KR101097850B1 - 젤다나마이신 생합성 조절유전자 변이주 및 이를 이용한 젤다나마이신 생산방법 - Google Patents

젤다나마이신 생합성 조절유전자 변이주 및 이를 이용한 젤다나마이신 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젤다나마이신(geldanamycin) 생합성 조절유전자 변이주 및 이를 이용한 젤다나마이신 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 열충격 단백질 저해활성을 가진 대사산물인 젤다나마이신을 생산하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주에서 젤다나마이신 생합성 조절에 관여하는 유전자들 중 생산량에 관여하는 유전자인 orf10 또는 gel19를 비활성시킨 균주, 및 상기 orf10 유전자를 비활성시킨 균주를 배양하여 젤다나마이신을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 젤다나마이신은 Hsp90 억제 작용을 나타내어 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 항염증제 또는 항암제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
젤다나마이신, 스트렙토마이세스, 조절유전자, 균주개량.

Description

젤다나마이신 생합성 조절유전자 변이주 및 이를 이용한 젤다나마이신 생산방법{Modified microorganisms of geldanamycin biosynthesis regulator genes and the method for producing geldanamycin using the same}
본 발명은 젤다나마이신(geldanamycin) 생산량 변화 균주 개발에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주의 젤다나마이신 생합성 조절 유전자인 orf10 또는 gel19를 비활성시킨 균주, 상기 orf10 유전자를 비활성시킨 균주를 이용하여 젤다나마이신 대량으로 생산하는 방법, 및 상기 gel19 유전자를 비활성시킨 균주를 이용하여 젤다나마이신 생산을 제거하는 방법에 관한 것이다.
젤다나마이신은 허비마이신(herbimycin), 멕벡신(macbecin) 및 레브라스타틴(reblastatin)과 함께 3-아미노-5-하이드록시벤조산(3-amino-5-hydroxybenzoic acid; AHBA)을 최초 전구체로 이용하여 생합성되는 폴리케타이드(polyketide) 골격 구조를 가진 화합물이다. 상기한 화합물들은 1970년에서 2000년 사이에 항생제, 항진균제, 항바이러스제 및 항암제로서 그 기능이 확인되었다(DeBoer C. et al. J. Antibiotic., 23(9) 442-447, 1970; Omura, S. et al., J. Antibiotic. 32, 255-261, 1979; Muroi, M. et. al., J. Antibiotic. 33, 205-212, 1980; Neckers L. et al.,Invest. New Drugs 17, 361-373, 1999; Piper P.W., Curr. Opin. Investing Drugs 2(11) 1606-1610, 2001).
젤다나마이신은 1994년에 Neckers 등에 의해 샤페론(chaperone) 단백질 활성을 가진 열충격 단백질 90(Heat shock protein 90; Hsp90)의 에티피(ATP) 결합자리에 결합하는 것이 확인되었다(Whitesell L. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8324-8328, 1994; Prodromou C. et. al. Cell , 90, 65-75, 1997). 이러한 발견으로 인하여 기존의 젤다나마이신이 암 발생 단백질(oncogenic protein) 기능을 갖는 타이로신 키나아제(tyrosin kinase)의 효소활성을 억제하여 항암 활성을 나타내는 것이 아니라, 타이로신 키나아제를 포함한 다양한 종류의 Hsp90의 대상 단백질(client protein)의 구조적 안전성에 중요한 Hsp90의 기능을 저해함으로서 상기 대상 단백질들의 안정성이 저해되어 나타나는 약리효능인 것으로 확인되었다(Walter S. and Buchner J., Angew. Chem. Int. Ed. 41, 1098-1113, 2002; Piper P. W., Current opinion in Investigational Drugs 2, 1606~1610, 2001).
젤다나마이신은 거대 환형 락탐 구조로 리파마이신 및 안사미토신과 같은 안사마이신계 항생물질에 속하는 것으로, 이런 부류의 화합물들의 생합성은 상기와 같이 AHBA를 출발 단위로 하여, 아세테이트, 프로피오네이트 및 글리콜레이트와 같은 골격연장 전구체의 연속적 부가에 의해 폴리케타이드 기본 골격을 형성한 후에, 기본골격을 수식하는 부가적인 반응을 거쳐서 생합성된다.
