KR20080078853A - 항암제로서 유용한 21-데옥시막베신 유사체 - Google Patents

항암제로서 유용한 21-데옥시막베신 유사체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 21-데옥시막베신 유사체에 관한 것으로, 이는 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리에 유용하다. 본 발명은 또한 이러한 화합물의 생산 방법 및 의약분야, 특별히 치료제 및/또는 암 또는 B-세포 악성종양의 전처리제에서의 용도를 제공한다.
Figure P1020087015388
데옥시막베신(deoxymacbecin), 항암제, 암

Description

항암제로서 유용한 21-데옥시막베신 유사체{21-DEOXYMACBECIN ANALOGUES USEFUL AS ANTITUMOR AGENTS}
본 발명은 신규한 안사마이신 유사체에 관한 것이다. 특히, 모생산균주의 유전공학적 처리에 의해 생성되며, 개선된 약제학적 성질을 가지는 21-데옥시막베신 유사체에 관한 것이다.
90 kDa 열충격단백질(Hsp90)은 단백질의 접힘 및 조립과 관련된 풍부한 분자 샤페론인데, 이들 다수가 신호 전달 경로와 관련되어 있다(Neckers, 2002; Sreedhar et al., 2004a; Wegele et al., 2004 및 이들의 참고문헌). 거의 50 여종 이상의 이러한 소위 클라이언트 단백질(client proteins)라 일컫는 단백질이 확인되었으며, 스테로이드 수용체, 비수용체성 티로신 키나아제, 예를 들어 src 류, 사이클린-의존성 키나아제, 예를 들어 cdk4 및 cdk6, 낭포성 막횡단 조절자(cystic transmembrane regulator), 산화질소 합성효소 및 이외의 것들을 포함한다(Donze and Picard, 1999; McLaughlin et al., 2002; Chiosis et al., 2004; Wegele et al., 2004; http://www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors. pdf).
또한, Hsp90은 돌연변이 영향에 대한 세포의 스트레스 반응 및 보호에서 중요한 역할을 한다(Bagatell and Whitesell, 2004; Chiosis et al., 2004). Hsp90의 기능은 복잡하고 이는 동적인 다중-효소 복합체의 형성에 관여한다(Bohen, 1998; Liu et al., 1999; Young et al., 2001; Takahashi et al., 2003; Sreedhar et al., 2004; Wegele et al., 2004). Hsp90은 클라이언트 단백질의 분해, 세포 주기 조절장애/또는 정상화 및 아포토시스(apoptosis)를 야기하는 억제제의 표적이다(Fang et al., 1998; Liu et al., 1999; Blagosklonny, 2002; Neckers, 2003; Takahashi et al., 2003; Beliakoff and Whitesell, 2004; Wegele et al., 2004). 더욱 최근에, Hsp90은 종양의 전이를 위한 중요한 세포외 매개체임이 확인되었다(Eustace et al., 2004).
Hsp90은 이의 기능(Blagosklonny et al., 1996; Neckers, 2002; Workman and Kaye, 2002; Beliakoff and Whitesell, 2004; Harris et al., 2004; Jez et al., 2003; Lee et al., 2004)에 대한 심도 있고 상세한 연구 및 고속처리 스크리닝 분석의 개발(Carreras et al., 2003; Rowlands et al., 2004)을 반영하는 암 치료법을 위한 새로운 주요 치료 표적으로서 확인되었다. Hsp90 억제제는 안사마이신, 마크롤리드(macrolides), 퓨린, 피라졸, 쿠마린 항생제 및 그외의 것들을 포함한다(Bagatell and Whitesell, 2004; Chiosis et al., 2004 및 이들의 참고문헌).
벤제노이드 안사마이신은 방향족 고리 구조 양쪽에 결합된 다양한 길이의 지방족 고리에 의해 특징지어지는 광범위한 화학적 구조의 한 종류이다. 자연적으로 발생하는 안사마이신은 하기를 포함한다: 막베신(macbecin), 18,21-디히드로막베신(또한 막베신 I 및 막베신 II로 각각 알려져있음)(1 & 2; Tanida et al., 1980), 겔다나마이신(3; DeBoer et al., 1970; DeBoer and Dietz, 1976; WO 03/106653 및 이들의 참고문헌), 및 허비마이신 류(4; 5, 6, Omura et al., 1979, Iwai et al., 1980 and Shibata et al, 1986a, WO 03/106653 및 이들의 참고문헌).
Figure 112008045421569-PCT00001
안사마이신은 원래 이들의 항균 및 항바이러스 활성이 규명되었으나, 최근에 항암제로서의 이들의 잠재적 이용성이 더 큰 관심의 대상이 되고 있다(Beliakoff and Whitesell, 2004). 많은 Hsp90 억제제가 최근에 임상 실험에서 평가되기 시작하였다(Csermely and Soti, 2003; Workman, 2003). 특히, 겔다나마이신은 나노몰로도 효과를 나타내고 종양 세포 의존적으로 변형된 단백질 키나아제에 대해 명백한 특이성을 갖는다(Chiosis et al., 2003; Workman, 2003).
Hsp90 억제제를 이용한 치료는 방사선 조사에 의한 종양 세포 사멸의 유도를 증진시키는 것으로 나타났고, Hsp90 억제제와 세포독성 물질과의 결합에 의해 세포 사멸능(예를 들어, 유방암, 만성 골수성 백혈병 및 비소세포폐암)이 증가됨이 또한 설명되었다.(Neckers, 2002; Beliakoff and Whitesell, 2004) 항-신생혈관생성 활성에 대한 가능성 또한 관심의 대상이다: Hsp90 클라이언트 단백질 HIF-1α는 고형 종양의 진행에 중요한 역할을 한다(Hur et al., 2002; Workman and Kaye, 2002; Kaur et al., 2004).
Hsp90 억제제는 또한 면역억제제로서 작용하고 Hsp90 억제 후의 다양한 종류의 종양 세포의 보체-매개성 용해와 관련되어 있다(Sreedhar et al., 2004).
잠재적 항말라리아 약물로서의 Hsp90 억제제가 또한 논의되었다(Kumar et al., 2003). 또한, 겔다나마이신이 복합적으로 글리코실화된 포유류 프리온 단백질 PrPc의 형성을 방해하는 것으로 나타났다(Winklhofer et al., 2003).
상기에서 기술한 바와 같이, 안사마이신이 잠재적 항암 및 항B-세포 악성종양 화합물로서 관심을 받고 있으나, 최근 이용가능한 안사마이신이 양호하지 않은 약학적 또는 약제학적 성질, 예를 들면 양호하지 않은 용해도, 양호하지 않은 대사 안정성, 양호하지 않은 생체이용성 또는 양호하지 않은 제형능을 보인다(Goetz et al., 2003; Workman 2003; Chiosis 2004). 허비마이신 A 및 겔다나마이신 모두는 이들의 강한 간독성으로 인해 임상 실험에 대해 안좋은 후보 물질로 확인되었고(review Workman, 2003), 겔다나마이신은 간독성으로 인해 임상 1상에서 탈락되었다(Supko et al., 1995, WO 03/106653).
겔다나마이신은 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus)의 배양 여과물로부터 분리되었고 시험관 내에서 원생생물에 대해 강한 활성을 갖고, 세균과 곰팡이에 대해 약한 활성을 갖는 것으로 나타났다. 1994년 겔다나마이신과 Hsp90과의 관계가 밝혀졌다(Whitesell et al., 1994). 겔다나마이신에 대한 생합성 유전자 클러스터가 클론화되고 서열분석되었다(Allen and Ritchie, 1994; Rascher et al., 2003; WO 03/106653).
DNA 서열은 NCBI 허가번호 AY179507 에서 이용가능하다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(duamyceticus) JCM4427로부터 유래된 유전공학적으로 제작된 겔다마이신 생산 균주의 분리, 및 4,5-디히드로-7-O-데스카르바모일-7-히드록시겔다나마이신 및 4,5-디히드로-7-O-데스카르바모일-7-히드록시-17-O-데메틸겔다나마이신의 분리가 최근에 기술되었다(Hong et al., 2004).
허비마이신 생산종 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) AM-3672에 겔다나마이신을 처리함으로써 화합물 15-히드록시겔다나마이신, 3중고리 겔다나마이신 유사체 KOSN-1633 및 메틸-겔다나마이신이 분리되었다(Hu et al., 2004).
두 화합물 17-포밀-17-데메톡시-18-O-21-O-디히드로겔나마이신 및 17-히드록시메틸-17-데메톡시겔다마이신이 S.하이그로스코피쿠스 K279-78로부터 분리되었다. S.하이그로스코피쿠스 K279-78은 허비마이신 생산 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AM-3672 기원의 다양한 유전자를 포함하는 44kbp 크기의 삽입체를 갖는 코스미드 pKOS279-78을 포함하고 있는 S.하이그로스코피쿠스 NRRL 3602이다(Hu et al., 2004).
겔다나마이신 생합성 클러스터의 폴리케티드 합성효소의 네 가지 모듈 내에서 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인을 치환시켰다(Patel et al., 2004). AT 치환은 완전하게 가공된 유사체 14-데스메틸-겔다마이신, 8-데스메틸-겔다마이신 및 6-데스메틸-겔다마이신과 완전하게 가공되지 않은 4,5-디히드로-6-데스메톡시-겔다마이신을 이끌어내는 모듈 1, 4 및 5 내에서 수행되었다.
모듈 7 AT의 치환은 세 종류의 2-데스메틸 화합물, KOSN1619, KOSN1558 및 KOSN1559을 생산해내는데, 이중 KOSN1559는 겔다마이신보다 4배 이상, 17-AGG보다 8배 이상의 결합력으로 Hsp90과 결합하는 2-데메틸-4,5-디히드로-17-데메톡시-21-데옥시 겔다마이신 유도체이다.
그러나 이는 SKBr3을 사용한 IC50 측정 결과를 반영하지 않은 것이다. 또 다른 유사체인 신규한 비벤조퀴노이드 겔다마이신 KOS-1806은 단일페놀기(monophenolic) 구조를 가진다(Rascher et al., 2005). KOS-1806에 대한 활성 데이터는 주어지지 않았다.
1979년에 안사마이신 항생제 허비마이신 A가 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주 No. AM-3672의 발효 배지로부터 분리되었고, 이의 잠재적 제초 활성에 따라 명명되었다. 항암활성은 세포의 변형된 형태를 되돌리는 약물을 스크리닝하기 위해 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV)의 온도감수성 변이체에 감염된 랫 신장 세포를 사용하여 평가되었다(for review see Uehara, 2003). 허비마이신 A는 Hsp90 샤페론 단백질에 결합하여 일차적으로 작용하는 것으로 주장되었지만, 보존된 시스테인 잔기에 직접 결합하고, 이어 키나아제를 불활성화시킨다는 것도 논의되었다(Uehara, 2003).
화학적 유도체가 분리되었고 벤조퀴논 핵의 C19의 치환체가 변형된 화합물 및 고리 사슬 내에서 할로겐화된 화합물이 허비마이신 A보다 독성이 더 적고 항암활성이 더 높은 것으로 나타났다(Omura et al., 1984; Shibata et al., 1986b). 허비마이신 생합성 유전자 클러스터의 서열은 WO 03/106653 및 최근 논문에서 확인되 었다(Rascher et al., 2005).
항진균 및 항원충 활성에 의해 확인된 안사마이신 화합물 막베신 (1) 및 18,21-디히드로막베신(2) (C-14919E-1 및 C-14919E-1)은 노카르디아(Nocardia) 종 No. C-14919 (Actinosynnema pretiosum subsp pretiosum ATCC 31280)의 배양물 상층액으로부터 분리되었다(Tanida et al., 1980; Muroi et al., 1980; Muroi et al., 1981; US 4,315,989 및 US 4,187,292). 18,21-디히드로막베신은 방향족 핵의 디히드로 퀴논 형태를 포함하는 특성을 가진다. 막베신 및 18,21-디히드로막베신 모두 쥣과 백혈병 P388 세포주와 같은 암세포주에 대해 유사한 항균 및 항암 활성을 가지는 것으로 나타났다(Ono et al., 1982).
역전사 효소 활성 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 활성은 막베신에 의해 억제되지 않았다(Ono et al., 1982). 막베신의 Hsp90 억제기능은 문헌으로 보고된바 있다(Bohen, 1998; Liu et al., 1999). 막베신 및 18,21-디히드로막베신이 미생물 배양액에 첨가된 후, 화합물의 특정 위치 또는 위치들에서 메톡시기가 히드록시기로 변환되는 것은 US 4,421,687 및 US 4,512,975 특허에 기술되어 있다.
매우 다양한 토양 미생물을 선별하는 가운데, 스트렙토마이세스 속에 속하는 생산균주로부터 화합물 TAN-420A 내지 E가 확인되었다(7-11, EP 0 110 710).
Figure 112008045421569-PCT00002
2000년에 스트렙토마이세스 종. S6699의 세포 배양액으로부터 겔다나마이신과 관련이 있는 비-벤조퀴논 안사마이신 대사체인 레블라스틴의 분리 및 이의 류마티스 관절염 치료에 있어서 이의 잠재적 치료 가치가 기술되었다(Stead et al., 2000).
화학적으로 연관이 없는 벤조뷔논 안사마이신과 구별되는 또 다른 Hsp90 억제제인 라디시콜(모노르덴)은 곰팡이 모노스포리움 보노르덴(Monosporium bonorden)으로부터 항진균 활성이 처음 발견되었고(for review see Uehara, 2003), 그 구조는 넥트리아 라디시콜라로부터 분리된 14개 탄소의 마크롤리드와 동일한 것으로 밝혀졌다. 이의 항진균, 항균, 항원충 및 세포독성 활성에 부가적으로 연이어 Hsp90 샤페론 단백질의 억제제로서 확인되었다(for review see Uehara, 2003; Schulte et al., 1999). 라디시콜의 항-신생혈관생성 활성(Hur et al., 2002) 및 이의 반-합성 유도체(Kurebayashi et al., 2001)가 또한 기술된 바 있다.
최근의 관심은 안사마이신 항암 화합물의 새로운 세대로서 겔다나마이신의 17-아미노 유도체, 예를 들면 17-(알릴아미노)-17-데스메톡시 겔다나마이신(17-AGG, 12)(Hostein et al., 2001; Neckers, 2002; Nimmanapalli et al., 2003; Vasilevskaya et al., 2003; Smith-Jones et al., 2004) 및 17-데스메톡시-17-N,N-디메틸아미노에틸아미노-겔다나마이신(17-DMAG, 13)(Egorin et al., 2002; Jez et al., 2003)에 집중되어 있다(Bagatell and Whitesell, 2004).
더욱 최근에 겔다나마이신이 17-위치에서 유도되어 17-겔다나마이신 아미드, 카바메이트, 우레아 및 17-아릴겔다나마이신 유사체가 생성되었다(Le Brazidec et al., 2003). 60개 이상의 17-알킬아미노-17-데메톡시겔다나마이신 유사체의 라이브러리가 보고되었고 Hsp90에 대한 친화도 및 용해도가 시험되었다(Tian et al., 2004). 겔다나마이신의 독성을 감소시키기 위한 다른 연구는 종양-표적성 단일클론 항체와 결합시킴으로써 활성 겔다나마이신 화합물을 악성 종양 세포로 선택적 표적화 및 전달하는 것이다(Mandler et al., 2000).
Figure 112008045421569-PCT00003
이러한 유도체가 감소된 간독성을 나타내지만 제한된 용해도를 가진다. 예를 들면 17-AGG는 용해제(예를 들어 Cremophore, DMSO-egg lecithin)의 사용을 필요로 하고, 그 자체로 일부 환자에게 부작용을 일으킬 수 있다(Hu et al., 2004).
Hsp90 억제제의 안사마이신 계 대부분은 일반적인 구조적 모이어티를 갖는다: 단백질, 글루타티온 등과 같은 핵친화성 공유결합을 빠르게 형성할 수 있는 미켈(Michael) 수용체인 벤조퀴논.
벤조퀴논 모이어티는 또한 비특이적 독성을 야기하는 산소 라디칼이 형성되는 동안 디히드로퀴논과 산화환원 평형상태가 되도록 한다(Dikalov et al., 2002). 예를 들어 겔다나마이신 처리는 활성산소를 생성시킬 수 있다(Sreedhar et al., 2004a).
그러므로, 암 및/또는 B-세포 악성종양 치료에 이용할 수 있고, 바람직하게는 향상된 용해도, 투여시 개선된 약학적 성질 및 부작용이 감소된 안사마이신 같 은, 벤조퀴논 모이어티가 결여된 신규한 안사마이신 유도체를 규명할 필요가 남아 있다.
