응이 완결되지 않은 것으로 나와, 플라스크를 52 psi로 가압하고 밤새 흔들어 주었다. 이어지는 며칠에 걸쳐 압력이 48 psi 밑으로 떨어지자, 압력을 48 psi로 다시 올렸다. GC/MS 분석 결과 여전히 반응이 미결로 나타나자, 동일한 팔라듐 담지 탄소 101 mg을 새로 가하고, 반응을 48 psi로 다시 가압하였다. 17분 뒤, 수소가 고갈되자 다시 48 psi로 가압하였다. 이 압력이 다음 며칠에 걸쳐서 48 psi 아래로 내려가자, 이 반응이 GC/MS 분석에서 완결된 것으로 나타날 때까지 48 psi로 가압하였다. 상기 촉매를 소결 깔때기(fritted funnel) 위의 실리카겔로 걸러서 버림으로써 무색의 오일 1.47 g을 얻었다. 이 생성물을 GC/FID로 분석하자 순도가 99.42%로 나타났다.

실시예 17

이 실시예에서는 β-파네센을 파네산으로 바꾸는 대규모 수소 첨가에 대하여 기술한다.

2 갤런 반응기 속으로 액체 파네센 4 kg(4.65 L=1.23 갤런)과 10 중량% Pd/C(건조) 촉매 24 g을 넣었다. 이로써 초기 촉매 부하량은 5.16 g/L가 되었다. 이 용기를 밀봉하고 질소 기체로 씻어 낸 다음 진공 속에서 공기를 빼내었다. 교반을 시작하고, 압축 수소 기체를 100 psig 하에서 연속적으로 가하였다. 이 반응기를 80℃로 가열한 다음 23시간 후 분석을 위하여 시료를 채취하였다. GC-FID를 이용하여 파네산 농도를 측정하자 45.87%였다. 4시간이 더 지나서 두 번째 시료를 채취하고 분석하였다. GC-FID를 이용하여 파네산 농도를 측정하자 47%였다. 이 반응기를 식히고, 밀봉을 푼 다음, 10 중량% Pd/C(건조) 촉매 10 g을 가하였다(총 중량 37 g). 이 반응기를 상기 전술한 조건으로 되돌렸다. 약 24시간 후 세 번째 시료를 채취하여 분석하였다. GC-FID를 이용하여 측정한 파네산 농도는 67.86%였다. 이 반응기를 식히고, 밀봉을 푼 다음, 10 중량% Pd/C(건조) 촉매 24 g을 가하였다(총 중량 58 g). 이 반응기를 상기 전술한 조건으로 되돌렸다. 약 24시간 후 네 번째 시료를 채취하여 분석하였다. GC-FID를 이용하여 측정한 파네산 농도는 97.27%였다. 이 반응기를 식히고, 밀봉을 푼 다음, 10 중량% Pd/C(건조) 촉매 10 g을 가하였다(총 중량 68 g). 이 반응기를 상기 전술한 조건으로 되돌렸다. 약 24시간 후 다섯 번째이자 마지막 시료를 채취하여 분석하였다. GC-FID를 이용하여 측정한 파네산 농도는 99.71%였다. 이 반응기를 식히고, 배기하고 밀봉을 풀었다. 이 반응 혼합물을 이어서 0.5 마이크론 필터 카트리지로 여과하여 두 개의 1 갤런 유리병에 담았다. 총 반응 시간은 약 96시간이었다.

상기 배치의 경험을 바탕으로 하여, 이 실험 방법을 이후의 배치에서는 바꾸었다. 2 갤런 반응기 속으로 액체 파네센 4 kg(4.65 L=1.23 갤런)과 10 중량% Pd/C(건조) 촉매 75 g을 넣었다. 이로써 초기 촉매 부하량은 16.13 g/L가 되었다. 이 용기를 밀봉하고 질소 기체로 씻어 낸 다음 진공 속에서 공기를 빼내었다. 교반을 시작하고, 압축 수소 기체를 100 psig 하에서 연속적으로 가하였다. 이 반응기를 80℃로 가열하였다. 총 반응 시간은 약 48시간이었다. GC-FID를 이용하여 파네산의 최종 농도를 측정하자 99.76%였다. 이 반응기를 식히고, 배기하고 밀봉을 풀었다. 이 반응 혼합물을 이어서 0.5 마이크론 필터 카트리지로 여과하여 두 개의 1 갤런 유리병에 담았다.

원할 경우, 이 생성물을 증류하여 더 정제할 수 있다. 1 L 증류 실험 방법을 아래에 예시한다. 수랭식 증류 헤드(distillation head)와 Vigreaux 컬럼이 연결부에 부착된 2 L 둥근 바닥 플라스크 속에 약 1 L의 파네산을 넣었다. 이 액체를 교반해 주면서 14 Torr로 진공을 걸었다. 이 시점에서 상기 액체를 155℃로 가열하고 플라스크를 유리 섬유와 알루미늄박으로 감싸 주었다. 가열 도중 액체는 맑은 색에서 밝은 노랑으로 변했다. 120℃에서 증기가 증류 헤드 위에 맺히기 시작했다. 증류를 마치기까지 대략 950 mL의 맑은 파네산을 얻었다.

실시예 18

이 실시예에서는 초저황 디젤(ASTM D 975 표준을 만족하는 2번 디젤 연료) 90%와 아세트산 3,7,11-트리메틸도데실 및 파네산의 혼합물 10%인 블렌드의 특성에 대하여 기술한다. 이 혼합물은 주로 아세트산 3,7,11-트리메틸도데실으로 되어 있고 여기서 소량으로 파네산이 포함된다.

	ASTM 시험 방법	90% 초저황 디젤과 10% 아세트산 3,7,11-트리메틸도데실 및 파네산
세탄가	D613	50.4
저온 필터 막힘점(℃)	D6371	≤22
흐림점(℃)	D2500	≤22
유동점(℃)	D97	≤24
40℃에서의 점도	D445	3.594

실시예 19

이 실시예에서는 인디아나주 Whitting의 BP 정유 설비 또는 캘리포니아주 Carson의 BP 정유 설비에서 얻은 초저황 디젤 연료에 파네산을 여러 가지 비율로 혼합한 연료를 시험하는 것에 대하여 기술한다. BP Carson 정유 설빙에서 얻은 디젤 연료는 CARB 연료로서 캘리포니아 대기 자원 위원회 요건을 만족한다. 비록 윤활제를 상기 정유 설비에서 CARB 연료에 추가하는 것이 전형적이지만, 이 CARB 연료 시료는 어떠한 윤활제도 첨가되기 전에 구하였다. 도 9와 도 10은 이들 정유 설비에서 얻은 디젤 연료에 파네산을 여러 가지 양으로 혼합한 시료의 시험 데이터를 보여 준다. 도 11A~B는 이들 여러 가지 연료와 그 블렌드에 대하여 시험한 증류 특성을 보여 준다.

실시예 20

이 실시예에서는 석유 디젤 속에 천연적으로 존재하는 파네산의 양을 측정하는 것을 기술하는데, 석유 디젤은 수 천개의 개별 화합물들의 복잡한 혼합물이다. 이들 화합물의 대부분은 C₁₀~C₂₂ 탄화수소이고 일반적으로 파라핀계, 나프텐계와 방향족계 물질이다.

디젤 시료를 헥산에 희석하고, Zielinska 외, J. Air & Waste Manage . Assoc. 54: 1138~1150 (2004)에서 기재한 대로 GC-MS로 측정하였다. 표 13은 그 결과를 ㎍/mL, 중량%와 부피% 단위로 보여 준다.

표 13의 마지막 두 시료를 뺀 모든 디젤 시료는 디젤 연료를 파는 주유소로부터 구입하였다. 상기 Whiting에서 온 2번 디젤 연료는 BP Whiting 정유 설비에서 온 것이다. 상기 CARB 디젤 연료는 BP Carson 정유 설비에서 온 것이며 윤활도 향상제를 포함하지 않는다.

실시예 21

이 실시예에서는 BP Whiting 정유 설비의 디젤 연료 또는 BP Carson 정유 설비로부터의 CARB 디젤 연료와 파네산의 블렌드에 윤활도 개선제를 첨가하는 것에 대하여 기술한다.

BP Whiting 정유 설비로부터의 디젤 연료는 (종래 ECD-1로 알려진) Infinium R696 윤활도 개선제를 200 ppm 함유한다. 상기 기본 연료에 추가로 100 ppm을 보태어 주고, 파네산을 이 기본 연료에 5 부피%, 20 부피%, 50 부피%와 65 부피%로 혼합한 연료를 ASTM D 6070에 따라 윤활도 평가하였다. 상기 5 부피%, 20 부피%, 50 부피%와 65 부피%의 연료의 측정 윤활도(60℃에서의 HFRR)는 각각 200 ㎛, 240 ㎛, 280 ㎛와 240 ㎛였다.

서열 목록

서열 번호: 1

MevT66 오페론(5'으로부터 3')

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서열 번호: 2

pAM52의 atoB(opt): mvaS : mvaA 오페론(5'으로부터 3')

ATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTGCGGTCCGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACGGCTCTTTAGCGAGCACCTCTGCAATCGATCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGCCATTGAACGCGCCAAAATCGACAGCCAGCACGTTGATGAGGTGATCATGGGCAATGTGTTACAAGCCGGCCTGGGTCAAAACCCAGCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCTGGTCTGGCCGAGACCGTGTGTGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGGCAGCACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCATCGTTGCGGGTGGCATGGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCCCGCAGCGGTTATCGCCTGGGCGATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTATTACGGCCGAAAACGTGGCGAAAGAATACGGCATTACGCGCGAGATGCAGGATGAATTAGCACTGCACTCTCAGCGCAAAGCAGCAGCCGCGATCGAGTCTGGTGCGTTTACGGCGGAAATCGTGCCAGTTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTCCCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCTTAGGTGCCTTACGCCCAGCCTTTGACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCATCAATGATGGTGCAGCGGCACTGGTCATCATGGAAGAGAGCGCCGCATTAGCAGCGGGTCTGACCCCATTAGCGCGCATTAAATCTTATGCCAGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGATGGGCATGGGTCCGGTCCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGCGGGCCTGCAACTGGCCGACATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGTTCCTGGCGGTGGGTAAGAATCTGGGCTTCGACAGCGAGAAAGTCAATGTGAACGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGCGCACGCATCTTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACGCGACAAGACCTTAGGCCTGGCGACCTTATGTATTGGTGGCGGTCAAGGTATCGCCATGGTGATCGAACGCCTGAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGACAATAGGTATCGACAAAATAAACTTTTACGTTCCAAAGTACTATGTAGACATGGCTAAATTAGCAGAAGCACGCCAAGTAGACCCAAACAAATTTTTAATTGGAATTGGTCAAACTGAAATGGCTGTTAGTCCTGTAAACCAAGACATCGTTTCAATGGGCGCTAACGCTGCTAAGGACATTATAACAGACGAAGATAAAAAGAAAATTGGTATGGTAATTGTGGCAACTGAATCAGCAGTTGATGCTGCTAAAGCAGCCGCTGTTCAAATTCACAACTTATTAGGTATTCAACCTTTTGCACGTTGCTTTGAAATGAAAGAAGCTTGTTATGCTGCAACACCAGCAATTCAATTAGCTAAAGATTATTTAGCAACTAGACCGAATGAAAAAGTATTAGTTATTGCTACAGATACAGCACGTTATGGATTGAATTCAGGCGGCGAGCCAACACAAGGTGCTGGCGCAGTTGCGATGGTTATTGCACATAATCCAAGCATTTTGGCATTAAATGAAGATGCTGTTGCTTACACTGAAGACGTTTATGATTTCTGGCGTCCAACTGGACATAAATATCCATTAGTTGATGGTGCATTATCTAAAGATGCTTATATCCGCTCATTCCAACAAAGCTGGAATGAATACGCAAAACGTCAAGGTAAGTCGCTAGCTGACTTCGCATCTCTATGCTTCCATGTTCCATTTACAAAAATGGGTAAAAAGGCATTAGAGTCAATCATTGATAACGCTGATGAAACAACTCAAGAGCGTTTACGTTCAGGATATGAAGATGCTGTAGATTATAACCGTTATGTCGGTAATATTTATACTGGATCATTATATTTAAGCCTAATATCATTACTTGAAAATCGTGATTTACAAGCTGGTGAAACAATCGGTTTATTCAGTTATGGCTCAGGTTCAGTTGGTGAATTTTATAGTGCGACATTAGTTGAAGGCTACAAAGATCATTTAGATCAAGCTGCACATAAAGCATTATTAAATAACCGTACTGAAGTATCTGTTGATGCATATGAAACATTCTTCAAACGTTTTGATGACGTTGAATTTGACGAAGAACAAGATGCTGTTCATGAAGATCGTCATATTTTCTACTTATCAAATATTGAAAATAACGTTCGCGAATATCACAGACCAGAGTAACTAGTAGGAGGAAAACATCATGCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCGACATTTATCTCGTCAACAAAAGTTACAACAATTGGTAGATAAGCAATGGTTATCAGAAGATCAATTCGACATTTTATTGAATCATCCATTAATTGATGAGGAAGTAGCAAATAGTTTAATTGAAAATGTCATCGCGCAAGGTGCATTACCCGTTGGATTATTACCGAATATCATTGTGGACGATAAGGCATATGTTGTACCTATGATGGTGGAAGAGCCTTCAGTTGTCGCTGCAGCTAGTTATGGTGCAAAGCTAGTGAATCAGACTGGCGGATTTAAAACGGTATCTTCTGAACGTATTATGATAGGTCAAATCGTCTTTGATGGCGTTGACGATACTGAAAAATTATCAGCAGACATTAAAGCTTTAGAAAAGCAAATTCATAAAATTGCGGATGAGGCATATCCTTCTATTAAAGCGCGTGGTGGTGGTTACCAACGTATAGCTATTGATACATTTCCTGAGCAACAGTTACTATCTTTAAAAGTATTTGTTGATACGAAAGATGCTATGGGCGCTAATATGCTTAATACGATTTTAGAGGCCATAACTGCATTTTTAAAAAATGAATCTCCACAAAGCGACATTTTAATGAGTATTTTATCCAATCATGCAACAGCGTCCGTTGTTAAAGTTCAAGGCGAAATTGACGTTAAAGATTTAGCAAGGGGCGAGAGAACTGGAGAAGAGGTTGCCAAACGAATGGAACGTGCTTCTGTATTGGCACAAGTTGATATTCATCGTGCTGCAACACATAATAAAGGTGTTATGAATGGCATACATGCCGTTGTTTTAGCAACAGGAAATGATACGCGTGGTGCAGAAGCAAGTGCGCATGCATACGCGAGTCGTGACGGACAGTATCGTGGTATTGCAACATGGAGATACGATCAAAAACGTCAACGTTTAATTGGTACAATAGAAGTGCCTATGACATTGGCAATCGTTGGCGGTGGTACAAAAGTATTACCAATTGCTAAAGCTTCTTTAGAATTGCTAAATGTAGATTCAGCACAAGAATTAGGTCATGTAGTTGCTGCCGTTGGTTTAGCACAGAACTTTGCAGCATGTCGCGCGCTCGTTTCCGAAGGTATCCAGCAAGGCCATATGAGCTTGCAATATAAATCTTTAGCTATTGTTGTAGGTGCAAAAGGTGATGAAATTGCGCAAGTAGCTGAAGCATTGAAGCAAGAACCCCGTGCGAATACACAAGTAGCTGAACGCATTTTACAAGAAATTAGACAACAATAG

