BRPI0718564A2 - Composto, métodos para preparar um composto, para gerar análogos de ansamicina, para tratar uma doença, e para produzir um composto, análogo de ansamicina, composição farmacêutica, uso de um análogo de ansamicina, cepa engenheirada, e, uso de uma cepa engenheirada. - Google Patents

Description

“COMPOSTO, MÉTODOS PARA PREPARAR UM COMPOSTO, PARA GERAR ANÁLOGOS DE ANSAMICINA, PARA TRATAR UMA DOENÇA, E PARA PRODUZIR UM COMPOSTO, ANÁLOGO DE ANSAMICINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM ANÁLOGO DE ANSAMICINA, CEPA ENGENHEIRADA, E, USO DE UMA CEPA ENGENHEIRADA”

A presente invenção refere-se aos análogos de ansamicina que são úteis, e.g. no tratamento de câncer, malignidades de célula B, malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes ou como um pré-tratamento profilático para câncer. A presente invenção também proporciona métodos para a produção destes compostos e seu uso em medicina.

Fundamentos da invenção

O desenvolvimento de drogas anticâncer elevadamente específicas com toxicidade baixa e características farmacocinéticas favoráveis compreende um desafio maior em terapia anticâncer.

A proteína de choque térmico de 90 kDa (Hsp90) é uma chaperona molecular abundante envolvida na montagem e no dobramento de proteínas, muitas das quais estão envolvidas em rotas de transdução de sinal (para revisões veja Neckers, 2002; Sreedhar et al, 2004a; Wegele et al., 2004 e referências nos mesmos). Até agora aproximadamente 50 destas proteínas denominadas clientes têm sido identificadas e incluem receptores de esteróides, tirosina cinases não-receptoras e.g. família src, cinases dependentes de ciclina e.g. cdk4 e cdkó, o regulador de transmembrana cístico, óxido nítrico sintase e outras (Donzé e Picard, 1999; McLaughlin et al, 2002; Chiosis et al., 2004; Wegele et al, 2004; http://www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf). Ademais, Hsp90 desempenha um papel chave em resposta ao estresse e proteção da célula contra os efeitos de mutação (Bagatell e Whitesell, 2004; Chiosis et al, 2004). A função de Hsp90 é complicada e envolve a formação de complexos de multi-enzimas dinâmicos (Bohen, 1998; Liu et al, 1999; Young et al., 2001; Takahashi et al., 2003; Sreedhar et al., 2004; Wegele et al., 2004).

5 Hsp90 é um alvo para inibidores (Fang et al., 1998; Liu et al, 1999; Blagosklonny, 2002; Neckers, 2003; Takahashi et al., 2003; Beliakoff e Whitesell, 2004; Wegele et al, 2004) resultando em degradação de proteínas clientes, desregulação /ou normalização de ciclo celular e apoptose. Mais recentemente, Hsp90 tem sido identificada como um mediador extracelular 10 importante para invasão de tumor (Eustace et al., 2004). Hsp90 foi identificada como um alvo terapêutico maior novo para terapia de câncer que é exemplificado em pesquisa intensa e detalhada sobre a função de Hsp90 (Blagosklonny et al, 1996; Neckers, 2002; Workman e Kaye, 2002; Beliakoff e Whitesell, 2004; Harris et al, 2004; Jez et al, 2003; Lee et al., 2004) e o 15 desenvolvimento de ensaios de triagem de produtividade alta (Carreras et al, 2003; Rowlands et al., 2004). Inibidores de Hsp90 incluem classes de compostos tais como ansamicinas, macrolidas, purinas, pirazóis, antibióticos de cumarina e outras (para revisão veja Bagatell e Whitesell, 2004; Chiosis et al., 2004 e referências nos mesmos).

As ansamicinas benzenóides são uma classe ampla de

estruturas químicas caracterizadas por um anel alifático de comprimento variado unidas em ambos os lados de uma estrutura de anel aromático. Ansamicinas naturalmente ocorrentes incluem: macbecina e 18,21-di-hidro- macbecina (também conhecida como macbecina I e macbecina II 25 respectivamente) (1 & 2; Tanida et al., 1980), geldanamicina (3; DeBoer et al, 1970; DeBoer e Dietz, 1976; WO 03/106653 e referências nos mesmos), e a família herbimicina (4; 5, 6, Omura et al, 1979, Iwai et al., 1980 e Shibata et al, 1986a, WO 03/106653 e referências nos mesmos). O 10

15

OH

NH,

macbecina, 1

18,21-dihidromacbecina (macbecina II), 2

0

geldanamicina, 3

NH2

herbimicina A, 4 R1=OCH3, R2=CH3 herbimicina B, 5 R1=H, R2=H herbimicina C, 6 R1=OCH3, R2=H

Ansamicinas foram originalmente identificadas com relação à sua atividade antibacteriana e antiviral, contudo, recentemente sua utilidade potencial como agentes anticâncer tem se tomado de interesse maior (Beliakoff e Whitesell, 2004). Muitos inibidores de Hsp90 estão sendo correntemente avaliados em testes clínicos (Csermely e Soti, 2003; Workman,

2003). Em particular, geldanamicina tem potência nanomolar e aparente especificidade para células de tumor dependentes de proteína cinase aberrantes (Chiosis et al., 2003; Workman, 2003).

Tem sido mostrado que tratamento com inibidores de Hsp90 intensifica a indução de morte de célula de tumor por radiação e capacidades de matança de células aumentadas (e.g. câncer de mama, leucemia mielóide crônica e câncer de pulmão de célula não-pequena) pela combinação de inibidores de Hsp90 com agentes citotóxicos também tem sido demonstrado (Neckers, 2002; Beliakoff e Whitesell, 2004). O potencial para atividade anti- angiogênica também é de interesse: a proteína Hsp90 cliente HIF-Ia desempenha um papel chave na progressão de tumores sólidos (Hur et al., 2002; Workman e Kaye, 2002; Kaur et al., 2004).

Inibidores de Hsp90 também funcionam como imunossupressores e estão envolvidos na Iise induzida por complemento de vários tipos de células de tumor após inibição de Hsp90 (Sreedhar et al., 5 2004). Tratamento com inibidores de Hsp90 também pode resultar em produção de superóxido induzida (Sreedhar et al, 2004a) associada com Iise mediada por célula imune (Sreedhar et al, 2004). O uso de inibidores de Hsp90 como drogas anti-malária potenciais também tem sido discutido (Kumar et al, 2003). Ademais, tem sido mostrado que geldanamicina 10 interfere com a formação de proteína príon de mamífero glicosilada complexa PrPc (Winklhofer et al, 2003).

Como descrito acima, ansamicinas são de interesse como compostos anticâncer e anti-malignidade de célula B potenciais, contudo as ansamicinas correntemente disponíveis exibem propriedades farmacológicas 15 ou farmacêuticas insatisfatórias, por exemplo mostram solubilidade em água insatisfatória, estabilidade metabólica insatisfatória, biodisponibilidade insatisfatória ou capacidade de formulação insatisfatória (Goetz et al., 2003; Workman 2003; Chiosis 2004). Ambas herbimicina A e geldanamicina foram identificadas como candidadas insatisfatórias para testes clínicos devido à sua 20 hepatotoxicidade forte (revisão Workman, 2003) e geldanamicina foi retirada de testes clínicos de Fase I devido à hepatotoxicidade (Supko et al., 1995; WO 03/106653).

Geldanamicina foi isolada de filtrados de cultura de Streptomyces hygroscopicus e mostra atividade forte in vitro contra 25 protozoários e atividade fraca contra bactérias e fungos. Em 1994 a associação de geldanamicina com Hsp90 foi mostrada (Whitesell et al., 1994). O agrupamento de genes biossintéticos para geldanamicina foi clonado e seqüenciado (Allen e Ritchie, 1994; Rascher et al, 2003; WO 03/106653). A seqüência de DNA está disponível sob o número de acesso NCBI de AYl 79507. O isolamento de cepas produtoras de geldanamicina geneticamente engenheiradas derivadas de S. hygroscopicus subsp. duamyceticus JCM4427 e o isolamento de 4,5-di-hidro-7-0-descarbamoil-7- hidróxi-geldanamicina e 4,5-di-hidro-7-0-descarbamoil-7-hidróxi-l I-O- 5 desmetil-geldanamicina foram recentemente descritos (Hong et al., 2004). Pela alimentação de geldanamicina à cepa produtora de herbimicina Streptomyces hygroscopicus AM-3672 os compostos 15-hidróxi- geldanamicina, o análogo tricíclico de geldanamicina KOSN-1633 e geldanamicinato de metila foram isolados (Hu et al., 2004). Os dois 10 compostos 17-formil-17-desmetóxi-l 8-0-21-O-di-hidro-geldanamicina e 17- hidróxi-metil-17-desmetóxi-geldanamicina foram isolados de S. hygroscopicus K279-78. S. hygroscopicus K279-78 é S. hygroscopicus NRRL 3602 contendo cosmídeo pKOS279-78 que tem um inserto de 44 kpb que contém vários genes da cepa produtora de herbimicina Streptomyces 15 hygroscopicus AM-3672 (Hu et al, 2004). Substituições de domínios de acil- transferase têm sido feitas em quatro dos módulos da policetídeo sintase do agrupamento biossintético de geldanamicina (Patel et al, 2004). Substituições de AT foram realizadas nos módulos 1, 4 e 5 levando aos análogos totalmente processados 14-desmetil-geldanamicina, 8-desmetil-geldanamicina e 6- 20 desmetóxi-geldanamicina e 4,5-di-hidro-6-desmetóxi-geldanamicina não totalmene processada. Substituição do módulo 7 AT leva à produção de três 2-desmetil-compostos, KOSNl619, KOSNl558 e KOSNl559, um dos quais (KOSN1559), um 2-desmetil-4,5-di-hidro-17-desmetóxi-21-desóxi-derivado de geldanamicina, liga-se em Hsp90 com uma afinidade de ligação 4 vezes 25 maior do que geldanamicina e uma afinidade de ligação 8 vezes maior do que 17-AAG. Contudo isto não é refletido em uma melhoria na medição de IC50 usando SKBr3. Outro análogo, uma nova geldanamicina não-benzoquinóide, designada KOS-1806 tem uma estrutura monofenólica (Rascher et al, 2005). Não há dados de atividade para KOS-1806. Em 1979 o antibiótico ansamicina herbimicina A foi isolado do caldo de fermentação de Streptomyces hygroscopicus cepa No. AM-3672 e chamado de acordo com sua atividade herbicida potente. A atividade antitumor foi estabelecida pelo uso de células de uma linhagem de rim de rato 5 infectada com um mutante sensível à temperatura de vírus de sarcoma de Rous (RSV) para triagem de drogas que reverteram a morfologia transformada destas células (para revisão veja Uehara, 2003). Herbimicina A foi postulada como atuando primariamente através de ligação em proteínas chaperona Hsp90 mas a ligação direta nos resíduos de cisteína conservados e 10 subseqüente inativação de cinases também foi discutido (Uehara, 2003).

Derivados químicos têm sido isolados e compostos com substituintes alterados em C19 do núcleo benzoquinona e compostos halogenados na cadeia ansa mostraram menos toxicidade e maiores atividades antitumor do que herbimicina A (Omura et al, 1984; Shibata et al., 1986b). A 15 seqüência do agrupamento de genes biossintéticos de herbimicina foi identificada em WO 03/106653 e em um jornal recente (Rascher et al, 2005).

Os compostos de ansamicina macbecina (1) e 18,21-di-hidro- macbecina (2) (C-14919E-1 e C-14919E-1), identificados por sua atividade antiprotozoal e antifúngica, foram isolados dos sobrenadantes de cultura de 20 Nocardia sp No. C-14919 (Actinosynnema pretiosum subsp pretiosum ATCC 31280) (Tanida et al., 1980; Muroi et al., 1980; Muroi et al., 1981; US 4,315,989 e US 4,187,292). 18,21-Di-hidro-macbecina é caracterizada por conter a forma di-hidro-quinona do núcleo. Foi mostrado que ambas macbecina e 18,21-di-hidro-macbecina possuem atividades antitumor e 25 antibacteriana similares contra linhagens de célula de câncer tal como a linhagem de célula P388 de leucemia murina (Ono et al., 1982). Atividades de transcriptase reversa e de desóxi-nucleotidil-transferase não foram inibidas por macbecina (Ono et al., 1982). A função inibitória de Hsp90 de macbecina tem sido relatada na literatura (Bohen, 1998; Liu et al., 1999). A conversão de macbecina e 18,21-di-hidro-macbecina após adição em um caldo de cultura microbiana em um composto com um grupo hidroxila em vez de um grupo metoxila em uma certa posição ou posições é descrita em patentes US 4.421.687 e US 4.512.975.

Durante uma triagem de uma variedade grande de microorganismos de solo, os compostos TAN-420A a E foram identificados das cepas produtoras pertencendo ao gênero Streptomyces (7-11, EP 0 110 710).

H3CO1

0

NH2

TAN-420A, 7 R1=H, R2=H TAN-420C, 9 R1=H, R2=CH3 TAN-420E, 11 R1=CH3, R2=CH3

NH2

TAN-420B, 8 R1=H, R2=H TAN-420D, 10 R1=H, R2=CH3

Em 2000, o isolamento do metabólito reblastatina do tipo ansamicina não-benzoquinona, relacionado com geldanamicina de culturas de célula de Streptomyces sp. S6699 e e seu valor terapêutico potencial no tratamento de artrite reumatóide foi descrito (Stead et al, 2000).

Um outro inibidor de Hsp90, distinto das ansamicinas benzoquinona quimicamente não-relacionadas é Radicicol (monordeno) que 15 foi originalmente descoberto em relação à sua atividade antifungica do fungo Monosporium bonorden (para revisão veja Uehara, 2003) e a estrutura foi verificada em ser idêntica à macrolida de 14 membros isolada de Nectria radicicola. Em adição à sua atividade antifungica, antibacteriana, anti- protozoal e citotóxica foi subseqüentemente identificado como um inibidor de 20 proteínas chaperona Hsp90 (para revisão veja Uehara, 2003; Schulte et al, 1999). A atividade anti-angiogênica de radicicol (Hur et al, 2002) e seus derivados semi-sintéticos (Kurebayashi et al., 2001) também têm sido descritos.

Interesse recente tem focalizado sobre 17-amino-derivados de geldanamicina como uma nova geração de compostos anticâncer de ansamicina (Bagatell e Whitesell, 2004), por exemplo 17-(alil-amino)-17- 5 desmetóxi-geldanamicina (17-AAG, 12) (Hostein et al., 2001; Neckers, 2002; Nimmanapalli et al., 2003; Vasilevskaya et al., 2003; Smith-Jones et al.,

2004) e 17-desmetóxi-17-N,N-dimetil-amino-etil-amino-geldanamicina (17- DMAG, 13) (Egorin et al., 2002; Jez et al., 2003). Mais recentemente geldanamicina foi derivada na posição-17 para criar 17-geldanamicina- 10 amidas, carbamatos, uréias e 17-aril-geldanamicina (Le Brazidec et al., 2003). Uma biblioteca de mais de sessenta análogos de 17-alquil-amino-17- desmetóxi-geldanamicina tem sido relatada e testada para sua afinidade por Hsp90 e e solubilidade em água (Tian et al., 2004). Uma outra abordagem para reduzir a toxicidade de geldanamicina é a seleção e a liberação seletivas 15 de um composto de geldanamicina ativo em células malignas por conjugação em um anticorpo monoclonal selecionador de tumor (Mandler et al., 2000).

geldanamicina, 3 17-AAG, 12 17-DMAG, 13

Embora muitos destes derivados exibam hepatotoxicidade reduzida eles ainda têm solubilidade em água apenas limitada. Por exemplo 17-AAG exige o uso de um veículo de solubilização (e.g. Cremophore®, DMSO-Iecitina de ovo), que em si mesmo pode resultar em efeitos colaterais em alguns pacientes (Hu et al, 2004).

A maioria da classe de ansamicina de inibidores de Hsp90 possui um grupo estrutural comum: a benzoquinona que é um aceptor de Michael que pode prontamente formar ligações covalentes com nucleófilos tais como proteínas, glutitiona, etc. O grupo benzoquinona também sofre equilíbrio redox com di-hidro-quinona, durante o qual são formados radicais oxigênio, que causam toxicidade não-específíca adicional (Dikalov et al., 2002).

5 Portanto, permanece uma necessidade de identificar novos

derivados de ansamicina, que podem ter utilidade no tratamento de câncer e / ou malignidades de célula B, preferivelmente tais ansamicinas têm solubilidade em água melhorada, um perfil farmacocinético melhorado e perfil de efeito colateral reduzido para administração. A presente invenção mostra novos análogos de ansamicina gerados por biotransformação e opcionalmente engenharia genética da cepa produtora parental. Em particular a presente invenção mostra novos análogos de 18,21-didesóxi-ansamicina e outros análogos de ansamicina, que geralmente podem ter propriedades farmacêuticas melhoradas comparados com as ansamicinas presentemente disponíveis; em particular é esperado que mostrem melhorias com respeito a uma ou mais das seguintes propriedades: atividade contra diferentes sub-tipos de câncer, toxicidade, e solubilidade em água, estabilidade metabólica, biodisponibilidade e capacidade de formulação. Preferivelmente os análogos de ansamicina (tais como análogos de 18,21-didesóxi-ansamicina) mostram biodisponibilidade melhorada.

Sumário da invenção

Na presente invenção unidades iniciadores não-naturais têm sido alimentadas a uma cepa produtora de geldanamicina, opcionalmente em combinação com inativação ou deleção selecionada dos genes responsáveis 25 pelas modificações pós-PKS de geldanamicina, e opcionalmente com a introdução de genes pós-PKS apropriados para realizar modificações pós-PKS com o propósito de produzir análogos novos de ansamicina formados pela incorporação de uma unidade iniciadora não-natural e, por exemplo, que resulta em compostos de 18,21-didesóxi-ansamicina que podem estar opcionalmente substituídos com flúor ou outros substituintes. Opcionalmente os genes ou reguladores responsáveis pela biossíntese de unidade iniciadora (ácido iniciador) podem ser manipulados pela inativação ou deleção selecionada ou modificados por outros meios tais como exposição de células à 5 radiação UV e seleção do fenótipo indicando que a biossíntese de unidade iniciadora tem sido interrompida. A abordagem pode ser aplicada a outras ansamicinas tais como herbimicina e reblastatina bem como à autolitimicina. A seleção opcional dos genes pós-PKS pode ocorrer via uma variedade de mecanismos, e.g. por integração, deleção selecionada de uma região do 10 agrupamento de geldanamicina incluindo todos ou alguns dos genes pós-PKS opcionalmente seguida por inserção do(s) gene(s) ou outros métodos para tomar não-funcionais os genes pós-PKS ou suas enzimas codificadas e.g. inibição química, mutagênese sítio-direcionada ou mutagênese da célula por exemplo pelo uso de radiação UV. Adicionalmente, genes pós-PKS do 15 agrupamento de geldanamicina ou outro agrupamento de ansamicina tais como, mas não limitados aos agrupamentos de macbecina, herbimicina, reblastatina ou TAN podem ser reintroduzidos para realizar modificações específicas pós-PKS. Como um resultado, a presente invenção proporciona análogos de ansamicina tais como análogos de 18,21-didesóxi-ansamicina, 20 métodos para a preparação destes compostos, e métodos para o uso destes compostos em medicina ou como intermediários na produção de outros compostos.