본 발명은 모생산균주의 유전적 조작에 의해 생성되는 신규한 안사마이신 유사체에 관한 것이다. 특히 본 발명은 현재 이용가능한 안사마이신과 비교하여 전체적으로 개선된 약제학적 성질을 가지는 21-데옥시막베신 유사체에 관한 것인데, 이들은 특히 독성, 글루타티온 같은 친핵체와의 결합력, 용해도, 대사안정성, 생체이용성 및 제형 가능성 중 하나 또는 그 이상의 성질에 있어서의 개선을 나타낸다. 바람직하게 21-데옥시막베신 유사체는 개선된 독성 및/또는 용해도를 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 막베신 생합성과 관련된 유전자 클러스터를 클론화하고 규명하기 위해 많은 노력을 기울였다. 이러한 관점으로 벤조퀴논 모이어티 생성을 담당하는 유전자가 특별히 표적화되었다. 예를 들면, mbcM으로의 통합, 선택적인 유전자 삽입에 따른 mbcM 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 막베신 클러스터 부분의 표적화된 결실에 의하거나, MbcM을 비기능화시키는 다른 방법들, 예를 들면, 화학적인 억제, 위치특이돌연변이(site-directed mutagenesis), 또는 예를 들어 UV에 의한 세포의 돌연변이를 통해 벤조퀴논 모이어티가 제거된 신규한 유도체를 생산해냈다. 막베신의 post-PKS 변형에 관여하는 다른 유전자들의 선택적인 표적화에 의한 불활성화 또는 결실이 수행될 수 있다. 추가적으로 이러한 유전자들 중 일부는 mbcM과는 다르게 세포 내로 재도입될 수 있다.
post-PKS 유전자들의 선택적 표적화는 다양한 종류의 메커니즘에 의해 일어날 수 있다. 예를 들면, 통합, 선택적인 유전자 삽입에 따른 post-PKS 유전자 전부 또는 모두를 포함하는 막베신 클러스터 부위의 표적화된 결실에 의하거나, post-PKS 유전자 또는 이들이 코딩하는 효소를 비기능화시키는 다른 방법들, 예를 들면, 화학적인 억제, 위치특이돌연변이(site-directed mutagenesis) 또는 예를 들어 UV에 의한 세포의 돌연변이를 통해 일어날 수 있다.
그 결과, 본 발명은 21-데옥시막베신 유사체, 이러한 화합물의 제조방법, 및 이러한 화합물을 의학적으로 이용하거나 다른 화합물 생산에서 중간체로서 이용하는 방법을 제공한다.
따라서 첫 번째 양태로서, 본 발명은 통상적으로 C21 자리에 존재하는 산소원자가 결실된 막베신 유사체를 제공하는데, 막베신 내에서 산소 원자는 케토기로서 존재하며, 18,21-디히드로막베신 내에서 산소 원자는 히드록실기로서 존재한다.
더욱 구체적인 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1에 따른 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염을 제공한다.
Figure 112008045421569-PCT00004
R1 은 H, OH, 또는 OCH3 이다.
R2 는 H 또는 CH3이다.
R3 및 R4는 모두가 H이거나 함께 하나의 결합을 나타낸다(즉, C4와 C5는 이중결합임)
R5 는 H 또는 -C(O)-NH2 이다.
21-데옥시막베신 유사체는 또한 본원에서 “본 발명의 화합물”로 언급될 수 있으며, 상기 용어는 본원에서 혼용될 수 있다.
상기 구조는 대표적인 호변체(tautomer)를 나타내며, 본 발명은 화학식 (1) 화합물의 모든 호변체, 예를 들어 에놀 화합물이 예시된 경우에는 케토화합물 및 그 반대의 경우를 포함한다.
본 발명은 상기에서 보인 구조(1)로 정의된 화합물의 입체이성질체 모두를 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 약제학적인 목적으로 화학식 1과 같은 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염을 제공한다.
정의
관사 "하나의(a)"와 "하나의(an)"는 관사의 문법적 객체들 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하도록 본원 명세서에서 사용되었다. 예를 들면, "하나의 유사체"는 한 개의 유사체 또는 한 개 이상의 유사체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "유사체(들)"는 서로 구조적으로 유사하지만 구성상에서 조금 차이가 있는(한 원자가 또 다른 원자로 치환되거나 특정 기능기가 존재 또는 부재하는 경우) 화학적 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 “상동체(들)”은 다른 막베신 생산 균주로부터 유래한 대체가능한 막베신 생합성 클러스터로부터 유래하거나, 예를 들면, 겔다나마이신, 허비마이신 또는 레블라스타틴으로부터의 대체가능한 안사마이신 생합성 유전자 클러스터로부터 유래한 상동체로부터 유래하는 본원에 기술된 유전자 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 상동체를 의미한다. 이러한 상동체는 같은 기능을 수행하는 단백질을 코딩하거나, 막베신 또는 관련된 안사마이신 폴리케티드 생합성에서 이들 자체로 상기 유전자 또는 단백질과 같은 기능을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 상동체는 본원에 기재된 구체적 유전자 서열(표 3, 서열번호 17은 클러스터 내의 모든 유전자 서열이며, 이로부터 구체적인 유전자가 추론될 수 있다)에 대해 적어도 40%의 서열 동일성, 바람직하게 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 가진다. 퍼센트 상동성은 NCBI 웹사이트 상에서 이용이 가능한 BLASTn 또는 BLASTp 같은 당업계에 알려진 프로그램을 사용하여 계산할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “암”은 피부나 신체 기관, 예를 들어 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 뇌, 위 또는 장에서의 양성 또는 악성 신 생장을 의미한다. 암은 인접 조직으로 침윤되고 떨어져 있는 기관, 예를 들어 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 퍼지는(전이) 경향이 있다. 본원에서 사용된 용어 암은 흑색종, 임파종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종 및 비만세포종과 같지만 이에 한정되지 않는 전이성 종양 세포 형태, 및 직장암, 전립선암, 소세포폐암 및 비소세포폐암, 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 교모세포암, 원발성 간암 및 난소암과 같지만 이에 한정되지 않는 조직암 형태를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "B-세포 악성 종양"은 만성 림프성 백혈병(CLL), 다발성 골수종 및 비호지킨 임파종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)을 포함하는 질병 그 룹을 포함한다. 이들은 혈액 및 혈액 형성 기관의 종양성 질환이다. 이들은 골수 및 면역계 기능 장애로 인해 발생하며, 환자를 감염 및 출혈에 매우 민감해지게 한다.
본원에서 사용된 용어 "생체이용도"는 투여 후 약물 또는 다른 물질이 흡수되거나 생물학적 활성 자리에서 이용가능하게 되는 정도 또는 속도를 의미한다. 이러한 성질은 화합물의 용해도, 위에서의 흡수율, 단백질 결합 정도 및 대사 등을 포함하는 수많은 요소에 의존한다. 당해 분야의 당업자에게 익숙한 생체 이용가능성을 위한 다양한 테스트가 본원에 기술되어 있다(Egorin et al. (2002)).
본원에서 사용된 용어 “수용해도”는 수성 매질, 예를 들어, pH 7.3 인산 완충 식염수(PBS)에서의 용해도를 의미한다. 용해도를 위한 테스트는 “수용해도 분석”으로서 하기 실험예에 주어져 있다.
본원에서 사용된 용어 “post-PKS 유전자(들)”은 폴리케티드의 post-폴리케티드 합성 효소의 변형에 요구되는 유전자를 의미한다. 예를 들어, 모노옥시게나제, O-메틸트랜스퍼라제 및 카르바모일트랜스퍼라제이 있지만 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 막베신 계 내의 이러한 변형 유전자는 mbcM , mbcN , mbcP , mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450을 포함한다.
화학식 (I)의 화합물과 같은 본원 발명 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 무기산 또는 유기산 또는 염기로부터 형성되는 통상적인 염뿐만 아니라 4차 암모늄산 부가염을 포함한다. 적절한 산성염의 보다 구체적인 예로는 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 인산염, 질산염, 과염소산염, 푸마르산염, 아세트산염, 프로피온산염, 숙신산염, 글리콜산염, 포름산염, 젖산염, 말레산염, 타르타르산염, 시트르산염, 팔모익산(palmoic acid)염, 말론산염, 히드록시말레산염, 페닐아세트산염, 글루탐산염, 벤조산염, 살리실산염, 푸마르산염, 톨루엔술폰산염, 메탄술폰산염, 나프탈렌-2-술폰산염, 벤젠술폰산염, 히드록시나프토익산염, 요오드화수소산염, 말산염, 스테로익산(steroic acid)염, 타닌산염 및 그 등가물을 포함한다. 옥살산과 같은 기타 산들은 그 자체로는 약제학적으로 허용가능하지 않지만, 본원 발명의 화합물과 그들의 약제학적으로 허용가능한 염을 얻을 때 중간체로서 유용한 염의 제조에서 유용할 수 있다.
적절한 염기성염의 보다 구체적인 예로는 나트륨염, 리튬염, 칼륨염, 마그네슘염, 알루미늄염, 칼슘염, 아연염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 콜린염, 디에탄올아민염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염 및 프로카인염을 포함한다. 본 발명에 따른 화합물에 대한 하기의 언급에는 화학식(I)의 화합물과 약제학적으로 허용가능한 이의 염 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 “18,21-디히드로막베신” 및 “막베신 II"(막베신의 디히드로퀴논 형태)는 혼용될 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 상기에서 설명한 바와 같이 21-데옥시막베신 유사체, 이러한 화합물의 제조방법, 및 이러한 화합물을 의학적으로 이용하는 방법 및 중간체 또는 추가적인 반합성 유도체 또는 생체내변환 방법에 의한 유도체로서 이용하는 방법을 제공한다.
바람직하게는 R1은 H 또는 OH이다. 본 발명의 한 실시예에서 R1은 H이다. 본 발명의 또 다른 실시예에서 R1은 OH이다.
바람직하게는 R2는 H이다.
바람직하게는 R3 및 R4 는 모두 H이다.
바람직하게는 R5는 -C(O)-NH2이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 R1은 H, R2는 H, R3 및 R4는 모두 H, R5는 -C(O)-NH2이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서 R1은 OH, R2는 H, R3 및 R4는 모두 H, R5는 -C(O)-NH2이다.
안사 고리에 연결된 비-수소 곁사슬의 입체화학은 바람직하게 하기 구조(15)와 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같다.
본 발명은 또한 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염과 함께 하나 또는 그 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 21-데옥시막베신 유사체를 생체내변환이나 합성화학을 통한 다른 변형을 위한 기질로서 이용하는 방법을 제공한다.
임상적 시도를 해온 겔다나마이신 및 17-AGG 같은 기존의 안사마이신 Hsp90 억제제들 일부는 양호하지 않은 약제학적 성질, 양호하지 않은 수용해도 및 양호하지 않은 생체이용성을 가진다.
본 발명은 수용해도와 같이 개선된 성질을 가지는 신규한 21-데옥시막베신 유사체를 제공한다. 당업자는 전형적인 방법을 사용하여 본 발명에서 제시된 화합물의 수용해도를 쉽게 결정할 수 있다. 대표적 방법은 본원 실시예에 나타냈다.
하나의 양태로서, 본 발명은 의약 제조분야에서 21-데옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다. 다른 일 실시예에서 본 발명은 암 및/또는 B-세포 악성종양 치료를 위한 의약 제조에서 21-데옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다. 다른 일 실시 예에서 본 발명은 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리를 위한 의약 제조에서 21-데옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 의료분야에서 21-데옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다. 다른 일 실시예에서 본 발명은 암 및/또는 B-세포 악성종양 치료에 있어 21-데옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다. 다른 일 실시예에서 본 발명은 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료 및/또는 암의 예방적 전처리를 위한 의약 제조에서의 21-데옥시막베신 유사체의 용도를 제공한다.
다른 일 실시예에서 본 발명은 암 및/또는 B-세포 악성종양 치료방법을 제공하는데, 상기 방법은 치료학적으로 유효한 양의 21-데옥시막베신 유사체를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 일 실시예에서 본 발명은 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환 및/또는 암의 예방적 전처리를 위한 치료 방법을 제공하는데, 상기 방법은 치료학적으로 유효한 양의 21-데옥시막베신 유사체를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기에서 기재한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 암 및/또는 B-세포 악성종 양 치료에 유용할 것으로 기대된다. 본 발명의 화합물 및 특별히 Hsp90에 대해 양호한 선택성 및/또는 양호한 독성학적 성질 및/또는 양호한 양물동력학을 가질 수 있는 본 발명의 화합물은 예를 들면, 이에 제한되지는 않지만 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 류마티스성 관절염 같은 자가면역질환의 다른 징후들의 치료나 암의 예방적 전처리에 효과적일 수 있다.
중추신경계 질환 및 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 프리온병(광우병), 척수인경 근위축증(SBMA), 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
혈관신생 의존성 질병은 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막증 및 다양한 다른 안과질환, 동맥경화증 및 류마티스성 관절염을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
자가면역질환은 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스, 건선을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
“환자”는 인간 및 다른 동물(특별히 포유류) 대상을 포함하며, 바람직하게는 인간 대상이다. 따라서, 본 발명의 21-데옥시막베신 유사체의 상기 방법 및 용 도는 인간 의학 및 수의학 분야에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 인간 의학분야이다.
상기에서 언급된 본 발명의 화합물 또는 이의 제형은 이에 제한되지는 않지만 예를 들면, 비경구 투여(정맥내 투여 포함), 경구 투여, 국부 투여(구강, 설하, 경피를 포함), 의료용 장치(예를 들어, 스텐트), 흡입에 의해, 또는 주사(피하 또는 근육내)를 통한 소정의 통상적인 방법에 의해 투여될 수 있다. 치료는 단일 투여 또는 일정 시간에 걸친 복수회의 투여로 이루어질 수 있다.
본원 발명의 화합물은 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 하나 또는 그 이상의 허용 가능한 담체와 함께 약제학적 제형으로서 제공되는 것이 바람직하다.
이에 본 발명의 화합물과 함께 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성이 제공된다.
상기 희석제 또는 담체는 본 발명의 화합물과 양립할 수 있다는 의미에서 "허용가능"해야만 하고 복용자에게 해롭지 않아야 한다. 적합한 담체의 예는 하기에 보다 상세하게 기술한다.
본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 치료제와 복합적으로 투여될 수 있다. 두 가지(또는 그 이상) 제제의 복합투여는 각각을 사용할 때보다 훨씬 작은 양을 투여해야 부작용을 줄일 수 있다. 또한, 이전의 치료에 의해 질병에 내성이 생 긴 경우에도 암과 같은 질병의 재감작(resensitisation)을 가능하게 한다.
또한, 본 발명의 화합물 및 다른 치료제를 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 암 또는 B-세포 악성 종양 치료를 위한 세포독성제 또는 세포증식 억제제 같은 제2의 제제와 함께 복합 치료를 하는 데 있어서의 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명의 화합물은 암 또는 B-세포 악성 종양 치료를 위해 세포독성제 또는 세포증식억제제와 같은 다른 치료제와 함께 복합 투여된다. 또한 전형적인 제제는 알킬화제제 및 유사분열 억제제(토포이소머라제 II 억제제 및 튜불린 억제제 포함) 같은 세포독성제를 포함한다. 또 다른 전형적인 제제는 단백질 키나아제 억제제 및 타이로신 키나아제 수용체 차단제 같은 DNA 결합제, 항대사제 및 세포증식 억제제를 포함한다.
적합한 제제는 메토트렉사이트, 류코보린, 프레니손, 블레오마이신, 사이클로포스파미드, 5-플루오르우라실, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 독소루비신(아드리아마이신), 타목시펜, 토레미펜, 메게스트롤 아세테이트, 아나스트로졸, 고세렐린, 항-HER2 단일 클론 항체(예를 들어, Herceptin™ 로 시판되는 트라스투주맙), 카페시타빈, 라록시펜 염화수소, EGFR 억제제(예를 들어, Iressa로 시판되는 게피티닙, Tarceva™로 시판되는 엘로티닙, Erbitux™로 시판되는 세툭시맙), VEGF 억제제(예를 들어, Avastin™으로 시판되는 베바시주맙), 프로테아좀 억제제(예를 들어, Velcade™로 시판되는 보르테조밉) 또는 Glivec로 시판되는 이마티닙을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 적합한 제제는 시스플라틴, 사이타라빈, 사이클로헥시클로로데틸니트로스우레아, 젬시타빈, 이포스프아미드, 류코보린, 미토마이신, 미토잔트론, 옥살리플라틴, 탁솔 및 빈데신을 포함하는 탁산 같은 통상적인 화학치료제; 호르몬 치료제; 단일클론항체 치료제; 다사티닙, 라파티닙 같은 단백질 키나아제 억제제; 보리노스타트 같은 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제; 수니티닙, 소파레닙, 레나리도미드 같은 혈관신생 억제제; 및 템시로리무스 같은 mTOR 억제제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가적으로, 본 발명의 화합물은 방사선 치료 또는 외과 수술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 치료와 병용하여 투여될 수 있다.