젤다나마이신의 생합성 경로는, 이를 생산하는 미생물로부터 클론닝한 생합성 관련 유전자의 염기서열의 유사성 분석에 의한 예측과 방사성동위원소 14C나 3H로 표지된 전구체로 실험한 결과에 의하여, 젤다나마이신 생합성은 초기 폴리케타이드골격이 만들어진 후에 이에 O-카르바모일화, 하이드록실화, O-메틸화 및 산화반응을 거쳐 완성될 것이라고 제안되었다. 그러나, 염기서열을 결정하고, 염기서열의 유사성 분석으로부터 유전자의 기능을 추정하는 것 외에, 초기 폴리케타이드를 생합성 과정과 이 과정에 관련된 유전자나 효소의 기능을 실험적으로 증명한 예는 소수에 불과하다.
이미, 제 1형 폴리케타이드 합성효소(type-I polyketide synthases, PKS) 유전자를 포함하는 젤다나마이신 생합성에 관련되는 유전자 클러스터가 다른 종의 스트렙토마이세스로부터 클로닝되고, 염기서열이 분석되었다. 예를 들어, 미국특허출원 제20040077058호는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 젤다니우스 NRRL3602(Streptomyces hygroscopicus var. geldanus NRRL3602) 균주에서 젤다나마이신 생합성 유전자 조작을 통하여 재조합 폴리케타이드 합성효소, 폴리케타이드 변형 단백질 등을 개시하고 있다. 또한, 미국특허출원 제20040077058호는 세포의 바람직하지 않은 과증식에 의한 암이나 기타 질병의 치료에 유용한 벤조퀴논 안사 마이신 유사화합물과 그 제조방법에 관하여 개시하고 있다.
젤다나마이신 자체는 간독성 등의 문제로 임상 실험에 실패한 후, 그 유도체인 17-알릴 아미노 겔다나마이신(17-AAG)이 미국 식약청 임상 2상을 진행하고 있으며, 프로테아제 저해제와의 병용 투여 방법으로 임상 3상을 진행하고 있어, 조만간 신약 허가를 획득할 가능성이 높다. 따라서 그 전구체인 젤다나마이신의 생산성은 향후 17-알릴 아미노 겔다나마이신의 신약 허가 여부에 따라 중요한 생산공정상의 경제성에 영향을 줄 것으로 고려되고 있다.
지금까지, 젤다나마이신과 관련하여 한국 공개특허 제10-2006-0014532호는 젤다나마이신 유도체 및 그 제조 방법을 개시하고 있고, 한국 등록특허 제10-0860502호는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주의 젤다나마이신 탄소 15번의 수식에 관여하는 모듈 1의 디하드라타제의 DH 도메인을 암호화하는 유전자를 유전자 조작하여 젤다나마이신 유도체의 제조 방법을 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0861697호는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스 균주의 napK 유전자를 비활성시켜 젤다나마이신 유도체의 제조 방법을 개시하고 있다. 그러나, 젤다나마이신의 생합성 조절에 관여하는 유전자들 중 생산량에 관여하는 유전자의 변형을 통해 젤다나마이신의 생산성이 변형된 균주에 대한 내용은 밝혀지지 않았다.