Portanto, em um primeiro aspecto a presente invenção proporciona análogos de geldanamicina ou outras ansamicinas que são faltos da unidade iniciadora usual, e que têm em vez dessa uma unidade iniciadora que, por exemplo, resulta em compostos de 18,21-didesóxi-ansamicina que podem opcionalmente estar substituídos com flúor ou outros substituintes.

Portanto em um aspecto da invenção é proporcionado um composto de fórmula (!) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: Ri

R/i

sendo que:

Ri representa H, OH, OMe;

R2 representa H ou Me;

R3 representa H ou CONH2;

R4 e R5 quer ambos representam H quer juntos representam

uma ligação (i.e. C4 a C5 é uma ligação dupla);

R6 representa H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF3, CH3, SH, CH2CH3

OU NRioaRllaj

R7 representa H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF3, CH3, SH, CH2CH3

ou NRiobRi ib;

R8 representa H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF3, CH3, SH, CH2CH3

ou NRiocRiicí

R9 representa H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF3, CH3, SH, CH2CH3

ou NRiodRi ídj

RlOa, Rila, Riob, Ri ib, RiOc Riic Riod, Riid independentemente

representam H, CH3 ou CH2CH3;

contudo com a condição de que:

(i) quando R^ representa H, R7 representa OH e R8 representa OH então R9 não representa H;

(ii); quando R7 representa OH, R8 representa H e R9 representa

H, então R6 não representa H, OH ou OMe; e (iii) quando R7 representa OMe, R8 representa H e R9 representa H, então Ré não representa OMe.

O composto da condição (i) é 18,21-di-hidro-geldanamicina, um composto conhecido.

Os compostos das condições (ii) e (iii) são mostrados em

W02005/061461.

Adequadamente:

(iv) quando R6 representa H, OH, ou OMe, R7 representa H e R8 representa H então R9 não representa OH, Cl ou NH2; e

(v) quando R6 representa H, OH, ou OMe, R8 representa H e

R9 representa H então R7 não representa NH2.

Adequadamente

(vi) quando R6 representa H ou OH, então R7, R8 e R9 não representam todos H.

Os compostos da condição (vi) são mostrados em Kim et al.

ChemBioChem (2007) 8, 1491-1494. Contudo também são mostrados em um pedido de patente inicial depositado pelos presentes inventores.

Em um aspecto mais específico a presente invenção proporciona análogos de 18,21-didesóxi-ansamicina de acordo com a

fórmula (IA) abaixo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

sendo que: Ri representa H, OH, OMe;

R2 representa H ou Me;

R3 representa H ou CONH2;

R4 e R5 quer ambos representam H quer juntos representam uma ligação (i.e. C4 a C5 é uma ligação dupla);

R6 representa H, OH, OMe ou F;

R7 representa H ou F;

Rs representa H ou F.

Análogos de ansamicina tais como análogos de 18,21-

didesóxi-ansamicina também são aqui chamados de “compostos da invenção”, tais termos são aqui usados intercambiavelmente.

A estrutura acima mostra um tautômero representativo e a invenção inclui todos os tautômeros dos compostos de fórmula (I) por exemplo ceto-compostos onde enol-compostos são ilustrados e vice versa.

A invenção inclui todos os estereoisômeros dos compostos

definidos pela estrutura (I) como mostrado acima.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona análogos de ansamicina tais como compostos de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso como um fármaco.

Definições

Os artigos "um" e "uma" são usado aqui para se referirem a um ou mais do que um (i.e. pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. Por meio de exemplo “um análogo” significa um análogo ou mais do que um análogo.

Como aqui usado o termo “análogo(s)” refere-se aos

compostos químicos que são estruturalmente similares ao outro mas que diferem ligeiramente em composição (como na substituição de um átomo por outro ou na presença ou ausência de um grupo funcional particular).

O termo “análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina” como usado neste pedido refere-se aos compostos de acordo com a fórmula (IA).

Como aqui usado, o termo “homólogo(s)” refere-se a um homólogo de um gene ou de uma proteína codificada por um gene aqui mostrado de quer um agrupamento biossintético de macbecina de uma cepa 5 produtora de macbecina diferente quer de um homólogo de um agrupamento de genes biossintéticos de ansamicina alternativo e.g. de geldanamicina, herbimicina, autolitimicina ou reblastatina. Tal(ais)homólogo(s) codifíca(m) uma proteína que desempenha a mesma função que ela mesma pode desempenhar que a do dito gene ou proteína na síntese de macbecina ou um 10 policetídeo de ansamicina relacionado. Preferivelmente, tal(ais) homólogo(s) têm pelo menos 40% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação à seqüência do gene particular aqui mostrada (Tabela 3, SEQ ID NO: 11 que é uma seqüência de todos os 15 genes no agrupamento, da qual as seqüências dos genes particulares podem ser deduzidas), percentagem de identidade pode ser calculada usando qualquer programa conhecido por uma pessoa experiente na arte tal como BLASTn ou BLASTp, disponível no website NCBL

Como aqui usado, o termo “câncer” refere-se a um 20 crescimento novo de células maligno ou benigno na pele ou em órgãos do corpo, por exemplo mas sem limitação, mama, próstata, pulmão, rim, pâncreas, cérebro, estômago ou intestino. Um câncer tende a se infiltrar em tecido adjacente e se espalhar (metástase) para órgãos distantes, por exemplo para osso, fígado, pulmão ou o cérebro. Como aqui usado o termo câncer 25 inclui ambos tipos de célula de tumor metastático, tais como mas não limitados a, melanoma, linfoma, leucemia, fíbrossarcoma, rabdomiossarcoma, e mastocitoma e tipos de carcinoma de tecido, tais como mas não limitados a, câncer colorretal, próstata câncer, câncer de pulmão de célula pequena e câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer renal, câncer gástrico, gliobastoma, câncer de fígado primário e câncer ovariano.

Como aqui usado o termo “malignidades de célula B” inclui um grupo de distúrbios que inclui leucemia linfocítica crônica (CLL), mieloma múltiplo, e linfoma de não-Hodgkin (NHL). São doenças neoplásticas do sangue e dos órgãos formadores de sangue. Causam disfunção do sistema imune e de medula óssea, que tomam o hospedeiro elevadamente suscetível à infecção e ao sangramento.

Como aqui usado, o termo “biodisponibilidade” refere-se ao grau no qual ou à taxa na qual uma droga ou substância é absorvida ou se toma disponível no sítio de atividade biológica após administração. Esta propriedade é dependente de numerosos fatores incluindo a solubilidade do composto, a taxa de absorção no intestino, a extensão de ligação de proteína e metabolismo etc. Vários testes para biodisponibilidade que seriam familiares para uma pessoa experiente na arte estão descritos em Egorin et al. (2002).

O termo "solubilidade em água” como usado neste pedido refere-se à solubilidade em meios aquosos, e.g. solução salina tamponada com fosfato (PBS) em pH 7,3.

O termo “cepa produtora de ansamicina” como usado neste pedido refere-se às cepas, por exemplo cepas de tipo selvagem como exemplificado por um estreptomiceto tais como cepas produtoras de geldanamicina, cepas produtoras de herbimicina, cepas produtoras de reblastatina e cepas produtoras de autolitimicina. Assim exemplos incluem Streptomyces hygroscopicus subsp. geldanus NRRL3602 ou Streptomyces sp. DSM4137 ou Streptomyces violaceusniger DSM40699 que produzem ansamicinas tal como geldanamicina ou herbimicinas (eg herbimicina A, B ou C) e Streptomyces sp. S6699 ou Streptomyces autolyticus JX-47 que produzem ansamicinas tal como ou reblastatina ou autolitimicina quando cultivadas sob condições adequadas, por exemplo quando alimentadas com o alimento de iniciador natural ácido 3-amino-5-hidróxi-benzóico.

Assim o termo “cepa produtora de geldanamicina” como usado neste pedido refere-se às cepas, por exemplo cepas de tipo selvagem como exemplificado por um estreptomiceto tal como Streptomyces 5 hygroscopicus subsp. geldanus NRRL3602 ou Streptomyces sp. DSM4137 ou Streptomyces violaceusniger DSM40699 que produzem geldanamicina quando cultivadas sob condições adequadas, por exemplo quando alimentadas com o alimento de iniciador natural ácido 3-amino-5-hidróxi-benzóico.

O termo “cepa produtora de herbimicina” como usado neste 10 pedido refere-se às cepas, por exemplo cepas de tipo selvagem como exemplificadas por Streptomyces hygroscopicus AM-3672, que produzem herbimicinas eg herbimicina A, B ou C quando cultivadas sob condições adequadas, por exemplo quando alimentadas com o alimento de iniciador natural ácido 3-amino-5-hidróxi-benzóico.

Como aqui usado o termo “genes pós-PKS” refere-se aos

genes exigidos para modificações pós-policetídeo-sintase do policetídeo, por exemplo mas sem limitação monooxigenases, O-metil-transferases e carbamoil-transferases. Especificamente, no sistema de macbecina estes genes modificadores incluem mbcM, mbcN, mbcP, mbeMTl, mbcMT2 e mbcP450. Como aqui usado o termo “gene(s) de biossíntese de unidade

iniciadora” refere-se aos genes exigidos para a produção da unidade iniciadora naturalmente incorporada, ácido 3-amino-5-hidróxi-benzóico (AHBA). Especificamente, no sistema de macbecina estes genes de biossíntese de unidade iniciadora AHk (AHBA cinase), Adh (aDHQ 25 desidrogenase), AHs (AHBA sintase), OX (oxidorredutase), PH (Fosfatase). Especificamente no sistema de geldanamicina o gene gdmO é proposto para codificar a amino-desidrogenase-sintase necessária para a síntese de AHBA (Rascher et al., 2003) e no sistema de herbimicina hbmO tem sido identificado (Rascher et al., 2005). Outras cepas que produzem AHBA também contêm genes de biossíntese de AHBA. Os sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos da invenção tais como os compostos de fórmula (I) incluem sais convencionais formados de bases ou ácidos orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis bem como sais de amônio quaternário e de adição de ácido. Exemplos mais específicos de sais de ácido adequados incluem clorídrico, bromídrico, sulfürico, fosfórico, nítrico, perclórico, fumárico, acético, propiônico, succínico, glicólico, fórmico, lático, maleico, tartárico, cítrico, palmóico, malônico, hidróxi-maleico, fenil-acético, glutâmico, benzóico, salicílico, fumárico, tolueno-sulfônico, metano-sulfônico, naftaleno-2- sulfônico, benzeno-sulfônico, hidróxi-naftóico, iodídrico, málico, esteróico, tânico e semelhantes. Outros ácidos tal como oxálico, embora em si mesmos não farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos mais específicos de sais básicos adequados incluem sais de sódio, lítio, potássio, magnésio, alumínio, cálcio, zinco, Ν,Ν'-dibenzil-etileno-diamina, cloroprocaína, colina, dietanol-amina, etileno-diamina, N-metil-glicamina e procaína. Referências aqui em diante a um composto de acordo com a invenção incluem ambos compostos de fórmula (I) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Breve Descrição dos Desenhos

Figurai: Representação da biossíntese de geldanamicina mostrando o primeiro intermediário livre de enzima putativa, progeldanamicina e o processamento pós-PKS para geldanamicina. A lista das etapas de processamento PKS na figura não é intencionada para representar a ordem dos eventos. As seguintes abreviações são usadas para genes particulares no agrupamento: ALO - domínio de carregamento de AHBA; ACP - Proteína Acil-Carreadora; KS - β-ceto-sintase; AT - acil-transferase; DH - desidratase; ER - enoil-redutase; KR - β-ceto-redutase. Figura 2: Representação dos sítios de processamento pós-PKS de progeldanamicina para dar geldanamicina.

Figura 3: Estruturas dos compostos (14-25) descritas nos

Exemplos.

Figura 4: Estruturas dos compostos (26-37) descritas nos

Exemplos.

Descrição da Invenção

A presente invenção proporciona análogos de ansamicina, como exibido acima, métodos para a preparação destes compostos, métodos para o uso destes compostos em medicina e o uso destes compostos como intermediários ou modelos para derivação semi-sintética adicional.

Adequadamente R1 representa H ou OH. Em uma modalidade Ri representa H. Em outra modalidade Ri representa OH.

Adequadamente R2 representa H.

Adequadamente R3 representa CONH2.

Em uma modalidade adequadamente R4 e R5 juntos representam uma ligação.

Em outra modalidade, adequadamente R4 e R5 representam

cada um H.

Em uma modalidade, adequadamente Ri representa H, R2

representa H, R3 representa CONH2 e R4 e R5 representam cada um H.

Em uma modalidade, adequadamente R1 representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2 e R4 e R5 representam cada um H.

Em uma modalidade, adequadamente Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H e R6 representa OH.

Adequadamente R6 representa H, F, Me, Br, Cl, OH, OMe, NH2, mais adequadamente H, F, Me, Br, Cl, OH ou OMe, ainda mais adequadamente H ou F. Alternativamente adequadamente R6 representa CF3 ou

CH2CH3.

Adequadamente R7 representa H, F, OH, OMe, Br, Cl ou NH2, mais adequadamente H, F, OH, OMe, Br ou Cl, ainda mais adequadamente H, F, OH ou OMe, especialmente OH (ou alternativamente H ou F).

Adequadamente R8 representa H, F, Me, Cl, Br, OH ou NH2, mais adequadamente H, F, Me, Cl, Br ou OH, ainda mais adequadamente H ou F.

Adequadamente R9 representa H, F, Me, Cl, Br, OH ou NH2, mais adequadamente H, F, Me, Cl, Br ou OH, ainda mais adequadamente H ou F especialmente H.

Adequadamente Rioa, Riia5 Riot» Riib? Rioc? Riic> Riod, Rnd

representam H.

Adequadamente quando R7 representa OH, então um ou mais of R6, R8 ou R9 representa F, Br, Me ou NH2, e o restante representa H

Adequadamente se R6 representa Me, então R7 representa OH, H ou F, e R8 e R9 representam H

Adequadamente se R6 representa CF3, então R7 representa OH, H ou F, e R8 e R9 representam H Adequadamente se R6 representa CH2CH3, então R7 representa

OH, H ou F, e R8 e R9 representam H

em uma modalidade adequada da invenção R] representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4, R5, R65R7 e R8 representam cada um H, eg como representado pela seguinte estrutura, 18

Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa OH e R7 e R8 representam cada um H, eg como representado na seguinte estrutura,

18

Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa F e R7 e R8 representam cada um H, eg como representado pela IO seguinte estrutura, 18

Em outra modalidade adequada da invenção R( representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa F e R7 e R8 representam cada um H, eg como representado na seguinte estrutura,

18

Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa H, R7 representa F e R8 representa H, eg como representado na IO seguinte estrutura, Em outra modalidade adequada da invenção Rj representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa OH, R7 representa F e R8 representa H, eg como representado na seguinte estrutura,

Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa H, R7 representa F e R8 representa H eg como representado na seguinte estrutura, O-CONH2 Em outra modalidade adequada da invenção Rj representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 e R7 representam cada um F e R8 representa H, eg como representado na seguinte estrutura,

F

Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 e R7 representam cada um F e R8 representa H eg como representado na IO seguinte estrutura, Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6, R7 e R8 representam cada um F, eg como representado na seguinte estrutura,

Em uma modalidade da invenção R6, R7 e R8 não representam todos H, e em particular pelo menos um de R6, R7 e R8 representa F.

Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa F, R7 representa OH e R8 representa H eg como representado na seguinte estrutura, OH

Em outra modalidade adequada da invenção R] representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa Me, R7 representa OH e R8 representa H eg como representado na seguinte estrutura,

OH

Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa CF3, R7 representa OH e R8 representa H eg como representado na IO seguinte estrutura, OH

R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa CH2CH3, R7 representa OH e R8 representa H eg como representado na seguinte estrutura,

OH

Em outra modalidade adequada da invenção Rj representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa F, R7 representa OH e R8 representa H eg como representado na IO seguinte estrutura, HX

H3CO'

0-CONH2

Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa Me, R7 representa OH e R8 representa H eg como representado na seguinte estrutura,

HaC'

HoCO

10

CONHo

Em outra modalidade adequada da invenção Rj representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa CF3, R7 representa OH e R8 representa H eg como representado na seguinte estrutura, OH

R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa CH2CH3, R7 representa OH e Rg representa H eg como representado na seguinte estrutura,

OH

Em outra modalidade adequada da invenção R, representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa OMe, R7 representa H e R8 representa OH eg como representado na seguinte estrutura, Em outra modalidade adequada da invenção R( representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa OH, R7 representa HeRs representa OH eg como representado na 5 seguinte estrutura,

Em outra modalidade adequada da invenção Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa H, R7 representa H e R8 representa OH eg como representado na IO seguinte estrutura, Em outra modalidade adequada da invenção Rj representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa H, R7 representa F e R8 representa OH eg como representado na 5 seguinte estrutura,

Em outra modalidade adequada da invenção Rj representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa H, R7 representa Cl e R8 representa OH eg como representado na IO seguinte estrutura, Em outra modalidade adequada da invenção R1 representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa H, R7 representa OH e R8 representa F eg como representado na seguinte estrutura,

OH

Em outra modalidade adequada da invenção R1 representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa H, R7 representa OH e R8 representa Cl eg como representado na seguinte estrutura,

OH

Em outra modalidade adequada da invenção R) representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa OMe, R7 representa F e R8 representa OH eg como representado na seguinte estrutura,

Em outra modalidade da invenção R6, R7 e R8 todos

representam H.

Em outra modalidade R7 e R8 não representam OH, R9 representa H e um ou mais de R6, R7 e R8 representam F. Em outra modalidade da invenção quando R] representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representa H, R6 representa H e R7 representa H então R8 não representa H.

