KR20090075856A - 신규한 화합물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 예를 들어, 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균 감염, 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역 질환의 치료 또는 암의 예방적 전치료 (pretreatment)의 용도로 유용한 안사마이신 (ansamycin) 유사체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 화합물의 제조 방법 및 의약으로서의 용도를 제공한다.

Description

신규한 화합물 및 이의 제조방법{NOVEL COMPOUNDS AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION}

본 발명은 예를 들어, 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균 감염, 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역 질환의 치료 또는 암의 예방적 전치료 (pretreatment)의 용도로 유용한 안사마이신 (ansamycin) 유사체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 화합물의 제조 방법 및 의약으로서의 용도를 제공한다.

독성이 적고 약물 동력학적 특성이 우호적인 대단히 특수한 항암제의 개발은 항암 치료 분야에서 중요한 도전을 의미한다.

90 kDa 열충격 단백질 (Hsp90)은 단백질의 접힘 및 조립과 관련된 풍부한 분자 샤페론인데, 이들 다수가 신호 전달 경로와 관련되어 있다 (Neckers, 2002; Sreedhar et al., 2004a; Wegele et al., 2004 및 이들의 참고문헌). 거의 50 여종 이상의 이러한 소위 클라이언트 단백질 (client proteins)라 일컫는 단백질이 확인되었으며, 스테로이드 수용체, 비수용체성 티로신 키나제, 예를 들어 src 류, 사이클린-의존성 키나제, 예를 들어 cdk4 및 cdk6, 낭포성 막횡단 조절자 (cystic transmembrane regulator), 산화질소 합성효소 및 이외의 것들을 포함한다 (Donze and Picard, 1999; McLaughlin et al., 2002; Chiosis et al., 2004; Wegele et al., 2004; http://www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors. pdf). 또한, Hsp90은 돌연변이 영향에 대한 세포의 스트레스 반응 및 보호에서 중요한 역할을 한다 (Bagatell and Whitesell, 2004; Chiosis et al., 2004). Hsp90의 기능은 복잡하고 이는 동적인 다중-효소 병용체의 형성에 관여한다 (Bohen, 1998; Liu et al., 1999; Young et al., 2001; Takahashi et al., 2003; Sreedhar et al., 2004; Wegele et al., 2004). Hsp90은 클라이언트 단백질의 분해, 세포 주기 조절장애/또는 정상화 및 아포토시스 (apoptosis)를 야기하는 억제제의 표적이다 (Fang et al., 1998; Liu et al., 1999; Blagosklonny, 2002; Neckers, 2003; Takahashi et al., 2003; Beliakoff and Whitesell, 2004; Wegele et al., 2004). 더욱 최근에, Hsp90은 종양의 전이를 위한 중요한 세포외 매개체임이 확인되었다 (Eustace et al., 2004). Hsp90은 이의 기능 (Blagosklonny et al., 1996; Neckers, 2002; Workman and Kaye, 2002; Beliakoff and Whitesell, 2004; Harris et al., 2004; Jez et al., 2003; Lee et al., 2004)에 대한 심도 있고 상세한 연구 및 고속처리 스크리닝 분석의 개발 (Carreras et al., 2003; Rowlands et al., 2004)을 반영하는 암 치료법을 위한 새로운 주요 치료 표적으로서 확인되었다. Hsp90 억제제는 안사마이신, 마크롤리드 (macrolides), 퓨린, 피라졸, 쿠마린 항생제 및 그외의 것들을 포함한다 (Bagatell and Whitesell, 2004; Chiosis et al., 2004 및 이들의 참고문헌).

벤제노이드 안사마이신은 방향족 고리 구조 양쪽에 결합된 다양한 길이의 지방족 고리에 의해 특징지어지는 광범위한 화학적 구조의 한 종류이다. 자연적으로 발생하는 안사마이신은 하기를 포함한다: 막베신 (macbecin), 18,21-디하이드로막베신 (또한 막베신 I 및 막베신 II로 각각 알려져있음) (1 & 2; Tanida et al., 1980), 젤다나마이신 (3; DeBoer et al., 1970; DeBoer and Dietz, 1976; WO 03/106653 및 이들의 참고문헌), 및 헤르비마이신 류 (4, 5, 6, Omura et al., 1979, Iwai., 1980 and Shibata et al, 1986a, WO 03/106653 및 이들의 참고문헌).

안사마이신은 원래 이들의 항균 및 항바이러스 활성이 규명되었으나, 최근에 항암제로서의 이들의 잠재적 이용성이 더 큰 관심의 대상이 되고 있다 (Beliakoff and Whitesell, 2004). 많은 Hsp90 억제제가 최근에 임상 실험에서 평가되기 시작하였다 (Csermely and Soti, 2003; Workman, 2003). 특히, 젤다나마이신은 나노몰로도 효과를 나타내고 종양 세포 의존적으로 변형된 단백질 키나제에 대해 명백한 특이성을 갖는다 (Chiosis et al., 2003; Workman, 2003).

Hsp90 억제제를 이용한 치료는 방사선 조사에 의한 종양 세포 사멸의 유도를 증진시키는 것으로 나타났고, Hsp90 억제제와 세포독성 물질과의 결합에 의해 세포 사멸능 (예를 들어, 유방암, 만성 골수성 백혈병 및 비소세포폐암)이 증가됨이 또한 설명되었다 (Neckers, 2002; Beliakoff and Whitesell, 2004). 항-신생혈관생성 활성에 대한 가능성 또한 관심의 대상이다: Hsp90 클라이언트 단백질 HIF-1α는 고형 종양의 진행에 중요한 역할을 한다 (Hur et al., 2002; Workman and Kaye, 2002; Kaur et al., 2004).

Hsp90 억제제는 또한 면역억제제로서 작용하고 Hsp90 억제 후의 다양한 종류의 종양 세포의 보체-매개성 용해와 관련되어 있다 (Sreedhar et al., 2004). Hsp90 억제제를 사용한 치료는 또한 면역 세포-매개성 용해 (Sreedhar et al., 2004)와 결합하여 슈퍼옥사이드 생산물 (Sreedhar et al., 2004a)을 생산할 수 있다. 잠재적 항말라리아 약물로서의 Hsp90 억제제가 또한 논의되었다 (Kumar et al., 2003). 또한, 젤다나마이신이 병용적으로 글리코실화된 포유류 프리온 단백 질 PrP^c의 형성을 방해하는 것으로 나타났다 (Winklhofer et al., 2003).

상기에서 기술한 바와 같이, 안사마이신이 잠재적 항암 및 항-B-세포 악성종양 화합물로서 관심을 받고 있으나, 최근 이용 가능한 안사마이신이 양호하지 않은 약학적 또는 약제학적 성질, 예를 들면 양호하지 않은 용해도, 양호하지 않은 대사 안정성, 양호하지 않은 생체이용성 또는 양호하지 않은 제형능을 보인다 (Goetz et al., 2003; Workman 2003; Chiosis 2004). 헤르비마이신 A 및 젤다나마이신 모두는 이들의 강한 간독성으로 인해 임상 실험에 대해 안좋은 후보 물질로 확인되었고 (review Workman, 2003), 젤다나마이신은 간독성으로 인해 임상 1 상에서 탈락되었다 (Supko et al., 1995, WO 03/106653).

젤다나마이신은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus)의 배양 여과물로부터 분리되었고 시험관 내에서 원생생물에 대해 강한 활성을 갖고, 세균과 곰팡이에 대해 약한 활성을 갖는 것으로 나타났다. 1994년 젤다나마이신과 Hsp90과의 관계가 밝혀졌다 (Whitesell et al., 1994). 젤다나마이신에 대한 생합성 유전자 클러스터가 클론화되고 서열분석되었다 (Allen and Ritchie, 1994; Rascher et al., 2003; WO 03/106653). DNA 서열은 NCBI 허가번호 AY179507에서 이용 가능하다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스 (duamyceticus) JCM4427로부터 유래된 유전공학적으로 제작된 젤다나마이신 생산 균주의 분리 및 4,5-디하이드로-7-O-데스카르바모일-7-하이드록시젤다나마이신 및 4,5-디하이드로-7-O-데스카르바모일-7-하이드록시-17-O-데메틸젤다 나마이신의 분리가 최근에 기술되었다 (Hong et al., 2004). 헤르비마이신 생산종 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus) AM-3672에 젤다나마이신을 처리함으로써 화합물 15-하이드록시젤다나마이신, 3중고리 젤다나마이신 유사체 KOSN-1633 및 메틸-젤다나마이신이 분리되었다 (Hu et al., 2004). 두 화합물 17-포밀-17-데메톡시-18-O-21-O-디하이드로겔나마이신 및 17-하이드록시메틸-17-데메톡시젤다나마이신이 S. 하이그로스코피쿠스 K279-78로부터 분리되었다. S. 하이그로스코피쿠스 K279-78은 헤르비마이신 생산 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM-3672 기원의 다양한 유전자를 포함하는 44 kbp 크기의 삽입체를 갖는 코스미드 pKOS279-78을 포함하고 있는 S. 하이그로스코피쿠스 NRRL 3602이다 (Hu et al., 2004). 젤다나마이신 생합성 클러스터의 폴리케티드 합성효소의 네 가지 모듈 내에서 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인을 치환시켰다 (Patel et al., 2004). AT 치환은 완전하게 가공된 유사체 14-데스메틸-젤다나마이신, 8-데스메틸-젤다나마이신 및 6-데스메틸-젤다나마이신과 완전하게 가공되지 않은 4,5-디하이드로-6-데스메톡시-젤다나마이신을 이끌어내는 모듈 1, 4 및 5 내에서 수행되었다. 모듈 7 AT의 치환은 세 종류의 2-데스메틸 화합물, KOSN1619, KOSN1558 및 KOSN1559를 생산해내는데, 이 중 KOSN1559는 젤다나마이신보다 4배 이상, 17-AGG보다 8배 이상의 결합력으로 Hsp90과 결합하는 2-데메틸-4,5-디하이드로-17-데메톡시-21-데옥시 젤다나마이신 유도체이다. 그러나 이는 SKBr3을 사용한 IC₅₀ 측정 결과를 반영하지 않은 것이다. 또 다른 유사체인 신규한 비벤조퀴노이드 젤다 나마이신 KOS-1806은 단일페놀기 (monophenolic) 구조를 가진다 (Rascher et al., 2005). KOS-1806에 대한 활성 데이터는 주어지지 않았다.

1979년에 안사마이신 항생제 헤르비마이신 A가 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주 No. AM-3672의 발효 배지로부터 분리되었고, 이의 잠재적 제초 활성에 따라 명명되었다. 항암활성은 세포의 변형된 형태를 되돌리는 약물을 스크리닝하기 위해 라우스 육종 바이러스 (Rous sarcoma virus, RSV)의 온도감수성 변이체에 감염된 랫 신장 세포를 사용하여 평가되었다 (for review see Uehara, 2003). 헤르비마이신 A는 Hsp90 샤페론 단백질에 결합하여 일차적으로 작용하는 것으로 주장되었지만, 보존된 시스테인 잔기에 직접 결합하고, 이어 키나제를 비활성화시킨다는 것도 논의되었다 (Uehara, 2003).

화학적 유도체가 분리되었고 벤조퀴논 핵의 C19의 치환체가 변형된 화합물 및 고리 사슬 내에서 할로겐화된 화합물이 헤르비마이신 A보다 독성이 더 적고 항암활성이 더 높은 것으로 나타났다 (Omura et al., 1984; Shibata et al., 1986b). 헤르비마이신 생합성 유전자 클러스터의 서열은 WO 03/106653 및 최근 논문에서 확인되었다 (Rascher et al., 2005).

항진균 및 항원충 활성에 의해 확인된 안사마이신 화합물 막베신 (1) 및 18,21-디하이드로막베신 (2) (C-14919E-1 및 C-14919E-1)은 노카르디아 (Nocardia) 종 No. C-14919 (Actinosynnema pretiosum subsp pretiosum ATCC 31280)의 배양물 상층액으로부터 분리되었다 (Tanida et al., 1980; Muroi et al., 1980; Muroi et al., 1981; US 4,315,989 및 US 4,187,292). 18,21-디하이드로막베신은 방향족 핵 의 디하이드로퀴논 형태를 포함하는 특성을 가진다. 막베신 및 18,21-디하이드로막베신 모두 쥣과 백혈병 P388 세포주와 같은 암세포주에 대해 유사한 항균 및 항암 활성을 가지는 것으로 나타났다 (Ono et al., 1982). 역전사 효소 활성 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 활성은 막베신에 의해 억제되지 않았다 (Ono et al., 1982). 막베신의 Hsp90 억제기능은 문헌으로 보고된바 있다 (Bohen, 1998; Liu et al., 1999). 막베신 및 18,21-디하이드로막베신이 미생물 배양액에 첨가된 후, 화합물의 특정 위치 또는 위치들에서 메톡시기가 하이드록시기로 변환되는 것은 US 4,421,687 및 US 4,512,975 특허에 기술되어 있다.

매우 다양한 토양 미생물을 선별하는 가운데, 스트렙토마이세스 속에 속하는 생산균주로부터 화합물 TAN-420A 내지 E가 확인되었다 (7-11, EP 0 110 710).

2000년에 스트렙토마이세스 종 S6699의 세포 배양액으로부터 젤다나마이신과 관련이 있는 비-벤조퀴논 안사마이신 대사체인 레블라스틴의 분리 및 이의 류마티스 관절염 치료에 있어서 이의 잠재적 치료 가치가 기술되었다 (Stead et al., 2000).

화학적으로 연관이 없는 벤조퀴논 안사마이신과 구별되는 또 다른 Hsp90 억제제인 라디시콜 (모노르덴)은 곰팡이 모노스포리움 보노르덴 (Monosporium bonorden)으로부터 항진균 활성이 처음 발견되었고 (for review see Uehara, 2003), 그 구조는 넥트리아 라디시콜라로부터 분리된 14개 탄소의 마크롤리드와 동일한 것으로 밝혀졌다. 이의 항진균, 항균, 항원충 및 세포독성 활성에 부가적으로 연이어 Hsp90 샤페론 단백질의 억제제로서 확인되었다 (for review see Uehara, 2003; Schulte et al., 1999). 라디시콜의 항-신생혈관생성 활성 (Hur et al., 2002) 및 이의 반-합성 유도체 (Kurebayashi et al., 2001)가 또한 기술된 바 있다.

최근의 관심은 안사마이신 항암 화합물의 새로운 세대로서 젤다나마이신의 17-아미노 유도체, 예를 들면 17-(알릴아미노)-17-데스메톡시 젤다나마이신 (17-AGG, 12) (Hostein et al., 2001; Neckers, 2002; Nimmanapalli et al., 2003; Vasilevskaya et al., 2003; Smith-Jones et al., 2004) 및 17-데스메톡시-17-N,N-디메틸아미노에틸아미노-젤다나마이신 (17-DMAG, 13) (Egorin et al., 2002; Jez et al., 2003)에 집중되어 있다 (Bagatell and Whitesell, 2004). 더욱 최근에 젤다나마이신이 17-위치에서 유도되어 17-젤다나마이신 아미드, 카바메이트, 우레아 및 17-아릴젤다나마이신 유사체가 생성되었다 (Le Brazidec et al., 2003). 60개 이상의 17-알킬아미노-17-데메톡시젤다나마이신 유사체의 라이브러리가 보고되었고 Hsp90에 대한 친화도 및 용해도가 시험되었다 (Tian et al., 2004). 젤다나마이신 의 독성을 감소시키기 위한 다른 연구는 종양-표적성 단일클론 항체와 결합시킴으로써 활성 젤다나마이신 화합물을 악성 종양 세포로 선택적 표적화 및 전달하는 것이다 (Mandler et al., 2000).

이러한 유도체가 감소된 간독성을 나타내지만 제한된 용해도를 가진다. 예를 들면 17-AGG는 용해제 (예를 들어, Cremophore, DMSO-egg lecithin)의 사용을 필요로 하고, 그 자체로 일부 환자에게 부작용을 일으킬 수 있다 (Hu et al., 2004).

Hsp90 억제제 안사마이신 계 대부분은 일반적인 구조적 모이어티를 갖는다: 단백질, 글루타티온 등과 같은 핵친화성 공유결합을 빠르게 형성할 수 있는 미켈 (Michael) 수용체인 벤조퀴논. 벤조퀴논 모이어티는 또한 비특이적 독성을 야기하는 산소 라디칼이 형성되는 동안 디하이드로퀴논과 산화환원 평형상태가 되도록 한다 (Dikalov et al., 2002).

그러므로, 암 및/또는 B-세포 악성종양 치료에 이용할 수 있고, 바람직하게는 향상된 용해도, 투여시 개선된 약학적 성질 및 부작용이 감소된 안사마이신 같은, 벤조퀴논 모이어티가 결여된 신규한 안사마이신 유도체를 규명할 필요가 남아 있다. 본 발명은 생체내 변화 및 모생산균주의 유전적 조작에 의해 생성되는 신규한 안사마이신 유사체에 관한 것이다. 특히 본 발명은 현재 이용 가능한 안사마이신과 비교하여 일반적으로 개선된 약제학적 성질을 가지는 신규한 18,21-디데속시-안사마이신 유사체 및 이외의 안사마이신 유사체에 관한 것인데, 이들은 특히 여러가지의 특수한 암에 대항하는 활성, 독성, 용해도, 대사 안정성, 생체 이용성 및 제형 가능성 중 하나 또는 그 이상의 성질에 있어서의 개선을 나타낸다. 바람직하게 안사마이신 유사체 (18,21-디데속시-안사마이신 유사체와 같은)는 개선된 생체 이용성을 나타낸다.

발명의 요약

본 발명에서, 인공적인 스타터 유닛의 도입에 의해 형성되는 신규한 안사마이신 유사체 (ansamycin analogue)를 생산하기 위하여, 인공적인 스타터 유닛을 젤다나마이신 (geldanamycin) 생산 균주에 공급하며, 이는 젤다나마이신의 post-PKS 변형을 초래하는 유전자들의 표적화된 비활성화 또는 결실과 함께, post-PKS 변형에 영향을 주는 적절한 post-PKS 유전자 도입과 함께 수행되었으며, 결국 예를 들어, 선택적으로 플루오르 또는 다른 치환기로 치환될 수 있는 18,21-디데스옥시-안사마이신 (18,21-didesoxy-ansamycin) 화합물이 되었다. 선택적으로, 스타터 유닛 (starter unit)(스타터 산 (stater acid)) 생합성을 초래하는 유전자 또는 조절자는 표적화된 비활성화 또는 결실에 의해 조작되거나, 또는 세포를 UV 방사선으로 조사하는 것 및 스타터 유닛 생합성이 방해받는 것으로 나타나는 표현형을 선택하는 것과 같은 다른 수단에 의해 변형될 수 있다. 이런 접근은 오토라이티마이신 (autolytimycin) 뿐만 아니라 헤르비마이신 (herbimycin) 및 레블라스타틴 (reblastatin)과 같은 다른 안사마이신에 적용될 수 있다. post-PKS 유전자의 임의의 표적화는 다양한 메커니즘에 의해 일어날 수 있다. 예를 들어, 통합 (integration), post-PKS 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 젤다나마이신 클러스터 영역의 표적화된 결실과 선택적으로 뒤따르는 유전자(들) 삽입에 의하거나, 또는 post-PKS 유전자 또는 이들이 코딩하는 효소를 비기능화시키는 다른 방법들, 예를 들어, 화학적인 억제, 위치특이적 돌연변이 (site-directed mutagenesis) 또는 예들 들어 UV 조사에 의한 세포의 돌연변이를 통해 일어날 수 있다. 또한, 젤다나마이신 클러스터, 또는 이에 제한 되지는 않지만, 막베신 (macbecin), 헤르비마이신, 레블라스타틴 또는 TAN 클러스터와 같은 다른 안사마이신 클러스터 유래의 post-PKS 유전자가 특이적 post-PKS 변형을 이루기위해 재도입될 수 있다. 결과적으로, 본 발명은 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체와 같은 안사마이신 유사체, 이러한 화합물의 제조 방법, 및 이러한 화합물을 의약적으로 이용하거나 추가의 화합물의 제조시 중간체로서 이용하는 방법을 제공한다.

그러므로, 첫 번째 양태로서, 본 발명은 통상적인 스타터 유닛이 결핍되고, 대신에 예를 들어, 선택적으로 플루오르 또는 다른 치환기로 치환될 수 있는 18,21-디데스옥시-안사마이신 화합물을 야기하는 스타터 유닛이 도입된 젤다나마이신 또는 다른 안사마이신의 유사체를 제공한다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 (I)]

상기 식에서,

R₁은 H, OH, OMe이고;

R₂는 H 또는 Me이며;

R₃은 H 또는 CONH₂이고;

R₄ 및 R₅는 둘다 H이거나 함께 하나의 결합을 형성하며 (즉, C4 와 C5는 이중 결합으로 연결됨);

R₆은 H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF₃, CH₃, SH, CH₂CH₃ 또는 NR_1OaR_11a이고;

R₇은 H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF₃, CH₃, SH, CH₂CH₃ 또는 NR_1ObR_11b이며;

R₈은 H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF₃, CH₃, SH, CH₂CH₃ 또는 NR_1OcR_11c이고;

R₉는 H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF₃, CH₃, SH, CH₂CH₃ 또는 NR_1OdR_11d이며;

R_10a, R_11a, R_10b, R_11b, R_10c, R_11c, R_10d 및 R_11d는 독립적으로 H, CH₃ 또는 CH₂CH₃이고;

단 여기서:

(i) 상기 R₆이 H이고, R₇이 OH이며, R₈이 OH인 경우, R₉는 H가 아니고;

(ii) 상기 R₇이 OH이고, R₈이 H이며, R₉가 H인 경우, R₆은 H, OH 또는 OMe가 아니며;

(iii) 상기 R₇이 OMe이고, R₈이 H이며, R₉가 H인 경우, R₆은 OMe가 아니다.

상기 (i) 조건의 화합물은 공지의 화합물인 18,21-디하이드로젤다나마이신 (18,21-dihydrogeldanamycin)이다. 상기 (ii) 및 (iii) 조건의 화합물은 국제 공개 특허 제WO2005/061461호에 개시되어 있다.