이에, 본 발명자들은 젤다나마이신의 생산량을 증가시키는 균주를 개발하고자 연구하던 중, 젤다나마이신을 생산하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주에서 젤다나마이신 생합성 조절에 관여하는 유전자들 중 생산량에 관여하는 유전자인 orf10 또는 gel19 유전자를 비활성시킨 결과, orf10 유전자-비활성 변이주에서 젤다나마이신 생산이 야생 균주에 비해 약 4배 이상 증가되었으며, gel19 유전자-비활성 변이주에서 젤다나마이신 생산이 제거되었음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 젤다나마이신 생합성 조절 유전자인 orf10 비활성 변이주, 젤다나마이신 생합성 조절 유전자인 gel19 비활성 변이주, 상기 젤다나마이신 생합성 조절 유전자 변이주의 제조 방법, 및 상기 orf10 비활성 변이주로부터 젤다나마이신 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 gel19 유전자가 변이되어 불활성화된 gel19 유전자 비활성 컨스트럭트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 gel19 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)를 상기 gel19 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 삽입시켜 젤다나마이신(geldanamycin)이 녹아웃된 형질전환 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 orf10 유전자가 변이되어 불활성화된 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)를 상기 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 삽입시켜 젤다나마이신이 생산이 야생 균주에 비해 증가한 형질전환 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트 또는 gel19 유전자 비활성 컨스트럭트를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 재조합 벡터를 젤다나마이신을 생산하는 숙주세포에 삽입시켜 형질전환 변이주를 제조하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 형질전환 변이주 중 항생제에 대한 내성 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 젤다나마이신 생합성 조절유전자 변이주 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 orf10 유전자 비활성 변이주를 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양한 배양액으로부터 젤다나마이신을 수득하는 단계를 포함하는, 젤다나마이신 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠 스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주의 젤다나마이신(geldanamycin) 생합성 조절유전자를 조작한 변이주를 제조함으로써, 상기 균주를 이용하여 젤다나마이신 생상성을 현저히 향상시킬 수 있으며, 상기 생산되는 젤다나마이신은 Hsp90 억제 작용을 나타내어 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 항염증제 또는 항암제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은
1) 젤다나마이신(geldanamycin) 생합성 조절유전자인 gel19 또는 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 재조합 벡터를 젤다나마이신을 생산하는 숙주세포에 삽입시켜 형질전환 변이주를 제조하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 형질전환 변이주 중 항생제에 대한 내성 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 젤다나마이신 생합성 조절유전자 변이주 제조 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 젤다나마이신 생합성 조절유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 gel19 유전자 또는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 orf10 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 gel19 유전자 서열과 70% 이상 상동하며 gel19 단백질의 생물학적 기능과 동일한 기능을 부여하는 유전자 또는 상기 orf10 유전자 서열과 70% 이상 상동하며 orf10 단백질의 생물학적 기능과 동일한 기능을 부여하는 유전자라면 본 발명에서 이용 가능하다.
상기 비활성 컨스트럭트는 gel19 또는 orf10 유전자 내에 항생제 내성 유전자를 삽입하여 제작하는 것이 바람직하며, 카나마이신(kanamycin)과 같은 항생제 내성 유전자의 삽입이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 공지되어 유용하게 조작할 수 있는 항생제 내성 유전자이면 모두 이용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 재조합 벡터는 상기 비활성 컨스트럭트를 미리 제한효소(restriction enzyme) EcoRI/HindIII로 잘려진 벡터 pKC1139(Bierman, M. et. al., (1992) Gene 116, 43-49)에 접합시켜 제조한 재조합 벡터 pKC-o10인 것이 바람직하나 이에 한정된 것이 아니다. 골격 벡터로는 pKC1139인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 공지된 다른 벡터를 이용하여도 무방하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 숙주세포는 gel19 또는 orf10 유전자, 또는 이와 70% 이상의 상동성을 가지며 젤다나마이신 활성을 갖는 유전자를 포함한 젤다나마이신 생합성에 결정적 역할을 하는 유전자군을 포함하는 공지의 젤다나마이신 생산 균주가 사용될 수 있다. 상기 젤다나마이신 생산 균주로는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus), 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 17997(Streptomyces hygroscopicus 17997), 스트렙토마이세스 하이그로프코피쿠스 변이종 젤다누스 NRRL 3602(Streptomyces hygroscopicus var. geldanus NRRL 3602) 또는 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스 EF-76(Streptomyces melanosporofaciens EF-76)인 것이 바람직하고, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 공지된 젤다마이신 생산 균주라면 모두 이용 가능하다.