제형은 단위 투약 형태로 전형적으로 제공될 수 있고, 제약 업계에 잘 알려져 있는 방법 중 어느 하나를 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 성분(본 발명의 화합물)을 하나 또는 그 이상의 부속 성분으로 구성되는 담체와 연계시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 상기 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세하게 분쇄된 고체 담체 또는 둘 모두와 연계시키고, 다음으로 필요에 따라 제품 모양을 만드는 과정에 의해 균일하고 친밀하게 제조된다.
본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태의 활성 성분, 선택적으로 무독성 유기 또는 무기, 산 또는 염기, 부가 염을 포함하는 약제학적 제형의 형태로 경구 또는 임의의 비경구 경로 중 어느 하나에 의해 정상적으로 투여될 것이다. 투여 경로뿐만 아니라, 질병 및 치료될 환자에 따라 상기 조성물은 다양한 투여량으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 즉시-, 지연- 또는 조절-방출 적용을 위해 정제, 캡슐, 좌제, 엘릭서, 용액 또는 현탁액의 형태로 경구, 구강 또는 설하 투여될 수 있으며, 이들은 향료 또는 색소를 포함할 수 있다.
이러한 정제는 미세결정 셀룰로즈, 락토오즈, 시트르산 나트륨, 탄산 칼슘, 제2인산 칼슘 및 글리신과 같은 부형제, 전분(바람직하게 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 전분 글리콜산 나트륨(sodium starch glycolate), 크로스카멜로스 나트륨 및 특정 복합 규산염과 같은 붕해제, 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 히드록시-프로필셀룰로스(HPC), 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 바인더를 포함할 수 있다. 추가적으로, 마그네슘 스테아르산, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크와 같은 윤활제를 포함할 수 있다.
유사한 형태의 고형 조성물은 또한 젤라틴 캡슐의 충진제로 사용될 수 있다. 이러한 측면에서 바람직한 부형제는 락토오스, 전분, 셀룰로스, 유당 또는 고분자 량의 폴리에틸렌 글리콜이 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭서를 위해, 본 발명의 화합물은 다양한 가미제 또는 향료, 칼라재 또는 색소와 함께, 유화제 및/또는 현탁제와 함께, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 함께, 및 이들의 혼합물과 함께 혼합될 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 부속 성분과 함께 압착 또는 주조되어 만들어질 수 있다.
압착된 정제는 바인더(예를 들어, 포비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 붕해제(예를 들어, 전분 글리콜산 나트륨, 교차-결합된 포비돈, 교차-결합된 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨), 표면-활성제 또는 분산제와 선택적으로 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유 유동성 형태의 활성 성분을 적합한 기계 안에서 압착시켜 제조될 수 있다. 주조된 정제는 비활성 액체 희석제로 수화된 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기계 안에서 주조하여 만들어질 수 있다. 상기 정제는 선택적으로 코팅되거나 자국을 낼 수 있고, 활성 성분을 느리게 또는 조절하여 방출되도록, 예를 들어 소정 방출 특성을 제공하는 다양한 함량의 히드록시프로필메틸 셀룰로스를 이용하여 제형화될 수 있다.
경구 투여에 적합한 본원 발명에 따른 제형은 각각이 미리 정해진 함량의 활성 성분을 포함하는, 캡슐, 교갑(cachet) 또는 정제와 같은 분리된 단위로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비-수성 액체 상태의 액제 또는 현탁제로서; 또 는 수중유(oil-in-water) 액체형 에멀젼 또는 유중수(water-in-oil) 액체형 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 상기 활성 성분은 또한 환약(bolus), 연약(electuary), 또는 페이스트(paste)로서 제공될 수 있다.
입 안의 국소 투여에 적합한 제제는 성분, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스의 향기나는 기초 제형에 활성 성분을 포함하는 로젠지(lozenge); 젤라틴과 글리세린, 또는 수크로스와 아카시아와 같은 비활성 성분에 활성 성분을 포함하는 향정(pastille); 및 적절한 액체형 캐리어에 활성 성분을 포함하는 구강-세척액을 포함한다.
상기에서 특별히 언급된 성분들뿐만 아니라, 본 발명의 제형은 문제가 되는 제제의 형태를 고려하여 당해 분야에서 통상적인 기타 물질을 포함할 수 있는데, 예를 들면, 경구 투여를 위해 적절한 제제로는 착향료를 포함할 수 있다.
국부 투여에 적합한 약제학적 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 약물이 함침된 드레싱(impregnated dressing), 스프레이, 에어졸 또는 오일, 경피 기구, 분진성 분말(dusting powder) 등으로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 활성제를 포함하는 전형적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 따라서, 이들은 또한 크림 또는 연고 내에 보존제, 약물 침투를 돕는 용매, 연화제 및 로션 내에 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 양립할 수 있는 전형적인 담체 및 첨 가제를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 조성물의 약 1% 이상 내지 약 98%로 제공될 수 있다. 보다 일반적으로 조성물의 약 80% 이상을 형성할 것이다. 예시하여 설명하면, 크림 또는 연고는 소정의 균일성을 갖는 크림 또는 연고를 제조하기에 충분한 양의 화합물을 약 5-10중량%의 화합물을 포함하는, 충분한 양의 친수성 재료와 물을 혼합하여 제조한다.
경피 투여를 위한 약제학적 조성물은 오랜 시간 동안 환자의 표피와 밀접하게 접촉되어 있도록 분리 패치로 제공될 수 있다. 예를 들어 활성 성분은 전리 요법에 의해 패치로부터 전달될 수 있다.
외부 조직, 예를 들어, 입 및 피부에 적용하기 위해서, 조성물은 국부 연고 또는 크림으로 바람직하게 적용된다. 연고로 제형화된 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 물과 섞일 수 있는(water-miscible) 연고 베이스를 사용할 수 있다.
대안적으로, 활성제는 수중유 크림 베이스 또는 유중수 베이스로 구성된 크림으로 제형화될 수 있다.
비경구 투여를 위해, 유입 단위 투약 형태는 활성 성분 및 살균된 부형제를 이용하여 제조할 수 있는데, 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일과 같지만 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 물이다. 상기 부형제 및 사용 된 농도에 따라, 상기 활성 성분은 부형제에 현탁되거나 용해될 수 있다. 용액을 제조하는 데 있어서, 상기 활성 성분은 주입을 위해 물에 용해할 수 있고 적합한 용기 또는 앰플에 충진되고 봉입되기 전에 여과 살균될 수 있다.
유리하게, 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 제제는 부형제에 용해될 수 있다. 안정성을 증진시키기 위해, 조성물은 용기에 충진하고 진공 상태에서 물을 제거한 후 냉동시킬 수 있다. 냉동 건조된 분말은 다음으로 용기에 봉입되고 주입하기 위해 동반된 물의 용기는 사용하기 전에 액상으로 되게 하도록 제공할 수 있다.
비경구 현탁액은, 활성 성분이 용해되는 대신에 부형제에 현탁되고 여과를 통해 살균될 수 없는 것을 제외하고, 실질적으로 용액과 동일한 방법으로 제조한다. 상기 활성 성분은 살균된 부형약에 현탁시키기 전 산화 에틸렌에 노출시켜 살균할 수 있다. 유리하게, 계면활성제 또는 침윤제가 조성물에 포함되어 상기 활성 성분의 균일한 분포를 촉진한다.
본 발명의 화합물은 또한 당업계에 알려진 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 미국특허 제5,399,163호, 미국특허 제5,383,851호, 미국특허 제5,312,335호, 미국특허 제5,064,413호, 미국특허 제4,941,880호, 미국특허 제4,790,824호 또는 미국특허 제 4,596,556호에서 공지한 장치와 같은 바늘없는 피하주사 주입 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에서 유용한 잘 알려진 이식체 및 모듈의 예는, 조절된 속도로 약물을 투약하기 위한 이식 가능한 미세-주입 펌프를 공지한 미국특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료용 장치를 공지한 미국특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 공지한 미국특허 제 4,447,233호; 연속적인 약물 전달을 위한 다양한 유입 속도의 이식 가능한 주입 기구를 공지한 미국특허 제4,447,224호; 멀티-챔버 구획(multi-chamber compartment)을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 공지한 미국특허 제4,439,196호; 및 삼투 약물 전달 시스템을 공지한 미국특허 제4,475,196호를 포함한다. 많은 다른 이러한 이식체, 전달 시스템 및 모듈은 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 화합물이 투여될 투여량은 특정 화합물, 관련 질환, 환자 및 질환의 성질 및 심각도, 환자의 신체적 조건, 선택된 투여 경로에 따라 다양할 것이다. 적절한 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
상기 조성물은 투여 방법에 따라 본 발명의 화합물을 0.1중량% 이상, 바람직하게 5 내지 60중량%, 보다 바람직하게 10 내지 30중량%로 포함할 수 있다.
본 발명 화합물의 개별적인 투여 제형의 최적 함량 및 투여 간격은 치료 조 건의 성질 및 정도, 투여 제형, 경로 및 부위, 및 치료될 특정 환자의 나이와 상태에 의해 결정될 것이고, 의사는 궁극적으로 사용될 적절한 투여 제형을 결정할 것이라는 것은 당해 분야의 당업자에 의해 인식될 것이다. 이러한 투여 제형은 적절할 정도로 자주 반복될 수 있다. 부작용이 생긴다면, 보통의 임상 진료에 따라서 투여 제형의 함량 및/또는 빈도가 변경되거나 또는 감소될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 21-데옥시막베신 유사체의 제조방법을 제공하는 것이다.
막베신은 두 단계로 생합성되는 것이 고려될 수 있다. 첫 번째 단계에서는 코어-PKS 유전자가 2-탄소의 반복 어셈블리에 의해 마크롤리드 코어를 조립하는데, 이들은 이후 도1에서 보듯이, 첫 번째 효소-없는 중간체 “프리-막베신”을 형성하기 위해 환형화된다. 두 번째 단계에서는 일련의“post-PKS" 절단 효소들이(예를 들면, P450 모노옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제, FAD-의존성 옥시게나제 및 카르바모일트랜스퍼라제) 프리(pre)-막베신 주형에 다양한 부가적 기들을 첨가하기 위해 작용하고, 도 2와 같은 최종적인 모체 화합물 구조를 생성한다. 21 데옥시막베신 유사체는 비슷한 방법으로 생합성될 수 있다.
이러한 생합성 생산물은 신규한 화합물을 생산할 수 있는 적합한 생산 균주의 제작을 통해 얻어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 21-데옥시막베신 유사체의 제조방법을 제공한다.
a) 적절한 조건에서 배양시 막베신 또는 이의 유사체를 생산하는 첫번째 숙주 균주를 제공하는 단계;
b) 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자, 여기서 상기 post-PKS 유전자들 중 적어도 하나는 mbcM 또는 이의 상동체인 유전자를 결실시키거나 불활성화시키는 단계;
c) 상기 변형된 숙주 균주를 21-데옥시막베신 유사체 생산에 적합한 환경에서 배양하는 단계; 및
d) 상기 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.
단계 (a)에서 “막베신 및 이의 유사체”는 막베신 또는 R1-R5 에 의한 변형을 포함하는 이들의 유사체를 의미한다.
단계 (b)에서 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자, 여기서 post-PKS 유전자들 중 적어도 하나는 mbcM 또는 이의 상동체인 유전자를 결실시키거나 불활성화시키는 것은 선별적으로 적합하게 이루어질 수 있다.
다른 일 실시예에서, 단계 b)는 DNA를 mbcM 유전자 또는 이의 상동체 내로 통합시켜 기능적인 mbcM 단백질을 생산할 수 없도록 mbcM(또는 이의 상동체)을 불활성화시키는 것을 포함한다.
대체가능한 하나의 실시예에서, 단계 b)는 mbcM 유전자 또는 이의 상동체를 표적화하여 결실시키는 것을 포함한다.
다른 일 실시예에서 mbcM 또는 이의 상동체는 위치 특이 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 불활성화된다. 다른 일 실시예에서 상기 단계 a)의 숙주 균주는 돌연변이 대상이며, 하나 또는 그 이상의 post-PKS 효소들, 여기서 이들 중 적어도 하나는 MbcM인 효소가 기능하지 않는 변형된 균주가 선택되었다.
본 발명은 또한 mbcM 또는 이의 유사체의 발현을 억제할 수 있는 조절자를 돌연변이 시키는 것을 포함하는데, 당업자는 조절자의 결실 또는 불활성화가 유전자의 결실 또는 불활성화와 같은 효과를 낼 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 구체적 실시예에서, post-PKS 유전자를 선택적으로 결실시키거나 불활성화시키는 방법은 하기의 단계를 포함한다;
(i) 관심 유전자(예를 들어, 겔다나마이신 PKS 생합성 클러스터 및/또는 라파마이신 생합성 클라스터)의 상동체에 기초한 축퇴성 올리고를 고안하고, PCR 반응에서 이러한 프라이머를 사용하여 적합한 막베신 생산 균주로부터 관심 유전자(예를 들어, mbcM)의 내부적 단편을 분리하는 단계;
(ii) 이러한 단편을 포함하는 플라스미드를 동일한 균주 또는 다른 막베신 생산 균주로 통합시켜, 상동재조합에 의해 표적화된 유전자(예를 들어, mbcM 또는 이의 상동체)를 파괴시키는 단계;
(iii) 이렇게 생산된 균주를 막베신 유사체, 예를 들어 21-데옥시막베신 유사체 생산에 적합한 환경에서 배양하는 단계.
구체적 일 실시예에서, 단계 (i)의 막베신-생산 균주는 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum; A. mirum)이다. 또 다른 구체적 실시예에서 단계 (ii)의 막베신-생산 균주는 A. 프레티오섬(A. pretiosum)이다.
당업자는 상기에서 기술된 대체가능한 방법들을 사용하여 균등한 균주를 얻을 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어:
· 축퇴성 올리고는 이에 제한되는 것은 아니나 예를 들면, A.pretiosum 또는 A.mirum 같은 막베신 생산 균주로부터 관심 유전자를 증폭하는 데 이용될 수 있다.
· 다른 축퇴성 올리고는 막베신 생산체의 mbcM 유전자 또는 그 상동체의 적절한 부분을 성공적으로 증폭시킬 수 있도록 고안될 수 있다.
· A.pretiosum 균주의 mbcM 유전자 서열은 A.pretiosum의 mbcM 유전자에 특이적인 올리고를 합성하는데 사용될 수 있으며, 이때 내부적 단편은 어느 막베신 생산 균주, 예를 들면 A.pretiosum 또는 Actionosynnema mirum(A.mirum)로부터 증폭될 수 있다.
· A.pretiosum 균주의 mbcM 유전자 서열은 A.pretiosum의 mbcM 유전자에 대한 축퇴성 올리고를 생성하기 위해 상동 유전자 서열과 함께 이용될 수 있으며, 이때 내부적 단편은 어느 막베신 생산 균주, 예를 들면 A.pretiosum 또는 Actionosynnema mirum(A.mirum)로부터 증폭될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, mbcM에 더하여 추가적인 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화될 수 있다. 도 2는 막베신 생합성 클러스터 내의 post-PKS 유전자의 활성을 나타낸 것이다. 따라서, 당업자는 관심 화합물을 생산할 수 있는 균주에 이르기 위해 추가적인 post-PKS 유전자의 결실 또는 불활성화가 필요할 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기와 같이 mbcM을 포함하는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화되도록 제작된 균주 내로 예를 들면, 대체가능한 막베신 생산 균주 또는 동종의 균주로부터 유래된, mbcM 또는 이의 상동체를 포함하지 않는 하나 또는 그 이상의 동종의 post PKS 유전자가 재도입된다.
이에, 본 발명의 또 다른 양태에 따라, 21-데옥시막베신 유사체의 제조방법이 제공되며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 적합한 환경에서 배양 시 막베신을 생산하는 첫 번째 숙주 균주를 제공하는 단계;
b) 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자, 여기서 상기 post-PKS 유전자들 중 적어도 하나는 mbcM 또는 이의 상동체인 유전자를 결실시키거나 불활성화시키는 단계;
c) mbcM을 포함하지 않는 post-PKS 유전자 일부 또는 전부를 재도입시키는 단계;
d) 21-데옥시막베신 유사체 생산을 위한 적합한 환경 하에서 상기 변형된 숙주 균주를 배양하는 단계; 및
e) 상기 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.