바람직하게는

(iv) 상기 R₆이 H, OH 또는 OMe이고, R₇이 H이고, R₈이 H인 경우, R₉는 OH, Cl 또는 NH₂가 아니며;

(v) 상기 R₆이 H, OH 또는 OMe이고, R₈은 H이고, R₉는 H인 경우, R₇은 NH₂가 아니다.

바람직하게는

(vi) 상기 R₆이 H 또는 OH인 경우, R₇, R₈ 및 R₉는 모두 H가 아니다.

상기 (vi) 조건의 화합물은 Kim et al ChemBioChem (2007) 8, 1491-1494에 개시되어 있다. 그러나, 이들은 또한 모두 본 발명자들이 출원한 선행 특허 출원에 개시되어 있다.

더욱 구체적인 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 (IA)에 따른 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 (IA)]

상기 식에서;

R₁은 H, OH, OMe이고;

R₂는 H 또는 Me이며;

R₃ 은 H 또는 CONH₂이고;

R₄ 및 R₅는 모두가 H이거나 하나의 결합이고 (즉, C4와 C5는 이중 결합임);

R₆은 H, OH, OMe 또는 F이고;

R₇은 H 또는 F이며;

R₈은 H 또는 F이다.

또한, 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체와 같은 안사마이신 유사체는 본원에서 "본 발명의 화합물"로 언급되며, 상기 용어들은 본원에서 혼용될 수 있다.

상기 구조는 대표적인 호변이성체 (tautomer)를 나타내며, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물의 모든 호변이성체, 예를 들어 에놀 (enol) 화합물이 예시된 경우의 케토 (keto) 화합물과 그 반대의 경우를 포함한다.

본 발명은 상기에서 나타낸 화학식 (I)로 정의된 화합물의 모든 입체이성질체를 포함한다.

추가의 양태로서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 화학식 (I)의 화합물과 같은 안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

정의

관사 "하나의 (a)" 및 "하나의 (an)"는 관사의 문법적 객체들 중 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들어, "하나의 유사체"는 한 개의 유사체 또는 한 개 이상의 유사체를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "유사체(들)"란, 서로 구조적으로 유사하지만 구성상에서 조금 차이가 있는 (한 원자가 또 다른 원자로 치환되거나 특정 기능기가 존재 또는 부재하는 경우) 화학적 화합물을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체"란, 화학식 (IA)에 따른 화합물을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "상동체(들)"란, 다른 막베신 생산 균주로부터 유래한 대체가능한 막베신 생합성 클러스터로부터 유래하거나, 예를 들어, 젤다나마이신 (geldanamycin), 헤르비마이신 (herbimycin), 오토라이티마이신 (autolytimycin) 또는 레블라스타틴 (reblastatin)으로부터의 대체가능한 안사마이신 생합성 유전자 클러스터로부터 유래한 상동체로부터 유래하는 본원에 개시된 유전자 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 상동체를 의미한다. 이러한 상동체(들)는 같은 기능을 수행하는 단백질을 코딩하거나, 막베신 또는 관련된 안사마이신 폴리케티드 (polyketide) 합성에서 이들 자체로 상기 유전자 또는 단백질과 같은 기능을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 상동체(들)는 본원에 개시된 특정 유전자 서열 (표 3, 서열번호 11은 클러스터 내의 모든 유전자 서열이며, 이로부터 특정 유전자의 서열이 추론될 수 있음)에 대해 적어도 40%의 서열 상동성, 바람직하게 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 가진다. 상동성 백분율 (percentage identity)은 NCBI 웹사이트 상에서 이용가능한 BLASTn 또는 BLASTp와 같은 당업자에게 알려진 어떠한 프로그램을 사용하여서도 계산할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "암"은 피부나 신체 기관, 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 뇌, 위 또는 장에서의 세포의 양성 또는 악성 신 성장을 의미한다. 암은 인접 조직으로 침윤되고 떨어져 있는 기관, 예를 들어, 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 퍼지는(전이) 경향이 있다. 본원에서 사용되는 용어 암은 이에 제한되지는 않지만 흑색종 (melanoma), 임파종 (lymphoma), 백혈병 (leukaemia), 섬유육종 (fibrosarcoma), 횡문근육종 (rhabdomyosarcoma) 및 비만세포종 (mastocytoma)과 같은 전이성 종양 세포 타입 및 이에 제한되지는 않지만 직장암 (colorectal cancer), 전립선암 (prostate cancer), 소세포폐암 (small cell lung cancer) 및 비-소세포폐암 (non-small cell lung cancer), 유방암 (breast cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 방광암 (bladder cancer), 신장암 (renal cancer), 위암 (gastric cancer), 교모세포암 (gliobastoma), 원발성 간암 (primary liver cancer) 및 난소암 (ovarian cancer)과 같은 조직암 타입을 모두 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "B-세포 악성 종양"은 만성 림프성 백혈병 (chronic lymphocytic leukaemia, CLL), 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 비-호지킨 임파종 (non-Hodgkin's lymphoma, NHL)을 포함하는 질환 군을 포함한다. 이들은 혈액 및 혈액 형성 기관의 종양성 질환이다. 이들은 골수 및 면역계 기능 장애를 발생시키며, 환자를 감염 및 출혈에 매우 민감해지게 한다.

본원에서 사용되는 용어 "생체이용도 (bioavailability)"는 투여 후 약물 또는 다른 물질이 흡수되거나 생물학적 활성 위치에서 이용가능하게 되는 정도 또는 비율을 의미한다. 이러한 성질은 화합물의 용해도, 위에서의 흡수율, 단백질 결합 정도 및 대사 등을 포함하는 수많은 인자에 의존한다. 당업자에게 익숙한 다양한 생체이용도 테스트가 Egorin et al. (2002)에 기술되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "수용해도(water solubility)"는 수성 매질, 예를 들어 pH 7.3의 인산 완충 식염수 (PBS)에서의 용해도를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "안사마이신 생산 균주"는 예를 들어, 젤다나마이신 생산 균주, 헤르비마이신 생산 균주, 레블라스타틴 생산 균주 및 오토라이티마이신 생산 균주 같은 스트렙토마이세트 (streptomycete)에 의해 예시되는 야생형 균주를 의미한다. 따라서 이들의 예로는 예를 들어, 천연 스타터 공급물 3-아미노-5-하이드록시벤조산을 공급하였을 때와 같이 적절한 조건에서 배양시, 젤다나마이신 또는 헤르비마이신 (예를 들어, 헤르비마이신 A, B 또는 C)와 같은 안사마이신을 생산하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602 (Streptomyces hygroscopicus subsp. geldanus NRRL3602) 또는 스트렙토마이세스 종 DSM4137 (Streptomyces sp. DSM4137) 또는 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르 DSM40699 (Streptomyces violaceusniger DSM40699), 및 레블라스타틴 또는 오토라이티마이신 같은 안사마이신을 생산하는 스트렙토마이세스 종 S6699 또는 스트렙토마이세스 오토라이티쿠스 JX-47 (Streptomyces autolyticus JX-47)을 포함한다.

그러므로, 본원에서 사용되는 용어 "젤다나마이신 생산 균주"는 예를 들어, 천연 스타터 공급물 3-아미노-5-하이드록시벤조산을 공급하였을 때와 같이 적절한 조건에서 배양시, 젤다나마이신을 생산하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602 또는 스트렙토마이세스 종 DSM4137 또는 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르 DSM40699와 같은 스트렙토마이세트에 의해 예시되는 야생형 균주를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "헤르비마이신 생산 균주"는 예를 들어, 천연 스타터 공급물 3-아미노-5-하이드록시벤조산을 공급하였을 때와 같이 적절한 조건에서 배양시, 예를 들어 헤르비마이신 A, B 또는 C 같은 헤르비마이신을 생산하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM-3672 (Streptomyces hygroscopicus AM-3672)에 의해 예시되는 야생형 균주를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "post-PKS 유전자(들)"은 폴리케티드의 post-폴리케티드 합성 효소 예를 들어 이에 한정되지는 않지만, 모노옥시게나제 (monooxygenase), O-메틸트랜스퍼라제 (O-methyltransferase) 및 카르바모일트랜스퍼라제 (carbamoyltransferase)와 같은 합성효소의 변형에 필요한 유전자를 의미한다. 구체적으로, 막베신 시스템에서 이러한 변형 유전자들로는 mbcM, mbcN, mbcP, mbcMT1, mbcMT2 및 mbcP450을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "스타터 유닛 생합성 유전자(들)"은 자연적으로 도입된 스타터 유닛, 3-아미노-5-하이드록시벤조산 (AHBA)의 생산을 위해 요구되는 유전자를 의미한다. 구체적으로, 막베신 시스템의 이러한 스타터 유닛 생합성 유전자로는 AHk (AHBA 키나제), Adh (aDHQ 디하이드로게나제), AHs (AHBA 합성효소), OX (옥시도리덕타제), PH (포스파타제)가 포함된다. 구체적으로, 젤다나마이신 시스템에서 gdmO 유전자는 AHBA 합성에 요구되는 아미노 디하이드로퀴네이트 (amino dehydroquinate) 합성효소를 인코딩하는 것으로 제안되고 있고 (Rascher et al., 2003), 헤르비마이신 시스템에서 hbmO가 동정되었다 (Rascher et al., 2005). AHBA를 생산하는 다른 균주는 또한 AHBA 생합성 유전자를 함유한다.

상기 화학식 (I)의 화합물과 같은 본 발명 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 4차 암모늄 산부가 염 뿐만 아니라 약제학적으로 허용가능한 무기산 또는 유기산 또는 염기로부터 형성되는 통상적인 염도 포함한다. 적절한 산염의 보다 구체적인 예로는 염산(hydrochloric acid)염, 브롬화수소산(hydrobromic acid)염, 황산(sulfuric acid)염, 인산(phosphoric acid)염, 질산(nitric acid)염, 과염소산(perchloric acid)염, 푸마르산(fumaric acid)염, 아세트산(acetic acid)염, 프로피온산(propionic acid)염, 숙신산(succinic acid)염, 글리콜산(glycolic acid)염, 포름산(formic acid)염, 젖산(lactic acid)염, 말레산(maleic acid)염, 타르타르산(tartaric acid)염, 시트르산(citric acid)염, 팔모익산(palmoic acid)염, 말론산(malonic acid)염, 하이드록시말레산(hydroxymaleic acid)염, 페닐아세트산(phenylacetic acid)염, 글루탐산(glutamic acid)염, 벤조산(benzoic acid)염, 살리실산(salicylic acid)염, 푸마르산(fumaric acid)염, 톨루엔술폰산(toluenesulfonic acid)염, 메탄술폰산(methanesulfonic acid)염, 나프탈렌-2-술폰산(naphthalene-2-sulfonic acid)염, 벤젠술폰산(benzenesulfonic acid)염, 하이드록시나프토익산(hydroxynaphthoic acid)염, 요오드화수소산(hydroiodic acid)염, 말산(malic acid)염, 스테로익산(steroic acid)염, 타닌산(tannic acid)염 및 그 등가물을 포함한다. 옥살산(oxalic acid)과 같은 다른 산들은 그 자체로는 약제학적으로 허용가능하지 않지만, 본 발명의 화합물과 그들의 약제학적으로 허용가능한 염을 얻을 때 중간체로서 유용한 염의 생산에서 유용할 수 있다. 적절한 염기염의 보다 구체적인 예로는 나트륨염, 리튬염, 칼륨염, 마그네슘염, 알루미늄염, 칼슘염, 아연염, N,N'-디벤질에틸렌디아민(N,N'-dibenzylethylenediamine)염, 클로로프로카인(chloroprocaine)염, 콜린(choline)염, 디에탄올아민(diethanolamine)염, 에틸렌디아민(ethylenediamine)염, N-메틸글루카민(N-methylglucamine)염 및 프로카인(procaine)염을 포함한다. 본 발명에 따른 화합물에 대한 하기의 언급에는 화학식(I)의 화합물과 이의 약제학적으로 허용가능한 염 모두를 포함한다.

상세한 설명

본 발명은 상기에서 설명한 바와 같이, 안사마이신 유사체, 이러한 화합물의 제조 방법, 이러한 화합물의 의약적으로 이용하는 방법 및 추가의 반합성 유도체화 (semi-synthetic derivatisation)를 위한 중간체 또는 주형 (template)으로서 이러한 화합물의 용도를 제공한다.

바람직하게는 R₁은 H 또는 OH이다. 하나의 실시태양에서 R₁은 H이다. 또 다른 실시태양에서 R₁은 OH이다.

바람직하게는 R₂는 H이다.

바람직하게는 R₃은 CONH₂이다.

하나의 실시태양에서 바람직하게는 R₄ 및 R₅는 함께 하나의 결합을 형성한다.

또 다른 실시태양에서, 바람직하게는 R₄ 및 R₅는 각각 H이다.

하나의 실시태양에서, 바람직하게는 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이다.

하나의 실시태양에서, 바람직하게는 R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이다.

하나의 실시태양에서, 바람직하게는 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 OH이다.

바람직하게는 R₆은 H, F, Me, Br, Cl, OH, OMe, NH₂이고, 더욱 바람직하게는 H, F, Me, Br, Cl, OH 또는 OMe이고, 더더욱 바람직하게는 H 또는 F이다.

양자택일적으로 바람직하게는 R₆은 CF₃ 또는 CH₂CH₃이다.

바람직하게는 R₇은 H, F, OH, OMe, Br, Cl 또는 NH₂이고, 더욱 바람직하게는 H, F, OH, OMe, Br 또는 Cl이며, 더더욱 바람직하게는 H, F, OH 또는 OMe이고, 특별히 OH (또는 양자택일적으로 H 또는 F)이다.

바람직하게는 R₈은 H, F, Me, Cl, Br, OH 또는 NH₂이고, 더욱 바람직하게는 H, F, Me, Cl, Br 또는 OH이며, 더더욱 바람직하게는 H 또는 F이다.

바람직하게는 R₉는 H, F, Me, Cl, Br, OH 또는 NH₂이고, 더욱 바람직하게는 H, F, Me, Cl, Br 또는 OH이며, 더더욱 바람직하게는 H 또는 F이고, 특별히 H이다.

바람직하게는 R_10a, R_11a, R_10b, R_11b, R_10c, R_11c, R_10d 및 R_11d는 H이다.

바람직하게는 R₇이 OH인 경우, R₆, R₈ 또는 R₉ 중 하나 또는 그 이상은 F, Br, Me 또는 NH₂이고, 나머지는 H이다.

바람직하게는 만약 R₆이 Me이면, R₇은 OH, H 또는 F이고, R₈ 및 R₉는 H이다.

바람직하게는 만약 R₆이 CF₃이면, R₇은 OH, H 또는 F이고, R₈ 및 R₉는 H이다.

바람직하게는 만약 R₆이 CH₂CH₃이면, R₇은 OH, H 또는 F이고, R₈ 및 R₉는 H이다.

본 발명의 바람직한 하나의 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄, R₅, R₆, R₇ 및 R₈은 각각 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 OH이고, R₇ 및 R₈은 각각 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 F이고, R₇ 및 R₈은 각각 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 F이고, R₇ 및 R₈은 각각 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 H이고, R₇은 F이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기의 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 OH이고, R₇은 F이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 H이고, R₇은 F이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆ 및 R₇은 각각 F이고, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆ 및 R₇은 각각 F이고, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆, R₇ 및 R₈은 각각 F이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, R₆, R₇ 및 R₈은 모두 H가 아니고, 특히 R₆, R₇ 및 R₈의 적어도 하나는 F이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 F이고, R₇은 OH이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 Me이고, R₇은 OH이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 CF₃이고, R₇은 OH이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 CH₂CH₃이고, R₇은 OH이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 F이고, R₇은 OH이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 Me이고, R₇은 OH이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 CF₃이고, R₇은 OH이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 CH₂CH₃이고, R₇은 OH이며, R₈은 H이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 OMe이고, R₇은 H이며, R₈은 OH이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 OH이고, R₇은 H이며, R₈은 OH이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 H이고, R₇은 H이며, R₈은 OH이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 H이고, R₇은 F이며, R₈은 OH이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 H이고, R₇은 Cl이며, R₈은 OH이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 H이고, R₇은 OH이며, R₈은 F이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 H이고, R₇은 OH이며, R₈은 Cl이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 하기 구조로 나타낸 바와 같이, R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 OMe이고, R₇은 F이며, R₈은 OH이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, R₆, R₇ 및 R₈은 모두 H이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, R₇ 및 R₈은 OH가 아니고, R₉는 H이며, R₆, R₇ 및 R₈의 하나 또는 그 이상은 F이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, R₁이 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 H이며, R₆은 H이고, R₇은 H인 경우, R₈은 H가 아니다.

더 바람직한 실시태양은 실시예에 기술되어 있고, 도 3 및 도 4에 예시되어 있다.

안사고리 (ansa ring)에 대한 비-수소 곁사슬의 바람직한 입체화학 (stereochemistry)은 하기 도 1 및 도 2 (즉, 바람직한 입체화학은 젤다나마이신의 입체화학을 따름)에 나타낸 바와 같다.

본 발명은 또한 생체내 변환 또는 합성 화학에 의한 추가의 변형을 위한 기질로서 안사마이신 유사체의 용도를 제공한다. 하나의 양태로서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 안사마이신 유사체를 제공한다. 구체적인 실시태양으로서, 본 발명은 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균 감염, 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역 질환의 치료 용도 및/또는 암의 예방적 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환 (pretreatment) 용도로서 사용하기 위한 안사마이신 유사체를 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 의약 제조를 위한 안사마이신 유사체의 용도를 제공한다. 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균 감염, 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역 질환의 치료 및/또는 암의 예방적 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환용 의약 제조를 위한 안사마이신 유사체의 용도를 제공한다.

추가의 실시태양으로, 본 발명은 안사마이신 유사체를 치료학적으로 유효한 양으로 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균 감염, 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역 질환의 치료 또는 암의 예방적 전치료 방법을 제공한다.

상기에서 기재한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 암 및 B-세포 악성종양 치료에 유용할 것으로 기대된다. 본 발명의 화합물 및 특히 Hsp90에 대해 개선된 선택성 및/또는 개선된 독성학적 성질 및/또는 개선된 양물동력학 (pharmacokinetics)을 가질 수 있는 본 발명의 화합물은 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만 말라리아, 진균 감염, 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 류마티스성 관절염 같은 자가면역질환의 다른 징후들의 치료나 암의 예방적 전치료에 또한 효과적일 수 있다.

중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 프리온병 (prion disease), 척수인경 근위축증 (spinal and bulbar muscular atrophy, SBMA), 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

혈관신생 의존성 질병은 노인성 황반변성 (Age-related macular degeneration), 당뇨병성 망막증 (diabetic retinopathy) 및 다양한 다른 안과질환, 동맥경화증 (atherosclerosis) 및 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

자가면역질환은 류마티스성 관절염, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 제1형 당뇨병 (type I diabetes), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus) 및 건선 (psoriasis) 을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

“환자”는 인간 및 다른 동물 (특히 포유류) 대상을 포함하며, 바람직하게는 인간 대상이다. 따라서, 본 발명의 안사마이신 유사체의 상기 방법 및 용도는 인간 의학 및 수의학 분야에 이용되며, 바람직하게는 인간 의학분야에서 이용된다.

상기에서 언급된 본 발명의 화합물 또는 이의 제형은 이에 제한되지는 않지만 예를 들어, 비경구 투여 (정맥내 투여 포함), 경구 투여, 국부 투여 (구강, 설하, 경피를 포함), 의료용 장치 (예를 들어, 스텐트), 흡입에 의해, 또는 주사 (피하 또는 근육내)를 통한 소정의 통상적인 방법에 의해 투여될 수 있다. 치료는 단일 투약 또는 일정 시간에 걸친 복수회의 투약으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 화합물은 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 하나 또는 그 이상의 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께 약제학적 제형으로서 제공되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 화합물과 함께 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 희석제(들) 또는 담체(들)는 본 발명의 화합물과 양립할 수 있다는 의미에서, "허용가능"해야만 하고 이의 복용자에게 해롭지 않아야 한다. 적절한 담체의 예는 하기에 보다 상세하게 기술한다.

본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 치료제와 병용적으로 투여될 수 있다. 두 가지 (또는 그 이상) 제제의 병용투여는 각각을 사용할 때보다 훨씬 작은 양을 투여할 수 있어 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물 및 추가의 치료제를 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 암 또는 B-세포 악성 종양 치료를 위한 제2의 제제와 함께 병용 치료를 하기 위한 본 발명 화합물의 용도를 제공한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 예를 들어, 암 또는 B-세포 악성 종양 치료를 위해 다른 치료제와 함께 병용 투여된다. 바람직한 제제로는 이에 제한되지는 않지만, 블레오마이신 (bleomycin), 카페시타빈 (capecitabine), 시스플라틴 (cisplatin), 사이타라빈 (cytarabine), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 독소루비신 (doxorubicin), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 젬시타빈 (gemcitabine), 류코보린 (leucovorin), 메토트렉사이트 (methotrexate), 미토잔톤 (mitoxantone), 파클리탁셀 (paclitaxel) 및 도세탁셀 (docetaxel)을 포함하는 탁산 (taxane), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine) 및 비노렐빈 (vinorelbine)과 같은 통상적인 화학치료제; 아나스트로졸 (anastrozole), 고세렐린 (goserelin), 메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate), 프레니손 (prenisone), 타목시펜 (tamoxifen) 및 토레미펜 (toremifene)과 같은 호르몬 치료제; 트라스투주맙 (trastuzumab)(항-Her2), 세툭시맙 (cetuximab)(항-EGFR) 및 베바시주맙 (bevacizumab)(항-VEGF)과 같은 단일클론 항체 치료제; 이마티닙 (imatinib), 다사티닙 (dasatinib), 게피티닙 (gefitinib), 엘로티닙 (erlotinib), 라파티닙 (lapatinib) 및 템시로리무스 (temsirolimus)같은 단백질 키나제 억제제; 보르테조밉 (bortezomib) 같은 프로테아좀 (proteasome) 억제제; 보리노스타트 (vorinostat)같은 히스톤 디아세틸라제 (histone deacetylase, HDAC) 억제제; 수니티닙 (sunitinib), 소파레닙 (sorafenib) 및 레나리도미드 (lenalidomide) 같은 혈관신생 억제제를 포함한다. 게다가, 본 발명의 화합물은 이에 한정되지는 않지만, 방사선 치료 또는 외과 수술을 포함하는 다른 치료와 병행하여 투여될 수 있다.