서열 번호: 3

pAM498의 ERG20-P_GAL-tHMGR 삽입부(5'으로부터 3')

GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCGTTGTTAGTGGCGTTAGTGCTTGCATTCAAAGACATGGAGGGCGTTATTACGCCGGAGCTCCTCGACAGCAGATCTGATGACTGGTCAATATATTTTTGCATTGAGGCTCTGTTTGGAATTATATTTTGAGATGACCCATCTAATGTACTGGTATCACCAGATTTCATGTCGTTTTTTAAAGCGGCTGCTTGAGTCTTAGCAATAGCGTCACCATCTGGTGAATCCTTTGAAGGAACCACTGACGAAGGTTTGGACAGTGACGAAGAGGATCTTTCCTGCTTTGAATTAGTCGCGCTGGGAGCAGATGACGAGTTGGTGGAGCTGGGGGCAGGATTGCTGGCCGTCGTGGGTCCTGAATGGGTCCTTGGCTGGTCCATCTCTATTCTGAAAACGGAAGAGGAGTAGGGAATATTACTGGCTGAAAATAAGTCTTGAATGAACGTATACGCGTATATTTCTACCAATCTCTCAACACTGAGTAATGGTAGTTATAAGAAAGAGACCGAGTTAGGGACAGTTAGAGGCGGTGGAGATATTCCTTATGGCATGTCTGGCGATGATAAAACTTTTCAAACGGCAGCCCCGATCTAAAAGAGCTGACACCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGAGAGAGAGATTCTTGAACGTTTTCCCTAAATTAGTAGAGGAATTGAACGCATCGCTTTTGGCTTACGGTATGCCTAAGGAAGCATGTGACTGGTATGCCCACTCATTGAACTACAACACTCCAGGCGGTAAGCTAAATAGAGGTTTGTCCGTTGTGGACACGTATGCTATTCTCTCCAACAAGACCGTTGAACAATTGGGGCAAGAAGAATACGAAAAGGTTGCCATTCTAGGTTGGTGCATTGAGTTGTTGCAGGCTTACTTCTTGGTCGCCGATGATATGATGGACAAGTCCATTACCAGAAGAGGCCAACCATGTTGGTACAAGGTTCCTGAAGTTGGGGAAATTGCCATCAATGACGCATTCATGTTAGAGGCTGCTATCTACAAGCTTTTGAAATCTCACTTCAGAAACGAAAAATACTACATAGATATCACCGAATTGTTCCATGAGGTCACCTTCCAAACCGAATTGGGCCAATTGATGGACTTAATCACTGCACCTGAAGACAAAGTCGACTTGAGTAAGTTCTCCCTAAAGAAGCACTCCTTCATAGTTACTTTCAAGACTGCTTACTATTCTTTCTACTTGCCTGTCGCATTGGCCATGTACGTTGCCGGTATCACGGATGAAAAGGATTTGAAACAAGCCAGAGATGTCTTGATTCCATTGGGTGAATACTTCCAAATTCAAGATGACTACTTAGACTGCTTCGGTACCCCAGAACAGATCGGTAAGATCGGTACAGATATCCAAGATAACAAATGTTCTTGGGTAATCAACAAGGCATTGGAACTTGCTTCCGCAGAACAAAGAAAGACTTTAGACGAAAATTACGGTAAGAAGGACTCAGTCGCAGAAGCCAAATGCAAAAAGATTTTCAATGACTTGAAAATTGAACAGCTATACCACGAATATGAAGAGTCTATTGCCAAGGATTTGAAGGCCAAAATTTCTCAGGTCGATGAGTCTCGTGGCTTCAAAGCTGATGTCTTAACTGCGTTCTTGAACAAAGTTTACAAGAGAAGCAAATAGAACTAACGCTAATCGATAAAACATTAGATTTCAAACTAGATAAGGACCATGTATAAGAACTATATACTTCCAATATAATATAGTATAAGCTTTAAGATAGTATCTCTCGATCTACCGTTCCACGTGACTAGTCCAAGGATTTTTTTTAACCCGGGATATATGTGTACTTTGCAGTTATGACGCCAGATGGCAGTAGTGGAAGATATTCTTTATTGAAAAATAGCTTGTCACCTTACGTACAATCTTGATCCGGAGCTTTTCTTTTTTTGCCGATTAAGAATTCGGTCGAAAAAAGAAAAGGAGAGGGCCAAGAGGGAGGGCATTGGTGACTATTGAGCACGTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCTTGGAGTATGTCTGTTATTAATTTCACAGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGTTTGCGGCTTGCAGAGCACAGAGGCCGCAGAATGTGCTCTAGATTCCGATGCTGACTTGCTGGGTATTATATGTGTGCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACCCGGTTATTGCAAGGAAAATTTCAAGTCTTGTAAAAGCATATAAAAATAGTTCAGGCACTCCGAAATACTTGGTTGGCGTGTTTCGTAATCAACCTAAGGAGGATGTTTTGGCTCTGGTCAATGATTACGGCATTGATATCGTCCAACTGCATGGAGATGAGTCGTGGCAAGAATACCAAGAGTTCCTCGGTTTGCCAGTTATTAAAAGACTCGTATTTCCAAAAGACTGCAACATACTACTCAGTGCAGCTTCACAGAAACCTCATTCGTTTATTCCCTTGTTTGATTCAGAAGCAGGTGGGACAGGTGAACTTTTGGATTGGAACTCGATTTCTGACTGGGTTGGAAGGCAAGAGAG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서열 번호: 4

pAM491의 ERG13-P_GAL-tHMGR 삽입부(5'으로부터 3')

GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACACAGGAAGACCAGAAAATCCTCATTTCATCCATATTAACAATAATTTCAAATGTTTATTTGCATTATTTGAAACTAGGGAAGACAAGCAACGAAACGTTTTTGAAAATTTTGAGTATTTTCAATAAATTTGTAGAGGACTCAGATATTGAAAAAAAGCTACAGCAATTAATACTTGATAAGAAGAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAAACACCAGAGTCAAACGACGTTGAAATTGAGGCTACTGCGCCAATTGATGACAATACAGACGATGATAACAAACCGAAGTTATCTGATGTAGAAAAGGATTAAAGATGCTAAGAGATAGTGATGATATTTCATAAATAATGTAATTCTATATATGTTAATTACCTTTTTTGCGAGGCATATTTATGGTGAAGGATAAGTTTTGACCATCAAAGAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTAAAGGAAGACTTAGGCCGCAAAAGCAACAACAATTACACAATACAAACTTGCAAATGACTGAACTAAAAAAACAAAAGACCGCTGAACAAAAAACCAGACCTCAAAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATTTACATCCCAACTCAATGTGTCAACCAATCTGAGCTAGAGAAATTTGATGGCGTTTCTCAAGGTAAATACACAATTGGTCTGGGCCAAACCAACATGTCTTTTGTCAATGACAGAGAAGATATCTACTCGATGTCCCTAACTGTTTTGTCTAAGTTGATCAAGAGTTACAACATCGACACCAACAAAATTGGTAGATTAGAAGTCGGTACTGAAACTCTGATTGACAAGTCCAAGTCTGTCAAGTCTGTCTTGATGCAATTGTTTGGTGAAAACACTGACGTCGAAGGTATTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCAACGCGTTGTTCAACTCTTTGAACTGGATTGAATCTAACGCATGGGATGGTAGAGACGCCATTGTAGTTTGCGGTGATATTGCCATCTACGATAAGGGTGCCGCAAGACCAACCGGTGGTGCCGGTACTGTTGCTATGTGGATCGGTCCTGATGCTCCAATTGTATTTGACTCTGTAAGAGCTTCTTACATGGAACACGCCTACGATTTTTACAAGCCAGATTTCACCAGCGAATATCCTTACGTCGATGGTCATTTTTCATTAACTTGTTACGTCAAGGCTCTTGATCAAGTTTACAAGAGTTATTCCAAGAAGGCTATTTCTAAAGGGTTGGTTAGCGATCCCGCTGGTTCGGATGCTTTGAACGTTTTGAAATATTTCGACTACAACGTTTTCCATGTTCCAACCTGTAAATTGGTCACAAAATCATACGGTAGATTACTATATAACGATTTCAGAGCCAATCCTCAATTGTTCCCAGAAGTTGACGCCGAATTAGCTACTCGCGATTATGACGAATCTTTAACCGATAAGAACATTGAAAAAACTTTTGTTAATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTGATTGTTCCAACAAACACAGGTAACATGTACACCGCATCTGTTTATGCCGCCTTTGCATCTCTATTAAACTATGTTGGATCTGACGACTTACAAGGCAAGCGTGTTGGTTTATTTTCTTACGGTTCCGGTTTAGCTGCATCTCTATATTCTTGCAAAATTGTTGGTGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAGAGAATCACCGAAACTCCAAAGGATTACGAAGCTGCCATCGAATTGAGAGAAAATGCCCATTTGAAGAAGAACTTCAAACCTCAAGGTTCCATTGAGCATTTGCAAAGTGGTGTTTACTACTTGACCAACATCGATGACAAATTTAGAAGATCTTACGATGTTAAAAAATAATCTTCCCCCATCGATTGCATCTTGCTGAACCCCCTTCATAAATGCTTTATTTTTTTGGCAGCCTGCTTTTTTTAGCTCTCATTTAATAGAGTAGTTTTTTAATCTATATACTAGGAAAACTCTTTATTTAATAACAATGATATATATATACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTTTTTTTTTTTGTTCTTTTTTTTGATTCCGGTTTCTTTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAGCAGAAGGAAGAACGAAGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTGGTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGCTATTTAATATCATGCACGAAAAGCAAACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCGTACCACCAAGGAATTACTGGAGTTAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAACACATGTGGATATCTTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGT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서열 번호: 5

pAM493의 IDI1-P_GAL-tHMGR 삽입부(5'으로부터 3')