또 다른 일 실시예에서 mbcM을 포함하는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화되도록 제작된 균주는 이에 제한되는 것은 아니나, 리파마이신, 안사미토신, 겔다나마이신, 허비마이신의 생합성에 관계된 클러스터를 포함하는 이종의 PKS 클러스터 유래의 하나 또는 그 이상의 post PKS에 의해 보완될 수 있다.
구체적으로, 상기 숙주 균주는 mbcM이 결실되거나 불활성화된 막베신 생산 균주를 기초로 제작된 균주일 수 있다. 대안적으로, 상기 숙주 균주는 mbcM1, mbcMT1, mbcMT2, mbcP 및 mbcP450이 결실되거나 불활성화된 막베신 생산균주를 기초로 제작된 균주일 수 있다.
이러한 시스템에서 결실 또는 불활성화를 포함하는 기술된 방법들 중 어느 하나의 방법에 의해 균주는 기능하지 않는 mbcM 또는 이의 유사체를 생성할 수 있으며, 이를 통해 하나 이상의 막베신 유사체가 생산될 수 있다. 이에 대한 많은 수의 가능한 이유들이 당업자들에게 설명될 수 있다. 예를 들면, post-PKS 단계에 바람직한 순서가 있을 수 있는데, 하나의 활성을 제거하는 것이 이후의 모든 단계를 관련된 효소들에 맞지 않는 기질 상에서 이루어지도록 할 수 있다. 이는 post-PKS 효소에 제공되는 새로운 기질에 대한 낮은 효율성 또는 단계의 순서가 바뀌었기 때문에 더이상 남아있는 효소에 대한 기질이 아닌 단계 생성물들로 인하여, 배양액 내에 중간체를 생성하도록 한다.
혼합물 내에서 관찰되는 화합물의 비율은 교반 배양기의 rpm(revolutions per minute) 조절 및 교반 배양기의 분출도 같은 배양 환경 내의 변화를 통해 조절될 수 있다.
실시예에서 기재된 바와 같이, 더 작은 작동반경(2.5cm)과 더 높은 rpm(300)의 배양기 내에서 BIOT-3806의 생산물 배양액의 배양은 유사체를 덜 생성시켰다. 반면에 더 넓은 작동반경(5cm) 및 더 낮은 rpm(200 또는 250)의 배양기 내에서의 동등한 실험은 중간체를 더 많이 생성시켰다.
당업자는 생합성 클러스터 내의 일부 유전자가 오페론 내에 구성되고 하나의 유전자 파괴는 종종 동일 오페론 내의 하위 유전자의 발현에 영향을 준다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
화합물의 혼합물이 관찰될 때, 이들은 하기의 예에 일부 기재된 바와 같은 전형적인 방법을 사용하여 바로 분리할 수 있다.
21-데옥시막베신 유사체는 본원에서 기재된 바와 같이 많은 방법을 통해 선별될 수 있고, 하나의 화합물이 선호적인 특징을 보이는 환경 내에서 균주는 이러한 화합물을 우선적으로 만들도록 제작될 수 있다. 이것이 가능하지 않은 비정상적인 환경 내에서 중간체가 형성될 수 있는데, 이는 이후 원하는 화합물을 생산하기 위해 생체내변화될 수 있다.
본 발명은 막베신 PKS 유전자 클러스터 유래의 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자의 선택적인 결실 또는 불활성화에 의해 생성된 신규한 막베신 유사체를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 막베신 생합성 유전자 클러스터 유래의 적어도 mbcM 또는 이의 상동체가 선택적으로 결실되거나 불활성화됨으로써 생산되는 신규한 21-데옥시막베신 유사체에 관한 것이다.
일 실시예에서, mbcM 또는 이의 유사체는 단독으로 결실되거나 불활성화된다.
대체가능한 실시예에서, mbcM 뿐만 아니라 다른 post-PKS 유전자도 추가적으로 결실되거나 불활성화되었다.
구체적 실시예에서, 숙주 균주 내에서 mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450로 구성된 군으로부터 선택되는 추가적인 유전자가 결실되거나 불활성화되었다. 다른 일 실시예에서, mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택되는 추가적인 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화되었다. 다른 일 실시예에서, mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택되는 추가적인 둘 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화되었다. 다른 일 실시예에서, mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택되는 추가적인 셋 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화되었다. 다른 일 실시예에서, mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택되는 추가적인 넷 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화되었다.
당업자는 유전자가 기능하지 않도록 하기 위해 유전자를 완전하게 제거할 필요가 없다는 것을 이해할 수 있을 것이며, 결과적으로 본원에서 사용된 용어 “결실되거나 불활성화된다”는 유전자가 기능하지 않게 되는 어떤 방법이라도 포함하며, 이에 제한되지는 않지만, 유전자가 발현하지 않거나 불활성화 형태로 발현되도록 하는 유전자 전체적인 결실, 표적 유전자로의 삽입에 의한 불활성화, 위치특이적 돌연변이, 유전자가 발현되지 않거나 불활성화 형태로 발현되도록 하는 숙주 균주의 돌연변이(예를 들면, 방사선 또는 돌연변이 유발 화학제, 원형질체 융합 또는 트랜스포존 돌연변이)를 의미한다. 또한 이는 유전자의 내부적 단편의 결실을 포함한다. 대안적으로, 활성 유전자의 기능은 억제제에 의해 화학적으로 약화될 수 있는데, 예를 들면 메타파이론(양립가능한 명칭 2-메틸-1,2-디(3-파이리딜-1-프로파논), EP0627009) 및 안사이미돌은 산화제의 억제제이며, 이들 화합물은 생산 배지에 첨가되어 유사체를 생성시킬 수 있다. 또한, 시네펀진(sinefungin)은 메틸 트랜 스퍼라제 억제제이고, 이는 생체 내에서의 메틸 트랜스퍼라제 활성 억제를 위한 것을 제외하고 유사하게 사용될 수 있다(McCammon and Parks 1981).
양립가능한 구체예에서, 모든 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화될 수 있고, 이때 mbcM 또는 이의 상동체를 포함하지 않는 하나 또는 그 이상의 유전자가 상보성(예를 들면, 자가-복제 플라스미드 상의 부착 부위(att site)에 또는 염색체의 상동부위 내로의 삽입에 의해)에 의해 재도입될 수 있다.
그러므로, 구체예에서 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 21-데옥시막베신 유사체의 생성방법에 관한 것이다.
a) 적합한 환경에서 배양 시 막베신을 생산하는 첫 번째 숙주 균주를 제공하는 단계;
b) 모든 post-PKS 유전자를 선택적으로 결실시키거나 불활성화시키는 단계;
c) 상기 변형된 숙주 균주를 21-데옥시막베신 유사체 생산에 적합한 환경에서 배양하는 단계; 및
d) 상기 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.
양립가능한 구체예에서, 하나 또는 그 이상이 결실된 post-PKS 유전자가 재도입된되고, mbcM 유전자는 재도입되지 않는다.
다른 일 실시예에서, mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 재도입된다. 다른 일 실 시예에서, mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 재도입된다. 다른 일 실시예에서, mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택되는 셋 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 재도입된다. 다른 일 실시예에서, mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 및 mbcP450으로 구성된 군으로부터 선택되는 넷 또는 그 이상의 post-PKS 유전자 재도입된다.
또한, 당업자에게 mbcM 또는 이의 상동체를 포함하는 post-PKS 유전자들의 서브셋이 결실되거나 불활성화될 수 있고, mbcM를 포함하지 않는 상기 post-PKS 유전자의 더 작은 서브셋은 21-데옥시막베신 유사체 생산 균주에 재도입될 수 있다는 사실은 명백할 것이다.
당업자는 적어도 mbcM 또는 이의 상동체가 결여된, 막베신에 대한 생합성 유전자 클러스터를 포함하는 균주를 생성하기 위한 다양한 방법이 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
폴리케티드 유전자 클러스터는 이종 숙주 내에서 발현될 수 있다는 것이 당업자들에게 잘 알려져 있다(Preifer and Khosla, 2001). 따라서, 본 발명은 mbcM을 포함하지 않거나, 비기능성 mbcM 변이체를 포함하거나, 저항성 및 조절 유전자 포함하거나 포함하지 않는, 완전하거나 추가적인 결실을 포함하는, 막베신 생합성 유 전자 클러스터의 이종 숙주 내로의 전이를 포함한다.
대안적으로, 완전한 막베신 생합성 클러스터는 저항성 및 조절 유전자를 포함하거나 포함하지 않은 상태로 이종 숙주내로 전이될 수 있으며, 이는 본원에 기재된 mbcM을 결실시키거나 불활성화시키기 위한 방법들을 통해 조작될 수 있다.
상기에서 정의된 바와 같이 이러한 방대한 DNA 절편들의 전이를 위한 방법 및 벡터는 당업계에 잘 알려져 있거나(Rawlings, 2001; Staunton and Weissman, 2001), 본원에서 기술된 방법으로 제공된다.
이러한 배경에서, 바람직한 숙주세포 균주는 원핵생물이며, 더욱 바람직하게는 악티노마이세테 또는 대장균이고, 더욱더 바람직한 숙주 세포 균주는 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum; A. mirum), 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum; A. pretiosum), S. 하이그로코피쿠스(hygroscopicus), S. 하이그로코피쿠스 속(hygroscopicus sp.), S. 하이그로코피쿠스 바(hygroscopicus var.), 아스코마이세티쿠스(ascomyceticus), 스트렙토마이세스 스트렙토마이세스 쭈쿠밴시스(Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 사카로폴리스포라 에리쓰래아(Saccharopolyspora erythraea), 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 아버미티리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 신나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 리모수스(Streptomyces rimosus), 스트렙토마이세스 알버스(Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 그리세오퍼스쿠스(Streptomyces griseofuscus), 스트렙토마이세스 론지스포로플라버스(Streptomyces longisporoflavus), 스트렙토마이세스 베네주에래(Streptomyces venezuelae), 스트렙토마이세스 알버스(Streptomyces albus), 마이크로모노스포라 종(Micromonospora sp.), 마이크로모노스포라 그리세오루비다(Micromonospora griseorubida), 아미코라톱시스 메디터라네이(Amycolatopsis mediterranei) 또는 악티노플라네스 종 (Actinoplanes sp.) N902-109를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 예로는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종(Streptomyces hygroscopicus subsp.) 겔다너스(geldanus) 및 스트렙토마이세스 비오라테우스니거(Streptomyces violaceusniger)를 포함한다.
일 구체예에서 전체적인 생합성 클러스터가 전이되었다. 양립가능한 구체예에서 mbcM이 제거된 전체 PKS가 전이되었다. 양립가능한 구체예에서 mbcM을 포함하는 작용성 post-PKS 유전자 어떤 것도 없이 전체 PKS가 전이되었다.
다른 일 구체예에서 전체적인 막베신 생합성 클러스터가 전이되었고, 이때 본원에 기술된 바에 따라 조작되었다.
본 발명의 대안적 양태로서, 본 발명의 21-데옥시막베신 유사체는 적합한 균주를 통해 생체내전환되어 더 진행될 수 있다. 적합한 균주는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum; A. mirum), 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum; A. pretiosum), S. 하이그로코피쿠스(hygroscopicus), S. 하이그로코피쿠스 속(hygroscopicus sp.) 같은 이용가능한 야생형 균주 중 어느 하나일 수 있다.
대안적으로, 적합한 균주는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, mbcN, mbcP, mbcMTI, mbcMT2 mbcP450(본원에서 정의된 바와 같이), gdmN, gdmM, gdmL, gdmP(Rascher et al., 2003), 겔다나마이신 17-O-메틸 트랜스퍼라제, asm7, asm10, asm11, asm12, asm19 및 asm21 (Cassady et al., 2004, Spiteller et al., 2003) 같은 각각의 post-PKS 유전자에 의해 생체내변환되도록 조작될 수 있다.
아직 규명되지 않은 유전자가 있거나, 공유 도메인 내의 서열이 존재하지 않더라도 당업자가 전형적인 방법을 통해 이러한 서열을 획득하는 것은 통상적이다.예를 들면 겔다나마이신 17-O-메틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 서열은 공유 도메인 내에 존재하지 않지만, 당업자는 프로브를 만들 수 있는데, 비슷한 O-메틸 트랜스퍼라제를 이용하여 이종의 프로브를 만들거나 이용가능한 상동의 유전자로부터 축퇴성 프라이머를 고안함으로써 상동의 프로브를 만들어 겔다나마이신 생산 균주 상에서 서던블롯(Southern blots)을 수행할 수 있으며, 이를 통해 생체내변환 시스템을 생성할 수 있는 이러한 유전자를 획득할 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 균주는 본래의 폴리케티드 클러스터에 의해 생산되는 폴리케티드 생산을 막을 수 있도록, 전체적 또는 부분적으로 결실되거나, 아니면 불활성화된 하나 또는 그 이상의 본래의 폴리케티드 클러스터를 가질 수 있다.
상기 조작된 균주는 예를 들면, 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum; A. mirum), 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum; A. pretiosum), S. 하이그로코피쿠스(hygroscopicus), S. 하이그로코피쿠스 속(hygroscopicus sp.), S. 하이그로코피쿠스 바(hygroscopicus var.), 아스코마이세티쿠스(ascomyceticus), 스트렙토마이세스 쭈쿠밴시스(Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 사카로폴리스포라 에리쓰래아(Saccharopolyspora erythraea), 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 아버미티리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 신나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 리모수스(Streptomyces rimosus), 스트렙토마이세스 알버스(Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 그리세오퍼스쿠스(Streptomyces griseofuscus), 스트렙토마이세스 론지스포로플라버스(Streptomyces longisporoflavus), 스트렙토마이세스 베네주에래(Streptomyces venezuelae), 마이크로모노스포라 종(Micromonospora sp.), 마이크로모노스포라 그리세오루비다(Micromonospora griseorubida), 아미코라톱시스 메디터라네이(Amycolatopsis mediterranei) 또는 악티노플라네스 종 (Actinoplanes sp.) N902-109를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 가능한 균주 는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종(Streptomyces hygroscopicus subsp.) 겔다너스(geldanus) 및 스트렙토마이세스 비오라테우스니거(Streptomyces violaceusniger)를 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 mbcM 유전자 또는 이의 상동체가 결실되거나 불활성화되어 21-데옥시막베신 또는 이의 유사체(예를 들어 화학식 1의 화합물로 정의되는 21-데옥시막베신 유사체)를 생산할 수 있는, 자연적으로 막베신 또는 이의 유사체를 생산하는 숙주 및 21-데옥시막베신 또는 이의 유사체 생산에 대한 이의 용도를 제공한다.
그러므로, 일 구체예에서 본 발명은 유전공학적으로 처리되어 변경되지 않은 상태의 막베신을 자연적으로 생산하는 균주를 제공한다. 이때 상기 균주는 결실된 막베신 PKS 유전자 클러스터 유래의 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자를 가지며, 여기서 결실되거나 불활성화된 post-PKS 유전자의 하나는 mbcM 또는 이의 상동체이다.
본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 과정에서 산출되는 모든 생산물을 포함한다.
상기에서 기재한 바와 같이 본 발명의 21-데옥시막베신 유사체의 제조 과정 이 실질적으로 또는 전적으로 생합성에 의한다고 하더라도, 전형적인 화학적 합성 방법을 포함하는 과정에 의한 본 발명의 21-데옥시막베신 유사체를 생산하거나 상호전환하는 것을 배제하는 것은 아니다.
막베신 생합성 유전자 클러스터의 유전적 조작을 위해, 먼저 유전자 클러스터가 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum)으로부터 서열분석되었지만, 당업자는 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니나 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum) 같은 막베신을 생산하는 양립가능한 균주가 있다는 것을 이해할 수 있다.
이러한 균주 유래의 막베신 생합성 유전자 클러스터는 본원에서 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum)에 대해 기재한 바와 같이 서열분석될 수 있으며, 상기 정보는 동등한 균주를 생성하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 하기를 포함한다:
- mbcM 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화된 막베신 생산 균주를 기초로 조작된 균주로서, 구체적으로 mbcM이 결실 또는 불활성화되거나, mbcM1, mbcMT1, mbcMT2, mbcP 및 mbcP450이 결실되거나 불활성화되도록 제작된 균주. 적합한 막베신 생산 균주는 A.프레티오섬 또는 A.미럼이다.
- 21-데옥시막베신 유사체의 제조에 있어서 이렇게 제작된 균주의 용도.