제형은 편리하게는 단위 투약 형태로 제공될 수 있고, 제약 업계에 잘 알려져 있는 어떠한 방법을 이용하여서도 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 성분 (본 발명의 화합물)을 하나 또는 그 이상의 부속 성분으로 구성되는 담체와 조합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 상기 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세하게 분쇄된 고체 담체 또는 둘 모두와 조합시키고, 다음으로 필요에 따라 제품을 성형하는 과정에 의해 균일하고 밀접하게 결합되도록 제조된다.

본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태의 활성 성분, 선택적으로 무독성 유기 또는 무기 산 또는 염기 부가 염의 형태를 포함하는 약제학적 제형의 형태로 경구 또는 임의의 비경구 경로에 의해 투여되는 것이 보통이다. 투여 경로 뿐만 아니라, 치료될 질병 및 환자에 따라 상기 조성물은 다양한 투여량으로 투여할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 화합물은 즉시-, 지연- 또는 조절-방출 적용을 위해 정제, 캡슐, 좌제 (ovules), 엘릭서 (elixir), 용액 또는 현탁액의 형태로 경구, 구강 또는 설하 투여할 수 있으며, 이들은 향료 또는 색소를 포함할 수 있다.

이러한 정제는 미세결정 셀룰로오스 (microcrystalline cellulose), 락토오스 (lactose), 시트르산 나트륨 (sodium citrate), 탄산 칼슘 (calcium carbonate), 제2인산 칼슘 (dibasic calcium phosphate) 및 글리신 (glycin)과 같은 부형제, 전분 (바람직하게 옥수수, 감자 또는 타피오카 (tapioca) 전분), 전분 글리콜산 나트륨 (sodium starch glycollate), 크로스카멜로스 나트륨 (croscarmellose sodium) 및 특정 병용 규산염과 같은 붕해제, 및 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 하이드록시프로필메틸셀룰로스 (hydroxypropylmethylcellulose, HPMC), 하이드록시-프로필셀룰로스 (hydroxy-propylcellulose, HPC), 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 바인더를 포함할 수 있다. 게다가, 스테아르산 마그네슘 (magnesium stearate), 스테아르산 (stearic acid), 글리세릴 베헤네이트 (glyceryl behenate) 및 탈크와 같은 윤활제를 포함할 수 있다.

유사한 형태의 고형 조성물은 또한 젤라틴 캡슐의 충진제로 사용될 수 있다. 이러한 측면에서 바람직한 부형제로는 락토오스, 전분, 셀룰로오스, 유당 또는 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭서의 경우, 본 발명의 화합물은 다양한 감미료 또는 향료, 칼라재 또는 색소와 함께, 유화제 및/또는 현탁제와 함께, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 (propylene glycol) 및 글리세린과 같은 희석제와 함께, 그리고 이들의 조합물과 함께 혼합할 수 있다.

정제는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 부속 성분과 함께, 압착 또는 몰딩 에 의해 만들 수 있다. 압착된 정제는, 선택적으로 바인더 (예를 들어, 포비돈 (povidone), 젤라틴, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 (hydroxypropylmethyl cellulose)), 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 붕해제 (예를 들어, 전분 글리콜산 나트륨, 교차-결합된 포비돈, 교차-결합된 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨), 계면활성제 또는 분산제와 함께 혼합된, 분말 또는 과립과 같은 자유 유동성 형태로, 활성성분을 적절한 기계 안에서 압착시켜 제조할 수 있다. 몰딩된 정제는 비활성 액체 희석제로 적신 분말 화합물의 혼합물을 적절한 기계 안에서 몰딩하여 만들 수 있다. 상기 정제는 선택적으로 코팅되거나 자국을 낼 수 있고, 예를 들어, 바람직한 방출 프로파일을 제공하도록 다양한 비율의 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스를 이용하여, 활성 성분이 느리게 또는 조절되어 방출되도록 제형화할 수 있다.

경구 투여에 적절한 본 발명에 따른 제형은 각각 미리 결정된 함량의 활성 성분을 포함하는, 캡슐, 교갑 (cachet) 또는 정제와 같은 분리된 단위로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비-수성 액체 상태의 액제 또는 현탁제로서; 또는 수중유 (oil-in-water) 액체형 에멀젼 또는 유중수 (water-in-oil) 액체형 에멀젼으로서 제공할 수 있다. 상기 활성 성분은 또한 환약 (bolus), 연약 (electuary), 또는 페이스트로서 제공할 수 있다.

입 안의 국소 투여에 적절한 제형으로는 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스 (tragacanth)의 향기나는 기재 (basis)에 활성 성분을 포함하는 로젠지(lozenge); 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 비활성 기재에 활성 성분을 포함하는 향정 (pastille); 및 적절한 액체 담체내에 활성 성분을 포함하는 구강-세척액이 포함된다.

또한, 상기에서 구체적으로 언급된 성분들뿐만 아니라, 본 발명의 제형은 문제가 되는 제제의 형태를 고려하여 당해 분야에서 통상적인 기타 물질을 포함할 수 있다는 것이 이해될 수 있는데, 예를 들어, 경구 투여를 위해 적절한 제제로는 향미료를 포함할 수 있다.

국부 투여에 적절한 약제학적 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 약물이 함침된 드레싱 (impregnated dressing), 스프레이, 에어졸 또는 오일, 경피 기구, 분진성 분말 (dusting powder) 등으로 제형화할 수 있다. 이러한 조성물은 활성제를 포함하는 통상적인 방법을 통해 생산될 수 있다. 따라서, 이들은 또한 보존제, 약물 침투를 돕는 용매, 크림 또는 연고를 위한 연화제 및 로션을 위한 에탄올 또는 올레일 알코올 (oleyl alcohol)과 같은 양립할 수 있는 전형적인 담체 및 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 조성물의 약 1% 내지 약 98%까지 존재할 수 있다. 보다 일반적으로 이들은 조성물의 약 80%까지를 형성할 것이다. 예시하여 설명하면, 크림 또는 연고는 바람직한 농도를 갖는 크림 또는 연고를 생산하기에 충분한 양으로, 화합물을 약 5-10중량%로 포함하여, 충분한 양의 친수성 재료와 물을 혼합함으로써 생산한다.

경피 투여를 위한 약제학적 조성물은 오랜 시간 동안 환자의 표피와 밀접하게 접촉되어 있도록 분리 패치로 제공할 수 있다. 예를 들어, 활성 성분은 전리 요법에 의해 패치로부터 전달할 수 있다.

외부 조직, 예를 들어, 입 및 피부에 적용하기 위해서, 조성물은 바람직하게는 국부 연고 또는 크림으로 적용한다. 연고로 제형화된 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 물과 섞일 수 있는 (water-miscible) 연고 베이스와 함께 사용할 수 있다.

양자택일적으로, 활성제는 수중유 크림 베이스 또는 유중수 베이스를 가진 크림으로 제형화할 수 있다.

비경구 투여를 위해, 유입 단위 투약 형태 (fluid unit dosage forms)는 활성 성분 및 살균된 부형약 (vehicle)을 이용하여 제조할 수 있는데, 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올 (polyol), 글리세린 및 식물성 오일 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 물을 이용할 수 있다. 상기 부형약 및 사용된 농도에 따라, 상기 활성 성분은 부형약에 현탁되거나 용해할 수 있다. 용액을 생산하는 데 있어서, 상기 활성 성분은 주입을 위해 물에 용해할 수 있고 여과 살균한 후 적절한 바이알 (vial) 또는 앰플에 충진하고 봉입할 수 있다.

유리하게, 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 제제는 부형약에 용해할 수 있다. 안정성을 증진시키기 위해, 조성물은 바이알에 충진한 후 냉동되고, 진공 상태에서 물을 제거할 수 있다. 냉동 건조된 분말은 바이알에 봉입하고, 사용하기 전에 액상으로 만들기 위한 주사용 물을 담은 동봉된 바이알을 공급할 수 있다.

비경구 현탁액은, 활성 성분이 용해되는 대신에 부형약에 현탁되고 여과를 통해 살균될 수 없는 것을 제외하고, 실질적으로 용액과 동일한 방법으로 생산한다. 상기 활성 성분은 살균된 부형약에 현탁시키기 전 산화 에틸렌에 노출시켜 살균할 수 있다. 유리하게, 계면활성제 또는 침윤제가 조성물에 포함되어 상기 활성 성분의 균일한 분포를 촉진한다.

본 발명의 화합물은 또한 당업계에 알려진 의료 장치를 이용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 미국특허 제5,399,163호; 미국특허 제5,383,851호; 미국특허 제5,312,335호; 미국특허 제5,064,413호; 미국특허 제4,941,880호; 미국특허 제4,790,824호; 또는 미국특허 제4,596,556호에서 개시한 장치와 같은 바늘 없는 피하주사 주입 장치로 투여할 수 있다. 본 발명에서 유용한 공지의 이식체 (implant) 및 모듈의 예로는, 조절된 속도로 약물을 투약하기 위한 이식 가능한 미세-주입 펌프를 개시한 미국특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료용 장치를 공지한 미국특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 공지한 미국특허 제 4,447,233호; 연속적인 약물 전달을 위한 다양한 유입 속도의 이식 가능한 주입 기구를 공지한 미국특허 제4,447,224호; 멀티-챔버 구획 (multi-chamber compartment)을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국특허 제4,439,196호; 및 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국특허 제4,475,196호가 포함된다. 많은 다른 이러한 이식체, 전달 시스템 및 모듈은 당업계에 알려져 있다.

본 발명 화합물의 투여량은 구체적 화합물, 관련 질환, 환자 및 질환의 성질 및 심각도, 환자의 신체적 조건, 선택된 투여 경로에 따라 변경될 것이다. 적절한 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정할 수 있다.

상기 조성물은 투여 방법에 따라 본 발명의 화합물을 0.1중량% 이상, 바람직하게는 5 내지 60중량%, 보다 바람직하게는 10 내지 30중량%로 포함할 수 있다.

본 발명 화합물의 개별적인 투약의 최적 함량 및 투약 간격은 치료 조건의 성질 및 정도, 투여 제형, 경로 및 부위, 그리고 치료되고 있는 특정 환자의 나이와 건강상태에 의해 결정될 것이며, 의사가 궁극적으로 사용될 적절한 투약을 결정할 것이라는 것은 당업자에게 인식될 것이다. 이러한 투약은 적절할 정도로 자주 반복할 수 있다. 부작용이 생긴다면, 보통의 임상 진료에 따라서 투여량 및/또는 빈도를 변경하거나 또는 감소시킬 수 있다.

추가의 양태로서, 본 발명은 안사마이신 유사체의 생산 방법을 제공한다.

예를 들어, 젤다나마이신 및 헤르비마이신 같은 안사마이신 폴리케티드는 당업계에 잘 알려진 폴리케티드 생합성 클러스터에 의해 합성된다. 젤다나마이신은 두 단계로 생합성 되는 것으로 고려될 수 있다. 첫 번째 단계에서, 코어-PKS 유전자가 단순한 카르복실산 (carboxylic acid) 전구체의 반복 어셈블리 (assembly)에 의해 마크롤리드 (macrolide) 코어를 조립하여, 폴리케티드 사슬을 제공하는데, 이는 도 1에서 보듯이, 첫 번째 효소-없는 중간체 (enzyme-free intermediate) 인 "프로젤다나마이신 (progeldanamycin)" 을 형성하기 위해 환형화된다. 두 번째 단계에서, 일련의 "post-PKS" 절단 효소들 (예를 들어, 사이토크롬 P450 모노옥시게나제 (cytochrome P450 monooxygenase), 메틸트랜스퍼라제 (methyltransferases), FAD-의존성 옥시게나제 (FAD-dependent oxygenases) 및 카르바모일트랜스퍼라제 (carbamoyltransferase))이 프로젤다나마이신 주형에 다양한 부가기들 (additional groups)을 부가하는 작용을 하여, 도 2와 같은 최종적인 모체 화합물 구조를 생성한다. 안사마이신 유사체는 유사한 방법으로 생합성될 수 있다. 이러한 생합성 생산은 신규한 화합물을 생산하도록 유전자 조작된 적절한 생산 균주와 함께 생체내 변환에 의해 개발되어질 수 있다.

놀랍게도, 본 발명자들은 안사마이신 생산 균주에 인공적인 스타터 유닛 (스타터 산 또는 에스테르 같은 이의 유사체)의 공급을 통해, 이러한 스타터 유닛이 안사마이신 구조로 도입될 수 있고, 이로써 신규한 안사마이신 유사체를 제조할 수 있는 것을 알아냈다.

따라서, 본 발명에 따라, 하기의 단계를 포함하는 안사마이신 유사체의 제조 방법을 제공한다:

(a) 적절한 조건에서 배양시, 젤다나마이신, 헤르비마이신 (헤르비마이신 A, B 또는 C)과 같은 안사마이신 또는 이의 유사체를 생산하는 균주를 제공하는 단계;

(b) AHBA가 아닌 스타터 유닛 (starter unit)을 상기 균주에 공급하여, 스타터 유닛을 상기 안사마이신 유사체로 도입시키는 단계;

(c) 상기 균주를 안사마이신 유사체의 제조를 위한 적합한 조건하에서 배양하는 단계; 및

(d) 선택적으로 제조된 화합물을 분리하는 단계.

바람직하게는 상기 (a) 단계의 균주는 하나 또는 그 이상의 AHBA 생합성 유전자가 결실되거나 비활성화된 균주인 것을 특징으로 하는 균주이다. 이는 AHBA의 수율 (yield)을 줄여서 인공적인 스타터 유닛의 도입을 위한 경쟁을 피할 수 있다. 양자택일적으로, 상기 (a) 단계의 균주는 AHBA 생합성 효율이 낮아지도록 돌연변이 된 균주이다. 바람직하게는 상기 (c) 단계의 조건은 AHBA 생합성 효율이 준최적 (sub-optimal)이 되도록 하는 조건이다. 따라서, 바람직하게는 상기 AHBA는 그럼에도 불구하고 공급된 인공적인 스타터 유닛의 도입을 허용하는 수준으로 상기 균주에 의해 생산된다. 일반적으로 상기 공급된 인공적인 스타터 유닛의 도입 양은 > 20% 이고, 바람직하게는 도입된 총 스타터 유닛의 >50% 이다.

바람직하게는 상기 스타터 유닛은 하기 화학식 (II), 또는 상기 산 모이어티 (moiety)가 에스테르 (예를 들어 메틸 또는 에틸 에스테르)와 같이 유도된, 이의 유사체로부터 선택된다:

[화학식 (II)]

상기 식에서, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 상기에서 정의한 바와 같다.

바람직하게는 상기 스타터 유닛은 3,5-디아미노벤조산, 3-아미노-4-하이드록시벤조산 또는 3-아미노-4-클로로벤조산이 아니다.

하나의 실시태양에서, 상기 스타터 유닛은 R₆, R₇, R₈ 및 R₉가 모두 H인 화학식 (II)의 화합물이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 스타터 유닛은 R₆, R₇, R₈ 및 R₉가 모두 H가 아닌 화학식 (II)의 화합물이다.

또 다른 예가 되는 스타터 유닛은 이에 제한되지는 않지만, 하기의 표 4 및 표 5의 두 번째 컬럼에 나타낸 화합물뿐만 아니라, 이의 적절한 유도체들 (예를 들어, 염 및 에스테르 등)을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 균주는 안사마이신 생산 균주 (예를 들어, 젤다나마이신 또는 헤르비마이신 생산 균주)이고, 상기 스타터 유닛은 상기 균주가 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체를 생산하도록 선택된다.

하나의 실시태양에서, 상기 스타터 유닛은 상기 균주가 플루오르로 선택적으로 치환된 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체를 생산하도록 선택된다.

하나의 실시태양에서, 상기 스타터 유닛은 상기 균주가 플루오르로 치환된 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체를 생산하도록 선택된다.

또 다른 실시태양에서, 상기 균주는 막베신 생산 균주이고, 상기 스타터 유닛은 상기 균주가 벤젠고리의 18번 또는 21번 위치가 치환되지 않은 막베신 유사체를 생산하도록 선택된다.

바람직하게는, 상기 방법은 (i) 상기 (d) 단계의 생성물에 화학적 변형과정이나 생체내 변환과정을 가하는 단계 및 상기 단계에서 생성된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계를 추가로 포함하거나 또는 (ii) 상기 (d) 단계 이전에 상기 (c) 단계의 생성물에 화학적 변형과정이나 생체내 변환과정을 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기의 단계를 포함하는 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체 같은 유사체의 제조 방법이 제공된다:

(a) 조건은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화 및/또는 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자가 결실되거나 비활성화된, 적절한 조건에서 배양시, 안사마이신 또는 이의 유사체를 생산하는 제1 숙주 균주를 제공하는 단계;

(b) 상기 균주에 인공적인 스타터 유닛을 공급하는 단계;

(c) 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체 같은 안사마이신 유사체의 제조를 위한 적절한 조건에서 상기 변형된 숙주 균주를 배양하는 단계; 및

(d) 생성된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.

바람직하게는 공급된 스타터 유닛은 스타터 산이다.

특별히, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체의 제조 방법을 제공한다:

(a) 적절한 조건에서 배양시 젤다나마이신, 헤르비마이신 (예를 들어, 헤르비마이신 A, B 또는 C)과 같은 안사마이신 또는 이의 유사체를 생산하는 제1 숙주 균주를 제공하는 단계;

(b) 상기 균주에 인공적인 스타터 산을 공급하는 단계;

(c) 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체의 제조를 위한 적절한 조건에서 상기 숙주 균주를 배양하는 단계; 및

(d) 생성된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.

바람직하게는, 상기 방법은 하기의 단계를 추가로 포함한다;

(e) 일반적으로 상기 (c) 단계 이전에 수행되며, 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛의 생합성 유전자 또는 그의 상동체인 유전자를 결실 또는 비활성화시키는 단계.

바람직하게는 상기 방법은 추가적으로, 또는 대신에, 하기의 단계를 포함한다:

(f) 일반적으로 상기 (c) 단계 이전에 수행되며, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자의 결실 또는 비활성화시키는 단계.

상기 (a) 단계의 "젤다나마이신, 헤르비마이신 (예를 들어, 헤르비마이신 A, B 또는 C)과 같은 안사마이신 또는 그의 유사체를 생산하는 숙주 균주"는 적절한 조건에서 배양시 젤다나마이신, 헤르비마이신 (예를 들어, 헤르비마이신 A, B 또는 C) 또는 상기 R₁-R₁₁의 정의에 의한 안사마이신 화합물과 같은 안사마이신을 생산하는 균주를 포함한다. 적절한 조건 (및 상기 (c) 단계의 적절한 조건)은 적절한 스타터 공급물 및 적절한 조성의 성장 배지 (이는 당업자에게 잘 알려져 있거나 공지의 방법에 의해 결정될 수 있음)의 제공을 포함한다.

예를 들어, 상기 (a) 단계의 제1 숙주 균주는 적절한 조건에서 배양시 젤다나마이신 또는 그의 유사체를 생산할 수 있다.

바람직하게는 인공적인 스타터 공급물은 치환된 벤조산 (천연 스타터 산인 3-아미노-5-하이드록시-벤조산이 아님)이고, 가장 바람직하게는 선택적으로 고리 주위가 추가적으로 치환된 3-아미노-벤조산이다. 바람직하게는 인공적인 스타터 공급물은 치환되지 않거나 하나, 둘 또는 3개의 플루오르 원자에 의해 치환된 3-아미노-벤조산이다.

바람직한 실시태양에서, 인공적인 스타터 산 공급물은 3-아미노벤조산이다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 인공적인 스타터 산 공급물은 5-아미노-2-플루오로벤조산이다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 인공적인 스타터 산 공급물은 5-아미노-3-플루오로벤조산이다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 인공적인 스타터 산 공급물은 5-아미노-2,3-디-플루오로벤조산이다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 인공적인 스타터 산 공급물은 5-아미노-2,3,6-트리-플루오로벤조산이다.

당업자는 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 치환된 벤조산의 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, N-아세틸-시스테아민 티오에스테르 (N-acetyl-cysteamine thioester), 및 예를 들어, N-아세틸-시스테아민 티오에스테르의 도입을 위해 적절히 활성화된 생합성 중간체의 디케티드 (diketide) 유사체와 같이, 숙주 균주에 공급하여 동일한 화합물(들)을 생산할 수 있는 대체가능한 인공적인 스타터 유닛이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 또한 산 화합물은 상응하는 염의 형태로 제공될 수 있다.

숙주 균주는 예를 들어, 젤다나마이신 생산 균주 또는 헤르비마이신 생산 균주 같은 안사마이신 생산 균주일 수 있다. 양자택일적으로, 숙주 균주는 젤다나마이신 생산 균주 (또는 헤르비마이신 생산 균주)와 같은 안사마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주이다. 추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 안사마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 안사마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 이 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 안사마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 상동체 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주이다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 숙주 균주는 젤다나마이신 생산 균주이다.

양자택일적인 실시태양에서, 숙주 균주는 젤다나마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자가 결실되거나 비활성화 되도록 조작된 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 젤다나마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 젤다나마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 이 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 젤다나마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 젤다나마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되고, post-PKS 유전자가 재도입되어 특이적 post-PKS 변형이 일어나도록 조작된 균주이다. 젤다나마이신 클러스터 또는 이에 제한되지는 않지만, 막베신 또는 헤르비마이신같은 안사마이신 클러스터 유래의 post-PKS 유전자가 사용될 수 있다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 헤르비마이신 (예를 들어, 헤르비마이신 A, B 또는 C) 생산 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 오토라이티마이신 생산 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 레블라스타틴 생산 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 헤르비마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 상동체가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주이다.

추가의 실시태양에서, 숙주 균주는 헤르비마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 상동체 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주이다.