GTTTAAACTACTCAGTATATTAAGTTTCGAATTGAAGGGCGAACTCTTATTCGAAGTCGGAGTCACCACAACACTTCCGCCCATACTCTCCGAATCCTCGTTTCCTAAAGTAAGTTTACTTCCACTTGTAGGCCTATTATTAATGATATCTGAATAATCCTCTATTAGGGTTGGATCATTCAGTAGCGCGTGCGATTGAAAGGAGTCCATGCCCGACGTCGACGTGATTAGCGAAGGCGCGTAACCATTGTCATGTCTAGCAGCTATAGAACTAACCTCCTTGACACCACTTGCGGAAGTCTCATCAACATGCTCTTCCTTATTACTCATTCTCTTACCAAGCAGAGAATGTTATCTAAAAACTACGTGTATTTCACCTCTTTCTCGACTTGAACACGTCCAACTCCTTAAGTACTACCACAGCCAGGAAAGAATGGATCCAGTTCTACACGATAGCAAAGCAGAAAACACAACCAGCGTACCCCTGTAGAAGCTTCTTTGTTTACAGCACTTGATCCATGTAGCCATACTCGAAATTTCAACTCATCTGAAACTTTTCCTGAAGGTTGAAAAAGAATGCCATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTTTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGCCCCATGGTGCAGTATCTAGTTACGCCAAATTAGTGCAAAACCAAACACCTGAAGACATTTTGGAAGAGTTTCCTGAAATTATTCCATTACAACAAAGACCTAATACCCGATCTAGTGAGACGTCAAATGACGAAAGCGGAGAAACATGTTTTTCTGGTCATGATGAGGAGCAAATTAAGTTAATGAATGAAAATTGTATTGTTTTGGATTGGGACGATAATGCTATTGGTGCCGGTACCAAGAAAGTTTGTCATTTAATGGAAAATATTGAAAAGGGTTTACTACATCGTGCATTCTCCGTCTTTATTTTCAATGAACAAGGTGAATTACTTTTACAACAAAGAGCCACTGAAAAAATAACTTTCCCTGATCTTTGGACTAACACATGCTGCTCTCATCCACTATGTATTGATGACGAATTAGGTTTGAAGGGTAAGCTAGACGATAAGATTAAGGGCGCTATTACTGCGGCGGTGAGAAAACTAGATCATGAATTAGGTATTCCAGAAGATGAAACTAAGACAAGGGGTAAGTTTCACTTTTTAAACAGAATCCATTACATGGCACCAAGCAATGAACCATGGGGTGAACATGAAATTGATTACATCCTATTTTATAAGATCAACGCTAAAGAAAACTTGACTGTCAACCCAAACGTCAATGAAGTTAGAGACTTCAAATGGGTTTCACCAAATGATTTGAAAACTATGTTTGCTGACCCAAGTTACAAGTTTACGCCTTGGTTTAAGATTATTTGCGAGAATTACTTATTCAACTGGTGGGAGCAATTAGATGACCTTTCTGAAGTGGAAAATGACAGGCAAATTCATAGAATGCTATAACAACGCGTCAATAATATAGGCTACATAAAAATCATAATAACTTTGTTATCATAGCAAAATGTGATATAAAACGTTTCATTTCACCTGAAAAATAGTAAAAATAGGCGACAAAAATCCTTAGTAATATGTAAACTTTATTTTCTTTATTTACCCGGGAGTCAGTCTGACTCTTGCGAGAGATGAGGATGTAATAATACTAATCTCGAAGATGCCATCTAATACATATAGACATACATATATATATATATACATTCTATATATTCTTACCCAGATTCTTTGAGGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCGAATCATAAGCATTGCTTACAAAGAATACACATACGAAATATTAACGATAATGTCAATTACGAAGACTGAACTGGACGGTATATTGCCATTGGTGGCCAGAGGTAAAGTTAGAGACATATATGAGGTAGACGCTGGTACGTTGCTGTTTGTTGCTACGGATCGTATCTCTGCATATGACGTTATTATGGAAAACAGCATTCCTGAAAAGGGGATCCTATTGACCAAACTGTCAGAGTTCTGGTTCAAGTTCCTGTCCAACGATGTTCGTAATCATTTGGTCGACATCGCCCCAGGTAAGACTATTTTCGATTATCTACCTGCAAAATTGAGCGAACCAAAGTACAAAACGCAACTAGAAGACCGCTCTCTATTGGTTCACAAACATAAACTAATTCCATTGGAAGTAATTGTCAGAGGCTACATCACCGGATCTGCTTGGAAAGAGTACGTAAAAACAGGTACTGTGCATGGTTTGAAACAACCTCAAGGACTTAAAGAATCTCAAGAGTTCCCAGAACCAATCTTCACCCCATCGACCAAGGCTGAACAAGGTGAACATGACGAAAACATCTCTCCTGCCCAGGCCGCTGAGCTGGTGGGTGAAGATTTGTCACGTAGAGTGGCAGAACTGGCTGTAAAACTGTACTCCAAGTGCAAAGATTATGCTAAGGAGAAGGGCATCATCATCGCAGACACTAAATTGTTTAAAC

서열 번호: 6

pAM495의 ERG10-P_GAL-ERG12 삽입부(5'으로부터 3')

GTTTAAACTATTGTGAGGGTCAGTTATTTCATCCAGATATAACCCGAGAGGAAACTTCTTAGCGTCTGTTTTCGTACCATAAGGCAGTTCATGAGGTATATTTTCGTTATTGAAGCCCAGCTCGTGAATGCTTAATGCTGCTGAACTGGTGTCCATGTCGCCTAGGTACGCAATCTCCACAGGCTGCAAAGGTTTTGTCTCAAGAGCAATGTTATTGTGCACCCCGTAATTGGTCAACAAGTTTAATCTGTGCTTGTCCACCAGCTCTGTCGTAACCTTCAGTTCATCGACTATCTGAAGAAATTTACTAGGAATAGTGCCATGGTACAGCAACCGAGAATGGCAATTTCTACTCGGGTTCAGCAACGCTGCATAAACGCTGTTGGTGCCGTAGACATATTCGAAGATAGGATTATCATTCATAAGTTTCAGAGCAATGTCCTTATTCTGGAACTTGGATTTATGGCTCTTTTGGTTTAATTTCGCCTGATTCTTGATCTCCTTTAGCTTCTCGACGTGGGCCTTTTTCTTGCCATATGGATCCGCTGCACGGTCCTGTTCCCTAGCATGTACGTGAGCGTATTTCCTTTTAAACCACGACGCTTTGTCTTCATTCAACGTTTCCCATTGTTTTTTTCTACTATTGCTTTGCTGTGGGAAAAACTTATCGAAAGATGACGACTTTTTCTTAATTCTCGTTTTAAGAGCTTGGTGAGCGCTAGGAGTCACTGCCAGGTATCGTTTGAACACGGCATTAGTCAGGGAAGTCATAACACAGTCCTTTCCCGCAATTTTCTTTTTCTATTACTCTTGGCCTCCTCTAGTACACTCTATATTTTTTTATGCCTCGGTAATGATTTTCATTTTTTTTTTTTCCACCTAGCGGATGACTCTTTTTTTTTCTTAGCGATTGGCATTATCACATAATGAATTATACATTATATAAAGTAATGTGATTTCTTCGAAGAATATACTAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACCAGCCCAAAAAAAGCAAAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCCCGTATCACTAATGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTATATTCAAATAAAAGATTCGATTCTTCCTGCAAAGAAGGATGACGATGTAGCTTCCCAAGCTACTCAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGTGTTGGCTTTTTGGATCATATGATCCATGCGTTGGCAAAACACTCTGGTTGGTCTCTTATTGTTGAATGTATTGGTGACCTGCACATTGACGATCACCATACTACCGAAGATTGCGGTATCGCATTAGGGCAAGCGTTCAAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAAAAGATTCGGTACTGGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTAGTCGATTTATCTAGTAGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGAGATGATTGGTGATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAAAGTTTCGCGGAGGCGGCCAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAGAGGTTTCAACGATCACCACAGAAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTGGCTGTTGCCATAAGAGAAGCTATTTCTAGCAATGGCACCAATGACGTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATGTGAAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGATGGTCTGCTTAAATTTCATTCTGTCTTCGAAAGCTGAATTGATACTACGAAAAATTTTTTTTTGTTTCTCTTTCTATCTTTATTACATAAAACTTCATACACAGTTAAGATTAAAAACAACTAATAAATAATGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTGTTTCCTGGCAATAATAGATCGTCAATTTGTTGCTTTGTGGTAGTTTTATTTTCAAATAATTGGAATACTAGGGATTTGATTTTAAGATCTTTATTCAAATTTTTTGCGCTTAACAAACAGCAGCCAGTCCCACCCAAGTCTGTTTCAAATGTCTCGTAACTAAAATCATCTTGCAATTTCTTTTTGAAACTGTCAATTTGCTCTTGAGTAATGTCTCTTCGTAACAAAGTCAAAGAGCAACCGCCGCCACCAGCACCGGTAAGTTTTGTGGAGCCAATTCTCAAATCATCGCTCAGATTTTTAATAAGTTCTAATCCAGGATGAGAAACACCGATTGAGACAAGCAGTCCATGATTTATTCTTATCAATTCCAATAGTTGTTCATACAGTTCATTATTAGTTTCTACAGCCTCGTCATCGGTGCCTTTACATTTACTTAACTTAGTCATGATCTCTAAGCCTTGTAGGGCACATTCACCCATGGCATCTAGAATTGGCTTCATAACTTCAGGAAATTTCTCGGTGACCAACACACGAACGCGAGCAACAAGATCTTTTGTAGACCTTGGAATTCTAGTATAGGTTAGGATCATTGGAATGGCTGGGAAATCATCTAAGAACTTAAAATTGTTTGTGTTTATTGTTCCATTATGTGAGTCTTTTTCAAATAGCAGGGCATTACCATAAGTGGCCACAGCGTTATCTATTCCTGAAGGGGTACCGTGAATACACTTTTCACCTATGAAGGCCCATTGATTCACTATATGCTTATCGTTTTCTGACAGCTTTTCCAAGTCATTAGATCCTATTAACCCCCCCAAGTAGGCCATAGCTAAGGCCAGTGATACAGAAATAGAGGCGCTTGAGCCCAACCCAGCACCGATGGGTAAAGTAGACTTTAAAGAAAACTTAATATTCTTGGCATGGGGGCATAGGCAAACAAACATATACAGGAAACAAAACGCTGCATGGTAGTGGAAGGATTCGGATAGTTGAGCTAACAACGGATCCAAAAGACTAACGAGTTCCTGAGACAAGCCATCGGTGGCTTGTTGAGCCTTGGCCAATTTTTGGGAGTTTACTTGATCCTCGGTGATGGCATTGAAATCATTGATGGACCACTTATGATTAAAGCTAATGTCCGGGAAGTCCAATTCAATAGTATCTGGTGCAGATGACTCGCTTATTAGCAGGTAGGTTCTCAACGCAGACACACTAGCAGCGACGGCAGGCTTGTTGTACACAGCAGAGTGTTCACCAAAAATAATAACCTTTCCCGGTGCAGAAGTTAAGAACGGTAATGACATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCTCAGAACGTTTACATTGTATCGACTGCCAGAACCCCAATTGGTTCATTCCAGGGTTCTCTATCCTCCAAGACAGCAGTGGAATTGGGTGCTGTTGCTTTAAAAGGCGCCTTGGCTAAGGTTCCAGAATTGGATGCATCCAAGGATTTTGACGAAATTATTTTTGGTAACGTTCTTTCTGCCAATTTGGGCCAAGCTCCGGCCAGACAAGTTGCTTTGGCTGCCGGTTTGAGTAATCATATCGTTGCAAGCACAGTTAACAAGGTCTGTGCATCCGCTATGAAGGCAATCATTTTGGGTGCTCAATCCATCAAATGTGGTAATGCTGATGTTGTCGTAGCTGGTGGTTGTGAATCTATGACTAACGCACCATACTACATGCCAGCAGCCCGTGCGGGTGCCAAATTTGGCCAAACTGTTCTTGTTGATGGTGTCGAAAGAGATGGGTTGAACGATGCGTACGATGGTCTAGCCATGGGTGTACACGCAGAAAAGTGTGCCCGTGATTGGGATATTACTAGAGAACAACAAGACAATTTTGCCATCGAAT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서열 번호: 7

pAM497의 ERG8-P_GAL-ERG19 삽입부(5'으로부터 3')

GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAATCGTCTTACTTTCTAACTTTTCTTACCTTTTACATTTCAGCAATATATATATATATATTTCAAGGATATACCATTCTAATGTCTGCCCCTAAGAAGATCGTCGTTTTGCCAGGTGACCACGTTGGTCAAGAAATCACAGCCGAAGCCATTAAGGTTCTTAAAGCTATTTCTGATGTTCGTTCCAATGTCAAGTTCGATTTCGAAAATCATTTAATTGGTGGTGCTGCTATCGATGCTACAGGTGTTCCACTTCCAGATGAGGCGCTGGAAGCCTCCAAGAAGGCTGATGCCGTTTTGTTAGGTGCTGTGGGTGGTCCTAAATGGGGTACCGGTAGTGTTAGACCTGAACAAGGTTTACTAAAAATCCGTAAAGAACTTCAATTGTACGCCAACTTAAGACCATGTAACTTTGCATCCGACTCTCTTTTAGACTTATCTCCAATCAAGCCACAATTTGCTAAAGGTACTGACTTCGTTGTTGTCAGAGAATTAGTGGGAGGTATTTACTTTGGTAAGAGAAAGGAAGACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACCAGCCCAAAAAAAGCAAAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCCCGTATCACTAATGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTATATTCAAATAAAAGATTCGATTCTTCCTGCAAAGAAGGATGACGATGTAGCTTCCCAAGCTACTCAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGTGTTGGCTTTTTGGATCATATGATCCATGCGTTGGCAAAACACTCTGGTTGGTCTCTTATTGTTGAATGTATTGGTGACCTGCACATTGACGATCACCATACTACCGAAGATTGCGGTATCGCATTAGGGCAAGCGTTCAAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAAAAGATTCGGTACTGGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTAGTCGATTTATCTAGTAGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGAGATGATTGGTGATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAAAGTTTCGCGGAGGCGGCCAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAGAGGTTTCAACGATCACCACAGAAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTGGCTGTTGCCATAAGAGAAGCTATTTCTAGCAATGGCACCAATGACGTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATGTGAAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGTTTCTCATTCAAGTGGTAACTGCTGTTAAAATTAAGATATTTATAAATTGAAGCTTGGTCGTTCCGACCAATACCGTAGGGAAACGTAAATTAGCTATTGTAAAAAAAGGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAATGTTACATATCGAATTGATCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTTTGCGTCAATCAAAGATTCGTTTGTTTCTTGTGGGCCTGAACCGACTTGAGTTAAAATCACTCTGGCAACATCCTTTTGCAACTCAAGATCCAATTCACGTGCAGTAAAGTTAGATGATTCAAATTGATGGTTGAAAGCCTCAAGCTGCTCAGTAGTAAATTTCTTGTCCCATCCAGGAACAGAGCCAAACAATTTATAGATAAATGCAAAGAGTTTCGACTCATTTTCAGCTAAGTAGTACAACACAGCATTTGGACCTGCATCAAACGTGTATGCAACGATTGTTTCTCCGTAAAACTGATTAATGGTGTGGCACCAACTGATGATACGCTTGGAAGTGTCATTCATGTAGAATATTGGAGGGAAAGAGTCCAAACATGTGGCATGGAAAGAGTTGGAATCCATCATTGTTTCCTTTGCAAAGGTGGCGAAATCTTTTTCAACAATGGCTTTACGCATGACTTCAAATCTCTTTGGTACGACATGTTCAATTCTTTCTTTAAATAGTTCGGAGGTTGCCACGGTCAATTGCATACCCTGAGTGGAACTCACATCCTTTTTAATATCGCTGACAACTAGGACACAAGCTTTCATCTGAGGCCAGTCAGAGCTGTCTGCGATTTGTACTGCCATGGAATCATGACCATCTTCAGCTTTTCCCATTTCCCAGGCCACGTATCCGCCAAACAACGATCTACAAGCTGAACCAGACCCCTTTCTTGCTATTCTAGATATTTCTGAAGTTGACTGTGGTAATTGGTATAACTTAGCAATTGCAGAGACCAATGCAGCAAAGCCAGCAGCGGAGGAAGCTAAACCAGCTGCTGTAGGAAAGTTATTTTCGGAGACAATGTGGAGTTTCCATTGAGATAATGTGGGCAATGAGGCGTCCTTCGATTCCATTTCCTTTCTTAATTGGCGTAGGTCGCGCAGACAATTTTGAGTTCTTTCATTGTCGATGCTGTGTGGTTCTCCATTTAACCACAAAGTGTCGCGTTCAAACTCAGGTGCAGTAGCCGCAGAGGTCAACGTTCTGAGGTCATCTTGCGATAAAGTCACTGATATGGACGAATTGGTGGGCAGATTCAACTTCGTGTCCCTTTTCCCCCAATACTTAAGGGTTGCGATGTTGACGGGTGCGGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTGCCCCAGGGAAAGCGTTACTAGCTGGTGGATATTTAGTTTTAGATCCGAAATATGAAGCATTTGTAGTCGGATTATCGGCAAGAATGCATGCTGTAGCCCATCCTTACGGTTCATTGCAAGAGTCTGATAAGTTTGAAGTGCGTGTGAAAAGTAAACAATTTAAAGATGGGGAGTGGCTGTACCATATAAGTCCTAAAACTGGCTTCATTCCTGTTTCGATAGGCGGATCTAAGAACCCTTTCATTGAAAAAGTTATCGCTAACGTATTTAGCTACTTTAAGCCTAACATGGACGACTACTGCAATAGAAACTTGTTCGTTATTGATATTTTCTCTGATGATGCCTACCATTCTCAGGAGGACAGCGTTACCGAACATCGTGGCAACAGAAGATTGAGTTTTCATTCGCACAGAATTGAAGAAGTTCCCAAAACAGGGCTGGGCTCCTCGGCAGGTTTAGTCACAGTTTTAACTACAGCTTTGGCCTCCTTTTTTGTATCGGACCTGGAAAATAATGTAGACAAATATAGAGAAGTTATTCATAATTTATCACAAGTTGCTCATTGTCAAGCTCAGGGTAAAATTGGAAGCGGGTTTGATGTAGCGGCGGCAGCATATGGATCTATCAGATATAGAAGATTCCCACCCGCATTAATCTCTAATTTGCCAGATATTGGAAGTGCTACTTACGGCAGTAAACTGGCGCATTTGGTTAATGAAGAAGACTGGAATATAACGATTAAAAGTAACCATTTACCTTCGGGATTAACTTTATGGATGGGCGATATTAAGAATGGTTCAGAAACAGTAAAACTGGTCCAGAAGGTAAAAAATTGGTATGATTCGCATATGCCGGAAAGCTTGAAAATATATACAGAACTCGATCATGCAAATTCTAGATTTATGGATGGACTATCTAAACTAGATCGCTTACACGAGACTCATGACGATTACAGCGATCAGATATTTGAGTCTCTTGAGAGGAATGACTGTACCTGTCAAAAGTATCCTGAGATCACAGAAGTTAGAGATGCAGTTGCCACAATTAGACGTTCCTTTAGAAAAATAACTAAAGAATCTGGTGCCGATA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서열 번호: 8

대장균 발현을 위하여 코돈 최적화된 Artemisia annua의 β-파네센 합성 효소(5'으로부터 3')

ATGGACACTCTGCCGATCTCTTCCGTAAGCTTTTCTTCCTCTACTTCCCCGCTGGTAGTCGATGACAAGGTTTCTACCAAACCTGATGTAATTCGTCACACTATGAACTTCAACGCATCTATCTGGGGCGATCAGTTCCTGACTTATGATGAACCGGAAGATCTGGTAATGAAAAAGCAACTGGTAGAAGAACTGAAAGAAGAAGTTAAAAAGGAACTGATCACCATTAAGGGTAGCAACGAACCGATGCAGCACGTGAAACTGATTGAACTGATCGATGCGGTTCAGCGTCTGGGTATTGCTTATCATTTTGAAGAGGAAATCGAGGAAGCTCTGCAACACATCCACGTAACCTACGGCGAACAATGGGTGGATAAAGAGAATCTGCAGTCTATCAGCCTGTGGTTCCGCCTGCTGCGTCAGCAAGGTTTCAATGTCTCTTCTGGCGTTTTCAAAGACTTCATGGATGAAAAGGGCAAATTCAAGGAATCCCTGTGTAACGATGCGCAAGGTATCCTGGCACTGTACGAAGCGGCCTTCATGCGTGTGGAAGACGAAACCATTCTGGACAACGCGCTGGAATTCACTAAAGTGCATCTGGACATCATCGCGAAAGATCCGTCCTGCGACTCCTCTCTGCGTACTCAGATCCATCAAGCGCTGAAACAGCCGCTGCGTCGTCGCCTGGCACGTATTGAGGCTCTGCACTATATGCCGATTTACCAGCAGGAAACCTCTCACGACGAAGTCCTGCTGAAACTGGCTAAACTGGACTTCAGCGTTCTGCAATCTATGCACAAGAAAGAACTGTCCCACATCTGCAAATGGTGGAAAGATCTGGATCTGCAAAACAAACTGCCGTACGTTCGTGACCGTGTTGTTGAGGGCTATTTTTGGATTCTGTCCATCTACTATGAACCACAGCACGCGCGTACTCGCATGTTTCTGATGAAAACCTGCATGTGGCTGGTTGTCCTGGACGACACCTTTGACAACTATGGTACGTACGAAGAACTGGAAATCTTCACCCAGGCCGTGGAACGTTGGTCTATTTCCTGCCTGGATATGCTGCCGGAATACATGAAACTGATCTATCAAGAACTGGTTAACCTGCACGTGGAAATGGAAGAGTCTCTGGAGAAAGAAGGTAAAACTTACCAGATCCACTACGTCAAGGAGATGGCGAAAGAACTGGTCCGTAACTATCTGGTCGAGGCGCGTTGGCTGAAAGAGGGCTATATGCCGACTCTGGAAGAATACATGAGCGTATCCATGGTTACCGGCACCTACGGCCTGATGATTGCGCGTTCCTACGTCGGCCGTGGTGATATTGTTACCGAAGATACCTTTAAGTGGGTTTCTTCCTACCCGCCGATCATCAAAGCGTCTTGTGTCATCGTTCGCCTGATGGACGACATCGTTTCTCACAAAGAGGAGCAAGAACGTGGTCACGTAGCATCTAGCATCGAATGCTACTCCAAAGAATCCGGCGCGTCCGAAGAAGAAGCTTGCGAATACATCAGCCGTAAAGTTGAAGATGCCTGGAAAGTTATCAACCGCGAAAGCCTGCGTCCGACGGCGGTCCCGTTTCCGCTGCTGATGCCGGCAATCAACCTGGCACGCATGTGTGAGGTTCTGTACAGCGTGAACGATGGTTTTACTCACGCGGAAGGTGACATGAAGAGCTATATGAAGAGCTTCTTCGTACACCCTATGGTCGTATGA

서열 번호: 9

대장균 발현을 위하여 코돈 최적화된 Picea abies의 α-파네센(5'으로부터 3')

