KR20090005377A - 17-옥시막베신 유도체 및 이의 암 및/또는 b-세포 악성종양 치료 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암, B-세포 악성 종양, 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리에 유용한, 하기 화학식 (IA) 또는 (IB)에 따른 17-옥시막베신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로, 하기 식에서, R1은 H, OH 또는 OCH3이고; R2는 H 또는 CH3이고; R3는 H 또는 CONH2이고; R4 및 R5는 각각 모두가 H이거나 함께 하나의 결합(즉, C4 내지 C5는 이중 결합임)을 나타내며; R6는 H 또는 OH이고; 및 R7은 H 또는 CH3이다. 본 발명은 또한 상기 화합물의 제조 방법 및 이들의 의약 용도, 특별히 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료 및/또는 예방 용도를 제공한다.
Description
본 발명은 예를 들어 암, B-세포 악성 종양, 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리(pre-treatment)에 유용한, 17-옥시막베신 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물의 제조 방법 및 이들의 의약 용도, 특별히 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료 및/또는 예방 용도를 제공한다.
90 kDa 열충격단백질(Hsp90)은 단백질의 접힘 및 조립과 관련된 풍부한 분자 샤페론인데, 이들 다수가 신호 전달 경로와 관련되어 있다(Neckers, 2002; Sreedhar et al., 2004a; Wegele et al., 2004 및 이들의 참고문헌을 참조). 지금까지 거의 50 여종의 이러한 소위 클라이언트 단백질(client proteins)이라 일컫는 단백질이 확인되었으며, 스테로이드 수용체(steroid receptors), 예를 들어 src 류와 같은 비수용체성 티로신 키나아제(non-receptor tyrosine kinases), 예를 들어 cdk4 및 cdk6과 같은 사이클린-의존성 키나아제(cyclin-dependent kinases), 낭포성 막횡단 조절자(cystic transmembrane regulator), 산화질소 합성효소 및 이외의 것들을 포함한다(Donze and Picard, 1999; McLaughlin et al., 2002; Chiosis et al., 2004; Wegele et al., 2004; http://www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf). 또한, Hsp90은 스트레스 응답(stress response) 및 돌연변이 영향에 대한 세포 보호에서 중요한 역할을 한다(Bagatell and Whitesell, 2004; Chiosis et al., 2004). Hsp90의 기능은 복잡하고 이는 동적인 다중-효소 복합체의 형성에 관여한다(Bohen, 1998; Liu et al., 1999; Young et al., 2001; Takahashi et al., 2003; Sreedhar et al., 2004; Wegele et al., 2004). Hsp90은 클라이언트 단백질의 분해, 세포 주기 조절장애 및 아포토시스(apoptosis)를 야기하는 억제제를 위한 표적이다(Fang et al., 1998; Liu et al., 1999; Blagosklonny, 2002; Neckers, 2003; Takahashi et al., 2003; Beliakoff and Whitesell, 2004; Wegele et al., 2004). 더욱 최근에, Hsp90은 종양의 침입(invasion)를 위한 중요한 세포외 매개체임이 확인되었다(Eustace et al., 2004). Hsp90은 이의 기능에 대한 심도 있고 상세한 연구(Blagosklonny et al., 1996; Neckers, 2002; Workman and Kaye, 2002; Beliakoff and Whitesell, 2004; Harris et al., 2004; Jez et al., 2003; Lee et al., 2004) 및 고속처리 스크리닝 분석의 개발(Carreras et al., 2003; Rowlands et al., 2004)에 반영되는, 암 치료법을 위한 새로운 주요 치료 표적으로서 확인되었다. Hsp90 억제제는 안사마이신(ansamycins), 마크롤리드(macrolides), 퓨린, 피라졸, 쿠마린 항생제 및 그 외의 것들과 같은 화합물 종류를 포함한다(Bagatell and Whitesell, 2004; Chiosis et al., 2004 및 이들의 참고문헌을 참조).
벤제노이드 안사마이신(benzenoid ansamycins)은 방향족 고리 구조의 어느 한쪽에 결합된 다양한 길이의 지방족 고리에 의해 특징지어지는 화학적 구조의 광범위한 부류이다. 자연적으로 발생하는 안사마이신은 하기를 포함한다: 막베신(macbecin) 및 18,21-디히드로막베신(또한 막베신 I 및 막베신 II로 각각 알려져있음)(1 & 2; Tanida et al., 1980), 겔다나마이신(3; DeBoer et al., 1970; DeBoer and Dietz, 1976; WO 03/106653 및 이들의 참고문헌), 및 허비마이신 류(4; 5, 6, Omura et al., 1979, Iwai et al., 1980 and Shibata et al, 1986a, WO 03/106653 및 이들의 참고문헌).
안사마이신은 원래 이들의 항균 및 항바이러스 활성이 규명되었으나, 최근에 항암제로서의 이들의 잠재적 유용성이 더 큰 관심의 대상이 되고 있다(Beliakoff and Whitesell, 2004). 많은 Hsp90 억제제가 최근에 임상 실험에서 평가되고 있다(Csermely and Soti, 2003; Workman, 2003). 특히, 겔다나마이신은 나노몰 수준의 효능(nanomolar potency)을 나타내고 종양 세포 의존적으로 변형된 단백질 키나아제에 대해 명백한 특이성을 갖는다(Chiosis et al., 2003; Workman, 2003).
Hsp90 억제제를 이용한 치료는 방사선 조사에 의한 종양 세포 사멸의 유도를 증진시키는 것으로 나타났고, Hsp90 억제제와 세포독성 약물의 조합에 의해 세포 사멸능(예를 들어, 유방암, 만성 골수성 백혈병 및 비소세포폐암)이 증가됨이 또한 입증되었다(Neckers, 2002; Beliakoff and Whitesell, 2004). 항-신생혈관생성 활성에 대한 가능성 또한 관심의 대상이다: Hsp90 클라이언트 단백질 HIF-1α는 고형 종양의 진행에 중요한 역할을 한다(Hur et al., 2002; Workman and Kaye, 2002; Kaur et al., 2004).
Hsp90 억제제는 또한 면역억제제로서 작용하고 Hsp90 억제 후의 다양한 종류의 종양 세포의 보체-매개성 용해와 관련되어 있다(Sreedhar et al., 2004). Hsp90 억제제를 이용한 치료는 또한 면역 세포-매개성 용해(Sreedhar et al., 2004)와 관련된, 유도 과산화물 생산(Sreedhar et al., 2004a)을 야기할 수 있다. 잠재적 항말라리아 약물로서의 Hsp90 억제제의 용도가 또한 논의되었다(Kumar et al., 2003). 또한, 겔다나마이신이 복합적으로 글리코실화된 포유류 프리온 단백질 PrPc의 형성을 방해하는 것으로 나타났다(Winklhofer et al., 2003).
상기한 바와 같이, 안사마이신이 잠재적 항암 및 항-B-세포 악성종양 화합물로서 관심을 받고 있으나, 최근 이용가능한 안사마이신은 열등한 약리적 또는 약제학적 성질, 예를 들면 열등한 물에 대한 용해도, 열등한 대사 안정성, 열등한 생체이용율 또는 열등한 제형능을 나타낸다(Goetz et al., 2003; Workman 2003; Chiosis 2004). 허비마이신 A 및 겔다나마이신 모두는 이들의 강한 간독성으로 인해 임상 시험의 열등한 후보 물질로서 확인되었고(Workman, 2003), 겔다나마이신은 간독성으로 인해 임상 1상에서 탈락되었다(Supko et al., 1995, WO 03/106653).
겔다나마이신은 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus)의 배양 여과물로부터 분리되었고, 시험관 내에서 원생생물에 대해서는 강한 활성을 보였고, 세균과 곰팡이에 대해서는 약한 활성을 나타내었다. 1994년, 겔다나마이신과 Hsp90과의 조합이 제시되었다(Whitesell et al., 1994). 겔다나마이신에 대한 생합성 유전자 클러스터가 클론화되고 서열분석되었다(Allen and Ritchie, 1994; Rascher et al., 2003; WO 03/106653). DNA 서열은 NCBI 수탁번호 AY179507 에서 이용가능하다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(S. hygroscopicus subsp. duamyceticus) JCM4427로부터 유래된 유전공학적으로 제작된 겔다마이신 생산 균주의 분리, 및 4,5-디히드로-7-O-데스카르바모일-7-히드록시겔다나마이신 및 4,5-디히드로-7-O-데스카르바모일-7-히드록시-17-O-데메틸겔다나마이신의 분리가 최근에 기술되었다(Hong et al., 2004). 허비마이신 생산 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) AM-3672에 겔다나마이신을 처리함으로써 화합물 15-히드록시겔다나마이신, 3중고리 겔다나마이신 유사체 KOSN-1633 및 메틸-겔다나마이신이 분리되었다(Hu et al., 2004). 두 화합물 17-포밀-17-데메톡시-18-O-21-O-디히드로겔나마이신 및 17-히드록시메틸-17-데메톡시겔다마이신이 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(S. hygroscopicus) K279-78로부터 분리되었다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 K279-78은, 허비마이신 생산 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM-3672 기원의 다양한 유전자를 함유하는 44kbp 크기의 삽입체를 갖는 코스미드 pKOS279-78을 포함하고 있는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 NRRL 3602이다(Hu et al., 2004). 겔다나마이신 생합성 클러스터의 폴리케티드 합성효 소(polyketide synthase)의 네 가지 모듈 내에서 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인을 치환시켰다(Patel et al., 2004). AT 치환은 완전하게 가공된 유사체 14-데스메틸-겔다마이신, 8-데스메틸-겔다마이신 및 6-데스메톡시-겔다마이신과 완전하게 가공되지 않은 4,5-디히드로-6-데스메톡시-겔다마이신을 이끌어내는 모듈 1, 4 및 5 내에서 수행되었다. 모듈 7 AT(Acyltransferase)의 치환은 세 종류의 2-데스메틸 화합물, KOSN1619, KOSN1558 및 KOSN1559을 생산해내는데, 이중 하나(KOSN1559)인, 겔다나마이신의 2-데메틸-4,5-디히드로-17-데메톡시-21-데옥시 유도체는 겔다나마이신보다 4배 이상, 17-AAG보다 8배 이상의 결합력으로 Hsp90과 결합한다. 그러나 이는 SKBr3을 사용한 IC50 측정에서의 향상에 반영되지 않는다. 또 다른 유사체인 신규한 비벤조퀴노이드 겔다나마이신(nonbenzoquinoid geldamycin) KOS-1806은 단일페놀(monophenolic) 구조를 가진다(Rascher et al., 2005). KOS-1806에 대한 활성 데이터는 주어지지 않았다.
1979년에 안사마이신 항생제 허비마이신 A가 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 균주 No. AM-3672의 발효 배지로부터 분리되었고, 이의 잠재적 제초 활성에 따라 명명되었다. 항암활성은 세포의 변형된 형태를 되돌리는 약물을 스크리닝하기 위해 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV)의 온도감수성 변이체로 감염된 랫 신장 세포를 사용하여 평가되었다(Uehara, 2003 참조). 허비마이신 A는 Hsp90 샤페론 단백질에 결합하여 일차적으로 작용하는 것으로 주장되었지만, 보존된 시스테인 잔기에 직접 결합하고, 이어 키나아제를 불활성화시킨다는 것도 논의되었다(Uehara, 2003).
화학적 유도체가 분리되었고 벤조퀴논 핵의 C19의 치환체가 변경된 화합물 및 고리 사슬(ansa chain) 내에서 할로겐화된 화합물이 허비마이신 A보다 독성이 더 적고 항암활성이 더 높은 것으로 나타났다(Omura et al., 1984; Shibata et al., 1986b). 허비마이신 생합성 유전자 클러스터의 서열은 WO 03/106653 및 최근 논문에서 확인되었다(Rascher et al., 2005).
항진균 및 항원충 활성에 의해 확인된 안사마이신 화합물 막베신 (1) 및 18,21-디히드로막베신 (2) (C-14919E-1 및 C-14919E-1)은 노카르디아(Nocardia) 종 No. C-14919 (Actinosynnema pretiosum subsp pretiosum ATCC 31280)의 배양물 상층액으로부터 분리되었다(Tanida et al., 1980; Muroi et al., 1980; Muroi et al., 1981; US 4,315,989 및 US 4,187,292). 18,21-디히드로막베신은 디히드로퀴논 형태의 핵을 포함하는 특징을 가진다. 막베신 및 18,21-디히드로막베신 모두 뮤린 백혈병 P388 세포주와 같은 암세포주에 대해 유사한 항균 및 항암 활성을 가지는 것으로 나타났다(Ono et al., 1982). 역전사 효소 활성 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 활성은 막베신에 의해 억제되지 않았다(Ono et al., 1982). 막베신의 Hsp90 억제기능은 문헌으로 보고된바 있다(Bohen, 1998; Liu et al., 1999). 막베신 및 18,21-디히드로막베신이 미생물 배양액에 첨가된 후, 화합물의 특정 위치 또는 위치들에서 메톡시기 대신에 히드록시기를 가진 화합물로 전환되는 것은 US 4,421,687 및 US 4,512,975 특허에 기술되어 있다.
매우 다양한 토양 미생물을 선별하는 가운데, 스트렙토마이세스 속에 속하는 생산균주로부터 화합물 TAN-420A 내지 E가 확인되었다(7-11, EP 0 110 710).
2000년에 스트렙토마이세스 종.(Streptomyces sp.) S6699의 세포 배양액으로부터 겔다나마이신과 관련이 있는 비-벤조퀴논(non-benzoquinone) 안사마이신 대사체인 레블라스틴(reblastin)의 분리 및 류마티스 관절염 치료에 있어서 이의 잠재적 치료 가치가 기술되었다(Stead et al., 2000).
화학적으로 관련이 없는 벤조퀴논 안사마이신과 구별되는 또 다른 Hsp90 억제제인 라디시콜(모노르덴)(Radicicol(monorden))은 곰팡이 모노스포리움 보노르덴(Monosporium bonorden)으로부터 그것의 항진균 활성이 처음 발견되었고(Uehara, 2003), 그 구조는 넥트리아 라디시콜라(Nectria radicicola)로부터 분리된 14-원의(14-membered) 마크롤리드와 동일한 것으로 밝혀졌다. 이의 항진균, 항균, 항원충 및 세포독성 활성 이외에, Hsp90 샤페론 단백질의 억제제로서도 그 후에 확인되었다(Uehara, 2003; Schulte et al., 1999). 라디시콜의 항-신생혈관생성 활 성(Hur et al., 2002) 및 이의 반-합성 유도체(Kurebayashi et al., 2001)가 또한 기술된 바 있다.
최근의 관심은 안사마이신 항암 화합물의 새로운 세대로서 겔다나마이신의 17-아미노 유도체, 예를 들면 17-(알릴아미노)-17-데스메톡시 겔다나마이신(17-AAG, 12)(Hostein et al., 2001; Neckers, 2002; Nimmanapalli et al., 2003; Vasilevskaya et al., 2003; Smith-Jones et al., 2004) 및 17-데스메톡시-17-N,N-디메틸아미노에틸아미노-겔다나마이신(17-DMAG, 13)(Egorin et al., 2002; Jez et al., 2003)에 집중되어 있다(Bagatell and Whitesell, 2004). 더욱 최근에 겔다나마이신이 17-위치에서 유도되어져 17-겔다나마이신 아미드, 카바메이트, 우레아 및 17-아릴겔다나마이신을 생성하였다(Le Brazidec et al., 2003). 60개 이상의 17-알킬아미노-17-데메톡시겔다나마이신 유사체의 라이브러리가 보고되었고 Hsp90에 대한 친화도 및 수용해도가 시험되었다(Tian et al., 2004). 겔다나마이신의 독성을 감소시키기 위한 다른 연구는 종양-표적성 단일클론 항체와 결합시킴으로써 활성 겔다나마이신 화합물을 악성 종양 세포로 선택적 표적화 및 전달하는 것이다(Mandler et al., 2000).
이러한 유도체의 대부분이 감소된 간독성을 나타내지만 여전히 제한된 수용해도를 가진다. 예를 들면 17-AAG는 가용화 담체(solubilising carrier)(예를 들어 Cremophore®, DMSO-egg lecithin)의 사용을 필요로 하고, 그 자체로 일부 환자에게 부작용을 일으킬 수 있다(Hu et al., 2004).
Hsp90 억제제의 안사마이신 계(class) 대부분은 일반적인 구조적 모이어티를 갖는다: 단백질, 글루타티온 등과 같은 친핵제와 공유결합을 빠르게 형성할 수 있는 미켈(Michael) 수용체인 벤조퀴논. 벤조퀴논 모이어티는 또한, 추가적인 비특이적 독성을 야기하는 산소 라디칼이 형성되는 동안, 디히드로퀴논과 산화환원 평형상태(redox equilibrium)가 되도록 한다(Dikalov et al., 2002). 예를 들어 겔다나마이신 처리는 과산화물 생성을 유도할 수 있다(Sreedhar et al., 2004a).
그러므로, 암 및/또는 B-세포 악성종양 치료에 이용할 수 있는 신규한 안사마이신 유도체, 바람직하게는 향상된 수용해도, 개선된 약리학적 프로파일(profile) 및/또는 투여시 감소된 부작용 프로파일을 가지는 안사마이신을 확인할 필요가 남아 있다. 본 발명은 모생산균주의 유전적 조작에 의해 생성되는 신규한 안사마이신 유사체를 개시한다. 특히 본 발명은 현재 이용가능한 안사마이신과 비교할 때 전체적으로 개선된 약제학적 성질을 가지는 신규한 17-옥시막베신 유사체를 개시한다; 특히 이들은 하기 특성 중 하나 또는 그 이상의 성질에 있어서의 개선을 나타낸다: 다른 암 하위-타입(sub-types)에 대한 활성, 독성, 수용해도, 대 사안정성, 생체이용도 및 제형 가능성. 바람직하게 17-옥시막베신 유사체는 개선된 수용해도 및/또는 생체이용도를 나타낸다.
발명의 요약
본 발명은 C17 위치에 히드록시기 또는 메톡시기 중 어느 하나를 가지는 신규한 17-옥시막베신 유사체, 이들 화합물의 제조 방법 및 제약에서 또는 다른 화합물의 제조에서의 중간체로써 이들 화합물의 사용 방법을 제공한다.
따라서, 첫 번째 양태로서, 본 발명은 벤조퀴논을 가지거나(예를 들어, 이들은 막베신 I 유사체이다) 디히드로퀴논 모이어티를 가질 수 있고(예를 들어, 이들은 18,21-디히드로막베신 또는 막베신 II 유사체이다), C17 위치에서 히드록시기 또는 메톡시기를 가지는 막베신의 유사체를 제공한다.
더욱 구체적 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 (IA) 또는 (IB)에 따른 17-옥시막베신 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
상기 식에서,
R1은 H, OH 또는 OCH3이고;
R2는 H 또는 CH3이고;
R3는 H 또는 CONH2이고;
R4 및 R5는 각각 모두가 H이거나 함께 하나의 결합(즉, C4 내지 C5는 이중 결합임)을 나타내며;
R6는 H 또는 OH이고; 및
R7은 H 또는 CH3이다.
화학식 (IA) 또는 (IB)에 다른 상기 막베신 유사체는 또한 본원에서 “본 발명의 화합물”로 언급될 수 있으며, 상기 용어들은 본원에서 혼용되어 사용된다. 화학식 (IA) 및 (IB)의 화합물은 전술에서 화학식 (I)의 화합물로써 총체적으로 언급된다.
상기 구조는 대표적인 호변체(tautomer)를 나타내며, 본 발명은 화학식 (I) 화합물의 모든 호변체, 예를 들어 에놀 화합물이 예시된 경우의 케토화합물과 그 반대의 경우를 포함한다.
본 발명은 상기에서 나타낸 바와 같은 화학식 (I)로 정의된 화합물의 모든 입체이성질체를 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 화학식 (I)의 화합물과 같은 막베신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
정의
관사 "하나의(a)"와 "하나의(an)"는 관사의 문법적 객체들 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하도록 본원 명세서에서 사용되었다. 예를 들면, "하나의 유사체"는 한 개의 유사체 또는 한 개 이상의 유사체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "유사체(들)"는 서로 구조적으로 유사하지만 구성상에서 조금 차이가 있는(한 원자가 또 다른 원자로 치환되거나 특정 기능기가 존재 또는 부재하는 경우) 화학적 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "상동체(들)"은 다른 막베신 생산 균주로부터 유래한 대체가능한 막베신 생합성 클러스터로부터 유래하거나, 예를 들면, 겔다나마이신, 허비마이신 또는 레블라스타틴으로부터의 대체가능한 안사마이신 생합성 유전자 클러스터로부터 유래한 상동체로부터 유래하는 본원에 기술된 유전자 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 상동체를 의미한다. 이러한 상동체(들)는 같은 기능을 수행하는 단백질을 코딩하거나, 막베신 또는 관련된 안사마이신 폴리케티드 생합성에서 이들 자체로 상기 유전자 또는 단백질과 같은 기능을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 상동체(들)는 본원에 기재된 구체적 유전자 서열(특히, 막베신 생합성 유전자 클러스터 내의 모든 유전자 서열이며, 이로부터 구체적인 유전자가 추론될 수 있는 표 3, 서열번호 11, 및 gdmL의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 나타내는 도 6A 및 6B, 서열번호 20 및 21 참조)에 대해 적어도 40%의 서열 동일성, 바람직하게 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 가진다. 퍼센트 상동성(persentage identity)은 NCBI 웹사이트 상에서 이용이 가능한 BLASTn 또는 BLASTp와 같은 당해 분야의 전문가에게 알려진 프로그램을 사용하여 계산할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "암"은 피부나 신체 기관, 예를 들어 이에 제한되지 않지만, 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 뇌, 위 또는 장에서의 세포의 양성 또는 악성 신 생장을 의미한다. 암은 인접 조직으로 침윤되고 떨어져 있는 기관, 예를 들어 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 퍼지는(전이) 경향이 있다. 본원에서 사용된 용어 암은 이에 제한되지 않지만 흑색종, 임파종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종 및 비만세포종과 같은 전이성 종양 세포 타입; 및 이에 제한되지 않지만 직장암, 전립선암, 소세포폐암 및 비소세포폐암, 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 교모세포암, 원발성 간암 및 난소암과 같은 조직암 타입을 모두 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "B-세포 악성 종양"은 만성 림프성 백혈병(CLL), 다발성 골수종 및 비호지킨 임파종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)을 포함하는 질환 그룹을 포함한다. 이들은 혈액 및 혈액 형성 기관의 종양성 질환이다. 이들은 골수 및 면역계 기능 장애를 발생시키며, 환자를 감염 및 출혈에 매우 민감해지게 한다.
본원에서 사용된 용어 "생체이용도(bioavailability)"는 투여 후 약물 또는 다른 물질이 흡수되거나 생물학적 활성 자리에서 이용가능하게 되는 정도 또는 속도를 의미한다. 이러한 성질은 화합물의 용해도, 위에서의 흡수율, 단백질 결합 정도 및 대사 등을 포함하는 수많은 인자에 의존한다. 당해 분야의 당업자에게 익숙한 다양한 생체이용도 테스트가 예를 들어 Egorin et al. (2002)에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "수용해도(water solubility)"는 수성 매질(aqueous media), 예를 들어, pH 7.3 인산 완충 식염수(PBS)에서의 용해도를 의미한다. 대표적인 수용해도 분석이 하기 실시예에 주어져 있다.
본원에서 사용된 용어 "post-PKS 유전자(들)"은 폴리케티드의 post-폴리케티드 합성 효소의 변형에 요구되는 유전자를 의미한다. 예를 들어 모노옥시게나제, O-메틸트랜스퍼라제 및 카르바모일트랜스퍼라제가 있으며 이에 한정되지 않는다. 이 용어는 또한 구체적으로 C17 위치에 산소의 부가를 위해 필요한 유전자, 예를 들어 gdmL 및 이의 상동체를 포함한다. 특히, 용어 "막베신 post-PKS 유전자(들)"은 막베신 PKS 유전자 클러스터 내의 이들 변형 유전자, 예를 들어 mbcM, mbcN, mbcP, mbcMT1, mbcMT2 및 mbcP450을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "막베신 생산 균주"는 예를 들어 천연 스타터 주입물 3-아미노-5-히드록시벤조산을 주입했을 때와 같이 적합한 조건 하에서 배양했을 때 막베신을 생산하는, 예를 들어 A. 프레티오섬(A. pretiosum) 및 A. 미럼(A. mirum)에 의해 예시되어지는 야생형 균주와 같은, 균주를 의미한다.