결실되거나 비활성화될 수 있는 스타터 유닛 생합성 유전자들로는 예를 들어, 젤다나마이신 생산 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM 3602 내에서 ahba-B 클러스터의 ahba-3, ahba-1c, ahba-4, ahba-b, ahba-1a 및 ahba-1b 로 알려진 유전자 (Rascher et al 2005), 또는 막베신 생산 균주인 악티노신네마 프레티오섬 ATCC 31280 (Actinosynnema pretiosum ATCC 31280)내의 PH, OX, Ahs, Adh 및 AHk 유전자 (표 3) 뿐만 아니라, 유사한 기능을 갖는 다른 균주내에서 그들의 상동체도 포함된다. 예를 들어, 젤다나마이신 생산 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM 3602내의 ahba-B 클러스터의 모든 유전자들은 결실되거나 비활성화될 수 있다.

상기에서 언급한 결실은 예를 들어, 안사마이신 생산 균주 (예를 들어, 젤다나마이신 또는 헤르비마이신 생산 균주)를 기초로, gdmM 또는 그의 상동체, 및 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자, 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주와 결합 될 수 있다.

바람직하게는 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자 또는 post-PKS 유전자는 선택적으로, 결실되거나 비활성화될 것이다.

추가의 실시태양에서, 상기 조작된 균주내에서 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자 또는 post-PKS 유전자가 비활성화되는데, 이는 유전자에 DNA를 삽입하여 기능적인 단백질을 생산할 수 없도록 조작하여 이루어진다. 양자택일적인 실시태양에서, 상기 조작된 균주내에서 하나 또는 그 이상의 상기 스타터 유닛 생합성 유전자 또는 post-PKS 유전자가 결실되는데, 이는 표적화된 결실 또는 결실에 의해 이루어진다. 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 균주내에서 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자 또는 post-PKS 유전자가 비활성화되는데, 이는 위치특이적 돌연변이 (Site-directed mutagenesis)에 의해 이루어진다. 추가의 실시태양에서, 젤다나마이신 생산 숙주는 화학제품 또는 UV 에 의해 돌연변이를 유발하고, 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 효소 또는 post-PKS 효소가 기능을 하지 못하도록 변형된 균주가 선택된다. 본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자의 발현을 조절하는 조절자의 돌연변이를 포함하며, 당업자는 조절자의 결실 또는 비활성화가 유전자의 결실 또는 비활성화와 동일한 결과를 나타낼 수 있을 것이다. post-PKS 유전자는 적절한 프로모터 하에서, 상기 숙주 세포로 도입될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 하나 또는 그 이상의 결실된 유전자가 스트렙토마이세스 파지 phiBTI (Streptomyces phage phiBTI)의 염색체의 파지 부착 부위 (chromosomal phage attachment site)로 도입될 수 있다 (Gregory et al., 2003). 당업자는 외부의 (in trans) 상보성 (complementation)은 이러한 파지 부착 부위, 또는 실제 부착 부위의 용도로 제한되지 않음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 결실된 보조 유전자의 상보성은 또한 이에 제한되지는 않지만, 예를 들어, pSET152의 유도체를 이용하여 스트렙토마이세스 파지 phiC31의 부착 부위와 같은 다른 파지 부착 부위로 적절한 프로모터의 존재하에서, 하나 또는 그 이상의 보조 유전자가 도입되는 것에 의해 달성될 수 있다 (Bierman et al., 1992). 당업자는 이미 알려진 추가의 파지들이 존재하고, 더 많은 파지들이 유전자를 숙주 균주로 도입하는데 사용될 수 있는 추가의 시스템을 생성하기 위한 적절한 프로모터와 함께 전달 벡터에 전달시킬수 있는 통합 (integration) 기능을 갖고 있을 것이라고 기대될 수 있는 것을 인식할 수 있을 것이다 (Smovkina et al., 1990, Matsuura et al., 1996, Van Mellaert et al., 1998, Lee et al., 1991). 더 많은 파지들이 특징지워지기 때문에 당업자는 유사하게 사용될 수 있는 추가의 이용가능한 인테그라제 (integrase)가 존재한다는 것을 기대할 것이다. 또한, 적절한 프로모터 존재하에 post-PKS 유전자의 도입은, 제한 없이, 염색체 내의 중성 위치 (neutral position) 및 비-중성 위치 (예를 들어, 선택된 유전자를 붕괴시키기 위해) 내로의 상동 재조합에 의해 이루어 질 수 있다. 또한, 자가-복제 벡터들은 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, pSG5 (예를 들어, pKC1139 Bierman et al., 1992), pIJ101 (예를 들어, PIJ487, Kieser et al., 2000) 및 SCP2^* (예를 들어, PIJ698, Kieser et al., 2000)로부터 유래한 스트렙토마이세스 복제 원점을 포함하는 벡터들을 사용할 수 있다.

추가의 실시태양에서, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 상기와 같이 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주는, 하나 또는 그 이상의 동일한 post-PKS 유전자, 또는 양자택일적인 젤다나마이신 생산 균주로부터 유래된 그의 상동체를 그 안으로 재도입한다.

추가의 실시태양에서, 하나 또는 그 이상의 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주는, 이에 제한되지는 않지만 리파마이신 (rifamycin), 안사미토신 (ansamitocin), 막베신 또는 헤르비마이신의 생합성을 지시하는 클러스터를 포함하는 이종 (heterologous) PKS 클러스터유래의 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자에 의해 상보된다.

post-PKS 유전자를 선택적으로 결실 또는 비활성화시키는 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(i) 목적 유전자의 서열에 기초한 특정 올리고를 고안하고, PCR을 통해 적절한 젤다나마이신 생산 균주로부터 목적 유전자의 내부적 단편을 분리하는 단계;

(ii) 상기 단편을 포함하는 플라스미드를 동일한 균주 또는 다른 젤다나마이신 생산 균주로 통합시켜, 상동 재조합에 의해 표적화된 유전자를 붕괴시키는 단계;

(iii) 안사마이신 유사체의 생산을 위한 적절한 조건에서 상기와 같이 생산된 균주를 배양하는 단계.

당업자는 상기에서 기술한 선택적인 방법들을 사용하여 균등한 균주를 얻을 수 있음을 알 수 있을 것이다, 예를 들어:

■ 목적 유전자의 상동체(들)에 기초한 축퇴성 (degenerate) 올리고를 고안할 수 있고 (예를 들어, 리파마이신, 막베신 또는 헤르비마이신 생합성 클러스터 및/또는 다른 이용가능한 서열로부터), PCR을 통해 적절한 젤다나마이신 생산 균주로부터 목적 유전자의 내부적 단편을 분리할 수 있다. 다른 축퇴성 올리고는 젤다나마이신 생산자, 또는 그의 상동체 생산 균주의 post-PKS 유전자의 적절한 영역, 또는 이의 상동체를, 성공적으로 증폭시킬 수 있도록 고안될 수 있다.

■ 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602 균주의 유전자 서열은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602의 유전자에 특이적인 올리고를 생성하는데 사용될 수 있고, 내부적 단편은 어떠한 젤다나마이신 생산 균주, 예를 들어, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602 또는 스트렙토마이세스 종 DSM4137 또는 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르 DSM40699로부터 증폭할 수 있다.

■ 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602 균주의 유전자 서열은 상동체 유전자 서열 (예를 들어, 스트렙토마이세스 종 DSM4137 또는 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르 DSM40699의 젤다나마이신 생합성 클러스터로부터)과 함께 사용하여 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602의 유전자에 대한 축퇴성 올리고를 생성할 수 있고, 그 다음 내부적 단편은 어떠한 젤다나마이신 생산 균주, 예를 들어, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602 또는 스트렙토마이세스 종 DSM4137 또는 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르 DSM40699로부터 증폭할 수 있다.

도 2는 젤다나마이신 생합성 클러스터내의 post-PKS 유전자의 활성을 나타낸다. 당업자는 관심 화합물을 생산할 수 있는 균주가 되도록 어떤 부가적인 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화될 필요가 있는지 확인할 수 있을 것이다.

이러한 시스템에서 균주가 상기에서 기술한 비활성화 또는 결실을 포함하는 방법 중의 하나를 사용한 결과로, 기능을 하지 못하는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자를 생성할 때, 하나 이상의 안사마이신 유사체를 생산할 수 있음이 관찰될 것이다. 이에 대해 당업자에게 이해될 수 있는 많은 가능한 이유들이 있다. 예를 들어, post-PKS 단계에 바람직한 순서가 있을 수 있고, 단일 활성을 제거하는 것이 이후의 모든 단계를 수반되는 효소들에 맞지 않는 기질 상에서 이루어지게 할 수 있다. 이는 post-PKS 효소에 제공되는 신규한 기질에 대한 낮아진 효율성 또는 단계의 순서가 바뀌어 더이상 남아있는 효소에 대한 기질이 아닌 생성물로 변경되는 것으로 인하여, 배양액 내에 중간체가 생성되도록 이끌 수 있다.

당업자는 혼합물 내에서 관찰되는 화합물의 비율을 성장 조건을 변화시킴으로써 조절할 수 있음을 알 것이다.

당업자는 어떤 유전자의 생합성 클러스터는 오페론 (operon)으로 구성되고, 하나의 유전자의 붕괴는 종종 같은 오페론 내의 하위 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있음을 알 것이다.

화합물의 혼합물이 관찰될 때, 이들은 하기의 실시예에 기술된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 쉽게 분리할 수 있다.

안사마이신 유사체는 본원에 기술된 바와 같은 많은 방법에 의해 선별할 수 있고, 바람직하게는 하나의 화합물이 선호적인 특징을 나타내는 환경 내에서 균주는 이러한 화합물을 만들 수 있도록 조작될 수 있다. 이것이 불가능한 비정상적인 환경 내에서 중간체가 생성될 수 있는데, 중간체는 이후 생체내 변환되어 바람직한 화합물을 생성한다.

본 발명은 안사마이신 폴리케티드 또는 이의 유사체 (예를 들어, 젤다나마이신 또는 이의 유사체) 생산 균주를 배양하여 생성된 신규한 안사마이신 유사체를 제공한다. 상기 균주는 선택적으로 PKS 유전자 클러스터의 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자의 결실 또는 비활성화된 것을 선택하고, 스타터 유닛의 도입을 위한 산 공급물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 젤다나마이신 생산 균주에 인공적인 스타터 유닛을 제공하고, 젤다나마이신 PKS 유전자 클러스터의 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자의 결실 또는 비활성화를 선택하는 것과 선택적으로 조합하여, 생산된 신규한 안사마이신 유사체에 관한 것이다. 더 나아가, 안사마이신 생합성 클러스터의 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 재도입될 수 있다.

당업자는 유전자 산물이 기능하지 않도록 하기 위해 유전자가 완전히 결실될 필요가 없다는 것을 알 것이고, 결과적으로 본원에서 사용하는 용어 "결실되거나 비활성화된다"는 유전자 산물이 기능하지 않게 되는 어떤 방법이라도 포함하며, 이에 제한되지는 않지만, 유전자가 발현되지 않거나 비활성화 단백질을 생산하도록 발현되도록 하는, 유전자 전체 결실, 유전자 일부 결실, 표적 유전자로의 삽입에 의한 비활성화, 위치특이적 돌연변이; 유전자가 발현되지 않거나 비활성화 단백질을 생산하도록 발현되도록 하는, 숙주 균주의 돌연변이 (예를 들어, 방사선 조사 또는 돌연변이 유발 화학제에 노출, 원형질체 융합 또는 트랜스포존 돌연변이)를 포함한다. 양자택일적으로, 활성 유전자 산물의 기능은 억제제에 의해 화학적으로 약화될 수 있는데, 예를 들어, 메타파이론 (metapyrone) (다른 명칭: 2-메틸-1,2-디(3-피리딜-1-프로파논, EP 0 627 009) 및 안사이미돌 (ancymidol)은 옥시게나제 (oxygenase)의 억제제이며, 이들 화합물은 생산 배지에 첨가되어 유사체를 생성시킬 수 있다. 게다가, 시네펀진 (sinefungin)은 메틸 트랜스퍼라제 (methyl transferase) 억제제이고, 이는 생체 내에서의 메틸 트랜스퍼라제 활성 억제를 위한 것을 제외하고 유사하게 사용될 수 있다 (McCammon and Parks 1981).

양자택일적인 실시태양에서, 모든 post-PKS 유전자는 결실되거나 비활성화될 수 있고, 하나 또는 그 이상의 유전자는 상보성 (예를 들어, 자가-복제 플라스미드 상의 부착 부위 또는 염색체의 상동 부위 내로의 삽입에 의해)에 의해 재도입될 수 있다. 따라서, 구체적인 실시태양에서 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 안사마이신 유사체 (예를 들어, 18, 21-디데스옥시 안사마이신 유사체)의 제조 방법에 관한 것이다:

(a) 적절한 조건에서 배양시 젤다나마이신을 생산하는 제1 숙주 균주를 제공하는 단계;

(b) 선택적으로 모든 post-PKS 유전자를 선택적으로 결실 또는 비활성화시키는 단계;

(c) 상기 균주에 인공적인 스타터 유닛을 공급하는 단계;

(d) 안사마이신 유사체의 생산을 위한 적절한 조건에서 상기 변형된 숙주 균주를 배양하는 단계; 및

(e) 생성된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.

양자택일적인 실시태양에서, 하나 또는 그 이상의 결실된 post-PKS 유전자가 재도입된다. 추가의 실시태양에서, 다른 생산 유기체에서 유래한 젤다나마이신 클러스터의 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 재도입된다. 추가의 실시태양에서, 막베신 생합성 클러스터에서 선택된 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 도입되며, mbcM, mbcN, mbcP, mbcMT1, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택된 유전자가 재도입된다. 추가의 실시태양에서, mbcM, mbcN, mbcP, mbcMT1, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택된 2개 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 재도입된다. 추가의 실시태양에서, mbcM, mbcN, mbcP, mbcMT1, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택된 3개 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 재도입된다. 추가의 실시태양에서, mbcM, mbcN, mbcP, mbcMT1, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택된 4개 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 재도입된다. 추가의 양자택일적인 실시태양에서, mbcM, mbcN, mbcP, mbcMT1, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택된 5개 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 재도입된다.

게다가, 당업자에게 post-PKS 유전자들의 서브셋 (subset)이 결실되거나 비활성화될 수 있고, 선택적으로 상기 post-PKS 유전자들의 더 작은 서브셋이, 인공적인 스타터 유닛을 공급시, 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체와 같은 유사체를 생산하는 균주에 재도입될 수 있다는 사실은 명백할 것이다.

그러므로, 바람직한 실시태양에서 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 안사마이신 유사체 (예를 들어, 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체)를 제조하는 방법에 관한 것이다:

(a) 적절한 조건에서 배양시 젤다나마이신을 생산하는 제1 숙주 균주를 제공하는 단계;

(b) gdmM을 선택적으로 결실 또는 비활성화시키는 단계;

(c) 상기 균주에 인공적인 스타터 유닛을 공급하는 단계;

(d) 안사마이신 유사체 (18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체)의 생산을 위한 적절한 조건에서 상기 변형된 숙주 균주를 배양하는 단계; 및

(e) 생성된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.

추가의 바람직한 실시태양에서 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 안사마이신 유사체 (예를 들어, 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체)를 제조하는 방법에 관한 것이다:

(a) 적절한 조건에서 배양시 젤다나마이신을 생산하는 제1 숙주 균주를 제공하는 단계;

(b) gdmM을 선택적으로 결실 또는 비활성화시키는 단계;

(c) 임의의 추가의 post-PKS 유전자를 선택적으로 결실 또는 비활성화시키는 단계

(d) 상기 균주에 인공적인 스타터 유닛을 공급하는 단계;

(e) 안사마이신 유사체 (18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체)의 생산을 위한 적절한 조건에서 상기 변형된 숙주 균주를 배양하는 단계; 및

(f) 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.

폴리케티드 유전자 클러스터가 이종 숙주 내에서 발현될 수 있다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다 (Pfeifer and Khosla, 2001). 따라서, 본 발명은 저항성 및 조절 유전자를 포함하거나 포함하지 않는, 완전하거나 결실을 포함하는, 예를 들어, 젤다나마이신 생합성 유전자 클러스터 같은 안사마이신 폴리케티드 생합성 클러스터의 이종 숙주 내로의 전이를 포함한다. 양자택일적으로, 완전한, 예를 들어, 젤다나마이신 생합성 유전자 클러스터 같은 안사마이신 폴리케티드 생합성 클러스터는 저항성 및 조절 유전자를 포함하거나 포함하지 않은 상태로 이종 숙주내로 전이될 수 있으며, 이는 그 다음 본원에 기술된 방법들을 통해 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 또는 스타터 유닛 생합성 유전자를 결실시키거나 비활성화시키도록 조작될 수 있다. 상기에서 정의된 바와 같이 이러한 방대한 DNA 절편들의 전이를 위한 방법 및 벡터는 당업계에 잘 알려져 있거나 (Rawlings, 2001; Staunton and Weissman, 2001), 본 발명에서 개시된 방법으로 제공된다. 이러한 배경에서, 바람직한 숙주세포 균주는 원핵생물이며, 더욱 바람직하게는 악티노마이세테 (actinomycete) 또는 대장균이고, 더욱더 바람직한 숙주 세포 균주는 악티노신네마 미럼 (Actinosynnema mirum; A. mirum), 악티노신네마 프레티오섬 아종 프레티오섬 (Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum; A. pretiosum), 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 종, S. 하이그로스코피쿠스 바. 아스코마이세티쿠스 (S. hygroscopicus var. ascomyceticus), 스트렙토마이세스 쭈쿠밴시스 (Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르, 스트렙토마이세스 코엘리칼라 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 사카로폴리스포라 에리쓰래아 (Saccharopolyspora erythraea), 스트렙토마이세스 프라디애 (Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 아버미티리스 (Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 신나모넨시스 (Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 리모수스 (Streptomyces rimosus), 스트렙토마이세스 알버스 (Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 그리세오퍼스쿠스 (Streptomyces griseofuscus), 스트렙토마이세스 론지스포로플라버스 (Streptomyces longisporoflavus), 스트렙토마이세스 베네주에래 (Streptomyces venezuelae), 스트렙토마이세스 알버스 (Streptomyces albus), 마이크로모노스포라 종 (Micromonospora sp.), 마이크로모노스포라 그리세오루비다 (Micromonospora griseorubida), 아미코라톱시스 메디터라네이 (Amycolatopsis mediterranei) 또는 악티노플라네스 종 (Actinoplanes sp.) N902-109를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시태양에서, 전체 생합성 클러스터는 전이된다. 양자택일적인 실시태양에서 전체 PKS가, 어떠한 관련된 스타터 유닛 생합성 유전자 및/또는 post-PKS 유전자 없이 전이된다.

추가의 실시태양에서, 전체 젤다나마이신 생합성 클러스터가 전이된 다음, 본원에서 기술된 바에 따라 조작된다.

추가의 실시태양에서, 전체 PKS가 어떠한 관련된 스타터 유닛 생합성 유전자 및/또는 post-PKS 유전자 없이 전이되고, 이에 제한되지는 않지만, 예를 들어, gdmN, mbcN, hbmN, gdmL, 및/또는 mbcP450와 같은 선택된 post-PKS 유전자가 새로운 숙주로 도입된다.

본 발명의 양자택일적인 양태에서, 본 발명의 안사마이신 유사체(들)는 적절한 균주를 이용한 생체내 변환에 의해 더 처리될 수 있다. 적절한 균주는 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 악티노신네마 미럼, 악티노신네마 프레티오섬 아종 프레티오섬, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 종, 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르 같은 이용가능한 야생형 균주일 수 있다. 양자택일적으로, 적절한 균주는, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, mbcM, mbcN, mbcP, mbcMT2, mbcP450 (본원에서 정의된 바와 같이), gdmN, gdmM, gdmL, gdmP (Rascher et al., 2003), 젤다나마이신 O-메틸 트랜스퍼라제, hbmN, hbmL, hbmP (Rascher et al., 2005), 헤르비마이신 O-메틸 트랜스퍼라제 및 추가의 헤르비마이신 모노옥시게나제, asm7, asm10, asm11, asm12, asm19 및 asm21 (Cassady et al., 2004, Spiteller et al., 2003)에 의해 코딩된 구체적 post-PKS 효소를 이용하여 생체내 변환되도록 조작될 수 있다. 아직 규명되지 않은 유전자가 있거나, 공유 도메인 내의 서열이 존재하지 않더라도 당업자가 표준 방법을 통해 이러한 서열을 획득하는 것은 통상적인 것이다. 예를 들면 젤다나마이신 O-메틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 서열은 공유 도메인 내에 존재하지 않지만, 당업자는 프로브를 만들 수 있는데, 유사한 O-메틸 트랜스퍼라제를 이용하여 이종의 프로브를 만들거나 이용가능한 상동의 유전자로부터 축퇴성 프라이머를 고안함으로써 상동의 프로브를 만들어 젤다나마이신 생산 균주 상에서 서던블롯 (Southern blots)을 수행할 수 있으며, 이를 통해 생체내 변환 시스템을 생성할 수 있는 이러한 유전자를 획득할 수 있다.

구체적인 실시태양에서, 상기 균주는 본래의 폴리케티드 클러스터에 의해 생산되는 폴리케티드 생산을 막을 수 있도록, 전체적 또는 부분적으로 결실되거나, 아니면 비활성화된 하나 또는 그 이상의 본래의 폴리케티드 클러스터를 가질 수 있다. 상기 조작된 균주는 예를 들면, 악티노신네마 미럼, 악티노신네마 프레티오섬 아종 프레티오섬, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 종, S. 하이그로스코피쿠스 바. 아스코마이세티쿠스, 스트렙토마이세스 쭈쿠밴시스, 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르, 스트렙토마이세스 코엘리칼라, 스트렙토마이세스 리비단스, 사카로폴리스포라 에리쓰래아, 스트렙토마이세스 프라디애, 스트렙토마이세스 아버미티리스, 스트렙토마이세스 신나모넨시스, 스트렙토마이세스 리모수스, 스트렙토마이세스 알버스, 스트렙토마이세스 그리세오퍼스쿠스, 스트렙토마이세스 론지스포로플라버스, 스트렙토마이세스 베네주에래, 마이크로모노스포라 종, 마이크로모노스포라 그리세오루비다, 아미코라톱시스 메디터라네이 또는 악티노플라네스 종 N902-109를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

당업자는 다른 안사마이신 폴리케티드 생합성 클러스터, 예를 들어, 헤르비마이신, 레블라스타틴, 또는 TAN 클러스터가 동등하게 본 발명의 화합물을 생산하는 데 사용될 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다.