Outras modalidades adequadas descritas nos Exemplos e ilustradas em Figuras 3 e 4.

A estereoquímica preferida das cadeias laterais de não- hidrogênio para o anel ansa é como mostrada em Figuras 1 e 2 abaixo (isto é a estereoquímica preferida segue aquela da geldanamicina).

A presente invenção também proporciona o uso de um análogo de ansamicina como um substrato para modificação adicional quer por biotransformação quer por química sintética. Em um aspecto a presente invenção proporciona um análogo de ansamicina para uso como um medicamento. Em uma modalidade específica a presente invenção proporciona um análogo de ansamicina para uso no tratamento de câncer, malignidades de célula B, malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes e/ou como um pré-tratamento profilático de câncer.

Em outro aspecto a presente invenção proporciona o uso de um análogo de ansamicina na manufatura de um medicamento. Em uma modalidade específica a presente invenção proporciona o uso de um análogo de ansamicina na manufatura de um medicamento para o tratamento de câncer, malignidades de célula B, malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes e/ou como um pré-tratamento profilático de câncer.

Em uma outra modalidade a presente invenção proporciona um método de tratamento de câncer, malignidades de célula B, malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes ou um pré-tratamento profilático para câncer, dito método compreendendo administrar a um paciente em necessidade da mesma uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo de ansamicina.

Como observado acima, pode ser esperado que compostos da invenção sejam úteis no tratamento de câncer e malignidades de célula B. Compostos da invenção e especialmente aqueles que podem ter seletividade melhorada para Hsp90 e/ou um perfil de toxocologia melhorado e/ou farmacocinética melhorada também pode ser eficaz no tratamento de outras indicações por exemplo, mas não limitadas a malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes tal como artrite reumatóide ou como um pré-tratamento profilático de câncer.

Doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas incluem, mas não são limitadas a, mal de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doenças de príon, atrofia muscular bubal e espinhal (SBMA) e atrofia muscular bubal e espinhal (ALS).

Doenças dependentes de angiogênese incluem, mas não são limitadas a, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética e vários outros distúrbios oflálmicos, arteriosclerose e artrite reumatóide.

Doenças autoimunes incluem, mas não são limitadas a, artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabete de tipo I, lúpus eritematoso sistêmico e psoríase,

“Paciente” inclui sujeitos humanos ou outro animal (especialmente mamífero), preferivelmente sujeitos humanos. Conseqüentemente os métodos e usos dos análogos de ansamicina da invenção são de uso em medicina veterinária, preferivelmente medicina humana.

Os compostos da invenção acima mencionados ou uma formulação dos mesmos pode(m) ser administrado(s) por qualquer método convencional por exemplo mas sem limitação podem ser administrados parenteralmente (incluindo administração intravenosa), oralmente, topicamente (incluindo bucal, sublingual ou transdermal), via um dispositivo médico (e.g. um stent), por inalação, ou via injeção (subcutânea ou intramuscular). O tratamento pode consistir de uma dose única ou uma pluralidade de doses durante um período de tempo.

Embora seja possível que um composto da invenção seja administrado sozinho, é preferível se apresentar como uma formulação farmacêutica, junto com um ou mais veículos ou diluentes aceitáveis. Assim é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção junto com um ou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. O(s) diluente(s) ou veículo(s) precisa(m) ser "aceitável(eis)" no sentido de serem compatíveis com o composto da invenção e e não prejudiciais para os seus pacientes recipientes. Exemplos de veículos adequados são descritos com mais detalhe abaixo.

Os compostos da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos. Co-administração de dois (ou mais) agentes pode permitir que sejam usadas doses significativamente menores de cada um, reduzindo-se deste modo os efeitos colaterais vistos. Também é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção e um outro agente terapêutico junto com um ou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um composto da invenção em terapia de combinação com um segundo agente eg para o tratamento de câncer ou malignidades de célula B. Em uma modalidade, um composto da invenção é co- administrado com outro agente terapêutico, por exemplo um agente terapêutico para o tratamento de câncer ou malignidades de célula B. Agentes preferidos incluem, mas não são limitados a, os agentes quimioterapêuticos convencionais tais como bleomicina, capecitabina, cisplatina, citarabina, ciclofosfamida, doxorubicina, 5-fluorouracil, gencitabina, leucovorina, metotrexato, mitoxantona, os taxanos incluindo paclitaxel e docetaxel, vincristina, vimblastina e vinorelbina; as terapias hormonais, anastrozol, goserelina, acetato de megestrol, prenisona, tamoxifeno e toremifeno; as terapias com anticorpo monoclonal tais como trastuzumab (ani-Her2), cetuximab (ant-EGFR) e bevacizumab (anti-VEGF); e inibidores de proteína cinsase imatinib, dasatinib, gefitinib, erlotinib, lapatinib, temsirolimus; os inibidores de proteassomo tal como bortezomib; inibidores de histona- desacetilase (HDAC) tal como vorinostat; inibidores de angiogênese tal como sunitinib, sorafenib, lenalidomida. Adicionalmente, um composto da invenção pode ser administrado em combinação com outras terapias incluindo, mas não limitadas a, radioterapia ou cirurgia.

As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na arte da farmácia. Tais métodos incluem a etapa de associar o ingrediente ativo (composto da invenção) com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral as formulações são preparadas por associação uniforme e íntima do ingrediente ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessária, moldagem do produto.

Os compostos da invenção serão normalmente administrados oralmente ou por qualquer rota parenteral, na forma de uma formulação farmacêutica compreendendo o ingrediente ativo, opcionalmente na forma de um sal de adição, de base, ou de ácido, inorgânico, ou orgânico não-tóxico, em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável. Dependendo do distúrbio e do paciente a ser tratado, bem como da rota de administração, as composições podem ser administradas em doses variadas.

Por exemplo, os os compostos da invenção podem ser administrados oralmente, bucalmente ou sublingualmente na forma de tabletes, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes aromatizantes ou colorantes, para aplicações de liberação imediata, retardada ou controlada.

Tais tabletes podem conter excipientes tais como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina, desintegrantes tais como amido (preferivelmente amido de milho, de batata ou de tapioca), amido-glicolato de sódio, croscarmelose sódica e certos silicatos complexos, e aglutinantes de granulação tais como poli(vinil-pirrolidona), hidróxi-propil-metil-celulose (HPMC), hidróxi-propil- celulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia. Adicionalmente, agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, behenato de glicerila e talco podem ser incluídos.

Composições sólidas de um tipo similar também podem ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina. Excipientes preferidos incluem sob este aspecto lactose, amido, uma celulose, açúcar de leite ou poli(etileno-glicóis) de peso molecular alto. Para suspensões aquosas e/ou elixires, os compostos da invenção podem ser combinados com vários agentes edulcorantes ou aromatizantes, corantes ou matéria colorante, com agentes emulsificadores e/ou de suspensão e com diluentes tais como água, etanol, propileno-glicol e glicerina, e suas combinações.

Um tablete pode ser preparado por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Tabletes comprimidos podem ser preparados comprimindo em uma máquina adequada o ingrediente ativo em uma forma de fluidez livre tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturada com um aglutinante (e.g. povidona, gelatina, hidróxi-propil-metil-celulose), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (e.g. amido-glicolato de sódio, povidona reticulada, sódio-carbóxi-metil-celulose reticulada), agente tensoativo ou 5 dispersante. Tabletes moldados podem ser preparados por moldagem em uma máquina adequada de uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os tabletes podem ser opcionalmente revestidos ou sulcados e podem ser formulados de modo a proporcionarem liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo nos mesmos, por exemplo, hidróxi-propil- 10 metil-celulose em proporções variadas para proporcionar perfil de liberação desejado.

Formulações de acordo com a presente invenção adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas tais como cápsulas, gélulas ou tabletes, cada um contendo uma quantidade 15 predeterminada de ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não-aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo-em-água ou uma emulsão líquida de água-em-óleo. O ingrediente ativo também pode se apresentar como um bolo, eletuário ou uma pasta.

Formulações adequadas para administração tópica incluem

pastilhas losângicas compreendendo o ingrediente ativo em uma base aromatizada, normalmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e enxagüatórios bucais compreendendo o ingrediente ativo em um veículo líquido adequado.

Deve ser entendido que em adição aos ingredientes particularmente mencionados acima as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na arte tendo consideração ao tipo de formulação em questão, por exemplo aqueles adequados para administração oral podem incluir agentes aromatizantes.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica podem ser formuladas como ungüentos, cremes, suspensões, loções, pós, soluções, pastas, geles, curativos impregnados, borrifos, aerossóis ou óleos, dispositivos transdermais, pós de polvilhar, e semelhantes. Estas composições podem ser preparadas via métodos convencionais contendo agente ativo. Assim, também podem compreender aditivos e veículos convencionais compatíveis, tais como conservantes, solventes para auxiliar na penetração de droga, emoliente em cremes ou ungüentos e etanol ou oleil- álcool para loções. Tais veículos podem estar presentes como de cerca de 1% a até cerca de 98% da composição. Mais normalmente formarão a até cerca de 80%) da composição. Como apenas uma ilustração, um creme ou ungüento é preparado por misturação de quantidades suficientes de material hidrofílico e água, contendo de cerca de 5-10% em peso do composto, em quantidades suficientes para produzir um creme ou ungüento tendo a consistência desejada.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração transdermal podem ser apresentadas como emplastros discretos intencionados para permanecerem em contato íntimo com a epiderme do paciente recipiente por um período de tempo prolongado. Por exemplo, o agente ativo pode ser liberado do emplastro por iontoforese.

Para aplicações em tecidos externos, por exemplo a boca e a pele, as composições são preferivelmente aplicadas como um creme ou ungüento tópico. Quando formulado em um ungüento o agente ativo pode ser empregado com uma base de ungüento quer miscível com água quer parafínica.

Alternativamente, o agente ativo pode ser formulado em um creme com uma base de óleo-em-água ou uma base de água-em-óleo.

Para administração parenteral, formas de dosagem unitárias fluidas são preparadas utilizando o ingrediente ativo e um veículo estéril, por exemplo mas sem limitação água, alcoóis, polióis, glicerina e óleos vegetais, água sendo preferida. O ingrediente ativo, dependendo do veículo e da concentração usados, pode estar quer suspenso quer dissolvido no veículo.

5 Em preparação de soluções o ingrediente ativo pode ser dissolvido em água para injeção e esterilizado por filtração antes de enchimento de um frasco ou uma ampola adequada e vedação.

Vantajosamente, agentes tais como anestésicos, conservantes e agentes tampão podem ser dissolvidos em veículo. Para intensificar a 10 estabilidade, a composição pode ser congelada após enchimento do frasco e a água removida sob vácuo. O pó liofilizado seco é então vedado no frasco e um frasco acompanhante de água para injeção pode ser fornecido para reconstituir o líquido antes do uso.

Suspensões parenterais são preparadas substancialmente na 15 mesma maneira que a das soluções, exceto que o ingrediente ativo é suspenso no veículo em vez de ser dissolvido e esterilização não pode ser realizada por filtração. O ingrediente ativo pode ser esterilizado por exposição a óxido de etileno antes de suspensão no veículo estéril. Vantajosamente, um agente tensoativo ou umectante é incluído na composição para facilitar distribuição 20 uniforme do ingrediente ativo.

Os compostos da invenção também podem ser administrados usando dispositivos médicos conhecidos na arte. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais 25 como os dispositivos mostrados em US 5.399.163; US 5.383.851; US 5.312.335; US 5.064.413; US 4.941.880; US 4.790.824; ou US 4.596.556. Exemplos de módulos e implantes bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: US 4.487.603, que mostra uma bomba de microinfüsão implantável para fornecer medicação em uma vazão controlada; US 4.486.194, que mostra um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; US 4.447.233, que mostra uma bomba de infusão de medicamento para fornecimento de medicação em uma vazão de infusão precisa; US 4.447.224, que mostra um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para 5 fornecimento continuo de droga; US 4.439.196, que mostra um sistema osmótico de fornecimento de droga tendo compartimentos de multicâmaras; e US 4.475.196, que mostra um sistema osmótico de fornecimento de droga. Muitos outros tais implante, sistemas de fornecimento, e módulos são conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte.

A dosagem a ser administrada de um composto da invenção

variará de acordo com o composto particular, a doença envolvida, o sujeito, e a natureza e a severidade da doença e a condição física do sujeito, e a rota de administração selecionada. A dosagem apropriada pode ser prontamente determinada por uma pessoa experiente na arte.

As composições podem conter de 0,1% em peso,

preferivelmente de 5-60%), mais preferivelmente de 10-30% em peso, de um composto da invenção, dependendo do método de administração.

Será reconhecido por uma pessoa experiente na arte que a quantidade e o espaçamento ótimos de dosagens individuais de um composto

da invenção serão determinados pela natureza e pela extensão da condição sendo tratada, pela forma, pela rota e pelo sítio de administração, e pela idade e pela condição do sujeito particular sendo tratado, e que um médico finalmente determinará as dosagens apropriadas a serem usadas. Esta dosagem pode ser repetida sempre que apropriado. Se efeitos colaterais se 25 desenvolverem a quantidade e/ou a freqüência da dosagem podem ser alteradas ou reduzidas, de acordo com a prática clínica normal.

Em um outro aspecto a presente invenção proporciona métodos para a produção de ansamicina análogos.

Policetídeos de ansamicina por exemplo geldanamicina e herbimicina são sintetizados por agrupamentos biossintéticos de policetídeo que são bem conhecidos na arte. Geldanamicina pode ser considerada em ser biossintetizada em dois estágios. No primeiro estágio os genes de núcleo-PKS montam o núcleo de macrolida pela montagem repetida de precursores de ácido carboxílico simples para dar uma cadeia de policetídeo que é então ciclizada para formar o primeiro intermediário livre de enzima "progeldanamicina", veja Figura I. No segundo estágio uma série de enzimas adaptadoras de "pós-PKS" (e.g. uma citocromo P450 monooxigenase, metil- transferases, oxigenases dependentes de FAD e uma carbamoiltransferase) atuam para adicionar os vários grupos adicionais para prolongar o modelo progeldanamicina resultando na estrutura de composto parental final, veja Figura 2. Os análogos de ansamicina podem ser biossintetizados em uma maneira similar. Esta produção biossintética pode ser explorada por biotransformação opcionalmente combinada com engenharia genética de cepas produtoras adequadas para resultar na produção de compostos novos.

Surpreendentemente os inventores têm verificado que pela alimentação de cepas produtoras de ansamicina com unidades iniciadoras não-naturais (ácidos iniciadores ou seus análogos tais como ésteres), estas unidades iniciadoras podem ser incorporadas em estruturas de ansamicina para produzir novos análogos de ansamicina.

Assim de acordo com a invenção é proporcionado um método para preparar um análogo de ansamicina que compreende:

a) proporcionar uma cepa que produz uma ansamicina tal como geldanamicina, uma herbimicina (herbimicina A, B ou C) ou um seu análogo quando cultivada sob condições apropriadas

b) alimentar uma unidade iniciadora que não é AHBA à dita cepa de tal modo que a unidade iniciadora seja incorporada no dito análogo de ansamicina;

c) cultivar dita cepa sob condições adequadas para a produção de um análogo de ansamicina; e d) opcionalmente isolar os compostos produzidos. Adequadamente a cepa de a) é caracterizada por ser uma cepa na qual um ou mais genes de biossíntese de AHBA têm sido deletados ou inativados. Isto pode evitar competição para incorporação de uma unidade iniciadora não-natural por AHBA que diminuiria rendimento. Alternativamente, a cepa de a) pode ser mutada para abaixar a eficiência da biossíntese de AHBA. Adequadamente as condições de etapa c) são tais que a eficiência da biossíntese de AHBA é sub-óptima. Assim desejavelmente AHBA é produzido pela cepa em um nível que contudo permite incorporação da unidade iniciadora não-natural alimentada. Tipicamente a quantidade de unidade iniciadora não-natural alimentada incorporada é > 20%, preferivelmente >50%) da incorporação da unidade iniciadora total.

Adequadamente a unidade iniciadora é selecionada de R7

sendo que R6, R7, R8 e R9 são como definidos acima, ou um seu análogo no qual o grupo ácido é derivado tal como um éster (eg o metil- ou etil-éster).

Adequadamente a unidade iniciadora não é: ácido 3,5- diamino-benzóico, ácido 3-amino-4-hidróxi-benzóico ou ácido 3-amino-4- cloro-benzóico.

Em uma modalidade a unidade iniciadora é um composto de fórmula (II) na qual R6, R7, R8 e R9 todos representam H.

Em outra modalidade a unidade iniciadora é um composto de fórmula (II) na qual R6, R7, R8 e R9 não representam todos H.

Outras unidades iniciadoras exemplares incluem, mas não são limitadas àqueles compostos mostrados nas segundas colunas de Tabelas 4 e 5 abaixo, bem como seus derivados apropriados (tais como sais e ésteres etc.).

Em uma modalidade a cepa é uma cepa produtora de ansamicina (eg uma cepa produtora de geldanamicina ou herbimicina) e a unidade iniciadora é selecionada de tal modo que a cepa produza um análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina.

Em uma modalidade a unidade iniciadora é selecionada de tal modo que a cepa produza um análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina que está opcionalmente substituído com flúor.

Em uma modalidade a unidade iniciadora é selecionada de tal modo que a cepa produza um análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina que está substituído com flúor.

Em outra modalidade a cepa é uma cepa produtora de macbecina e a unidade iniciadora é selecionada de tal modo que a cepa produza um análogo de macbecina que não está substituído em posições 18 ou

21 do anel benzeno.

Adequadamente o método (i) adicionalmente compreende a etapa de submeter o produto de etapa (d) a um processo de modificação química ou biotransformação opcionalmente seguido pela etapa de isolar os compostos resultantes ou (ii) adicionalmente compreende a etapa de submeter o produto de etapa (c) a um processo de modificação química ou biotransformação antes de etapa (d).

De acordo com outro aspecto da invenção é proporcionado um método para a geração de análogos tais como análogos de 18,21-didesóxi- ansamicina, dito método compreendendo:

a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produz uma ansamicina ou um seu análogo quando cultivada sob condições apropriadas na qual opcionalmente um ou mais genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados e/ou um ou mais genes de biossíntese de unidade iniciadora têm sido deletados ou inativados;

b) alimentar uma unidade iniciadora não-natural à dita cepa

c) cultivar dita cepa hospedeira modificada sob condições adequadas para a produção de análogos de ansamicina tais como análogos de

18,21-didesóxi-ansamicina; e

d) opcionalmente isolar os compostos produzidos.