화학식 (I)의 화합물과 같은 본원 발명 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 무기산 또는 유기산 또는 염기로부터 형성되는 통상적인 염뿐만 아니라 4차 암모늄산 부가염도 포함한다. 적절한 산성염의 보다 구체적인 예로는 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 인산염, 질산염, 과염소산염, 푸마르산염, 아세트산염, 프로피온산염, 숙신산염, 글리콜산염, 포름산염, 젖산염, 말레산염, 타르타르산염, 시트르산염, 팔모익산(palmoic acid)염, 말론산염, 히드록시말레산염, 페닐아세트산염, 글루탐산염, 벤조산염, 살리실산염, 푸마르산염, 톨루엔술폰산염, 메탄술폰산염, 나프탈렌-2-술폰산염, 벤젠술폰산염, 히드록시나프토익산염, 요오드화수소산염, 말산염, 스테로익산(steroic acid)염, 타닌산염 및 그 등가물을 포함한다. 옥살산과 같은 다른 산들은 그 자체로는 약제학적으로 허용가능하지 않지만, 본원 발명의 화합물과 그들의 약제학적으로 허용가능한 염을 얻을 때 중간체로서 유용한 염의 제조에 유용할 수 있다. 적절한 염기성염의 보다 구체적인 예로는 나트륨염, 리튬염, 칼륨염, 마그네슘염, 알루미늄염, 칼슘염, 아연염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 콜린염, 디에탄올아민염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염 및 프로카인염을 포함한다. 본 발명에 따른 화합물에 대한 하기의 언급에는 화학식(I)의 화합물과 이의 약제학적으로 허용가능한 염 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "18,21-디히드로막베신" 및 "막베신 II"(막베신의 디히드로퀴논 형태)는 혼용되어 사용될 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 상술한 바와 같은 17-옥시막베신 유사체, 이들 화합물의 제조방법, 및 이들 화합물을 의약적으로 이용하는 방법 및 추가적인 반합성 유도체화(semi-synthetic derivatisation) 또는 생체내 변환(biotransforamtion) 방법에 의한 유도체화(derivatisation)를 위한 중간체 또는 주형(templates)으로서 이들 화합물의 용도를 제공한다.
바람직하게는 17-옥시막베신 유도체는 화학식 IA에 따른 구조를 갖는다.
바람직하게는 17-옥시막베신 유도체는 화학식 IB에 따른 구조를 갖는다.
바람직하게는 R3은 CONH2이다.
바람직하게는 R6는 OH이다. 선택적으로 R6는 H이다.
바람직하게는 R7은 H이다.
하나의 적절한 실시태양에서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 IA에 따른 구조를 가지며, 상기 식에서 R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5 각각은 H이고, R6는 OH이고, 또한 R7은 H이다.
하나의 적절한 실시태양에서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 IB에 따른 구조를 가지며, 상기 식에서 R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5 각각은 H이고, 또한 R7은 H이다.
하나의 적절한 실시태양에서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 IA에 따른 구조를 가지며, 상기 식에서 R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5 각각은 H이고, R6는 OH이고, 또한 R7은 CH3이다.
하나의 적절한 실시태양에서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 IB에 따른 구조를 가지며, 상기 식에서 R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5 각각은 H이고, 또한 R7은 CH3이다.
하나의 적절한 실시태양에서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 IA에 따른 구조를 가지며, 상기 식에서 R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5 각각은 H이고, R6는 H이고, 또한 R7은 H이다.
하나의 적절한 실시태양에서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 IA에 따른 구조를 가지며, 상기 식에서 R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5 각각은 H이고, R6는 H이고, 또한 R7은 CH3이다.
안사 고리(ansa ring)에 대한 비-수소 곁사슬의 바람직한 입체화학은 도 1 및 2에 있는 막베신에 대하여 나타낸 것과 같다(즉, 바람직한 입체화학은 막베신의 입체화학을 따른다).
R6가 OH인 본 발명의 화합물은 벤조퀴논 형태 또는 디히드로벤조퀴논 형태로 발효 배지로부터 분리될 수 있다. 벤조퀴논은 디히드로퀴논(환원)으로 화학적으로 변환될 수 있고, 그 반대로 변환될 수 있다(산화)는 것은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 따라서 이들 형태들은 당해 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법으로 쉽게 상호변환될 수 있다. 예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 벤조퀴논 형태가 분리되는 경우에는 상응하는 디히드로퀴논으로 변환될 수 있다. 일 예로써 (그러나 제한되는 것은 아님), 이는 수소화물, 예를 들어 이로 제한되는 것은 아니지만 LiAlH4 또는 SnCl2-HCl과 같은 유기 배지에서 성취될 수 있다. 이와는 달리 이 변환은 유기 담체(organic media)에서 본 발명의 화합물의 벤조퀴논 형태를 용해한 후, 제한되는 것은 아니지만 차아황산나트륨(Na2S2O4 또는 소듐 티오나이트)과 같은 환원제 수용성 용액으로 세척함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게, 이 변환은 본 발명의 화합물을 에틸 아세테이트에 용해하고, 이 용액을 차아황산나트륨의 수용성 용액에 격렬하게 혼합함으로써 수행할 수 있다(Muroi et al., 1980). 수득된 유기 용액은 물로 세척하고 건조하고, 감압 하에서 용매를 제거하여 본 발명의 화합물의 18,21-디히드로 형태를 거의 정량 수득한다.
디히드로퀴논을 퀴논으로 산화시키기 위하여 몇 가지의 방법이 제한되지 않지만 이용할 수 있다: 본 발명의 화합물의 디히드로퀴논 형태를 에틸 아세테이트와 같은 유기 용매로 용해한 다음, 이 용액은 제3 염화철의 수용액으로 격렬게 혼합한다. 그 후 유기 용액은 물로 세척하고, 건조하고, 감압하에서 유기 용매를 제거하여 막베신 화합물의 벤조퀴논 형태를 거의 정량으로 수득한다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 17-옥시막베신 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 생체변환 또는 합성 화학에 의한 추가의 변형을 위한 기질로서 17-옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 의약품의 제조에 있어서의 17-옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다. 추가적인 실시태양에서, 본 발명은 암 및/또는 B-세포 악성종양의 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의 17-옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다. 추가적인 실시태양에서, 본 발명은 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환 및/또는 암의 예방적 전처리를 위한 의약품의 제조에 있어서의 17-옥시막베신의 용도를 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 의약품에서의 17-옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다. 추가적인 실시태양에서, 본 발명은 암 및/또는 B-세포 악성종양의 치료에서의 17-옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다. 추가적인 실시태양에서, 본 발명은 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환 및/또는 암의 예방적 전처리를 위한 의약품의 제조에 있어서의 17-옥시막베신의 용도를 제공한다.
추가적인 실시태양에서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 17-옥시막베신 유사체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 및/또는 B-세포 악성종양을 치료하는 방법을 제공한다. 추가적인 실시태양에서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 17-옥시막베신 유사체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리를 위한 방법을 제공한다.
상기 지적한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 암 및/또는 B-세포 악성종양 치료에 유용할 것으로 기대할 수 있다. 본 발명의 화합물은 예를 들면, 제한되지는 않지만 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 류마티스성 관절염 같은 자가면역질환의 다른 증상들의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리에도 효과적일 수 있다.
중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 프리온병, 척수인경 근위축증(SBMA), 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
혈관신생 의존성 질병은 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막증 및 다양한 다른 안과질환, 동맥경화증 및 류마티스성 관절염을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
자가면역질환은 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스, 건선을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"환자"는 인간 및 다른 동물(특히 포유류) 대상을 포함하며, 바람직하게는 인간 대상이다. 따라서, 본 발명의 17-옥시막베신 유사체의 상기 방법 및 용도는 인간 의학 및 수의학 분야에서의 용도이며, 바람직하게는 인간 의학분야의 용도이다.
상기에서 언급된 본 발명의 화합물 또는 이의 제형은 제한되지는 않지만 예를 들면, 비경구 투여(정맥내 투여 포함), 경구 투여, 국부 투여(구강, 설하, 경피를 포함), 의료용 장치(예를 들어, 스텐트)에 의해, 흡입에 의해, 또는 주사(피하 또는 근육내)를 통한 통상적인 방법에 의해서도 투여할 수 있다. 치료는 단일 투여 또는 일정 시간에 걸친 복수회의 투여로 이루어질 수 있다.
본 발명의 화합물은 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 하나 또는 그 이상의 허용 가능한 담체와 함께 약제학적 제형으로서 제공하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 화합물을 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 희석제(들) 또는 담체(들)는 본 발명의 화합물과 양립할 수 있다는 의미에서 "허용가능" 해야만 하고 이의 복용자에게 해롭지 않아야 한다. 적합한 담체의 예는 하기에 보다 상세하게 기술한다.
본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 치료제와 복합적으로 투여할 수 있다. 두 가지(또는 그 이상) 제제의 복합투여는 각각을 사용할 때보다 훨씬 작은 양으로 투여 가능하게 하여 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 이전의 치료에 의해 질병에 내성이 생긴 경우에도 암과 같은 질병의 재감작(resensitisation)을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 화합물 및 추가적인 치료제를 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 제2 제제, 예를 들어 세포독성제 또는 세포증식 억제제와 같은 암 또는 B-세포 악성 종양 치료를 위한 제2의 제제와 함께 복합 치료(combination therapy)에서의 본 발명 화합물의 용도를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 다른 치료제, 예로 암 또는 B-세포 악성 종양 치료를 위해 세포독성제 또는 세포증식 억제제와 같은 다른 치료제와 함께 복합 투여된다. 전형적인 추가적 제제로는 알킬화제제 및 유사분열 억제제(토포이소머라제 II 억제제 및 튜불린 억제제 포함)와 같은 세포독성제가 포함된다. 또 다른 전형적인 추가적 제제로는 DNA 결합제; 항대사제; 및 단백질 키나아제 억제제 및 타이로신 키나아제 수용체 차단제와 같은 세포증식 억제제가 포함된다. 적합한 제제로는 메토트렉사이트, 류코보린, 프레니손, 블레오마이신, 사이클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 독소루비신(아드리아마이신), 타목시펜, 토레미펜, 메게스트롤 아세테이트, 아나스트로졸, 고세렐린, 항-HER2 단일 클론 항체(예를 들어, 상표 Herceptin™으로 시판되는 트라스투주맙), 카페시타빈, 라록시펜 염산염, EGFR 억제제(예를 들어, 상표 Iressa®로 시판되는 게피티닙, 상표 Tarceva™로 시판되는 엘로티닙, 상표 Erbitux™로 시판되는 세툭시맙), VEGF 억제제(예를 들어, 상표 Avastin™으로 시판되는 베바시주맙), 및 프로테아좀 억제제(예를 들어, 상표 Velcade™로 시판되는 보르테조밉)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 또한, 적합한 제제로는 시스플라틴, 사이타라빈, 사이클로헥실클로로에틸니트로스우레아, 겜시타빈, 이포스프아미드, 류코보린, 미토마이신, 미토잔톤, 옥살리플라틴, 및 탁솔과 빈데신을 포함하는 탁산과 같은 통상적인 화학치료제; 호르몬 치료제; 세툭시맙(항-EGFR)과 같은 단클론항체 치료제; 다사티닙, 라파티닙과 같은 단백질 키나아제 억제제; 보리노스타트와 같은 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제; 수니티닙, 소라페닙, 레나리도미드와 같은 혈관신생 억제제; 및 템시로리무스와 같은 mTOR 억제제가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 적합한 제제로는 상표 Glivec®으로 시판되는 이마티닙이 있다. 추가적으로, 본 발명의 화합물은 제한되지는 않지만, 방사선 치료 또는 외과 수술을 포함한 다른 치료와 병용하여 투여될 수 있다.
제형은 편리하게는 단위 투약 형태로 제공할 수 있고, 제약 업계에 잘 알려져 있는 어떠한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 방법은 활성 성분(본 발명의 화합물)을 하나 또는 그 이상의 부속 성분으로 구성되는 담체와 조합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 상기 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세하게 분쇄된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 밀접하게 조합시킨 다음, 필요에 따라 생성물을 성형함으로써 제조된다.
본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태의 활성 성분, 선택적으로 무독성 유기 또는 무기, 산 또는 염기, 부가 염의 형태로 포함하는 약제학적 제형의 형태로 경구 또는 임의의 비경구 경로에 의해 투여하는 것이 보통이다. 투여 경로뿐만 아니라, 치료될 질병 및 환자에 따라 상기 조성물은 다양한 투여량으로 투여할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 즉시-, 지연- 또는 조절-방출 적용을 위해 정제, 캡슐, 좌제, 엘릭서, 용액 또는 현탁액의 형태로 경구, 구강 또는 설하 투여할 수 있으며, 이들은 향료 또는 색소를 포함할 수 있다.
이러한 정제는 미세결정 셀룰로즈, 락토오즈, 시트르산 나트륨, 탄산 칼슘, 제2인산 칼슘 및 글리신과 같은 부형제, 전분(바람직하게 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 전분 글리콜산 나트륨, 크로스카멜로스 나트륨 및 특정 복합 규산염과 같은 붕해제, 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 히드록시-프로필셀룰로스(HPC), 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 바인더를 포함할 수 있다. 그 외에, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크와 같은 윤활제를 포함할 수 있다.
유사한 형태의 고형 조성물은 또한 젤라틴 캡슐의 충진제로 사용될 수 있다. 이러한 측면에서 바람직한 부형제로는 락토오스, 전분, 셀룰로스, 유당 또는 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭서의 경우, 본 발명의 화합물은 다양한 가미제 또는 향료, 칼라재 또는 색소와 함께, 유화제 및/또는 현탁제와 함께, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제와 함께, 그리고 이들의 조합물과 함께 혼합할 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 부속 성분과 함께, 압착 또는 성형에 의해 만들 수 있다. 압착된 정제는, 경우에 따라 바인더(예를 들어, 포비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 붕해제(예를 들어, 전분 글리콜산 나트륨, 교차-결합된 포비돈, 교차-결합된 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨), 계면활성제 또는 분산제와 함께 혼합된, 분말 또는 과립과 같은 자유 유동성 형태로, 활성성분을 적합한 기계 안에서 압착시켜 제조할 수 있다. 몰딩된 정제는 비활성 액체 희석제로 적신 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기계 안에서 몰딩하여 만들 수 있다. 상기 정제는 선택적으로 코팅되거나 자국을 낼 수 있고, 예를 들어 정해진 방출 특성을 제공하도록 다양한 비율의 히드록시프로필메틸 셀룰로스를 이용하여, 활성 성분이 느리게 또는 조절되어 방출되도록 제형화할 수 있다.
경구 투여에 적합한 본원 발명에 따른 제형은 각각이 미리 소정 함량의 활성 성분을 각각 포함하는, 캡슐, 교갑(cachet) 또는 정제와 같은 분리된 단위로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비-수성 액체 상태의 액제 또는 현탁제로서; 또는 수중유(oil-in-water) 액체형 에멀젼 또는 유중수(water-in-oil) 액체형 에멀젼으로서 제공할 수 있다. 상기 활성 성분은 또한 환약(bolus), 연약(electuary), 또는 페이스트로서 제공할 수 있다.
입 안의 국소 투여에 적합한 제형으로는 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스(tragacanth)의 향기나는 기재에 활성 성분을 포함하는 로젠지(lozenge); 젤라틴과 글리세린, 또는 수크로스와 아카시아와 같은 비활성 기재에 활성 성분을 포함하는 향정(pastille); 및 적절한 액체 담체 내에 활성 성분을 포함하는 구강-세척액이 포함된다.
상기에서 특별히 언급된 성분들뿐만 아니라, 본 발명의 제형은 문제가 되는 제제의 형태를 고려하여 당해 분야에서 통상적인 기타 물질을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 경구 투여를 위해 적절한 제제로는 향미료를 포함할 수 있다.
국부 투여에 적합한 약제학적 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 약물이 함침된 드레싱(impregnated dressing), 스프레이, 에어졸 또는 오일, 경피 기구, 분진성 분말(dusting powder) 등으로 제형화할 수 있다. 이러한 조성물은 활성제를 포함하는 전형적인 방법을 통해 제조할 수 있다. 따라서, 이들은 또한 보존제, 약물 침투를 돕는 용매, 크림 또는 연고를 위한 연화제, 및 로션을 위한 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 양립할 수 있는 전형적인 담체 및 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 조성물의 약 1% 내지 약 98%까지 존재할 수 있다. 보다 일반적으로 이들은 조성물의 약 80%까지를 형성할 것이다. 예를 들면, 크림 또는 연고는 바람직한 점성를 갖는 크림 또는 연고를 제조하기에 충분한 양으로, 화합물을 약 5-10중량%로 포함하여, 충분한 양의 친수성 재료와 물을 혼합하여 제조한다.
경피 투여를 위한 약제학적 조성물은 오랜 시간 동안 환자의 표피와 밀접하게 접촉되어 있도록 분리 패치로 제공할 수 있다. 예를 들어 활성 성분은 전리 요법에 의해 패치로부터 전달할 수 있다.
외부 조직, 예를 들어, 입 및 피부에 적용하기 위해서, 조성물은 바람직하기로는 국부 연고 또는 크림으로 적용한다. 연고로 제형화된 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 물과 섞일 수 있는(water-miscible) 연고 베이스와 함께 사용할 수 있다.
이와는 달리, 활성제는 수중유 크림 베이스 또는 유중수 베이스를 가진 크림으로 제형화될 수 있다.
비경구 투여를 위해, 유입 단위 투약 형태(fluid unit dosage forms)는 활성 성분 및 살균된 베히클(vehicle)을 이용하여 제조할 수 있는데, 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일 등이 있으나 이들로 한정되지 않으며, 바람직하게는 물을 이용할 수 있다. 상기 베히클 및 사용된 농도에 따라, 상기 활성 성분은 베히클에 현탁되거나 용해할 수 있다. 용액을 제조하는 데 있어서, 상기 활성 성분은 주입을 위해 물에 용해할 수 있고 여과 살균한 후 적합한 바이알(vial) 또는 앰플에 충진하고 봉입할 수 있다.
유리하게, 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 제제는 베히클에 용해할 수 있다. 안정성을 증진시키기 위해, 조성물은 바이알에 충진한 후 냉동되고, 진공 상태에서 물을 제거할 수 있다. 냉동 건조된 분말은 바이알 내에 봉입하고, 주사(injection)용 물을 담은 동봉된 바이알을 사용 전 분말을 액상으로 되게 하기 위하여 공급할 수 있다.
비경구 현탁액은, 활성 성분이 용해되는 대신에 베히클에 현탁되고 여과를 통해 살균을 수행할 수 없는 것을 제외하고, 실질적으로 용액과 동일한 방법으로 제조한다. 상기 활성 성분은 살균된 베히클에 현탁시키기 전 산화 에틸렌에 노출시켜 살균할 수 있다. 유리하게, 계면활성제 또는 침윤제가 조성물에 포함되어 상기 활성 성분의 균일한 분포를 촉진한다.
본 발명의 화합물은 또한 당업계에 알려진 의료 장치를 이용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 일 실시태양에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 미국특허 제5,399,163호, 미국특허 제5,383,851호, 미국특허 제5,312,335호, 미국특허 제5,064,413호, 미국특허 제4,941,880호, 미국특허 제4,790,824호 또는 미국특허 제4,596,556호에서 공지한 장치와 같은 바늘없는 피하주사 주입 장치로 투여할 수 있다. 본 발명에서 유용한 잘 알려진 이식체(implants) 및 모듈의 예는, 조절된 속도로 약물을 투약하기 위한 이식 가능한 미세-주입 펌프를 공지한 미국특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료용 장치를 공지한 미국특허 제4,486,194호; 정확한 주입속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 공지한 미국특허 제 4,447,233호; 연속적인 약물 전달을 위한 다양한 유입 속도의 이식 가능한 주입 기구를 공지한 미국특허 제4,447,224호; 멀티-챔버 구획(multi-chamber compartments)을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 공지한 미국특허 제4,439,196호; 및 삼투 약물 전달 시스템을 공지한 미국특허 제4,475,196호를 포함한다. 많은 다른 이러한 이식체, 전달 시스템 및 모듈은 당업계에 알려져 있다.
본 발명 화합물의 투여량은 특정 화합물, 관련 질환, 환자 및 질환의 성질 및 심각도, 환자의 신체적 조건, 선택된 투여 경로에 따라 변경될 것이다. 적절한 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정할 수 있다.
상기 조성물은 투여 방법에 따라 본 발명의 화합물을 0.1중량% 이상, 바람직하게 5 내지 60중량%, 보다 바람직하게 10 내지 30중량%로 포함할 수 있다.
본 발명 화합물의 개별적인 투약의 최적량 및 투약 간격은 치료되고 있는 병의 성질 및 정도, 투여 제형, 경로 및 부위, 그리고 치료되고 있는 특정 환자의 나이와 건강상태에 의해 결정되며, 의사가 궁극적으로 사용될 적절한 투약을 결정할 것이라는 것은 당해 분야의 당업자에게 인식되어 있다. 이러한 투약은 필요에 따라 자주 반복할 수 있다. 부작용이 생긴다면, 보통의 임상 진료에 따라서 투여량 및/또는 빈도를 변경하거나 또는 감소시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 17-옥시막베신 유사체의 제조방법을 제공한다.
막베신은 두 단계로 생합성되는 것으로 간주될 수 있다. 첫 번째 단계에서는 코어-PKS 유전자가 2-탄소 단위의 반복된 어셈블리(assembly)에 의해 마크롤리드 코어(macrolide core)를 조립하고, 도 1과 같은 첫 번째 효소-없는 중간체 "프리-막베신"을 형성하기 위해 환형화된다. 두 번째 단계에서는 일련의 "post-PKS" 절단 효소들(예를 들면, P450 모노옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제, FAD-의존성 옥시게나제 및 카르바모일트랜스퍼라제)이 프리-막베신 주형에 다양한 부가기들(additional groups)을 부가하는 작용을 하고, 도 2와 같은 최종적인 모체 화합물 구조를 생성한다. 본 발명의 17-옥시막베신 유사체는 비슷한 방법으로 생합성될 수 있다.
이러한 생합성의 생산은 신규한 화합물을 결국 생산하는 적합한 생산 균주의 유전적 조작에 의해 개발할 수 있다. 특히, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 17-옥시막베신 유사체의 제조방법을 제공한다:
a) 적절한 조건에서 배양시 막베신 또는 이의 유사체를 생산하는 제1의 숙주 균주를 제공하는 단계;
b) 막베신의 C17 위치를 산화할 수 있는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자를 삽입하는 단계;
c) 상기 변형된 숙주 균주를 신규 화합물의 생산을 위해 적절한 조건에서 배양하는 단계; 및
d) 선택적으로 생산된 그 화합물을 분리하는 단계.
단계 (a)에서, "막베신 또는 이의 유사체"는 R1의 정의에 포함되는 막베신 또는 막베신의 이들 유사체를 의미한다.
단계 (b)에서, 삽입된 post-PKS 유전자(들)는 바람직하게 gdmL, 또는 이의 상동체이다.
상기 방법은 추가적으로 하기 단계를 포함할 수 있다:
e) 일반적으로 상기 단계 c) 이전에 수행되고, 단계 b) 이전에 수행될 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 막베신 post-PKS 유전자를 결실시키거나 불활성화시키는 단계.
단계 e)에서, 하나 또는 그 이상의 막베신 post-PKS 유전자를 결실시키거나 불활성화시키는 것은 적절하게 선택적으로 수행될 것이다.
상기 방법들은 선택적으로 하기 단계를 추가로 포함한다:
f) 일반적으로 상기 단계 c) 이전에 수행되며, 결실된 post-PKS 유전자의 하나 또는 그 이상을 재도입하는 단계; 및/또는
g) 일반적으로 상기 단계 c) 이전에 수행되며, 다른 PKS 클러스터로부터 post-PKS 유전자를 도입하는 단계.
하나의 또 다른 실시태양에서, 단계 e)는 DNA를 유전자 내로 통합시킴으로써 기능적인 단백질이 생산되지 않도록 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 또는 이의 상동체를 불활성화하는 것을 포함한다. 하나의 선택적인 실시태양에서, 단계 e)는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 또는 이의 상동체의 표적화된 결실을 만드는 것을 포함한다. 하나의 또 다른 실시태양에서, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 또는 이의 상동체는 위치 특이 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 불활성화된다. 하나의 또 다른 실시태양에서, 단계 a)의 숙주 균주는 돌연변이 유발되고, 변형된 균주는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 효소 또는 이의 상동체가 기능적이지 않는 것 중에서 선택된다. 본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 또는 이의 상동체의 발현을 조절하는 조절자의 돌연변이시킨 것을 포함하는데, 당업자라면 조절자의 결실 또는 불활성화가 유전자의 결실 또는 불활성화와 같은 결과를 나타낼 수 있음을 알 것이다.
하나의 또 다른 실시태양에서, 단계 e)의 균주는 결실되거나 불활성화된 하나 또는 그 이상의 유전자 또는 이의 상동체로 보충된다.
하나의 또 다른 실시태양에서, 단계 e)의 균주는 다른 PKS 클러스터로부터 유래한 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자, 예를 들어 이로 제한되는 것은 아니지만 C17에서 메틸기를 수산기로 교환할 수 있는 단백질을 발현하는 유전자로 보충된다.
본 발명의 구체적 실시태양에서, 선택적으로 post PKS 유전자를 삽입하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(i) 주형으로써 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭으로 C17-수산화와 관련되는 유전자를 분리하는 단계로서, 상기 게놈 DNA는 자체로 적합하게 관련된 수산화된 분자를 생산하는 균주에 있으며, 예를 들어 공지된 gdmL 서열에 기초한 특정 프라이머 또는 그 주형이 이용할 수 없는 서열에 대한 gdmL 유전자 또는 gdmL 상동체인 경우 gdmL의 공지된 서열에 기초한 축퇴성 프라이머(degenerate primer)를 사용하여 겔다나마이신 생산자로부터 gdmL 유전자를 분리하는 단계.
(ii) 상기 유전자를 숙주세포로 전달하기 위한 적합한 벡터내로 클로닝하는 단계로서, 이는 세포 내에서 유지될 것이고 기능적인 C17-수산화효소를 생산하기 위하여 gdmL 유전자 또는 이의 상동체가 발현되도록 하는 단계이다. 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, actl 프로모터 존재하에 gdmL 발현을 촉진하는 actll-ORF4 활성제도 포함하는 벡터 내에 위치하도록 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 NRRL 3602 gdmL 유전자를 클로닝하는 단계. 실시예 2에 사용된 벡터는 또한 접합 전달을 위한 oriT, phiBT1 부착 부위 및 아프라마이신 저항성 마커를 포함한다.