예를 들어, 이에 제한되지는 않지만 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM 3672 (Rascher et al., 2005)와 같은 헤르비마이신 생산 균주 또는 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 또는 스타터 유닛 생합성 유전자가 비활성되거나 결실되도륵 조작된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM-3672와 같은 헤르비마이신 유사체 생산 균주를 사용하여, 본 발명에서 기술한 바와 같이, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 post-PKS 상동체 및 이종 유전자가 재도입되고 스타터 유닛이 공급된다. 헤르비마이신 PKS 클러스터의 서열은 GenBank (허가번호 AY947889) (Rascher et al., 2005)에 기탁된 것이고, 유전자는 상기 서열상에 위치할 필요는 없으나, 본 발명에서 기술된 바와 같이, 상동체 서열을 사용하여, 축퇴성 올리고를 고안하여, 생성한 상동체 또는 이종 프로브의 사용에 의해 위치한다.

당업자는 레블라스타틴 클러스터가 동등하게 본 발명의 화합물을 생산하는 데 사용될 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 이는 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만 스트렙토마이세스 종 S6699 (Stead et al., 2000)와 같은 레블라스타틴 생산 균주 또는 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 또는 스타터 유닛 생합성 유전자가 비활성되거나 결실되도륵 조작된 스트렙토마이세스 종 S6699와 같은 레블라스타틴 유사체 생산 균주를 사용하여, 본 발명에서 기술한 바와 같이, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 post-PKS 상동체 및 이종 유전자가 재도입되고 스타터 유닛을 공급하여 생산할 수 있다.

당업자는 천연물을 생산하는 균주에 본 발명의 방법을 적용하여 본 발명의 화합물을 생산하는 데 사용될 수 있는, 다양한 추가의 균주가 존재한다는 것을 알 수 있을 것이다.

비록, 상기에서 기술한 바와 같은 본 발명의 안사마이신 유사체 제조과정은 대체로 또는 전적으로 생합성에 의하나, 표준 화학 합성 방법을 포함하는 과정에 의한 본 발명의 안사마이신 유사체의 생산 또는 상호전환을 제외하지 않는다.

젤다나마이신 PKS 유전자 클러스터의 유전적 조작을 위해, GenBank (허가 번호 AY179507)에 기탁된 유전자 서열을 사용하였다 (Rascher et al., 2003). 유전자는 상기 서열상에 위치할 필요는 없으나, 본 발명에서 기술된 바와 같이, 상동체 서열을 사용하여, 축퇴성 올리고를 고안하여, 생성한 상동체 또는 이종 프로브의 사용에 의해 위치한다.

막베신 클러스터의 post-PKS 유전자의 사용을 위해, 막베신 유전자 클러스터는 악티노신네마 프레티오섬 아종 프레티오섬 프레티오섬에서 실시예 1에서 기술한 바와 같이 서열분석을 하였다. 당업자는 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나 악티노신네마 미럼 같은 막베신을 생산하는 양자택일적인 균주가 있다는 것을 알 것이다. 이러한 균주 유래의 막베신 생합성 유전자 클러스터는 본원에서 악티노신네마 프레티오섬 아종 프레티오섬에 대해 기술한 바와 같이 서열분석될 수 있으며, 상기 정보는 동등한 균주를 생성하는데 사용될 수 있다.

추가의 양태로서, 본 발명은 하기를 포함한다:

-안사마이신 생산 균주 (예를 들어, 젤다나마이신 또는 헤르비마이신 (예를 들어, 헤르비마이신 A, B 또는 C) 생산 균주)를 기초로, gdmM 상동체 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주로, 구체적으로 gdmM 상동체가 결실되거나 비활성화된 조작된 균주. 바람직하게는, 안사마이신 생산 균주는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602 또는 스트렙토마이세스 종 DSM4137 또는 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르 DSM40699와 같은 스트렙토마이세스이다.

-안사마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주. 예를 들어, 젤다나마이신 생산 균주가 gdmO이 결실되거나 비활성화되도록 조작되거나, 예를 들어, 헤르비마이신 생산 균주가 hbmO이 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주.

-안사마이신 생산 균주 (예를 들어, 젤다나마이신 또는 헤르비마이신 생산 균주)를 기초로, gdmM 또는 그의 상동체 및 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주. 예를 들어, 젤다나마이신 생산균주인, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM-3602의 ahba-B 클러스터의 모든 유전자 (또는 다른 균주의 상동체)는 결실되거나 비활성화될 수 있다.

양자택일적으로, 젤다나마이신 생산균주인, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM-3602의 ahba-B 클러스터의 어떤 유전자 (또는 다른 균주의 상동체)는 결실되거나 비활성화될 수 있고, 이는 상기 AHBA 생합성이 줄어들거나 제거되도록 균주를 이끌며, 이는 상기 균주에 AHBA를 공급시, 젤다나마이신 또는 다른 안사마이신을 적합하게 생산하도록 복구되는 것을 통해 실험적으로 확인할 수 있다.

- 안사마이신 유사체 (예를 들어, 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체) 제조에 사용되는 상기 조작된 균주의 용도.

- 상기에서 언급된 방법 중 어느 하나에 따라 얻거나 얻을 수 있는 안사마이신 유사체.

본 발명의 화합물은 하나 또는 그 이상의 하기 성질을 가지는 것으로 기대될 수 있다는 점에서 유리하다; Hsp90에 대한 높은 결합력, Hsp90에 대한 빠른 결합속도, 우수한 안정성, 우수한 제형 능력, 우수한 경구 생체이용도, 우수한 약물동력학 성질로 이에 제한되지는 않지만, 낮은 글루크로니데이션 (glucuronidation), 우수한 세포흡수성, 우수한 뇌 약물동력학, 적혈구에 대한 낮은 결합력, 우수한 독성학적 프로파일, 우수한 간독성 (hepatotoxicity) 프로파일 , 우수한 신장독성 (nephrotoxicity) 프로파일, 낮은 부작용 및 낮은 심장 부작용을 포함한다.

도 1은 제1 추정 효소가 유리된 중간체, 프로젤다나마이신 및 젤다나마이신에 대한 post-PKS 프로세싱을 보여주는 젤다나마이신 생합성의 대표도면이다. 도면 내의 PKS 프로세싱 단계는 사건의 순서를 대표하는 것은 아니다. 다음의 약어는 클러스터의 구체적 유전자를 나타낸다: ALO - AHBA 부하 도메인 (loading domain); ACP - 아실 운반 단백질 (Acyl Carrier Protein); KS - β-케토신타제 (β-ketosynthase); AT - 아실 트랜스퍼라제 (acyl transferase); DH - 탈수소효소; ER - 에노일 리덕타제 (enoyl reductase); KR - β-케토리덕타제 (β-ketoreductase).

도 2는 젤다나마이신을 얻기 위한 프로-젤다나마이신의 post-PKS 프로세싱 부위를 묘사한 것이다.

도 3은 실시예들에 기재된 화합물들 (14-25)의 구조를 나타낸다.

도 4는 실시예들에 기재된 화합물들 (26-37)의 구조를 나타낸다.

일반적인 방법

배지 1 - MAM

증류수 1 L 내의 조성임

밀 전분	10 g
옥수수 침지 고형물	2.5 g
효모 추출물	3 g
CaCO3	3 g
황산제일철(Iron sulphate)	0.3 g
한천	20 g

121 ℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.

배지 2 - R6

증류수 700 mL 내의 조성임

수크로스	200 g
덱스트린 분말(Dextrin powder)	10 g
카사미노산(Casamino acids)	1 g
MgSO4.7H2O	0.05 g
*미량 원소	1 mL
K2SO4	0.1 g
한천	20 g

FeSO₄.7H₂O, MnCl₂.4H₂0 및 ZnSO₄.7H₂O는 각각 미량원소 1 g/L임

121 ℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.

멸균 후, 하기의 멸균 용액들을 첨가한다 (글루타믹산은 필터로 멸균됨).

L-글루타믹산 모노 소디움 염(0.65 M)	100 mL
CaCl2.2H2O(0.48 M)	100 mL
MOPS(pH 7.2)(0.1 M)	100 mL

LCMS 분석을 위한 배양 브로스의 추출

배양 브로스 (1 mL) 및 에틸 아세테이트 (1 mL)를 15-30분 동안 강하게 혼합한 후 10분 동안 원심분리하였다. 유기층 0.5 mL를 수집하고, 증발시켜 건조한 다 음 메탄올 0.25 mL 내에서 용해시켰다.

LCMS 분석 과정

양성 및/또는 음성 이온 모드에서 작동하는 Buker Daltonics Esquire 3000+ electrospray mass spectrometer가 결합된 통합적인 Agilent HP1100 HPLC 시스템 상에서 LCMS 방법 1을 이용하여 LCMS 분석을 수행하였다. LCMS 방법 1: 크로마토그래피는 Phenomenex Hyperclone column (C₁₈ BDS, 3 micron 입자 크기, 15O × 4.6 mm) 상에서 다음의 구배용매 조성 과정에 따라 1 mL/min의 유속으로 용출하여 수행하였다; T=O, 10%B; T=2, 10%B; T=20, 100%B; T=22, 100%B; T=22.05, 10%B; T=25, 10%B. 이동상 A = 물 + 0.1% 포름산; 이동상 B = 아세토니트릴 + 0.1 % 포름산. UV 스펙트럼은 190 내지 400 nm 사이에서 기록되었고, 추출된 크로마토그램은 210, 254 및 276 nm에서 얻었다. 질량 스펙트럼은 100 내지 1500 amu 사이에서 기록되었다.

NMR 구조 설명 방법

NMR 스펙트럼은 298 K에서 작동하는 Bruker Advance 500 spectrometer 상에서 ¹H 및 ¹³C 각각에 대하여 500 MHz 및 125 MHz에서 기록되었다. ¹H-¹H COSY, APT, HMBC 및 HMQC 스펙트럼을 획득하기 위해 Standard Bruker pulse sequences를 사용하였다. NMR 스펙트럼을 잔류 프로톤 (residual proton)이나 이들이 작동되는 용 매의 표준 탄소 공명 (standard carbon resonances)과 대비하였다.

화합물의 순도 평가

순수한 화합물을 기술된 LCMS 방법 2를 이용하여 분석하였다. LCMS 방법 2: 크로마토그래피는 Phenomenex HyperClone C₁₈-BDS column (4.6 × 150 mm, 3 micron 입자 크기) 상에서 물 + 0.1% 포름산 : 아세토니트릴 + 0.1% 포름산의 (90 : 10) 내지 (0 : 100)까지의 농도 구배로 1 mL/min의 유속으로 20분 동안 용출하여 수행하였다. MS 및 다중 파장 (210, 254 및 276 nm)에 의해 순도를 평가하였다. 모든 화합물의 순도는 모든 파장에서 95% 이상이었다. 최종적으로 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼의 검사에 의해 순도를 확인하였다.

항암 활성을 위한 시험관 내 생물검정

화합물의 시험관 내 항암 활성 평가는 단일층 증식 방법에 의해 증식된 인간 종양 세포주의 패널을 대상으로 온코테스트 시험 기관 (Oncotest Testing Facility), Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg을 통해 수행하였다. 선택된 세포주들의 특성을 표 1에 요약하였다.

시험 세포주

#	세포주	특성
1	CNXF 498NL	CNS
2	CXF HT29	결장(結腸, Colon)
3	LXF 1121L	폐, 거대 세포 암종(large cell ca)
4	MCF-7	유방, NCI 표준
5	MEXF 394NL	흑색종(Melanoma)
6	DU145	전립선 - PTEN 양성(positive)

온코테스트 세포주는 Roth et al.,(1999)에 기술된 바와 같이 인간 종양 이종이식체로부터 수립되었다. 공여체 이종이식의 기원은 Fiebig et al.,(1999)에 의해 기술되었다. 다른 세포주는 NCI (DU 145, MCF-7)로부터 얻거나 DSMZ, Braunschweig, Germany에서 구입하였다.

명시되지 않더라도, 모든 세포주는 RPMI 1640 배지, 10% 우태아 혈청 (fetal calf serum) 및 0.1 mg/mL 젠타마이신이 포함된 '조제배지 (ready-mix)' (PAA, Clbe, Germany) 내에서 가습조건 (95% air, 5% CO₂), 37 ℃에서 생장시켰다.

화합물이 인간 종양 세포주의 생장에 미치는 영향을 평가하기 위해 변형된 요오드화 프로피디엄 분석 (propidium iodide assay)을 사용하였다 (Dengler et al.,(1995).

간단히 설명하면, 세포를 트립신 처리하여 증식기 상태에서 채취하고, 계수하고, 편평한 바닥 96웰 마이크로타이터 플레이트에 세포주에 따른 세포밀도 (5-10.000 생존 세포/웰)로 접종하였다. 세포가 다시 증식기에 접어들도록 하기 위해 24시간 회복 후에, 배양배지 (플레이트 당 6개의 대조군 웰) 또는 안사마이신 유사체를 포함하는 배양배지 0.010 mL를 웰에 첨가하였다. 각 농도는 3개씩 처리되었다. 화합물은 다섯 가지 농도로 적용하였다 (100; 10; 1; 0.1 및 0.01 μM). 연속적 노출 4일 후, 시험 화합물이 있거나 없는 세포 배양배지를 0.2 mL의 수성 요오드화 프로피디엄 (PI) 용액 (7 mg/L)으로 교체하였다. 생존 세포의 비율을 측정하기 위해, 플레이트를 냉동시켜 세포를 투과화 (permeabilization)시켰다. 이러한 플레이트를 해동한 후, 형광도를 Cytofluor 4000 microplate reader (여기 530 nm, 방출 620 nm)를 이용하여 측정하였고, 생존 세포의 총 수와의 직접적인 관계를 도출하였다.

생장 억제 정도는 처리군/대조군×100 (% T/C)로 나타내었다.

실시예 1 - 막베신 PKS 유전자 클러스터의 서열분석

악티노신네마 프레티오섬 (ATCC 31280) 및 악티노신네마 미럼 (DSM 43827, ATCC 29888)에서 Kieser et al., (2000)에 기술된 표준 프로토콜을 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. DNA 서열분석은 표준 과정을 사용하여 Sequencing facility of the Biochemistry Department, University of Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QW에서 분석하였다.

프라이머 BIOSG104 5'-GGTCTAGAGGTCAGTGCCCCCGCGTACCGTCGT-3' (서열번호: 1) 및 BIOSG105 5'-GGCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC-3' (서열번호: 2)는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 NRRL 3602 (서열 허가번호: AY179507)의 젤다나마이신 생합성 유전자 클러스터 유래의 카르바모일트랜스퍼라제-코딩 유전자 gdmN를 표준 기술을 이용하여 증폭하기 위해 사용하였다. 서던 블롯 실험은 DIG 시약 및 비-방사성 핵산 표지 및 검출을 위한 키트를 사용하여 제조 지침서 (Roche)에 따라 수행되었다. DIG-표지된 gdmN DNA 단편을 이종 프로브로 사용하였다. gdmN에서 생성된 프로브 및 A. 프레티오섬 2112로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 약 8 kb EcoRI 단편을 서던 블롯 분석으로 확인하였다. 단편은 표준 절차에 의해 리트머스 28 내로 클로닝하고, 형질변환체들은 콜로니 하이브리다이제이션 (hybridization)으로 확인하였다. 클론 p3을 분리하고, 약 7.7 kb 삽입체를 서열분석하였다. 클론 p3에서 분리한 DNA를 EcoRI 및 EcoRI/SacI로 절단하고, 약 7.7 kb 및 약 1.2 kb 크기의 밴드를 각각 분리하였다. 표지화 반응을 제조 프로토콜에 따라 수행하였다. 상기에 명명된 두 균주의 코스미드 라이브러리는 벡터 SuperCos 1 및 the Gigapack III XL packaging kit (Stratagene)를 사용하여 제조 지침서에 따라 만들었다. 이러한 두 라이브러리는 표준 프로토콜을 사용하여 선별되었고, 프로브로서 클론 p3로부터 유래한 7.7 kb EcoRI 절편의 DIG-표지화 절편이 사용되었다. 코스미드 52는 A. 프레티오섬의 코스미드 라이브러리로부터 동정되었고, 서열분석을 위해 the sequencing facility of the Biochemistry Department of the University of Cambridge에 맡겨졌다. 유사하게, 코스미드 43 및 코스미드 46은 A. 미럼의 코스미드 라이브러리로부터 동정되었다. 세개의 코스미드는 모두 서던 블롯 분석에서 나타난 바와 같이 7.7 kb EcoRI 단편을 포함한다.

코스미드 43의 PKS 영역의 약 0.7 kbp 단편은 프라이머 BIOSG124 5'-CCCGCCCGCGCGAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC-3' (서열번호: 3) 및 BIOSG125 5'- GCGTCCTCGCGCAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC-3' (서열번호: 4)를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 증폭되고, 클로닝 되었으며, 중복되는 클론에 대한 A. 프레티오섬 코스미드 라이브러리를 선별하기 위한 프로브로서 사용되었다. 프라이머 BIOSG130 5'- CCAACCCCGCCGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG-3' (서열번호: 5) 및 BIOSG131 5'-GTCGTCGGCTACGGGCCGGTGGGGCAGCTGCTGT-3' (서열번호: 6) 뿐만 아니라, A. 프레티오섬의 코스미드 라이브러리 선별을 위해 사용되었던 BIOSG132 5'- GTCGGTGGACTGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC-3' (서열번호: 7) 및 BIOSG133 5'- GGCCGGTGGTGCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG-3' (서열번호: 8)로 증폭된, DNA 단편 유래의 프로브를 생성하기 위해 코스미드 52의 서열정보를 또한 사용하였다. 코스미드 311 및 코스미드 352를 분리하고, 코스미드 352를 서열분석을 위해 사용하였다. 코스미드 352는 코스미드 52와 약 2.7 kb의 중복부분을 포함한다. 다른 코스미드의 선별을 위해 프라이머 BIOSG136 5'-CACCGCTCGCGGGGGTGGCGCGGCGCACGACGTGG CTGC-3' (서열번호: 9) 및 BIOSG 137 5'-CCTCCTCGGACAGCGCGATCAGCGCCGCGC ACAGCGAG-3' (서열번호: 10)을 사용하고, 코스미드 311을 주형으로 사용하여 표준 프로토콜에 따라 약 0.6 kb PCR 단편을 증폭하였다. A. 프레티오섬의 코스미드 라이브러리를 선별하고, 코스미드 410을 분리하였다. 이는 코스미드 352와 약 17 kb가 중복되고, 서열분석을 위해 제공되었다. 세가지 중복되는 코스미드 (코스미드 52, 코스미드 352 및 코스미드 410)의 서열이 조립되었다. 서열분석된 부분은 약 100 kbp이었으며, 막베신 생합성 유전자 클러스터를 구성하는 23개의 오픈 리딩 프레임이 잠재적으로 확인되었다. 서열번호: 11 내의 각 오픈 리딩 프레임의 위치를 표 3에 나타내었다.

코스미드의 요약

코스미드	균주
코스미드 43	악티노신네마 미럼 ATCC 29888
코스미드 46	악티노신네마 미럼 ATCC 29888
코스미드 52	악티노신네마 프레티오섬 ATCC 31280
코스미드 311	악티노신네마 프레티오섬 ATCC 31280
코스미드 352	악티노신네마 프레티오섬 ATCC 31280
코스미드 410	악티노신네마 프레티오섬 ATCC 31280

post-PKS 유전자 및 개시 유닛 생합성 유전자 각각의 오픈 리딩 프레임 위치

서열번호 11번 내의 뉴클레오티드 위치	유전자 이름	인코딩된 단백질의 기능
14925-17909*	mbcRII	전사제어 인자
18025-19074c	mbcO	아미노하이드로퀴네이트 신타제
19263-20066c*	mbc?	알려지지 않음, AHBA 신타제
20330-40657	mbcAl	PKS
40654-50859	mbcAll	PKS
50867-62491*	mbcAlll	PKS
62500-63276*	mbcF	아미드 신타제
63281-64852*	mbcM	C21 모노옥시게나제
64899-65696c*	PH	포스파타제
65693-66853c*	OX	옥시도리덕타제
66891-68057c*	Ahs	AHBA 신타제
68301-68732*	Adh	ADHQ 디하이드라타제
68690-69661c*	AHk	AHBA 키나제
70185-72194c*	mbcN	카르바모일트랜스페라제
72248-73339c	mbcH	메톡시말로닐 ACP 경로
73336-74493c	mbcI	메톡시말로닐 ACP 경로
74490-74765c	mbcJ	메톡시말로닐 ACP 경로
74762-75628c*	mbcK	메톡시말로닐 ACP 경로
75881-76537	mbcG	메톡시말로닐 ACP 경로
76534-77802*	mbcP	C4,5 모노옥시게나제
77831-79054*	mbcP450	P450
79119-79934*	mbcMT1	O-메틸트랜스페라제
79931-80716*	mbcMT2	O-메틸트랜스페라제

[주] 1: c는 완전한 DNA 가닥에 의해 코딩된 유전자를 말한다; 2: 몇몇 경우 하나 이상의 잠재성 후보 (candidate) 개시 코돈이 확인될 수 있다. 당업자는 이를 인식할 수 있고 대체가능한 개시 코돈을 확인할 수 있다. 하나 이상의 가능한 개시 코돈을 갖는 그러한 유전자들에 (*) 표시를 했다. 개시 코돈이 될 것이라 믿는 것에 표시하였으나, 당업자는 대체가능한 개시 코돈을 사용하여 활성 단백질을 생성할 수 있음을 이해할 것이다.

실시예 2 - gdmM 비활성 균주의 생성

gdmM의 프레임내 결실 (in-frame deletion)은 하기과 같이 수행된다.