Adequadamente a unidade iniciadora alimentada é um ácido

iniciador.

Em particular, a presente invenção proporciona um método de produzir análogos de 18,21-didesóxi-ansamicina dito método compreendendo:

a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produz uma ansamicina tal como geldanamicina, herbimicinas (eg herbimicina A, B ou C) ou um seu análogo quando cultivada sob condições apropriadas b) alimentar um ácido iniciador não-natural à dita cepa;

c) cultivar dita cepa sob condições adequadas para a produção de análogos de 18,21-didesóxi-ansamicina; e

d) opcionalmente isolar os compostos produzidos.

Adequadamente o método adicionalmente compreende as

etapas de:

e) deletar ou inativar um ou mais dos genes de biossíntese de unidade iniciadora, ou um seu homólogo, dita etapa normalmente ocorrendo antes de etapa c).

Adequadamente o método adicionalmente, ou em vez, compreende a etapa de:

f) deletar ou inativar um ou mais genes pós-PKS, dita etapa normalmente ocorrendo antes de etapa c).

Em etapa (a)“uma cepa hospedeira que produz uma ansamicina tal como geldanamicina, herbimicinas (eg herbimicina A, B ou C) ou um seu análogo” inclui uma cepa que produz uma ansamicina tal como geldanamicina, uma herbimicina (eg herbimicina A, B ou C) ou os compostos de ansamicina que estão incluídos nas definições de Ri-Rn quando cultivada sob condições apropriadas. Condições apropriadas (e condições adequadas em etapa (c)) incluem a obtenção de um meio de crescimento e de alimentação de iniciador adequado de composição adequada (que será conhecido por uma pessoa experiente na arte ou pode ser determinado por métodos por si conhecidos).

Por exemplo em etapa (a) a primeira cepa hospedeira pode produzir geldanamicina ou um seu análogo quando cultivada sob condições apropriadas.

Adequadamente a alimentação de iniciador não-natural é um ácido benzóico substituído (não sendo ácido 3-amino-5-hidróxi-benzóico que é o ácido iniciador natural), muito mais adequadamente um ácido 3-amino- benzóico opcionalmente substituído adicionalmente ao redor do anel. Adequadamente a alimentação de iniciador não-natural é ácido 3-amino- benzóico substituído com nenhum, um, dois ou três átomos de flúor.

Em uma modalidade adequada a alimentação de ácido iniciador não-natural é ácido 3-amino-benzóico.

Em outra modalidade adequada a alimentação de ácido iniciador não-natural é ácido 5-amino-2-fluoro-benzóico.

Em outra modalidade adequada a alimentação de ácido iniciador não-natural é ácido 5-amino-3-fluoro-benzóico.

Em outra modalidade adequada a alimentação de ácido iniciador não-natural é ácido 5-amino-2,3-di-fluoro-benzóico.

Em outra modalidade adequada a alimentação de ácido iniciador não-natural é ácido 5-amino-2,3,6-tri-fluoro-benzóico.

Uma pessoa experiente na arte perceberá que há unidades iniciadoras não-naturais alternativas que poderiam ser alimentadas à célula hospedeira para produzir o(s) mesmo(s) composto(s) por exemplo, mas não limitados a, o metil-éster, o etil-éster, o N-acetil-cisteamina-tio-éster o ácido benzóico substituído e o análogo de dicetídeo do intermediário biossintético ativado apropriadamente para incorporação por exemplo como o N-acetil- 5 cisteamina-tio-éster. Compostos ácidos também podem ser fornecidos como formas de sal correspondente.

A cepa hospedeira pode, por exemplo, ser uma cepa produtora de ansamicina tal como cepa produtora de geldanamicina ou a cepa produtora de herbimicina. Alternativamente, a cepa hospedeira é uma cepa engenheirada 10 baseada em uma cepa produtora de ansamicina tal como a cepa produtora de geldanamicina (ou a cepa produtora de herbimicina) na qual um ou mais dos genes biossintéticos de unidade iniciadora têm sido deletados ou inativados. Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina na qual um ou mais dos genes 15 pós-PKS têm sido deletados ou inativados

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina na qual gdmM tem sido deletado ou inativado.

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina na qual o homólogo de gdmM e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

Em uma modalidade da invenção a cepa hospedeira é uma cepa produtora de geldanamicina.

Em uma modalidade alternativa, a cepa hospedeira é uma cepa

engenheirada baseada em uma cepa produtora de geldanamicina na qual um ou mais dos genes biossintéticos de unidade iniciadora têm sido deletados ou inativados.

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de geldanamicina na qual um ou mais dos genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de geldanamicina na qual gdmM tem sido deletado ou inativado.

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de geldanamicina na qual gdmM e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa

engenheirada baseada em uma cepa produtora de geldanamicina na qual um ou mais dos genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados e então genes pós-PKS são re-introduzidos para realizarem modificações específicas pós- PKS. Genes pós-PKS do agrupamento de geldanamicina ou outro 15 agrupamento de ansamicinas tal como, mas não limitados aos agrupamentos de macbecina ou herbimicina podem ser usados.

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa produtora de herbimicina (eg herbimicina A, B ou C).

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa produtora de autolitimicina.

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa produtora de reblastatina.

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de herbimicina na qual o homólogo de gdmM tem sido deletado ou inativado.

Em uma outra modalidade a cepa hospedeira é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de herbimicina na qual o homólogo de gdmM e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados. Genes biossintéticos de unidade iniciadora que podem ser deletados ou inativados incluem, por exemplo, genes conhecidos como ahba- 3, ahba-lc, ahba-4, ahba-b, ahba-la, ahba-lb do agrupamento ahba-B na cepa produtora de geldanamicina, S. hygroscopicus AM 3602 (veja Rascher et al 5 2005), ou genes PH, OX, Ahs, Adh e AHk na cepa produtora de macbecina, Actinosynnema pretiosum ATCC 31280 (veja tabela 3), bem como aqueles homólogos em outras cepas que têm função similar. Por exemplo, todos os genes do agrupamento ahba-B na cepa produtora de geldanamicina, S. hygroscopicus AM 3602 podem ser deletados ou inativados.

As deleções anteriormente mencionadas podem ser

combinadas eg a cepa hospedeira pode ser uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina (eg uma cepa produtora de geldanamicina ou herbimicina) na qual gdmM ou um seu homólogo e um ou mais dos genes biossintéticos de unidade iniciadora e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

Adequadamente os um ou mais genes biossintéticos de unidade iniciadora ou genes pós-PKS serão seletivamente deletados ou inativados.

Em uma outra modalidade, um ou mais genes biossintéticos de 20 unidade iniciadora ou genes pós-PKS são inativados em dita cepa engenheirada por integração de DNA no(s) gene(s) de tal modo que proteína funcional não é mais produzida. Em uma modalidade alternativa, um ou mais de ditos genes biossintéticos de unidade iniciadora ou genes pós-PKS são deletados em dita cepa engenheirada ao se fazer uma deleção ou deleções 25 selecionada(s). Em uma outra modalidade um ou mais genes biossintéticos de unidade iniciadora ou genes pós-PKS são inativados em dita cepa engenheirada por mutagênese sítio-direcionada. Em uma outra modalidade uma cepa hospedeira produtora de geldanamicina é submetida à mutagênese, agente químico ou UV, e uma cepa modificada é selecionada na qual uma ou mais das enzimas biossintéticas de unidade iniciadora ou enzimas pós-PKS não são funcionais. A presente invenção também inclui mutações dos reguladores controlando a expressão de um ou mais dos genes pós-PKS, uma pessoa experiente na arte perceberá que deleção ou inativação de um 5 regulador pode ter o mesmo resultado que a deleção ou inativação do gene. Os genes pós-PKS podem ser introduzidos em ditas células hospedeiras sob um promotor apropriado. Em uma modalidade preferida um ou mais dos genes deletados podem ser introduzidos no sítio de ligação de fago cromossômico do Streptomyces fago phiBTl (Gregory et al., 2003). Uma 10 pessoa experiente na arte perceberá que complementação em trans não é limitada a este sítio de ligação de fago, ou de fato ao uso de um sítio de ligação. Portanto, complementação de genes auxiliares deletados também pode ser realizada pela, mas não limitadas a, introdução de um ou mais genes auxiliares sob um promotor apropriado nos outros sítios de ligação de fago tal 15 como o sítio de ligação para Streptomyces fago phiC31 por exemplo pelo uso de um derivado de pSET152 (Bierman et al., 1992). Uma pessoa experiente na arte perceberá que há outros fagos já conhecidos, e pode ser esperado que muito mais fagos contenham as funções de integração que poderiam ser transferidas para um vetor de liberação juntamente com um promotor 20 adequado para gerar outos sistemas que podem ser usados para introduzir genes na cepa hospedeira (Smovkina et al., 1990, Matsuura et al., 1996, Van Mellaert et al., 1998, Lee et al., 1991). À medida que mais fagos são caracterizados poder-se-ia esperar que haveria outras integrases disponíveis que poderiam ser usadas similarmente. Introdução de genes pós-PKS sob um 25 promotor apropriado também pode ser realizada por, sem limitação, recombinação homóloga em uma posição neutra no cromossomo, recombinação homóloga em uma posição não-neutra no cromossomo (por exemplo para interromper um gene escolhido). Vetores de auto-replicação também podem ser usados por exemplo, mas não limitados a, vetores contendo a origem de replicação de Streptomyces de pSG5 (e.g. pKC1139 Bierman et al., 1992), pIJ 101 (e.g. pIJ487, Kieser et al., 2000) e SCP2* (e.g. pIJ698, Kieser et al., 2000).

Em uma outra modalidade uma cepa engenheirada na qual um ou mais genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados como acima, tem re- introduzido nela um ou mais dos mesmos genes pós-PKS, ou seus homólogos de uma cepa produtora de geldanamicina alternativa.

Em uma outra modalidade uma cepa engenheirada na qual um ou mais genes tem sido deletado ou inativado é complementada por um ou mais dos genes pós-PKS de um agrupamento PKS heterólogo incluindo, mas não limitados aos agrupamentos dirigindo a biossíntese de rifamicina, ansamitocina, macbecina ou herbimicina.

Um método de seletivamente deletar ou inativar um gene pós- PKS compreende:

(i) planejar oligos específicos baseados na seqüência do gene de interesse, isolar o fragmento interno do gene de interesse de uma cepa produtora de geldanamicina adequada usando PCR,

(ii) integrar um plasmídeo contendo este fragmento em quer na mesma, quer em uma cepa produtora de geldanamicina diferente seguido por recombinação homóloga, que resulta na disrupção do gene selecionado,

(iii) cultivar a cepa assim produzida sob condições adequadas para a produção dos análogos de ansamicina.

Uma pessoa experiente na arte perceberá que uma cepa equivalente pode ser conseguida usando métodos alternativos àquele descrito acima, e.g.:

■ Oligos degenerados baseados em homólogo(s) do gene de interesse podem ser planejados (e.g. dos agrupamentos biossintéticos de rifamicina, macbecina ou herbimicina e/ou outras seqüências disponíveis) e o fragmento interno do gene de interesse pode ser isolado de uma cepa produtora de geldanamicina adequada usando PCR. Oligos degenerados diferentes podem ser planejados que amplificação com sucesso uma região apropriada do gene pós-PKS, ou um seu homólogo, de uma cepa produtora de geldanamicina, ou cepa produtora de um seu homólogo.

■ A seqüência do gene da cepa Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus NRRL3602 pode ser usada para gerar os oligos que podem ser específicos para o gene de Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus NRRL3602 e então o fragmento interno pode ser amplificado de qualquer cepa produtora de geldanamicina e.g Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus NRRL3602 ou Streptomyces sp. DSM4137 ou Streptomyces violaceusniger DSM40699,.

■ A seqüência do gene da cepa Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus NRRL3602 pode ser usada junta com a seqüência de genes homólogos (eg dos agrupamentos de biossíntese de geldanamicina de Streptomyces sp. DSM4137 ou Streptomyces violaceusniger DSM40699) para gerar oligos degenerados para o gene de Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus NRRL3602 e então o fragmento interno pode ser amplificado de qualquer cepa produtora de geldanamicina e.g Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus NRRL3602 ou Streptomyces sp. DSM4137 ou Streptomyces violaceusniger DSM40699.

Figura 2 mostra a atividade dos genes pós-PKS no agrupamento biossintético de geldanamicina. Uma pessoa experiente na arte assim seria capaz de identificar quais genes pós-PKS necessitariam ser deletados ou inativados com o objetivo de se chegar a uma cepa que produzirá o(s) composto(s) de interesse.

Pode ser observado nestes sistemas que quando uma cepa é gerada na qual um ou mais dos genes pós-PKS não funcionam como um resultado de um dos métodos descritos incluindo inativação ou deleção, que mais do que um análogo de ansamicina pode ser produzido. Há numerosas razões possíveis para isto que serão reconhecidas por aquelas pessoas experientes na arte. Por exemplo pode haver uma ordem preferida de etapas pós-PKS e remoção de uma atividade única acarreta a realização de todas as etapas subseqüentes em substratos que não são naturais para as enzimas envolvidas. Isto pode levar ao acúmulo de intermediários no caldo de cultura devido à eficiência abaixada para os substratos novos apresentados às enzimas pós-PKS, ou deixar de lado produtos que não são mais substratos para as enzimas restantes possivelmente porque a ordem das etapas tem sido alterada.

Uma pessoa experiente na arte perceberá que a proporção dos compostos observada em uma mistura pode ser manipulada pelo uso de variações nas condições de crescimento.

Uma pessoa experiente na arte perceberá que em um agrupamento biossintético alguns genes estão organizados em operons e disrupção de um gene muitas vezes terá um efeito sobre a expressão dos genes subseqüentes no mesmo operon.

Quando uma mistura de compostos é observada estes podem ser prontamente separados usando técnicas padrão algumas das quais são descritas nos exemplos seguintes.

Análogos de ansamicina podem ser selecionados por numerosos métodos, como aqui descrito, e na circunstância onde um único composto mostra um perfil favorável uma cepa pode ser engenheirada para preparar este composto preferivelmente. Na circunstância incomum quando isto não é possível, pode ser gerado um intermediário que é então biotransformado para produzir o composto desejado.

A presente invenção proporciona novos análogos de ansamicina gerados pelo cultivo de uma cepa produtora de um policetídeo de ansamicina ou um seu análogo, por exemplo geldanamicina ou um seu análogo, a cepa opcionalmente tendo deleção ou inativação selecionada de um ou mais genes pós-PKS do agrupamento de genes PKS e proporcionando um alimentação de ácido para incorporação da unidade iniciadora. Em particular, a presente invenção refere-se aos novos análogos de ansamicina produzidos pela alimentação de uma unidade iniciadora não-natural a uma cepa produtora de geldanamicina, opcionalmente combinada com a deleção ou inativação seletiva de um ou mais genes pós-PKS, do agrupamento de genes PKS de geldanamicina. Adicionalmente, um ou mais genes pós-PKS de um agrupamento biossintético de ansamicina podem ser re-introduzidos.

Uma pessoa experiente na arte perceberá que um gene não necessita ser completamente deletado para que o produto do gene seja tomado não-funcional, conseqüentemente o termo “deletado ou inativado” como aqui usado inclui qualquer método pelo qual o produto de gene é tomado não- funcional incluindo mas não limitado a: deleção do gene em sua totalidade, deleção de parte do gene, inativação por inserção no gene alvo, mutagênese sítio-direcionada que resulta em o gene quer não ser expressado quer ser expressado para produzir proteína inativa, mutagênese da cepa hospedeira que resulta em o gene quer não ser expressado quer ser expressado para produzir proteína inativa (e.g. por radiação ou exposição aos agentes químicos mutagênicos, fusão de protoplasto ou mutagênese de transposon). Alternativamente a função de um produto de gene ativo pode ser prejudicada quimicamente com inibidores, por exemplo metapirona (nome alternativo 2- metil-l,2-di(3-piridil-l-propanona), EP 0.627.009) e ancimidol são inibidores de oxigenases e estes compostos podem ser adicionados no meio de produção para gerar análogos. Adicionalmente, sinefungina é um inibidor de metil- transferase que pode ser usado similarmente mas para inibição de atividade de metil-transferase in vivo (McCammon e Parks, 1981).

Em uma modalidade alternativa, todos os genes pós-PKS podem ser deletados ou inativados e então um ou mais dos genes podem ser então reintroduzidos por complementação (e.g. em um sítio de ligação, em um plasmídeo de auto-replicação ou por inserção em uma região homóloga do cromossomo). Portanto, em uma modalidade particular a presente invenção refere-se aos métodos de geração de análogos de ansamicina (eg análogos de

18,21-didesóxi-ansamicina), dito método compreendendo:

a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produz geldanamicina quando cultivada sob condições apropriadas

b) opcionalmente seletivamente deletar ou inativar todos os genes pós-PKS,

c) alimentar uma unidade iniciadora não-natural à dita cepa

d) cultivar dita cepa hospedeira modificada sob condições adequadas para a produção de análogos de ansamicina; e

e) opcionalmente isolar os compostos produzidos.

Em uma modalidade alternativa, um ou mais dos genes pós- PKS deletados são reintroduzidos. Em uma outra modalidade um ou mais genes pós-PKS do agrupamento de geldanamicina de um organismo produtor diferente são reintroduzidos. Em uma outra modalidade, um ou mais dos genes pós-PKS selecionados do agrupamento biossintético de macbecina são introduzidos, este grupo consistindo de mbcM, mbcN, mbcP, mbcMTl, mbcMT2 e mbcP450 são reintroduzidos. Em uma outra modalidade, 2 ou mais dos genes pós-PKS selecionados do grupo consistindo de mbcM, mbcN, mbcP, mbcMTl, mbcMT2 e mbcP450 são reintroduzidos. Em uma outra modalidade, 3 ou mais dos genes pós-PKS selecionados do grupo consistindo de mbcM, mbcN, mbcP, mbcMTl, mbcMT2 e mbcP450 são reintroduzidos. Em uma outra modalidade, 4 ou mais dos genes pós-PKS selecionados do grupo consistindo de mbcM, mbcN, mbcP, mbcMTl, mbcMT2 e mbcP450 são reintroduzidos. Em uma outra modalidade alternativa, 5 ou mais dos genes pós-PKS selecionados do grupo consistindo de mbcM, mbcN, mbcP, mbcMTl, mbcMT2 e mbcP450 são reintroduzidos.