본 발명의 화합물은 하나 또는 그 이상의 다음의 성질을 가지는 것으로 기대될 수 있다는 점에서 유리하다: Hsp90에 대한 높은 결합력, Hsp90에 대한 빠른 결합속도, 높은 용해도, 양호한 안정성, 양호한 제형가능성, 양호한 경구적 생체이용성, 및 이에 제한되는 것은 아니나, 낮은 글루크로닌화, 양호한 세포 흡수성, 양호한 뇌의 양물동태성, 적혈구에 대한 낮은 결합력, 양호한 독성학적 성질, 양호한 간독성 성질, 양호한 신장독성, 낮은 부작용 및 낮은 심장성 부작용을 포함하는 양호한 약물동태적 성질.
도 1: 첫 번째 잠재 효소가 유리된, 프리(pre)-막베신 및 post-PKS 프로세싱을 보여주는 막베신 생합성을 나타낸 것이다.
도면 내의 PKS 과정 단계의 리스트는 사건의 순서를 대표하는 것은 아니다.
다음 약어는 클러스터 내의 구체적 유전자에 이용된다: ALO - AHBA loading domain; ACP - Acyl Carrier Protein; KS - β-ketoacylsynthase; AT - acyl transferase; DH - dehydratase; ER - enoyl reductase; KR - β-ketoreductase.
도 2: 막베신을 얻기 위한 프리-막베신의 post-PKS 프로세싱 부위를 묘사한 것이다.
도 3: 플라스미드 pLSS308이 상동 재조합에 의해 염색체 내로 통합되어 mbcM 유전자 파괴를 일으키도록 제작된 균주 BIOT-3806의 생성을 도시화한 것이다.
도 4: gdmM (서열번호 1) 및 riforf19 (서열번호 2)의 서열 정렬을 나타낸 것이다. 축퇴성 올리고의 결합 부분에 밑줄을 그었다.
도 5: gdmM (서열번호 1), mbcM 단편(서열번호 3, A. 미럼) 및 mbcM 유전자(서열번호 4, A. 프레티오섬)의 서열 정렬을 나타낸 것이다. 축퇴성 올리고의 결합 부분에 밑줄을 그었다.
도 6: A는 gdmM의 변역에 의해 생성되는 GdmM의 단백질 서열(서열번호 5)을 나타낸 것이고, B는 riforf19의 번역에 의해 생성되는 Riforf19의 단백질 서열(서열번호 6을 나타낸 것이다; 이는 단백질 서열 사이의 유사성을 보여준다.
도 7: 실시예 4에 기재된 mbcM의 프레임내 결실의 구축을 나타낸 것이다.
도 8: A는 PCR 생산물 PCRwv308의 서열을 보여준다. 서열번호 20
B는 PCR 생산물 PCRwv309의 서열을 보여준다. 서열번호 21
도 9: A는 실시예 4에 기재된 바와 같이 mbcM 내에 502 아미노산의 프레임내 결실된 DNA 서열을 나타낸 것이다(서열번호 26 및 27).
주요: 1-21 bp는 3-아미노-5-하이드록시벤조익산 생합성의 포스파타제의 3‘ 말단을 코딩하며, 136-68 bp는 mbcM 결실 단백질을 코딩하고, 161-141bp는 mbcF의 3’ 말단을 코딩한다.
B는 단백질의 아미노산 서열을 보여주는 것이다(서열번호 28). 단백질 서열은 도 9A 내에 보여진 완전한 가닥으로부터 생성된 것이다.
도 10: mbcP, mbcP450, mbcMTI 및 mbcMT2 유전자가 프레임 내에 결실되어 mbcM의 결실을 가져온 악티노신네마 프레티오섬 균주의 생성을 묘사한 것이다.
도 11: 증폭된 PCR 생산물 1+2a의 서열을 나타낸 것이다(서열번호 31)
도 12: 증폭된 PCR 생산물 3b+4의 서열을 나타낸 것이다(서열번호 34)
도 13: 0-80nM 화합물 14 및 0-3 μg/ml 미토마이신 C을 시험관 내(in vitro)에서 병용처리시 암세포주 DU145의 생장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 14: 0-160nM 화합물 14 및 0-100 μg/ml 사이클로헥실클로로에틸니트로수레아(CCNU)를 시험관 내(in vitro)에서 병용처리시 암세포주 DU145의 생장에 미치 는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 15: 0-160nM 화합물 14 및 0-100 μg/ml 이포스파미드를 시험관 내(in vitro)에서 병용처리시 암세포주 DU145의 생장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 16: 0-160nM 화합물 14 및 0-10 μg/ml 미토잔트론을 시험관 내(in vitro)에서 병용처리시 암세포주 DU145의 생장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17: 0-160nM 화합물 14 및 0-1 μg/ml 빈데신을 시험관 내(in vitro)에서 병용처리시 암세포주 DU145의 생장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
일반적인 방법
배양물 발효
세균 균주 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum) ATCC 31280(미국특허 제4,315,989호) 및 악티노신네마 미럼(Actinosynnema mirum) DSM 43827 (KCC A-0225)(Watanabe et al., 1982)의 생장을 위한 조건은 미국특허 제4,315,989호 및 미국특허 제4,187,292호에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 방법은 이러한 특허들로부터 개조될 수 있고, 교반 배양기 내의 튜브 또는 플라스크 내의 브로쓰의 배양을 위한 방법은 하기와 같을 수 있는데, 공개된 프로토콜에 대한 변형을 실시예에 나타냈다.
두 균주 모두는 ISP2 아가 배지(배지 3, Shirling, E.B. and Gottlieb, D., 1966) 상에서 28℃ 온도로 2-3일간 배양될 수 있고, 종자 배지(배지 1, 하기 참조 및 US 4,315,989와 US 4,187,292 참조)에 접종하는 데 사용될 수 있다.
접종된 종자 배지는 28℃에서 48시간 동안 5 또는 2.5 cm 작동반경으로 200 내지 300 rpm 사이로 교반하면서 배양되었다.
막베신, 18,21-디히드로막베신 및 21-데옥시막베신 같은 막베신 유사체 생산을 위해 발효배지(배지 2, 하기 참조 및 US 4,315,989와 US 4,187,292 참조)는 2.5% 내지 10%의 농도로 종자 배양물로 접종되었고, 초기에 28℃에서 24 시간 동안 5 또는 2.5 cm 작동반경으로 200 내지 300 rpm 사이로 교반하면서 배양한 후, 26℃에서 6일 동안 배양했다. 다음으로 상기 배양액은 추출을 위해 채취했다.
배지
배지 1 - 종자 배지
증류수 1L 내의 조성임
Glucose 20g
Soluble potato starch (Sigma) 30g
Spray dried corn steep liquor (Roquette Freres) 10g
'Nutrisoy' toasted soy flour (Archer Daniels Midland) 10g
Peptone from milk solids (Sigma) 5g
NaCI 3g
CaCO3 5g
NaOH로 pH 조정 7.0
121℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.
오토클래이브 후 아프라마이신을 최종농도가 50 mg/L가 되도록 첨가하였다.
배지 2 - 발효 배지
증류수 1L 내의 조성임
Glycerol 50g
Spray dried corn steep liquor (Roquette Freres) 10g
'Bacto' yeast extract(Difco) 20g
KH2PO4 20g
MgCl2.6H2O 5g
CaCO3 1g
NaOH로 pH 조정 6.5
121℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.
배지 3 - ISP2 배지
증류수 1L 내의 조성임
Malt extract 10g
Yeast extract 4g
Dextrose 4g
Agar 15g
NaOH로 pH 조정 7.3
121℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.
배지 4 - MAM
증류수 1L 내의 조성임
Wheat starch 10g
Corn steep solids 2.5g
Yeast extract 3g
CaCO3 3g
Iron sulphate 0.3g
Agar 20g
121℃로 20분 동안 오토클래이브시켜 멸균하였다.
LCMS 분석을 위한 배양 브로쓰의 추출
배양 브로쓰(1mL) 및 에틸 아세테이트 (1 mL)를 첨가하였고 15-30분 동안 혼합한 후 10분 동안 원심분리하였다. 유기층 0.5 mL를 수집하였고 증발시켜 건조한 다음 메탄올 0.25 mL에 다시 용해하였다.
발효 브로쓰 분석 및 생체 내 변환 연구를 위한 LCMS 분석 과정
LCMS는 양성 및/또는 음성 이온 모드에서 작동하는 Buker Daltonics Esquire 3000+ electrospray mass spectrometer가 결합된 통합적인 Agilent HP1100 HPLC system을 이용하여 수행되었다.
크로마토그래피는 Phenomenex Hyperclone column (C18 BDS, 3u, 150 × 4.6 mm) 상에서 아세토니트릴+0.1%포름산/물+0.1% 포름산(40/60)로부터 아세토니트릴+0.1% 포름산/물+0.1% 포름산(80/20)까지의 선형 농도 구배로 1 mL/min의 유속으로 11분 동안 용출하여 수행하였다.
UV 분광은 190 내지 400 nm 사이에서 기록하였고, 추출된 크로마토그램은 210, 254 및 276 nm에서 얻었다. 질량 분석은 100 내지 1500 amu 사이에서 기록하였다.
항암 활성을 위한 시험관 내 생물검정
화합물의 시험관 내 항암활성 평가는 단일층 증식 방법에 의해 증식된 38가지의 종양 세포주의 패널을 대상으로 온코테스트 시험 기관(Oncotest Testing Facility), Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg을 통해 수행했다. 선택된 세포주들 중 9 가지의 특징을 표1에 요약했다.
Figure 112008045421569-PCT00005
온코테스트 세포주는 Roth et al., (1999)에 기술된 바와 같이 인간 종양 이종이식체로부터 수립되었다. 공여체 이종이식의 기원은 Fiebig et al., (1999)에 의해 기술되었다. 다른 세포주는 NCI(H460, SF-268, OVCAR-3, DU145, MDA-MB- 231, MDA-MB-468)로부터 얻거나, DSMZ, Braunschweig, Germany (LNCAP)에서 구입할 수 있다.
명시되지 않더라도, 모든 세포주는 RPMI 1640 배지, 10% 우태아 혈청(fetal calf serum) 및 0.1mg/mL 젠타마이신이 포함된 '조제 배지(ready-mix)' 배지 내에서 가습조건(95% air, 5% CO2), 37℃에서 생장시켰다(PAA, Clbe, Germany).
화합물이 인간 종양 세포주의 생장에 미치는 영향을 평가하기 위해 변형된 요오드화 프로피디엄 분석(propidium iodide assay)이 사용되었다(Dengler et al., (1995)).
간단하게, 세포를 트립신 처리하여 증식기 상태에서 채취하고, 수를 세고, 편평한 바닥 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 세포주에 따른 세포 밀도(5-10.000 생존 세포/웰)로 접종하였다.
세포가 다시 증식기에 접어들도록 하기 위해 24시간 회복 후에, 배양 배지(플레이트 당 6개의 대조군 웰) 또는 막베신을 포함하는 배양 배지 0.010 mL를 웰에 첨가하였다.
각 농도는 3개씩 처리되었다. 화합물은 다섯 가지 농도로 적용하였다 (100; 10; 1; 0.1 및 0.01).
연속적 노출 4일 후, 시험 화합물이 있거나 또는 없는 세포 배양 배지를 0.2 mL의 수성 요오드화 프로피디엄 (PI) 용액(7 mg/L)으로 교체하였다.
생존 세포의 비율을 측정하기 위해서, 플레이트를 냉동시켜 세포를 투과화(permeabilization)시켰다. 상기 플레이트를 해동한 후, 형광도를 Cytofluor 4000 microplate reader(여기 530 nm, 방사 620 nm)를 이용하여 측정하였고 생존 세포의 총 수와의 직접적인 관계를 도출하였다.
생장 억제 정도는 처리군/대조군×100(% T/C)로 나타내었다. 활성 화합물에 대한 IC70 값은 세포 생존도에 대한 화합물 농도를 플롯팅하여 측정하였다.
항암 활성에 대한 복합적인 시험관 내 생물검정
화합물의 조합이 DU145 세포의 생장에 미치는 영향을 평가하기 위해 각각의 표준 제제 4 플레이트가 준비된다는 것을 제외하고는, 상기에 기재한 바와 같은 변형된 요오드화 프로피디엄 분석을 또한 사용하였다. 플레이트 하나는 표준 제제가 단독으로 있고, 세 개의 플레이트에는 각각 3개의 다른 고정농도의 화합물 14가 표준제제와 조합되어 있다. 표준 제제를 반-로그 증가에서 sextuplicates 내의 10 농도로 적용하였다. 처리되지 않은 세포 및 화합물 14를 단독으로 처리한 세포들 각각은 6 웰/플레이트에서 덮개를 덮어 배양했다. 생장 억제 정도는 처리군/대조군×100(% T/C)로 나타내었다. 각각의 조합에 대한 IC70 값은 세포 생존도에 대한 화합물 농도를 플롯팅하여 측정하였다.
실시예 1 - 막베신 생합성 유전자 클러스터의 서열분석
악티노신네마 프레티오섬(ATCC 31280) 및 악티노신네마 미럼(DSM 43827, ATCC 29888)에서 Kieser et al., (2000)에 기술된 표준 프로토콜을 이용하여 게놈 DNA를 분리했다. DNA 시퀀싱(서열분석)은 표준 과정을 사용하여 Sequencing facility of the Biochemistry Department, University of Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QW에서 분석했다.
프라이머 BIOSG104 5'-GGTCTAGAGGTCAGTGCCCCCGCGTACCGTCGT-S' (서열번호 7) 및 BIOSG105 5'-GGCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC-S' (서열번호 8)는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 NRRL 3602(서열 허가번호: AY179507)의 겔다나마이신 생합성 유전자 클러스터 유래의 카르바모일트랜스퍼라제-코딩 유전자 gdmN를 표준 기술을 이용하여 증폭하기 위해 사용되었다.
서던 블럿 실험은 DIG 시약 및 비-방사성 핵산 표지 및 검출을 위한 키트를 사용하여 제조지침서(Roche)에 따라 수행했다.
DIG-표지된 gdmN DNA 절편은 이종 프로브로 사용되었다. gdmN에서 생성된 프로브 및 A.프레티오섬2112에서 분리된 게놈 DNA를 사용하여 약 8kb의 EcoRI 단편을 서던 블롯 분석으로 확인했다.
절편은 표준 절차에 따라 리트머스 28 내로 클로닝하고, 형질전환체들을 콜로니 부합법(hybridization)으로 확인했다. 클론 p3을 분리하고, 약 7.7kb 삽입체를 서열분석했다. 클론 p3에서 분리한 DNA를 EcoRI 및 EcoRI/SacI으로 절단하고, 약 7.7kb 및 약 1.2kb 크기의 밴드를 각각 분리했다. 표지화 반응은 제조 프로토콜에 따라 수행했다.
상기에 명명된 두 균주의 코스미드 라이브러리는 벡터 SuperCos 1 및 Gigapack III XL packaging kit (Stratagene)를 사용하여 제조 지침서에 따라 만들었다.
이러한 두 라이브러리는 표준 프로토콜을 사용하여 선별되었고, 프로브로서 클론 p3로부터 유래한 7.7kb EcoRI 절편의 DIG-표지화 절편이 사용되었다.
코스미드 52는 A.프레티오섬의 코스미드 라이브러리로부터 동정되었고, 서열분석을 위해 the sequencing facility of the Biochemistry Department of the University of Cambridge에 맡겨졌다.
유사하게 코스미드 43 및 코스미드 46은 A.미럼의 코스미드 라이브러리로부터 동정되었다. 세가지 코스미드는 모두 서던 블롯 분석에서 나타난 바와 같이 7.7kb EcoRI 절편을 포함한다.
코스미드 43의 PKS 부분의 약 0.7kbp 절편은 프라이머 BIOSG124 5'-CCCGCCCGCGCGAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC-S' (서열번호 9) 및 BIOSG 125 5'-GCGTCCTCGCGCAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC-S' (서열번호 10)을 사용하여 표준 프로토콜에 따라 증폭되고, 클로닝되었으며, 중복되는 클론에 대한 A.프레티오섬 코스미드를 선별하기 위한 프로브로서 사용되었다.
A. 프레티오섬의 코스미드 라이브러리 선별을 위해 사용되었던 프라이머 BIOSG130 5'- CCAACCCCGCCGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG-S' (서열번호 11) 및 BIOSG131 5'-GTCGTCGGCTACGGGCCGGTGGGGCAGCTGCTGT-S' (서열번호 12)에 더해, BIOSG132 5'- GTCGGTGGACTGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC-S' (서열번호 13) 및 BIOSG133 5'- GGCCGGTGGTGCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG-3' (서열번호 14)로 증폭된 DNA 절편 유래의 프로브를 생성하기 위해 코스미드 52의 서열 정보가 사용되었다.