2.1 gdmM 의 상위 플랭킹 부분에 상동적인 DNA의 클로닝

올리고 gdm1for (서열번호: 12) 및 gdm1rev (서열번호: 13)은 주형으로 게놈 및 Pfu DNA 폴리머라제를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 겔다누스 (NRRL 3602) 유래 DNA의 2268 bp 부분을 증폭하는 데 사용된다. 각각의 올리고 내의 5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위해 제한효소 부위를 도입한다. 증폭된 PCR 생산물 (PCRgdm1)은 gdmM의 첫번째 2 아미노산을 포함할때까지 gdmM의 상동적인 상위 부분을 포함한다. 이러한 2268 bp 단편을 SmaI로 선형화된 pUC18 내로 클로닝하고, 디인산화 (dephosphorylate)하여 pUC18gdm1을 얻는다.

gdmlfor TTAAGCTTGGACCGGCGCGAACTCGCGGACACCCACCT

Hind III

(서열번호: 12)

gdmlrev TTTCTAGAGGTCATGCGCCCGCCAGGATCAGGTCGACC

XbaI

(서열번호: 13)

439 bp, 1687 bp 및 2828 bp인 3개의 단편을 제공하는 NdeI 및 SmaI를 이용한 제한효소 절단에 의해 플라스미드 pUC18gdm1를 확인한다.

2.2 gdmM 의 하위 플랭킹 부분에 상동적인 DNA의 클로닝

올리고 gdm2for (서열번호 14) 및 gdm2rev (서열번호 15)은 주형으로 게놈 및 Pfu DNA 폴리머라제를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 겔다누스 (NRRL 3602) 유래 DNA의 2267 bp 부분을 증폭하는 데 사용된다. 5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위한 제한효소 부위가 도입되도록 각각의 올리고 내에 고안되었다. 증폭된 PCR 산물 (PCRgdm2)은 정지 코돈인 gdmM의 마지막 2 아미노산 유래 부분 및 gdmM의 상동적인 하위 부분을 포함한다. 이러한 2267 bp 단편을 SmaI로 선형화된 pUC18 내로 클로닝하고, 플라스미드 pUC18gdm2을 얻는다.

gdm2for TTTCTAGACCTTCGTAAGGCTCCCCTGCCTGGGCATGG

XbaI

(서열번호: 14)

gdm2rev TTGAATTCTCTGCTCGGCTACGGCTTCGGCGACGAGTA

EcoRI

(서열번호: 15)

440 bp, 1594 bp 및 2919 bp인 3개의 단편을 제공하는 NdeI 및 SmaI를 이용한 제한효소 절단에 의해 플라스미드 pUC18gdm2를 확인한다.

2.3 gdmM 의 프레임내 결실을 이루기 위한 플라스미드의 생성

생산물 PCRgdm1 및 PCRgdm2는 하기와 같이 하나의 단계에 따라 pKC1139 내로 클로닝된다. pKC1139를 HindII 및 EcoRI로 절단하고, 생성된 백본 단편을 HindIII/XbaI 단편에 있는 PCRgdm1 및 XbaI/EcoRI 단편에 있는 PCRgdm2로 연결하되, 단일의 세 부분으로 연결한다. 최종 플라스미드, pKC1139gdm1gdm2를 확인하기 위하여 제한효소 절단을 사용한다.

2.4 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 겔다누스 ( NRRL 3602)의 형질변환 및 gdmM 결실 변이의 선별

플라스미드 pUZ8002가 내재되어 있는 대장균 ET12567는 접합을 위한 대장균 공여균주를 생성시키기 위해 전기천공을 통해 pKC1139gdm1gdm2로 형질변환된다. 이러한 균주는 표준 방법을 사용한 접합에 의해 하이그로스코피쿠스 아종 겔다누스 (NRRL 3602)를 형질변환하는데 이용한다 (Kieser et al, (2000) Practical Streptomyces Genetics). 세균접합체 (exconjugants)를 배지 2 상에 도말하고, 28 ℃로 배양한다. 24시간 후, 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕스산을 플레이트 상에 바른다. pKC1139에 기초한 벡터들은 28 ℃에서 자기복제하고, 형질변환체들은 자기복제 플라스미드서로 pKC1139gdm1gdm2를 포함할 것이라고 기대된다. 4-7일 후, 콜로니들을 아프라마이신 (50 mg/L) 및 날리딕스산 (25 mg/L)을 포함하는 배지 2 플레이트에 부착한다. 그런 다음 플레이트를 37 ℃에서 3-4일 동안 배양시킨다 - 온도가 증가하면 플라스미드가 존재하지 않는 pKC1139는 자기복제를 멈추고, 37 ℃에서 기능하지 않는 레플리콘 및 그에 따라 아프라마이신을 이용한 지속된 선별이 상동적인 부분 중 하나를 통해 염색체 내로의 통합을 위해 선택한다. 그런 다음 콜로니들을 다시 아프라마이신 및 날리딕스산을 포함하는 배지 2 플레이트에 부착시키고, 대장균 세포가 더이상 계대배양 되지 않을 때까지 37 ℃에서 3-4일 동안 배양시킨다.

2차 재조합체를 위한 계대배양

배양한지 3-4일이 더 지난 후, 항생물질이 없는 배지 2 플레이트를 사용하여 계대배양 단계를 수행한다. 이를 위해, 각 패치에 있는 물질을 긁어내고, 배지 2 아가 플레이트에 도말하고, 37 ℃에서 충분히 성장하여 눈에 보일때까지 보통 3일 동안 배양한다. 동일한 기술을 이용하여 2, 3 및 4번째 계대배양 단계를 수행한다. 4번째 계대배양은 포자를 형성하기 위해 28 ℃에서 배양한다. 며칠 (보통 7-10일) 후에 포자형성 (sporulation)이 눈에 보이면, 포자 현탁액을 분리하고, 표준 기술을 이용하여 희석 과정 (dilution series)을 수행한다. 희석 과정의 분취액 (aliquot)을 배지 1 플레이트에 도말하고, 28 ℃에서 콜로니들이 눈에 보일때까지 배양한다. 단일 콜로니들을 채집하고, 아프라마이신이 존재 및 존재하지 않는 배지 1 플레이트에 동시에 부착한다.

항생물질이 없는 플레이트에서는 성장하지만 아프라마이신 플레이트에서는 성장하지 않는 부착물들을 항생물질 마커의 감소량 확인을 위해 +/- 아프라마이신 플레이트에 다시 부착한다. 변이된 균주는 543 아미노산의 프레임내 결실을 사용하여 비활성 GdmM 단백질을 코딩한다.

gdmM 결실 변이체들을 배지 1에 부착하고, 28 ℃에서 4일동안 생장시킨다. 각각의 부착물로부터 6 mm의 원형 플러그를 종자배지 10 mL (1 L 당 - 글루코스 40 g, 사탕무당밀 10 g, 효모 추출물 2.5 g, 펩톤 2.5 g, 트립톤 2.5 g, 오트밀 5 g)를 포함한 각각의 50 mL 팔콘 튜브에 접종하는 데 이용한다. 이러한 종자배지 배양액을 28 ℃, 1 인치 작동반경의 300 rpm 조건에서 36-72시간 동안 배양한다. 그런 다음 이들을 생산배지 (종자배지와 동일함)에 접종하고(10 ml 내에 0.5 mL), 28 ℃에서 6일동안 생장시킨다. 2차 대사체들을 추출하고 젤다나마이신 유사체의 생산물을 얻기 위해 일반적인 방법에 따라 LCMS로 분석한다. 하나의 변이체는 화합물 1을 생산하는 S. 하이그로스코피쿠스 gdmM^-를 나타내고, 이는 KOS-1806와 구별되지 않을 것으로 예상된다 (Rascher et al, 2005). 당업자는 예를 들어 라쉐르 (Rascher) (2005)에 의해 발표된 바와 같이 저항 유전자의 삽입에 의해 분열 변이를 통합 (integration)하거나 생성시킴으로써 대체가능한 gdmM 비활성 방안을 용이하게 고안할 수 있다.

실시예 3 - gdmM 이 결손된 균주 S. 하이그로스코피쿠스 gdmM ^- 에 AHBA 유사체를 공급함으로써 신규한 젤다나마이신 유사체의 생성

3.1 S. 하이그로스코피쿠스 gdmM ^- 를 이용한 생체내 변환

상기 실시예 2에 기재된바와 같이 생성된 S. 하이그로스코피쿠스 gdmM^-를 MAM 플레이트 (배지 1)에 부착시키고, 28 ℃에서 3일간 생장시킨다. 6 mm의 원형 플러그를 종자배지 10 mL (1 L 당 - 글루코스 40 g, 사탕무당밀 10 g, 효모 추출물 2.5 g, 펩톤 2.5 g, 트립톤 2.5 g, 오트밀 5 g)를 포함한 각각의 50 mL 팔콘 튜브에 접종하는 데 이용한다. 이러한 종자 배양물을 28 ℃, 1 인치 작동반경의 300 rpm으로 36-72시간동안 배양한다. 그리고 이것을 생산배지 (종자배지와 같음)에 접종 (10 mL 내에 0.5 mL)하는 데 사용하고 28 ℃에서 24 시간동안 생장시킨다. 200 mM 공급스톡용액 (메탄올 내 - 표 4 참조) 0.1 mL를 최종 공급농도가 2 mM이 되도록 각각의 팔콘 튜브에 첨가한다. 튜브를 28 ℃에서 6일 더 배양한다.

3.2 LCMS를 이용한 배양 추출물 내 신규한 젤다나마이신 유사체의 동정

실시예 3.1에 기재된 발효 추출물을 생성하고, 일반적인 방법에 따라 LCMS로 분석한다. 모든 경우에서 관찰될 것으로 예상되는 주요 안사마이신은 표 4에 나타나 있다. 상기 표 4는 균주에 공급된 치환된 벤조산 유사체, 주요 LCMS 질량 및 주요 화합물의 질량을 나타낸다. 도 3 및 4는 생산될 것으로 예상되는 화합물의 구조를 나타낸다.

LCMS에 의한 화합물의 확인

실험번호	공급된 AHBA 유사체	생성된 화합물	[M+Na]+	[M-H]-	질량
3A		14	541	517	518.3
		15	525	501	502
3B		14	541	517	518.3
		16	541	517	518
3C		14	541	517	518.3
		17	543	519	520
3D		14	541	517	518.3
		18	543	519	520
3E		14	541	517	518.3
		19	559	535	536
3F		14	541	517	518.3
		20	561	537	538
3G		14	541	517	518.3
		21	579	555	556
3H		14	541	517	518.3
		22	559	535	536
3I		14	541	517	518.3
		23	555	531	532
3J		14	541	517	518.3
		24	609	585	586
3K		14	541	517	518.3
		25	569	545	546
3L		14	541	517	518.3
		26	575	551	552
3M		14	541	517	518.3
		27	559	535	536
3N		14	541	517	518.3
		28	541	517	518
3O		14	541	517	518.3
		29	559	535	536
3P		14	541	517	518.3
		30	559	535	536
3Q		14	541	517	518.3
		31	555	531	532
3R		14	541	517	518.3
		32	543	519	520
3S		14	541	517	518.3
		33	541	517	518
3T		14	541	517	518.3
		34	559	535	536
3U		14	541	517	518.3
		35	575	551	552
3V		14	541	517	518.3
		36	559	535	536
3W		14	541	517	518.3
		37	575	551	552

실시예 4 - AHBA 생합성의 비활성을 이용한 균주의 생성

비활성화된 AHBA 합성에 관련된 유전자/들을 이용한 균주 생산의 이점은 균주 내에 자연발생하는 AHBA와의 경쟁이 덜하다는 것이다. 그러므로 치환된 벤조산 유사체를 공급하는 것은 더 효과적일 수 있으며, 또한 정제가 더 간단해질 수 있다. 아래의 방법은 Rascher et al 2005로부터 조정되었다.

4.1 플라스미드 pKC1139AHBAdel의 구축

올리고 LHS (서열번호: 16) 및 LHSrev (서열번호: 17)는 주형으로 게놈 DNA 및 KOD DNA 폴리머라제를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 겔다누스 (NRRL 3602) 유래 DNA의 ~1.65 kbp 부분을 증폭하는 데 사용한다. 5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위한 제한효소 부위가 도입되도록 각각의 올리고 내에 고안된다. 증폭된 PCR 산물 (PCR LHS)은 AHBA 생성물과 관련된 AHBA 'B' 클러스터의 왼쪽 사이드 영역을 포함한다. 이러한 ~1.65 kbp 단편을 사전에 SmaI로 절단된 pUC18 내로 클로닝하고 디인산화하여, pUC18LHS을 얻는다.

LHSfor CGCAAGCTTAGACCTCGACCACCGGTGTCTGGA

HindIII

(서열번호: 16)

LHSrev CCGTCTAGACACGATTTCCAGCGCATGGCCCA

XbaI

(서열번호 : 17)

올리고 RHSfor (서열번호: 18) 및 RHSrev (서열번호: 19)는 주형으로 게놈 DNA 및 KOD DNA 폴리머라제를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 겔다누스 (NRRL 3602) 유래 DNA의 ~0.98 kbp 부분을 증폭하는 데 사용한다. 5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위한 제한효소 부위가 도입되도록 각각의 올리고 내에 고안된다. 증폭된 PCR 산물 (PCR LHS)은 AHBA 생성물과 관련된 AHBA 'B' 클러스터의 오른쪽 사이드 영역을 포함한다. 이러한 ~0.98 kbp 단편을 사전에 SmaI로 절단된 pUC18 내로 클로닝하고 디인산화하여, pUC18LHS을 얻는다.

RHSfor TGCTCTAGACTCACCCGCTCGCCTTCGTCA

XbaI

(서열번호: 18)

RHSrev TGCGAATTCTGAGCCACCACGGCGTGTGACA

EcoRI

(서열번호: 19)

생산물 PCRLHS 및 PCRRHS를 하기와 같이 한 단계에 따라 pKC1139 내로 클로닝한다. pKC1139를 HindII 및 EcoRI로 절단하고, 생성된 백본 단편을 HindIII/XbaI 단편에 있는 PCRLHS 및 XbaI/EcoRI 단편에 있는 PCRRHS로 연결하되, 각각의 PCR 단편은 pUC18 클론으로부터 취함하고, 단일의 세 부분으로 연결한다. 제한효소 절단은 pKC1139AHBAdel를 나타내는 최종 플라스미드를 확인하는데 사용된다.

4.2 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 겔다누스 ( NRRL 3602)의 형질변환 및 AHBA 'B' 결실 변이의 선별

플라스미드 pUZ8002가 내재되어 있는 대장균 ET12567은 접합을 위한 대장균 공여균주를 생성시키기 위해 전기천공을 통해 pKC1139AHBAdel로 형질변환되었다. 이러한 균주는 접합에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 겔다누스 (NRRL 3602)의 형질변환에 이용되었다 (Kieser et al, (2000) Practical Streptomyces Genetics). 세균접합체를 배지 2 상에 도말하고, 28 ℃로 배양하였다. 24시간 후, 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕스산을 배양용기 상에 발랐다. pKC1139에 기초한 벡터들을 28 ℃에서 자기복제여서, 형질변환체들은 자기복제 플라스미드로서 pKC1139AHBAdel를 포함할 것으로 기대된다. 4-7일 후, 콜로니들을 아프라마이신 (50 mg/L) 및 날리딕스산 (25 mg/L)을 포함하는 배지 2 플레이트에 부착한다. 그런 다음 플레이트를 37 ℃에서 3-4일 동안 배양시킨다. 상동적인 조합에 의해 염색체 내로의 플라스미드 통합이 일어난다. 그런 다음 콜로니들을 다시 아프라마이신 및 날리딕스산을 포함하는 배지 2 플레이트에 부착시키고, 대장균이 더이상 계대배양하지 않을때 까지 37 ℃에서 3-4일 동안 배양시킨다.

2차 재조합체를 위한 계대배양

배양한지 3-4일이 더 지난 후, 항생물질이 없는 배지 1 플레이트을 사용하여 계대배양 단계를 수행한다. 이를 위해, 각 패치에 있는 물질을 긁어내고, 배지 1 아가 플레이트에 도말하고, 37 ℃에서 충분히 성장하여 눈에 보일때 까지 보통 3일 동안 배양한다. 동일한 기술을 이용하여 2, 3 및 4번째 계대배양 단계를 수행한다. 4번째 계대배양은 포자를 형성하기 위해 28 ℃에서 배양한다. 며칠 (보통 7-10일) 후에 포자형성이 눈에 보이면, 포자 현탁액을 분리하고 표준 기술을 이용하여 희석 과정을 수행한다. 희석 과정의 분취액을 배지 1 플레이트에 도말하고, 28 ℃에서 콜로니들이 눈에 보일때까지 배양한다. 단일 콜로니들을 채집하고, 아프라마이신이 존재 및 존재하지 않는 배지 1 플레이트에 동시에 부착한다.

항생물질이 없는 플레이트에서는 성장하지만 아프라마이신 플레이트에서는 성장하지 않는 부착물들을 항생물질 마커의 감소량 확인을 위해 +/- 아프라마이신 플레이트에 다시 부착한다. 변이된 균주는 AHBA 'B' 생합성 영역 내에 큰 결실을 포함한다.

결실 변이체들을 배지 1에 부착하고, 28 ℃에서 4일동안 성장시킨다. 각각의 부착물로부터 6 mm의 원형 플러그를 종자배지 10 mL (1 L 당 - 글루코스 40 g, 사탕무당밀 10 g, 효모 추출물 2.5 g, 펩톤 2.5 g, 트립톤 2.5 g, 오트밀 5 g)를 포함한 각각의 50 mL 팔콘 튜브에 접종하는 데 이용한다. 이러한 종자배지 배양액을 28 ℃, 1 인치 작동반경의 300 rpm 조건에서 36-72시간 동안 배양한다. 그런 다음 이들을 생산배지 (종자배지와 동일함)에 접종(10 mL 내에 0.5 mL)하고, 28 ℃에서 6일동안 생장시킨다. 2차 대사체들을 추출하고 젤다나마이신 유사체의 생산물을 얻기 위해 일반적인 방법에 따라 LCMS로 분석한다. 하나의 변이체는 S. 하이그로스코피쿠스 AHBA를 나타내고, 젤다나마이신 생성의 결핍에 의해 짐지워진다. 더 나아가, 젤다나마이신 생성은 생성물 내에 24시간 시점에 AHBA를 공급함으로써 복원된다.

실시예 5 - pKC1139AHBAdel를 이용한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 gdmM ^- 의 형질변환에 의해 비활성화된 gdmM 및 AHBA 모두를 합성하는 균주 생성

AHBA와의 경쟁을 제거함으로써 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 gdmM^-로 공급하는 것의 성공률을 증진시킬 수 있다. 따라서 실시예 4에 따른 동일한 과정을 정확히 이용하면 AHBA 'B' 결실이 본 발명의 화합물 생성을 위한 뛰어난 균주를 생성하기 위해 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 gdmM^-에서 실행된다.

플라스미드 pUZ8002가 내재되어 있는 대장균 ET12567는 접합을 위한 대장균 공여균주를 생성시키기 위해 전기천공을 통해 pKC1139AHBAdel로 형질변환된다. 이러한 균주는 표준 방법을 사용한 접합에 의해 하이그로스코피쿠스 아종 겔다누스(NRRL 3602)스의 형질변환에 이용된다(Kieser et al, (2000) Practical Streptomyces Genetics). 세균접합체를 상기 실시예 4에 따라 선별하고 2차 재조합체를 상기에 기술한바와 같이 선별한다.

최종 이중 결실 균주는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 gdmM^-AHBAB^-를 나타내고 젤다나마이신이나 젤다나마이신 생산 결핍에 의해 짐지워진다. 생산 배양물을 AHBA로 보충하면, KOS-1806 생산이 복원된다 (Rascher et al. 2005).

실시예 6 - gdmM 및 AHBA의 합성이 모두 비활성화된 균주에 공급함으로써 신규한 젤다나마이신 유사체를 생성 - 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 gdmM ^- AHBAB ^-

6.1 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 gdmM ^- AHBAB ^- 를 이용한 생체내 변환

상기 실시예 5에 기재된바와 같이 생성된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 gdmM^-AHBAB^-를 MAM 플레이트 (배지 1)에 부착하고, 28 ℃에서 3일동안 생장시킨다. 6 mm의 원형 플러그를 종자배지 10 mL (1 L 당 - 글루코스 40 g, 사탕무당밀 10 g, 효모 추출물 2.5 g, 펩톤 2.5 g, 트립톤 2.5 g, 오트밀 5 g)를 포함한 각각의 50 mL 팔콘 튜브에 접종하는 데 이용한다. 이러한 종자배지 배양액을 28 ℃, 1 인치 작동반경의 300 rpm 조건에서 36-72시간 동안 배양한다. 그런 다음 이들을 생산배지 (종자배지와 동일함)에 접종 (10 mL 내에 0.5 mL)하고, 28 ℃에서 24시간 동안 생장시킨다. 200 mM 공급스톡용액 (메탄올 내 - 표 5 참조) 0.1 mL를 최종 공급농도가 2 mM이 되도록 각각의 팔콘 튜브에 첨가한다. 튜브를 28 ℃에서 6일 더 배양한다.

6.2 LCMS를 이용한 배양 추출물에 있는 신규한 젤다나마이신 유사체의 동정

실시예 6.1에 기재된 발효 추출물을 생성하고, 일반적인 방법에 따라 LCMS로 분석한다. 모든 경우에서 관찰될 것으로 예상되는 주요 안사마이신을 표 5에 나타내었으며, 이러한 안사마이신은 공급받지 못한 발효 추출물 내에서는 발견되지 않을 것이다. 상기 표 5는 균주에 공급된 치환된 벤조산 유사체, LCMS 질량 및 화합물의 질량을 나타낸다. 도 3 및 4는 생산될 것으로 예상되는 화합물의 구조를 나타낸다.

LCMS에 의한 화합물의 확인

실험번호	공급된 AHBA 유사체	생성된 화합물	[M+Na]+	[M-H]-	질량
6A		15	525	501	502
6B		16	541	517	518
6C		17	543	519	520
6D		18	543	519	520
6E		19	559	535	536
6F		20	561	537	538
6G		21	579	555	556
6H		22	559	535	536
6I		23	555	531	532
6J		24	609	585	586
6K		25	569	545	546
6L		26	575	551	552
6M		27	559	535	536
6N		28	541	517	518
6O		29	559	535	536
6P		30	559	535	536
6Q		31	555	531	532
6R		32	543	519	520
6S		33	541	517	518
6T		34	559	535	536
6U		35	575	551	552
6V		36	559	535	536
6W		37	575	551	552

본 명세서에서 언급되는 특허 및 특허출원을 포함하는 모든 참고문헌은 가능한 한 전체적인 범위로 본 발명에 참고문헌으로서 포함된다. 명세서 및 하기 청구항까지 전체적으로, 만일 문맥상 달리 요구되지 않는다면, 단어 '포함하다', 및 '포함하는'과 같은 어미 변화 단어는, 어떠한 다른 전체적인 것, 또는 전체 또는 단계들을 이루는 단계 또는 군도 배제하지 않는 경우를 제외하고, 제시된 전체적인 것, 또는 전체를 이루는 단계 또는 군을 포함하는 것을 나타내는 것으로 이해되어질 것이다.