(iii) 예를 들어 접합에 의해 숙주 세포를 상기 벡터로 형질전환하는 단계.
당해 분야의 당업자는 숙주 세포 내에 DNA 조각의 유지가 다양한 표준 방법에 의하여 수행될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터 및 gdmL 또는 이의 상동체는 실시예 2에 기술된 바와 같이 스트렙토마이세스 파지 phiBT1의 염색체 파지 부착 부위(chromosomal phage attachment site) 내로 도입될 수 있다(Gregory et al., 2003). 당해 분야의 당업자는 표적 유전자의 발현이 벡터를 상기 파지 부착 부위에 도입하거나 또는 실제 부착 부위의 용도로 제한되지 않음을 이해할 것이다. 따라서, 발현 벡터는 스트렙토마이세스 파지 phiC31에 대한 부착 부위와 같은 다른 파지 부착 부위 내로 예를 들어 pSET152의 유도체를 사용하는 것에 의하여 도입될 수 있다(Bierman et al., 1992). 그러한 통합은 이에 제한되는 것은 아니지만 다음을 포함하는 다른 이용가능한 통합 기능(integration function)을 사용하여 유사하게 실시될 수 있다: pSAM2 인테그라제(예로, pPM927에서(Smovkina et al., 1990)), R4 인테그라제(예로, pAT98에서(Matsuura et al., 1996)), VWB 인테그라제(예로, pKT02에서(Van Mellaert et al., 1998)), 및 L5 인테그라제(예로, Lee et al., 1991). 당해 분야의 당업자는 유전자를 에이. 프레티오숨(A. pretiosum) 내로 도입하는데 사용될 수 있는 또 다른 시스템을 생산하기 위하여 적합한 프로모터와 함께 전달 벡터로 전달될 수 있는 병합 기능(integration function)을 포함하는 것으로 기대될 수 있는 많은 방산선균 파지(Actinomycete phage)가 있음을 인식할 것이다. 실제 많은 파지들은 방사선균으로부터 동정될 것이고, 병합기능은 이들로부터 획득될 수 있고 유사한 방법으로 이용될 수 있을 것이다. 더 많은 파지들의 특성이 밝혀짐에 따라 유사하게 사용될 수 있는 또 다른 이용가능한 인테그라제가 있을 것으로 기대될 것이다. 어떠한 경우에 인테그라제가 고효율 병합이 가능하도록 특정 attB 부위의 부가에 의하여 숙주 균주의 변형(alteration)을 필요할 수도 있다. 적절한 프로모터에 의한 gdmL 또는 이의 상동체의 도입은 이로 제한되는 것은 아니지만, 염색체의 중성 위치(neutral position) 내로 상동재조합, 염색체의 비중성 위치 내로 (예로 선택된 유전자를 방해하기 위하여) 상동재조합에 의하여 야기될 수 있다. 자가복제 벡터들은 예를 들어 이로 제한되는 것은 아니지만, pSG5(예로, pKC1139 Bierman et al., 1992), pIJ101(예로, PIJ487, Kieser et al., 2000) 및 SCP2*(예로, PIJ698, Kieser et al., 2000)로부터 유래한 스트렙토마이세스 복제 원점을 포함하는 벡터들이 사용될 수 있다.
당해 분야의 당업자는 GdmL 또는 이의 상동체의 생산을 위해 사용될 수 있는 많은 프로모터들이 있음을 쉽게 받아들일 것이다. 예로, gdmL 프로모터, 실시예 2에서와 같이 일반적으로 인지체 활성자 actII-ORF4(Rowe et al., 1998)와 함께 사용되는 actI 또는 actIII 프로모터와 같은 제2의 대사산물 생합성 클러스터부터 유래된 프로모터, 프리스티나마이신(pristinamycin)에 저항성이 있는 프로모터와 같은 스트레스에 반응하는 프로모터(Blanc et al., 1995), 및 에리트로마이신 저항성 유전자 ermE 프로모터(PermE) (Bibb et al., 1985) 및 그 돌연변이된 버전(PermE*)을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적 실시태양에서, post PKS 유전자를 선택적으로 결실시키거나 불활성화시키는 방법은 다음을 포함한다:
(i) 관심 유전자(예를 들어, 겔다나마이신 PKS 생합성 클러스로부터 유래 및/또는 허비마이신 생합성 클러스터로부터 유래)의 상동체(들)에 기초한 축퇴성 올리고를 고안하고, PCR 반응에서 이러한 프라이머를 사용하는 등으로 적합한 막베신 생산 균주로부터 관심 유전자(또는 이의 상동체)의 내부적 단편을 분리하는 단계;
(ii) 상기 단편을 포함하는 플라스미드를 동일한 균주 또는 다른 막베신 생산 균주로 통합시켜, 상동재조합에 의해 표적화된 유전자(또는 이의 상동체)를 파괴시키는 단계;
(iii) 상기와 같이 생산된 균주를 막베신 유사체의 생산에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계.
구체적 구현예에서, 단계 (i)의 막베신-생산 균주는 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum; A. mirum)이다. 또 다른 구체적 구현예에서 단계 (ii)의 막베신-생산 균주는 악티노신네마 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum; A. pretiosum)이다.
당업자는 상기에서 기술된 대체가능한 방법들을 사용하여 균등한 균주를 얻을 수 있음을 알 것이다. 예를 들어:
ㆍ 축퇴성 올리고는 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, A. pretiosum 또는 A. mirum 과 같은 막베신 생산 균주 유래의 관심 유전자를 증폭하는 데 이용할 수 있다.
ㆍ 다른 축퇴성 올리고는 막베신 생산자의 표적 유전자의 적절한 지역 또는 그 상동체를 성공적으로 증폭시킬 수 있도록 고안될 수 있다.
ㆍ A. pretiosum 균주의 표적 유전자 서열은 A. pretiosum의 유전자에 특이적인 올리고를 합성하는데 사용될 수 있으며, 이때 내부적 단편은 막베신 생산 균주, 예를 들면 A. pretiosum 또는 A. mirum으로부터 증폭될 수 있다.
ㆍ A. pretiosum 균주의 유전자 서열은 A. pretiosum의 유전자에 대한 축퇴성 올리고를 생성하기 위해 상동 유전자 서열과 함께 이용될 수 있으며, 이때 내부적 단편은 막베신 생산 균주, 예를 들면 A. pretiosum 또는 A. mirum으로부터 증폭될 수 있다.
도 2는 막베신 생합성 클러스터 내에서 post-PKS 유전자의 활성을 나타낸다. 당해 분야의 당업자라면 이에 따라 관심 화합물을 생산할 균주가 되도록 어떠한 추가적인 post-PKS 유전자가 결실되거나 비활성화될 필요가 있는지 확인할 수 있을 것이다.
이러한 시스템에서 추가적인 post-PKS 유전자가 삽입되었고, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 또는 이의 상동체가 불활성화 또는 결실을 포함하는 기술된 방법들 중 어느 하나의 방법에 의해 작용하지 않고 선택적으로 다른 post-PKS 유전자가 재삽입되었던 균주가 생성된 때, 하나 이상의 막베신 유사체가 생산될 수 있는 것으로 관찰되었다. 이에 대해 당업자들에 의해 이해될 수 있는 많은 가능한 이유들이 있다. 예를 들면, post-PKS 단계에 바람직한 순서가 있을 수 있는데, 단일의 활성을 제거하는 것이 이후의 모든 단계를 관련된 효소들에 맞지 않는 기질 상에서 이루어지도록 할 수 있다. 이는 post-PKS 효소에 제공되는 새로운 기질에 대한 낮아진 효율성 또는 단계의 순서가 바뀌어 더이상 남아있는 효소에 대한 기질이 아닌 생성물로 바꾸는 것으로 인하여, 배양액 내에 중간체를 생성하도록 할 수 있다. 선택적으로 생합성 경로에서 어느 유전자의 발현에 영향이 있을 수 있다.
당업자라면 혼합물 내에서 관찰되는 화합물의 비율은 성장 조건을 변화시킴으로써 조절될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
화합물의 혼합물이 관찰될 때, 이들은 하기의 실시예에 일부 기재된 바와 같은 전형적인 기술을 사용하여 쉽게 분리할 수 있다.
17-옥시막베신 유사체는 본원에서 기재된 바와 같이 많은 방법을 통해 선별될 수 있고, 하나의 화합물이 선호적인 특징을 나타내는 환경 내에서 균주는 바람직하기로는 이러한 화합물을 만들도록 조작될 수 있다. 이것이 가능하지 않은 비정상적인 환경 내에서 중간체가 형성될 수 있는데, 이는 이후 목적하는 화합물을 생산하도록 생체내 변환된다.
본 발명은 막베신의 17 위치를 산화할 수 있는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자의 선택된 삽입, 선택적으로 막베신 PKS 유전자 클러스터로부터 유래한 하나 또는 그 이상의 posk-PKS 유전자의 결실 또는 불활성화와 결합하여 생산되는 신규한 막베신 유사체를 제공한다. 특히, 본 발명은 선택적으로 막베신 PKS 유전자 클러스로부터 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 또는 이의 상동체의 선택된 결실 또는 불활성과 결합된, gdmL 또는 이의 상동체의 삽입에 의하여 생산되는 신규한 17-옥시막베신 유사체에 관한 것이다. 구체적 실시태양에서, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2가 추가적으로 숙주 균주에서 결실 또는 불활성화된다. 또 다른 구현예에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 추가적으로 결실 또는 불활성화된다. 또 다른 실시태양에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 셋 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 추가적으로 결실 또는 불활성화된다. 또 다른 실시태양에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 넷 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 추가적으로 결실 또는 불활성화된다. 또 다른 실시태양에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 다섯 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 추가적으로 결실 또는 불활성화된다.
하나의 구체적 실시태양에서, mbcP, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2가 결실되고, gdmL이 (예로 파지 부착 부위(phage attachment site)로) 도입되고 4,5-디히드로-11-O-데스메틸-15-데스메톡시-17-히드록시막베신을 생산하기 위해 프로모토로부터 발현된다.
하나의 구체적 실시태양에서, mbcM이 결실되고, gdmL이 (예로 파지 부착 부위로) 도입되고 4,5-디히드로-11-O-데스메틸-15-데스메톡시-17-히드록시-21-데스옥시막베신을 생산하기 위해 프로모토로부터 발현된다.
하나의 구체적 실시태양에서, mbcM이 결실되고, gdmL이 (예로 파지 부착 부위로) 도입되고 4,5-디히드로-11-O-데스메틸-15-O-데스메틸-17-히드록시-21-데스옥시막베신을 생산하기 위해 프로모토로부터 발현된다.
하나의 구체적 실시태양에서, mbcM, mbcP, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2가 결실되고, gdmL이 (예로 파지 부착 부위(phage attachment site)로) 도입되고 4,5-디히드로-11-O-데스메틸-15-데스메톡시-17-메톡시-21-데스옥시막베신을 생산하기 위해 프로모터로부터 발현된다.
하나의 구체적 실시태양에서, mbcM, mbcP, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2가 결실되고, gdmL이 (예로 파지 부착 부위(phage attachment site)로) 도입되고 4,5-디히드로-11-O-데스메틸-15-데스메틸-17-메톡시-21-데스옥시막베신을 생산하기 위해 프로모터로부터 발현된다.
당업자라면 유전자가 기능하지 않도록 하기 위해 유전자를 완전하게 제거할 필요가 없다는 것을 알 수 있을 것이며, 결과적으로 본원에서 사용된 용어 "결실되거나 불활성화된다"는 제한되지 않지만, 다음을 포함하는 유전자가 기능하지 않게 되는 어떤 방법이라도 포함한다: 유전자의 전체적인 결실, 유전자의 일부 결실, 표적 유전자로의 삽입에 의한 불활성화, 유전자가 발현되지 않거나 불활성 형태로 발현되도록 하는 위치특이적 돌연변이, 유전자가 발현되지 않거나 불활성 형태로 발현되도록 하는 숙주 균주의 돌연변이(예를 들면, 방사선 또는 돌연변이 유발 화학제, 원형질체 융합 또는 트랜스포존 돌연변이). 선택적으로, 활성 유전자의 기능은 억제제에 의해 화학적으로 약화될 수 있는데, 예를 들면 메타파이론(metapyrone)(다른 명칭으로 2-메틸-1,2-디(3-피리딜-1-프로파논), EP 0 627 009) 및 안시미돌(ancymidol)은 산화제의 억제제이며, 이들 화합물은 생산 배지에 첨가되어 유사체를 생성시킬 수 있다. 또한, 시네펀진(sinefungin)은 메틸 트랜스퍼라제 억제제이고, 이는 생체 내에서의 메틸 트랜스퍼라제 활성 억제를 위한 것을 제외하고 유사하게 사용될 수 있다(McCammon and Parks 1981).
하나의 다른 실시태양에서, 17 위치에서 산화할 수 있는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 삽입된 균주에서, 모든 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화될 수 있고, 이때 하나 또는 그 이상의 유전자가 상보성(예를 들면, 자가-복제 플라스미드 상의 부착 부위(attachment site)에 또는 염색체의 상동부위 내로의 삽입에 의해)에 의해 재도입할 수 있다. 그러므로, 특별한 실시태양에서 본 발명은 하기의 방법을 포함하는, 17-옥시히드로막베신 유사체의 생성방법에 관한 것이다:
a) 적합한 조건 하에서 배양했을 때 막베신을 생산하는 제1의 숙주 균주를 제공하는 단계;
b) 막베신의 C17 위치를 산화할 수 있는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자를 선택적으로 삽입하는 단계;
c) 모든 post-PKS 유전자를 선택적으로 결실시키거나 불활성화시키는 단계;
d) 상기 변형된 숙주 균주를 신규한 화합물의 생산에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
e) 임의로 상기 생산된 화합물을 분리하는 단계.
바람직하게 단계 b)에서 post-PKS 유전자는 gdmL 또는 이의 상동체이다.
하나의 다른 실시태양에서, 단계 c)에서 결실되거나 불활성화된 하나 또는 그 이상의 막베신 post-PKS 유전자는 재도입된다. 하나의 또 다른 실시태양에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자는 재도입된다. 하나의 또 다른 실시태양에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 또는 그 이상의 post-PKS 유전자는 재도입된다. 하나의 또 다른 실시태양에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2로 구성된 군으로부터 선택되는 셋 또는 그 이상의 post-PKS 유전자는 재도입된다. 하나의 또 다른 실시태양에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2로 구성된 군으로부터 선택되는 넷 또는 그 이상의 post-PKS 유전자는 재도입된다. 하나의 또 다른 실시태양에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2로 구성된 군으로부터 선택되는 다섯 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 재도입된다. 하나의 또 다른 선택적인 실시태양에서, mbcP, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2가 재도입된다.
또한, C17 위치를 산화시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 삽입되고, 적어도 하나 이상의 상기 post-PKS 유전자가 gdmL 또는 이의 상동체인 균주에서, 막베신 post-PKS 유전자들의 서브셋(subset)이 결실되거나 불활성화될 수 있고, 상기 post-PKS 유전자들의 더 작은 서브셋이 17-옥시막베신 유사체를 생산하는 균주에 도달하도록 재도입될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
당해 분야의 당업자는 C17 위치를 산화시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자를 추가적으로 발현하는 막베신에 대한 생합성 유전자 클러스터를 포함하고, 상기 post-PKS 유전자의 적어도 하나 이상은 gdmL 또는 이의 상동체인 균주를 생산하는 다양한 방법이 있음을 이해할 것이다.
폴리케티드 유전자 클러스터가 이종 숙주 내에서 발현될 수 있다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다(Pfeifer and Khosla, 2001). 따라서, 본 발명은 gdmL 또는 이의 상동체를 포함하고, 저항성 및 조절 유전자를 포함하거나 포함하지 않는, 완전하거나 추가적인 결실을 포함하는, 막베신 생합성 유전자 클러스터의 이종 숙주 내로의 전이를 포함한다. 택일적으로, 막베신 생합성 클러스터는 gdmL 또는 이의 상동체를 자연적으로 포함하는 균주로 전이될 수 있다. 상기에서 정의된 바와 같이 이러한 방대한 DNA 절편들의 전이를 위한 방법 및 벡터는 당업계에 잘 알려져 있거나(Rawlings, 2001; Staunton and Weissman, 2001), 본원에서 기술된 방법으로 제공된다. 이러한 배경에서, 바람직한 숙주세포 균주는 원핵생물이며, 더욱 바람직하게는 악티노마이세테(actinomycete) 또는 대장균이고, 보다 더 바람직하게는 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum; A. mirum), 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum; A. pretiosum), S. 하이그로코피쿠스(S. hygroscopicus), S. 하이그로코피쿠스 속(S. hygroscopicus sp.), S. 하이그로코피쿠스 바. 아스코마이세티쿠스(S. hygroscopicus var. ascomyceticus), 스트렙토마이세스 쭈쿠밴시스(Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 사카로폴리스포라 에리쓰래아(Saccharopolyspora erythraea), 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 아버미티리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 신나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 리모수스(Streptomyces rimosus), 스트렙토마이세스 알버스(Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 그리세오퍼스쿠스 (Streptomyces griseofuscus), 스트렙토마이세스 론지스포로플라버스(Streptomyces longisporoflavus), 스트렙토마이세스 베네주에래(Streptomyces venezuelae), 스트렙토마이세스 알버스(Streptomyces albus), 마이크로모노스포라 종(Micromonospora sp.), 마이크로모노스포라 그리세오루비다(Micromonospora griseorubida), 아미코라톱시스 메디터라네이(Amycolatopsis mediterranei) 또는 악티노플라네스 종 (Actinoplanes sp.) N902-109를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 예로는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 겔다너스(Streptomyces hygroscopicus subsp. geldanus) 및 스트렙토마이세스 비오라세우스니거(Streptomyces violaceusniger)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 전체적인 생합성 클러스터가 gdmL 또는 이의 상동체와 함께 전이된다. 하나의 택일적 실시태양에서, 전체 PKS는 관련된 막베신 post-PKS 유전자 없이, 그러나 gdmL 또는 이의 상동체와 함께 전이된다. 임의적으로, 일부 post-PKS 유전자는 적절하게 도입될 수 있다. 임의적으로, 겔다나마이신 또는 허비마이신과 같은 다른 클러스터로부터 유래한 추가적인 유전자가 적절하게 도입될 수 있다.
하나의 또 다른 실시태양에서, gdmL 또는 이의 상동체를 가진 전체적인 막베신 생합성 클러스터는 전이된 다음, 본원에 기술된 바에 따라 조작된다.
본 발명의 다른 택일적 양태로서, 본 발명의 17-옥시막베신 유사체는 적합한 균주를 이용한 생체내 전환에 의해 더 처리될 수 있다. 적합한 균주는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum), 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum), S. 하이그로코피쿠스(S. hygroscopicus), S. 하이그로코피쿠스 속(S. hygroscopicus sp.)과 같은 이용가능한 야생형 균주일 수 있다. 양자택일적으로, 적합한 균주는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, mbcM, mbcN, mbcP450, mbcMT2 (본원에서 정의된 바와 같이), gdmN, gdmM, gdmL, gdmP (Rascher et al., 2003), 겔다나마이신 O-메틸 트랜스퍼라제, hbmN, hbmL, hbmP(Rascher et al., 2005), 허비마이신 O-메틸 트랜스퍼라제 및 추가적인 허비마이신 모노옥시게나제, asm7, asm10, asm11, asm12, asm19 및 asm21 (Cassady et al., 2004, Spiteller et al., 2003)에 의해 코딩된 특별한 post-PKS 효소를 이용하여 생체내변환되도록 조작될 수 있다. 아직 규명되지 않은 유전자가 있거나, 공유 도메인 내의 서열이 존재하지 않더라도 당업자가 전형적인 방법을 통해 이러한 서열을 획득하는 것은 통상적인 것이다. 예를 들면 겔다나마이신 O-메틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 서열은 공유 도메인 내에 존재하지 않지만, 당업자는 프로브, 유사한 O-메틸 트랜스퍼라제를 이용하여 이종의 프로브를 만들거나 또는 이용가능한 상동의 유전자로부터 축퇴성 프라이머를 고안하고 생산 미생물로부터 DNA 단편을 증폭함으로써 상동의 프로브를 만들 수 있는데, 이는 겔다나마이신 생산 균주 상에서 서던블롯(Southern blots)을 수행하는데 사용될 수 있으며, 이를 통해 생체내변환 시스템을 생성할 수 있는 이 유전자를 획득할 수 있다. 유사하게, 허비마이신 클러스터의 공지된 서열은 최종 구조에 요구되는 P450 모노옥시게나제 중의 하나를 가지고 있지 않은 것 같다. 당업자는 유사한 P450을 이용하여 이종의 프로브를 만들거나 또는 이용가능한 상동의 유전자를 이용하여 축퇴성 프라이머를 고안하고 생산 미생물로부터 DNA 단편을 증폭함으로써 분리될 수 있는 상동의 프로브를 만들 수 있으며, 이는 허비마이신 생산 균주 상에서 서던블롯을 수행하는데 사용될 수 있고, 이를 통해 생체내 변환 시스템을 생성할 수 있는 이 유전자를 획득할 수 있다.
하나의 택일적 실시태양에서, C17-O-메틸 트랜스퍼라제를 gdmL 또는 이의 상동체와 함께 공발현시켜 C17 메톡시 막베신 유사체를 생산한다. 상기 O-메틸 트랜스퍼라제는 상기에 기술된 축퇴성 프라이머를 사용하여 겔다나마이신 생산 균주로부터 분리될 수 있다.
특별한 실시태양에서, 상기 균주는 본래의 폴리케티드 클러스터에 의해 생산되는 폴리케티드 생산을 막을 수 있도록, 전체적 또는 부분적으로 결실되거나, 아니면 불활성화된 하나 또는 그 이상의 본래의 폴리케티드 클러스터를 가질 수 있다. 상기 조작된 균주는 예를 들면, 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum), 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum), S. 하이그로코피쿠스(S. hygroscopicus), S. 하이그로코피쿠스 속(S. hygroscopicus sp.), S. 하이그로코피쿠스 바. 아스코마이세티쿠스(S. hygroscopicus var. ascomyceticus), 스트렙토마이세스 쭈쿠밴시스(Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 사카로폴리스포라 에리쓰래아(Saccharopolyspora erythraea), 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 아버미티리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 신나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 리모수스(Streptomyces rimosus), 스트렙토마이세스 알버스(Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 그리세오퍼스쿠스(Streptomyces griseofuscus), 스트렙토마이세스 론지스포로플라버스(Streptomyces longisporoflavus), 스트렙토마이세스 베네주에래(Streptomyces venezuelae), 마이크로모노스포라 종(Micromonospora sp.), 마이크로모노스포라 그리세오루비다(Micromonospora griseorubida), 아미코라톱시스 메디터라네이(Amycolatopsis mediterranei) 또는 악티노플라네스 종 (Actinoplanes sp.) N902-109를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 가능한 균주는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 겔다너스(Streptomyces hygroscopicus subsp. geldanus) 및 스트렙토마이세스 비오라세우스니거(Streptomyces violaceusniger)를 포함한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 천연적으로 막베신 또는 이의 유사체를 생산하는 숙주세포로서, gdmL 또는 이의 상동체가 삽입되어 17-옥시막베신 또는 이의 유사체(예로, 화학식 (I)의 화합물로 정의된 17-옥시막베신 유사체)를 생산하는 균주 및 17-옥시막베신 또는 이의 유사체의 생산을 위한 이의 용도를 제공한다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 변형되지 않은 상태에서 막베신을 천연적으로 생산하는 균주로서, C17 위치를 산화시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 삽입된 유전적으로 조작된 균주이며, 상기 post-PKS 유전자 중의 적어도 하나 이상은 gdmL 또는 이의 상동체이며, 임의적으로 막베신 PKS 유전자 클러스터로부터 유래한 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자는 결실되어 있는 균주를 제공한다.
본 발명은 본원에서 기술된 본 발명의 방법에 의한 모든 산물을 포함한다.
상기 기술된 본 발명의 17-옥시막베신 유사체의 제조 공정이 실질적으로 또는 전적으로 생합성에 의한다고 하더라도, 전형적인 화학적 합성 방법을 포함하는 과정에 의한 본 발명의 17-옥시막베신 유사체를 생산하거나 상호전환하는 것을 배제하는 것은 아니다.
막베신 PKS 유전자 클러스터의 유전적 조작을 위해, 먼저 유전자 클러스터가 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum)으로부터 서열분석되었지만, 당업자라면 예를 들면, 제한되는 것은 아니나 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum)과 같은 막베신을 생산하는 대체가능한 균주가 있다는 것을 이해할 것이다. 이들 균주 유래의 막베신 생합성 유전자 클러스터는 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum)에 대하여 본원에서 기재한 바와 같이 서열분석될 수 있으며, 상기 정보는 동등한 균주를 생성하는데 사용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기를 포함한다:
- 17-위치에서 막베신을 산화시킬 수 있는 활성을 코딩하는 유전자, 예로 gdmL가 도입된, 막베신 생산 균주에 기초한 조작된 균주. 임의로 또 다른 post-PKS 유전자, 예를 들어 mbcP, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2가 결실되거나 불활성화될 수 있으며, 임의로 이들 일부 또는 전부가 도입될 수 있고/있거나 임의로 이종성의 클러스터로부터 유래한 post-PKS 유전자가 도입될 수 있다. 이들 단계들은 어떠한 순서로 실시될 수 있다. 막베신 생산 균주는 적합하게 A. 프레티오섬(A. pretiosum) 또는 A. 미럼(A. mirum)이다.