Adicionalmente, será evidente para uma pessoa experiente na arte que um subconjunto dos genes pós-PKS, poderia ser deletado ou inativado e opcionalmente um subconjunto menor de ditos genes pós-PKS poderia ser reintroduzido para se chegar a uma cepa que, quando alimentada com uma unidade iniciadora não-natural, produz análogos de ansamicina tais como análogos de 18,21-didesóxi-ansamicina.

Portanto, em uma modalidade preferida a presente invenção

refere-se aos métodos de geração de análogos de ansamicina (eg análogos de

18.21-didesóxi-ansamicina), dito método compreendendo:

a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produz geldanamicina quando cultivada sob condições apropriadas b) seletivamente deletar ou inativar gdmM,

c) alimentar uma unidade iniciadora não-natural à dita cepa

d) cultivar dita cepa hospedeira modificada sob condições adequadas para a produção de análogos de ansamicina (eg análogos de 18,21- didesóxi-ansamicina); e

e) opcionalmente isolar os compostos produzidos.

Em uma outra modalidade preferida a presente invenção refere-se aos métodos de geração de análogos de ansamicina (eg análogos de

18.21-didesóxi-ansamicina), dito método compreendendo:

a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produz geldanamicina quando cultivada sob condições apropriadas

b) seletivamente deletar ou inativar gdmM

c) opcionalmente seletivamente deletar ou inativar outros

genes pós-PKS

d) alimentar uma unidade iniciadora não-natural à dita cepa e) cultivar dita cepa hospedeira modificada sob condições

adequadas para a produção de análogos de ansamicina (eg análogos de 18,21- didesóxi-ansamicina); e

f) opcionalmente isolar os compostos produzidos.

E bem conhecido por aquelas pessoas experientes na arte que agrupamentos de genes de policetídeo podem ser expressados em hospedeiros heterólogos (Pfeifer e Khosla, 2001). Conseqüentemente, a presente invenção inclui a transferência do agrupamento biossintético de policetídeo de ansamicina por exemplo o agrupamento de genes biossintético de 5 geldanamicina, com ou sem genes regulatórios ou de resistência, quer sob outros aspectos completa quer contendo deleções, em um hospedeiro heterólogo. Alternativamente, o agrupamento biossintético de policetídeo de ansamicina completo por exemplo o agrupamento biossintético de geldanamicina completo pode ser transferido para dentro de um hospedeiro 10 heterólogo, com ou sem genes regulatórios ou de resistência, e pode então ser manipulados pelos métodos aqui descritos para deletar ou inativar um ou mais dos genes pós-PKS ou genes de biossíntese de unidade iniciadora. Métodos e vetores para a transferência como definida acima de tais pedaços grandes de DNA são bem conhecidos na arte (Rawlings, 2001; Staunton e Weissman, 15 2001) ou são aqui obtidos nos métodos mostrados. Neste contexto uma cepa celular hospedeira preferida é um procariote, mais preferivelmente um actinomiceto ou Escherichia coli, ainda mais preferivelmente incluem, mas não limitadas a Actinosynnema mirum (A. mirum), Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum (A. pretiosum), S. hygroseopicus, S. hygroseopicus sp., S. 20 hygroseopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyees violaceusniger, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyees avermitilis, Streptomyees einnamonensis, Streptomyees rimosus, Streptomyces albus, Streptomyees griseofuseus, Streptomyees longisporoflavus, 25 Streptomyees venezuelae, Streptomyees albus, Micromonospora sp., Micromonospora griseorubida, Amycolatopsis mediterranei ou Actinoplanes sp. N902-109.

Em uma modalidade o agrupamento biossintético inteiro é transferido. Em uma modalidade alternativa o PKS inteiro é transferido sem qualquer um dos associados genes de biossíntese de unidade iniciadora e/ou genes pós-PKS.

Em uma outra modalidade o agrupamento biossintético de geldanamicina inteiro é transferido e então manipulado de acordo com a 5 descrição aqui.

Em uma outra modalidade o PKS inteiro é transferido sem qualquer um dos associados genes de biossíntese de unidade iniciadora e/ou genes pós-PKS e genes pós-PKS selecionados, por exemplo mas não limitados a gdmN, mbcN, hbmN, gdmL, e/ou mbcP450 são introduzidos no hospedeiro novo.

Em um aspecto alternativo da invenção, o(s) análogo(s) altemativo(s) da presente invenção podem ser adicionalmente processados por biotransformação com uma cepa apropriada. A cepa apropriada sendo qualquer uma cepa de tipo selvagem disponível por exemplo, mas sem 15 limitação Actinosynnema mirum, Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum, S. hygroseopicus, S. hygroseopicus sp. Streptomyces violaceusniger. Alternativamente, uma cepa apropriada pode ser engenheirada para permitir biotransformação com enzimas pós-PKS particulares por exemplo, mas sem limitação, aquelas codificadas por mbcM, mbcN, mbcP, mbcMT2, mbcP450 20 (como aqui definido), gdmN, gdmM, gdmL, gdmP, (Rascher et al., 2003) a geldanamicina O-metil-transferase, hbmN, hbmL, hbmP, (Rascher et al., 2005) herbimicina O-metil transferases e outras herbimicina mono- oxigenases, asm7, asmlO, asmll, asml2, asml9 e asm21 (Cassady et al., 2004, Spiteller et al, 2003). Onde genes têm ainda que serem identificados ou 25 as seqüências não são de domínio público é rotina para aquelas pessoas experientes na arte adquirir tais seqüências por métodos padrão. Por exemplo a seqüência do gene codificador de uma geldanamicina O-metil-transferase não está em domínio público, mas uma pessoa experiente na arte poderia gerar uma sonda, quer uma sonda heteróloga usando uma O-metil-transferase similar, quer uma sonda homóloga pelo projeto de iniciadores degenerados de genes homólogos disponíveis para realizar Southern Blots em uma cepa produtora de geldanamicina e assim adquirir este gene para gerar sistemas de biotransformação.

5 Em uma modalidade particular a cepa pode ter tido um ou

mais de seus agrupamentos de policetídeo nativo deletados, quer inteiramente quer em parte, ou diferentemente inativados, de modo a prevenir a produção do policetídeo produzido pelo dito agrupamento de policetídeo nativo. Ditas cepas engenheiradas podem ser selecionadas do grupo incluindo, por exemplo 10 mas sem limitação, Actinosynnema mirum, Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum, S. hygroseopicus, S. hygroseopicus sp., S. hygroseopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces violaceusniger, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyces avermitilis, Streptomyces 15 cinnamonensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora sp., Micromonospora griseorubida, Amycolatopsis mediterranei ou Actinoplanes sp. N902-109.

Uma pessoa experiente na arte reconhecerá que outros agrupamentos biossintéticos de policetídeo de ansamicina por exemplo os agrupamentos herbimicina, reblastatina ou TAN poderiam igualmente serem usados para gerar os compostos da invenção.

Pelo uso de uma cepa produtora de herbimicina por exemplo, mas não limitada a Streptomyees hygroseopicus AM3672 (Rascher et al., 25 2005) ou uma cepa produtora de um análogo de herbimicina por exemplo, mas não limitada a uma engenheirada Streptomyces hygroseopicus AM-3672 na qual um ou mais dos genes pós-PKS ou genes de biossíntese de unidade iniciadora têm sido inativados ou deletados opcionalmente com um ou mais genes pós-PKS homólogos ou heterólogos reintroduzidos e alimentados com um ácido iniciador como aqui descrito. A seqüência do agrupamento de PKS de herbimicina está depositada em GenBank (número de acesso AY947889) (Rascher et al., 2005). Onde genes não localizados nesta seqüência são exigidos, eles são localizados pelo uso de sondas homólogas ou heterólogas 5 geradas pelo planejamento de oligos degenerados usando seqüências homólogas como aqui descrito.

Uma pessoa experiente na arte reconhecerá que o agrupamento de reblastatina poderia igualmente ser usado para gerar os compostos da invenção, pelo uso de uma cepa produtora de reblastatina por exemplo, mas 10 não limitada a Streptomyces sp. S6699 (Stead et al., 2000) ou uma cepa produtora de um análogo de reblastatina por exemplo, mas não limitada a uma engenheirada Streptomyces sp. S6699 na qual um ou mais dos genes pós-PKS ou genes de biossíntese de unidade iniciadora têm sido inativados ou deletados opcionalmente com um ou mais genes pós-PKS homólogos ou 15 heterólogos reintroduzidos e alimentados com um ácido iniciador como aqui descrito.

Uma pessoa experiente na arte reconhecerá que haverá múltiplas outras cepas que produzem produtos naturais que podem ser usadas para produzir os compostos desta invenção quando os métodos desta invenção são aplicados.

Embora o processo para a preparação dos análogos de ansamicina da invenção como descrito acima seja substancial ou inteiramente biossintético, não está excluída a produção ou interconversão de análogos de ansamicina da invenção por um processo que compreende métodos químicos sintéticos padrão.

Com o objetivo de permitir a manipulação genética do agrupamento de genes PKS de geldanamicina, a seqüência de agrupamento de genes depositada em GenBank (número de acesso AYl79507) foi usada (Rascher et al., 2003). Onde genes não localizados nesta seqüência são exigidos, eles são localizados pelo uso de sondas homólogas ou heterólogas geradas pelo projeto de oligos degenerados usando seqüências homólogas como aqui descrito.

Com o propósito de usar os genes pós-PKS do agrupamento de macbecina, o agrupamento de genes de macbecina foi seqüenciado de Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum isto é descrito em exemplo 1. Uma pessoa experiente na arte perceberá que há cepas alternativas que produzem macbecina, por exemplo mas sem limitação Actinosynnema mirum.

O agrupamento de genes PKS de macbecina destas cepas pode ser seqüenciado como aqui descrito para Aetinosynnema pretiosum subsp. pretiosum, e a informação usada para gerar cepas equivalentes.

Outros aspectos da invenção incluem:

- Uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina (eg uma cepa produtora de geldanamicina ou uma cepa produtora de herbimicina (eg herbimicina A, B ou C) na qual o homólogo de gdmM e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados, particularmente uma tal cepa engenheirada na qual o homólogo de gdmM tem sido deletado ou inativado. Adequadamente a cepa produtora de ansamicina é um estreptomicete tal como Streptomyees hygroseopicus subsp. geldanus NRRL3602 ou Streptomyees sp. DSM4137 ou Streptomyees violaceusniger DSM40699.

- Uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina na qual um ou mais dos genes de biossíntese de unidade iniciadora têm sido deletados ou inativados eg uma cepa produtora de geldanamicina, por exemplo na qual gdmO está deletado ou inativado ou uma cepa produtora de herbimicina, por exemplo na qual hbmO está deletado ou inativado.

- Uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina (eg uma cepa produtora de geldanamicina ou herbimicina) na qual gdmM ou um seu homólogo e um ou mais dos genes biossintéticos de unidade iniciadora e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados. Por exemplo, todos os genes do agrupamento ahba-B na cepa produtora de geldanamicina, S. hygroseopicus AM 3602 (ou homólogo em outras cepas) podem ser deletados ou inativados. Alternativamente alguns do agrupamento ahba-B na cepa produtora de geldanamicina, S. hygroseopicus AM 3602 (ou homólogo em outras cepas) podem ser deletados ou inativados levando a uma cepa na qual biossíntese de AHBA é reduzida ou eliminada que pode ser experimentalmente confirmada quando se alimenta AHBA a uma tal cepa restaura boa produção de geldanamicina ou outra ansamicina.

- uso de uma tal cepa engenheirada na preparação de um análogo de ansamicina (eg um análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina).

- Análogos de ansamicina obtidos ou obteníveis por qualquer um dos métodos anteriormente mencionados.

Compostos da invenção são vantajosos pelo fato de qu e pode ser esperado que tenham uma ou mais das seguintes propriedades: ligação firme em Hsp90, velocidade de ligação rápida em Hsp90, boa solubilidade, boa estabilidade, boa capacidade de formulação, boa disponibilidade oral, boas propriedades farmacocinéticas incluindo mas não limitadas a baixa glicuronidação, boa captação celular, boa farmacocinética do cérebro, baixa ligação em eritrócitos, bom perfil de toxicologia, bom perfil de hepatotoxicidade, bom perfil de nefrotoxicidade, baixos efeitos colaterais e baixos efeitos colaterais cardíacos.

EXEMPLOS

Métodos Gerais

Meio 1 - MAM

Em I L de água destilada

Amido de milho IOg Sólidos de licor de macerado 2,5g de milho Extrato de levedo 3g CaCO3 3g Sulfato de ferro 0,3g Agar 20g Esterilização em autoclave a 1210C por 20 minutos. Meio 2 - R6

Em 700 mL de água destilada

Sacarose 200g Dextrina em pó IOg Casaminoácidos Ig MgS04.7H20 0,05g *Elementos traço ImL K2SO4 0,lg Agar 20g *Elementos traço lg/L de cada um de FeS04.7H20, MnCl2.4H20 e ZnS04.7H20.

Esterilização em autoclave a 121°C por 20 minutos.

Após esterilização adicionar as seguintes soluções estéreis (observação ácido glutâmico é esterilizado por filtração)

Acido L-glutâmico sal IOOmL mono-sódico (0,65M) CaCl2.2H20 (0.48M) IOOmL MOPS (pH7,2) (0.1M) IOOmL Extração de caldos de cultura para análise por LCMS Caldo de cultura (1 mL) e acetato de etila (1 mL) foram

misturados vigorosamente por 15-30 min seguido por centrifugação por 10 min. 0,5 mL da camada orgânica foi colhido, evaporado até a secura e então re-dissolvido em 0,25 mL de metanol.

Procedimento de análise por LCMS LCMS analítica foi realizada usando Método I de LCMS

usando sistema Agilent HP1100 HPLC em combinação com um espectrômetro de massa com electrospray Bruker Daltonics Esquire 3000+ operando em modo de íon negativo e/ou positivo. Método I de LCMS: cromatografia foi realizada em uma coluna Phenomenex Hyperclone (C18 20 BDS, tamanho de partícula de 3 micrômetros, 150 mm x 4,6 mm) eluindo em uma vazão de fluxo de 1 mL/min usando o seguinte processo de eluição em gradiente; T=O, 10%B; T=2, 10%B; T=20, 100%B; T=22, 100%B; T=22.05, 10%B; T=25, 10%B. Fase móvel A = água + ácido fórmico 1%; fase móvel B = acetonitrila + ácido fórmico 1%. Espectros em UV foram registrados entre 190 e 400 nm, com cromatogramas extraídos obtidos em 210, 254 e 276 nm.

5 Espectros de massa foram registrados entre 100 e 1500 amu.

Métodos de elucidação de estrutura por RMN Espectros de RMN foram registrados em um espectrômetro Bruker Advance 500 a 298 K operando a 500 MHz e 125 MHz para 1H e 13C respectivamente. Seqüências de pulso Bruker Padrão foram usadas para 10 adquirir espectros de 1H-1H COSY, APT, HMBC e HMQC. Espectros de RMN foram referidos às ressonâncias de próton residual ou carbono padrão dos solventes nas quais foram corridos.

Avaliação da pureza do composto

Compostos purificados foram analisados usando Método 2 de 15 LCMS descrito. Método 2 de LCMS: cromatografia foi realizada em uma coluna Phenomenex HyperClone Ci8-BDS (4,6 mm x 150 mm, tamanho de partícula de 3 micrômetros) eluindo com um gradiente de água + ácido fórmico 1%: acetonitrila + ácido fórmico 1%, (90:10) a (0:100), a 1 mL/min durante 20 min. Pureza foi avaliada por MS e em múltiplos comprimentos de 20 onda (210, 254 & 276 nm). Todos os compostos foram >95% puros em todos os comprimentos de onda. Pureza foi finalmente confirmada por inspeção dos espectros de 1H e 13C RMN.

Bioensaio in vitro para atividade anticâncer Avaliação in vitro de compostos para atividade anticâncer em um painel de linhagens de célula de tumor de humano em um ensaio de proliferação de monocamada foram realizados na Oncotest Testing Facility, Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg. As características das linhagens de célula selecionadas são resumidas em Tabela Tabela I - Linhagens de célula de teste

# Linhagem de célula Características 1 CNXF 498NL CNS 2 CXF HT29 Cólon 3 LXF 1121L Pulmão, câncer de célula grande 4 MCF-7 Mama, padrão NCI MEXF 394NL Melanoma 6 DU145 Próstata - positivo para PTEN As linhagens de célula de Oncotest foram estabelecidas de

xenoenxertos de tumor de humano como descrito por Roth et al., (1999). A origem dos xenoenxertos de doador é descrita por Fiebig et al., (1999). Outras linhagens de célula foram quer obtidas de NCI (DU145, MCF-7) quer compradas de DSMZ, Braunschweig, Alemanha.

Todas as linhagens de célula, a não ser que seja especificado de outra maneira, foram crescidas a 37°C em uma atmosfera umedecida (95% de ar, 5% de CO2) em um meio 'ready-mix' contendo meio RPMI 1640, 10% de soro fetal bovino, e 0,1 mg/mL de gentamicina (PAA, Cõlbe, Alemanha).

Um ensaio de iodeto de propídio modificado foi usado para avaliar os efeitos do(s) composto(s) de teste sobre o crescimento de linhagens de célula de tumor de humano (Dengler et al., (1995)).

Resumidamente, células foram colhidas de culturas em fase exponencial por tripsinização, contadas e plaqueadas em placas de microtítulo de fundo plano de 96 cavidades em uma densidade de células dependente da linhagem de célula (5 - 10.000 células viáveis/cavidade). Após recuperação de

24 h para permitir que as células retomassem o crescimento exponencial,

0,010 mL de meio de cultura (6 cavidades de controle por placa) ou meio de 20 cultura contendo o análogo de ansamicina foi adicionado nas cavidades. Cada concentração foi plaqueada três vezes. Compostos foram aplicados em cinco concentrações (100; 10; 1; 0,1 e 0,01 μΜ). Após 4 dias de exposição contínua, meio de cultura de célula com ou sem composto de teste foi substituído por 0,2 mL de uma solução aquosa de iodeto de propídio (PI) (7 mg/L). Para medir a proporção de células vivas, células podem ser permeabilizadas por congelamento das placas. Após descongelamento das placas, fluorescência foi medida usando a leitora de microplaca Cytofluor 4000 (excitação 530 nm, emissão 620 nm), dando uma relação direta para o número total de células viáveis.

Inibição de crescimento foi expressada como tratado/controle

x 100 (% T/C).

Exemplo 1 - Seqiienciamento de agrupamento de genes Macbecina PKS

DNA genômico foi isolado de Actinosynnema pretiosum

(ATCC 31280) e Actinosynnema mirum (DSM 43827, ATCC 29888) usando protocolos padrão descritos em Kieser et al, (2000). Seqüenciamento de DNA foi realizado pela instalação de seqüenciamento do Biochemistry Department, University de Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 IQW usando procedimentos padrão.