ATGGACCTGGCAGTAGAAATTGCAATGGATCTGGCTGTTGATGATGTTGAACGTCGTGTGGGTGATTACCACTCTAACCTGTGGGACGACGACTTTATTCAGAGCCTGTCCACCCCGTACGGCGCCTCTTCTTACCGCGAACGCGCTGAACGTCTGGTTGGTGAAGTTAAAGAAATGTTCACCTCTATTAGCATCGAAGACGGCGAACTGACCTCTGACCTGCTGCAGCGTCTGTGGATGGTGGATAATGTAGAACGCCTGGGTATCTCTCGTCACTTCGAAAACGAAATCAAAGCCGCGATCGATTACGTTTATTCTTACTGGTCTGATAAAGGCATTGTTCGTGGTCGTGATAGCGCGGTTCCGGACCTGAATAGCATCGCGCTGGGTTTCCGTACCCTGCGCCTGCATGGTTACACTGTTTCTAGCGATGTTTTTAAAGTTTTTCAGGACCGTAAAGGCGAATTTGCTTGTTCTGCGATCCCGACCGAGGGTGATATTAAGGGCGTTCTGAACCTGCTGCGTGCATCCTATATTGCATTCCCGGGTGAAAAAGTGATGGAGAAAGCACAGACCTTCGCTGCAACCTACCTGAAAGAAGCACTGCAGAAAATCCAGGTTTCCAGCCTGAGCCGTGAGATCGAATATGTGCTGGAATATGGTTGGCTGACTAACTTCCCGCGTCTGGAAGCTCGTAACTATATCGATGTTTTCGGTGAAGAAATCTGTCCGTACTTCAAAAAGCCGTGCATTATGGTTGATAAACTGCTGGAACTGGCAAAACTGGAATTCAACCTGTTCCACTCTCTGCAGCAGACCGAACTGAAACATGTAAGCCGCTGGTGGAAAGATTCTGGTTTTTCCCAGCTGACTTTCACCCGTCACCGTCACGTGGAATTCTACACCCTGGCATCTTGTATCGCTATTGAGCCGAAACATTCCGCATTCCGTCTGGGCTTCGCGAAAGTGTGCTATCTGGGTATTGTGCTGGATGATATCTACGATACTTTTGGCAAGATGAAAGAACTGGAACTGTTTACCGCTGCTATTAAACGCTGGGACCCGTCTACTACTGAGTGCCTGCCGGAATATATGAAAGGCGTTTATATGGCCTTCTATAACTGTGTAAATGAACTGGCCCTGCAGGCGGAGAAGACCCAGGGTCGTGACATGCTGAACTACGCGCGCAAAGCCTGGGAAGCACTGTTCGACGCGTTCCTGGAAGAAGCAAAATGGATTAGCTCCGGTTACCTGCCGACCTTCGAAGAATACCTGGAAAACGGCAAGGTATCTTTCGGTTACCGTGCGGCCACTCTGCAGCCAATTCTGACTCTGGATATTCCGCTGCCGCTGCACATCCTGCAGCAAATCGACTTCCCGTCTCGTTTTAACGATCTGGCTAGCAGCATCCTGCGTCTGCGTGGTGACATCTGCGGCTACCAGGCTGAACGTTCTCGTGGTGAAGAAGCCTCTTCCATCTCTTGCTATATGAAAGATAATCCGGGCTCTACCGAAGAGGACGCGCTGTCTCACATTAACGCCATGATCTCTGATAACATTAACGAGCTGAATTGGGAACTGCTGAAACCGAACTCTAATGTACCGATCTCCTCTAAGAAACACGCGTTCGATATCCTGCGTGCGTTCTACCACCTGTACAAGTATCGTGACGGTTTCTCTATCGCTAAGATCGAAACTAAGAACCTGGTGATGCGTACCGTTCTGGAGCCGGTACCGATGTAA

서열 번호: 10

Saccharomyces cerevisiae 발현을 위하여 코돈 최적화된 Artemisia annua의 β-파네센 합성 효소(5'으로부터 3')

GGATCCATGTCAACTTTGCCTATTTCTTCTGTGTCATTTTCCTCTTCTACATCACCATTAGTCGTGGACGACAAAGTCTCAACCAAGCCCGACGTTATCAGACATACAATGAATTTCAATGCTTCTATTTGGGGAGATCAATTCTTGACCTATGATGAGCCTGAAGATTTAGTTATGAAGAAACAATTAGTGGAGGAATTAAAAGAGGAAGTTAAGAAGGAATTGATAACTATCAAAGGTTCAAATGAGCCCATGCAGCATGTGAAATTGATTGAATTAATTGATGCTGTTCAACGTTTAGGTATAGCTTACCATTTTGAAGAAGAGATCGAGGAAGCTTTGCAACATATACATGTTACCTATGGTGAACAGTGGGTGGATAAGGAAAATTTACAGAGTATTTCATTGTGGTTCAGGTTGTTGCGTCAACAGGGCTTTAACGTCTCCTCTGGCGTTTTCAAAGACTTTATGGACGAAAAAGGTAAATTCAAAGAGTCTTTATGCAATGATGCACAAGGAATATTAGCCTTATATGAAGCTGCATTTATGAGGGTTGAAGATGAAACCATCTTAGACAATGCTTTGGAATTCACAAAAGTTCATTTAGATATCATAGCAAAAGACCCATCTTGCGATTCTTCATTGCGTACACAAATCCATCAAGCCTTAAAACAACCTTTAAGAAGGAGATTAGCAAGGATTGAAGCATTACATTACATGCCAATCTACCAACAGGAAACATCTCATGATGAAGTATTGTTGAAATTAGCCAAGTTGGATTTCAGTGTTTTGCAGTCTATGCATAAAAAGGAATTGTCACATATCTGTAAGTGGTGGAAAGATTTAGATTTACAAAATAAGTTACCTTATGTACGTGATCGTGTTGTCGAAGGCTACTTCTGGATATTGTCCATATACTATGAGCCACAACACGCTAGAACAAGAATGTTTTTGATGAAAACATGCATGTGGTTAGTAGTTTTGGACGATACTTTTGATAATTATGGAACATACGAAGAATTGGAGATTTTTACTCAAGCCGTCGAGAGATGGTCTATCTCATGCTTAGATATGTTGCCCGAATATATGAAATTAATCTACCAAGAATTAGTCAATTTGCATGTGGAAATGGAAGAATCTTTGGAAAAGGAGGGAAAGACCTATCAGATTCATTACGTTAAGGAGATGGCTAAAGAATTAGTTCGTAATTACTTAGTAGAAGCAAGATGGTTGAAGGAAGGTTATATGCCTACTTTAGAAGAATACATGTCTGTTTCTATGGTTACTGGTACTTATGGTTTGATGATTGCAAGGTCCTATGTTGGCAGAGGAGACATTGTTACTGAAGACACATTCAAATGGGTTTCTAGTTACCCACCTATTATTAAAGCTTCCTGTGTAATAGTAAGATTAATGGACGATATTGTATCTCACAAGGAAGAACAAGAAAGAGGACATGTGGCTTCATCTATAGAATGTTACTCTAAAGAATCAGGTGCTTCTGAAGAGGAAGCATGTGAATATATTAGTAGGAAAGTTGAGGATGCCTGGAAAGTAATCAATAGAGAATCTTTGCGTCCAACAGCCGTTCCCTTCCCTTTGTTAATGCCAGCAATAAACTTAGCTAGAATGTGTGAGGTCTTGTACTCTGTTAATGATGGTTTTACTCATGCTGAGGGTGACATGAAATCTTATATGAAGTCCTTCTTCGTTCATCCTATGGTCGTTTGACTCGAG

서열 번호: 11

Saccharomyces cerevisiae 발현을 위하여 코돈 최적화된 Picea abies의 α-파네센(5'으로부터 3')

GGATCCATGGATTTGGCTGTTGAGATTGCAATGGACTTGGCTGTGGATGATGTCGAAAGAAGGGTGGGCGATTACCATTCTAACTTATGGGACGATGATTTTATACAATCATTAAGTACTCCTTACGGTGCTAGTTCATACAGAGAAAGAGCAGAGAGATTAGTGGGTGAGGTCAAAGAGATGTTTACATCCATCTCTATAGAGGATGGAGAATTAACAAGTGATTTATTACAGCGTTTGTGGATGGTTGATAATGTAGAGAGATTGGGAATTTCCCGTCATTTTGAGAATGAGATCAAGGCAGCTATTGACTATGTCTATTCCTACTGGAGTGATAAGGGCATCGTTAGAGGTAGGGATTCTGCAGTGCCTGATTTAAACTCTATTGCCTTAGGTTTTAGAACATTGAGATTACATGGTTATACCGTCTCTTCCGACGTATTCAAAGTTTTTCAAGATAGAAAGGGTGAATTCGCATGTAGTGCCATCCCAACTGAGGGCGACATTAAGGGTGTTTTAAACTTGTTGAGAGCTTCATACATCGCCTTTCCAGGAGAAAAAGTTATGGAAAAAGCTCAAACATTTGCTGCTACTTATTTGAAAGAGGCATTGCAAAAGATTCAGGTTTCCTCTTTGTCACGTGAGATCGAATACGTATTAGAATACGGCTGGTTGACAAACTTCCCTAGATTAGAAGCCAGAAACTATATCGATGTATTCGGTGAGGAGATTTGCCCATATTTCAAGAAGCCTTGTATAATGGTTGATAAGTTATTGGAATTGGCTAAGTTAGAATTTAATTTATTTCACTCATTACAACAGACCGAATTGAAACACGTTTCTAGATGGTGGAAAGACTCTGGCTTTTCTCAATTAACTTTTACACGTCATAGACATGTCGAATTCTATACATTGGCCTCCTGTATTGCAATTGAACCTAAACACTCTGCATTTAGGTTAGGTTTCGCCAAGGTTTGCTACTTAGGCATCGTATTAGATGATATTTACGACACCTTCGGAAAGATGAAGGAATTAGAATTATTCACTGCCGCAATAAAAAGATGGGACCCTTCAACAACAGAATGTTTACCAGAATACATGAAAGGTGTGTACATGGCATTCTATAACTGCGTTAATGAATTGGCTTTACAAGCAGAGAAAACTCAAGGAAGGGATATGTTAAACTACGCACGTAAGGCCTGGGAGGCTTTGTTCGATGCTTTTTTGGAAGAAGCCAAATGGATATCTAGTGGTTACTTACCAACCTTCGAAGAATATTTAGAAAATGGTAAAGTATCTTTCGGATATAGAGCTGCAACTTTGCAGCCAATTTTAACTTTGGATATACCTTTGCCCTTGCATATTTTGCAGCAAATAGACTTCCCTTCTAGATTTAATGATTTAGCTAGTAGTATTTTGAGATTGCGTGGCGATATATGCGGTTACCAAGCAGAGAGATCTAGAGGTGAGGAAGCATCATCTATAAGTTGCTATATGAAGGATAATCCCGGTTCTACAGAAGAAGACGCCTTATCTCACATAAACGCTATGATATCTGATAACATTAACGAGTTGAACTGGGAGTTATTAAAGCCAAATTCCAATGTTCCAATATCAAGTAAAAAGCACGCTTTTGATATATTACGTGCTTTCTATCACTTGTATAAGTATCGTGATGGTTTTTCTATCGCAAAGATTGAAACTAAGAATTTGGTTATGAGAACTGTGTTGGAACCAGTACCAATGTGACTCGAG

서열 번호: 12

pAM328의 KanMX-PMET3 영역(5'으로부터 3')

GAATTCGCCCTTNTGGATGGCGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCACATACGATTGACGCATGATATTACTTTCTGCGCACTTAACTTCGCATCTGGGCAGATGATGTCGAGGCGAAAAAAAATATAAATCACGCTAACATTTGATTAAAATAGAACAACTACAATATAAAAAAACTATACAAATGACAAGTTCTTGAAAACAAGAATCTTTTTATTGTCAGTACTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTGCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAAACGTGAGTCTTTTCCTTACCCATGGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGATTTTAAAAGGAAGTATATGAAAGAAGAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCTTTTATATTTCTCTACAGGGGCGCGGCGTGGGGACAATTCAACGCGTCTGTGAGGGGAGCGTTTCCCTGCTCGCAGGTCTGCAGCGAGGAGCCGTAATTTTTGCTTCGCGCCGTGCGGCCATCAAAATGTATGGATGCAAATGATTATACATGGGGATGTATGGGCTAAATGTACGGGCGACAGTCACATCATGCCCCTGAGCTGCGCACGTCAAGACTGTCAAGGAGGGTATTCTGGGCCTCCATGTCGCTGGCCGGGTGACCCGGCGGGGACGAGGCAAGCTAAACAGATCTGATCTTGAAACTGAGTAAGATGCTCAGAATACCCGTCAAGATAAGAGTATAATGTAGAGTAATATACCAAGTATTCAGCATATTCTCCTCTTCTTTTGTATAAATCACGGAAGGGATGATTTATAAGAAAAATGAATACTATTACACTTCATTTACCACCCTCTGATCTAGATTTTCCAACGATATGTACGTAGTGGTATAAGGTGAGGGGGTCCACAGATATAACATCGTTTAATTTAGTACTAACAGAGACTTTTGTCACAACTACATATAAGTGTACAAATATAGTACAGATATGACACACTTGTAGCGCCAACGCGCATCCTACGGATTGCTGACAGAAAAAAAGGTCACGTGACCAGAAAAGTCACGTGTAATTTTGTAACTCACCGCATTCTAGCGGTCCCTGTCGTGCACACTGCACTCAACACCATAAACCTTAGCAACCTCCAAAGGAAATCACCGTATAACAAAGCCACAGTTTTACAACTTAGTCTCTTATGAAGTTACTTACCAATGAGAAATAGAGGCTCTTTCTCGAGAAATATGAATATGGATATATATATATATATATATATATATATATATATATGTAAACTTGGTTCTTTTTTAGCTTGTGATCTCTAGCTTGGGTCTCTCTCTGTCGTAACAGTTGTGATATCGNAAGGGCGAATTC

서열 번호: 13

프라이머 4-49 mvaA SpeI (5'으로부터 3')

GCTACTAGTAGGAGGAAAACATCATGCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCG

서열 번호: 14

프라이머 4-49 mvaAR XbaI (5'으로부터 3')

GCTTCTAGACTATTGTTGTCTAATTTCTTGTAAAATGCG

서열 번호: 15

프라이머 HMGS 3' Sa mvaS-AS (5'으로부터 3')

TTGCATGATGTTTTCCTCCTACTAGTTACTCTGGTCTGTGATATTCGCGAAC

서열 번호: 16

프라이머 HMGS 5' Sa mvaS-S (5'으로부터 3')

GAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGACAATAGGTATCGACAAAATAAACT

서열 번호: 17

프라이머 19-25 atoB SfiI-S (5'으로부터 3')

GCTAGGCCATCCTGGCCATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTG

서열 번호: 18

프라이머 19-25 mvaA-AsiSI-AS (5'으로부터 3')

GCTTGCGATCGCCGGCGGATTTGTCCTACTCAG

서열 번호: 19

프라이머 67-1A-C (5'으로부터 3')

ACACTCGAGGAGGAATAAATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG

서열 번호: 20

프라이머 67-1B-C (5'으로부터 3')

TGATGGTACCTTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTGGC

서열 번호: 21

프라이머 67-1C-C (5'으로부터 3')

ACTAGGTACCAGGAGGAATAAATGAAGCAACTCACCATTCTGGGC

서열 번호: 22

프라이머 67-1D-C (5'으로부터 3')

AATTGATGGGCCCTCAGCTTGCGAGACGCATCACCTC

서열 번호: 23

프라이머 67-1E-C (5'으로부터 3')

CATAAAGGGCCCAGGAGGAATAAATGGCAACCACTCATTTGGATG

서열 번호: 24

프라이머 67-1F-C (5'으로부터 3')

TATTGTTCATATGTTATGTATTCTCCTGATGGATGGTTCG

서열 번호: 25

프라이머 67-1G-C (5'으로부터 3')

AACTAACACATATGAGGAGGAATAAATGCGGACACAGTGGCCCTC

서열 번호: 26

프라이머 67-1H-C (5'으로부터 3')

TGTTAGTTACGCGTTTAAAGCATGGCTCTGTGCAATGG

서열 번호: 27

프라이머 67-2A-C (5'으로부터 3')

ACGGGATCCAGGAGGAATAAATGCGAATTGGACACGGTTTTGACG

서열 번호: 28

프라이머 67-2B-C (5'으로부터 3')

TTTAGTTGGGCCCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC

서열 번호: 29

프라이머 67-2C-C (5'으로부터 3')

TACTAAGGGCCCAGGAGGAAATAATGCATAACCAGGCTCCAATTCAACG

서열 번호: 30

프라이머 67-2D-C (5'으로부터 3')

TCCGGGTACCTTATTTTTCAACCTGCTGAACGTCAATTCG

서열 번호: 31

프라이머 67-2E-C (5'으로부터 3')

AACAGGTACCAGGAGGAAATAATGCAGATCCTGTTGGCCAACC

서열 번호: 32

프라이머 67-2F-C (5'으로부터 3')

TGGATGAAGTCGACTTAATCGACTTCACGAATATCGACACGCAGC

서열 번호: 33

프라이머 67-2G-C (5'으로부터 3')

CATCAAGTCGACAGGAGGAAATAATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTG

서열 번호: 34

프라이머 67-2H-C (5'으로부터 3')

TAATGCAAGCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCG

서열 번호: 35

프라이머 67-2I-C (5'으로부터 3')

CAGTAAAGCTTAGGAGGAAATAATGGACTTTCCGCAGCAACTCG

서열 번호: 36

프라이머 67-2J-C (5'으로부터 3')

TAGTTCCATGGTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCCGC

서열 번호: 37

프라이머 9-156A (5'으로부터 3')

ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGG

서열 번호: 38

프라이머 9-156B (5'으로부터 3')

TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAG

서열 번호: 39

프라이머 61-67-CPK001-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACT

서열 번호: 40

프라이머 61-67-CPK002-G (5'으로부터 3')

ACTGCAAAGTACACATATATCCCGGGTGTCAGCTCTTTTAGATCGG

서열 번호: 41

프라이머 61-67-CPK003-G (5'으로부터 3')

CCGATCTAAAAGAGCTGACACCCGGGATATATGTGTACTTTGCAGT

서열 번호: 42

프라이머 61-67-CPK004-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACGGCGTCAGTCCACCAGCTAACA

서열 번호: 43

프라이머 61-67-CPK005-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACAC

서열 번호: 44

프라이머 61-67-CPK006-G (5'으로부터 3')

AAAGATGAATTGAAAAGCTTCCCGGGTATGGACCCTGAAACCACAG

서열 번호: 45

프라이머 61-67-CPK007-G (5'으로부터 3')

CTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTT

서열 번호: 46

프라이머 61-67-CPK008-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACCCAACAATAATAATGTCAGATC

서열 번호: 47

프라이머 61-67-CPK009-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACTACTCAGTATATTAAGTTTCGA

서열 번호: 48

프라이머 61-67-CPK010-G (5'으로부터 3')

ATCTCTCGCAAGAGTCAGACTGACTCCCGGGCGTGAATAAGCTTCGGGTGACCCTTATGGCATTCTTTTT

서열 번호: 49

프라이머 61-67-CPK011-G (5'으로부터 3')

AAAAAGAATGCCATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTCAGTCTGACTCTTGCGAGAGAT

서열 번호: 50

프라이머 61-67-CPK012-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACAATTTAGTGTCTGCGATGATGA

서열 번호: 51

프라이머 61-67-CPK013-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACTATTGTGAGGGTCAGTTATTTC

서열 번호: 52

프라이머 61-67-CPK014alt-G (5'으로부터 3')

GCGGGGACGAGGCAAGCTAAACTTTAGTATATTCTTCGAAGAAA

서열 번호: 53

프라이머 61-67-CPK015alt-G (5'으로부터 3')

TTTCTTCGAAGAATATACTAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGC

서열 번호: 54

프라이머 61-67-CPK017-G (5'으로부터 3')

CGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAGAGGCTAGCAGAATTACCCTCCACGTTGATTG

서열 번호: 55

프라이머 61-67-CPK018-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACGCCGCCGTTGTTGTTATTGTAG

서열 번호: 56

프라이머 61-67-CPK019-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAA

서열 번호: 57

프라이머 61-67-CPK020-G (5'으로부터 3')

GGGTGACCCGGCGGGGACGAGGCAAGCTAAACGTCTTCCTTTCTCTTACCAAAGT

서열 번호: 58

프라이머 61-67-CPK021-G (5'으로부터 3')

ACTTTGGTAAGAGAAAGGAAGACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCC

서열 번호: 59

프라이머 61-67-CPK022-G (5'으로부터 3')

AATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTCCCGGGTGGATGGCGGCGTTAGTATCGAATCGACAGC

서열 번호: 60

프라이머 61-67-CPK023-G (5'으로부터 3')

GCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAAAGATTCTCTTTTTTTATGATATT

서열 번호: 61

프라이머 61-67-CPK024-G (5'으로부터 3')

GTTTAAACGTGTTAACGTTTCTTTCGCCTACGTGGAAGGAGAATC

서열 번호: 62

프라이머 61-67-CPK025-G (5'으로부터 3')

TCCCCCCGGGTTAAAAAAAATCCTTGGACTAGTCA

서열 번호: 63

프라이머 61-67-CPK031-G (5'으로부터 3')

TCCCCCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAA

서열 번호: 64

프라이머 61-67-CPK032-G (5'으로부터 3')

TCCCCCCGGGTATATATATATCATTGTTAT

서열 번호: 65

프라이머 61-67-CPK035-G (5'으로부터 3')

TCCCCCCGGGAAAAGTAAGTCAAAAGGCAC

서열 번호: 66

프라이머 61-67-CPK040-G (5'으로부터 3')

TCCCCCCGGGATGGTCTGCTTAAATTTCAT

서열 번호: 67

프라이머 61-67-CPK041-G (5'으로부터 3')

TCCCCCCGGGTAGCTTGTACCCATTAAAAGAATTTTATCATGCCG

서열 번호: 68

프라이머 61-67-CPK046-G (5'으로부터 3')

TCCCCCCGGGTTTCTCATTCAAGTGGTAAC

서열 번호: 69

프라이머 61-67-CPK047-G (5'으로부터 3')

TCCCCCCGGGTAAATAAAGAAAATAAAGTT

서열 번호: 70

프라이머 61-67-CPK050-G (5'으로부터 3')

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGA

서열 번호: 71

프라이머 61-67-CPK051-G (5'으로부터 3')

TCCTAATTTCTTTTTCTGAAGCCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

서열 번호: 72

프라이머 61-67-CPK052-G (5'으로부터 3')

AGTTTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA

서열 번호: 73

프라이머 61-67-CPK053-G (5'으로부터 3')

TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGGCTGCAGACCAATTGGTGAAAACT

서열 번호: 74

프라이머 61-67-CPK054-G (5'으로부터 3')

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTT

서열 번호: 75

프라이머 61-67-CPK055-G (5'으로부터 3')

AACAAAGTTTAGTTGAGAGTTTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

서열 번호: 76

프라이머 61-67-CPK056-G (5'으로부터 3')

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCTCAGAACGTTTACATTGTAT

서열 번호: 77

프라이머 61-67-CPK057-G (5'으로부터 3')

ATACAATGTAAACGTTCTGAGACATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

서열 번호: 78

프라이머 61-67-CPK058-G (5'으로부터 3')

TGCAGAAGTTAAGAACGGTAATGACATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA

서열 번호: 79

프라이머 61-67-CPK059-G (5'으로부터 3')

TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGCA

서열 번호: 80

프라이머 61-67-CPK060-G (5'으로부터 3')

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTG

서열 번호: 81

프라이머 61-67-CPK061-G (5'으로부터 3')

CACTGAAGGCTCTCAACTCTGACATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

서열 번호: 82

프라이머 61-67-CPK062-G (5'으로부터 3')

GGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA

서열 번호: 83

프라이머 61-67-CPK063-G (5'으로부터 3')

TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGACCGTTTACACAGCATCCGTTACC

서열 번호: 84

프라이머 61-67-CPK064-G (5'으로부터 3')

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGC

서열 번호: 85

프라이머 61-67-CPK065-G (5'으로부터 3')

GCATACTATTGTTGTCGGCAGTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

서열 번호: 86

프라이머 A (5'으로부터 3')

CCATGGACACTCTGCCGATCTCTTCCGTAAGC

서열 번호: 87

프라이머 B (5'으로부터 3')

GAGCTCTCATACGACCATAGGGTGTACG

서열 번호: 88

프라이머 C (5'으로부터 3')

CCATGGACCTGGCAGTAGAAATTGC

서열 번호: 89

프라이머 D (5'으로부터 3')