본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 제작된 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜서 변이주를 만들었으며, 이를 각각 gel19 유전자 비활성 변이주를 '스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨19(Streptomyces hygroscopicus AC19)'라 명명하고 2009년 2월 19일자로 KCTC에 기탁하였고(기탁번호: KCTC11469BP), orf10 유전자 비활성 변이주를 '스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨20(Streptomyces hygroscopicus AC20)'이라 명명하고 2009년 2월 19일자로 KCTC에 기탁하였다(기탁번호: KCTC11470BP).
본 발명자들은 상기와 같이 제조한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨19(Streptomyces hygroscopicus AC19) 변이주의 젤다나마이신 생산량을 알아보기 위해, 상기 변이주를 배양한 후, 배양 추출물을 HPLC 분석을 하였다. 그 결과, 본 발명의 AC19 균주는 젤다나마이신이 생산되지 않는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 상기와 같이 제조한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨20(Streptomyces hygroscopicus AC20) 변이주의 젤다나마이신 생산량을 알아보 기 위해, 상기 변이주를 배양한 후, 배양 추출물을 HPLC 분석을 하였다. 그 결과, 본 발명의 AC20 균주는 야생 균주에 비해 젤다나마이신 생산량이 약 4배 정도 높은 경향을 나타내었다.
따라서, 젤다나마이신 생합성 조절 유전자 중 생산량에 관여하는 유전자인 orf10 또는 gel19를 비활성시킨 균주를 제조함으로써 젤다마이신 생합성 관련 유전자의 기능 분석 및 젤다나마이신 생산량 향상에 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 gel19 유전자가 변이되어 불활성화된 gel19 유전자 비활성 컨스트럭트를 제공한다.
상기 비활성 컨스트럭트는 gel19 유전자 내에 항생제 내성 유전자를 삽입하여 제작하는 것이 바람직하며, 상기 항생제 내성 유전자는 카나마이신(kanamycin)내성 유전자인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 gel19 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터의 골격 벡터로는 pKC1139인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 공지된 다른 벡터를 이용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)를 상기 gel19 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 삽입시켜 젤다나마이신(geldanamycin)이 녹아웃된 형질전환 변이주를 제공한다.
본 발명자들은 상기 gel19 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스 균주에 형질전환시켜서 변이주를 만들었으며, 이를 '스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨19(Streptomyces hygroscopicus AC19)'라 명명하고 2009년 2월 19일자로 KCTC에 기탁하였다(기탁번호: KCTC11469BP).
본 발명자들은 상기 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨19(Streptomyces hygroscopicus AC19) 변이주의 젤다나마이신 생산량을 알아보기 위해, 상기 변이주를 배양한 후, 배양 추출물을 HPLC 분석을 하였다. 그 결과, 본 발명의 AC19 균주는 젤다나마이신이 생산되지 않는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨19(Streptomyces hygroscopicus AC19)는 조절 유전자의 기능 제거로 젤다나마이신을 생산하지 않으므로 이를 이용해 젤다나마이신 생합성 조절 기작 연구의 호스트 균주로 사용하거나 다른 폴리케타이드 생산 연구 및 외래 유전자에 의한 젤다나마이신 생산에 작용기작 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 orf10 유전자가 변이되어 불활성화된 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 제공한다.
상기 비활성 컨스트럭트는 orf10 유전자 내에 항생제 내성 유전자를 삽입하 여 제작하는 것이 바람직하며, 상기 항생제 내성 유전자는 카나마이신(kanamycin)내성 유전자인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터의 골격 벡터로는 pKC1139인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 공지된 다른 벡터를 이용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)를 상기 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 삽입시켜 젤다나마이신이 생산이 야생 균주에 비해 증가한 형질전환 변이주를 제공한다.
본 발명자들은 상기 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스 균주에 형질전환시켜서 변이주를 만들었으며, 이를 '스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨20(Streptomyces hygroscopicus AC20)'이라 명명하고 2009년 2월 19일자로 KCTC에 기탁하였다(기탁번호: KCTC11470BP).