Iniciadores BIOSG104 5’-

GGTCTAGAGGTCAGTGCCCCCGCGTACCGTCGT-3’ (SEQ ID NO: 1) AND BIOSG105 5’-GGCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC-3’ (SEQ ID NO: 2) foram empregados para amplificar o gene codificador de carbamoil- 20 transferase gdmN do agrupamento de genes biossintético de geldanamicina de Streptomyces hygroseopicus NRRL 3602 (Número de acesso de seqüência: AYl 79507) usando técnicas padrão. Experimentos de Southern Blot foram realizados usando os Reagentes DIG e Kits para Marcação e Detecção de Ácido Nucleico Não-Radioativo de acordo com as instruções do fabricante 25 (Roche). O fragmento de DNA gdmN marcado com DIG foi usado como uma sonda heteróloga. Usando a sonda gerada de gdmN e o DNA genômico isolado de A. pretiosum 2112 foi identificado um fragmento EcoR\ de aproximadamente 8 kb em análise de Southern Blot. O fragmento foi clonado em Litmus 28 aplicando procedimentos padrão e transformantes foram identificados por hibridização de colônia. O clone p3 foi isolado e o inserto de aproximadamente 7,7 kb foi seqüenciado. DNA isolado de clone p3 foi digerido com EcoKX e EcóR\/Sac\ e as bandas ao redor de 7,7 kb e a cerca de

1,2 kb foram isoladas, respectivamente. Reações de marcação foram realizadas de acordo com os protocolos dos fabricantes. Bibliotecas de cosmídeos das duas cepas nomeadas acima foram criadas usando o vetor SuperCos 1 e o kit de empacotamento the Gigapack III XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Estas duas bibliotecas foram selecionadas usando protocolos padrão e como uma sonda, os fragmentos marcados com DIG do fragmento EeoRl de 7,7 kb derivado de clone p3 foram usados. Cosmídeo 52 foi identificado da biblioteca de cosmídeos de A. pretiosum e submetido ao seqüenciamento na instalação de seqüenciamento do Biochemistry Department of the University de Cambridge. Similarmente, cosmídeo 43 e cosmídeo 46 foram identificados da biblioteca de cosmídeos de A. mirum. Todos os três comídeos contêm o fragmento EcoRl de 7,7 kb como mostrado pela análise de Southern Blot.

Um fragmento de cerca de 0,7 kb da região PKS do cosmídeo 43 foi amplificado usando iniciadores BIOSGl 24 5’- CCCGCCCGCGCGAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC-3’ (SEQ ID NO: 3) e BIOSG125 5’-

GCGTCCTCGCGCAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC-3’ (SEQ ID NO: 4) aplicando protocolos padrão, clonado e usado como uma sonda para selecionar a biblioteca de cosmídeos de A. pretiosum para clones de sobreposição. A informação de seqüência de cosmídeo 52 também foi usada 25 para criar sondas derivadas de fragmentos de DNA amplificados por iniciadores BIOSG130 5’-

CCAACCCCGCCGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG-3’ (SEQ ID NO: 5) e BIOSGl31 5’-GTCGTCGGCTACGGGCCGGTGGGGCAGCTGCTGT- 5’ (SEQ ID NO: 6) bem como BIOSG132 5’- GTCGGTGGACTGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC-3’ (SEQ ID NO:

7) e BIOSG133 5’- GGCCGGTGGTGCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG-3’ (SEQ ID NO:

8) que foram usados para selecionar a biblioteca de cosmídeos de A. pretiosum. Cosmídeos 311 e 352 foram isolados e cosmídeo 352 foi enviado

para seqüenciamento. Cosmídeo 352 contém uma sobreposição de aproximadamente 2,7 kb com cosmídeo 52. Para selecionar outros cosmídeos, um fragmento de PCR de aproximadamente 0,6 kb foi amplificado usando iniciadores BIOSG136 5’-

CACCGCTCGCGGGGGTGGCGCGGCGCACGACGTGG CTGC-3’ (SEQ ID NO: 9) e BIOSG 137 5’-

CCTCCTCGGACAGCGCGATCAGCGCCGCGC ACAGCGAG-3’ (SEQ ID NO: 10) e cosmídeo 311 como modelo aplicando protocolos padrão. A biblioteca de cosmídeos de A. pretiosum foi selecionada e cosmídeo 410 foi 15 isolado. Ele sobrepõe aproximadamente 17 kb com cosmídeo 352 e foi enviado para seqüenciamento. A seqüência dos três cosmídeos de sobreposição (cosmídeo 52, cosmídeo 352 e cosmídeo 410) foi montada. A região seqüenciada abarca cerca de 100 kbp e 23 matrizes de leitura aberta foram identificadas potencialmente constituindo o agrupamento de genes 20 biossintéticos de macbecina. A localização de cada uma das matrizes de leitura aberta dentro de SEQ ID NO: 11 é mostrada em Tabela 3 Tabela 2 - Sumário dos cosmídeos

Cosmídeo Cepa Cosmídeo 43 Actinosynnema mirum ATCC 29888 Cosmídeo 46 Aetinosynnema mirum ATCC 29888 Cosmídeo 52 Aetinosynnema pretiosum ATCC 31280 Cosmídeo 311 Aetinosynnema pretiosum ATCC 31280 Cosmídeo 352 Aetinosynnemapretiosum ATCC 31280 Cosmídeo 410 Aetinosynnema pretiosum ATCC 31280 Tabela 3 - localização de cada uma das matrizes de leitura aberta para os

genes pós-PKS e os genes de biossíntese de unidade iniciadora

Posição de nucleotídeo Nome do Função da proteína codificada em SEQ ID NO: 11 Gene 14925-17909* mbeRll regulador de transcrição 18025-19074c mbeO amino-hidroquinato sintase 19263-20066c* mbe? desconhecida, biossíntese de AHBA 20330-40657 mbeAI PKS 40654-50859 mbeAII PKS 50867-62491* mbcAIII PKS 62500-63276* mbcF amida sintase 63281-64852* mbcM C21 monooxigenase 64899-65696c* PH fosfatase 65693-66853c* OX oxidorredutase 66891-68057c* Ahs AHBA sintase 68301-68732* Adh ADHQ desidratase 68690-69661c* AHk AHBA cinase 70185-72194c* mbcN carbamoil-transferase 72248-73339c mbeH rota de metóxi-malonil ACP 73336-74493c mbel rrota de metóxi-malonil ACP 74490-74765c mbeJ rota de metóxi-malonil ACP 74762-75628c* mbeK rota de metóxi-malonil ACP 75881-76537 mbeG rota de metóxi-malonil ACP 76534-77802* mbcP C4,5 monooxigenase 77831-79054* mbcP450 P450 79119-79934* mbcMTl O-metil-transferase 79931-80716* mbe MT2 (9-metil-transferase [Nota 1: c indica que o gene é codificado pela fita de DNA complementar;

Nota 2: é algumas vezes o caso no qual mais do que um códon de iniciação candidato potencial pode ser identificado. Uma pessoa experiente na arte reconhecerá este e será capaz de identificar códons de iniciação possíveis alternativos. Temos indicado aqueles genes que têm mais de um códon de iniciação possível com um símbolo Em toda parte temos indicado o que acreditamos ser o códon de iniciação, contudo, uma pessoa experiente na arte perceberá que pode ser possível gerar proteína ativa usando um códon de iniciação alternativo.]

Exemplo 2 - Geração de uma cepa inativada por dgmM Uma deleção em matriz de gdmM é realizada como segue.

2.1 Clonagem de DNA homólogo à região flanqueadora a montante de sdmM.

Oligos gdmlfor (SEQ ID NO: 12) e gdmlrev (SEQ ID NO: 13) são usados para amplificar uma região de 2268 pb de DNA de Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus (NRRL 3602) em uma reação PCR padrão usando DNA genômico como modelo e Pfii DNA polimerase. Uma extensão 5' em cada oligo introduz sítios de restrição para auxiliar na clonagem do fragmento amplificado. O produto de PCR (PCRgdml) cobre uma região de homologia a montante de gdmM até uma inclusão dos primeiros 2 aminoácidos de gdmM. Este fragmento de 2268 pb é clonado em pUC18 que é linearizado com Smal e desfosforilado, para dar pUC18gdml. gdm 1 for TTAAGCTTGGACCGGCGCGAACTCGCGGACACCCACCT Hinàlll (SEQ ID NO: 12)

gdm 1 rev TTTCTAGAGGTCATGCGCCCGCCAGGATCAGGTCGACC XbaI (SEQ ID NO: 13)

Plasmídeo pUC18gdml é identificado por digestão por enzima de restrição com Ndel e Smal que dá três fragmentos de 439pb, 1687pb e 2828pb.

2.2 Clonagem de DNA homólogo à região flanqueadora a jusante de gdmM.

Oligos gdm2for (SEQ ID NO: 14) e gdm2rev (SEQ ID NO: 15) são usados para amplificar uma região de 2267 pb de DNA de Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus (NRRL 3602) em uma reação PCR padrão usando DNA genômico como modelo e Pfu DNA polimerase. Uma extensão 5' é planejada em cada oligo para introduzir sítios de restrição 5 para auxiliar na clonagem do fragmento amplificado. O produto de PCR amplificado (PCRgdm2) cobre uma região dos últimos 2 aminoácidos de gdmM, o códon de terminação e uma região de homologia de gdmM. Este fragmento de 2267pb é clonado em pUC18 que é linearizado com Smal, resultando em plasmídeo pUC18gdm2.

gdm2for TTTCT AGACCTTCGTAAGGCTCCCCTGCCTGGGCATGG

Xbal (SEQ ID NO: 14)

gdm2rev TTGAATTCTCTGCTCGGCTACGGCTTCGGCGACGAGTA EcoKl (SEQ ID NO: 15)

Plasmídeo pUC18gdm2 é identificado por digestão por enzima de restrição com NdeI e Smal que dá três fragmentos de 440pb, 1594pb e 2919pb.

2.3 Geração de um plasmídeo para realizar uma deleção em matriz de gdmM Os produtos PCRgdml e PCRgdm2 são clonados em

pKC1139 em uma etapa como segue. pKC1139 é digerido com Hinàlll e EcoKl e o fragmento de estrutura principal é gerado e ligado com PCRgdml em um fragmento HinàWMXbal e PCRgdm2 em um fragmento Xbal/EcoKi em uma ligação única de três partes. Digestão por enzima de restrição é usada para confirmar o plasmídeo final, pKCl 139gdmlgdm2.

2.4 Transformação de Streptomyces hygroscopicus subsp. geldanus (NRRL 3602) e seleção de um mutante de deleção de gdmM

Eseheriehia eoli ETl2567, hospedando o plasmídeo pUZ8002 é transformada com pKCl 139gdmlgdm2 por eletroporação para gerar a cepa doadora de E. coli para conjugação. Esta cepa é usada para transformar Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus (NRRL 3602) por conjugação usando métodos padrão (Kieser et al, (2000) Practical Streptomyces Genetics). Exconjugantes são plaqueados sobre meio 2 e incubados a 28°C.

5 Placas são revestidas após 24 h com 50 mg/L de apramicina e 25 mg/L de ácido nalidíxico. Vetores baseados em pKCl 139 auto-replicam a 28°C, assim é esperado que transformantes contenham pKCl 139gdmlgdm2 com um plasmídeo de auto-replicação. Após 4-7 dias as colônias são aplicadas como manchas sobre placas de meio 2 contendo apramicina (50 mg/L) e ácido 10 nalidíxico (25 mg/L). As placas são então incubadas a 37°C por 3-4 dias - o aumento em temperatura interrompe a replicação do plasmídeo livre baseado em pKC1139, cuja replicação não funciona a 37°C e portanto seleção continuada com apramicina seleciona para integração no cromossomo via uma das regiões de homologia. As colônias são então reaplicadas como 15 manchas sobre placas de meio 2 contendo apramicina e ácido nalidíxico e incubadas a 37°C por 3-4 dias para garantir que nenhumas células de E. coli atravessem mais além.

Sub-cultura de recombinantes secundários

Após mais 3-4 dias de incubação, etapas de sub-cultura são 20 realizadas usando placas de meio 2 sem antibiótico. Para fazer isto, material de cada mancha é raspado e plaqueado sobre uma placa de ágar de meio 2 e incubado 37°C até crescimento ser visível, tipicamente no dia três. É realizada uma etapa de terceira e quarta sub-culturas usando a mesma técnica. A etapa de quarta sub-cultura é incubada a 28°C para permitir esporulação. Quando 25 esporulação é visível após vários dias (tipicamente 7-10 dias), suspensões de esporo são isoladas e série de diluições é realizada usando técnicas padrão. Alíquotas da série de diluições são espalhadas sobre placas de meio 1 e incubadas a 28°C até que colônias fossem visíveis. Colônias individuais são recolhidas e aplicadas como manchas em paralelo sobre placas de meio 1 com e sem apramicina.

Manchas que crescem sobre a placa sem antibiótico mas não crescem sobre a placa com apramicina são reaplicadas como mancha sobre placas de apramicina +/- para confirmar perda do marcador antibiótico. A 5 cepa mutante codifica uma proteína gdmM inativa com uma deleção em matriz de 543 aminoácidos.

Mutante de deleção de gdmM são aplicados como manchas sobre Meio 1 e crescidos a 28°C por quatro dias. Um pedaço circular de 6 mm de cada mancha é usado para inocular tubos falcon de 50 mL individuais 10 contendo 10 mL de meio de semente (por litro; glicose 40g, melaço de beterraba IOg, extrato de levedo 2,5g, peptona 2,5g, triptona 2,5g, farinha de aveia 5g). Estas culturas de semente são incubadas por 36-72h a 28°C, 300 rpm com um arremesso de 2,54 centímetros. Estes são usados então para inocular (0,5 mL em 10 mL) meio de produção (mesmo que o meio de 15 semente) e são crescidos a 28°C por 6 dias. Metabólitos secundários são extraídos e analisados por LCMS para produção de análogos de geldanamicina como descrito nos Métodos Gerais. Um mutante é chamado de S. hygroseopicus gdmM que deve produzir composto, 1, que é esperado em ser indistinguível de KOS-1806 (Rascher et al., 2005). Uma pessoa experiente 20 na arte pode prontamente planejar estratégias de inativação de dgmM alternativas por exemplo por integração ou por geração de um mutante de disrupção por inserção de um gene de resistência como publicado por Rascher (2005).

Exemplo 3 - Geração de análogos de geldanamicina novos por alimentação de AHBA análogos à cepa S. hygroseopicus gdmM nocauteada em gdmM

3.1 Biotransformação usando S. hygroseopicus gdmM

S. hygroseopicus gdmM, cuja geração é descrita em exemplo 2 acima, é aplicada como mancha sobre placas MAM (meio 1) e crescida a 28°C por três dias. Um pedaço circular de 6 mm é usado para inocular tubos falcon de 50 mL individuais contendo 10 mL de meio de semente (por litro; glicose 40g, melaço de beterraba IOg, extrato de levedo 2,5g, peptona 2,5g, triptona 2,5g, farinha de aveia 5g). Estas culturas de semente são incubadas 5 por 36-72h a 28°C, 300 rpm com um arremesso de 2,54 centímetros. Estes são usados então para inocular (0,5 mL em 10 mL) meio de produção (mesmo que o meio de semente) e são crescidos a 28°C for 24 h. 0,1 mL de uma solução de estoque de alimentação 200 mM (em metanol - veja lista em tabela 4) é adicionado em cada tubo falcon para dar uma concentração de 10 alimentação final de 2 mM. Tubos são incubados por mais 6 dias a 28°C.

3.2 Identificação de análogos de geldanamicina novos por LCMS em extratos de cultura

Extratos da fermentação descritos em exemplo 3.1 são gerados e ensaiados por LCMS como descrito em Métodos Gerais. Em todos os casos, 15 as ansamicinas maiores esperadas em serem observadas são descritas em tabela 4. A tabela descreve o análogo de ácido benzóico substituído que é alimentado à cepa, as massas maiores em LCMS, e a massa dos compostos maiores. Figuras 3 e 4 mostras as estruturas dos compostos esperados em serem produzidos.

Tabela 4 - Compostos identificados por LCMS

Número do Análogo de AHBA Composto [M+Na]+ [M-H] Massa experimento alimentado produzido 3A 14 541 517 518,3 525 501 502 3B H02Cr^^H2 14 541 517 518,3 16 541 517 518 3C HO9C NH? 14 541 517 518,3 17 543 519 520 3D „Á„, 14 541 517 518,3 18 543 519 520 3Ν JCCoh 14 541 517 518.3 28 541 517 518 OH 14 541 517 518.3 29 559 535 536 3Ρ ώΟΗ 14 541 517 518.3 559 535 536 3Q OH 14 541 517 518.3 31 555 531 532 3R jH 14 541 517 ^ 518.3 32 543 519 520 3S n 14 541 517 518.3 33 541 517 518 3Τ .A, 14 541 517 518.3 34 559 535 536 3U Cl 14 541 517 518.3 575 551 552 3V XX 14 541 517 518.3 36 559 535 536 3W χγ 2 14 541 517 518.3 37 575 551 552 Exemplo 4 — Geração de uma cepa com inativação de biossíntese de AHBA

Uma vantagem da produção de uma cepa com gene(s) envolvido(s) em síntese de AHBA inativado(s) é que há menos competição de AHBA natural dentro da cepa. Alimentação com análogos de ácido benzóico substituído pode ser portanto mais eficiente, também acarretando purificação mais simples. O método abaixo é adaptado de Rascher et al 2005.

4.1 Construção do plasmídeo pKCl 139AHBAdel

Oligos LHSfor (SEQ ID NO: 16) e LHSrev (SEQ ID NO: 17) 10 são usados para amplificar uma região de -1,65 kpb de DNA de Streptomyees hygroseopicus subsp. geldanus (NRRL 3602) em uma reação PCR padrão usando DNA genômico como o modelo e KOD DNA polimerase. Uma extensão 5' é planejada em cada oligo para introduzir sítios de restrição para auxiliar na clonagem do fragmento amplificado. O produto de PCR 15 amplificado (PCR LHS) cobre uma região do lado esquerdo do agrupamento de AHBA 'B' associado com a produção de AHBA. Este fragmento de -1,65 kpb é clonado em pUC18 que tem sido previamente digerido com Smal e desfosforilado, dando pUC18LHS

LHSfor CGC A AGCTTAGACCTCGACC ACCGGT GTCTGGA HindUl

(SEQ ID NO: 16)

LHSrev CCGTCTAGACACGATTTCCAGCGCATGGCCCA Xbal (SEQ ID NO: 17)

Oligos RHSfor (SEQ ID NO: 18) e RHSrev (SEQ ID NO: 19)

são usados para amplificar uma região de -0,98 kpb de DNA de Streptomyees hygroseopicus subsp. geldanus (NRRL 3602) em uma reação PCR padrão usando DNA genômico como o modelo e KOD DNA polimerase. Uma extensão 5' é planejada em cada oligo para introduzir sítios de restrição para auxiliar na clonagem do fragmento amplificado. O produto de PCR amplificado (PCR LHS) cobre uma região do lado direito do agrupamento de AHBA 'B' associado com a produção de AHBA. Este fragmento de -0,98 kpb é clonado em pUC18 que tem sido previamente digerido com Smal e 5 desfosforilado, dando pUC 18RHS.