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sequence <220> <223> Primer <400> 7 gtcggtggac tgccctgcgc ctgatcgccc tgcgc 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggccggtggt gctgcccgag gacggggagc tgcgg 35 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 9 caccgctcgc gggggtggcg cggcgcacga cgtggctgc 39 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 10 cctcctcgga cagcgcgatc agcgccgcgc acagcgag 38 <210> 11 <211> 100588 <212> DNA <213> Actinosynnema pretiosum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(100588) <223> macbecin biosynthetic gene cluster <220> <221> gene <222> (14925)..(17909) <223> mbcRII encoding transcriptional regulator <220> <221> gene <222> (18025)..(19074) <223> mbcO encoding aminohydroquinate synthase (gene encoded by complement DNA strand) <220> <221> gene <222> (19263)..(20066) <223> mbc? encoding unknown protein function, AHBA biosynthesis (gene is encoded by the complement DNA strand) <220> <221> gene <222> 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(the gene is encoded by the complement DNA strand) <220> <221> gene <222> (72248)..(73339) <223> mbcH encoding methoxymalonyl ACP pathway (the gene is encoded by the complement DNA strand) <220> <221> gene <222> (73336)..(74493) <223> mbcI encoding methoxymalonyl ACP pathway (the gene is encoded by the complement DNA strand) <220> <221> gene <222> (74490)..(74765) <223> mbcJ encoding methoxymalonyl ACP pathway function (the gene is encoded by the complement DNA strand) <220> <221> gene <222> (74762)..(75628) <223> mbcK encoding methoxymalonyl ACP pathway function (the gene is encoded by the complement DNA strand) <220> <221> gene <222> (75881)..(76537) <223> mbcG encoding methoxymalonyl ACP pathway function <220> <221> gene <222> (76534)..(77802) <223> mbcP encoding C4,5 monooxygenase function <220> <221> gene <222> (77831)..(79054) <223> mbcP450 encoding P450 function <220> <221> gene <222> (79119)..(79934) <223> mbcMT1 encoding O-methyltransferase function <220> <221> gene <222> (79931)..(80716) <223> mbcMT2 encoding O-methyltransferase function <400> 11 gatctggggc gacgagccgc ccgccgggcc ggggccggcg ttgcaggcgc tcgtctcccg 60 gctgcggcgg gcgctcggcg cgccgggcgc ggtcgcgctg ggggtgggcg ggtaccggct 120 cgtggcggac gtggacgcgg cgcggttcga ggagctggcc gcgcggggcg gggaggacgc 180 gctgcgggag gccgccgcgc tgtggggcgg gcgggtcggg ggcgagccgc cggtggtcgc 240 ggccgtcgcg ccgcgggtgg cgacccggct ggcgcggctg tcggtggagg tggtgctgga 300 cctggcggag gtcgagctgg cgctcgggcg caccggggcg gccatcggtg gggcgagcgg 360 ggtgctggcc gagcacccgg cgcacgagcg ggccgccggg gtgctggtgg acgcgctcgc 420 gggcgcggga cggcaggccg aggcgctggc ggcctacgag cgggtccgcg cggcgctggc 480 cgacgagctg ggcgccgacc ccggcacggc cctgcgcgag cgccacctgc ggctgctgcg 540 cgccaccccg ccaccgctcc cccggccgaa cgcgctgccc gcgccggtga cgggcttcct 600 cggccgggac gccgacctcg cccgcgtcgc cgacctgctg gccgccgggc ggctggtcac 660 cgtcgtcggg cccggcgggg tgggcaagac ccggctggcc gtggaggcgc tgcgccggga 720 ccgggacgcg ctgctggtgg acctcgcgcc ggtcgccgag ccctcggagg tcgtcgccgc 780 cgtgctcgcc gggatcgggc tgcgcggcga ccgcgaccgg ccgggcgggg acgcgacggc 840 gctgctggcc gccgagctgg cggcgcgcag gtcggtgctg ctgctggaca actgcgagca 900 cctggtcgac gccgtggccc acctggtcgc gctcctgctc ccccgctgcc ccgagctgcg 960 cgtgctcgcc accagccggg aacccctggc ggtcgacggg gaggcgctgg tcccgctggg 1020 gccgctcgcg ctgcccggaa tcggggacgg gcttgacgcc gcggtcggca cggcctcggt 1080 gcggttgttc gcccaacggg cgtcggcggt gcgccccggt ttcgccgtcg acgccacgac 1140 gctgccggac gtggtgcgcc tggtgcgggc gctggacggg ctgccgctgg cgctggagct 1200 ggccgccgcc cggttgcgcg ccctgccgct gcccgacctg gtggccgggt tgtcggcgcg 1260 gttccgcctg ctggcgggcg ggaaccgggc cgcgccgccc cggcaccgca cgctgcgcgc 1320 ggtgatcgcg tggagctggg acctgctgga cgggcccgag cgggccgtgg ccgagcggat 1380 ctccgtgctg cccggcgggg tcaccccgga gtcggccgcc gccgtctgcg cgggcgccgt 1440 gcccgccgac gaggtgcccg aactgctggc cgcgctggtc gaccggtcgc tgctgagcct 1500 ggtcgggggt cggcggcgga tgctggagac ggtgcgcgcg tacggggtcg agcgcctggc 1560 cgccgccggg gacttgagcg cggtccgcga cctggccgcc gcgcacgtgg cgggggtgct 1620 ggcggggcag gacgcggtgc tgcgcgggcc ggggcagcgc gcggcggtgg cggcgatcgg 1680 cgcggagcac gacaacgcgg tggccgcgct gcaccaccgg tgcgccaccg gggacgcgga 1740 cggggcgctc gcgctggcgc tgtcgctggt ctggtactgg caggtgttcg gccgccagtc 1800 cgagggcgcg cactggctcg ggcgggcgct ggcggtgccc ggcgggccgt ccccggagcg 1860 ggactgcgcg cgggccgccc acctgctcgg cctggccgac ggcgggcacg gggtgggtga 1920 tcgcggggag gtgggggcgc tcgcggaccg ggtgctggcg caccgggggc tccccggtca 1980 cctgcgggtg ctcggggcgg tcctgctgtt cctgctgggg cgcggcgagg gggtgttccg 2040 ggagctgggc gcgggcggcg ggtggttgtc cgggctggcg cacctgttcc tggccgagct 2100 ggcggagaac gcgggcgagc tggaccgggc gcgcgggcac gcggaggtgt ccctggaccg 2160 gttccgggcg gccggggacg ggtggggcgt ggcgggggtg ctgccggtgc gggcgcgggc 2220 gcggcggtac gacgacctgg acgggacgtg ggcggacctt cgggaggcgc gggcgctgga 2280 gggggagttc ggggcgctga gccccggtga ccgggtgcgg gcggacctgc ggtgggtcga 2340 cctgcacgag cggcgcggtg acagcggggc ggcgctggag gtgctggccg cggcccgtgc 2400 tcggggggag caggtcgcgg tggtggacgc gcgggaggcc gcgctgcggg tgcggctcgg 2460 ggacctgggg cgggcgggtg agctgctggc cggggtgggt ggggcggtgg gcgacctggc 2520 gcgggccgcg tatcgggtgg cctcggggga cctggcgggt gcggagcggg cgttgcggcg 2580 ggcgcgggtg gtggcggctg cgagcgggga gctgcccgcg ctggccccgg tggcggtggg 2640 ggcggcggcg ctggagcagg cgcgggggcg gtgggcgggg tcgggggtgc tgctcgggac 2700 ggccgcgcgg gtgcggggcg cgcacgaccg caccgacccc ctggtgcgcg agctggtcga 2760 ccgggggcgg gcggcggtgg gcgggagcgc gttcgcggcg gcgtacgcgc gggggtggga 2820 ggcggagcgg gacgtggcgg cggcgttcgt gctctgagcg ccgggatcgg gcgggcgggg 2880 tcaggcgggc ggggtcatgt gggcggggtc aggcgggcca ggtcacacgt ccagggaccc 2940 cgcccagtcc gcgatcgtcc ggacttcggc ctgcgtcggg aagaccttct cggtgagcac 3000 gcggtgcacc tcggggtcgc cgtccaggca gccgtcggcc aggacggtga gctggaagtc 3060 caggtcggcg gcctggcgga gggtggacag gaccacgccg ctggtcgcga tgccggtgag 3120 caccaggtgg tcgacgccct gggcgcgcag gacgaggtcc aggtcgctgc ccgcgaacgc 3180 gctgacgcgg cgcttggtca ccaccacctc gtcgtcgagc ggcgcggtct cggggtggaa 3240 gtcggtggcg ccggagcccc tgggggccgc ggccaggcgg ccgaacatct tgttgcgcgg 3300 gtggatctcc gcgtagtcgg ggcggaagcc gacgccgacg tggatcaccg gcacggacgc 3360 ggcgcgggcc gcctcgagcg cggtggcgag cctggggagg taggccgggt cggggtagcg 3420 ggcgaccacg gcgggctgga cgtccatcac cagcagggcg ggggtgggga tctcgggcct 3480 cgtttcggtg gtggcggcgc gggggccgcc ggtgggggtc aggggtgcgg gggtgccggg 3540 gtgagcaggc tggtgacggt gagcaggcgg tcggcgagtt cctcggggcg cagcgggtcc 3600 tcggcgcgca cgacccagtc gtggacgatc gcgccggtgc cgtgggagat cagcacggcc 3660 aggtcgcggg cggcccgctc gtccacctcg cccaggccgg cgcgcagggc ctcggtggtg 3720 atgagggtgc ggaagagctc ggccagggcc tccgccagcc gccacgcgca cgggccggtg 3780 agcacggcgc ggtagaaggg gcggtggtcg gcgaagtggc gggccacggc caggaggcgg 3840 gcgtggcgcg gggcccgcgg gtcggccagg tgcggcagga gctcgcgccg caccaggtcc 3900 gccgcagcgg cgacgaggag cgtgtcgcgg tcgccgaagt gctggtagag cagctgcctg 3960 ctgacgtcgg cggcctcggc caggtcggtc accgggaccg ccgccccgcg ctcggcgacc 4020 aggtcgacgg cggcggccat gagggcggcc ctggagcggg cgacccggcg gtcggggcgg 4080 gtggtcacgg gggtgaaact agacagttgt caataaatga gcaagtgtcg tcgaacgcgc 4140 gcgcgggaat ctccggtgcg cggggcccgt ccctggcagc atgatcacgc gatgaccgag 4200 gtgaggacgc gcccgtacgc cgggcccgcg gacctgcgcg cgatgcaggg gttggcgcgg 4260 cggatctgga cgccgtcgag ccggtggcac gtcggcgacc tggcctggca gcgcaaccag 4320 cacaccgggc gcgaggccga gtggccgacc gcgctgtggg aggcgggcgg cgaggtggtg 4380 gcgtgggggt gggccgagct gccgggtgag ctggcgctgc tggtcgaccc cgcccggccg 4440 gagcttgcgg gggcggtgct cgactggttc gcgggcgtgg ccaccgcgcc ccggcggtcg 4500 gtcaccgtgc tggacgccga accgcacctg gtcgccgcgc tggaggctcg cgggtacgag 4560 cggctgggcg ggccgcactt ccggcactcg gtgcgcgcgc tggacgacct gccgacgccc 4620 gaactgcccg ccgggtaccg ggtccgcgcc gtgcggggcg aggaggacgt ggcggcgcgg 4680 gtcgcggcgc accgggcggc ctggtggccg tcgcgggtca ccgaggagag ctaccgggcg 4740 gtgatggggg cgtggccgta ccggccgggg ctggactggg tggtggaggg gccggacggg 4800 cggttcgcgg ccacctgcct gatctggttc gacgagcgca acggcgtggg cgagctggaa 4860 ccggtcgggg tcgaccccgg tctgcggcgg cgcgggctgg ggcgggcggt gtgcctggcg 4920 gcgctgggcg cgctgcgcga ggcgggcggg cgggcggcgg tggtgtaccc gctgcacggg 4980 caccccgacc accccgcgcc cgcgccgctg taccgggggc tggggttccg cgagcacgcc 5040 cgcacgatca ccttcaccgc gctggaggcg cgcgggtagc agcggccggg cggggcgagc 5100 ggacccggtc gacgagcggc tccgctgtcg gagcggtcgt cccagcgcgt ggacaccagt 5160 gccacgacca gaccgcgccc cgcttcgcgt ggtcggctcg ggggtcgacc gcggtgaggc 5220 tctcgccggg gtgggtgaac cacgtcctgg cgatggcctg caccgcgagc accgggtgcc 5280 gcccgtggcg ctggacgtca ccgacgcagc cgccgtcgac cgggccgggc cggccgcgtt 5340 cggccgttgc gccgcgccgg ccgagtccga cgccaggtgg cggccggtcc ccgggtccgc 5400 ctggaactga ccccgccggc ctccccgccc gcccgtccgg ccgggcgccg aacccgcctc 5460 aggcgtgctc gaccgcgcgc accgatcccc ccaccaccac cggcatcggg acgtggtgca 5520 cggtcgtcgg gctgcggtcg cggcgggggc gggacaggag gagttccacg gccatcgcgc 5580 ccaggcggtg gtgcggcagg gcgacggtgg tcaggcgcgg gcgcatccag gcggccacgg 5640 ggtggtcgtc gaagccgacc acggagacgt cgtccggcac ggacaggccc gcctccgcga 5700 gcgcctggca cgcgccgaac gccaggcggt cgttgaagca cagcagcgcg cgagggcggt 5760 ggtgggacag gaggtccagg gtggcgcggt agccgttctc cggcatccac tccacgcacg 5820 ggcgcacgct ctccacctcc acccccgccg ccgcgaaggt ctccagcgcg ccggagaggc 5880 gggccacggc ggcgatgtgg cgcgggtcga tcgcctcggc cgtgggcccg gtgccgatca 5940 ggtgcacgcc ctcgcggtgc ccggcgtcga gcagcacgcg cgccgccgaa cggccgccgc 6000 cgcggtcgtc ggggagcacg gcgtgcgcgg ggaagtcgtt ggcgggcagc acgttcagca 6060 gcacggacgg cccgtcgcgc agcccgtccg ggacctccag cagccggggg aacctggccg 6120 cgaagaccac gccctccacc tggcgggcgc gcagcgaggc caccagcgcc gcctccacct 6180 cgcggtcgcc gccgctctca ccggcgaaca gggtgaaccc gtgccggtgg gcggcgccga 6240 ccgcgccctc gatcagctca ccggacagct tggccgaggc cacggcgtcc gagacgaaac 6300 cgagggtctt ggtgcgggag gcggacagca gcgtgtcgcg gcggtagccg agctgctcgg 6360 ccgtcgcccg caccttgcgc tccaccgccg ccgagatgcg cagctcccga gcgcggccgg 6420 agagcaccag ggaggcggtg ggcaccgaca cggcgcaggc ggacgcgacg tcggccagcg 6480 tgacgcgcgt ccgcccgctc tcgcggacac ctgctcgcgg gggtgtgccc gtcacccgtg 6540 cctcccgtca ccggtcgcgc gacagccccg cgcgaggtcc taccccatcg tgcaggccgc 6600 gccgttcaag gagaaccccg aaggtggggc cgcgtccccg ccgtgggtga cctggtagcc 6660 gatgctgact ttgccaccgg gtgggatcgc cgcgttgtag cccgcgtcgc gggcggtcac 6720 ccggcccgag ctgggcgcgt acgaggcgtt ccagccggag gtgatcacct ggcccgcggg 6780 cagcgcgaac tccagcgacc agccctgcac ctgcgtggtc ccggtgttgg tgatggcgag 6840 ctccgccgtc aggccgttgc cccaggcgtt gacggtggcc gacacccggc aggcccccgg 6900 ctgcggttcg ccgggcgtgg tggtggtggt ggtggtggtg gtcgtggtcg tggtggtgct 6960 ggtcgggtcg gggccggttc cggcgaactg ggtgaagaac cgccaggtct cctcgggcgc 7020 ccacgtcctg gtgccgctgt cgccgggcgc gttgtcctgc ggtgcggcga tgtggccctc 7080 gtcgaacgcg acccagcgca ccgggtagcc gtcgcggcag ccggtgtagg tggtgccccg 7140 gtgggtcagg ctgccctggg acggttccgg cgggttctgc gcggcgcagc cgttgttgcg 7200 cacgaaccgg tcgcgcatcg agcgcccgcc ggagatgttc aggacgctgt cgcgcaggcc 7260 gtggatgccg aggtaggcga tgggctgcgt gccgccggcg cagccgctga gcacgccgcc 7320 cgcgatgacc gcgaccgcgc ggaacaccgt cggccgcgag caggccaccg agtaggacat 7380 cgcgccgccg tagctgaagc cggtggcgaa ccgctgggtg gtgtccacgc acagcccggc 7440 gtcgagctgg cggacgatgt cgtcgacgag ggtgatgtcc tcgccgccgt tgttggccca 7500 gccgttgttg aagccctgcg gcgccacgaa gatcgtgctg ctgcccgcca ggcgcttgag 7560 gccgtagtag gaccagacgt cccgctgcac ggtctggccg gtggcgacgt cgttcgcggt 7620 gccgctgagc cagtggaagc cgaagacgac gcggtggggg cggttccggt cgtagccgtc 7680 cgggatcgac aggatgtagg tgcgggactt gccgctgctg gtgatcgtgc gcgtgccgct 7740 ggtgagcgcg ggcgccttgc cgcagccctc cgtcgtggcg gacgcgccgg gggcgccgga 7800 cgcgccgggc gctccggtcg cgctggtggt gatcagcccc gcggcgaggg tgagcagcgc 7860 gatgcccgct gccgcgagga ccctgttgcg cgccaaggga ttcgcccttc ctgtggtggt 7920 tccggtgggt gtggtcacgg ggtggtgagg tcgaagcggc gggcggtgac ggagccgccg 7980 agcgcggcgg tggcgtggtt gaagacggcg aagcggtagc ccatgaagaa ccgccagtcg 8040 ttcttgagcg tgaacgccgg gccgaaggcg gtgaagttga cgccgtcggt gctgtaggag 8100 aaccgggcct gcctgccgtt gccggggcgg atgtcggcgt tggcgcgcaa ccagatccgg 8160 gagccgccca ggtcggcgct cgcgacctcg tagccggttc cggtggtgcg ccaggagccg 8220 tccatggtca ggccggtgac ggagacgatc cggttgcggc cgttgtcgcg cttgacgccg 8280 atccacgccg aggagtcgcg cagcacggcc agcccggtgc ggtcgccgtc gcgcatcccc 8340 gacaggtcca gttccacggt gccggtggag gtggggccct ggatgcggtg ggtgagggtg 8400 ttgcgggcgg agtacaggtc gttggtgacg gtcgcggtgg acaggcgaag gccgttgttc 8460 acgctgtact tggcggtgtc cgggttgtgg ttccactccc actgcgggcc gagcgcggcg 8520 ccggagaagg tgtcggcgcc gatcatgggt ttgacctggc gcgggggcgc gggcaggttc 8580 ggcttcgggt aggtcgcgcc ccagccgccg ttgacggtgg tgacgcgcgg ccagccgtcc 8640 gaggtccagg tgatcggggc gagcaccggc acgcgcccgc cggggtaggc gtcgacgaac 8700 gccaggtagt gccagtcgcc gttctgggtc tgcaccaggc cgccctggtg cggcactccc 8760 ccgccctgga tcggcgaggg caggtcgagc agcacctgct ggatcgagta cgggccgaac 8820 gggctggacg acttgagcac gtactggccg ttcgcgggcc tggtgagcca gatgtagtag 8880 ttgccgccgc gcttgtagaa gcgcgcccct tcgagggtgc cgatgttcga gggggtctgg 8940 aacacctgct gggagcggac ctccgacttc ccgtcggcgg agagctgggc gacgctgatg 9000 ctggtgttgc cgtaggcgac gtacagggtg tcgtcgtcgt ccacgagcat cccggcgtcg 9060 tagtagcact tgttgatggt ggtgtgcttg gaccactggc cgtcgacggc ggtcgcggtg 9120 tacaggtgcg tctgggcgaa gtcgacgcag ccgccccagt agaaggtgcg gttgctcttg 9180 cggtgcgcca 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tcggtgatcg tgctgaccgc gctgctggtg tgcctgatcc ccaccacgat cggcgcgctg 95580 ctgtccgcga tcggcatcgc gggcatggac cgcctggtgc agcgcaacgt gctggccacc 95640 tcgggccgcg ccgtcgaggc ggccggtgac gtggacacgc tgctgctgga caagaccggc 95700 accatcacct ggggcaaccg ccgcgccacc gagctgatcc ccgcgcccgg cgtcacgctg 95760 gacgagctgg tggacgccgc ccggttgtcg tcgctggccg acggcacccc cgagggccgc 95820 agcgtggtcg agctgtgcgc gaccgggcac ggccgctccc ccgagcccac cgacgcggag 95880 aagaccggcg agttcgtgcc gttcaccgcc cagacccgga tgagcggcat cgacctggac 95940 ggccgcagcg tccgcaaggg cgccgcgacc gcgttcaccc tcaccgactc ggtcaagtcc 96000 acggtggacg agatcagcgg cgacggcggc accccgctgg tggtcgccga cggcgagcgg 96060 gtgctcggcg tgatccggct gtccgacgtg gtcaagcccg gcatgaagga gcggttcgcc 96120 gagctgcgcg ccatgggcat ccgcacggtc atggtcaccg gcgacaaccc gctgaccgcc 96180 agggcgatcg cggccgaggc gggggtcgac gactacctcg ccgaggccaa gcccgaggac 96240 aagatggccc tgatccgcaa ggagcaggag ggcggcaagc tggtcgcgat gaccggcgac 96300 ggcaccaacg acgcgccggc gctggcccag tccgacgtgg gcgtggccat 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gtacgcggcg atccaggtgc 97200 cgcgcgtggc gcgggagcgc ggggtgtcgg aggacgccgt gcgggcgctg gtcgccgagg 97260 cgtcggtggg ccgctcgctc gggttcgtgg gcgagccggg cgtcaacgtc accgccctca 97320 accgggccgt cgacgcggcg gagtgagacc gaccgggggc cgtcctcgcg gcggcccccg 97380 gtcttcccca tttctctgat ctcgggagcg ggcgggaccg tggacaagcg caagcgcggc 97440 gaactgcgca tctacctggg cgcggcgccg ggcgtcggca agaccttcgc gatgctcggc 97500 gaggcgcacc gccgccgggg gcgcggcgcg gacgtcgtcg tcgccctggt cgagacgcac 97560 ggccgcgagc gcaccgccac catggtcgac ggcctggagg tgctgccccg caaggaggtc 97620 cagcaccggg ggaccacgat caccgagatg gacgtggacg cggtgctggc ccgcgcgccc 97680 gagatcgccg tggtggacga gctggcgcac accaacgccc ccggctcccg caacgccaag 97740 cgctggcagg acgtcgagga gctgctggac gccggcatcg acgtgctgtc cacgctcaac 97800 atccagcacc tggagtcgct caacgacgtg gtgcgccgca tcacccgcgt cgagcagcgc 97860 gagaccatcc ccgacgaggt ggtgcgccgc gccgagcagg tggagctggt cgacctgacc 97920 ccggaggcgc tgcgccgccg cctggcgcac ggcaacgtct acgccgcgca caagatcgac 97980 gccgcgctgg gcaactactt ccgggtcggg aacctgaccg cgctgcgcga gctggcgctg 98040 ctgtgggtgg ccgaccaggt ggacgtggcg ctccagcggt accgcaccga gcagcgcatc 98100 accgacacct gggaggcccg cgagcgggtc gtggtcgcgg tgaccggcgg cgcggagagc 98160 gagaccctga tccgcagggc ccgccgcatc gccgcgcgcg ccggggcgga gctgctggtg 98220 gtgcacacca tgcgcggcga cggcctcgcg ggttccgcgc cggagtcgat ccggacccgc 98280 gtcgggctca ggtgctcgac ggtgctcttc aacgtggtct cctcgtaacg ggacgtgcgg 98340 aacaccccgc agcgcccagg gtcgggcggc tgacgggatt cgcctgagtc taggcgaggc 98400 cgcccccggc cggggtggca ccccgcgacc gggtggttca cgtgcgggtg cgcgcgcccg 98460 gcgcggcgcg cgcggtgcga gaggtgggcc gtccggcggc gcgcggtttt ccgacatggc 98520 gcgcgcacga aatagttttc ggcgggtcgg gcgccgtcga atcgactcgg ggtcgggttt 98580 tccgcgccac cccggaagcg gacgaaccgg gcgggcgaac cgggcgggcg gtgcgcggac 98640 aacgggcgcg accgccgcgg tgcgccggtt tgggcagcct ttaccgccct ccaggtcacc 98700 cattccgccg ttgcggggaa catccgcgta ccagtggccc ccggcggaca cgcggcccag 98760 cacccgctag gccgttcgca ggacgtcgtg gtgcaccggg agcgtgaaac cgaacgtaac 98820 cggacagcgg cgggctcaag 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cgtgataggc agcgcccaga gcctcaccga ctaccggctc ttacccctga 99720 tcgagtacat gtgctggcgc tacccgagcg tccagatctc gctgcactcg cgaacaaccc 99780 ggtcgaacct ggccgccgtg cgcgagggca ggttggactg cgcgttcttc atcggcccgg 99840 tcgagcagcg ggacggtctg gagacgacgg tgctgtgccc cgaaccgctg gtgatggtcg 99900 cgggccccgg ccacgcgctg gcgcggtcgg gcgcggtcac cgaggcggac ctgcggggca 99960 gcacgctggt cagggccgag aacggggcga gctaccacga gcagttcgag cgggcgctcg 100020 ggctgcacga ggccgagtcg cgatcgccgg tgctggccct ggactcggtc gacgcggcca 100080 agcgggcggt cgcctcgggg ctgggcatct cgctggtgcc ggaggtcacg gtcgccgcgg 100140 agctggcgga cggcaggctc agccgcatcg gctggacccc gccgttccgg gtgttcaccc 100200 agttcgcgtg gcgccaggac aactcggcga acccgtcggt gaccgcgctg gtctcggcgg 100260 cggcgcaggt ggtgagcgag caggtggccg cgacacccgc gtagggcgtc gacgtgcagg 100320 gtcgtggatg cggagcggcc ccctcgtgct gcgcagaggg ggccgagacc gtcggggcga 100380 caggatttga acctgcgacc ccccgctccc aaagcgggtg cgctaccaaa ctgcgccacg 100440 ccccggtcac caggagctta gcgcgacgcg ctaagctgtt ttcagcaccc acccggtggg 100500 cgctgcgcgg gtgtagctca atggtagagc cccagccttc caagctggtc atgcgggttc 100560 gattcccgtc acccgctcca ccagatcc 100588 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 12 ttaagcttgg accggcgcga actcgcggac acccacct 38 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 13 tttctagagg tcatgcgccc gccaggatca ggtcgacc 38 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 14 tttctagacc ttcgtaaggc tcccctgcct gggcatgg 38 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 15 ttgaattctc tgctcggcta cggcttcggc gacgagta 38 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 16 cgcaagctta gacctcgacc accggtgtct gga 33 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 17 ccgtctagac acgatttcca gcgcatggcc ca 32 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 18 tgctctagac tcacccgctc gccttcgtca 30 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 19 tgcgaattct gagccaccac ggcgtgtgac a 31