- 상기 언급된 균주를 배양하는 것을 포함하는 17-옥시막베신 유사체를 생산하는 공정. 상기 균주들은 당업자에게 알려진 적합한 배지에서 배양될 것이고, 적합한 배양 물질(feed material), 예로 적절한 스타터 산(starter acids)가 제공될 수 있다.
- 17-옥시막베신 또는 이의 유사체를 분리하는 단계를 더 포함하는 상기 공정. 분리는 예로 크로마토그래피(예로, HPLC) 등의 전형적인 수단에 의하여 실시될 수 있다.
- 17-옥시막베신 유사체의 제조에서의 조작된 균주의 상기 용도.
본 발명의 화합물은 하나 또는 그 이상의 다음의 성질을 가지는 것으로 기대될 수 있다는 점에서 유리하다: 모 화합물과 비교했을 때 하나 또는 그 이상의 다른 암 서브-타입에 대한 우수한 활성; 우수한 간독성 프로파일, 우수한 신장독성, 우수한 심장 안전성과 같은 우수한 독성학적 프로파일; 우수한 수용해도; 우수한 대사 안정성; 우수한 제형 가능성; 우수한 생체이용도; Hsp90에 대한 높은 결합력, Hsp90에 대한 빠른 결합속도 및/또는 우수한 뇌 약물동력학과 같은 우수한 약물동력학적 또는 약력학적 특성; 우수한 세포 흡수성; 및 적혈구에 대한 낮은 결합력.
도 1은 첫 번째 잠재 효소가 유리된 중간체, 프리(pre)-막베신, 및 막베신에 대한 post-PKS 프로세싱을 보여주는 막베신 생합성을 나타낸 것이다. 도면 내의 PKS 프로세싱 단계의 리스트는 사건의 순서를 대표하는 것은 아니다. 다음 약어는 클러스터 내의 구체적 유전자를 위해 사용된다: ALO - AHBA loading domain; ACP - Acyl Carrier Protein; KS - β-ketoacylsynthase; AT - acyl transferase; DH - dehydratase; ER - enoyl reductase; KR - β-ketoreductase.
도 2는 막베신을 얻기 위한 프리-막베신의 post-PKS 프로세싱 부위를 나타낸 것이다.
도 3은 mbcP, mbcP450, mbcM1 및 mbcM2 유전자가 프레임내 결실된 악티노신네마 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum)의 생성을 나타낸 것이다.
도 4는 증폭된 PCR 생산물 1+2a의 서열을 나타낸 것이다(서열번호 14).
도 5는 증폭된 PCR 생산물 3b+4의 서열을 나타낸 것이다(서열번호 17).
도 6A는 gdmL을 포함하는 PCR 생산물의 핵산 서열이고, 도 6B는 GdmL의 아미노산 서열이다.
실시예
일반적인 방법
배양물 발효
세균 균주 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum) ATCC 31280(미국특허 제4,315,989호) 및 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum) DSM 43827 (KCC A-0225)(Watanabe et al., 1982)의 생장을 위한 조건은 미국특허 제4,315,989호 및 미국특허 제4,187,292호에 기술되어 있다. 본원에서 사용되는 방법은 이러한 특허들로부터 개조될 수 있고, 교반 배양기에서 튜브 또는 플라스크 내의 브로쓰(broths)의 배양을 위한 방법은 하기와 같을 수 있는데, 공개된 프로토콜에 대한 변형은 실시예에 나타냈다. 균주는 28℃ 온도로 2-3일 동안 ISP2 아가 배지 (배지 3, Shirling, E.B. and Gottlieb, D., 1966)에서 성장하였고, 종자 배지(배지 1, US 4,315,989와 US 4,187,292로부터 개조된 하기를 참조)에 접종하는 데 사용되었다. 그 후 접종된 종자 배지는 28℃에서 48시간 동안 5 또는 2.5 cm 작동반경으로 200 내지 300 rpm 사이로 교반하면서 배양되었다. 막베신, 18,21-디히드로막베신 및 17-옥시막베신과 같은 막베신 유사체 생산을 위해 발효배지 (배지 2, 하기 및 US 4,315,989와 US 4,187,292 참조)는 2.5% 내지 10% 농도로 종자 배양물에 접종되었고, 초기에 28℃에서 24시간 동안, 이후 26℃에서 6일 동안 5 또는 2.5 cm 작동반경으로 200 내지 300 rpm 사이로 교반하면서 배양하였다. 그 후 상기 배양액은 추출을 위해 수집되었다.
배지
배지 1 - 종자 배지
글루코즈 | 20g |
가용성 감자 전분 (Sigma) | 30g |
스프레이 건조된 옥수수 침지 농축액 (Roquette Freres) | 10g |
'누트리소이(Nutrisoy)'의 구운 콩 분말(Archer Daniels Midland) | 10g |
우유 고형분 유래의 펩톤 (Sigma) | 5g |
NaCl | 3g |
CaCO3 | 5g |
NaOH로 pH 조정 | 7.0 |
121℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.
오토클래이브 후 적절한 때에 아프라마이신을 최종농도가 50 mg/L가 되도록 첨가하였다.
배지 2 - 발효 배지
증류수 1L 내의 조성임
글리세롤 | 50g |
스프레이 건조된 옥수수 침지 농축액 (Roquette Freres) | 10g |
'박토(Bacto)'의 효모 추출물 (Difco) | 20g |
KH2PO4 | 20g |
MgCl2.6H2O | 5g |
CaCO3 | 1g |
NaOH로 pH 조정 | 6.5 |
121℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.
배지 3 - ISP2 배지
증류수 1L 내의 조성임
맥아 추출물 | 10g |
효모 추출물 | 4g |
덱스트로즈 | 4g |
한천 | 15g |
NaOH로 pH 조정 | 7.3 |
121℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.
배지 4 - MAM
증류수 1L 내의 조성임
밀 전분 | 10g |
옥수수 침지 고형분(Corn steep solids) | 2.5g |
효모 추출물 | 3g |
CaCO3 | 3g |
황산화 철 | 0.3g |
한천 | 20g |
121℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.
LCMS 분석을 위한 배양 브로쓰의 추출
배양 브로쓰(1mL) 및 에틸 아세테이트 (1 mL)를 첨가하고, 15-30분 동안 강 하게 혼합한 후 10분 동안 원심분리하였다. 유기층 0.5 mL를 수집하였고 증발시켜 건조한 다음 메탄올 0.25 mL 또는 메탄올 0.23mL + 1% FeCl3 용액 0.02mL에 다시 용해하였다.
LCMS 분석 과정
LCMS 분석은 양성 및/또는 음성 이온 모드에서 작동하는 Buker Daltonics Esquire 3000+ electrospray mass spectrometer가 결합된, Agilent HP1100 HPLC system 상에서 수행되었다. 크로마토그래피는 Phenomenex Hyperclone column (C18 BDS, 3u, 150 × 4.6 mm) 상에서 하기의 농도구배적 용출 과정을 이용하여 1 mL/min의 유속으로 용출하여 수행하였다; T=0, 10%B; T=2, 10%B; T=20, 100%B; T=22, 100%B; T=22.05, 10%B; T=25, 10%B. 이동상 A = 물+0.1% 포름산; 이동상 B = 아세토니트릴+0.1%포름산. UV 분광은 190 내지 400 nm 사이에서 기록하였고, 추출된 크로마토그램은 210, 254 및 276 nm에서 얻었다. 질량 분석은 100 내지 1500 amu 사이에서 기록하였다.
NMR 구조 해석 방법
NMR 스펙트럼은 1H 및 13C 각각에 대하여 500 MHz 및 125 MHz에서 작동하는, 298 K에서의 Bruker Advance 500 spectrometer 상에서 기록되었다. 표준 Bruker 펄스 시퀀스가 1H-1H COSY, APT, HMBC 및 HMQC 스펙트럼들을 얻기 위하여 사용되었다. NMR 스펙트럼은 이들이 작동하는 용매의 잔기 프로톤 또는 표준 탄소 공명과 대조되었다.
화합물 순도 평가
정제된 화합물은 상기에서 기술된 LCMS 방법을 이용하여 분석되었다. 순도는 다수의 파장들(210, 254 및 276 nm)에서 MS에 의해 평가되었다. 모든 화합물은 모든 파장에서 >95%로 순수하였다. 순도는 최종적으로 1H 및 13C NMR 스펙트럼의 정밀 검사를 통해 확인되었다.
수용해도 평가
수용해도는 다음과 같이 테스트될 수 있다: 실온에서 100% DMSO 내의 17-옥시막베신 유사체 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 앰버 바이알 내에서 3개의 0.01 mL 앨리쿼트(aliquot)에 0.1 M PBS, pH 7.3 용액, 또는 100% DMSO 중 어느 하나를 0.5 mL가 될 때까지 넣었다. 결과로서 얻은 0.2 mM 용액을 어두운 곳, 실온에서 6 시간 동안 IKA® vibrax VXR 쉐이커 상에서 섞고, 이후 얻은 용액 또는 현탁액을 2 mL 에펜도르프 튜브 안으로 옮긴 다음 13200 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상청액의 앨리쿼트를 상기에서 기술한 바와 같은 LCMS 방법 1에 의해 분석하였다.
항암 활성에 대한 시험관 내(in vitro) 생물검정
단일층 증식 방법에 의해 증식된 인간 종양 세포주의 패널에서의 항암활성에 대한 화합물의 시험관 내 평가는 온코테스트 시험 기관(Oncotest Testing Facility), Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg을 통해 수행하였다. 선택된 세포주들의 특징을 표 1에 요약하였다.
[표 1]
시험 세포주
# | 세포주 | 특성 |
1 | CNXF 498NL | CNS |
2 | CXF HT29 | 결장(Colon) |
3 | LXF 1121L | 폐, 거대세포암종(large cell ca) |
4 | MCF-7 | 유방, NCI 표준 |
5 | MEXF 394NL | 흑색종 |
6 | DU145 | 전립선 - PTEN 양성(positive) |
온코테스트 세포주는 Roth et al., (1999)에 기술된 바와 같이 인간 종양 이종이식체로부터 수립되었다. 공여체 이종이식의 기원은 Fiebig et al., (1999)에 의해 기술되었다. 다른 세포주는 NCI(DU145, MCF-7)로부터 얻거나, DSMZ, Braunschweig, Germany 로부터 구입하였다.
명시되지 않더라도, 모든 세포주는 RPMI 1640 배지, 10% 우태아 혈청(fetal calf serum) 및 0.1mg/mL 젠타마이신이 포함된 '조제 배지(ready-mix)' 배지(PAA, Clbe, Germany) 내에서 가습조건(95% air, 5% CO2), 37℃에서 생장시켰다.
화합물이 인간 종양 세포주의 생장에 미치는 영향을 평가하기 위해 변형된 요오드화 프로피디엄 분석(propidium iodide assay)이 사용되었다(Dengler et al., (1995)).
간단하게, 세포를 트립신 처리하여 증식기 상태에서 채취하고, 수를 세고, 편평한 바닥 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 세포주에 따른 세포 밀도(5-10.000 생존 세포/웰)로 접종하였다. 세포가 다시 증식기에 접어들도록 하기 위해 24시간 회복 후에, 배양 배지(플레이트 당 6개의 대조군 웰) 또는 막베신을 포함하는 배양 배지 0.010 mL를 웰에 첨가하였다. 각 농도는 3개씩 처리하였다. 화합물은 두 가지 농도로 적용하였다 (1㎍/mL 및 10㎍/mL). 연속적 노출 4일 후, 시험 화합물이 있거나 또는 없는 세포 배양 배지를 0.2 mL의 수성 요오드화 프로피디엄 (PI) 용액(7 mg/L)으로 교체하였다. 생존 세포의 비율을 측정하기 위해서, 플레이트를 냉동시켜 세포를 투과(permeabilization)시켰다. 상기 플레이트를 해동한 후, 형광도를 Cytofluor 4000 microplate reader(여기 530 nm, 방사 620 nm)를 이용하여 측정하였고 생존 세포의 총 수와의 직접적인 관계를 도출하였다. 생장 억제 정도는 처리군/대조군×100(% T/C)로 나타내었다.
실시예 1 - 막베신 PKS 유전자 클러스터의 서열분석
악티노신네마 프레티오섬(ATCC 31280) 및 악티노신네마 미럼(DSM 43827, ATCC 29888)으로부터 Kieser et al., (2000)에 기술된 표준 프로토콜을 이용하여 게놈 DNA를 분리했다. DNA 시퀀싱(서열분석)은 표준 과정을 사용하여 캠브리지 대학교 생화학과 서열실험실(Sequencing facility of the Biochemistry Department, University of Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QW)에서 분석했다.
프라이머 BIOSG104 5'-GGTCTAGAGGTCAGTGCCCCCGCGTACCGTCGT-3'(서열번호 1) 및 BIOSG105 5'-GGCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC-3'(서열번호 2)는 표준 기술을 이용하여 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 NRRL 3602(서열 수탁번호: AY179507)의 겔다나마이신 생합성 유전자 클러스터 유래의 카르바모일트랜스퍼라제-코딩 유전자 gdmN를 증폭하는데 사용되었다. 서던 블럿 실험은 DIG 시약 및 비-방사성 핵산 표지 및 검출을 위한 키트를 사용하여 제조지침서(Roche)에 따라 수행했다. DIG-표지된 gdmN DNA 절편은 이종 프로브로 사용되었다. gdmN에서 생성된 프로브 및 A. 프레티오섬 2112에서 분리된 게놈 DNA를 사용하여 약 8kb의 EcoRI 단편을 서던 블롯 분석으로 확인하였다. 절편은 표준 절차에 따라 리트머스 28 내로 클로닝하고, 형질전환체들을 콜로니 부합법(hybridization)으로 확인했다. 클론 p3을 분리하고, 약 7.7kb 삽입체를 서열분석했다. 클론 p3에서 분리한 DNA를 EcoRI 및 EcoRI/SacI으로 절단하고, 약 7.7kb 및 약 1.2kb 크기의 밴드를 각각 분리했다. 표지화 반응은 제조자의 프로토콜에 따라 수행했다. 상기에 명명된 두 균주의 코스미드 라이브러리는 벡터 SuperCos 1 및 Gigapack III XL packaging kit(Stratagene)를 사용하여 제조 지침서에 따라 만들었다. 이러한 두 라이브러리는 표준 프로토콜을 사용하여 선별되었고, 프로브로써 클론 p3로부터 유래한 7.7kb EcoRI 절편의 DIG-표지화 절편이 사용되었다. 코스미드 52는 A. 프레티오섬의 코스미드 라이브러리로부터 동정되었고, 서열분석을 위해 캠브리지 대학교 생화학과 서열실험실에 맡겨졌다. 유사하게 코스미드 43 및 코스미드 46은 A. 미럼의 코스미드 라이브러리로부터 동정되었다. 세가지 코스미드는 모두 서던 블롯 분석에서 나타난 바와 같이 7.7kb EcoRI 절편을 포함한다.
코스미드 43의 PKS 부분의 약 0.7 kbp 절편은 프라이머 BIOSG124 5'-CCCGCCCGCGCGAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC-3'(서열번호 3) 및 BIOSG125 5'- GCGTCCTCGCGCAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC-3'(서열번호 4)을 사용하여 표준 프로토콜에 따라 증폭되고, 클로닝 되었으며, 중복되는 클론에 대한 A. 프레티오섬 코스미드 라이브러리를 선별하기 위한 프로브로써 사용되었다. A. 프레티오섬의 코스미드 라이브러리 선별을 위해 사용되었던 프라이머 BIOSG130 5'- CCAACCCCGCCGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG-3'(서열번호 5) 및 BIOSG131 5'-GTCGTCGGCTACGGGCCGGTGGGGCAGCTGCTGT-3'(서열번호 6)에 더해, BIOSG132 5'- GTCGGTGGACTGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC-3'(서열번호 7) 및 BIOSG133 5'- GGCCGGTGGTGCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG-3'(서열번호 8)로 증폭된 DNA 절편 유래의 프로브를 생성하기 위해 코스미드 52의 서열 정보가 사용되었다. 코스미드 311 및 352기 분리되었고, 코스미드 352는 서열분석을 위해 제공되어졌다. 코스미드 352는 코스미드 52와 약 2.7kb의 중복부분을 가진다. 다른 코스미드의 선별을 위해 프라이머 BIOSG136 5'-CACCGCTCGCGGGGGTGGCGCGGCGCACGACGTGGCTGC-3'(서열번호 9) 및 BIOSG 137 5'-CCTCCTCGGACAGCGCGATCAGCGCCGCGCACAGCGAG-3'(서열번호 10)을 사용하고, 코스미드 311을 주형으로 사용하여 표준 프로토콜에 따라 약 0.6kb PCR 절편을 증폭했다. A. 프레티오섬의 코스미드 라이브러리가 선별되었고, 코스미드 410이 분리되었다. 이는 코스미드 352와 약 17kb가 중복되며, 서열분석을 위해 제공되어졌다. 세 가지 중복성 코스미드(코스미드 52, 코스미드 352 및 코스미드 410)의 서열이 결집되었다. 서열분석된 부분은 약 100kbp의 크기였으며, 막베신 생합성 유전자 클러스터를 구성하는 23개의 오픈 리딩 프레임이 확인되었다. 서열번호 11 내의 각 오픈 리딩 프레임의 위치는 표 3에 나타냈다.
[표 2]
코스미드의 요약
코스미드 | 균주 |
Cosmid 43 | Actinosynnema mirum ATCC 29888 |
Cosmid 46 | Actinosynnema mirum ATCC 29888 |
Cosmid 52 | Actinosynnema pretiosum ATCC 31280 |
Cosmid 311 | Actinosynnema pretiosum ATCC 31280 |
Cosmid 352 | Actinosynnema pretiosum ATCC 31280 |
Cosmid 410 | Actinosynnema pretiosum ATCC 31280 |
[표 3]
서열번호 11 내의 각 오픈 리딩 프레임의 위치
서열번호 11 내의 뉴클레오타이드 위치 | 유전자명 | 인코딩된 단백질의 기능 |
14925-17909* | mbcRII | 전사 조절인자 |
18025-19074c | mbcO | 아미노히드로퀴네이트 신타아제 |
19263-20066c* | mbc? | 알려지지 않음(unknown), AHBA 생합성 |
20330-40657 | mbcAI | PKS |
40654-50859 | mbcAII | PKS |
50867-62491* | mbcAIII | PKS |
62500-63276* | mbcF | 아미드 신타아제 |
63281-64852* | mbcM | C21 모노옥시게나아제 |
64899-65696c* | PH | 포스파타아제 |
65693-66853c* | OX | 산화환원효소 |
66891-68057c* | Ahs | AHBA 신타아제 |
68301-68732* | Adh | ADHQ 탈수효소 |
68690-69661c* | AHk | AHBA 키나제 |
70185-72194c* | mbcN | 카르바모일트랜스퍼라제(carbamoyltransferase) |
72248-73339c | mbcH | 메톡시말로닐 ACP 경로 |
73336-74493c | mbcI | 메톡시말로닐 ACP 경로 |
74490-74765c | mbcJ | 메톡시말로닐 ACP 경로 |
74762-75628c* | mbcK | 메톡시말로닐 ACP 경로 |
75881-76537 | mbcG | 메톡시말로닐 ACP 경로 |
76534-77802* | mbcP | C4,5 모노옥시게나아제 |
77831-79054* | mbcP450 | P450 |
79119-79934* | mbcMT1 | O-메틸트랜스퍼라제 |
79931-80716* | mbcMT2 | O-메틸트랜스퍼라제 |
[주] 1 : c 는 완전한 DNA 가닥에 의해 코딩된 유전자를 말한다;
2 : 어떤 경우에는 하나 이상의 잠재성 개시 코돈이 확인될 수 있다. 당업자는 이를 인식할 수 있고 대체가능한 개시코돈을 확인할 수 있다. 하나 이상의 가능한 개시코돈을 가지는 그러한 유전자들에 (*) 표시를 했다. 개시코돈이 될 것으로 기대되는 것에 표시하였으나, 당업자는 대체가능한 개시코돈을 사용하여 활성 단백질을 생성할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
실시예 2: 4,5-디히드로-11-
O
-데스메틸-15-데스메톡시-17-히드록시-막베신
mbcP, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2 유전자가 프레임내(in-frame) 결실된 악티노시네마 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum)이 제조되었고, 이 균주는 4,5-디히드로-11-O-데스메틸-15-데스메톡시-17-히드록시-막베신을 생산하기 위하여 추가적으로 gdmL이 발현되었다.
2.1.
mbcMT2
의 하위 플랭킹 부분에 상동적인 DNA의 클로닝
올리고 Is4del1(서열번호 12) 및 Is4del2a(서열번호 13)는 주형으로 코스미드 52(실시예 1로부터 생성된) 및 Pfu DNA 합성효소를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 악티노신네마 프레티오섬(ATCC 31280) 유래 DNA의 1595bp 부분을 증폭하는데 사용하였다. 5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위하여 AvrII 부위가 도입되도록 올리고 Is4del1 내에 고안되었다(도 3). 증폭된 PCR 생산물(1+2a, 도 4, 서열번호 14)은 mbcMT2의 3’ 말단의 196bp 및 추가적으로 하위 상동부분의 1393bp를 코딩하였다. 이 1595bp 단편는 SmaI으로 선형화된 pUC19 내로 클로닝하여 플라스미드 pLSS1+2a를 얻었다.
Is4del1 (서열번호 12)
5’- GGTCACTGGCCGAAGCGCACGGTGTCATGG - 3’
Is4del2a (서열번호 13)
5’- CTAGGCGACTACCCCGCACTACTACACCGAGCAGG - 3’
2.2
mbcM
의 상위 플랭킹 부분에 상동적인 DNA의 클로닝
올리고 Is4del3b(서열번호 15) 및 Is4del4(서열번호 16)은 주형으로 코스미드 52(실시예 1로부터 생성된) 및 Pfu DNA 합성효소를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 악티노신네마 프레티오섬(ATCC 31280) 유래 DNA의 1541bp 부분을 증폭하는데 사용하였다. 5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위하여 AvrII 부위가 도입되도록 올리고 Is4del1 내에 고안되었다(도 3). 증폭된 PCR 생산물(3b+4, 도 5, 서열번호 17)은 mbcp의 5’ 말단의 95bp 및 추가적으로 상위 상동부분의 1440bp를 코딩하였다. 이 1541bp 단편는 SmaI으로 선형화된 pUC19 내로 클로닝하여 플라스미드 pLSS3b+4를 얻었다.
Is4del3b (서열번호 15)
5’- CCTAGGAACGGGTAGGCGGGCAGGTCGGTG - 3’
Is4del4 (서열번호 16)
5’- GTGTGCGGGCCAGCTCGCCCAGCACGCCCAC - 3’
생산물 1+2a 및 3b+4는 pUC19 내로 클로닝되어 다음 클로닝 과정을 위해 pUC19 폴리링커 내 HindIII 및 BamHI 자리를 형성했다.
pLss1+2a 유래의 1621bp AvrII/HindIII 단편 및 pLSS3b+4 유래의 1543bp AvrII/BamHI 단편은 pKC1132의 3556bp HindIII/BamHI 단편 내로 클로닝되어 pLSS315를 생성했다. 따라서 pLSS315는 AvrII 자리에 결합된 목적하는 4개의 ORF 결실 부위의 플랭킹 부위로 상동적인 DNA를 코딩하는 HindIII/BamHI 단편을 포함했다(도 3).
2.3 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬의 형질전환
플라스미드 pUZ8002가 내재되어 있는 대장균 ET12567은 접합(conjugation)을 위한 대장균 공여균주를 생성시키기 위해 전기천공을 통해 pLSS315로 형질전환시켰다. 이 균주는 무성 접합에 의한 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬의 형질전환에 이용되었다(Matsushima et al., 1994). 세균접합체(exconjugants)를 MMA 배지(1% 밀가루녹말, 0.25% 옥수수 침지 고형분, 0.3% 효모추출물, 0.3% 탄산칼슘, 0.03% 황산제일철, 2% 아가)에 도말하고, 28℃로 배양했다. 24시간 후, 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕스산을 배양용기 상에 발랐다. pLSS315는 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬 내에서 증폭될 수 없지만, 아프라마이신 저항성 콜로니는 플라스미드에 포함된 상동성 부분을 통한 상동재조합에 의해 염색체 내로 통합된 플라스미드를 포함하는 형질전환체가 될 수 있을 것으로 기대된다.
2.4 2차 교차에 대한 스크리닝
6개 막베신 생산 세균접합체는 추가적 분석을 위해 선택되었다. 6개 세균접합체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 제한효소처리하고, 서던블롯으로 분석했다. 블롯은 6개 분리체 중 5개에서 분리주 통합(isolates integration)이 상동체의 RHS 부분에서 발생하였고, 6개 분리체 중 1개에서 분리주 상동성 통합(isolates homologous integration)이 LHS 부분에서 발생하였음을 나타내었다. LHS 부분에서 상동성 통합으로 발생한 하나의 균주(BIOT-3829; Actinosynnema pretiosum:pLSS315#9) 및 RHS 부분에서 상동성 통합으로 발생한 두 개의 균주(BIOT-3826; ctinosynnema pretiosum:pLSS315#3 및 BIOT-3830; ctinosynnema pretiosum:pLSS315#12)는 2차 교차에 대한 스크리능을 위하여 계대배양으로 선택되었다.