RHSfor TGCTCTAGACTCACCCGCTCGCCTTCGTCA Xbal (SEQ ID NO: 18)

RHSrev T GCG AATTCT G AGCC ACC ACGGCGT GT GACA EcoRl

(SEQ ID NO: 19)

Os produtos PCRLHS e PCRRHS são clonados em pKC1139 em uma etapa como segue. pKC1139 é digerido com Hinàlll e EcoRl e o fragmento de estrutura principal é gerado e ligado com PCRLHS em um 15 fragmento on a HinâUI/Xbal e PCRRHS em um fragmento Xb al!EcoRl, cada fragmento de PCR tomado do clone pUC18, em uma ligação única de três partes. Digestão por enzima de restrição é usada para confirmar o plasmídeo final que é chamado de pKCl 139AHBAdel.

4.2 Transformação de Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus (NRRL 3602) e seleção de um mutante de deleção de AHBA tB’

Escherichia coli ET12567, hospedando o plasmídeo pUZ8002 foi transformada com pKCl 139AHBAdel por eletroporação para gerar a cepa doadora de E. coli para conjugação. Esta cepa é usada para transformar Streptomyces hygroseopicus subsp. geldanus (NRRL 3602) por conjugação 25 (Kieser et al, (2000) Practical Streptomyces Genetics). Exconjugantes são plaqueados sobre meio 2 e incubados a 28°C. Placas são revestidas após 24 h com 50 mg/L de apramicina e 25 mg/L de ácido nalidíxico. Vetores baseados em pKC1139 auto-replicam a 28°C, assim é esperado que transformantes contenham pKCl 139AHBAdel como um plasmídeo de auto-replicação. Após 4-7 dias colônias são aplicadas como manchas sobre placas de meio 2 contendo apramicina (50 mg/L) e ácido nalidíxico (25 mg/L). As placas são então incubadas a 37°C por 3-4 dias. Integração do plasmídeo no cromossomo então ocorre por recombinação homóloga. As colônias são então 5 reaplicadas como manchas sobre placas de meio 2 contendo apramicina e ácido nalidíxico e incubadas a 37°C por 3-4 dias para garantir que nenhumas células de E. coli atravessem mais além.

Sub-cultura de recombinantes secundários

Após mais 3-4 dias de incubação, etapas de sub-cultura são realizadas usando placas de meio 1 sem antibiótico. Para fazer isto, material de cada mancha é raspado e plaqueado sobre uma placa de ágar de meio 1 e incubado a 37°C até crescimento ser visível, tipicamente no dia três. É realizada uma etapa de terceira e quarta sub-culturas usando a mesma técnica. A etapa de quarta sub-cultura é incubada a 28°C para permitir esporulação. Quando esporulação é visível após vários dias (tipicamente 7-10 dias), suspensões de esporo são isoladas e série de diluições é realizada usando técnicas padrão. Alíquotas da série de diluições são espalhadas sobre placas de meio 1 e incubadas a 28°C até que colônias fossem visíveis. Colônias individuais são recolhidas e aplicadas como manchas em paralelo sobre placas de meio 1 com e sem apramicina.

Manchas que crescem sobre a placa sem antibiótico mas não crescem sobre a placa com apramicina são reaplicadas como mancha sobre placas de apramicina +/- para confirmar perda do marcador antibiótico. A cepa mutante contém uma deleção grande na região biossintética 'B' de AHBA.

Mutantes de deleção são aplicados como manchas sobre Meio 1 e crescidos a 28°C por quatro dias. Um pedaço circular de 6 mm de cada mancha é usado para inocular tubos falcon de 50 mL individuais contendo 10 mL de meio de semente (por litro; glicose 40g, melaço de beterraba IOg, extrato de levedo 2,5g, peptona 2,5g, triptona 2,5g, farinha de aveia 5g). Estas culturas de semente são incubadas por 36-72h a 28°C, 300 rpm com um arremesso de 2,54 centímetros. Estes são usados então para inocular (0,5 mL em 10 mL) meio de produção (mesmo que o meio de semente) e são crescidos a 28°C por 6 dias. Metabólitos secundários são extraídos e analisados por LCMS para produção de análogos de geldanamicina como descrito nos Métodos Gerais. Um mutante é chamado de S. hygroseopicus AHBA e é caracterizado pela falta de produção de geldanamicina. Ademais, produção de geldanamicina deve ser restaurada pela alimentação de AHBA em 24 horas em produção.

Exemplo 5 Geração de uma cepa com ambos gdmM e síntese de AHBA inativados por transformação de Streptomyces hygroseopicus gdmM com pKC 1139 AHB Adel.

O sucesso da alimentação em Streptomyces hygroseopicus gdmM pode ser melhorado pela remoção da competição por AHBA. Portanto usando exatamente o mesmo procedimento como para exemplo 4 é realizada uma deleção de AHBA 'B' em Streptomyces hygroseopicus gdmM para gerar uma cepa superior para a produção de compostos da invenção.

Escherichia coli ET12567, hospedando o plasmídeo pUZ8002 foi transformada com pKCl 139AHBAdel por eletroporação para gerar a cepa doadora de E. coli para conjugação. Esta cepa é usada para transformar Streptomyees hygroseopicus subsp. geldanus (NRRL 3602) por conjugação usando métodos padrão (Kieser et al, (2000) Practical Streptomyces Genetics). Exconjugantes foram selecionados como descrito acima (exemplo 4) e recombinantes secundários foram selecionados como descrito acima.

A cepa de deleção dupla final é chamada de Streptomyces hygroseopicus gdmMAHBAB' e é caracterizada por ser faltante de produção de geldanamicina ou análogos de geldanamicina. Quando culturas de produção são suplementadas com AHBA, produção de KOS-1806 é restaurada (Rascher et al. 2005).

Exemplo 6 Geração de análogos de geldanamicina novos por alimentação a uma cepa com ambos gdmM e síntese de AHBA inativados - Streptomyces hygroseopicus gdmMAHBAB'

16.1 Biotransformação usando Streptomyces hygroscopicus sdmM AHQAR'

Streptomyces hygroseopicus AHBAB", cuja geração é

descrita em exemplo 5 acima, é aplicada como mancha sobre placas MAM (meio 1) e crescida a 28°C por três dias. Um pedaço circular de 6 mm é usado para inocular tubos falcon de 50 mL individuais contendo 10 mL de meio de 10 semente (por litro; glicose 40g, melaço de beterraba IOg, extrato de levedo 2,5g, peptona 2,5g, triptona 2,5g, farinha de aveia 5g). Estas culturas de semente são incubadas por 36-72h a 28°C, 300 rpm com um arremesso de 2,54 centímetros. Estes são usados então para inocular (0,5 mL em 10 mL) meio de produção (mesmo que o meio de semente) e são crescidos a 280C for 15 24 h. 0,1 mL de uma solução de estoque de alimentação 200 mM (em metanol

- veja lista em tabela 5) é adicionado em cada tubo falcon para dar uma concentração de alimentação final de 2 mM. Tubos são incubados por mais 6 dias a 28°C.

16.2 Identificação de análogos de geldanamicina novos por LCMS em extratos de cultura

Extratos da fermentação descritos em exemplo 16.1 são gerados e ensaiados por LCMS como descrito em Métodos Gerais. Em todos os casos, a ansamicina maior esperada em ser observada é descrita em tabela 5, e estas ansamicinas não devem ser vistas em extratos de fermentações que 25 não são alimentados. A tabela descreve o análogo de ácido benzóico substituído que é alimentado à cepa, as massas por LCMS, e a massa do composto. Figuras 3 e 4 mostram as estruturas dos compostos esperadas em serem produzidas. Tabela 5 - Compostos identificados por LCMS

Número do Análogo de AHBA Composto [M+Na]+ [M-H] Massa experimento alimentado produzido 6A 15 525 501 502 6B hoXX 16 541 517 518 6C Fxx 17 543 519 520 HOpC^^^NH? 6D Á 18 543 519 520 ho2c/^^nh2 6E ”)Λ 19 559 535 536 ho2c^^^^nh2 6F Ά 20 561 537 538 ηο2ο^^^νη2 6G fyS 21 579 555 556 ho2c^^^nh2 F 6H OH 22 559 535 536 fyS ho2c^^^nh2 61 OH 23 555 531 532 "Xl ho2c^^^nh2 6J OH 24 609 585 586 F3C^A ho2c'^^hh2 6Κ OH 25 569 545 546 WL Η020^^ NH2 6L OH 26 575 551 552 iS HO2CTvY^ NH2 Cl 6Μ OH 27 559 535 536 A HO2Oy^H2 F 6Ν JDCoh 28 541 517 518 Η02σ^^^Η2 60 OH 29 559 535 536 íVF H02C^^'NH2 6Ρ F 30 559 535 536 A^oh HOzC^^^NHz 6Q CM 31 555 531 532 I §η0_£ O CM 0 1 6R XXl 32 543 519 520 H02C'^j^NH2 F 6S jXx 33 541 517 518 Η02σγ^Η2 OH referidos neste pedido são aqui incorporadas como referências na maior extensão possível.

Em todo o relatório descritivo e nas reivindicações que

seguem, a não ser que o contexto exija de outro modo, a palavra 'compreender', e variações tais como 'compreende', 'compreendem' e 'compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ditos mas não a 10 exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.

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Claims (99)

1. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, o composto caracterizado pelo fato de ser de fórmula (I): <formula>formula see original document page 96</formula> em que: R1 representa H, OH, OMe; R2 representa H ou Me; R3 representa H ou CONH2, R4 e R5 quer ambos representam H quer juntos representam uma ligação (i.e. C4 a C5 é uma ligação dupla); R6 representa H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF3, CH3, SH, CH2CH3 OU NRioaRlla; R7 representa H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF3, CH3, SH, CH2CH3 ou NRiobRiib; R8 representa H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF3, CH3, SH, CH2CH3 ou NRiOcR-I íõ R9 representa H, F, OH, OMe, Br, Cl, CF3, CH3, SH, CH2CH3 ou NRiOdRlld; RlOa, Riia, Riob, Ri ib, RiOc Riic Riod, Riid independentemente representam H, CH3 ou CH2CH3; contudo com a condição de que: (i) quando R6 representa H, R7 representa OH e R8 representa OH então R9 não representa H; (ii) quando R7 representa OH, R8 representa H e R9 representam H, então R6 não representa H, OH ou OMe; e (iii) quando R7 representa OMe, R8 representam H e R9 representa H, então R6 não representa OMe.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (iv) quando R6 representa H, OH, ou OMe, R7 representa H e R8 representa H então R9 não representa OH, Cl ou NH2; e (v) quando R6 representa H, OH, ou OMe, R8 representa H e R9 representa H então R7 não representa NH2.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que: (vi) quando R6 representa H ou OH, então R7, R8 e R9 não representam todos H.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um composto de fórmula (IA) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo H3^<formula>formula see original document page 97</formula> sendo que: Ri representa H, OH, OMe; R2 representa H ou Me; R3 representa H ou CONH2; R4 e R5 quer ambos representam H quer juntos representam uma ligação (i.e. C4 a C5 é uma ligação dupla); R6 representa H, OH, OMe ou F; R7 representa H ou F; R8 representa H ou F; R9 representa H.

5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 4, caracterizado pelo fato de que R1 representa H.

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 4, caracterizado pelo fato de que Rj representa OH.

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 6, caracterizado pelo fato de que R2 representa H.

8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 7, caracterizado pelo fato de que R3 representa CONH2

9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 8, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 juntos representam uma ligação.

10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 representam cada um H.

11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 10, caracterizado pelo fato de que R6, R7 e R8 não representam todos H.

12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 10, caracterizado pelo fato de que R6, R7 e R8 todos representam H.

13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações I a 11, caracterizado pelo fato de que quando Rj representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representa H, R6 representa H e R7 representa H então R8 não representa H.

14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2 e R4 e R5 representam cada um H.

15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 4, caracterizado pelo fato de que Ri representa OH, R2 representa H e R3 representa CONH2 e R4 e R5 representam cada um H.

16. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que R6 representa H ou F.

17. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e 16, caracterizado pelo fato de que R7 representa H ou F.

18. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1alOel 6, caracterizado pelo fato de que R7 representa OH.

19. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1al0el6al8, caracterizado pelo fato de que R8 representa H ou F.

20. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1al0el6al9, caracterizado pelo fato de que R9 representa H.

21. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a IOe 16a 20, caracterizado pelo fato de que Ri0a, Ri ia, Riob, Riib5 Rioc> Riic Riod, Riid representam H.

22. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que Ri representa H, R2 representa H e R3 representa CONH2 e R4 e R5 representam cada um H e R6 representa OH.

23. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4, R5, R65R7 e R8 representam cada um H.

24. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa OH e R7 e R8 representam cada um H.

25. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa F e R7 e R8 representam cada um H.

26. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Rj representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa F e R7 e R8 representam cada um H.

27. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R1 representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa H, R7 representa F e R8 representa H,

28. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Rj representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa OH, R7 representa F e R8 representa H,

29. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R1 representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 representa H, R7 representa F e R8 representa H.

30. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 e R7 representam cada um F e R8 representa H,

31. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R1 representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6 e R7 representam cada um F e R8 representa H.

32. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam cada um H, R6, R7 e R8 representam cada um F,

33. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser <formula>formula see original document page101</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

34. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser selecionado de <formula>formula see original document page101</formula> <formula>formula see original document page 102</formula> <formula>formula see original document page103</formula> <formula>formula see original document page 104</formula> e sais farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos mesmos.

35. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado de <formula>formula see original document page 104</formula> <formula>formula see original document page105</formula> e sais farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos mesmos.

36. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado de <formula>formula see original document page 106</formula> <formula>formula see original document page 107</formula> <formula>formula see original document page108</formula> <formula>formula see original document page 109</formula> <formula>formula see original document page 110</formula> e sais farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos mesmos.

37. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado de compostos 28, 29, 30, 31, 32, 36 e 37 como mostrado em Figura 4 e sais farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos mesmos.

38. Método para preparar um composto sendo um análogo de ansamicina, caracterizado pelo fato de compreender: a) proporcionar uma cepa que produz uma ansamicina ou um seu análogo quando cultivada sob condições apropriadas b) alimentar uma unidade iniciadora que não é AHBA à dita cepa de tal modo que a unidade iniciadora seja incorporada no dito análogo de ansamicina. c) cultivar dita cepa sob condições adequadas para a produção de um análogo de ansamicina; e d) opcionalmente isolar os compostos produzidos.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora alimentada em etapa (b) não é ácido 3- amino-benzóico.

40. Método de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora alimentada em etapa (b) não é 3,5-diamino-benzóico, ácido 3-amino-4-hidróxi-benzóico ou ácido 3- amino-4-cloro-benzóico.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações38 até reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a cepa de a) é distinguida por uma cepa na qual um ou mais genes de biossíntese de AHBA têm sido deletados ou inativados

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações38 até reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a cepa de a) é mutada para diminuir a eficiência de biossíntese de AHBA.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações38 a 40 ou reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que as condições de etapa c) são tais que a eficiência da biossíntese de AHBA é sub-óptima.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que AHBA é produzido pela cepa em um nível que contudo permite incorporação da unidade iniciadora não-natural alimentada.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a quantidade de unidade iniciadora não-natural alimentada incorporada é >20%, preferivelmente >50% da incorporação da unidade iniciadora total.

46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações38 a 45, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora é selecionada de <formula>formula see original document page 112</formula> sendo que R6, R7, R8 e R9 são como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 37; ou um seu análogo na qual o grupo ácido é derivado.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que R6, R7, R8 e R9 não representam todos H.

48. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que R6, R7, R8 e R9 todos representam H.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 48, caracterizado pelo fato de que a cepa é uma cepa produtora de ansamicina e a unidade iniciadora é selecionada de tal modo que a cepa produza um análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora é selecionada de tal modo que a cepa produza um análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina que está opcionalmente substituído com flúor.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora é selecionada de tal modo que a cepa produza um análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina que está substituído com flúor.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que a cepa é uma cepa produtora de ansamicina e a unidade iniciadora é selecionada de tal modo que a cepa produza um análogo de ansamicina que não está substituído em posições 18 ou 21 do anel benzeno.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 52, caracterizado pelo fato de que (i) adicionalmente compreende a etapa de submeter o produto de etapa (d) a um processo de modificação química ou biotransformação opcionalmente seguido pela etapa de isolar os compostos resultantes ou (ii) adicionalmente compreende a etapa de submeter o produto de etapa (c) a um processo de modificação química ou biotransformação antes de etapa (d).

54. Método para gerar análogos de ansamicina, dito método caracterizado pelo fato de compreender: a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produz uma ansamicina ou um seu análogo quando cultivada sob condições apropriadas na qual opcionalmente um ou mais genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados e/ou um ou mais genes de biossíntese de unidade iniciadora têm sido deletados ou inativados; b) alimentar uma unidade iniciadora não-natural à dita cepa c) cultivar dita cepa hospedeira modificada sob condições adequadas para a produção de análogos de ansamicina; e d) opcionalmente isolar os compostos produzidos.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não é 3,5-diamino benzóico, ácido 3- amino-4-hidróxi-benzóico ou ácido 3-amino-4-cloro-benzóico.

56. Método de acordo com a reivindicação 54 ou reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não é ácido 3-amino- benzóico.

57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 56, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora alimentada é um ácido iniciador.

58. Análogo de ansamicina, caracterizado pelo fato de ser obtenível pelo processo como definido nas reivindicações 38 a 57.

59. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um análogo de ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37 e 58, junto com um ou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

60. Análogo de ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37 e 58, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.

61. Uso de um análogo de ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37 e 58, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento de câncer, malignidades de célula B, malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes e/ou como um pré-tratamento profilático de câncer.