코스미드 311 및 352기 분리되었고, 코스미드 352는 서열분석을 위해 제공되어졌다. 코스미드 352는 코스미드 52와 약 2.7kb의 중복부분을 가진다. 다른 코스미드의 선별을 위해 프라이머 BIOSG136 5'- CACCGCTCGCGGGGGTGGCGCGGCGCACGACGTGG CTGC-3' (서열번호 15) 및 BIOSG 137 5'- CCTCCTCGGACAGCGCGATCAGCGCCGCGC ACAGCGAG-3' (서열번호 16)을 사용하고, 코스미드 311을 주형으로 사용하여 표준 프로토콜에 따라 약 0.6kb PCR 절편을 증폭했다. A.프레티오섬의 코스미드 라이브러리가 선별되었고, 코스미드 410이 분리되었다. 이는 코스미드 352와 약 17kb가 중복되며, 서열분석을 위해 제공되어졌다. 세 가지 중복성 코스미드(코스미드 52, 코스미드 352 및 코스미드 410)의 서열이 결집되었다.
서열분석된 부분은 약 100kbp의 크기였으며, 막베신 생합성 유전자 클러스터(서열번호 17)을 구성하는 23개의 오픈 리딩 프레임이 확인되었다. 서열번호 17 내의 각 오픈 리딩 프레임의 위치는 표 3에 나타냈다.
Figure 112008045421569-PCT00006
Figure 112008045421569-PCT00007
Figure 112008045421569-PCT00008
[주의 1 : c 는 완전한 DNA 가닥에 의해 코딩된 유전자를 말한다; 주의 2 : 어떤 경우에는 하나 이상의 잠재성 개시 코돈이 확인될 수 있다. 당업자는 이를 인식할 수 있고 양립가능한 개시코돈을 확인할 수 있다. 우리는 하나 이상의 가능한 개시코돈을 가지는 그러한 유전자들에 (*) 표시를 했다. 우리가 개시코돈일 될 것이라 믿는 것에 표시하였으나, 당업자는 양립가능한 개시코돈을 사용하여 활성 단백질을 생성할 수 있음을 이해할 것이다.]
실시예 2 - BIOT -3806 균주의 생성 : mbcM 상동인 gdmM 이 플라스미드 삽입에 의해 파괴된 악티노신네마 프레티오섬 ( Actinosynnema pretiosum ) 균주
pLSS308 구축의 요약은 도 3에 나타냈다.
2.1. 플라스미드 pLSS308 의 구축
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 균주 NRRL 3602 (AY179507)의 겔다나마이신 생합성 유전자 클러스터 유래의 gdmM 유전자 및 아미코라톱시스 메디테라네이(Amycolatopsis mediterranei, AF040570 AF040571)의 리파마이신 생합성 유전자 클러스터 유래의 orf19 의 DNA 서열은 VectorNTI 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬되었다(도 4).
축퇴성 올리고를 고안하기에 적합한 상동성 부분이 확인된 이러한 정렬은 악티노신네마 미럼(BIOT-3134; DSM43827; ATCC29888) 유래의 상동 유전자 절편을 증폭하는데 사용되었다.
축퇴성 올리고는 다음과 같다.
FPLS1 : 5': ccscgggcgnycngsttcgacngygag 3' ; (서열번호 18)
FPLS3: 5': cgtcncggannccggagcacatgccctg 3' ; (서열번호 19)
상기에서, n= G, A, T 또는 C; y = C 또는 T; s = G 또는 C
PCR 증폭을 위한 주형은 악티노신네마 미럼 코스미드 43이었다. 코스미드 43 생성은 상기 실시예 1에 기재했다.
올리고 FPLS1 및 FPLS3는 코스미드 43을 주형으로 사용하고, Taq DNA 중합효소를 사용한 표준 PCR 반응 내에서, 악티노신네마 미럼 유래의 gdmM 상동체의 내부적 단편을 증폭하기 위해 사용되었다. 결과적인 793bp의 PCR 생산물을 sma1으로 선형화된 pUC19 내로 클로닝하여, 플라스미드 pLSS301을 생성시켰다. 클로닝된 부분이 서열분석되었고, gdmM과 뚜렷한 상동성을 나타냈다(도 5). 코스미드 43(A.미럼)으로부터 증폭된 유전자 절편과 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬과의 정렬은 도 5에서 보듯이, 이들 서열 사이에서(축퇴성 올리고의 서열 부분은 제외) 단지 1bp만 다른 것으로 나타났다. 이는 A.미럼의 막베신 생합성 유전자 클러스터의 mbcM 유전자로부터 증폭된 것이 분명하다. 플라스미드 pLSS301은 EcoRI/HindIII로 절단하고, 그 절편을 EcoRI/HindIII로 절단된 pKC1132(Bierman et al., 1992) 내로 클로닝했다. 결과적인 플라스미드로 고안된 pLSS308은 아프라마이신 내성 및 A.미럼 mbcM 유전자의 내부적 단편을 포함한다.
2.2 악티노신네마 프레티오섬 아속 . 프레티오섬( Actinosynnema pretiosum subsp . pretiosum )의 형질전환
플라스미드 pUZ8002가 내재되어 있는 대장균 ET12567은 접합(conjugation)을 위한 대장균 공여균주를 생성시키기 위해 전기천공을 통해 pLSS308로 형질전환시켰다. 이 균주는 무성 접합에 의한 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬의 형질전환에 이용되었다(Matsushima et al., 1994). 세균접합체(exconjugants)를 배지 4 상에 도말하고, 28℃로 배양했다. 24시간 후, 50mg/L 아프라마이신 및 25mg/L 날리딕스산을 배양용기상에 발랐다.
pLSS308은 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬 내에서 증폭될 수 없지만, 어떠한 아프라마이신 저항성 콜로니는 플라스미드에 포함된 mbcM 내부적 단편을 통한 상동재조합에 의해 염색체의 mbcM 유전자 내로 통합된 플라스미드를 포함하는 형질전환체가 될 수 있을 것으로 기대된다(도 3). 이는 염색체 상의 mbcM 유전자가 잘린 두 복사체를 생성시킨다. 형질전환체들은 PCR 분석을 통해 확인했고, 증폭된 단편을 서열분석했다.
콜로니들은 배지 4(50mg/L 아프라마이신 및 25mg/L날리딕스 산 함유) 상에 부착되어 있다. 각각의 부착물로부터 6 mm의 원형 플러그를 종자배지 10mL(배지 1의 변형- 2% 글루코스, 3% 수성전분, 0.5% 콘스팁고형, 1% 콩가루, 0.5% 펩톤, 0.3% 염화나트륨, 0.5% 칼슘 카르보네이트 및 50mg/L 아프라마이신)를 포함한 각각의 50ml 팔콘 튜브에 접종하는 데 이용했다.
이러한 종자배지 배양액을 28℃, 200rpm조건에서 5cm 작동반경으로 2일 동안 배양했다. 이들을 이후 (5% v/v) 발효배지(배지 2)에 접종하고, 28℃에서 24시간동안 생장시키고, 이후 26℃에서 추가로 5일 동안 생장시켰다. 이들로부터 대사체를 상기에 기재된 표준 프로토콜에 따라 추출시켰다. 상기에 기재된 표준 프로토콜을 이용하여 HPLC를 통해 샘플의 막베신 유사체 생산성이 평가되었다. 생산력을 가지는 분리된 선택체는 BIOT-3806으로 지정했다.
2.3 BIOT -3806 유래의 화합물 확인
양성 및/또는 음성 이온 모드에서 작동하는 Bruker Daltonics Esquire 3000+ electrospray mass spectrometer가 결합된 Agilent HP1100 HPLC system을 사용하여 LCMS를 수행했다.
크로마토그래피를 Phenomenex Hyperclone 컬럼 (Ci8 BDS, 3u, 150 x 4.6 mm) 상에서 다음의 농도구배성 용출 과정을 이용하여 1mL/min의 유속으로 용출시켜 수행했다; T=O, 10%B; T=2, 10%B; T=20, 100%B; T=22, 100%B; T=22.05, 10%B; T=25, 10%B.
이동상 A = 물 + 0.1% 포름산; 이동상 B = 아세토니트릴 + 0.1% 포름산.
UV 스펙트라는 190 내지 400 nm 사이에서 기록되었다. 추출된 크로마토그램은 210, 254 및 276 nm에서 얻어졌다. 질량 분석은 100 내지 1500 amu 사이에서 기록되었다.
Figure 112008045421569-PCT00009
실시예 3 - 신규한 화합물의 생산 및 분리
3.1 발효 및 7-O- 카르바모일프리 - 막베신의 분리
BIOT-3806의 무성적 스탁은 50mg/L 아프라마이신이 함유된 배지 1 내에서 키워서 준비하고, 20% w/v 글리세롤:10% w/v 락토스가 함유된 증류수에 보존하고, -80℃에서 저장했다. 무성적 스탁은 50mg/L 아프라마이신이 보충된 ISP2 배지(배지 3)의 플레이트 상에서 48시간 동안 28℃에서 배양했다. 무성적 배양액은 ISP2 플레이트의 5mm 지름 크기의 두 개의 아가 플러그를 취해서 250mL 교반 플라스크 내의 50mg/L 아프라마이신을 함유하는 30mL 배지 1 내에 접종했다. 플라스크를 28℃, 200rpm조건에서(5cm 작동반경) 48시간 동안 배양했다.
5% v/v로 접종된 무성식 배양액은 2L 교반 플라스크 내의 200 mL 생산배지(배지 2) 내에 접종했다. 배양은 28℃에서 1일 동안 수행하고, 26℃, 300 rpm(2.5 cm 작동반경)으로 5일 동안 수행했다.
BIOT-3806의 발효 브로쓰(1L, 핑크색)는 동량의 에틸 아세테이트(EtOAc)로 세 번 추출했다. 결합된 EtOAc 추출물로부터 진공 내에서 용매를 제거하여 2.34g의 브라인 오일을 얻었다. 추출물은 이후 실리카겔 60 상에서 초기 CHCl3 및 MeOH 혼합물(95:5), 이후 MeOH 농도를 10%까지 증가시켜 용리되고 여러 분획으로 수집(대략. 분획별로 250 mL)되는 크로마토그래프를 했다. 분획은 HPLC를 사용하여 대사체의 존재에 대한 평가를 했다.
신규한 화합물(분획 5; 용매 제거 후 334mg 크루드 질량)을 포함하는 특정 분획은 농도구배된 워터:아세토니트릴(80:20) 내지 (50:50)로 25분에 걸쳐, 21mL/min의 유속으로 용리하는 Phenomenex Luna C18-BDS컬럼(21.2 x 250 mm; 5 ㎛ particle size) 상에서 크로마토크래피로 더 정제되었다. 분획은 분석용 HPLC로 평가하고, 신규한 화합물을 포함하는 이들이 결합되었고, 용매를 제거하여 회색이 도는 흰색의 고체(86 mg)를 얻었다. 아세톤-d 6 내에서 수행된 LCMS/MS 및 1D 및 2D NMR 실험에 의한 분석으로 화합물 7-O-카르바모일프리-막베신을 확인했다(14).
Figure 112008045421569-PCT00010
3.2 발효 및 7-O- 카르바모일 -15- 하이드록시프리 - 막베신의 분리
BIOT-3806의 무성적 스탁은 50 mg/L 아프라마이신이 함유된 배지 1 내에서 키워서 준비하고, 20% w/v 글리세롤:10% w/v 락토스가 함유된 증류수에 보존하고, -80℃에서 저장했다. 무성적 스탁은 50 mg/L 아프라마이신이 보충된 ISP2 배지(배지 3)의 플레이트 상에서 48시간 동안 28℃에서 배양했다. 무성적 배양액은 ISP2 플레이트의 5mm 지름 크기의 두 개의 아가 플러그를 취해서 250 mL 교반 플라스크 내의 50 mg/L 아프라마이신을 함유하는 30mL 배지 1 내에 접종했다. 플라스크를 28℃, 200 rpm조건에서(5cm 작동반경) 48시간 동안 배양했다.
5% v/v로 접종된 무성식 배양액은 2L 교반 플라스크 내의 200 mL 생산배지(배지 2) 내에 접종했다. 배양은 28℃에서 1일 동안 수행하고, 26℃, 200 rpm(5 cm 작동반경)으로 5일 동안 수행했다.
BIOT-3806의 발효 브로쓰(1.3L, 크림색)는 동량의 에틸 아세테이트(EtOAc)로 세 번 추출했다. 결합된 EtOAc 추출물로부터 진공 내에서 용매를 제거하여 2.87g의 브라운 오일을 얻었다.
추출물은 이후 실리카겔 60 상에서 초기 CHCl3 및 MeOH 혼합물(95:5), 이후 MeOH 농도를 10%까지 증가시켜 용리되고 여러 분획으로 수집(대략. 분획별로 250mL)되는 크로마토그래프를 했다. 분획은 HPLC를 사용하여 대사체의 존재에 대한 평가를 했다.
신규한 화합물(분획 7; 용매 제거 후 752mg 크루드 질량)을 포함하는 특정 분획은 농도구배된 워터:아세토니트릴(85:15) 내지 (55:40)로 25분에 걸쳐, 21mL/min의 유속으로 용리하는 Phenomenex Luna C18-BDS컬럼(21.2 x 250 mm; 5 ㎛ particle size) 상에서 크로마토크래피로 더 정제되었다.
분획은 분석용 HPLC로 평가하고, 신규한 화합물을 포함하는 이들이 결합되었고, 용매를 제거하여 회색이 도는 흰색의 고체(245.5mg)를 얻었다. 아세톤-d 6 내에서 수행된 MS 및 1D 및 2D NMR 실험에 의한 분석으로 화합물 7-O-카르바모일-15-하이드록시프리-막베신을 확인했다(15).
Figure 112008045421569-PCT00011
3.3 동정 및 특성화
MS 및 NMR 실험을 계속적으로 수행했다. 즉, LCMS, MSMS, 1 H, 13C, APT, COSY-45, HMQC, HMBC을 수행했다. 이러한 데이터의 철저하고 완전한 연구를 통해 프리-막베신의 두 유사체들의 양성자 및 탄소 대부분을 지정해낼 수 있었다. NMR 지정(assignment)은 표 5에 기술했다.
Figure 112008045421569-PCT00012
Figure 112008045421569-PCT00013
* 이들 탄소에 대한 접촉은 생성되지 않았고, 표시는
실시예 4. gdmM 상동체 mbcM 이 프레임내 결실( in - frame deletion )을 갖는 악티노신네마 프레티오섬 균주의 생성
4.1 mbcM 의 하위 플랭킹 부분에 상동적인 DNA 의 클로닝
올리고 BV145(서열번호 22) 및 BV146(서열번호 23)는 주형으로 코스미드 52(실시예 1로부터 생성된) 및 Pfu DNA 합성효소를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 악티노신네마 프레티오섬(ATCC 31280)유래 DNA의 1421bp 부분을 증폭하는 데 사용하였다.
5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위한 제한효소 자리가 도입되도록 각각의 올리고 내에 고안했다(도 7).
증폭된 PCR 생산물(PCRwv308, 서열번호 20, 도 8A)은 mbcM의 3‘ 말단의 33bp 및 하위 상동부분의 1368bp를 코딩한다. 이 1461bp 단편을 SmaI으로 선형화된 pUC19 내로 클로닝하여 pWV308을 얻었다.
4.2 mbcM 의 상위 플랭킹 부분에 상동적인 DNA 의 클로닝
올리고 BV147(서열번호 24) 및 BV148(서열번호 25)는 주형으로 코스미드 52(실시예 1로부터 생성된) 및 Pfu DNA 합성효소를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 악티노신네마 프레티오섬(ATCC 31280)유래 DNA의 1423bp 부분을 증폭하는 데 사용하였다.
5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위한 제한효소 자리가 도입되도록 각각의 올리고 내에 고안했다(도 7).
증폭된 PCR 생산물(PCRwv309, 서열번호 21, 도 8B)은 mbcM의 3‘ 말단의 30bp 및 상위 상동부분의 1373bp를 코딩한다. 이 1423bp 단편을 SmaI으로 선형화된 pUC19 내로 클로닝하여 pWV308을 얻었다.
BVl 45 ATATACTAGTCACGTCACCGGCGCGGTGTCCGCGGACTTCGTCAACG
SpeI
(서열번호 22)
BVl46 ATATCCTAGGCTGGTGGCGGACCTGCGCGCGCGGTTGGGGTG
AvrII
(서열번호 23)
BVl47 ATATCCTAGGCACCACGTCGTGCTCGACCTCGCCCGCCACGC
AvrII
(서열번호 24)
BVl 48 ATATTCTAGACGCTGTTCGACGCGGGCGCGGTCACCACGGGC
XbaI
(서열번호 25)
생산물 PCRwv308 및 PCRwv309는 같은 방향성으로 pUC19 내로 클로닝되어 다음 클로닝 과정을 위해 pUC19 폴리링커 내에 PstI 자리를 형성했다.
pWV309 유래의 1443bp AvrII/PstI 단편은 pWV308의 4073bp AvrII/PstI 단편 내로 클로닝되어 pWV310을 생성했다. pWV310은 그러므로 AvrII 자리에 결합된 mbcM의 플랭킹 부분과 상동적인 DNA를 코딩하는 SpeI/XbaI 단편을 포함했다.