GAGCTCTTACATCGGTACCGGCTCCAG

서열 번호: 90

프라이머 GW-52-84 pAM326 BamHI (5'으로부터 3')

TAATAAGGATCCATGTCAACTTTGCCTATTTC

서열 번호: 91

프라이머 GW-52-84 pAM326 NheI (5'으로부터 3')

TTATAGCTAGCTCAAACGACCATAGGATGAAC

서열 번호: 92

프라이머 61-67-CPK016-G (5'으로부터 3')

CAATCAACGTGGAGGGTAATTCTGCTAGCCTCTCCCGGGTGGATGGCGGCGTTAGTATCG

서열 번호: 93

프라이머 50-56-pw100-G (5'으로부터 3')

GAGTGAACCTGCTGCCTGGCGTGCTCTGACTCAGTACATTTCATAGTGGATGGCGGCGTTAGTATC

서열 번호: 94

프라이머 50-56-pw101-G (5'으로부터 3')

CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGATATCACAACTGTTACGA

서열 번호: 95

프라이머 61-67-CPK066-G (5'으로부터 3')

GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCACAGGAAACAGCTATGACC

서열 번호: 96

프라이머 61-67-CPK067-G (5'으로부터 3')

TTGCGTTTTGTACTTTGGTTCGCTCAATTTTGCAGGTAGATAATCGAAAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT

SEQUENCE LISTING <110> Amyris Biotechnologies, Inc. <120> FUEL COMPOSITIONS COMPRISING FARNESANE AND FARNESANE DERIVATIVES AND METHOD OF MAKING AND USING SAME <130> 11836-012-228 <150> 60/850,881 <151> 2006-10-10 <150> 60/860,854 <151> 2006-11-21 <160> 96 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 4247 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MevT66 operon <400> 1 gaattcaaag gaggaaaata aaatgaagaa ctgtgtgatt gtttctgcgg tccgcacggc 60 gatcggcagc tttaacggct ctttagcgag cacctctgca atcgatctgg gtgcgacggt 120 cattaaggcc gccattgaac gcgccaaaat cgacagccag cacgttgatg aggtgatcat 180 gggcaatgtg ttacaagccg gcctgggtca aaacccagcg cgtcaagcac tgttaaaatc 240 tggtctggcc gagaccgtgt gtggcttcac cgtcaataag gtttgcggct ctggcctgaa 300 gagcgtggcc ctggcagcac aagcgattca agccggtcag gcacaaagca tcgttgcggg 360 tggcatggag aacatgtctc tggcgccgta cttattagat gccaaagccc gcagcggtta 420 tcgcctgggc gatggtcagg tgtacgacgt catcttacgc gatggcttaa tgtgcgcgac 480 ccacggttac cacatgggta ttacggccga aaacgtggcg aaagaatacg gcattacgcg 540 cgagatgcag gatgaattag cactgcactc tcagcgcaaa gcagcagccg cgatcgagtc 600 tggtgcgttt acggcggaaa tcgtgccagt taacgtggtc acgcgcaaga agacgttcgt 660 tttcagccag gacgagttcc cgaaggcaaa cagcaccgcg gaggccttag gtgccttacg 720 cccagccttt gacaaagcgg gcacggtcac cgccggtaat gcgagcggca tcaatgatgg 780 tgcagcggca ctggtcatca tggaagagag cgccgcatta gcagcgggtc tgaccccatt 840 agcgcgcatt aaatcttatg ccagcggcgg cgtcccacca gccctgatgg gcatgggtcc 900 ggtcccagcc acgcaaaaag ccctgcaatt agcgggcctg caactggccg acattgatct 960 gatcgaggcg aacgaggcgt ttgcagcgca gttcctggcg gtgggtaaga atctgggctt 1020 cgacagcgag aaagtcaatg tgaacggtgg cgcgattgcg ttaggccatc cgattggtgc 1080 aagcggcgca cgcatcttag tgacgttact gcacgccatg caggcacgcg acaagacctt 1140 aggcctggcg accttatgta ttggtggcgg tcaaggtatc gccatggtga tcgaacgcct 1200 gaactgaaga tctaggagga aagcaaaatg aaactgagca ccaagctgtg ctggtgtggc 1260 atcaagggtc gcctgcgccc acaaaagcag caacagctgc acaacacgaa cctgcaaatg 1320 accgagctga aaaagcagaa gacggccgag caaaagaccc gcccgcagaa cgttggcatc 1380 aagggcatcc agatttatat cccgacgcag tgtgtcaacc aatctgagct ggagaaattc 1440 gatggcgtca gccagggtaa gtacaccatc ggcctgggcc agaccaacat gagcttcgtg 1500 aacgaccgtg aggacatcta ttctatgagc ctgacggtgc tgtctaagct gatcaagagc 1560 tacaacatcg acacgaataa gatcggtcgt ctggaggtgg gtacggagac gctgattgac 1620 aagagcaaaa gcgtgaagtc tgtcttaatg cagctgttcg gcgagaacac ggatgtcgag 1680 ggtatcgaca ccctgaacgc gtgttacggc ggcaccaacg cactgttcaa tagcctgaac 1740 tggattgaga gcaacgcctg ggatggccgc gatgcgatcg tcgtgtgcgg cgatatcgcc 1800 atctatgaca agggtgcggc acgtccgacc ggcggtgcag gcaccgttgc gatgtggatt 1860 ggcccggacg caccaattgt cttcgattct gtccgcgcgt cttacatgga gcacgcctac 1920 gacttttaca agccggactt cacgagcgaa tacccgtacg tggacggcca cttctctctg 1980 acctgctatg tgaaggcgct ggaccaggtt tataagtctt atagcaaaaa ggcgatttct 2040 aagggcctgg tcagcgaccc ggcaggcagc gacgccctga acgtgctgaa gtatttcgac 2100 tacaacgtgt tccatgtccc gacctgcaaa ttagtgacca aatcttatgg ccgcctgtta 2160 tataatgatt tccgtgccaa cccgcagctg ttcccggagg ttgacgccga gctggcgacg 2220 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ctggttcaag ttcctgtcca acgatgttcg taatcatttg 4500 gtcgacatcg ccccaggtaa gactattttc gattatctac ctgcaaaatt gagcgaacca 4560 aagtacaaaa cgcaactaga agaccgctct ctattggttc acaaacataa actaattcca 4620 ttggaagtaa ttgtcagagg ctacatcacc ggatctgctt ggaaagagta cgtaaaaaca 4680 ggtactgtgc atggtttgaa acaacctcaa ggacttaaag aatctcaaga gttcccagaa 4740 ccaatcttca ccccatcgac caaggctgaa caaggtgaac atgacgaaaa catctctcct 4800 gcccaggccg ctgagctggt gggtgaagat ttgtcacgta gagtggcaga actggctgta 4860 aaactgtact ccaagtgcaa agattatgct aaggagaagg gcatcatcat cgcagacact 4920 aaattgttta aac 4933 <210> 6 <211> 6408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERG10-PGAL-ERG12 insert of pAM495 <400> 6 gtttaaacta ttgtgagggt cagttatttc atccagatat aacccgagag gaaacttctt 60 agcgtctgtt ttcgtaccat aaggcagttc atgaggtata ttttcgttat tgaagcccag 120 ctcgtgaatg cttaatgctg ctgaactggt gtccatgtcg cctaggtacg caatctccac 180 aggctgcaaa ggttttgtct caagagcaat gttattgtgc accccgtaat tggtcaacaa 240 gtttaatctg tgcttgtcca ccagctctgt cgtaaccttc 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atggacctgg cagtagaaat tgcaatggat ctggctgttg atgatgttga acgtcgtgtg 60 ggtgattacc actctaacct gtgggacgac gactttattc agagcctgtc caccccgtac 120 ggcgcctctt cttaccgcga acgcgctgaa cgtctggttg gtgaagttaa agaaatgttc 180 acctctatta gcatcgaaga cggcgaactg acctctgacc tgctgcagcg tctgtggatg 240 gtggataatg tagaacgcct gggtatctct cgtcacttcg aaaacgaaat caaagccgcg 300 atcgattacg tttattctta ctggtctgat aaaggcattg ttcgtggtcg tgatagcgcg 360 gttccggacc tgaatagcat cgcgctgggt ttccgtaccc tgcgcctgca tggttacact 420 gtttctagcg atgtttttaa agtttttcag gaccgtaaag gcgaatttgc ttgttctgcg 480 atcccgaccg agggtgatat taagggcgtt ctgaacctgc tgcgtgcatc ctatattgca 540 ttcccgggtg aaaaagtgat ggagaaagca cagaccttcg ctgcaaccta cctgaaagaa 600 gcactgcaga aaatccaggt ttccagcctg agccgtgaga tcgaatatgt gctggaatat 660 ggttggctga ctaacttccc gcgtctggaa gctcgtaact atatcgatgt tttcggtgaa 720 gaaatctgtc cgtacttcaa aaagccgtgc attatggttg ataaactgct ggaactggca 780 aaactggaat tcaacctgtt ccactctctg cagcagaccg aactgaaaca tgtaagccgc 840 tggtggaaag attctggttt 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aatatcataa aaaaagagaa tctttcccgg gtggatggcg gcgttagtat cgaatcgaca 60 gc 62 <210> 60 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK023-G <400> 60 gctgtcgatt cgatactaac gccgccatcc acccgggaaa gattctcttt ttttatgata 60 tt 62 <210> 61 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK024-G <400> 61 gtttaaacgt gttaacgttt ctttcgccta cgtggaagga gaatc 45 <210> 62 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK025-G <400> 62 tccccccggg ttaaaaaaaa tccttggact agtca 35 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK031-G <400> 63 tccccccggg agttatgaca attacaacaa cagaa 35 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK032-G <400> 64 tccccccggg tatatatata tcattgttat 30 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK035-G <400> 65 tccccccggg aaaagtaagt caaaaggcac 30 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK040-G <400> 66 tccccccggg atggtctgct taaatttcat 30 <210> 67 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK041-G <400> 67 tccccccggg tagcttgtac ccattaaaag aattttatca tgccg 45 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK046-G <400> 68 tccccccggg tttctcattc aagtggtaac 30 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK047-G <400> 69 tccccccggg taaataaaga aaataaagtt 30 <210> 70 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK050-G <400> 70 aatttttgaa aattcaatat aaatggcttc agaaaaagaa attagga 47 <210> 71 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK051-G <400> 71 tcctaatttc tttttctgaa gccatttata ttgaattttc aaaaatt 47 <210> 72 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK052-G <400> 72 agttttcacc aattggtctg cagccattat agttttttct ccttgacgtt a 51 <210> 73 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK053-G <400> 73 taacgtcaag gagaaaaaac tataatggct gcagaccaat tggtgaaaac t 51 <210> 74 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK054-G <400> 74 aatttttgaa aattcaatat aaatgaaact ctcaactaaa ctttgtt 47 <210> 75 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK055-G <400> 75 aacaaagttt agttgagagt ttcatttata ttgaattttc aaaaatt 47 <210> 76 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK056-G <400> 76 aatttttgaa aattcaatat aaatgtctca gaacgtttac attgtat 47 <210> 77 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK057-G <400> 77 atacaatgta aacgttctga gacatttata ttgaattttc aaaaatt 47 <210> 78 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK058-G <400> 78 tgcagaagtt aagaacggta atgacattat agttttttct ccttgacgtt a 51 <210> 79 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK059-G <400> 79 taacgtcaag gagaaaaaac tataatgtca ttaccgttct taacttctgc a 51 <210> 80 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK060-G <400> 80 aatttttgaa aattcaatat aaatgtcaga gttgagagcc ttcagtg 47 <210> 81 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK061-G <400> 81 cactgaaggc tctcaactct gacatttata ttgaattttc aaaaatt 47 <210> 82 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK062-G <400> 82 ggtaacggat gctgtgtaaa cggtcattat agttttttct ccttgacgtt a 51 <210> 83 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK063-G <400> 83 taacgtcaag gagaaaaaac tataatgacc gtttacacag catccgttac c 51 <210> 84 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK064-G <400> 84 aatttttgaa aattcaatat aaatgactgc cgacaacaat agtatgc 47 <210> 85 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK065-G <400> 85 gcatactatt gttgtcggca gtcatttata ttgaattttc aaaaatt 47 <210> 86 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer A <400> 86 ccatggacac tctgccgatc tcttccgtaa gc 32 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer B <400> 87 gagctctcat acgaccatag ggtgtacg 28 <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer C <400> 88 ccatggacct ggcagtagaa attgc 25 <210> 89 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D <400> 89 gagctcttac atcggtaccg gctccag 27 <210> 90 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GW-52-84 pAM326 BamHI <400> 90 taataaggat ccatgtcaac tttgcctatt tc 32 <210> 91 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GW-52-84 pAM326 NheI <400> 91 ttatagctag ctcaaacgac cataggatga ac 32 <210> 92 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK016-G <400> 92 caatcaacgt ggagggtaat tctgctagcc tctcccgggt ggatggcggc gttagtatcg 60 <210> 93 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 50-56-pw100-G <400> 93 gagtgaacct gctgcctggc gtgctctgac tcagtacatt tcatagtgga tggcggcgtt 60 agtatc 66 <210> 94 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 50-56-pw101-G <400> 94 cgtgtatacg ttttccgctt ctgctcttcg tcttttctct tcttccgata tcacaactgt 60 tacga 65 <210> 95 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK066-G <400> 95 ggtaagacgg ttgggtttta tcttttgcag ttggtactat taagaacaat cacaggaaac 60 agctatgacc 70 <210> 96 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 61-67-CPK067-G <400> 96 ttgcgttttg tactttggtt cgctcaattt tgcaggtaga taatcgaaaa gttgtaaaac 60 gacggccagt 70