62. Análogo de ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37 e 58, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento para o tratamento de câncer, malignidades de célula B, malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes e/ou como um pré- tratamento profilático de câncer.

63. Método para tratar uma doença sendo câncer, malignidades de célula B, malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes ou um pré-tratamento profilático para câncer, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz do análogo de ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37 e 58.

64. Análogo de ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição, uso ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, caracterizadofa) pelo fato de que o análogo de ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado em combinação com outro tratamento.

65. Análogo de ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição, uso ou método de acordo com a reivindicação 64, caracterizadofa) pelo fato de que o outro tratamento é selecionado do grupo consistindo de: bleomicina, capecitabina, cisplatina, citarabina, ciclofosfamida, doxorabicina, 5-fluorouracil, gencitabina, leucovorina, metotrexato, mitoxantona, os taxanos incluindo paclitaxel e docetaxel, vincristina, vimblastina e vinorelbina; as terapias hormonais, anastrozol, goserelina, acetato de megestrol, prenisona, tamoxifeno e toremifeno; as terapias com anticorpo monoclonal tais como trastuzumab (ani-Her2), cetuximab (ant-EGFR) e bevacizumab (anti-VEGF); e inibidores de proteína cinsase imatinib, dasatinib, gefitinib, erlotinib, lapatinib, temsirolimus; os inibidores de proteassomo tal como bortezomib; inibidores de histona-desacetilase (HDAC) tal como vorinostat; inibidores de angiogênese tal como sunitinib, sorafenib, lenalidomida, radioterapia e cirurgia

66. Método para produzir um composto sendo um análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37 e 58, dito método caracterizado pelo fato de compreender: a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produz uma ansamicina ou um seu análogo quando cultivada sob condições apropriadas b) alimentar uma unidade iniciadora não-natural à dita cepa c) cultivar dita cepa hospedeira sob condições adequadas para a produção de análogos de 18,21-didesóxi-ansamicina; e d) opcionalmente isolar os compostos produzidos.

67. Método para produzir um composto sendo um análogo de18,21-didesóxi-ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 66, dito método caracterizado pelo fato de compreender: a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produz geldanamicina ou um seu análogo quando cultivada sob condições apropriadas b) alimentar uma unidade iniciadora não-natural à dita cepa c) cultivar dita cepa hospedeira sob condições adequadas para a produção de análogos de 18,21-didesóxi-ansamicina; e d) opcionalmente isolar os compostos produzidos.

68. Método de acordo com a reivindicação 66 ou 67, caracterizado pelo fato de que o método adicionalmente compreende a etapa de: e) deletar ou inativar um ou mais dos genes de biossíntese de unidade iniciadora, ou um seu homólogo, dita etapa normalmente ocorrendo antes de etapa c).

69. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 68, caracterizado pelo fato de que o método adicionalmente compreende a etapa de: f) deletar ou inativar um ou mais genes pós-PKS, dita etapa normalmente ocorrendo antes de etapa c).

70. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 69, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não-natural de etapa b) é ácido 3-amino-benzóico

71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 69, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não-natural de etapa b) é ácido 5-amino-2-fluoro-benzóico.

72. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 69, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não-natural de etapa b) é ácido 5-amino-3-fluoro-benzóico.

73. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 69, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não-natural de etapa b) é ácido 5-amino-2,3-di-fluoro-benzóico.

74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 69, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não-natural de etapa b) é ácido 5-amino-2,3,6-tri-fluoro-benzóico.

75. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 74, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa produtora de ansamicina.

76. Método de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa produtora de geldanamicina.

77. Método de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa produtora de herbimicina.

78. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 77, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina na qual um ou mais dos genes de biossíntese de unidade iniciadora têm sido deletados ou inativados.

79. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de geldanamicina na qual um ou mais dos genes de biossíntese de unidade iniciadora têm sido deletados ou inativados.

80. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações .66 a 79, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina na qual um ou mais dos genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

81. Método de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de geldanamicina na qual um ou mais dos genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

82. Método de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de herbimicina na qual um ou mais dos genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

83. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações66 a 82, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina na qual o homólogo de gdmM e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

84. Método de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de geldanamicina na qual gdmM e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

85. Método de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de herbimicina na qual o homólogo de gdmM e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

86. Método de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de ansamicina na qual o homólogo de gdmM tem sido deletado ou inativado.

87. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de geldanamicina na qual gdmM tem sido deletado ou inativado.

88. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que em etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de herbimicina na qual o homólogo de gdmM tem sido deletado ou inativado.

89. Cepa engenheirada, caracterizada pelo fato de estar baseada em uma cepa produtora de ansamicina na qual gdmM ou um seu homólogo e um ou mais dos genes biossintéticos de unidade iniciadora e opcionalmente outros genes pós-PKS têm sido deletados ou inativados.

90. Cepa de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que todos os genes do agrupamento ahba-B de S. hygroscopicus AM3602, ou homólogo em outras cepas, têm sido deletados ou inativados.

91. Cepa de acordo com a reivindicação 89 ou reivindicação90, caracterizada pelo fato de ser uma cepa produtora de geldanamicina.

92. Cepa de acordo com a reivindicação 89 ou reivindicação90, caracterizada pelo fato de ser uma cepa produtora de herbimicina.

93. Cepa de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que gdmO está deletado ou inativado.

94. Cepa de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que hbmO está deletado ou inativado.

95. Cepa engenheirada de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 94, caracterizada pelo fato de que cepa produtora de ansamicina é um estreptomiceto.

96. Cepa engenheirada de acordo com a reivindicação 95, caracterizada pelo fato de que a cepa é uma cepa produtora de geldanamicina que é Streptomyces hygroscopicus subsp. geldanus NRRL3602 ou Streptomyces sp. DSM4137 ou Streptomyces violaceusniger DSM40699.

97. Uso de uma cepa engenheirada como definido em qualquer uma das reivindicações 89 a 96, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um análogo de ansamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

98. Uso de uma cepa engenheirada como definido na reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que o análogo de ansamicina é um análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina.

99. Uso de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o análogo de 18,21-didesóxi-ansamicina é definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 37. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Biotica Technology Limited Martin, Christine <120> NOVOS COMPOSTOS E MÉTODOS PARA SUA PRODUÇÃO <130> BOA-P132PC <150> GB 0622342.4 <151 > 2006-11-09 <150> GB 0720875.4 <151 > 2007-10-24 <160> 19 <170> Patentin version 3.4 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Sequenciaartificiai <220> <223> Inieiador <400> 1 ggtctagagg tcagtgcccc cgcgtaccgt cgt 33 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Sequenciaartifieial <220> <223> Inieiador <400> 2 <formula>formula see original document page122</formula> <212> DNA <213> Sequenciaartificial <220> <223> Inieiador <400> 6 gtcgtcggct aegggceggt ggggcagctg etgt <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Sequenciaartifieial <220> <223> Inieiador <400> 7 gtcggtggac tgccctgcge ctgatcgccc tgcgc <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Sequenciaartifieial <220> <223> Inieiador <400> 8 ggccggtggt gctgceegag gacggggagc tgcgg <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Sequenciaartifieial <220> <223> Inieiador <formula>formula see original document page124</formula> <223> mbc? codificador de função de proteína desconhecida, biossíntese de AHBA (gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <222> (20330)..(40657) <223> mbcAI codificador de PKS <220> <221> gene <222> (40654)..(50859) <223> mbcAI I codificador de PKS <220> <221> gene <222> (50867)..(62491) <223> mbcAlil codificador de PKS <220> <221> gene <222> (62500)..(63276) <223> mbcF codificador de função de amida sintase <220> <221> gene <222> (63281)..(64852) <223> mbcM codificador de função de C21 monooxigenase <220> <221> gene <222> (64899)..(65696) <223> PH codificador de fosfatase (o gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <222> (65693)..(66853) <223> OX codificador de oxidorreductase (o gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <222> (66891 )..(68057) <223> Ahs codificador de AHBA sintase (o gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <222> (68301 )..(68732) <223> Adh codificador de ADHQ desidratase <220> <221> gene <222> (68690)..(69661) <223> AHk codificador de AHBA cinase (o gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <222> (70185)..(72194) <223> mbcN codificador de função de carbamoil-transferase(o gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <222> (72248)..(73339) <223> mbcH codificador da rota de metóxi-malonil ACP (o gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <222> (73336)..(74493) <223> mbcl codificador da função de rota de metóxi-malonil ACP (o gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <222> (74490)..(74765) <223> mbcJ codificador da função de rota de metóxi-malonil ACP (o gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <222> (74762)..(75628) <223> mi>cK codificador da rota de metóxi-malonil ACP (o gene é codificado pela fita de DNA complementar) <220> <221> gene <formula>formula see original document page127</formula> cgccaccccg ccaccgctcc cccggccgaa cgcgctgccc gcgccggtga cgggcttcct 600 cggccgggac gccgacctcg cccgcgtcgc cgacctgctg gccgccgggc ggctggtcac 660 cgtcgtcggg cccggcgggg tgggcaagac ccggctggcc gtggaggcgc tgcgccggga 720 ccgggacgcg ctgctggtgg acctcgcgcc ggtcgccgag ccctcggagg tcgtcgccgc 780 cgtgctcgcc gggatcgggc tgcgcggcga ccgcgaccgg ccgggcgggg acgcgacggc 840 gctgctggcc gccgagctgg cggcgcgcag gtcggtgctg ctgctggaca actgcgagca 900 cctggtcgac gccgtggccc acctggtcgc gctcctgctc ccccgctgcc ccgagctgcg 960 cgtgctcgcc accagccggg aacccctggc ggtcgacggg gaggcgctgg tcccgctggg 1020 gccgctcgcg ctgcccggaa tcggggacgg gcttgacgcc gcggtcggca cggcctcggt 1080 gcggttgttc gcccaacggg cgtcggcggt gcgccccggt ttcgccgtcg acgccacgac 1140 gctgccggac gtggtgcgcc tggtgcgggc gctggacggg ctgccgctgg cgctggagct 1200 ggccgccgcc cggttgcgcg ccctgccgct gcccgacctg gtggccgggt tgtcggcgcg 1260 gttccgcctg ctggcgggcg ggaaccgggc cgcgccgccc cggcaccgca cgctgcgcgc 1320 ggtgatcgcg tggagctggg acctgctgga cgggcccgag cgggccgtgg ccgagcggat 1380 ctccgtgctg cccggcgggg tcaccccgga gtcggccgcc gccgtctgcg cgggcgccgt 1440 gcccgccgac gaggtgcccg aactgctggc cgcgctggtc gaccggtcgc tgctgagcct 1500 ggtcgggggt cggcggcgga tgctggagac ggtgcgcgcg tacggggtcg agcgcctggc 1560 cgccgccggg gacttgagcg cggtccgcga cctggccgcc gcgcacgtgg cgggggtgct 1620 ggcggggcag gacgcggtgc tgcgcgggcc ggggcagcgc gcggcggtgg cggcgatcgg 1680 cgcggagcac gacaacgcgg tggccgcgct gcaccaccgg tgcgccaccg gggacgcgga 1740 cggggcgctc gcgctggcgc tgtcgctggt ctggtactgg caggtgttcg gccgccagtc 1800 cgagggcgcg cactggctcg ggcgggcgct ggcggtgccc ggcgggccgt ccccggagcg 1860 ggactgcgcg cgggccgccc acctgctcgg cctggccgac ggcgggcacg gggtgggtga 1920 tcgcggggag gtgggggcgc tcgcggaccg ggtgctggcg caccgggggc tccccggtca 1980 cctgcgggtg ctcggggcgg tcctgctgtt cctgctgggg cgcggcgagg gggtgttccg 2040 ggagctgggc gcgggcggcg ggtggttgtc cgggctggcg cacctgttcc tggccgagct 2100 ggcggagaac gcgggcgagc tggaccgggc gcgcgggcac gcggaggtgt ccctggaccg 2160 gttccgggcg gccggggacg ggtggggcgt ggcgggggtg ctgccggtgc gggcgcgggc 2220 gcggcggtac gacgacctgg acgggacgtg ggcggacctt cgggaggcgc gggcgctgga 2280 gggggagttc ggggcgctga gccccggtga ccgggtgcgg gcggacctgc ggtgggtcga 2340 cctgcacgag cggcgcggtg acagcggggc ggcgctggag gtgctggccg cggcccgtgc 2400 tcggggggag caggtcgcgg tggtggacgc gcgggaggcc gcgctgcggg tgcggctcgg 2460 ggacctgggg cgggcgggtg agctgctggc cggggtgggt ggggcggtgg gcgacctggc 2520 gcgggccgcg tatcgggtgg cctcggggga cctggcgggt gcggagcggg cgttgcggcg 2580 ggcgcgggtQ gtggcggctg cgagcgggga gctgcccgcg ctggccccgg tggcggtggg 2640 ggcggcggcg ctggagcagg cgcgggggcg gtgggcgggg tcgggggtgc tgctcgggac 2700 ggccgcgcgg gtgcggggcg cgcacgaccg caccgacccc ctggtgcgcg agctggtcga 2760 ccgggggcgg gcggcggtgg gcgggagcgc gttcgcggcg gcgtacgcgc gggggtggga 2820 ggcggagcgg gacgtggcgg cggcgttcgt gctctgagcg ccgggatcgg gcgggcgggg 2880 tcaggcgggc ggggtcatgt gggcggggtc aggcgggcca ggtcacacgt ccagggaccc 2940 cgcccagtcc gcgatcgtcc ggacttcggc ctgcgtcggg aagaccttct cggtgagcac 3000 <formula>formula see original document page130</formula> cggatctgga cgccgtcgag ccggtggcac gtcggcgacc tggcctggca gcgcaaccag 4320 cacaccgggc gcgaggccga gtggccgacc gcgctgtggg aggcgggcgg cgaggtggtg 4380 gcgtgggggt gggccgagct gccgggtgag ctggcgctgc tggtcgaccc cgcccggccg 4440 gagcttgcgg gggcggtgct cgactggttc gcgggcgtgg ccaccgcgcc ccggcggtcg 4500 gtcaccgtgc tggacgccga accgcacctg gtcgccgcgc tggaggctcg cgggtacgag 4560 cggctgggcg ggccgcactt ccggcactcg gtgcgcgcgc tggacgacct gccgacgccc 4620 gaactgcccg ccgggtaccg ggtccgcgcc gtgcggggcg aggaggacgt ggcggcgcgg 4680 gtcgcggcgc accgggcggc ctggtggccg tcgcgggtca ccgaggagag ctaccgggcg 4740 gtgatggggg cgtggccgta ccggccgggg ctggactggg tggtggaggg gccggacggg 4800 cggttcgcgg ccacctgcct gatctggttc gacgagcgca acggcgtggg cgagctggaa 4860 ccggtcgggg tcgaccccgg tctgcggcgg cgcgggctgg ggcgggcggt gtgcctggcg 4920 gcgctgggcg cgctgcgcga ggcgggcggg cgggcggcgg tggtgtaccc gctgcacggg 4980 caccccgacc accccgcgcc cgcgccgctg taccgggggc tggggttccg cgagcacgcc 5040 cgcacgatca ccttcaccgc gctggaggcg cgcgggtagc agcggccggg cggggcgagc 5100 ggacccggtc gacgagcggc tccgctgtcg gagcggtcgt cccagcgcgt ggacaccagt 5160 gccacgacca gaccgcgccc cgcttcgcgt ggtcggctcg ggggtcgacc gcggtgaggc 5220 tctcgccggg gtgggtgaac cacgtcctgg cgatggcctg caccgcgagc accgggtgcc 5280 gcccgtggcg ctggacgtca ccgacgcagc cgccgtcgac cgggccgggc cggccgcgtt 5340 cggccgttgc gccgcgccgg ccgagtccga cgccaggtgg cggccggtcc ccgggtccgc 5400 ctggaactga ccccgccggc ctccccgccc gcccgtccgg ccgggcgccg aacccgcctc 5460 <formula>formula see original document page132</formula> <formula>formula see original document page133</formula> tccggtgggt gtggtcacgg ggtggtgagg tcgaagcggc gggcggtgac ggagccgccg 7980 agcgcggcgg tggcgtggtt gaagacggcg aagcggtagc ccatgaagaa ccgccagtcg 8040 ttcttgagcg tgaacgccgg gccgaaggcg gtgaagttga cgccgtcggt gctgtaggag 8100 aaccgggcct gcctgccgtt gccggggcgg atgtcggcgt tggcgcgcaa ccagatccgg 8160 gagccgccca ggtcggcgct cgcgacctcg tagccggttc cggtggtgcg ccaggagccg 8220 tccatggtca ggccggtgac ggagacgatc cggttgcggc cgttgtcgcg cttgacgccg 8280 atccacgccg aggagtcgcg cagcacggcc agcccggtgc ggtcgccgtc gcgcatcccc 8340 gacaggtcca gttccacggt gccggtggag gtggggccct ggatgcggtg ggtgagggtg 8400 ttgcgggcgg agtacaggtc gttggtgacg gtcgcggtgg acaggcgaag gccgttgttc 8460 acgctgtact tggcggtgtc cgggttgtgg ttccactccc actgcgggcc gagcgcggcg 8520 ccggagaagg tgtcggcgcc gatcatgggt ttgacctggc gcgggggcgc gggcaggttc 8580 ggcttcgggt aggtcgcgcc ccagccgccg ttgacggtgg tgacgcgcgg ccagccgtcc 8640 gaggtccagg tgatcggggc gagcaccggc acgcgcccgc cggggtaggc gtcgacgaac 8700 gccaggtagt gccagtcgcc gttctgggtc tgcaccaggc cgccctggtg cggcactccc 8760 ccgccctgga tcggcgaggg caggtcgagc agcacctgct ggatcgagta cgggccgaac 8820 gggctggacg acttgagcac gtactggccg ttcgcgggcc tggtgagcca gatgtagtag 8880 ttgccgccgc gcttgtagaa gcgcgcccct tcgagggtgc cgatgttcga gggggtctgg 8940 aacacctgct gggagcggac ctccgacttc ccgtcggcgg agagctgggc gacgctgatg 9000 ctggtgttgc cgtaggcgac gtacagggtg tcgtcgtcgt ccacgagcat cccggcgtcg 9060 tagtagcact tgttgatggt ggtgtgcttg gaccactggc cgtcgacggc ggtcgcggtg 9120 tacaggtgcg tctgggcgaa gtcgacgcag ccgccccagt agaaggtgcg gttgctcttg 9180 cggtgcgcca ggaacgacgc ccagatgccg 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