균주들은 MMA 배지(50 mg/L 아프라마이신으로 보충된) 상에 부착되고, 28℃에서 4일간 생장시켰다. 각각 부착물의 1 ㎠ 부분을 50ml 팔콘 튜브에 담긴 7 mL의 ISP2(0.4% 효모 추출물, 1% 맥아 추출물, 항생제가 추가되지 않음)를 접종하는 데 사용했다. 배양물은 2-3일간 생장시켜 이후 50ml 팔콘 튜브에 담긴 7 mL의 ISP2(상기 참고) 내로 계대배양(5% 접종)했다. 4-5회 계대배양 후 배지에 초음파를 처리하고, 연속적으로 희석한 후, MMA 배지에 도말하고, 28℃에서 4일동안 배양하였다. 이후 단일콜로니를 아프라마이신을 포함하는 MMA 배지 및 항생제를 함유하지 않은 MMA 배지에 이중으로 부착한 후 플레이트를 28℃에서 4일 동안 배양하였 다. 항생제가 없는 플레이트 상에서 성장하지만, 아프라마이신 플레이트에서 성장하지 못하는 부착물(patch)은 이들이 항생제 마커를 잃었는지를 확인하기 위해 +/- 아프로마이신 플레이트 상에 재부착시켰다. 그 목적하는 돌연변이 균주는 유전자 mbcP, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2를 포함하는 막베신 클러스터의 3892bp의 결실을 가지고 있다. 올바른 결실을 포함하는 악티노신네마 프레티오섬:pLSS315#12로부터 기원한 콜로니를 BIOT-3852로 명명하였다.
이 균주의 발효 브로쓰를 추출하고, 일반적인 방법에 기재된 방법으로 분석하였다. LCMS 분석은 어떠한 막베신이 생산되지 않았으나, 단일의 더 많은 극성, 15.0분의 정체시간(retention time)을 가지는 주요 성분 14 및 m/z=515.5[M-H]-, 539.5 [M+Na]+가 관찰되었음을 나타내었다. 이것은 다른 곳에서 생산된 화합물 4,5-디히드로-11-O-데스메틸-15-데스메톡시막베신과 (구별 후에) LCMS 및 NMR에 의해 구별할 수 없었다.
14
2.5 플라스미드 Lit28gdmL의 분리
올리고 BioSG110 (서열번호 18) 및 BioSG111 (서열번호 19)은 표준 기술을 사용하여 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 NRRL 3602 (서열 허가 번호: AY179507)의 겔다나마이신 생합성 유전자 클러스터로부터 유래한 DNA 1512bp 부분을 증폭하는데 사용되었다 (서열번호 20; 도 6A, gdmL 아미노산 서열은 또한 도 6B, 서열번호 21에 나타나 있다). XbaI 및 NdeI 제한 부취가 밑줄된 프라이머의 말단에 도입되었다. 증폭된 PCR 산물은 전에 표준 기술을 사용하여 EcoRV로 선형화된 벡터 Litmus28 내로 클로닝하였다.
BioSG110 (서열번호 19):
5’- GGCATATGTTGACGGAGAGCACGACCGAGGTCGTTG - 3’
BioSG111 (서열번호 18):
5’- GGTCTAGAGGTCAGGGCACCCTCGCGAGGTCGCCGG - 3’
2.6 플라스미드 pGP9
gdmL
의 분리
플라스미드 Lit28gdmL은 NdeI/XbaI으로 절단되었고, 약 1.5kb 삽입 DNA 단편이 분리된 후, 이를 NdeI/XbaI 처리된 벡터 pGP9에 클로닝하였다. 플라스미드 pGP9gdmL은 표준 기술을 사용하여 분리되었다. 작제물은 제한 분해 분석(restriction digest assay)로 확인되었다.
2.7 pGP9gdmL로 BIOT-3852의 상보성(complementation)
플라스미드 pGP9gdmL을 이용하여 BIOT-3852의 접합 실험(conjugation experiment)가 다음과 같이 실시되었다. 플라스미드 pUZ8002가 내재되어 있는 대장균 ET12567은 접합(conjugation)을 위한 대장균 공여균주를 생성시키기 위해 전기천공을 통해 pLSS315로 형질전환시켰다. 이 균주는 BIOT-3852와 결합하여 접합 실험을 위해 사용되었다(Matsushima et al., 1994). 세균접합체(exconjugants)를 배지 4(MAM 배지)에 도말하고, 28℃로 배양했다. 24시간 후, 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕스산을 배양용기 상에 발랐다.
형질전환체는 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕스산을 포함하는 MMA 플레이트(배지 4) 내로 부착되었다. 각각의 부착물로부터 6 mm의 원형 플러그를 종자배지 10 mL(배지 1의 변형- 2% 글루코스, 3% 수성전분, 0.5% 옥수수 침지 고형분(corn steep solids), 1% 콩가루, 0.5% 펩톤, 0.3% 염화나트륨, 0.5% 탄산칼슘)를 포함한 각각의 50ml 팔콘 튜브에 접종하는 데 이용했다. 이들 종자배지 배양액을 28℃, 200 rpm 조건에서 2 인치(inch) 작동반경으로 2일 동안 배양했다. 이들을 이후 생산배지(배지 2- 5% 글리세롤, 1% 옥수수 침지 고형분, 2% 효모추출물, 2% 인산이수소칼륨, 0.5% 염화마그네슘, 0.1% 탄산칼슘)에 접종하고(0.5 mL 내지(into) 10 mL), 28℃에서 24 시간 동안 생장시키고, 이후 26℃에서 추가로 6일 동안 생장시켰다.
발효 브로쓰의 추출과 연속적인 LCMS 분석이 일반적인 방법에 기재된 방법으로 실시되었다. 그러한 하나의 추출물에서, 화합물 14의 산물 외에 작은 양의 새로운 화합물 (15)의 산물이 13.4 분의 정체 시간으로 용리된 것이 관찰되었다. 이것은 m/z = 531.4[M-H]- 및 555.4 [M+Na]+를 가진 특징적인 이온을 나타내었고, 화합물 15가 화합물 4,5-디히드로-11-O-데스메틸-15-데스메톡시-17-하이드록시막베신인 것과 일치하였다.
화학식 15
본원에서 언급되는 특허 및 특허출원을 포함하는 모든 참고문헌은 가능한 한 전체적인 범위로 본원에 참고용으로 포함된다.
명세서 및 하기 청구항까지 전체적으로, 만일 문맥상 달리 요구되지 않는다 면, 단어 '포함하다', 및 '포함하다'와 '포함하는'과 같은 어미 변화 단어는, 어떠한 다른 전체적인 것, 또는 전체 또는 단계들을 이루는 단계 또는 그룹도 배제하지 않는 경우를 제외하고, 제시된 전체적인 것, 또는 전체를 이루는 단계 또는 그룹을 포함하는 것을 나타내는 것으로 이해되어질 것이다.
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SEQUENCE LISTING
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<120> 17-OXYMACBECIN DERIVATIVES AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF CANCER AND/OR B-CELL MALIGNANCIES
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aggtcgcggg cggcccgctc gtccacctcg cccaggccgg cgcgcagggc ctcggtggtg 3720
atgagggtgc ggaagagctc ggccagggcc tccgccagcc gccacgcgca cgggccggtg 3780
agcacggcgc ggtagaaggg gcggtggtcg gcgaagtggc gggccacggc caggaggcgg 3840
gcgtggcgcg gggcccgcgg gtcggccagg tgcggcagga gctcgcgccg caccaggtcc 3900
gccgcagcgg cgacgaggag cgtgtcgcgg tcgccgaagt gctggtagag cagctgcctg 3960
ctgacgtcgg cggcctcggc caggtcggtc accgggaccg ccgccccgcg ctcggcgacc 4020
aggtcgacgg cggcggccat gagggcggcc ctggagcggg cgacccggcg gtcggggcgg 4080
gtggtcacgg gggtgaaact agacagttgt caataaatga gcaagtgtcg tcgaacgcgc 4140
gcgcgggaat ctccggtgcg cggggcccgt ccctggcagc atgatcacgc gatgaccgag 4200
gtgaggacgc gcccgtacgc cgggcccgcg gacctgcgcg cgatgcaggg gttggcgcgg 4260
cggatctgga cgccgtcgag ccggtggcac gtcggcgacc tggcctggca gcgcaaccag 4320
cacaccgggc gcgaggccga gtggccgacc gcgctgtggg aggcgggcgg cgaggtggtg 4380
gcgtgggggt gggccgagct gccgggtgag ctggcgctgc tggtcgaccc cgcccggccg 4440
gagcttgcgg gggcggtgct cgactggttc gcgggcgtgg ccaccgcgcc ccggcggtcg 4500
gtcaccgtgc tggacgccga accgcacctg gtcgccgcgc tggaggctcg cgggtacgag 4560
cggctgggcg ggccgcactt ccggcactcg gtgcgcgcgc tggacgacct gccgacgccc 4620
gaactgcccg ccgggtaccg ggtccgcgcc gtgcggggcg aggaggacgt ggcggcgcgg 4680
gtcgcggcgc accgggcggc ctggtggccg tcgcgggtca ccgaggagag ctaccgggcg 4740
gtgatggggg cgtggccgta ccggccgggg ctggactggg tggtggaggg gccggacggg 4800
cggttcgcgg ccacctgcct gatctggttc gacgagcgca acggcgtggg cgagctggaa 4860
ccggtcgggg tcgaccccgg tctgcggcgg cgcgggctgg ggcgggcggt gtgcctggcg 4920
gcgctgggcg cgctgcgcga ggcgggcggg cgggcggcgg tggtgtaccc gctgcacggg 4980
caccccgacc accccgcgcc cgcgccgctg taccgggggc tggggttccg cgagcacgcc 5040
cgcacgatca ccttcaccgc gctggaggcg cgcgggtagc agcggccggg cggggcgagc 5100
ggacccggtc gacgagcggc tccgctgtcg gagcggtcgt cccagcgcgt ggacaccagt 5160
gccacgacca gaccgcgccc cgcttcgcgt ggtcggctcg ggggtcgacc gcggtgaggc 5220
tctcgccggg gtgggtgaac cacgtcctgg cgatggcctg caccgcgagc accgggtgcc 5280
gcccgtggcg ctggacgtca ccgacgcagc cgccgtcgac cgggccgggc cggccgcgtt 5340
cggccgttgc gccgcgccgg ccgagtccga cgccaggtgg cggccggtcc ccgggtccgc 5400
ctggaactga ccccgccggc ctccccgccc gcccgtccgg ccgggcgccg aacccgcctc 5460
aggcgtgctc gaccgcgcgc accgatcccc ccaccaccac cggcatcggg acgtggtgca 5520
cggtcgtcgg gctgcggtcg cggcgggggc gggacaggag gagttccacg gccatcgcgc 5580
ccaggcggtg gtgcggcagg gcgacggtgg tcaggcgcgg gcgcatccag gcggccacgg 5640
ggtggtcgtc gaagccgacc acggagacgt cgtccggcac ggacaggccc gcctccgcga 5700
gcgcctggca cgcgccgaac gccaggcggt cgttgaagca cagcagcgcg cgagggcggt 5760
ggtgggacag gaggtccagg gtggcgcggt agccgttctc cggcatccac tccacgcacg 5820
ggcgcacgct ctccacctcc acccccgccg ccgcgaaggt ctccagcgcg ccggagaggc 5880
gggccacggc ggcgatgtgg cgcgggtcga tcgcctcggc cgtgggcccg gtgccgatca 5940
ggtgcacgcc ctcgcggtgc ccggcgtcga gcagcacgcg cgccgccgaa cggccgccgc 6000
cgcggtcgtc ggggagcacg gcgtgcgcgg ggaagtcgtt ggcgggcagc acgttcagca 6060
gcacggacgg cccgtcgcgc agcccgtccg ggacctccag cagccggggg aacctggccg 6120
cgaagaccac gccctccacc tggcgggcgc gcagcgaggc caccagcgcc gcctccacct 6180
cgcggtcgcc gccgctctca ccggcgaaca gggtgaaccc gtgccggtgg gcggcgccga 6240
ccgcgccctc gatcagctca ccggacagct tggccgaggc cacggcgtcc gagacgaaac 6300
cgagggtctt ggtgcgggag gcggacagca gcgtgtcgcg gcggtagccg agctgctcgg 6360
ccgtcgcccg caccttgcgc tccaccgccg ccgagatgcg cagctcccga gcgcggccgg 6420
agagcaccag ggaggcggtg ggcaccgaca cggcgcaggc ggacgcgacg tcggccagcg 6480
tgacgcgcgt ccgcccgctc tcgcggacac ctgctcgcgg gggtgtgccc gtcacccgtg 6540
cctcccgtca ccggtcgcgc gacagccccg cgcgaggtcc taccccatcg tgcaggccgc 6600
gccgttcaag gagaaccccg aaggtggggc cgcgtccccg ccgtgggtga cctggtagcc 6660
gatgctgact ttgccaccgg gtgggatcgc cgcgttgtag cccgcgtcgc gggcggtcac 6720
ccggcccgag ctgggcgcgt acgaggcgtt ccagccggag gtgatcacct ggcccgcggg 6780
cagcgcgaac tccagcgacc agccctgcac ctgcgtggtc ccggtgttgg tgatggcgag 6840
ctccgccgtc aggccgttgc cccaggcgtt gacggtggcc gacacccggc aggcccccgg 6900
ctgcggttcg ccgggcgtgg tggtggtggt ggtggtggtg gtcgtggtcg tggtggtgct 6960
ggtcgggtcg gggccggttc cggcgaactg ggtgaagaac cgccaggtct cctcgggcgc 7020
ccacgtcctg gtgccgctgt cgccgggcgc gttgtcctgc ggtgcggcga tgtggccctc 7080
gtcgaacgcg acccagcgca ccgggtagcc gtcgcggcag ccggtgtagg tggtgccccg 7140
gtgggtcagg ctgccctggg acggttccgg cgggttctgc gcggcgcagc cgttgttgcg 7200
cacgaaccgg tcgcgcatcg agcgcccgcc ggagatgttc aggacgctgt cgcgcaggcc 7260
gtggatgccg aggtaggcga tgggctgcgt gccgccggcg cagccgctga gcacgccgcc 7320
cgcgatgacc gcgaccgcgc ggaacaccgt cggccgcgag caggccaccg agtaggacat 7380
cgcgccgccg tagctgaagc cggtggcgaa ccgctgggtg gtgtccacgc acagcccggc 7440
gtcgagctgg cggacgatgt cgtcgacgag ggtgatgtcc tcgccgccgt tgttggccca 7500
gccgttgttg aagccctgcg gcgccacgaa gatcgtgctg ctgcccgcca ggcgcttgag 7560
gccgtagtag gaccagacgt cccgctgcac ggtctggccg gtggcgacgt cgttcgcggt 7620
gccgctgagc cagtggaagc cgaagacgac gcggtggggg cggttccggt cgtagccgtc 7680
cgggatcgac aggatgtagg tgcgggactt gccgctgctg gtgatcgtgc gcgtgccgct 7740
ggtgagcgcg ggcgccttgc cgcagccctc cgtcgtggcg gacgcgccgg gggcgccgga 7800
cgcgccgggc gctccggtcg cgctggtggt gatcagcccc gcggcgaggg tgagcagcgc 7860
gatgcccgct gccgcgagga ccctgttgcg cgccaaggga ttcgcccttc ctgtggtggt 7920
tccggtgggt gtggtcacgg ggtggtgagg tcgaagcggc gggcggtgac ggagccgccg 7980
agcgcggcgg tggcgtggtt gaagacggcg aagcggtagc ccatgaagaa ccgccagtcg 8040
ttcttgagcg tgaacgccgg gccgaaggcg gtgaagttga cgccgtcggt gctgtaggag 8100
aaccgggcct gcctgccgtt gccggggcgg atgtcggcgt tggcgcgcaa ccagatccgg 8160
gagccgccca ggtcggcgct cgcgacctcg tagccggttc cggtggtgcg ccaggagccg 8220
tccatggtca ggccggtgac ggagacgatc cggttgcggc cgttgtcgcg cttgacgccg 8280
atccacgccg aggagtcgcg cagcacggcc agcccggtgc ggtcgccgtc gcgcatcccc 8340
gacaggtcca gttccacggt gccggtggag gtggggccct ggatgcggtg ggtgagggtg 8400
ttgcgggcgg agtacaggtc gttggtgacg gtcgcggtgg acaggcgaag gccgttgttc 8460
acgctgtact tggcggtgtc cgggttgtgg ttccactccc actgcgggcc gagcgcggcg 8520
ccggagaagg tgtcggcgcc gatcatgggt ttgacctggc gcgggggcgc gggcaggttc 8580
ggcttcgggt aggtcgcgcc ccagccgccg ttgacggtgg tgacgcgcgg ccagccgtcc 8640
gaggtccagg tgatcggggc gagcaccggc acgcgcccgc cggggtaggc gtcgacgaac 8700
gccaggtagt gccagtcgcc gttctgggtc tgcaccaggc cgccctggtg cggcactccc 8760
ccgccctgga tcggcgaggg caggtcgagc agcacctgct ggatcgagta cgggccgaac 8820
gggctggacg acttgagcac gtactggccg ttcgcgggcc tggtgagcca gatgtagtag 8880
ttgccgccgc gcttgtagaa gcgcgcccct tcgagggtgc cgatgttcga gggggtctgg 8940
aacacctgct gggagcggac ctccgacttc ccgtcggcgg agagctgggc gacgctgatg 9000
ctggtgttgc cgtaggcgac gtacagggtg tcgtcgtcgt ccacgagcat cccggcgtcg 9060
tagtagcact tgttgatggt ggtgtgcttg gaccactggc cgtcgacggc ggtcgcggtg 9120
tacaggtgcg tctgggcgaa gtcgacgcag ccgccccagt agaaggtgcg gttgctcttg 9180
cggtgcgcca ggaacgacgc ccagatgccg ttgacgtacg cgcgggagcc gttgcccatg 9240
tcgtacttgg ccccgaagtc caggcgtggc acggagtgcc cggcgaactc ccagttgacc 9300
aggtcgtagg agcgcagcac gggcgcgccg ggcgagtagt gcatggtgga ggccgagtag 9360
tagtaggtgt cgtccacgcg caggacgtcg atgtcggcga agtcctgcca cagcacgggg 9420
ttggtgtagg tcccggccgc gcgggccggg tgggtggtgg tggcggtcag gctcgccgcc 9480
acgaggccga gcacggccag ggcgatgggc gcccatcggc gttgacgggg catcggtgtg 9540
cctctcctgg tgtccgggag ttggctctgg gcgcggcggc ggtggacttg tcgggcgcgg 9600
cggtggtcgt gggggtcagc agggggagtt ggtctgggtc agcaggccca gccgccaggg 9660
caggcggttg tagtcgccgg acgcgttggg gtccaggccc tggtacaggt agctcagctt 9720
gcaggggttg atctccatgg tctggtcggt cccgctgcgc accagctcgc cgtggctgat 9780
gtcgcgcgtc cactggccac cggggaacgt ggtgttgttg gccctggcga acgggttcga 9840
ctcgctgtcg gccagcgcgg tccacggtcc ggcgatcgcc ggggcggtcc aggagcggaa 9900
ccagcggcgg ccgtccgagc cgatcgcctc gtggagcatc agccactggt tcttgccggc 9960
gaccttgtag atgttggacg cctcgaacaa ccggttgcgg ttgctgtcct gcatggcgat 10020
cacggtgttg gtgaagccgt tggggaactg ggcgaggctg gtctccgagc ggtacaggtg 10080
gccgttgtcg tccgaggaga acaggtggca cttggccgtg tcgcagacgg tccagaagtc 10140
gacccagtag ccgttgccga tgttgtcccg gatgatctgc ggcatcccgt tggcgtagaa 10200
gttcctcggc gcggaccagg acgcggggtt ctcgatgtcg gcggtcgtcg agtacgaggc 10260
gttggacccg gtctggtaca ccaggtacca caggcgttgc ggggcgaagt agaacacctg 10320
cggcgcggcc cggtagcccg tgccgatccc ggagcggtcc aggtagtggt gcggggcgga 10380
cgcggcctgg gaccagtcgg tgaagctggt gtgcacgagg ttgtagccgt tggtgtagac 10440
cgaggcgaac acgtggtagc ggccgttgtg gcgcaccacg ctggggtcct tgacggagac 10500
cgtggcgtgc gaggagtcgg gcttgggtcc gatcagcgcg ccgctggagg accaccggaa 10560
gctgctcggc agcgagccgc ccggttgctg cggggtcgtg gtggtgggcg gcgtggtcgg 10620
gggcgtggtg gtcgtgggcc cgactcctcc cgtgcacgtg gtcccgttga ggctgaacga 10680
ggtcgggtcg gggttggacc cggtggaggt cgcggtgaac ccgaactcga cgcggccccc 10740
ggtggggatg gcggcgttgt aggaggcgtt gcgggcgctc acctggccgc cggactggga 10800
cacctcggcg ttccaggcct gcgcgacctg ctggcccgag ccgtaggtcc aggtgagcgt 10860
ccagccgtcg acggcgtcac cgaggttggt gatggcgacg ctcgcggtga aaccgccctg 10920
ccactgggag gtcgccgcgt aggcgatcga gcaccccggc gccgcggcgg cctggggtgg 10980
gagggcggcg agcgcggcca ccatggcgag cgaggtggtg gccatggcgc cgatccgggc 11040
ccggcgcggg gtgaacagcc ttgcgaggag catggtcgcc cttcgtcgtc gtcgacgggt 11100
ggtcggcgcg gccgaccggg agcggcggga gcgggctggt actcccccac ttcctgcaat 11160
ctagccaggt ggcacagggt ggtcaaagct aaaaagggcg gacgcggttt agcttccagc 11220
gcaaaggttt cgcgcgttct ttcggccggg gggcaggtgg atcggggcgg gctcggggcg 11280
aggacggggc tgggaatggg gcgggggatg gggcgggctc ggggcggggg tcgcccggag 11340
cccgccacgg gtcagaggcg cacgcggacg acggtgaacg ggaggttcgg ctcggcgatc 11400
tggtactgga agttgaccac cagcaggtcg tcgccgtcga aggtcgcggt ggacgggacg 11460
tccatgcccc tgccgttgac ccgccgcagc accgtggcgc gggagtggtc ctcgctcagc 11520
cgcaggacgc tgatctcgcc ctccgggtgg aacaggctgg tgacgctgta gaggtcgttg 11580
ccgcgcagga gcagcccgtc cgagccgatg tcgcccacgc cgcccaggtc gatcggggtg 11640
acggcgccgg tgcgggtgct gatgcggtgg aacgcctggg agttggtgtc ggcgagcagc 11700
acgtggcggc cgtccggggt gaccacgagg ccgttgccgt tgatgccctc ctcgtagcgc 11760
accggggagt cggcgaggtc cacgaacgtc ctcagtggct ggtcgacctc ggggctcgcc 11820
agctgggcgg cggtgatccg gtagaggacg gggcggaacg agtcgctgac gtaggcgtcg 11880
ccgttcgggg cgatggcgac gtcgttgacc aggccgtcgc gggcgccgga gtcgaacacg 11940
tgcaggagcg cgccggtgcg ggtgctgtgg acgaagacct tgccggtggc gccgcccgcg 12000
atgaccagcc tgcctcgggt gatcttcatg ccgacggcgg tggtgcggcc gtgctgaccg 12060
gcgggcagga acggctccag ggcggggcgg tcgacgtggc cgcgccagat cgtgccgtcg 12120
gtcgtgccgc cgacgtagaa gtgcggcgtg cccggctcgc ggacgatgcc ctccgggtag 12180
gcgcggtcgc cggggaccac gtagcgggtg acggggtggt gcgcggcggc ggcgggtggc 12240
acggcggcgg cgggtggcgc ggcggcggcg ggtggcgcgg cggcggggag ggctggggcg 12300
agcgcggtga ggagcagggt cgcggtgagg agggctcggg tggtggtcac ggaagggctc 12360
cgggggtcga aggggtgtct ggcgccagac aagcgcttcg tggcgcgggg tggcagtggg 12420
cgcttgtcgg gggtagttct tcacccccct tccgggcggg gcggccgact agggtgagcg 12480
gtgtgggcga tcttgggcgg cacccggtgg cgaaccgctc cgacgtgcgg gacttcctgg 12540
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ccggggtgct gcggctcgac gccgaggagc gggtctacct gttcgacctg gcgcgcgcgg 12780
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ccgagttccg ggcgcggtgg agcgcgcacg acgtgctgct gcacccgcgc ggcgccaaga 13200
ccttccggca ccccgaggcg ggtgagctga gcctgagcta ccactcggtg gacctgccga 13260
tctccgccac cgagacccgg cacgtgtgcg cgtgcaccgc cgaacccggc tcgaccgacg 13320
aggcgaggct gcgcgcgctc gtcgggtgag ccgggggtgg ccggccaccg ccgtcgcgct 13380
cgcggcggcg gggcggggcc gccggtcaga gcgtgagcgc catcccgatc gagccgggcg 13440
cggtctcggt gaagccgtgc ttgaggtaca gcgggcggcc gggcgcgtcg gccaggaggg 13500
tcacgaacgc gccgggcggg gcggcctcgc ggatgcgccg gagcagcgcg tccatgatcg 13560
cgccgccgac gccccttccc tggtggtcgg gcagcacggc catgtcgacg acgtggaagt 13620
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cgtggaagga ggcccaggcg ccgggcaggg cggcggcggc ctgctcggcg gtcttgggcg 13740
acaggccgga ctcggcgcgc aggcggaggt agtcggcgac ggacggcggg gtcgggtgga 13800
gctcgtagtc ccggtgcacg cggtcaggct cccacgggcg cgggcgggcc cccgcccgac 13860
ctgacgattt ccccgtcggc ggggatgcgg gcgggcgctc gcggattttc gacatccccc 13920
ggcccggcga gacgcggcgg cgccgctgaa aagagcgccg tcgcggccct tcgcgccgcc 13980
cccgacatcc cccgcgcggc gaccggtcaa tgcggtccac gcctgggggt ttccctccca 14040
cgtcgaacac cgccaccacg cgcccacgcg ccgcgtcgac caccccgacg ccgaggaaca 14100
cctgttcacg ggcacgggaa gccgcagcgg agggggaacc gggaatggcc gcaggcgatc 14160
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aggaagattc cagcgcccct ctcgaagaac ctgcgggaag ccctggaaga aaacccggac 14280
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accccgccca accgggcacc gagcgggcac ctccactcgg cccagcaccg ccccaagatc 14460
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tgccggaccg ggcgggacgg gcgttcctgg tggacggacc gcccgcctgc ggcaagacga 15300
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cctgcacccc gccggagacg gagctgccgt tcggggtgct caagcagctc ctcgcctccc 15420
ccggcatggc cagggtcgac ccgcgcctgg tcgccgacct cggcgagctg ctcgccccgg 15480
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tgttcctgga caccgtgcgg gcgctggccg tgctgggcgg cggctcggcg tcggacctgg 16020
gcaggctgtc cgggcacgag ccggagcagg tcgcccaggt gctgaacgcc ctgcgggagt 16080
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cggcggcggt ggcgctgctc cagcgcgcgc tcgactgcag cccggaccgg gagcgcagga 16380
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cgacgctgat gaagcacctg cgctgggccg ggaacaccgc cgactcggac gcggtgctcg 16560
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cggaccgcgc ggacgtggcc gcctcgtggt gcgagcagct gctgtcggcg cgggccgtgc 16920
cgctgctgcc gatgccgcgc gcgcaggtgc tggcgctggc ggccgagtcg gcgctgcgcc 16980
ggggcgacca cccgagcgcg gacgagctgg cgcgggaggc gctgaccgtg gtgtccccga 17040
ccgcgtgggg ggtgtcggtg gggctgccgc tgagcaccag ggtgctggcg ctgaccagga 17100
tgggccgcta cgacgaggcg gcggccgtgg tggcgcagcc ggtgccgaac gggatgttcg 17160