Claims

(a) 다음 구조식의 이소프레노이드 화합물

(I) 또는

(II) 또는

그 입체이성질체 및

(b) 연료 성분을 함유하는 혼합물을 함유하거나, 이 혼합물로부터 얻을 수 있는 연료 조성물:

단 여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴(alkaryl) 또는 아랄킬(aralkyl)이며, 상기 이소프레노이드 화합물의 함량은 상기 연료 조성물 전체 중량 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99 중량%이다.
제1항에 있어서,

상기 연료 조성물의 T90 증류 온도는 약 282℃에서 약 338℃인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 이소프레노이드 화합물의 함량은 상기 연료 조성물 전체 중량 기준으로 약 5 중량% 내지 약 90 중량%인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 이소프레노이드 화합물의 함량은 상기 연료 조성물 전체 중량 기준으로 적어도 10 중량%인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 이소프레노이드 화합물의 함량은 상기 연료 조성물 전체 중량 기준으로 적어도 20 중량%인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 이소프레노이드 화합물의 함량은 상기 연료 조성물 전체 중량 기준으로 적어도 50 중량%인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 연료 조성물의 황 함량은 상기 연료 조성물 전체 중량 기준으로 20 ppm 미만인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 연료 조성물의 방향족 함량은 상기 연료 조성물 전체 부피 기준으로 20 부피% 미만인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 연료 조성물의 초기 끓는점은 100℃를 넘는 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 연료 조성물의 최종 끓는점은 200℃를 넘는 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 연료 조성물의 초기 끓는점은 100℃ 내지 150℃이고, 이 연료 조성물의 최종 끓는점은 300℃를 넘는 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 연료 성분은 석유나 석탄에서 유래한 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제12항에 있어서,

상기 연료 성분은 디젤 연료, 제트 연료, 등유, 휘발유 또는 이들의 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 연료 성분은 증류한 디젤 연료(distillate diesel fuel)를 포함하되, 상기 증류한 디젤 연료의 함량은 상기 연료 조성물의 전체 중량 기준으로 적어도 10 중량%인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서, 연료 첨가제를 더 포함하는 연료 조성물.
제15항에 있어서,

상기 연료 첨가제는 윤활성 개선제, 항산화제, 열 안정성 개선제, 세탄가 개선제, 안정제, 저온 흐름 개선제, 연소 개선제, 소포제, 연무 방지제, 부식 억제제, 결빙 억제제, 인젝터 청정용 첨가제, 연기 억제제, 공기 저항 방지제, 금속 비활성제, 분산제, 세제, 항유화제, 염료, 표지 물질(marker), 정전기 분산제, 살생물제(biocide) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택하는 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제15항에 있어서, 상기 연료 첨가제는 윤활성 개선제인 연료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 이소프레노이드 화합물은 아래 구조식 (IV)의 화합물 또는 그 입체이성질체인 것을 특징으로 하는 연료 조성물:

(IV)

단 여기서 R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이다.
제18항에 있어서, 상기 R은 C₁~C₃ 알킬인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제19항에 있어서, 상기 R은 메틸인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 이소프레노이드 화합물은 아래 구조식 (IV)의 실질적으로 순수한 화합물 또는 그 입체이성질체인 것을 특징으로 하는 연료 조성물:

(IV)

단 여기서 R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이다.
(a) 적어도 50 부피%의 연료 성분과

(b) 0.01 부피% 초과 50 부피% 미만으로 다음 구조식의 이소프레노이드 화합물 또는 그 입체이성질체를 포함하는 혼합물을 함유하거나, 이 혼합물로부터 얻을 수 있는 연료 조성물:

(I) 또는

(II)

단 여기서 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이다.
제22항에 있어서, 연료 첨가제를 더 포함하는 연료 조성물.
제23항에 있어서,

상기 연료 첨가제는 윤활성 개선제, 항산화제, 열 안정성 개선제, 세탄가 개선제, 안정제, 저온 흐름 개선제, 연소 개선제, 소포제, 연무 방지제, 부식 억제제, 결빙 억제제, 인젝터 청정용 첨가제, 연기 억제제, 공기 저항 방지제, 금속 비활성제, 분산제, 세제, 항유화제, 염료, 표지 물질(marker), 정전기 분산제, 살생물제(biocide) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택하는 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제22항에 있어서, 상기 연료 성분은 제트 연료인 것이 특징인 연료 조성물.
제22항에 있어서, 상기 연료 성분은 디젤 연료인 것이 특징인 연료 조성물.
제22항에 있어서, 상기 디젤 연료는 증류한 디젤 연료(distillate diesel fuel)인 것이 특징인 연료 조성물.
제22항에 있어서, 상기 이소프레노이드 화합물은 Z가 OH인

(I)

또는 그 입체이성질체이거나,

(IV)

또는 그 입체이성질체이며, 여기서 R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제28항에 있어서,

상기 이소프레노이드 화합물은 R이 C₁~C₃ 알킬인 구조식 (IV)인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제29항에 있어서, R이 메틸인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
연료 조성물의 제조 방법에 있어서, 구조식이

(I) 또는

(II)

인 이소프레노이드 화합물 또는 그 입체이성질체와

연료 성분, 연료 첨가제 또는 이들의 조합물을 혼합하는 단계를 포함하되,

상기 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이며, 상기 이소프레노이드의 함량은 상기 연료 조성물 전체 중량 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99 중량%인 것을 특징으로 하는 연료 조성물의 제조 방법.
제31항에 있어서,

상기 연료 조성물의 T90 증류 온도는 약 282℃에서 약 338℃인 것을 특징으로 하는 연료 조성물의 제조 방법.
제31항에 있어서,

상기 이소프레노이드 화합물의 함량은 상기 연료 조성물의 전체 중량 기준으로 약 5 중량% 내지 약 90 중량%인 것을 특징으로 하는 연료 조성물의 제조 방법.
제31항에 있어서,

상기 이소프레노이드 화합물은 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질로부터 화학적 으로 변환된 것을 특징으로 하는 연료 조성물의 제조 방법.
제34항에 있어서,

상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질은

또는 그 입체이성질체인 것을 특징으로 하는 연료 조성물의 제조 방법.
제31항에 있어서,

상기 연료 조성물의 황 함량은 상기 연료 조성물의 전체 중량 기준으로 20 ppm 미만인 것을 특징으로 하는 연료 조성물의 제조 방법.
구조식이

(I) 또는

(II)

인 이소프레노이드 화합물 또는 그 입체이성질체와 연료 첨가제를 혼합하는 단계를 포함하며,

상기 Z는 H, O-R 또는 O-C(=O)R이고, R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬인 연료의 제조 방법.
제37항에 있어서,

구조식이 (I) 또는 (II)인 상기 이소프레노이드 화합물은 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질로부터 화학적으로 변환된 것을 특징으로 하는 연료의 제조 방법.
제38항에 있어서,

상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질은 생물학적 원료원으로부터 얻는 것을 특징으로 하는 연료의 제조 방법.
제39항에 있어서, 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질은

또는 그 입체이성질체이고, 이 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질에 수소를 첨가하고 에스테르화하여

(IV)

또는 그 입체이성질체를 제조하되, 여기서 R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카 릴 또는 아랄킬인 것을 특징으로 하는 연료의 제조 방법.
제40항에 있어서, 상기 R은 C₁~C₃ 알킬인 것이 특징인 연료의 제조 방법.
제41항에 있어서, 상기 R은 메틸인 것이 특징인 연료의 제조 방법.
제39항에 있어서, 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질은

또는 그 입체이성질체이며, 이 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질에 수소를 첨가하고 에스테르화하여

(V)

또는 그 입체이성질체를 제조하되, 여기서 R은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬인 것을 특징으로 하는 연료의 제조 방법.
제43항에 있어서, 상기 R은 C₁~C₃ 알킬인 것이 특징인 연료의 제조 방법.
제44항에 있어서, 상기 R은 메틸인 것이 특징인 연료의 제조 방법.
제37항에 있어서,

상기 연료 첨가제와 상기 이소프레노이드 혼합물을 연료 성분과 혼합하는 단계를 더 포함하는 연료의 제조 방법.
제46항에 있어서, 상기 연료 성분은 증류한 디젤 연료인 것을 특징으로 하는 연료의 제조 방법.
제37항의 제조 방법으로 제조한 연료.
어느 혼합물을 포함하거나, 이 혼합물로부터 얻을 수 있는 연료 조성물에 있어서,

상기 혼합물은 적어도 두 개의 서로 다른 화합물을 포함하고, 이 화합물들은 각각 독립적으로 구조식 (III), (IV) 또는 (V)

(III),
(IV)

또는
(V)

이거나 그 입체이성질체이되,

여기서 R은 C₁~C₅ 알킬이고 상기 두 화합물들은 상기 연료 조성물의 전체 중량 기준으로 적어도 약 5 중량%의 함량으로 각각 존재하는 연료 조성물.
내연 기관;

상기 내연 기관에 연결된 연료 탱크;

상기 연료 탱크 속에 있으며, 상기 내연 기관의 동력원이 되는 제1항의 연료 조성물을 갖추고 있는 교통 수단.
제50항에 있어서, 상기 내연 기관은 디젤 엔진인 것이 특징인 교통 수단.
제1항에 있어서,

상기 연료 조성물의 끓는점은 약 282℃에서 약 338℃인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 연료 조성물의 끓는점은 140℃에서 320℃인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 연료 조성물의 끓는점은 약 200℃ 미만인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
제1항의 연료 조성물을 연소시키는 단계를 포함하는 엔진의 구동 방법.
연료 성분과 생명공학으로 가공한 C₁₅ 이소프레노이드 화합물을 포함하는 연료 조성물.
미생물을 이용하여 파네센(farnesene)을 마련하는 단계,

상기 파네센으로부터 파네산(farnesane)을 마련하는 단계와

상기 파네산으로부터 연료 조성물을 제조하는 단계를 거쳐 제조한 연료 조성물.
단순한 당으로부터 유래한 연료 성분을 함유하는 연료 조성물.
제58항에 있어서, 상기 단순한 당은 포도당, 갈락토오스, 만노오스, 과당, 리보오스 또는 이들의 조합물인 것을 특징으로 하는 연료 조성물.
(a) C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질의 제조에 적절한 조건 하에서, 단순한 당을 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질을 제조할 수 있는 세포에 접촉시키는 단계,

(b) 상기 C₁₅ 이소프레노이드 출발 물질에 수소를 첨가하여 수소 첨가 C₁₅ 이소프레노이드 화합물을 생성하는 단계 및

(c) 상기 수소 첨가 C₁₅ 이소프레노이드 화합물을 하나 이상의 연료 성분이나 연료 첨가제와 혼합하여 연료 조성물을 제조하는 단계를 포함하는,

단순한 당으로부터 연료 조성물을 제조하는 방법.
제60항에 있어서, 상기 단순한 당은 포도당, 갈락토오스, 만노오스, 과당, 리보오스 또는 이들의 조합물인 것을 특징으로 하는 연료 조성물을 제조하는 방법.