4.3 악티노신네마 프레티오섬 아속 . 프레티오섬의 형질전환
플라스미드 pUZ8002가 내재되어 있는 대장균 ET12567은 접합(conjugation)을 위한 대장균 공여균주를 생성시키기 위해 전기천공을 통해 pWV320으로 형질전환시켰다. 이 균주는 무성 접합에 의한 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬의 형질전환에 이용되었다(Matsushima et al., 1994).
세균접합체(exconjugants)를 배지 4 상에 도말하고, 28℃로 배양했다. 24시간 후, 50 mg/L 아프라마이신 및 25 mg/L 날리딕스산을 배양용기 상에 발랐다.
pWV320은 악티노신네마 프레티오섬 아속. 프레티오섬 내에서 증폭될 수 없지만, 어떠한 아프라마이신 저항성 콜로니는 플라스미드에 포함된 상동체의 mbcM 플랭킹 부분을 통한 상동재조합에 의해 염색체 내로 통합된 플라스미드 pWV320를 포함하는 형질전환체가 될 수 있을 것으로 기대된다
6개 세균접합체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 제한효소처리하고, 서던블롯으로 분석했다. 블롯은 6개 분리체 중 4개에서 상동체의 상위 부분에서 상동적 통합이 발생된 것으로 나타났고, 6개 분리체 중 두 개에서 하위 부분에서 상동적 통합이 발생된 것으로 나타났다.
상위 부분(BIOT-3831에서 고안된)에서 상동적 통합되어 얻은 균주를 2차 교차에 대한 스크리닝을 위해 선택했다. 하위 부분(BIOT-3832에서 고안된)에서 상동적 통합되어 얻은 균주를 2차 교차에 대한 스크리닝을 위해 또한 선택했다.
4.4 2차 교차에 대한 스크리닝
균주들은 배지 4(50 mg/L 아프라마이신으로 보충된) 상에 부착되고, 28℃에서 4일간 생장시켰다. 각각 부착물의 1 cm2 부분을 50ml 팔콘 튜브에 담긴 항생제가 함유되지 않은 7 mL의 변형된 ISP2(1L 증류수 내에 0.4% 효모 추출물, 1% 맥아 추출물, 0.4% 덱스트로스 함유)에 접종하는 데 이용했다. 배양물은 2-3일간 생장시켜 이후 50ml 팔콘 튜브에 담긴 다른 7 mL의 변형된 ISP2(상기 참고) 내로 계대배양(5% 접종)했다. 4-5회 계대배양 후 배지에 초음파를 처리하고, 연속적으로 희석한 후, 배지 4로 옮겨 28℃에서 4일동안 배양하였다. 이후 단일콜로니를 아프라마이신을 포함하는 배지 4 및 항생제를 포함하지 않는 배지 4 위에 부착한 후 플레이트를 28℃에서 4일 동안 배양하였다.
아프라마이신 플레이트에서 자라지 못하는 것을 제외하고 항생제가 없는 플레이트 상에서 자란 부착물은 이들이 항생제 마커를 잃었는지를 확인하기 위해 +/- 아프로마이신 플레이트 상에 재부착시켰다.
모든 아프로마이신 감수성 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 서던 블롯으로 분석했다. 이러한 단계에서, 2차 교차 균주들의 반수는 야생형으로 되돌아가지만, 반수는 원하는 mbcM이 결실된 변이체로 생성된다. 상기 돌연변이 균주는 502 아미노산의 프레임내 결실을 가지는 mbcM 단백질을 코딩한다(도 9).
mbcM이 결실된 변이체는 배지 4 상에 부착되고, 28℃에서 4일간 생장시켰다. 각각의 부착물로부터 6 mm의 원형 플러그를 종자배지 10 mL(배지 1의 변형- 2% 글루코스, 3% 수성전분, 0.5% 콘스팁고형, 1% 콩가루, 0.5% 펩톤, 0.3% 염화나트륨, 0.5% 칼슘 카르보네이트)를 포함한 각각의 50ml 팔콘 튜브에 접종하는 데 이용했다.
이러한 종자배지 배양액을 28℃, 200 rpm조건에서 5 inch 작동반경으로 2일 동안 배양했다. 이들을 이후 생산배지(배지 2- 5% 글리세롤, 1% 콘스팁고형, 2% 효모추출물, 2% 인산이수소칼륨, 0.5% 염화마그네슘, 1% 칼슘 카르보네이트)에 접종하고, 28℃에서 24 시간 동안 생장시키고, 이후 26℃에서 추가로 5일 동안 생장시켰다.
이러한 배양물로부터 2차 대사체를 동량의 에틸 아세테이트를 첨가함으로써 추출했다. 세포 파편은 원심분리로 제거했다. 상등액을 깨끗한 튜브에 옮기고, 진공 하에서 용매를 제거했다. 샘플은 0.23mL 메탄올 내에 재구성시키고 0.02mL의 1%(w/v) FeCl3 용액을 첨가했다. 샘플의 막베신 유사체 생산성을 평가했다.
상기 실시예 2, 3에 기재한 방법을 사용한 LCMS를 통한 화학적 분석은 동일한 체류시간 및 질량 분석을 갖는 것들에 기초하여 화합물 14 및 15의 존재를 명백하게 확인시켰다.
4.5 BIOT -3872 원생생물 생성을 통한 각각의 콜로니 선별
하기의 배지 변형을 이용하는 Weber 및 Losick 1988 BIOT-3872로부터 개작된 방법으로 BIOT-3872로부터 원생생물을 생성시켰다; 악티노신네마 프레티오섬 배양물은 ISP2 플레이트(배지 3) 상에서 28℃에서 3일간 생장시키고, 5 mm2를 긁어내어 물 내에 멸균된 10%(w.v) 글리신 2 mL가 보충된 ISP2 브로쓰 40mL에 접종했다.
원생생물은 Weber 및 Losick 1988에 기재된 바와 같이 생성되었고, R2 플레이트(R2 제조법- 수크로스 103g, K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 10.12 g, 글루코스 10 g, 디프코 카사미노산 0.1g, 디프코 박토 아가 22g, 증류수를 최종 800mL가 되도록 첨가하고, 혼합물을 121℃에서 20분간 오토클레이브시켜 멸균했다. 오토클레이브한 후, 하기의 오토클레이브된 용액을 첨가했다; 0.5% KH2PO4 10mL, 3.68% CaCl2·2H2O 80mL, 20% L-프롤린 15mL, 5.73% TES 버퍼(pH7.2) 100mL, Trace element solution(ZnCI2 40mg, FeCl3·6H2O 200mg, CuCl2·2H2O 10mg, MnCl2·4H2O 10mg, Na2B4O7·10H2O 10mg, (NH4)6Mo7O24·4H2O 10mg, 증류수를 최종 1L가 되도록 첨가) 2mL, NaOH(1N) (비멸균된) 5 mL) 상에서 재생되었다.
80개의 각각의 콜로니들을 MAM 플레이트(배지 4) 상에 부착시키고, 상기 실시예 2, 3에 기재된 바와 같이 막베신 유사체의 생산성을 분석했다. 원생생물 대부분은 모균주와 비슷한 수준으로 생산시키는 부착물을 생성시켰다. 80개 샘플 중 15개는 모균주보다 확실히 더 많이 14 및 15를 생산했다. 가장 최고의 생산균주, WV4a-33(BIOT-3870)은 모균주보다 훨씬 높은 수준으로 14 및 15을 생산시키는 것으로 나타났다.
실시예 5. 생물학적 데이터 - 막베신 유사체의 시험관내 항암 활성 평가
시험 화합물의 시험관 내 항암활성 평가는 단일층 증식 방법에 의해 증식된 인간 종양 세포주의 패널을 대상으로 변형된 요오드화 프로피디엄 분석(propidium iodide assay)을 사용하는 일반적인 방법에 기재된 바와 같이 수행되었다.
9개 세포주에 대한 결과를 하기의 표 6에 나타냈다; 각각의 결과는 중복실험의 평균을 나타낸 것이다. 표 7은 평가기준으로서 막베신을 이용하여, 38개 세포주 패널 시험을 통한 화합물에 대한 평균 IC70를 보여준다.
Figure 112008045421569-PCT00014
Figure 112008045421569-PCT00015
실시예 6. 용해도 평가
시험 화합물의 용액(25mM)을 적절한 양의 DMSO 내에 용해시켜 3-5 mg 분취액(aliquots)으로 준비했다.
분취액(0.01 mL)은 유리 바이얼 내의 0.490 mL pH 7.3 PBS에 첨가되었다. 각각의 시간 포인트에 대한 3 PBS 바이얼이 황색 바이얼 내에 준비되었다. 6시간 포인트를 위한 DMSO 내의 세 개 분취액이 또한 준비되었다.
결과물인 0.5 mM 용액을 6시간까지 교반하였는데, 1, 3 및 6시간째에 분석을 위해 바이얼을 제거했다. 샘플은 HPLC(0.025mL 주입)에 의해 분석되었다.
화합물은 274 nm에서 측정된 피크 부분에 의해 정량화되었다.
각각의 시간 포인트별 PBS 내 2% DMSO에서의 용해도는 각각의 크로마토그램에 대한 전체 피크 부분과 6시간째에 해당되는 DMSO 용액에서 생성된 크로마토그램에 대한 평균 전체 피크 부분을 기뵤함으로써 결정했다. (DMSO 용액 내의 평균 전체 피크는 0.5mM로 가정되었다,)
상기 결과를 하기 표 8에 나타냈다.
Figure 112008045421569-PCT00016
* -이러한 화합물의 용해도는 이 평가의 최대 측정 한계이거나 이를 넘는 것이다.
실시예 7. Hsp90 결합
등온적정열량계 및 Kd 값 결정
효모 Hsp90은 1 mM EDTA 및 5 mM NaCl을 함유하는 20 mM Tris pH7.5에 투석되고, 동일한 버퍼이지만 2% DMSO를 함유하지 않은 버퍼로 0.008 mM로 희석되었다.
시험 화합물은 50 mM 농도로 100% DMSO 내에 용해시키고, 2% DMSO를 포함하는 Hsp90를 위해 동일 버퍼 내에서 0.1 mM로 희석했다. 작용열은 MSC 시스템(Microcal) 상에서 1.485mL의 세포 부피로 30℃에서 측정했다.
각각의 0.100 mM 시험화합물 0.027 mL의 10개 분획물들을 0.008 mM 효모 Hsp90 내로 주입했다. 희석열은 시험화합물을 2% DMSO가 함유된 버퍼 내로 주입시켜 각각의 실험 내에서 결정하였고, 세 플로팅 변수; 화학양론, 결합상수 및 작용 엔탈피 내의 변화에 따른 비선형 최소 스퀘어 커브-피팅 알고리즘(Microcal Origin)을 사용하여 올바를 데이터를 일치시켰다. 상기 결과는 하기 표 9에 나타냈다.
Figure 112008045421569-PCT00017
실시예 8. mbcM 이 프레임내 결실( in - frame deletion )되고, mbcMT1 , mbcMT2 , mbcP 및 mbcP450 이 추가적으로 결실된 악티노신네마 프레티오섬 균주의 생성
8.1 mbcMT2 의 하위 플랭킹 부분에 상동적인 DNA 의 클로닝
올리고 Is4del1(서열번호 29) 및 Is4del2a(서열번호 30)는 주형으로 코스미드 52(실시예 1로부터 생성된) 및 Pfu DNA 합성효소를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 악티노신네마 프레티오섬(ATCC 31280)유래 DNA의 1595bp 부분을 증폭하는 데 사용하였다. 5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위한 AvrII 자리가 도입되도록 올리고 Is4del2a 내에 고안했다(도 10). 증폭된 PCR 생산물(1+2a, 도 11, 서열번호 31)은 mbcMT2의 3‘ 말단의 196bp 및 하위 상동부분의 1393bp를 코딩한다. 이 1595bp 단편을 SmaI으로 선형화된 pUC19 내로 클로닝하여 pLSS1+2a를 얻었다.
Is4del1 (서열번호 29)
5' - GGTCACTGGCCGAAGCGCACGGTGTCATGG - 3'
Is4del2a (서열번호 30)
5' - CCTAGGCGACTACCCCGCACTACTACACCGAGCAGG - 3'
8.2 mbcM 의 상위 플랭킹 부분에 상동적인 DNA 의 클로닝
올리고 Is4del3b(서열번호 32) 및 Is4del4(서열번호 33)는 주형으로 코스미드 52(실시예 1로부터 생성된) 및 Pfu DNA 합성효소를 사용한 표준 PCR 반응 내에서 악티노신네마 프레티오섬(ATCC 31280)유래 DNA의 1541bp 부분을 증폭하는 데 사용하였다. 5' 연장부는 증폭된 단편을 클로닝하기 쉽게 하기 위한 AvrII 자리가 도입되도록 올리고 Is4del3b 내에 고안했다(도 10). 증폭된 PCR 생산물(3b+4, 도 12, 서열번호 34)은 mbcP의 5‘ 말단의 100bp 및 상위 상동부분의 ~1450bp를 코딩한다. 이 ~1550bp 단편을 SmaI으로 선형화된 pUC19 내로 클로닝하여 pLSS3b+4를 얻었다.
Is4del3b (서열번호 32)
5' - CCTAGGAACGGGTAGGCGGGCAGGTCGGTG - 3'
Is4del4 (서열번호 33)
5' - GTGTGCGGGCCAGCTCGCCCAGCACGCCCAC - 3'
생산물 1+2a 및 3b+4는 pUC19 내로 클로닝되어 다음 클로닝 과정을 위해 pUC19 폴리링커 내에 HindIII 및 BamHI 자리를 형성했다.
pLSS1+2a 유래의 1621bp AvrII/HindIII 단편 및 pLSS3b+4 유래의 1543bp AvrII/BamHI 단편은 pKC1132의 3556bp HindIII/BamHI 단편 내로 클로닝되어 pLSS315를 생성했다. pLSS315는 그러므로 AvrII 자리에 결합된 고안된 4개 ORF 결실 부분의 플랭킹 부분과 상동적인 DNA를 코딩하는 HindIII/BamHI 단편을 포함했다(도 7).
8.3 BIOT -3870의 pLSS315 에 의한 형질전환
플라스미드 pUZ8002가 내재되어 있는 대장균 ET12567은 접합(conjugation)을 위한 대장균 공여균주를 생성시키기 위해 전기천공을 통해 pLSS315로 형질전환시켰다. 이 균주는 무성 접합에 의한 BIOT-3870의 형질전환에 이용되었다(Matsushima et al., 1994).
세균접합체(exconjugants)를 MAM 배지(1% 수성전분, 0.25% 콘스팁고형, 0.3% 효모추출물, 0.3% 칼슘 카르보네이트, 0.03% 황산철, 2% 아가) 상에 도말하고, 28℃로 배양했다. 24시간 후, 50mg/L 아프라마이신 및 25mg/L 날리딕스산을 배양용기 상에 발랐다.
pLSS315는 BIOT-3870 내에서 증폭될 수 없지만, 어떠한 아프라마이신 저항성 콜로니는 플라스미드에 원래 포함된 상동 부분을 통한 상동재조합에 의해 염색체 내로 통합된 플라스미드를 포함하는 형질전환체가 될 수 있을 것으로 기대된다.
8.4 2차 교차에 대한 스크리닝
3개의 BIOT-3870의 주요한 형질전환체:pLSS315가 2차 교차에 대한 스크리닝을 위한 계대배양을 위해 선택되었다.
균주들은 MAM 배지(50mg/L 아프라마이신으로 보충된) 상에 부착시켜, 28℃에서 4일간 생장시켰다. 각각 부착물의 6mm 원형 플러그를 250ml 코니칼 플라스크에 담긴 ISP2(0.4% 효모 추출물, 1% 맥아 추출물, 0.4% 덱스트로스 함유, 항생제는 함유하지 않음)에 접종하는 데 이용했다.
배양물은 2-3일간 생장시켜 이후 250ml 코니칼 플라스크에 담긴 30ml의 ISP2(상기 참고) 내로 계대 배양(5% 접종)했다. 배양물을 실시예 3.6<?>에 기재된 바와 같이 4-5번 계대배양하여 원생생물화한 후, 상기 원생생물을 연속적으로 희석하고, 재생 배지 상에 도말하고(실시예 3.6), 28℃에서 4일간 배양시켰다. 하나의 클로니를 아프라마이신을 함유하는 MAM 배지 및 항생제를 포함하지 않는 NAM 배지 모두에 부착시키고, 28℃에서 4일간 배양시켰다.