Claims (99)

1. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:

   [화학식 (I)]

   

   상기 식에서,

   R₁은 H, OH, OMe이고;

   R₂는 H 또는 Me이며;

   R₃은 H 또는 CONH₂이고;

   R₄ 및 R₅는 둘다 H이거나 또는 함께 하나의 결합을 형성하며 (즉, C4와 C5는 이중 결합으로 연결됨);

   R₆은 H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF₃, CH₃, SH, CH₂CH₃ 또는 NR_1OaR_11a이고;

   R₇은 H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF₃, CH₃, SH, CH₂CH₃ 또는 NR_1ObR_11b이며;

   R₈은 H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF₃, CH₃, SH, CH₂CH₃ 또는 NR_1OcR_11c이고;

   R₉는 H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF₃, CH₃, SH, CH₂CH₃ 또는 NR_1OdR_11d이며;

   R_10a, R_11a, R_10b, R_11b, R_10c, R_11c, R_10d 및 R_11d는 각각 독립적으로 H, CH₃ 또는 CH₂CH₃이고;

   단 여기서:

   (i) 상기 R₆이 H이고, R₇은 OH이며, R₈은 OH인 경우, R₉는 H가 아니고;

   (ii) 상기 R₇이 OH이고, R₈은 H이며, R₉는 H인경우, R₆은 H, OH 또는 OMe가 아니며;

   (iii) 상기 R₇이 OMe이고, R₈은 H이며, R₉는 H인 경우, R₆은 OMe가 아니다.
2. 제1항에 있어서,

   (iv) 상기 R₆이 H, OH 또는 OMe이고, R₇은 H이며, R₈은 H인 경우, R₉는 OH, Cl 또는 NH₂가 아니며;

   (v) 상기 R₆이 H, OH 또는 OMe이고, R₈은 H이며, R₉는 H인 경우, R₇은 NH₂가 아닌 화합물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   (vi) 상기 R₆이 H 또는 OH인 경우, R₇, R₈ 및 R₉는 모두 H가 아닌 화합물.
4. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (IA)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:

   [화학식 (IA)]

   

   상기 식에서,

   R₁은 H, OH 및 OMe이고;

   R₂는 H 또는 Me이며;

   R₃은 H 또는 CONH₂이고;

   R₄ 및 R₅ 는 둘다 H이거나 또는 함께 하나의 결합을 형성하고 (즉, C4와 C5는 이중 결합으로 연결됨);

   R₆은 H, OH, OMe 또는 F이고;

   R₇은 H 또는 F이며;

   R₈은 H 또는 F이고;

   R₉는 H이다.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁은 H인 화합물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁은 OH인 화합물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₂는 H인 화합물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₃은 CONH₂인 화합물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₄ 및 R₅는 함께 하나의 결합을 형성하는 것인 화합물.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₄ 및 R₅는 각각 H인 화합물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₆, R₇ 및 R₈이 모두 H는 아닌 화합물.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₆, R₇ 및 R₈은 모두 H인 화합물.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁이 H이고, R₂는 H이고, R₃은 CONH₂이며, R₄ 및 R₅는 H이고, R₆은 H이며, R₇은 H인 경우, R₈은 H가 아닌 화합물.
14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H인 화합물.
15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H인 화합물.
16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₆은 H 또는 F인 화합물.
17. 제1항 내지 제10항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₇은 H 또는 F인 화합물.
18. 제1항 내지 제10항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₇은 OH인 화합물.
19. 제1항 내지 제10항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₈은 H 또는 F인 화합물.
20. 제1항 내지 제10항 및 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₉는 H인 화합물.
21. 제1항 내지 제10항 및 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R_1Oa, R_11a, R_10b, R_11b, R_10c, R_11c, R_10d 및 R_11d는 H인 화합물.
22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃ 는 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 OH인 화합물.
23. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄, R₅, R₆, R₇ 및 R₈은 각각 H인 화합물.
24. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 OH이고, R₇ 및 R₈은 각각 H인 화합물.
25. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 F이고, R₇ 및 R₈은 각각 H인 화합물.
26. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 F이고, R₇ 및 R₈은 각각 H인 화합물.
27. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 H이고, R₇은 F이며, R₈은 H인 화합물.
28. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 OH이고, R₇은 F이며, R₈은 H인 화합물.
29. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆은 H이고, R₇은 F이며, R₈은 H인 화합물.
30. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆ 및 R₇은 각각 F이고, R₈은 H인 화합물.
31. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 OH이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆ 및 R₇은 각각 F이고, R₈은 H인 화합물.
32. 제4항에 있어서, 상기 R₁은 H이고, R₂는 H이며, R₃은 CONH₂이고, R₄ 및 R₅는 각각 H이며, R₆, R₇ 및 R₈은 각각 F인 화합물.
33. 제4항에 있어서, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.

    
34. 제4항에 있어서, 하기 화학식 중에서 선택된 어느 하나의 화합물 및 이들 중 어느 하나의 약제학적으로 허용가능한 염.

    

    

    

    
35. 제1항에 있어서, 하기 화학식 중에서 선택된 어느 하나의 화합물 및 이들 중 어느 하나의 약제학적으로 허용가능한 염.

    

    
36. 제1항에 있어서, 하기 화학식 중에서 선택된 어느 하나의 화합물 및 이들 중 어느 하나의 약제학적으로 허용가능한 염.

    

    

    

    

    
37. 제1항에 있어서, 도 4에 나타낸 화합물 28, 29, 30, 31, 32, 36 및 37 중에서 선택된 어느 하나의 화합물 및 이들 중 어느 하나의 약제학적으로 허용가능한 염.
38. 하기의 단계를 포함하는 안사마이신 유사체 (ansamycin analogue)의 제조 방법:

    (a) 적절한 조건에서 배양시 안사마이신 또는 그의 유사체를 생산하는 균주 (strain)를 제공하는 단계;

    (b) AHBA가 아닌 스타터 유닛 (starter unit)을 상기 균주에 공급하여, 스타터 유닛을 상기 안사마이신 유사체로 도입시키는단계;

    (c) 상기 균주를 안사마이신 유사체의 생산을 위한 적절한 조건에서 배양하는 단계; 및

    (d) 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.
39. 제38항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 공급되는 스타터 유닛은 3-아미노벤조산이 아닌 방법.
40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 공급되는 스타터 유닛은 3,5-디아미노벤조산, 3-아미노-4-하이드록시벤조산 또는 3-아미노-4-클로로벤조산 이 아닌 방법.
41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 하나 또는 그 이상의 AHBA 생합성 유전자가 결실되거나 비활성화된 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 AHBA 생합성 효율이 낮아지도록 돌연변이된 균주인 방법.
43. 제38항 내지 제40항 또는 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 조건은 AHBA 생합성 효율이 준최적 (sub-optimal)이 되도록 하는 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 AHBA가 공급된 인공적인 (non-natural) 스타터 유닛의 도입을 허용하는 수준까지는 상기 균주에 의해 제조되는 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 공급된 인공적인 스타터 유닛의 도입양은 20%를 초과하고, 바람직하게는 도입된 총 스타터 유닛의 50%를 초과하는 방법.
46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스타터 유닛은 하기 화학식 (II) 또는 상기 산 모이어티가 유도체화된 이의 유사체로부터 선택되는 방법:

    [화학식 (II)]

    

    상기 식에서, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같다.
47. 제46항에 있어서, 상기 R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 모두 H가 아닌 방법.
48. 제46항에 있어서, 상기 R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 모두 H인 방법.
49. 제38항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 안사마이신 생산 균주이고, 상기 스타터 유닛이 선택되어, 상기 균주가 18,21-디데스옥시안사마이신 유사체를 제조하는 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 스타터 유닛이 선택되어, 상기 균주가 선택적으로 플루오르 (fluorine)로 치환된 18,21-디데스옥시안사마이신 유사체를 제조하는 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 스타터 유닛이 선택되어, 상기 균주가 플루오르로 치환된 18,21-디데스옥시안사마이신 유사체를 제조하는 방법.
52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 안사마이신 생산 균주이고, 상기 스타터 유닛이 선택되어, 상기 균주가 벤젠고리의 18번 또는 21번 위치가 치환되지 않은 안사마이신 유사체를 제조하는 방법.
53. 제38항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 (d) 단계의 생성물에 화학적 변형과정이나 생체내 변환과정을 가하는 단계 및 상기 단계에서 생성된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계를 추가로 포함하거나 또는 (ii) 상기 (d) 단계 이전에 상기 (c) 단계의 생성물에 화학적 변형과정이나 생체내 변환과정을 추가로 포함하는 방법.
54. 하기의 방법을 포함하는 안사마이신 유사체의 제조 방법:

    (a) 선택적으로 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화 및/또는 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛의 생합성 유전자가 결실되거나 비활성화된, 적절한 조건에서 배양시 안사마이신 또는 그의 유사체를 생산하는 제 1 숙주 균주를 제공하는 단계;

    (b) 상기 균주에 인공적인 스타터 유닛을 공급하는 단계;

    (c) 안사마이신 유사체의 제조를 위한 적절한 조건에서 상기 변형된 숙주 균주를 배양하는 단계; 및

    (d) 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.
55. 제54항에 있어서, 상기 스타터 유닛은 3,5-디아미노벤조산, 3-아미노-4-하이드록시벤조산 또는 3-아미노-4-클로로벤조산이 아닌 방법.
56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 스타터 유닛은 3-아미노벤조산이 아닌 방법.
57. 제38항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공급된 스타터 유닛은 스타터 산인 방법.
58. 제38항 내지 제57항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 안사마이신 유사체.
59. 제1항 내지 제37항 및 제58항 중 어느 한 항에 따른 안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과, 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
60. 의약으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제37항 및 제58항 중 어느 한 항에 따른 안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
61. 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균 감염, 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역 질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전치료 (pretreatment)용 의약 제조를 위한, 제1항 내지 제37항 및 제58항 중 어느 한 항에 따른 안사마이신 유사체 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도.
62. 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균 감염, 중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역 질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전치료의 의약으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제37항 및 제58항 중 어느 한 항에 따른 안사마이신 유사체 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
63. 제1항 내지 제37항 및 제58항 중 어느 한 항에 따른 안사마이신 유사체 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 치료적으로 유효한 양으로 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균 감염, 중추신 경계 질환 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역 질환의 치료 또는 암의 예방적 전치료 방법.
64. 상기 안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 다른 치료와 병용하여 투여되는 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 조성물, 용도 또는 방법.
65. 제 64항에 있어서, 상기 다른 치료가 블레오마이신 (bleomycin), 카페시타빈 (capecitabine), 시스플라틴 (cisplatin), 사이타라빈 (cytarabine), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 독소루비신 (doxorubicin), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 젬시타빈 (gemcitabine), 류코보린 (leucovorin), 메토트렉사이트 (methotrexate), 미토잔톤 (mitoxantone), 파클리탁셀 (paclitaxel)과 도세탁셀 (docetaxel)을 포함하는 탁산 (taxane), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine) 및 비노렐빈 (vinorelbine); 호르몬 치료제, 아나스트로졸 (anastrozole), 고세렐린 (goserelin), 메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate), 프레니손 (prenisone), 타목시펜 (tamoxifen) 및 토레미펜(toremifene) ; 트라스투주맙 (trastuzumab)(항-Her2), 세툭시맙 (cetuximab)(항-EGFR) 및 베바시주맙 (bevacizumab)(항-VEGF)과 같은 단일클론항체 치료제; 이마티 닙 (imatinib), 다사티닙 (dasatinib), 게피티닙 (gefitinib), 엘로티닙 (erlotinib), 라파티닙 (lapatinib) 및 템시로리무스 (temsirolimus)와 같은 단백질 키나제 (protein kinase) 억제제; 보르테조밉 (bortezomib)과 같은 프로테아좀 (proteasome)억제제; 보리노스타트 (vorinostat)와 같은 히스톤 데아세틸라제 (histone deacetylase, HDAC) 억제제; 수니티닙 (sunitinib), 소라페닙 (sorafenib), 레나리도미드 (lenalidomide)와 같은 혈관신생 억제제; 방사선 치료 및 외과 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 조성물, 용도 또는 방법.
66. 하기의 단계를 포함하는 제1항 내지 제37항 및 제58항 중 어느 한 항에 따른 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 제조 방법:

    (a) 적절한 조건에서 배양시 안사마이신 또는 그의 유사체를 생산하는 제 1 숙주 균주를 제공하는 단계;

    (b) 상기 균주에 인공적인 스타터 유닛을 공급하는 단계;

    (c) 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체의 제조를 위한 적절한 조건에서 상기 숙주 균주를 배양하는 단계; 및

    (d) 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.
67. 제66항에 있어서, 하기의 단계를 포함하는 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 제조 방법:

    (a) 적절한 조건에서 배양시 젤다나마이신 (geldanamycin) 또는 그의 유사체를 생산하는 제 1 숙주 균주를 제공하는 단계;

    (b) 상기 균주에 인공적인 스타터 유닛을 공급하는 단계;

    (c) 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체의 제조를 위한 적절한 조건에서 상기 숙주 균주를 배양하는 단계; 및

    (d) 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.
68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:

    (e) 일반적으로 상기 (c) 단계 이전에 수행되며, 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛의 생합성 유전자 또는 그의 상동체 유전자를 결실 또는 비활성화시키는 단계.
69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:

    (f) 일반적으로 상기 (c) 단계 이전에 수행되며, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자를 결실 또는 비활성화시키는 단계.
70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 인공적인 스타터 유닛은 3-아미노벤조산인 방법.
71. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 인공적인 스타터 유닛은 5-아미노-2-플루오로벤조산인 방법.
72. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 인공적인 스타터 유닛은 5-아미노-3-플루오로벤조산인 방법.
73. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 인공적인 스타터 유닛은 5-아미노-2,3-디-플루오로벤조산인 방법.
74. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 인공적인 스타터 유닛은 5-아미노-2,3,6-트리-플루오로벤조산인 방법.
75. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 안사마이신 생산 균주인 방법.
76. 제75항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 젤다나마이신 생산 균주인 방법.
77. 제75항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 헤르비마이신 (herbimycin) 생산 균주인 방법.
78. 제66항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 안사마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
79. 제78항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 젤다나마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
80. 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 안사마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
81. 제80항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 젤다나마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
82. 제80항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 헤르비마이신 생산 균주를 기초로, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
83. 제66항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 안사마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 상동체 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
84. 제83항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 젤다나마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
85. 제83항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 헤르비마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 상동체 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
86. 제83항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 안사마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 상동체가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
87. 제86항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 젤다나마이신 생산 균주를 기초로, gdmM이 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
88. 제86항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 헤르비마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 상동체가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주인 방법.
89. 안사마이신 생산 균주를 기초로, gdmM 또는 그의 상동체 및 하나 또는 그 이상의 스타터 유닛 생합성 유전자 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화되도록 조작된 균주.
90. 제89항에 있어서, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM3602A (S. hygroscopicus AM3602A)의 ahba-B 클러스터의 모든 유전자 또는 다른 균주의 상동체 유전자가 결실되거나 비활성화된 균주.
91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 상기 균주는 젤다나마이신을 생산하는 균주.
92. 제89항 또는 제90항에 있어서, 상기 균주는 헤르비마이신을 생산하는 균주.
93. 제91항에 있어서, 상기 균주는 gdmO가 결실되거나 비활성화된 균주.
94. 제92항에 있어서, 상기 균주는 hbmO가 결실되거나 비활성화된 균주.
95. 제89항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안사마이신 생산 균주는 스트렙토마이세트 (Streptomycete)인 조작된 균주.
96. 제95항에 있어서, 상기 젤다나마이신 생산 균주는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 젤다누스 NRRL3602 (Streptomyces hygroscopicus subsp. geldanus NRRL3602) 또는 스트렙토마이세스 종 DSM4137 (Streptomyces sp. DSM4137) 또는 스트렙토마이세스 비올라세우스니게르 DSM40699 (Streptomyces violaceusniger DSM40699)인 조작된 균주.
97. 안사마이신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 제조를 위한, 제89항 내지 제96항 중 어느 한 항에 따른 조작된 균주의 용도.
98. 제97항에 있어서, 상기 안사마이신 유사체는 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체인 조작된 균주의 용도.
99. 제98항에 있어서, 상기 18,21-디데스옥시-안사마이신 유사체는 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 의해 정의된 용도.

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