본 발명자들은 상기와 같이 제조한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨20(Streptomyces hygroscopicus AC20) 변이주의 젤다나마이신 생산량을 알아보기 위해, 상기 변이주를 배양한 후, 배양 추출물을 HPLC 분석을 하였다. 그 결과, 본 발명의 AC20 균주는 야생 균주에 비해 젤다나마이신 생산량이 약 4배 정도 높은 경향을 나타내었다.
따라서 본 발명의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨20(Streptomyces hygroscopicus AC20) 변이주는 젤다나마이신 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨20 변이주를 이용하여 젤다나마이신 대량 생산 방법을 제공한다.
상기 방법은,
1) orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 재조합 벡터를 젤다나마이신을 생산하는 숙주세포에 형질전환시켜 재조합된 변이주를 제조하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 변이주를 배양한 후, 배양액으로부터 젤다나마이신을 수득하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 orf10 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 유전자 서열과 70% 이상 상동하며 orf10 단백질의 생물학적 기능과 동일한 기능을 부여하는 유전자라면 모두 이용 가능하다. 상기 비활성 컨스트럭트는 orf10 유전자 내에 항생제 내성 유전자를 삽입하여 제작하는 것이 바람직하며, 카나마이신(kanamycin) 과 같은 항생제 내성 유전자의 삽입이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 공지되어 유용하게 조작할 수 있는 항생제 내성 유전자이면 모두 이용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 재조합 벡터의 골격 벡터로는 pKC1139인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 공지된 다른 벡터를 이용하여도 무방하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 숙주세포는 orf10 유전자 또는 이와 70% 이상의 상동성을 가지며 젤다나마이신 활성을 갖는 유전자를 포함한 젤다나마이신 생합성에 결정적 역할을 하는 유전자군을 포함하는 공지의 젤다나마이신 생산 균주가 사용될 수 있다. 상기 젤다나마이신 생산 균주로는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 공지된 젤다마이신 생산 균주라면 모두 이용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 배양은 YEME(Yeast extract-malt extract) 배지에서 배양하는 것이 바람직하고, 25 ~ 37℃에서 3일 ~ 10일 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 젤다나마이신 수득은 상기 배양액을 에틸아세테이트로 추출하고, 여과 및 농축한 후, 에틸아세테이트와 물을 이용하여 분획하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 상기 방법의 젤다나마이신 생산량을 야생 균주를 이용한 방법의 젤다나마이신 생산량과 비교하였다. 그 결과, 상기 생산 방법이 젤다나마이신 생산량이 약 4배 정도 많이 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 방법을 통해 젤다나마이신을 대량 생산함으로써, 젤다나마이신을 이용한 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 항염증제 또는 항암제 등의 약제 개발에 유용하게 이용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하지는 않는다.
<실시예 1> 젤다나마이신 생합성 조절 유전자 확인
본 발명자들은 젤다나마이신 생합성 유전자 클러스터의 염기서열 분석으로 일련의 생합성 조절에 관여할 것으로 추정되는 5개의 유전자 orf10, gel14, gel17, orf11, gel19를 확인하였다. 이들 유전자의 염기서열을 미국 생명정보 샌터 (NCBI)의 BLAST 프로그램을 이용하여 이미 알려진 유전정보와 상동성을 검색하여 각각의 상동성이 높은 유전자들을 확인하였다. 이들 유전자의 코딩된 아미노산 서열을 이용하여 Lasergene 프로그램(DNASTAR사)의 MegAlign을 이용하여 상동성 정도를 확인하였다.
구체적으로, gel14와 gel17는 거대한 ATP 결합 조절자(large ATP-binding regulator)인 LuxR 계열(LAL)의 조절 유전자로 C-말단에는 헬릭스-턴-헬릭 스(helix-turn-helix; HTH) DNA 결합자리를 가지고 있다. 이들은 이미 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 17997이라는 젤다나마이신 생산 균주에서 GdmRI과 GdmRII로 확인되어 He W 등(Arch. Microbiol. May; 189(5): 501-510, 2008)에 그 기능이 발표되었다. 또한, 두 개의 TetR 계열의 유전자(orf11과 gel19)와 AraC 계열의 조절 유전자 orf10이 확인되었다(도 1 참조).