ggcaccgcaa cagcgtggac tacctgtacg cgcgcgggca cttcttcctg gcgcgggaac 17220
ggccgcgcgc ggcgctgggc gacttcctgc tgtgcgggga gcagctgacc cggtggggcc 17280
tgggcagcgg gtgcgcgccg gtgccgtggc ggaccgcggc ggcggaggcg tggctggcgc 17340
agggcaaccg ggaccaggcg cgggtgctga tccacgagca gctcggcagg ccgggcacgg 17400
acagccgccg ggcgcgcggg caggcgctgc ggctgctcgc ggcgaccagc tcggtgaagc 17460
ggcacccgca gctgctgcgg gaggcggtgg cggtgttcga ggccgtcgac gacaagtacg 17520
agctggcgcg gaccctgcgc gacctgggga gggcgcagcg ggcgctgggc gagaacaagc 17580
tggcgcgccg ggtgatccgg cgggggtggc acgtcgcccg gatgtgcgag gcggcgccgc 17640
tgtgcgagga gctgatgccc accgccgacg ggctggtgcc cgcgcagccc gcgtcggcgg 17700
cccgcaggtc ggacctggac cggttgacca gctcggagca ccgggtggcc gcgctcgcgg 17760
cgtcggggct gacgaaccgg gagatcgcgg tgaagctgta cgtcacgcac agcacggtgg 17820
agcagcacct gacgcgggtg ttccgcaagc tcgggatcaa gcagcgggag cagctgccgc 17880
cggagctgag cgtcgaccgg tcgaagtgac gcggacgggg cggtcccgtg gatctggggc 17940
cgccccgtcc ggtcccggtc cgtccggtcc cgccctgtcc ggtcccgccc tgtccggtcc 18000
cgccccgtcc ggtcccggtc cgcctcaggc tcggggcatc gcggccaggg tggtggcgac 18060
gacgtgctcg tcgacgtcgc gcaccagctc ggcgccgcgc gggccgtcga gcacgaacgc 18120
caggccgccg gtggacttct tgtcgcggcg catgaaccgc agcagctcgt cgtccggcac 18180
gcccggcggc agcgcgacgg gcagcccgta gcccgcgacc acggagtggt gctcggccac 18240
ccggtccggg ccgatccggc cgagcgcgcc cgcgaggcgg ccggcgaaga ccgtgccgat 18300
cgcgacgccc tcgccgtgcc gcaccgcgaa accggtggcg agctccaggg cgtggccgag 18360
ggtgtggccg tagttgaggg tgtgccgcag gccggagtcg cgctcgtcgg cggccacgac 18420
gcgggccttg agggcgacgc tcgccgccac ctggtccagc agcggcagcc ggtccaggcc 18480
cggcgcgccg atgaagtggc agcgggcgat ctcgccgagg ccgttgcgca gctcgcgctc 18540
gggcagggtg gcgagcaggt cgaggtcgca cagcacggcg gcgggctgcc agtaggcgcc 18600
gacgaggttc ttgccctcgg ggaggttgac cgccgtcttg ccgccgacgc tcgcgtcgac 18660
ctgggccagc agcgaggtcg gcacgtgcac caccggggtg ccccggtggt agagcgaggc 18720
ggcgaggccg accgcgtcgg tggtggtgcc gccgccgcag gagacgacga cgtcggcgcg 18780
ggtcaggccg aactcggcga accggctgca caggtgggcg acggtggcga gggtcttgtc 18840
gtgctcgccg tcgcgggccg ggaggacgag ggaggggacg ccggggtcgg gcgtctggtc 18900
cgccgggcgg gcggtgacca cgacggcgcg gcgcgcgccg agggcccgca cgacgtccgg 18960
gagggcggcg cgcacgccgt gtccgatgtg gacggtgtag gcgcgctcgc ccagctcgac 19020
ccggacctcg cgggtggtgg cggcggtggg ggcggggtgg gtggagctgg gcactgcttc 19080
ctcctcgggt gggcgggacg gggggcgatc gggggacgcg gaggggtgac gggaaagcaa 19140
tcgggcagga atgggaacgg gtccgggggc gaacgggcag gaattcgaat gggggcaagc 19200
gaccgggagc gatcccagtg gtggggcgga agtgcgggcg gcggaaaggc ggtcgtgctg 19260
cctcagccgc cgcccgcggc gcccgtcacg agcgtggtgc gcagggtgag cgccgcccgc 19320
gccgccacgg ccgcgccgac gccgaggcgg ttgtgggtca gggtcgcctg ctcgaacagc 19380
accggcaggg ccgggcggcg gcggtccgcg gcggcgcgca gctgctccag gtagcgccgc 19440
cacgcgcccg ccgagccgac cacgcgcccg ccgggcggcg ccccctgcgc ggcgacggcg 19500
gcctcggtgc gctcgaccgg gcggagcggc ctgctccagc tctgccagca gtggaacagg 19560
aacgcgggcc tggccggttc cggggccagc gcgaccagtt cggccaggtg gtgcagcacc 19620
gtggcctgcg cgcccgactc gccagggtcc tcgccccaca ccgggctcac caccgacgcg 19680
acgtccaggg ccagttcgct ggacgcggtc gcgaccagcg gctcgaccgg cccgcccggc 19740
aggcccccac ccggcaggcc ctcgcccgcc gggtcgacgc gcaggtcgcg ggccgccgcc 19800
tcggcgcaca gcacggcgag caccgggccc cgcgcggcct cggtcgtgcc cagccacagc 19860
gccaccaccc ccgccccgcg caggaacgac cagtgcgcgc cccggtcccg cgcgcgcagc 19920
tcccgcacga cggggggcag cacctcggcc accgagcggg ctccaccgcc tgccagcgac 19980
cagcccgacc aggacggggc gcccgccgcc gggggtccgc cgaggggcgc tctcgcggaa 20040
ccggtccgcg tcatgtccac caccacttcc gccttggcga gaacgggtcc tgcgggatca 20100
ccgcgctgtt ccgacgccgc cgacaatagc gacgcgcaat acgccgaatt caccgccaaa 20160
tcaggtcagg ggggttgagg gggatgcctt agggggcgag tgcccgcaaa gcggaagaag 20220
aatcggaagc acatgcagga gcgacttcca agctcaggcc gcaggaccgg gtccgcgtcg 20280
tcgcggacac cccggtcctg cgcgtgcgcg caccgaagga cgtggtgaca tgcttcggac 20340
cgacctgatc cgcccggttc ccgaactgct cggggccaac gcggatcgct tcggcgacag 20400
gaccgcctac tcggacggtc gccgttcggt cgggcacgcc gggctggaac ggcgcacgcg 20460
ccgcctcgcc ggtcacctcg ggcagttgcg gctgcacccc ggcgaccgcg cgatgatctg 20520
cctgggaaat cgcgtcgaaa tgatcgagag ctatttcggc gtgctccgcg cggacgccgt 20580
ggcggtcccg gtgaacccgc gttccaccga cgcggagctg acccacctgc tcgccgacag 20640
cggggcccgg ctggtgatca ccgacgcggc gcgcgccgag cggttcgacc ggttgcgcgc 20700
cgagcggttc ggcgacctga ccgtgatcgc cacccaggac ggcccgctgc ccgacggcgt 20760
catcgcgttc gagccgctgg ccgccgagga gccggagctg cccgcgcgcg acgggctcgg 20820
gctcgacgac gtggcctgga tgctctacac ctccggcacg accgggcgcc ccaagggcgt 20880
gctgtccacg cagcgcagct gcctgtggtc ggtggccgcc tgctacgtgc cggtgccgga 20940
cctgcgcgcc gaggaccgcg tgctgtggcc gctgccgctg ttccacagcc tgtcgcacat 21000
cacctgcctg ctggccgcca cggccgtggg cgcgaccacg cgcatcgtgg acggcacgtc 21060
cgcgcaggac gtgctcgcgg cgctggagca ggagcggtcg acgttcctgg cgggcgtgcc 21120
gacgctgtac cggtacctgg tcgacgccgc ccgcgagcgc gggttcaccg ccccggacct 21180
gcgggtgggc ctggtcggcg gggcggtgac gacggcggag ctgctgcgcg cgttcgagga 21240
cacgttcggc gtgccgctga tcgacgccta cggcagcacc gagacgtgcg gggcgatcgc 21300
ggtgaactgg ccgaccgggg cgcgcgtggc gggctcgtgc gggctgccgg tgccggggct 21360
gacggtgcgg ctggtggacc cggagacgct gctggacgtg cccgccgggc gggagggcga 21420
gttctgggtg tcggggccga gcgtgatgct gggctaccac aaccagcccg aggcgacggc 21480
cgaggtgctg cgggacggct ggtaccgcac gggcgacctg gggcggcgcg acgaggccgg 21540
gttctgcacg gtcaccgggc ggatcaagga gatgatcatc cggggtgggg agaacgtgca 21600
ccccggcgag gtcgaggccg tggtgcgggc ggtgccgggg gtggcggacg tcgccgtcgt 21660
gggcaagccg cacgacgtgc tgggcgaggt gccggtggtg ttcgtggtgc cgggcgcggg 21720
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gcccgaggag gtctacgaga tcgagcgggt gccgcgcacg gcgtcgggca agaccacccg 21840
gcacgtgctg ctggacctgc ccgcccggtt gcgggcggcg tcgagcgggc agttccagtc 21900
gctgctgcgg ctggactggg tgccgaggac ggcgctgccg ggtgaggagg tcccggcgag 21960
ctgggtgctg gtggacggcg acccgctggg gctcgcggac gggttgcggg ccacgggcgc 22020
gcgggtgcgg gtgggcgagc cgggcgcgga tgcgctgggc gacggcggat cggacgccga 22080
cgagccgggc gcgagcagcg cgggcgaacc gggctcgggt ggctcgggtg agccgggctc 22140
gggtggctcg ggcgaaccgg gctcgggtga accgggcgcg agcagcgcgg gtgagccggg 22200
tgcgggtgag ccgggcgcgg ccgaaccccc gcaggtcgtg ctggtcgccg cggtccccgg 22260
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cgtcgggtgg ctggccgacg agcggttcgc gggggcgcgg ttcgtcgtgg ccacctcggg 22380
cgcggtgtcg acctcccccg gcgaggacct gcgggagctg cgggcggccc cgctgtgggg 22440
tgtggtgcgg tcggtgcagg ccgcgttccc cggtcgggtg gtggcggccg acctggacgc 22500
gtccggcgac gggcgggcgg cggcgctggc tcgcgtcgtc gcgggcgggc acgaccaggt 22560
ggccgtgcgc ggcgacgtgc cgctggcgcc ccggctggcc agggtgtccg tgccgtccga 22620
cccggccccc gccccggcgc tggacccgga cgggctggtc gtggtcaccg gtggcgactc 22680
ggcgcgcggc gcggccctcg cgcggcacct ggtggccgcg cacggcgcgc ggcgcctgct 22740
gctggtctcc cccgacgggc tgcccgacca ggccgccgcc gacctggagg ccgggttcgc 22800
ggcggcgggc gcgcgggcgg agtcggtggt gtgcgacccg gccgacccgg tcgcgctgcg 22860
cgccctgctc gacgcgcagg accgcccggt cacggccgtg gtgcacgtgc agggcgggcg 22920
ggcgctgctg gactcggcgc gcgccctcgt cgccctgcac gagctgaccc gccaggcgcg 22980
accggcgctg ttcgtcgtgg tcacctcggt ggccgggctg ctgggctcgg cgggcgaccc 23040
ggcgcgcgcg gcggccgacc agttcgccga ggcgctggtg cgcaggcgcg ccgaccgggg 23100
cctgccgggg ctggccgtgg cctggggtcc gctgccgggc gagcccgcgc aggcgggcgc 23160
gggcgcgctg ccgatggccg aggcgctgac cctggtcgac gccgcgctcg ccgccgacca 23220
gggcccgctg gtggtgctcg ggctcgacgc ggtcgggtcg cggcgcgcgg tgggcgcggt 23280
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ggtggccgag ttcacgcgca ggctcgcgga ggcgggtggg cagcgggccc gacgcgtcgc 23400
gctggacctg gtgcgcgagc acgtcgcggc ggcgctcggc ctgcccgagg acaccccggt 23460
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cgaccggatc aacgccgcga ccggcgcgtc cctgcccgcg acggcggtgt tcgaccaccc 23580
gaccccggcc gcgctcgccg accacctggt gcgcgaggtc accggcgacc ggccgcacgt 23640
cgagcgggcg cgggacgagc gggcgcgcgg gacctcgcgc gcggacgagc cggtggcgat 23700
cgtcgccatg gggtgcaggc tgcccggcgg cgtggcctcg ccggaggacc tgtggcggct 23760
ggtggacgag ggcgtcgacg cgatcggccc gttcccgacc gaccggggct gggacctggc 23820
caccctgctc gacggctcgg actcgccggg gaggtcctcc gtggaccgcg gtggtttcct 23880
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catggacccg cagcagcggt tgctgctgga ggtggtgtgg gagaccgtgg aacgcgccgg 24000
gatcgacccg cgctcgctgc acggcgaaga cgtcggcgtg ttcagcggcc tgatgtacca 24060
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cgtcctgccc cgcaccctgc acgtcggcac gccctcgtcc aaggtcgact ggtcggcggg 24840
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gggcgtgtcc tcgttcgggg tcagcggcac caacgcgcac gtcgtggtgg aggagcaccg 24960
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cgcgccgctg gtgctgtccg ggcgcacccg ctccgcgctc gccgcgcagg ccgcggccct 25080
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gccggtgcgc acgtgggacg tcacccgcgc ggcctcggcg ttccgcgaga tgagccgggg 28620
cgggcacacc ggcaagatcg tcctgacgat cccgcgccgc ctcgaccccg agggcacggt 28680
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cgccgaccgg gccgcgctcg acgccctgct cgcctcggtc ccggccgggc gcccgctgac 28920
ggcggtcgtg cacgcggcgg gcgcgctcga cgacggcacg gtcaccgcgc tcaccccgga 28980
gcggttcgac gcggtgttcc gccccaaggt ggacgcgatc gcgcacctgg acgaggcgac 29040
ccgcgacgcc gacctggccg cgttcgtcgt ctactcctcg gcggcgggcg tgctcggcaa 29100
cgcggggcag ggcaactacg cggcggcgaa cgccgtgctg gacgcggtgg cccgcacccg 29160
gcacgcccgc gccctcccgg cgacctcgct ggcctggggg ttgtggagcg acacgagcgc 29220
gctgaccgcg acgatggacg ggcgcgcggt ggaccgcacg cggcgcgcgg gcgtgctggg 29280
catgggcaac gacgaggcgc tggcggcgct ggacgcgggc ctggcgtccg ggctgcccgc 29340
gctggtggcc gcccggatcg acccggccgc gctgcgcgac cccgcgtcgg ggtcgccgct 29400
gctgcgcggg ctggtgcgcg ccacccgccg cacggccgcc acccgcgacc gggacgccgt 29460
gggcgggctg gccggacggt tggccgggtt gtcggccgcg gagcaggacg agctgctgct 29520
gggcctggtg cgcagcgagg ccgccgccgt gctcgggcac gcgagcgccg agcgggtcga 29580
gccgcaggtg gcgttccggg acatggggtt cgactcgctc accgccgtgg agctgcgcaa 29640
ccggctcgcg gcggcgaccg ggctgcggct gcccgcgacg gcgacgttcg accacccgac 29700
gccggtgcgg ttcgccgcgc tgctgcgggg cgagctgctg ggcgccgtcg tggctcccgg 29760
agccgtgacc gccgccgcgg ctcccgtgac cgccgccgcg cccgccgacg agccgatcgc 29820
gatcgtgtcg atggcgtgcc ggctgcccgg cggggtggtc gacccggccg ggctgtggga 29880
gctgctcacc ggggagcggg acgggatcgt ggacttcccc gacgaccggg gctgggacct 29940
ggagtcgctc taccacccgg acgccgactc ccccggcacc tcctacgtgc tgcgcggcgg 30000
gttcctggac gacgcgggcg ggttcgacgc cgggttcttc ggcatctccc cgcgcgaggc 30060
cctggcgatg gacccgcagc agcgggtgtt cctggagacc tgctgggagg cgttcgagcg 30120
cgccgggatc gacccggtct cggtgcgcgg cagcgacacc ggggtgttcg ccgggatcat 30180
cgaccaggac tacggggtgc gcgcgggcac ggcccccgag gagctggagg gctacctgct 30240
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gtcggcgctg aaccaggacg gggcgtcgaa cgggctgacc gcgcccagcg gaccggcgca 30660
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ggagggcgcg ccggggttcg agcgggtcga cgtgctccag cccacctcgt gggcggtgat 31680
ggtggcgctg gccgcgctgt ggcgctcgtg cggggtggag ccgtccgccg tcgtcgggca 31740
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gctgtccgtg ctcacctcgc ccgagcgggt cgccgaactg ctggagccgt gggccgggaa 31920
gctgtggatc gcggcggtca acagccccgc gtccgtctcg gtgtccggtg acgccgaggc 31980
gctgggcgag ttcgtgcggg tgctggccaa ggcccggatc aaccggtggc ggctgcccgg 32040
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gctggccgac gtcaccgccg cggcgggcga agtgccctgg ctgtccaccg tggacgggcg 32160
gtgggtggag cgcaccaggc tggacgccga ctactggtac cgcaacctgc gcgacgtggt 32220
ccgcttcgac gaggccgtcc gcgcgctggt ggacgccggg caccgggcgt tcgtggaggt 32280
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gacgccaccg gccgctccta cgtcaccgag ggcgggttcc tggacgacgc ggccctgttc 41040
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gacgccgcag ccgtggtcgc gttgcgcagc aaggcgatcg cccaggacct ggccgggctc 42780
ggcggcatga tgtccgtcgc cctgcccgcc gacgacgtcg acctgagcgg gtatcccgga 42840
cgcctgtggg tcgccgcgca caacggcccc acctcgaccg tggtggccgg tgacgtggac 42900
gcgctgcgcg agctccacgc ccactacgag ggcgccgagg tccgggcccg gatcatcccc 42960
gtcgactacg ccagccacac cgggcacgtc gacaccatcc gcgagcggct cgccgaggca 43020
ctggcgcacg tgcggccgag ggcgggcacg atcccgtggc tgtcgaccgc gaccggcgag 43080
tggaccaccg gtgaggacgc cgacgccgac tactggttcc gcaacctgcg cggcgcggtg 43140
ggcttccaca ccgccatcac caccctcgcc gagcagggcc accgggtgtt cgtggaagtc 43200
tccagccacc ccgtgctcac caccgccatc gaggccacgc tcgaaggaac cggacccacc 43260
gccgtcaccg gaaccctccg ccgcgacgac ggcggccccg accgcctcct caccagcctc 43320
gccaccctgc acgtgcgcgg cgtccacgtc gactggaagg ccgtgttcgc cggcacgggc 43380
gcgcgccgcg tcccgctgcc gacctacgcg ttccagcacg agcgctactg gctggaccgg 43440
ggcgcggcgg ccggtgacgt cacgggcgcg ggcctggccg acgcggcgca cccgctgctg 43500
gccgccgtcg cccagctgcc cggcaccggc ggggtgctgc tgagcgggcg gttgtcgcgg 43560
gcgacgcacc cgtggctggc cgagcacgtg gtgaacggga ccgcgctggt gcccggcacg 43620
gccctggtgg agctggcgct gcgcgcgggc gacgaggtgg acgcgcccgt gctgcgcgag 43680
ctggtgatca cccggccgat gccggtgccg gagcggggtt tcctgcacgt gcaggtggac 43740
gtcgcgggtg cggcggacga cgggtcgcgg gcggtgcgga tctggtcgcg cgccgaggac 43800
gcggcgagcg agacggcccg ctggaccgag cacgccaccg gctccctcgc ccccgacgac 43860
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gtggacgact tctacgaccg cctcgcgggc gcgggctacg agtacgggcc gctgttccag 43980
ggcctcaccg ccgcgtgggc cggggacggg caggcgtggg ccgaggtggt gctgcccggt 44040
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ttctgcctgc ccggcgggcc ggggtcgcgc acgctgctgc cgttcgcgtg gacgggcgtg 44160
cggctgcacg ccaccggcgc gacggcggtg cgggtgcacg cccgcgccac cggcgacgac 44220
ggcctcgtcg tggagctgcg cgacgcggac ggggaaccgg tcgtgacggt cgacgcgctc 44280
gtgctgcgcg acgccgaccc cgccgacgcg caggccccgg acgtcacggc ggacgcgttg 44340
tggcgggtgc ggtgggtcga gcagccgccc gcgcccgcgg cgcccggctg ggtgctgctg 44400
ggcgggccgt ccgggcacgc cgggttcgcc gccctgccgg tgttcgccga ccctgcggcc 44460
gtggcggcgc tgcccgaggg cgaccggccc gcggtggtcg tcgtggacac caccgcgtgt 44520
cgggagccgg ggcgggacgt gccgggggcg gcgcgggcgt tcgtggtgcg ggcgctggag 44580
ctgctggtgg cgtggctgcg cgaggacgcg ctggccggga cccgactggt gctagtcacc 44640
agcggcgcgg tgccggtgcg cgcggacgcc gaggtcaccg accccgctgc cgcggcggtg 44700
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gcgggcgcgg ggttcgcgcc ccggctcgcc agggccgagg ccgcgcccgg cgcgctgccg 44880
gtcgacgggc cggtgctggt caccggcggc accggcacgc tcggcgcgct cgtggcccgg 44940
cacctggtca ccgcgcacgg cgcgcggaac ctgcacctgg tgagcaggcg cggcccggac 45000
gcgtccggcg ctcgagaact cctggacgag ctgcgcgggc tgggtgccga ggtcgagctg 45060
tcggcgtgcg acgtggccga ccgggtggcg ctcgccgccc tgctggggcg cgtgcgcccc 45120
gccgccgtgg tgcacgcggc gggcgcggtg gacgacggcc tgctcaccga cctgaccgcc 45180
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ctcggggacg tgccgctggt ggtgttctcc tccgcgaccg gcaccctcgg cacccccggc 45300
caggcgaact acgccgcggc caacgcggtc gccgacgcgc tcgtgcagcg ccgccgcgcg 45360
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cgggtcgccg agcacctgcg ggagctgctg ttcggcgcgg agacggctca ggcccccgcg 45960
cggcgggagg tggtggccga cgacgacccg atcgccgtgg tgggcatggc ctgccggttc 46020
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atcggcccgt tcccggacga ccggggctgg gacctggcgg cgctgttcga cccggacccc 46140
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ctgctgctgg aggtggcgtg ggagacgttc gagcaggcgg gcatcaaccc gcgctcggcg 46320
cacggcaccg acaccggggt gttcgcgggc gtgatctacc acgactacgg cgaggcggcg 46380
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tcgcggcagc gcgggctggc cccggacggg cggtgcaagt cgttctcgga gggcgcggac 46680
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cctggggtcg ctgttcgacg acgacccgga cgcggcgggc tcctcgtacg tgcgggaggg 51180
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gcgggccgtg ctcgccgggg tcgcgggcct gcacgtgcgc ggcgcgacag tcgactgggg 53700
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cgaggaccac tggctggtgc gccgctccac cgccgccgac gtgggcgcgg tcggcctgcg 53820
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ccggggcctg acctcggcgt ggcgcggcga gggcgaggcg tgggcggagg tggcgctgcc 54360
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cgccctgacc ttccgcgccg cagccgacac cccgtccgcc gaggtcccgg acgcgctgtg 54660
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gaccgtgctg gtgcacgcgg cggcgggcgg ggtcggcatg gccgccgtgc agctcgcgcg 55620
ggcgttcggc gctcgggtgc tgggcaccgc gcacccggcc aagcacgcgg ccgtgacccg 55680
cctgggcgtc cccgagtccc acctgtcctc cagccgcgac accgcctacg ccgacctgtt 55740
cggcccggtg gacgtggtgc tgaactcgct caccggcgag cacgtggacg cctcgctggg 55800
gctgctgcgc gcgggcggcc ggttcctgga gatgggcaag accgacctgc gcgacgccga 55860
cgaggtcgcg aaggcgcacc ccggcgtcgc ctaccgcccg ttcgacctgg gcggcgaggc 55920
gcccgccgag cgcgtcgcgg agctgctggc cgagctggtc gcgctgttcg aggcgggccg 55980
catccacccg ctgcccaccg cggcctggga gatcacccgc gcgccggagg cgttcggctg 56040
gatgagccgg gccgggcacg tgggcaagat cgtgctgacc ctcccccgcc gccccgaccc 56100
ggacggcacg gtgctggtca ccggcggcac cggctcgctc ggcgcggtcg cggcccggca 56160
cctggtcacc gcgcacggag cccgccacct gctgctcgcc tcccgacgcg gcgagcaggc 56220
ccccggcgcg gcggagctga ccgacgggct gcgcgggctg ggcgcggacg tgcgggtcgc 56280
ggcgtgcgac gtcgccgacc gggacgcgct cgccgcgctg ctcgccacga tccccgccgc 56340
gcacccgctc accgccgtcg tgcacacggc gggcgtgctc gacgacggcg tgctcgccgc 56400