아프라마이신 플레이트에서 자라지 못하는 것을 제외하고 항생제가 없는 플레이트 상에서 자란 클론 no 1(no 32-37) 유래의 7개 부착물 및 클론 no 3(no 38-41)유래의 4개 부착물은 이들이 항생제 마커를 잃었는지를 확인하기 위해 +/- 아프로마이신 플레이트 상에 재부착시켰다.
막베신 유사체 생산은 일반적 방법에 기술된 바와 같이 수행했다. 분석은 일반적 방법 및 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행했다.
화합물 14는 모균주 BIOT-3870과 비슷한 정도의 산출량을 생산했고, 부착물 33, 34, 35, 37, 39 및 41에서는 화합물 15의 생산이 전혀 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 원하는 돌연변이 균주가 원래의 mbcM 결실에 더하여 mbcP, mbcP450, mbcMT1 및 mbcMT2 유전자를 포함하는 막베신 클러스터의 3892bp 결실을 가짐을 보여주는 것이다.
실시예 9. 생물학적 데이터 - 화합물 14와 표준 세포독성제 미토마이신C, 이포스파미드 , 사이클로헥실클로로에틸니트로수레아 ( CCNU ), 미토잔트론 및 빈데신과의 병용 시 시험관 내 항암활성 평가
표준 세포독성제와 병용될 때, 단일층 증식 방법으로 증식된 종양 세포 DU145에 대한 14의 시험관 내 항암 활성 평가는 변형된 요오드화 프로피디엄 분석을 이용하는 일반적 방법에 기재된 바와 같이 수행했다.
14의 4가지 구별되는 농도로 미토마이신 C에 대해 0-80nM, 이포스파미드, CCNU, 미토잔트론 및 빈데신에 대해 0-160 nM을 표준 제제 10농도에 따라 사용했다.
상대적인 세포 성장률 처리군/대조군(%T/C) 수준이 플롯되었고, 도 13- 17에 나타낸 그래프를 그리는 데 이용되었다. 이러한 그래프는 이후 표 10-11에 보인 IC70 값을 계산하는 데 이용되었다.
Figure 112008045421569-PCT00018
Figure 112008045421569-PCT00019
상기 데이터는 알킬화제 미토마이신 C, 이포스파미드 및 CCNU, 토포이소머라제 II 억제제 미토잔트론 및 유사분열 억제제 빈데신 같은 표준 세포독성제의 영향이 화합물 14의 첨가에 의해 개선되는 것을 보여준다.
미토마이신 C, 이포스파미드 및 CCNU, 미토잔트론 및 빈데신 같은 세포 독성제의 유용성은 이들의 독성 때문에 제한되는 것으로 알려져 있으며, 치료과정에서 이들의 최대 내성 용량 정도의 고농도로 편리하게 이용되었다. 그러므로 본 발명의 화합물 14 및 다른 화합물이 치료에 이용되는 세포 독성제(미토마이신 C, 이포스파미드 및 CCNU, 미토잔트론 및 빈데신 같은)의 양을 절약시킬 수 있는 유용한 효과를 낸다는 것이 추론될 수 있다. 따라서, 세포독성제 단독 또는 한 세포독성제와 다른 세포독성제의 병용 시보다 더 좋은 치료학적 효능 및 감소된 부작용을 가지는 유효량으로 수행할 수 있다.
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본 출원 내에서 언급된 특허 및 특허 출원을 포함하는 모든 참고문헌들은 최대한으로 가능할 수 있는 참고문헌에 의해 본원에서 통합되었다.
상세한 설명 및 청구항에 걸쳐 사용하는 "포함하다(comprise)"라는 용어는 문맥상 다른 뜻을 요구하지 않는 한, 언급한 완전체(integer), 단계(step), 완전체의 군을 포함하는 것을 의미하며 다른 완전체 또는 단계 또는 완전체의 군 또는 단계들을 배제하는 것이 아님을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 21-데옥시막베신 유사체는 독성, 글루타티온 같은 친핵체와의 결합력, 용해도, 대사안정성, 생체이용성 및 제형 가능성 등의 약제학적 성질이 개선되어 암 및/또는 B-세포 악성종양 치료에 효율적으로 이용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Biotica Technology Limited <120> 21-DEOXYMACBECIN ANALOGUES USEFUL AS ANTITUMOR AGENTS <130> IPA080207 <150> GB0526473.4 <151> 2005-12-24 <150> GB0606549.4 <151> 2006-03-31 <150> GB0614374.7 <151> 2006-07-20 <160> 34 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1638 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus NRRL 3602 <400> 1 atgaccggga aggaggcggc agtggacacc gcgcgggaaa cggacagcct cgaggccgag 60 gtgctgatcg tcggctacgg accggtgggc cagctactgt cggtgctact ggcccagcgc 120 gggcggcgcg tgacggtcgt ggagcgctgg ccggagccgt accggcaccc ccgggcggtc 180 gggttcgaca gtgaggccgc gcgccttctg gcctcggccg ggatcggcga ctcgctcgac 240 aagttcaccg aacccgcgcg ggaccacgcc tggcagaaca cgaagggcga gacgctgatc 300 gaccacgagg tggccgaccg ggggcactgc acctggccgg aggctttgtc ggcgtatcag 360 cccgccctgg agtccgcgct gatcgagcac ggggagacgc tgccgccgct gcggatcctg 420 cgcggatacg aggcggtggg actcgcggac gacggcgacc atgtgacctt gaccgtggtc 480 ggcccggacg gggagaagac ggacctcacc gcgctgtggg tggtcggctg cgacggcgcg 540 aacagcctgg taaggacggg 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<211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 ggtcactggc cgaagcgcac ggtgtcatgg 30 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 cctaggcgac taccccgcac tactacaccg agcagg 36 <210> 31 <211> 1595 <212> DNA <213> Actinosynnema pretiosum <400> 31 cctaggcgac taccccgcac tactacaccg agcaggccta cgcctacggg aactcctgga 60 catcaccgac cacaccgtcc aacgcaactt ccgcgaactg gccgatctgg taggcgacgc 120 gaagggcctg ctgttccacc cacgcgacct ggtgggcgtc ccagaattcg gctgcttcct 180 agcagtagcc gaacacccgt aaccacgcgg tggcgtcccc cacggacgcc accgcctcgc 240 gggctgcggg gcgagcgcag cgagcccgcg cagccccact cccgcgtccc tcttctccgt 300 gtggcctggc gcatgtcaaa ttcccactga ctgccaacag atcatgtgcc gtttgagcag 360 gtcagcgact tgtcgcgctt cggtgcctta aggccgagct gggatggggg cactgtttcc 420 ggactgagcg gggcagcttg gaaggtggag ttcggtgagc agaggcagca cgtcccgtcg 480 cacgtagagg tggttgtaca cgcggtggcg ggacctgcgc agtaggccgc tatccgcaag 540 ctgctccaag atcaggagtg cggcgcggtg cgtatagccg agttcggcgg tcagcatggt 600 gctgttgagc 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ctgccaacgc ggcttccggc accccgcgcg cctcgtcggc 1500 ttccaacgcc cgaacaccgt gccacagcac ggcccgcgcg ttgccctcgc tcgtctccag 1560 ccatcccatg acaccgtgcg cttcggccag tgacc 1595 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 cctaggaacg ggtaggcggg caggtcggtg 30 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 gtgtgcgggc cagctcgccc agcacgccca c 31 <210> 34 <211> 1541 <212> DNA <213> Actinosynnema pretiosum <400> 34 gtgtgcgggc cagctcgccc agcacgccca cgagggtctc cagcgcgtcc gcgccggtgc 60 gcgcgccccg gacgacctcg accgtgggga tcaggtacgg cgggttcatg aagtgcgtgc 120 cgatcagccg cgccgggtcg gggacgtgcc cggccagctc gtcgatcggg atcgaggagg 180 tgttggacac cagcggcacg cgcggcccgg tgagcgcggc ggccccggcc agcacctcgg 240 ccttgaccgg cagctcctcg gtgaccgcct ccaccaccag cgagacgtcc gcgacgtcgg 300 cgagcgaggt ggtggtgagc agctcgcccc gctcgcggtc ctcgggcagc gcccgcatca 360 gcctggccat gcgcagctgg gcggccaccg cctcccgcgc ccgcccgacc ttggcccggt 420 cggtctcgac cagcaccacc ggcacgccgt gcccgacggc cagggaggtg 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gtccgcgacc gatccggaca ccaccgccgt gcgcgagctg aacgcgctgc tgcacgccga 1380 cgagcgggtc gacatgtgcc tgctgccgat cgcggacgga atcacgctcg ccgtgaagcg 1440 gtgaacccgc ccgaatcgcg ccgaattccc ccggagagaa aggccgccgc agtgttcacc 1500 gaggacgtgg ccaccgacct gcccgcctac ccgttcctag g 1541

Claims (40)

  1. 하기 화학식 1에 따른 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염:
    [화학식 1]
    Figure 112008045421569-PCT00020
    상기에서,
    R1 은 H, OH, 또는 OCH3 이고,
    R2 는 H 또는 CH3이고,
    R3 및 R4는 모두가 H이거나 함께 하나의 결합을 나타내고(즉, C4와 C5는 이중결합임),
    R5 는 H 또는 -C(O)-NH2 이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1 은 H 또는 OH인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  3. 제1항에 있어서, 상기 R1 은 H인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  4. 제1항에 있어서, 상기 R1 은 OH인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2 는 H인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3 및 R4는 모두 H인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5 는 -C(O)-NH2인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  8. 제1항에 있어서, 상기 R1 은 H, R2 는 H, R3 및 R4는 모두 H, 및 R5 는 -C(O)-NH2인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  9. 제1항에 있어서, 상기 R1 은 H, R2 는 H, R3 및 R4는 모두 H, 및 R5 는 -C(O)-NH2인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  10. 제1항에 있어서,
    Figure 112008045421569-PCT00021
    인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  11. 제1항에 있어서,
    Figure 112008045421569-PCT00022
    인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염과 함께 하나 또는 그 이상의 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 의학으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 21-데옥시막베신 유사체.
  14. 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료제 제조 및/또는 암의 예방적 전처리에 있어서의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 21-데옥시막베신 유사체의 용도.
  15. 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환의 치료제 및/또는 암의 예방적 전처리로서의 사용을 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 21-데옥시막베신 유사체.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 21-데옥시막베신 유사체의 유효량을 이들을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암, B-세포 악성종양, 말라리아, 진균성 감염, 중추신경계 질환, 퇴행성 신경질환, 혈관신생 의존성 질환, 자가면역질환 및/또는 암의 예방적 전처리를 위한 치료 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염이 다른 치료제와 복합적으로 투여되는, 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염, 조성물, 용도 또는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 다른 치료제가 메토트렉사이트, 류코보린, 프레니손, 블레오마이신, 사이클로포스파미드, 5-플루오르우라실, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜, 메게스트롤 아세테이트, 아나스트로졸, 고세렐린, 항-HER2 단일 클론 항체, 카페시타빈, 라록시펜 염화수소, EGFR 억제제, VEGF 억제제, 프로테아좀 억제제, 방사선 치료 및 외과 수술로 구성되는 군으로부터 선택되는, 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염, 조성물, 용도 또는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 다른 치료제가 시스플라틴, 사이타라빈, 사이클로헥시클로로데틸니트로수리아, 사이클로포스파미드, 젬시타빈, 이포스프아미드, 류코보린, 미토마이신, 미토잔톤, 옥살리플라틴, 탁솔 및 빈데신을 포함하는 탁산 같은 통상적인 화학치료제; 아나스트로졸, 고세렐린, 메게스트롤 아세테이트 및 프레니손 같은 호르몬 치료제; 세툭시맙(항-EGFR) 같은 단일클론항체 치료제; 다사티닙, 라파티닙 같은 단백질 키나아제 억제제; 보리노스타트 같은 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제; 수니티닙, 소파레닙, 레나리도미드 같은 혈관신생 억제제; 및 템시로리무스 같은 mTOR 억제제로 구성되는 군으로부터 선택되는, 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염, 조성물, 용도 또는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 다른 치료제가 세포독성제인 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염, 조성물, 용도 또는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 다른 치료제가 미토마이신 C, 이포스프아미드, CCNU, 미토잔트론 및 빈데신으로부터 선택되는, 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염, 조성물, 용도 또는 방법.
  22. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 21-데옥시막베신 유사체의 생산 방법:
    상기 방법은 하기 단계를 포함한다.
    a) 적절한 조건에서 배양시 막베신 또는 이의 유사체를 생산하는 첫 번째 숙주 균주를 제공하는 단계;
    b) 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자, 여기서 상기 post-PKS 유전자들 중 적어도 하나는 mbcM 또는 이의 상동체인 유전자를 결실시키거나 불활성화시키는 단계;
    c) 상기 변형된 숙주 균주를 21-데옥시막베신 유사체 생산에 적합한 환경에서 배양하는 단계; 및
    d) 상기 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.
  23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 21-데옥시막베신 유사체의 생산 방법:
    상기 방법은 하기 단계를 포함한다.
    a) 적합한 환경에서 배양 시 막베신을 생산하는 첫 번째 숙주 균주를 제공하는 단계;
    b) 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자, 여기서 상기 post-PKS 유전자들 중 적어도 하나는 mbcM 또는 이의 상동체인 유전자를 결실시키거나 불활성화시키는 단계;
    c) mbcM을 포함하지 않는 post-PKS 유전자 일부 또는 전부를 재도입시키는 단계;
    d) 21-데옥시막베신 유사체 생산을 위한 적합한 환경 하에서 상기 변형된 숙주 균주를 배양하는 단계; 및
    e) 상기 생산된 화합물을 선택적으로 분리하는 단계.
  24. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 단계 a)의 균주는 막베신 생산 균주인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 21-데옥시막베신 유사체 생산을 위해 배양된 상기 제작된 균주는 mbcM을 포함하는 하나 또는 그 이상의 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화된 막베신 생산 균주에 기초하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 21-데옥시막베신 유사체 생산을 위해 배양된 상기 제작된 균주는 mbcM이 결실되거나 불활성화된 막베신 생산 균주에 기초하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 21-데옥시막베신 유사체 생산을 위해 배양된 상기 제작된 균주는 mbcM1, mbcMT1, mbcMT2, mbcP 및 mbcP450이 결실되거나 불활성화된 막베신 생산 균주에 기초하는 방법.
  28. mbcM 유전자 또는 이의 상동체가 결실되거나 불활성화되어 결국 21-데옥시막베신 또는 이의 유사체를 생산하는, 자연적으로 막베신 또는 이의 유사체를 생산하는 숙주 균주.
  29. mbcM 및 선택적으로 추가의 post-PKS 유전자가 결실되거나 불활성화된 막베신 생산 균주를 기초로 제작된 균주.
  30. 제29항에 있어서, mbcM이 결실 또는 불활성화되도록 제작된 균주.
  31. 제29항에 있어서, mbcM1, mbcMT1, mbcMT2, mbcP 및 mbcP450로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자 및 mbcM이 결실되거나 불활성화되도록 제작된 균주.
  32. 제29항에 있어서, mbcM1, mbcMT1, mbcMT2, mbcP 및 mbcP450로부터 선택된 둘 또는 그 이상의 유전자 및 mbcM이 결실되거나 불활성화되도록 제작된 균주.
  33. 제29항에 있어서, mbcM1, mbcMT1, mbcMT2, mbcP 및 mbcP450로부터 선택된 셋 또는 그 이상의 유전자 및 mbcM이 결실되거나 불활성화되도록 제작된 균주.
  34. 제29항에 있어서, mbcM1, mbcMT1, mbcMT2, mbcP 및 mbcP450로부터 선택된 넷 또는 그 이상의 유전자 및 mbcM이 결실되거나 불활성화되도록 제작된 균주.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개시성 막베신 생산 균주는 A.프레티오섬(A.pretiosum) 또는 A.미럼(A.mirum)인 균주.
  36. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 제작된 균주의 21-데옥시막베신 유사체 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염의 제조에 있어서의 용도.
  37. 제36항에 있어서, 상기 21-데옥시막베신 유사체는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 의해 특정되는 것을 특징으로 하는 용도.
  38. 제28항에 따른 숙주 균주의 21-데옥시막베신 또는 이의 유사체 생산을 위한 용도.
  39. 암 및/또는 B-세포 악성종양 치료를 위한 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 21-데옥시막베신 유사체, 용도 또는 방법.
  40. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산 가능한 21-데옥시막베신 유사체.
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