gcagaccccc gagcgcctgg acgcggtgtt ccgccccaag gtcgacgccg tcgcgaacct 56460
gcacgagctg accggcgacc cggccctgtt cgcggtgtac tcctcggcct ccggcgtgct 56520
cggcggcgcg ggccagacca actacgccgc cgcgaacgcc tggctcgacg gcctcgccca 56580
cgtccggcgc gcggcgggcc tgcccgcgac ctcgctggcc tggggcctgt gggcgcagga 56640
cggcggcatg acgggcggcc tggcgggcgg accggccggg ccgggcgggc gggcccgccg 56700
gggagccgtc gcgccgctgt ccaccaccga gggcatggcg ctgttcgacg cggccgtcgc 56760
gtcgggccgc ccgctcctgg ccccgatcag gctcgacccc gccgcgctca ccgccgacgg 56820
cgcgcagccg cccgcgctgc tgcgcggcct ggcccgcccc acccgccgca ccgccgtcgc 56880
ggccaccacc gacgacggcc tcgcgggcag gctcgccgcg ctcgacggcc ccggcaggca 56940
gcggctgctc gtggagctgg tgcgggagca ggccgccgcc gtgctgggct tcgcgacccc 57000
ggacgccgtg tcgccgggcc gggcgttccg ggacctgggc ttcgactcgc tgacggccgt 57060
ggagctgcgc aaccgcctct ccgccgccac cggcctgcca ctgcccgcca ccaccgtgtt 57120
cgaccacccg accccgctgg acgcggcggc ccacctgctc gacgcgctgg gcgtcgcccc 57180
cgcgcccgcc ccggccaccc cggtcgtgac ggccgcgcgg gacgacgacc cgatcgcggt 57240
cgtcgccatg ggctgccgcc tgcccggcgg cgtgtcctcc ccggaggacc tgtggcggct 57300
gctcgacggc ggcgtcgacg ccatcggccc gttcccggac gaccggggct gggacctggg 57360
gtcgctgttc gacgacgacc ccgacgcggt cggcaagtcc tacgtgcgcg agggcgggtt 57420
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cgccatggac ccgcagcagc ggctgctgct ggaggtggcc tgggagaccg tcgagcgggc 57540
cgggatcgac ccgacctcgt tgcgcggcgc ggacgtcggc gtgttcgccg gggcgggcgc 57600
gcagaactac ggcagcggcc ccggcccggt gcccgagggc ctggagggct acctgggcgt 57660
gggcggcgcg acgagcgtgg tgtccggccg cgtctcctac acgctcggcc tcaccgggcc 57720
cgcgctgacg atcgacaccg cgtgctcctc gtcgctggtg gcgatccacc tggcggtgcg 57780
gtcgctgcgc tcgggcgagt gctcgatggc cctggcgggt ggggtcgcgg tgatgggcga 57840
gcccgcggcg ttcgtggagt tctcccggca gcgcgggctc gccccggacg ggcggtgcaa 57900
gtcgttcggc gcggaggcgg acggcacgac gtgggccgag ggcgcgggac tggtgctgct 57960
ggagcggttg tcggtggcgc gggcgcgcgg gcacgaggtg ctggcggtgc tgcgcgggtc 58020
ggcggtcaac caggacgggg cgtccaacgg cctgaccgcg ccgaacggcc cgtcgcagga 58080
gcgggtgatc cgggcggccc tggccgacgc ggggatcacc ccggacgcgg tggacgcggt 58140
ggaggcgcac ggcaccggca ccaccctcgg tgacccgatc gaggcgcagg ccgtgctggc 58200
gacctacggg caggaccgcg agcagccgct gtggctgggg tcgctgaagt cgaacatcgg 58260
gcacgcgcag gcggcggcgg gcgtcgcgag cgtgatcaag tccgtgctgg cgctgggccg 58320
gggcgtgctg ccccgctccc tgcacgccag caccccgacc ccgcaggtcg actggtcctc 58380
gggggcggtg gagctgctgg cgcgggcgcg ggagtggccg gagaccgggc gtccgcgccg 58440
gatcggggtg tcctcgttcg gggtgagcgg caccaacgcg cacgtggtcc tggagcaggc 58500
ccccgagccg gaacccgcgc gggaggcgga acccgcgcgg gagtccgcgc cagggccgga 58560
gtccgttccg ccgctgaccg gggccacgcc gtggctgctg tccgcccgct cccccgaggc 58620
gctggcggac caggccgccc ggctggtgga cgccgtgccc gccgagtggc gggcctccga 58680
cgtgggctgg tcgctggcca ccacgcgggc cccgctggag cagcgggccg tggtcgtggc 58740
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gcacgtggtc accgggaccg ccgacgtgga cggcaggacc gccttcgtct tccccggcca 58860
gggcgcgcag tgggcgggca tggggcggga actcctggac gcctcgccgg tgttcgccga 58920
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gatcacctcg ggtggcgcgc tggaggacgt ggacgtcgtg cagcccacca gctgggcgat 59040
catggtgtcg ctggccgcgc tgtggcgctc gctcggcgtc cacccggacg cggtgatcgg 59100
gcactcgcag ggcgagatcg ccgccgccac cgtcgcgggc tggctcagcc tccaggacgg 59160
cgcgaagatc gtcgcgctgc gcagccagct gatcgacgag cacctgaccg ggctcggcgg 59220
catgatgtcc gtcgccctgc ccgccgagga catcgacctg accggctacc agggccggtt 59280
gtgggtggcc gcccacaacg gccccaccgc gaccgtggtc gccggggacg ccgacgccct 59340
ggcggagctg cgggacgcgc tggagggcga ggcccgcacc cgcgtgatcc ccgtcgacta 59400
cgccagccac accggccacg tcgacgccat ccgcgaccag ctcgcccgga tgctcgccga 59460
cgtcaccccg cggcccggcg agatcccgtg gctgtccacg gtgaccggcg agtggatcac 59520
ccccggcgac gacgacgccg actactggtt ccacaacctc cgccgcaccg tccacttcgc 59580
cgacgggatc accaccctgc tcgacgccgg gcaccgggcc ttcgtcgagg tctccacgca 59640
ccccgtgctc accccggccg tgcaggaggc cgccgaggcg aacccggcgc tgcgcaccgt 59700
cgccgtgggc accctgcgcc gcgcggacgg cggcgcggag cgggtggtgg cgggcctggc 59760
cgagctgctg gcgcgcgggg tggccgtgga cccggcggcg gtgttccccg gtgcgaggcg 59820
ggtcgcgctg ccgacgttcg cgttccggca cgagacgttc tggctctcgc gggcgctgcc 59880
cgacgcgcgg ccggtgccgc agggcgggca cccgctggcc ccggtggtgg tgagcgatcc 59940
gggcacgggc ggggtgatcc tgtccggccg gatctccgcg gccacccacc cgtggctgct 60000
cgaccacgcc gtcgcgggcg cggtgctgct gcccggcgcg gcgctggccg agctggcggt 60060
gcgggccggc gacgagaccg ggacgcccac cctggaggag ctggtgatcg gcaggccggt 60120
ggtgctgccc gaggacgggg agctgcggct ccaggtggtc gtgggcgccg aggacggggc 60180
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gagcggcacg ctgtcggcga agtcctcgct gcccgccgac gtcccggccg ccccgtggcc 60300
gcccgcgggc gcggagccga tcgcgctgga cgggttctac gaggccatgg caggggccgg 60360
ttacgggtac gggcccgcgt tccgggggct gcgcgcggcc tggcgcgacg gggacgacgt 60420
ggtcgccgag gtggccgtgc cgcgggcgca ggagcaggtg gcgggccggt tcggcatcca 60480
cccggcgctg ctggacgccg ccctgcacgc cgggaacttc tgcttccccg cgcaggacgg 60540
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gacgtcggtg cgggtgcggg cccgcgcggt gggcggccct ggcgcgcccg cgctgaccgt 60660
ggcgatcacc gacccgagcg gggtgccggt ggccggggtg ggcgcgctcg ggatgcgcgc 60720
ggtcagcccc gagcagctgg gcgcgccggg cgtcggcggt gacgcgctgc gggtgctgga 60780
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cccggacgtg gacgcctacg cggccgaccc ggaccggccg ggggcgctgc tggtggacgt 60900
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gctggagctg gtgcgggact gggcgacccg cggggacctg ggcggtgagc ggctggtgct 61020
ggtcacgacc ggggccgagg acgtgcgcga caccgcgccc cgcgacccgg cgcaggccgc 61080
cgtgtggggc ctggcgcgct cggcccgctc ggagcacccg gaccggttcg cgctggtcga 61140
cgcggacgac cggtccccgg cgacgctcgc cctggcggcc gggtcggcgt tcccggaggt 61200
ggtcctgcgc ggcgagcggg cgcacgcgcc gaggctggcg cgggccgtcc ccggcaggcc 61260
ggtggcgctg gacccggacg gcacggccct gatcaccggc ggcaccggcg ccctgggcgc 61320
gctcgccgcc cggcacctgg tgaccgcgca cggcgtgcgg cgcctgctgc tcaccggccg 61380
ccgggggccg gacgcccccg gcgcggcgga gctggccgag gagctgcgcg ggctgggcgc 61440
ggacgtgcgg gtggaggcgt gcgacgtcgc cgaccgggac gcgctcgccg cgctgctcgc 61500
gtcgatcccc gccgggcgcc cgctcaccgc cgtcgtgcac gcggcgggcg cgctcgacga 61560
cgccccggtg accgacctga ccccggagcg gctgtccgcc gtgctggccc cgaaggtcga 61620
cgcgctggcc aacctggacg agctggtcgg ggacgggccc gcggtgttcg cggtctactc 61680
ctcggcgtcc ggggtgctcg gcacggccgg gcaggcggcg tacgcggcgg ccaacacctt 61740
cgcggacgcg ctggtgcgcc gacgccgggc cgagggccgg gcgggcgtgt cgctggcgtg 61800
gggcctgtgg gcaggcgcca gcgagctgac cggcgacctg gccggtgacc ggctcgcccg 61860
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gggcgcggtc accacgggcg gcccggcgct ggtcgtgccg ctgccgctgg acctggcggc 61980
gctgcgcgcc tccgcgcgcg acgaggcggt gcccgcgctg ctgcgcgcgc tcgtccccgc 62040
cgcgcggcgc tcgctctccc ccgccaccgg gcaggccgcg cccccggccg ggttgcgggc 62100
gcgcctggcc gggctgtcgg gcgacgagca ggaggccgtg ctcaccgagc tggtccgcga 62160
cctggccgcc gccgtgctcg ggcacggcga gaagggcgcg gtgggcccgg acgacgcgtt 62220
cttcgagatc ggcttcgact ccatgacggc cgtgcagctg cggaaccggc tgaacaccgc 62280
caccgggctg cgcctgcccg ccgcgctgct gttcgaccag ccgacgcccg cgatcgccgc 62340
cgaggcgctg cgcgagcgac tggccgccga gcaatcgggc tcagggcaat cgggcgcagg 62400
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ctgcacaagc ggcacctgat gtccgtgccc tacgacaacg gcggcgcggc cgaccggttg 62640
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ggtcgggttc gacagcgagg cgacccgcgt gctggcctcg gccgggctcg ggcccgcgct 63480
ggccgagttc ggggagcccg cgggcgacta cgagtggcgc accgcgtccg gggagacgct 63540
gatcgcgttc accgtgcggg aggaggggca ctgcggctgg cccgaggcga cctcggccta 63600
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gacctccccc taatcccccc tgttcccagg ccatcaccgc agcacgcggg cacagcggca 68220
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cgtggatcga ggtgcacctg tcgaacgtgt gggcgcgcga gagcttccgg cacgagtcgg 68640
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ccgcccgcgc gctgctggac ctggtggact gaccgccgtc gcgcgcgagc ccggccgcgt 68760
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gatcttctgc cagcgcctcc agaaccgaga gcagtcgtcg ggcgtgcagt gcatggccaa 81840
taccatcgtc gcgtacccca gagggtgtcg ctcccgttca ggggcgacca tttcccacgc 81900
ccgcttggcc tccttggcgg cccggccaag atcgccgagc atcaggtagg tgcccgacaa 81960
cccgacaacc ctgcctgcca acgcggcttc cggcaccccg cgcgcctcgt cggcttccaa 82020
cgcccgaaca ccgtgccaca gcacggcccg cgcgttgccc tcgctcgtct ccagccatcc 82080
catgacaccg tgcgcttcgg ccagtgacca cgatcggctg tcgggatcgg tgttgcacaa 82140
cgccagctcc agcgctcgtt cagcagcgtt accgaccaca gcgcggcgcc gatgtccagc 82200
acttcttgcc ggtacccgcc cacgagtgcg gcggtgcgct gcacggccac gacttcccgc 82260
cgatgcacga tcagccactt gtacgccgcc aaggcgttgt cgaacagcgg cttcgccccg 82320
acctcgaagc cgtcgacgaa cacctcgcgc aaatcaccga gcagtttccc tgcggccaag 82380
gtgcgccgat gcaggtacct gcccaagcgc tccaactctt gcgggaactc ctgctgcaca 82440
gcccatcgca gcagtgcctg ggcttggtct gtctcctgcg cgcgatggcg accggccagc 82500
cggtaacgcg aggaggtgaa ctcggggtgc gtgatgttcg ggtgaagttc agtccacgaa 82560
ggctgcgtca gcaccagcac gccctggttc acccagtccc gcgcgtgttg ggcggtctcc 82620
tcgacggtga ttcccagcat cgcggccaac gacgaggtcg agaccacggg gtccggcagc 82680
aggtccagca atctcagctc ttgcggaatg ggcacaagag tgttgatcat cgatgcccct 82740
cccggaggac ggcgatgatt ggagtggcga acagaagggg aaacgccagt tcgccgggtt 82800
ccggcggtcc acgcgccttc ggccggccac ttggactccg acgggcagaa gttcaccggc 82860
aaggactctg gtgacggtgg agcggtgcac gcccatcgct tcggccaagg cgtagtcgct 82920
gtggtaacca gcgaactgag ctagctttcg catcttgtcg ccgcgcaccc cgacgacctt 82980
cttgatcttt tcggtctcgc tgtcgttgtc gtcgacatgt ccgccgtccg gcgctgacac 83040
cgttctcctt gagatcgccg agctgaatgg gggatgcttc gacgtaaggc gttgcgtatg 83100
cgcaacaggt caggcggcgt cgagtctccc cattaccgag gtttcgcttg atcgccgacg 83160
gggcccgcct cgaagaagtc caatcgagct ggcatcccct tcgattgatc aatagcgcga 83220
cgggtgtcgc tcgacatcgc cccaccgcct gctcctgacg tgccacgagc agggaggagc 83280
gacctccctc gggactgcac cgaccgttcc tccctgtccg ccgattcagt tgcattccgc 83340
cacgctaggt gccggatgcg ggccgaaggg acaacgaagg gacaagtcga acagcccagg 83400
tgcgaggtat cttgaaatag cccgaatcct ccgtcgcgaa gcaggtcgcc atgcccactg 83460
acgaacagtc cgagggtgtc ggagagcgca tagccgtcca acgcaaactg gctggcttga 83520
ctcagcaagc tctggcgaag cgcgcacacg tcagcctcag cctcatcaaa ggggtggaac 83580
agggaaggat tcccgcctct cccgcgctcg tgtcccaggt ctcgcgggcg ctcaaggtcg 83640
aggcgacgat cttgctgggg cagccgtacc gccccgagga tcggagcagt cttcgcgttc 83700
actccgtcat ccccggtctg cgccgagcct tggcggccta ccggttgccc gctgatgagg 83760
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cctacctcga cggctcccgt cgccgcctgg agcacgtggt gcgcaaggac gacgaggccg 84180
ccttgtcgat ctacggagtc ctgcacctga agtcggggct cgcggcggca cgggccggga 84240
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tgggcagtga ccactaccgg ctcgcgttcg accgggactc ggtcaacatc tggaccgtgg 84360
ggctggcagt ggagcgcatg gacggcacgg aagccgtcaa acgagcccac gggatgcgct 84420
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aggaccgcag gcgctcggat tccctggcag ggctcgcgcg ctggatcggt atgccggtgt 84660
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acggccagcg cgatcatctg cttgggcgcg ccgccgaaga agagggaccc cacccaccgc 84840
agtggtaaac cggcaccgag caccaacggc caccggccgg cagagcccgt ccccctcttt 84900
tttggaggtc tgccccgccg gcgaggcgtg cccttcagct ctcaagctct ccactctcga 84960
tcttgtggtc cgaacacccc ccgcaccccc actacgatcc ccccatgggg gctctgatca 85020
tcgcggtagt gctgctgctc gtcttcctcg tgcaactcaa gcgggaaccc agacgactgg 85080
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cagcagccgg ttccctggtc ctcctggccg gctacctggg cttcgccttc accctcttcc 85440
tgctctactc cgtgctctac ggccgagtcc gcaagcgcac cggccacacc gcgatcatcg 85500
tcctgggcgc gggcgtcccc ggcggccgag tgaccccgct cctggcaggc cgcctggacc 85560
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tcgtcaccag cagctaccac gtcccccgag ccgcgatcct ctcccgccgc gcaggcctga 85860
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tcgtgctcct gggtgacgaa cccacccgtt gccagcaccg tcggctggtc ggcggtcgcc 86400
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cacgaccacc gcgccacacc cgccccacgc agcgactagg ctgcccaccg gggtcgccag 86760
ccgatcccga gcgggttgag caggcagccc accgcagttc gcgctagtgg gatggaggga 86820
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ggccatcatg gacgaggtgg acgccccaac caccccaccc accccggccg cgctggacct 87600
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gatcggcacg cgcggacgcg gcctgctgct gatccgccag ctgaccgatc gctggggcag 87900
cacgccccac cccggcggca agaccgtgtg ggcggagctg ccgaacgtcc cggcgacctg 87960
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tccgggcgcg ttggacgccg gcgcactccc cggtgagggg tcgggcggcg gagtggatga 88080
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gatgtgcgtc gcggcggcgc agggcgcgga gacgggcgcg ggcgagcgct gagggcccgc 88560
ccggcgccac tcccccgtca cacctcccgc cgcagcacat cctcctccgt ctcccgccgc 88620
accagcaccc gcgccactcc gtcgcgcacg cccaccacag gcggcctgcc cacggcgttg 88680
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tccctgccgg acgcgctgcg caagctccac ccccgccacc agctgcgcaa ccccgtgatg 94920
ttcgtggtgt gggcgggctc ggtcctggtc acggtcttcg ccgtcaccga cccgaacccg 94980
ttcacgatcg cggtcgcgct gtggctgtgg ttcaccgccc tgttcgccaa cctcgccgag 95040
gccgtcgccg aggggcgcgg caaggcgcag gccgagtcgc tgcgcaggac taagaccgac 95100
gcgctggccc gcctgaccga cggccgcacc gtgcccggca ccgagctgaa ggtcggcgac 95160
ctggtcgtgg tcgaggccgg tgaggtgatc cccggcgacg gcgacgtggt cgagggcatc 95220
gccaccgtcg acgagtcggc gatcaccggc gagtccgcgc ccgtggtgcg cgagtccggc 95280
ggcgaccggt gcgcggtcac cggcggcacc accgtgctgt cggaccggat cgtcgtgcgc 95340
gtcaccagca agccgggcga gacgttcgtg gaccggatga tcgcgctggt cgagggcgcg 95400
cagcggcaga agacgccgaa cgagatcgcg ctgacgatcc tgctgtccac gctcacgatc 95460
atcttcctgc tcgcggtgct cgcgctccag ccgttcgcgg tgtactccgg cggcgagcag 95520
tcggtgatcg tgctgaccgc gctgctggtg tgcctgatcc ccaccacgat cggcgcgctg 95580
ctgtccgcga tcggcatcgc gggcatggac cgcctggtgc agcgcaacgt gctggccacc 95640
tcgggccgcg ccgtcgaggc ggccggtgac gtggacacgc tgctgctgga caagaccggc 95700
accatcacct ggggcaaccg ccgcgccacc gagctgatcc ccgcgcccgg cgtcacgctg 95760
gacgagctgg tggacgccgc ccggttgtcg tcgctggccg acggcacccc cgagggccgc 95820
agcgtggtcg agctgtgcgc gaccgggcac ggccgctccc ccgagcccac cgacgcggag 95880
aagaccggcg agttcgtgcc gttcaccgcc cagacccgga tgagcggcat cgacctggac 95940
ggccgcagcg tccgcaaggg cgccgcgacc gcgttcaccc tcaccgactc ggtcaagtcc 96000
acggtggacg agatcagcgg cgacggcggc accccgctgg tggtcgccga cggcgagcgg 96060
gtgctcggcg tgatccggct gtccgacgtg gtcaagcccg gcatgaagga gcggttcgcc 96120
gagctgcgcg ccatgggcat ccgcacggtc atggtcaccg gcgacaaccc gctgaccgcc 96180
agggcgatcg cggccgaggc gggggtcgac gactacctcg ccgaggccaa gcccgaggac 96240
aagatggccc tgatccgcaa ggagcaggag ggcggcaagc tggtcgcgat gaccggcgac 96300
ggcaccaacg acgcgccggc gctggcccag tccgacgtgg gcgtggccat gaacaccggc 96360
acctcggccg ccaaggaggc cgggaacatg gtggacctgg actccgaccc caccaagctc 96420
atcgagatcg tggagatcgg caagcagctg ctgatcacgc ggggcgcgct gacgacgttc 96480
tcggtcgcca acgacctggc gaagtacttc gcgatcctgc ccgccatgtt cgccgcgatc 96540
cacccgcagc tggacaagct caacgtcatg ggcctggcca cgccgcagtc ggcgatcctg 96600
tcggcggtca tcttcaacgc gctgatcatc gtggtgctga tcccgctggc gctgcgcggc 96660
gtgcgctaca agccctccag cgcgagctcg ctgctgcggc gcaacctgct ggtgtacggc 96720
gtcggcggca tcatcacgcc gttcgtcggc atctggctca tcgacctgct cgtccgcctc 96780
atccccggaa tcgggtgaac tccgtgaacg cgttcgtgaa gcaggccctg gccggtctgc 96840
gcgtcctgct ggtgctgacc gtcatcaccg gcgtgctcta ccccgccgcc gtctggctcg 96900
tctcgcgggt gcccggcctg cacgccaacg ccgaggccac cggcaccgag ctggtcgtgg 96960
cgccgcgcga gggcgacggc tggttccagc cgcgcccgtc gatggcgacg ctgcccgcgt 97020
cgggcgggtc caacaagggc gagcgcaacg ccgactacga cgcggtgatc gccgagcgcc 97080
gcaccgagat cgcccggcgc gagggcgttg cggaggacgc cgtgccgcag gacgcggtga 97140
ccgcctcggc ctccgggctg gacccgctga tcagcgccga gtacgcggcg atccaggtgc 97200
cgcgcgtggc gcgggagcgc ggggtgtcgg aggacgccgt gcgggcgctg gtcgccgagg 97260
cgtcggtggg ccgctcgctc gggttcgtgg gcgagccggg cgtcaacgtc accgccctca 97320
accgggccgt cgacgcggcg gagtgagacc gaccgggggc cgtcctcgcg gcggcccccg 97380
gtcttcccca tttctctgat ctcgggagcg ggcgggaccg tggacaagcg caagcgcggc 97440
gaactgcgca tctacctggg cgcggcgccg ggcgtcggca agaccttcgc gatgctcggc 97500
gaggcgcacc gccgccgggg gcgcggcgcg gacgtcgtcg tcgccctggt cgagacgcac 97560
ggccgcgagc gcaccgccac catggtcgac ggcctggagg tgctgccccg caaggaggtc 97620
cagcaccggg ggaccacgat caccgagatg gacgtggacg cggtgctggc ccgcgcgccc 97680
gagatcgccg tggtggacga gctggcgcac accaacgccc ccggctcccg caacgccaag 97740
cgctggcagg acgtcgagga gctgctggac gccggcatcg acgtgctgtc cacgctcaac 97800
atccagcacc tggagtcgct caacgacgtg gtgcgccgca tcacccgcgt cgagcagcgc 97860
gagaccatcc ccgacgaggt ggtgcgccgc gccgagcagg tggagctggt cgacctgacc 97920
ccggaggcgc tgcgccgccg cctggcgcac ggcaacgtct acgccgcgca caagatcgac 97980
gccgcgctgg gcaactactt ccgggtcggg aacctgaccg cgctgcgcga gctggcgctg 98040
ctgtgggtgg ccgaccaggt ggacgtggcg ctccagcggt accgcaccga gcagcgcatc 98100
accgacacct gggaggcccg cgagcgggtc gtggtcgcgg tgaccggcgg cgcggagagc 98160
gagaccctga tccgcagggc ccgccgcatc gccgcgcgcg ccggggcgga gctgctggtg 98220
gtgcacacca tgcgcggcga cggcctcgcg ggttccgcgc cggagtcgat ccggacccgc 98280
gtcgggctca ggtgctcgac ggtgctcttc aacgtggtct cctcgtaacg ggacgtgcgg 98340
aacaccccgc agcgcccagg gtcgggcggc tgacgggatt cgcctgagtc taggcgaggc 98400
cgcccccggc cggggtggca ccccgcgacc gggtggttca cgtgcgggtg cgcgcgcccg 98460
gcgcggcgcg cgcggtgcga gaggtgggcc gtccggcggc gcgcggtttt ccgacatggc 98520
gcgcgcacga aatagttttc ggcgggtcgg gcgccgtcga atcgactcgg ggtcgggttt 98580
tccgcgccac cccggaagcg gacgaaccgg gcgggcgaac cgggcgggcg gtgcgcggac 98640
aacgggcgcg accgccgcgg tgcgccggtt tgggcagcct ttaccgccct ccaggtcacc 98700
cattccgccg ttgcggggaa catccgcgta ccagtggccc ccggcggaca cgcggcccag 98760
cacccgctag gccgttcgca ggacgtcgtg gtgcaccggg agcgtgaaac cgaacgtaac 98820
cggacagcgg cgggctcaag tggggtaaca ctggcgccgc agcgcactct tacccacagc 98880
gacgaacgcg gcggaacgct accctttaca ggtgaagtga ggccattcgg agcaccggtg 98940
cgcagaaaac tttcacgccc ggagatgact ccactcgccg tagtccatta gtgtgggatt 99000
ccggtaccgt tgcgccgcag gccgcaagaa ggcggccagg aaagacgatt aactcatccg 99060
ggcgccccgc cgtcgtgcac gtgaacgcga cgggcgaccg ggaacggaac gagcgagaca 99120
tgtcatcgcg ctctttacca cctaccagaa aaggtgccga tgaccccgat gaagaccatt 99180
ccgccgattc ccccgaacac gcgggcgtcc gcccgtccgc cgctcgggca accgcacgac 99240
gggcttgcgc gccacccgga accccagggc ccggccgcga ggcgatgttg acccgacccc 99300
cggccaccag ccgggacagg ccgaccaccg ccacgcgcgg aacccacggc gaaccgcctc 99360
tcgccgtgat ccaccacgga ccgttgggga gttccatgga gacccgtcaa cttctggcgt 99420
tcaccacagt ggtgcagacc ggcagcttca cgaaggccgc cgccacgctg aactgctctc 99480
agcccacgat caccaccagg atcaaggcgc tggaggagac cctcggcgtc gccctgttcc 99540
gcaggttgcc gcgcggcatc cagatgacct ccgccggggt cgagctgctg ccgttcgcgc 99600
gcaacatcat cacgctcacc gacaaggccc gcaaggcgat caccatgaac ggggagccgc 99660
acgggcacct cgtgataggc agcgcccaga gcctcaccga ctaccggctc ttacccctga 99720
tcgagtacat gtgctggcgc tacccgagcg tccagatctc gctgcactcg cgaacaaccc 99780
ggtcgaacct ggccgccgtg cgcgagggca ggttggactg cgcgttcttc atcggcccgg 99840
tcgagcagcg ggacggtctg gagacgacgg tgctgtgccc cgaaccgctg gtgatggtcg 99900
cgggccccgg ccacgcgctg gcgcggtcgg gcgcggtcac cgaggcggac ctgcggggca 99960
gcacgctggt cagggccgag aacggggcga gctaccacga gcagttcgag cgggcgctcg 100020
ggctgcacga ggccgagtcg cgatcgccgg tgctggccct ggactcggtc gacgcggcca 100080
agcgggcggt cgcctcgggg ctgggcatct cgctggtgcc ggaggtcacg gtcgccgcgg 100140
agctggcgga cggcaggctc agccgcatcg gctggacccc gccgttccgg gtgttcaccc 100200
agttcgcgtg gcgccaggac aactcggcga acccgtcggt gaccgcgctg gtctcggcgg 100260
cggcgcaggt ggtgagcgag caggtggccg cgacacccgc gtagggcgtc gacgtgcagg 100320
gtcgtggatg cggagcggcc ccctcgtgct gcgcagaggg ggccgagacc gtcggggcga 100380
caggatttga acctgcgacc ccccgctccc aaagcgggtg cgctaccaaa ctgcgccacg 100440
ccccggtcac caggagctta gcgcgacgcg ctaagctgtt ttcagcaccc acccggtggg 100500
cgctgcgcgg gtgtagctca atggtagagc cccagccttc caagctggtc atgcgggttc 100560
gattcccgtc acccgctcca ccagatcc 100588
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 12
ggtcactggc cgaagcgcac ggtgtcatgg 30
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 13
cctaggcgac taccccgcac tactacaccg agcagg 36
<210> 14
<211> 1595
<212> DNA
<213> Actinosynnema pretiosum
<400> 14
cctaggcgac taccccgcac tactacaccg agcaggccta cgcctacggg aactcctgga 60
catcaccgac cacaccgtcc aacgcaactt ccgcgaactg gccgatctgg taggcgacgc 120
gaagggcctg ctgttccacc cacgcgacct ggtgggcgtc ccagaattcg gctgcttcct 180
agcagtagcc gaacacccgt aaccacgcgg tggcgtcccc cacggacgcc accgcctcgc 240
gggctgcggg gcgagcgcag cgagcccgcg cagccccact cccgcgtccc tcttctccgt 300
gtggcctggc gcatgtcaaa ttcccactga ctgccaacag atcatgtgcc gtttgagcag 360
gtcagcgact tgtcgcgctt cggtgcctta aggccgagct gggatggggg cactgtttcc 420
ggactgagcg gggcagcttg gaaggtggag ttcggtgagc agaggcagca cgtcccgtcg 480
cacgtagagg tggttgtaca cgcggtggcg ggacctgcgc agtaggccgc tatccgcaag 540
ctgctccaag atcaggagtg cggcgcggtg cgtatagccg agttcggcgg tcagcatggt 600
gctgttgagc agtggggcga cgagcagcgg ggcgggaagc gctttgacct tcctccgccc 660
ggtgcgcatc gcccaggtgg gcgatcgcgc gagcctcacg gatcgcggtc acctcatgca 720
ggctggcgct caacctggaa cgcgcgactg tttcgtccag acgtgccagg gcggtgtagg 780
cgtgcaacaa ggtcttgctg gtttcggagc gcagtctgag ccgggaccag gacgacaact 840
ccgcgatcct cgcggacggg ggcggcctcg tgtcttcacc ggtggtagtt gacctgcgcg 900
gggcggaggt gccctattgc tgccgggacg aggtcatccc ccggagcagt ttctcagcac 960
gccgtgaatc gagatccggg gcgctgagcg cggtgaacgc ctcgtccagc gagtcgcacg 1020
cgcacgtcgt cctgacatcg ggccgcgcat ggcccgaggt ggtcagcggt gagcgggaag 1080
gcgcggcagg gtgtgtgcga gacactccgg gactccgtgc agaaggtcga tcaggcgaaa 1140
gggttgaact gcgaatcgca aagcggcccg gccgcaaagg ggtcgggccg cctgcgacga 1200
ttggtcacgc tgctgcggcg cggtcccgcc ggaactgctt gccgagcagg tcgatccgcc 1260
ccttgtgatc ttctgccagc gcctccagaa ccgagagcag tcgtcgggcg tgcagtgcat 1320
ggccaatacc atcgtcgcgt accccagagg gtgtcgctcc cgttcagggg cgaccatttc 1380
ccacgcccgc ttggcctcct tggcggcccg gccaagatcg ccgagcatca ggtaggtgcc 1440
cgacaacccg acaaccctgc ctgccaacgc ggcttccggc accccgcgcg cctcgtcggc 1500
ttccaacgcc cgaacaccgt gccacagcac ggcccgcgcg ttgccctcgc tcgtctccag 1560
ccatcccatg acaccgtgcg cttcggccag tgacc 1595
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 15
cctaggaacg ggtaggcggg caggtcggtg 30
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 16
gtgtgcgggc cagctcgccc agcacgccca c 31
<210> 17
<211> 1541
<212> DNA
<213> Actinosynnema pretiosum
<400> 17
gtgtgcgggc cagctcgccc agcacgccca cgagggtctc cagcgcgtcc gcgccggtgc 60
gcgcgccccg gacgacctcg accgtgggga tcaggtacgg cgggttcatg aagtgcgtgc 120
cgatcagccg cgccgggtcg gggacgtgcc cggccagctc gtcgatcggg atcgaggagg 180
tgttggacac cagcggcacg cgcggcccgg tgagcgcggc ggccccggcc agcacctcgg 240
ccttgaccgg cagctcctcg gtgaccgcct ccaccaccag cgagacgtcc gcgacgtcgg 300
cgagcgaggt ggtggtgagc agctcgcccc gctcgcggtc ctcgggcagc gcccgcatca 360
gcctggccat gcgcagctgg gcggccaccg cctcccgcgc ccgcccgacc ttggcccggt 420
cggtctcgac cagcaccacc ggcacgccgt gcccgacggc cagggaggtg atccccaggc 480
ccatcgtgcc cgcgccgaga acggcgagca ccgtcctgcc gtcctgctct cccatcgcgc 540
tcccccgccg cggccaccgc ggccgccgtc cggtccgcgc gccgtcccgg cacgcgcatt 600
ccaccctcga tcgtgtgccg ggaaaggcgc gcccgacccc ctgacctgcc cccctgaacc 660
cccctcaacg gaaccggaaa tcgaatgtcc cgaacgcgcc gtcaaatcgt cgattgacag 720
ccgcagaact gttcatagac tgtggcggca gtaccgatct ccgaattcca cggaagagtc 780
ctcccccatg gctcagcaga tcagcgccac ctcggaaatc ctcgactacg tccgcgcgac 840
ctcgttgcgc gacgacgacg tgctcgccgg tctgcgggag cggaccgcgg ttctcccggc 900
cgcgtccgcg ctgcaggtgg ccccggagga ggggcagctg ctcggcctgc tggtgcgcct 960
ggtcggcgcg cgctcggtgc tggaggtcgg cacctacacc gggtacagca cgctgtgcat 1020
ggcccgcgcc ctcccgcccg gcggacgtgt cgtgacctgc gacgtcgtcg cgaagtggcc 1080
ggacatgggc aggccgttct gggagcgggc gggcgtcgcg gaccgcatcg acgtccgcgt 1140
cggcgacgcc cgcgccaccc tggccggcct gcacgccgag cacgccgtgt tcgacctggt 1200
gttcatcgac gcgaacaagt cggattacgt ccactactac gagcgcgcgc tgacgctgct 1260
gcgcaccggc ggcctggtcg tcgtggacaa cacgctcttt ttcgggcggg tcgccgatcc 1320
gtccgcgacc gatccggaca ccaccgccgt gcgcgagctg aacgcgctgc tgcacgccga 1380
cgagcgggtc gacatgtgcc tgctgccgat cgcggacgga atcacgctcg ccgtgaagcg 1440
gtgaacccgc ccgaatcgcg ccgaattccc ccggagagaa aggccgccgc agtgttcacc 1500
gaggacgtgg ccaccgacct gcccgcctac ccgttcctag g 1541
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 18
ggcatatgtt gacggagagc acgaccgagg tcgttg 36
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 19
ggtctagagg tcagggcacc ctcgcgaggt cgccgg 36
<210> 20
<211> 1512
<212> DNA
<213> Streptomyces hygroscopicus
<400> 20
ggcatatgtt gacggagagc acgaccgagg tcgttgtcgc gggtgcgggc gcgaccggac 60
tgatgctggc gtacgaactg gctctggccg gggtcgagac cctggtgctg gagaagctgc 120
cccagcggat ccagcaggtg aagggcggca cgattcagcc ccgtaccgcc gaactgctgg 180
agtcccgcgg cctgctggag ccgatgctgc ggcgggccat tgcgcgtgat ccggtgggcg 240
gcagtttcgg ggccctgccc gtgcccttgg actgcgcccc ctggcggacc gagcacccct 300
tcccgatcgg gatccctcag tgggagatcg aggaggtgct cgaggagcgg gcgaccgccg 360
ccggagcgcg ggtgctgcgc ggcaccgccg tctcaggggt cgcgccggac gacgacggtg 420
tggtcgtcac ggcggacggc ctgcgggcgc gggctcacta tctggtggcg tgcgacggcg 480
gccacagtac ggtgcgcaaa ctgctcgggc tgccgtttcc cggcagggcc ggaacgcatc 540
cggcggtgct ggccgatatc cgtctgtccg ccgtatcctc actggtgccg cggcagatgg 600
gacttatgag caccatgacc cgtcatgcgc gcggctactg gtccatgctg gtccctctcg 660
gcggcgaccg gtaccggttc accttcgggc acgcggacca ggcggacacc gcccgcgaca 720
cccccgtcac ccacgaggag atcgcggccg cgctgcaggc cgtgtacggc cctgagacca 780
ccctcggcgc cgtggacaac tcctcgcggt tctccgacgc cacgcgacaa ctggagcact 840
accgcacggg ccgtgtcctg ttcgccgggg acgccgcgca tatccacccc ccgctgggcg 900
cccagggcct caacctcggc gtacaggacg cgctcaacct cgggtggaaa ctggccgcgg 960
tcctccagga ccgggcgccg aacggcttgc tggacagcta ccacgccgaa cggcatccgg 1020
tcgcggccca ggtcctgcat cacacctcgg cgcaacgcgt cctggcgatt tcgaacccga 1080
gcgaggacgt ggccgccctg cgcgacatct tcaccgacct gctgcggctg cccgacacca 1140
accgccatct cgcggggctg atgtccggcc tctcgctgcg ctacgacctg cccggcgatc 1200
acccgctcac cggagagcgc atcccggacg ccgatctggt gaccgaaacc ggcaccaccc 1260
ggctgtcgac gctcttcggc tccggacacg ccgtcctgct cgacctggcc ggagccgtcc 1320
cggccgacct cccgctcccg ccacgagtcg acctcgtccg cgccacatgc gccgacgaca 1380
tgggcgccgc cgccctgctc atccgtcccg acggctatgt ctgctgggct acggacacct 1440
ccgccgcctg cggcgacacc ctgctggccg cgctcaccgg cgacctcgcg agggtgccct 1500
gacctctaga cc 1512
<210> 21
<211> 498
<212> PRT
<213> Streptomyces hygroscopicus
<400> 21
Met Leu Thr Glu Ser Thr Thr Glu Val Val Val Ala Gly Ala Gly Ala
1 5 10 15
Thr Gly Leu Met Leu Ala Tyr Glu Leu Ala Leu Ala Gly Val Glu Thr
20 25 30
Leu Val Leu Glu Lys Leu Pro Gln Arg Ile Gln Gln Val Lys Gly Gly
35 40 45
Thr Ile Gln Pro Arg Thr Ala Glu Leu Leu Glu Ser Arg Gly Leu Leu
50 55 60
Glu Pro Met Leu Arg Arg Ala Ile Ala Arg Asp Pro Val Gly Gly Ser
65 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Pro Val Pro Leu Asp Cys Ala Pro Trp Arg Thr Glu
85 90 95
His Pro Phe Pro Ile Gly Ile Pro Gln Trp Glu Ile Glu Glu Val Leu
100 105 110
Glu Glu Arg Ala Thr Ala Ala Gly Ala Arg Val Leu Arg Gly Thr Ala
115 120 125
Val Ser Gly Val Ala Pro Asp Asp Asp Gly Val Val Val Thr Ala Asp
130 135 140
Gly Leu Arg Ala Arg Ala His Tyr Leu Val Ala Cys Asp Gly Gly His
145 150 155 160
Ser Thr Val Arg Lys Leu Leu Gly Leu Pro Phe Pro Gly Arg Ala Gly
165 170 175
Thr His Pro Ala Val Leu Ala Asp Ile Arg Leu Ser Ala Val Ser Ser
180 185 190
Leu Val Pro Arg Gln Met Gly Leu Met Ser Thr Met Thr Arg His Ala
195 200 205
Arg Gly Tyr Trp Ser Met Leu Val Pro Leu Gly Gly Asp Arg Tyr Arg
210 215 220
Phe Thr Phe Gly His Ala Asp Gln Ala Asp Thr Ala Arg Asp Thr Pro
225 230 235 240
Val Thr His Glu Glu Ile Ala Ala Ala Leu Gln Ala Val Tyr Gly Pro
245 250 255
Glu Thr Thr Leu Gly Ala Val Asp Asn Ser Ser Arg Phe Ser Asp Ala
260 265 270
Thr Arg Gln Leu Glu His Tyr Arg Thr Gly Arg Val Leu Phe Ala Gly
275 280 285
Asp Ala Ala His Ile His Pro Pro Leu Gly Ala Gln Gly Leu Asn Leu
290 295 300
Gly Val Gln Asp Ala Leu Asn Leu Gly Trp Lys Leu Ala Ala Val Leu
305 310 315 320
Gln Asp Arg Ala Pro Asn Gly Leu Leu Asp Ser Tyr His Ala Glu Arg
325 330 335
His Pro Val Ala Ala Gln Val Leu His His Thr Ser Ala Gln Arg Val
340 345 350
Leu Ala Ile Ser Asn Pro Ser Glu Asp Val Ala Ala Leu Arg Asp Ile
355 360 365
Phe Thr Asp Leu Leu Arg Leu Pro Asp Thr Asn Arg His Leu Ala Gly
370 375 380
Leu Met Ser Gly Leu Ser Leu Arg Tyr Asp Leu Pro Gly Asp His Pro
385 390 395 400
Leu Thr Gly Glu Arg Ile Pro Asp Ala Asp Leu Val Thr Glu Thr Gly
405 410 415
Thr Thr Arg Leu Ser Thr Leu Phe Gly Ser Gly His Ala Val Leu Leu
420 425 430
Asp Leu Ala Gly Ala Val Pro Ala Asp Leu Pro Leu Pro Pro Arg Val
435 440 445
Asp Leu Val Arg Ala Thr Cys Ala Asp Asp Met Gly Ala Ala Ala Leu
450 455 460
Leu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Val Cys Trp Ala Thr Asp Thr Ser Ala
465 470 475 480
Ala Cys Gly Asp Thr Leu Leu Ala Ala Leu Thr Gly Asp Leu Ala Arg
485 490 495
Val Pro
Claims (36)
- 제1항에 있어서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 (IA)인 화합물.
- 제1항에 있어서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 (IB)인 화합물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R3는 CONH2인 화합물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R6는 OH인 화합물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R6는 H인 화합물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R7은 H인 화합물.
- 제1항에 있어서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 (IA)에 따른 구조를 가지며, R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5는 각각 H이고, R6는 OH이고, 또한 R7은 H인 화합물.
- 제1항에 있어서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 (IB)에 따른 구조를 가지며, R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5는 각각 H이고, 또한 R7은 H인 화합물.
- 제1항에 있어서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 (IA)에 따른 구조를 가지며, R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5는 각각 H이고, R6는 OH이고, 또한 R7은 CH3인 화합물.
- 제1항에 있어서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 (IB)에 따른 구조를 가지며, R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5는 각각 H이고, 또한 R7은 CH3인 화합물.
- 제1항에 있어서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 (IA)에 따른 구조를 가지며, R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5는 각각 H이고, R6는 H이고, 또한 R7은 H인 화합물.
- 제1항에 있어서, 17-옥시막베신 유사체는 화학식 (IA)에 따른 구조를 가지며, R1은 H이고, R2는 H이고, R3는 CONH2이고, R4 및 R5는 각각 H이고, R6는 H이고, 또한 R7은 CH3인 화합물.
- 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 17-옥시막베신 유사체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 의약품으로 사용하기 위한 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 17-옥시막베신 유사체.
- 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리를 위한 의약품의 제조에서 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 17-옥시막베신 유사체의 용도.
- 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리를 위한 의약품으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 17-옥시막베신 유사체.
- 치료학적으로 유효한 양의 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 17-옥시막베신 유사체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 및 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리를 방법.
- 17-옥시막베신 유사체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 다른 치료와 병행하여 투여되는, 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따른 17-옥시막베신 유사체, 조성물, 용도 또는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 다른 치료가 메토트렉사이트(methotrexate), 류코보린(leukovorin), 프레니손(prenisone), 블레오마이신(bleomycin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(doxetaxel), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 독소루비신(doxorubicin), 타모시 펜(tamoxifen), 토레미펜(toremifene), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 아나스트로졸(anastrozole), 고세렐린, 항-HER2 단클론 항체(anti-HER2 monoclonal antibody), 카페시타빈(capecitabine), 라록시펜 염화수소(raloxifene hydrochloride), EGFR 억제제, VEGF 억제제, 프로테아좀 억제제, 방사선 치료 및 외과 수술로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 17-옥시막베신 유사체, 조성물, 용도 또는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 다른 치료가 시스플라틴(cisplatin), 사이타라빈(cytarabine), 사이클로헥실클로로에틸니트로스우레아, 겜시타빈(gemcitabine), 이포스프아미드(Ifosfamid), 류코보린(leucovorin), 미토마이신, 미토잔톤(mitoxantone), 옥살리플라틴(oxaliplatin); 탁솔(taxol)과 빈데신(vindesine)을 포함하는 탁산(taxanes); 호르몬 치료제; 세툭시맙(cetuximab)(항-EGFR)과 같은 단클론항체 치료제; 다사티닙(dasatinib), 라파티닙(lapatinib)과 같은 단백질 키나아제 억제제; 보리노스타트(vorinostat)와 같은 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제; 수니티닙(sunitinib), 소파레닙(sorarenib), 레나리도미드(lenalidomide)와 같은 혈관신생 억제제; 템시로리무스(temsirolimus)와 같은 mTOR 억제제; 및 이마티닙(imatinib)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 17-옥시막베신 유사체, 조성물, 용도 또는 방법.
- 하기의 단계를 포함하는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 17-옥시 막베신 유사체의 제조방법:a) 적절한 조건에서 배양시 막베신 또는 이의 유사체를 생산하는 제1의 숙주 균주를 제공하는 단계;b) 일반적으로 막베신 PKS 유전자 클러스터와 관련되지 않은 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자를 삽입하는 단계로, 상기 post-PKS 유전자 중의 적어도 하나 이상은 gdmL 또는 이의 상동체인 단계;c) 상기 변형된 숙주 균주를 신규 화합물의 생산을 위한 적절한 조건에서 배양하는 단계; 및d) 임의적으로 생산된 그 화합물을 분리하는 단계.
- 제24항에 있어서, 상기 방법은 추가적으로 하기 단계를 포함하는 방법.e) 일반적으로 상기 단계 c) 이전에 수행되며, 하나 또는 그 이상의 막베신 post-PKS 유전자 또는 이의 상동체를 결실시키거나 불활성화시키는 단계.
- 제25항에 있어서, 상기 방법은 추가적으로 하기 단계를 포함하는 방법.f) 일반적으로 상기 단계 c) 이전에 수행되며, 하나 또는 그 이상의 결실된 post-PKS 유전자를 재도입하는 단계.
- 제24항 내지 제26항에 있어서, 상기 방법은 추가적으로 하기 단계를 포함하는 방법.g) 일반적으로 상기 단계 c) 이전에 수행되며, 다른 PKS 클러스터로부터 유래한 post-PKS 유전자를 도입하는 단계.
- 변형되지 않은 상태에서 막베신을 천연적으로 생산하는 유전적으로 조작된 숙주 균주로서, 상기 균주는 막베신 PKS 클러스터와 천연적으로 관련되지 않은 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자를 가지며, 상기 post-PKS 유전자의 적어도 하나 이상은 gdmL 또는 삽입된 이의 상동체인 숙주 균주.
- 제28항에 있어서, PKS 유전자 클러스터로부터 유래한 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 추가적으로 결실된 것인 숙주 균주.
- 제29항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 결실된 post-PKS 유전자가 재도입된 것인 숙주 균주.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 PKS 클러스터로부터 유래한 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 재도입된 것인 숙주 균주.
- 제29항에 있어서, mbcP, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2가 결실되고, gdmL이 도입된 것인 숙주 균주.
- 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, A. 프레티오섬(A. pretiosum) 또는 A. 미럼(A. mirum)인 숙주 균주.
- 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 균주를 배양하는 것을 포함하는 17-옥시막베신 또는 이의 유사체를 제조하는 방법.
- 제34항에 있어서, 17-옥시막베신 또는 이의 유사체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 17-옥시막베신 또는 이의 유사체의 생산을 위한 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 숙주 균주의 용도.
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