<실시예 2> TetR 계열 젤다나마이신 생합성 조절유전자 gel19 비활성 균주의 제조
<2-1> pKC-G19 벡터의 제조
본 발명자들은 AraC 계열 조절 유전자의 기능을 확인하기 위해, 다음과 같은 방법으로 유전자 파괴 돌연변이(gene-disruption mutant)(S. hyg-Δg19=AC19)를 제작하였다. 우선, gel19 유전자 변이 벡터를 제작하기 위해, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기의 두 쌍의 프라이머를 이용하여 gel19 유전자를 포함하는 두 조각의 DNA 분획을 PCR 증폭하였다. 첫번째 프라이머 쌍은, HindIII 및 KpnI 제한 효소사이트를 도입한, 5'-CCC AAG CTT CAC CGG TAT GGC CCG CGA GTG C-3'(정방향 프라이머)(서열번호: 3)와 5'-CCG GTA CCA TAT GCG TCC GCA TCA GCC GCG G-3'(역방향 프라이머)(서열번호: 4); 다른 프라이머 쌍은, PstI 및 EcoRI 제한 효소사이트를 도입한, 5'-AAC TGC AGT GCC CCG AGC AGC AGC GGC TGG-3'(정방향 프라이머)(서열번호: 5), 5'-CGG AAT TCC CGG ACG GCG GAA ACC CCG GCG-3'(역방향 프라이머)(서열번호: 6).
상기 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터(pCR2.1-TOPO, InvitrogenTM life technologies, USA)에 클로닝하여 pTA-G19-HK(991bp) 및 pTA-G19-PE(1002bp)을 제조하였다. 카나마이신 내성 유전자인 aphII 유전자를 포함하는 pFD-neoS의 KpnI/PstI 제한효소 절단 1.1-kb DNA 분획을 선택 마커 및 유전자-파괴 컨스트럭트를 구성하기 위하여 사용하였다. pTA-G19-HK의 1.0-kb HindIII/KpnI 절단분획, pTA-G19-PE의 PstI/EcoRI 1.0-kb 단편, 및 pFD-neoS의 1.1-kb SalI 절단편(aphII 유전자)을 미리 EcoRI 및 HindIII로 잘려진 대장균-방선균 셔틀 벡터인 pKC1139(Bierman, M.; Logan, R.; O'Brien, K.; Seno, E. T.; Rao, R. N.; Schoner, B. E. Gene 1992, 116, 43-49) 벡터에 연결하여 'pKC-G19' 벡터를 제조하였다. 상기 pKC-G19 벡터는 gel19 유전자 부위를 양말단에 가지고 중간에 카나마이신 내성 유전자를 가지고 있는 형태를 가진다(도 2 참조).
<2-2> AC19 균주의 제조
상기 실시예 <2-1>에서 제조한 pKC-G19 벡터를 대장균 균주인 ET12567(pUZ8002)에 도입하고, 상기 형질전환 대장균을 젤다나마이신 생산균주 S. hygroscopicus JCM4427와 혼합하여 컨쥬게이트(conjugate)가 되도록 하였다. 대장균과 방선균 간의 상호 유전적 컨쥬게이션(intergeneric conjugation)은 Flett, F.; Mersinias, V.; Smith, C. P. FEMS Microbiol. Lett. 1997, 155, 223-229에 기재된 방법으로 수행하였다. 컨쥬게이션 형질전환체는 아프라마이신(apramycin)과 카나마이신(Kanamycin) 양자에 내성을 나타내었다(도 3 참조).
상기 pKC-G19 벡터는 pKC1139의 방선균 온도 감수성 오리진(temperature sensitive origin)을 가지고 있어 37℃ 이상에서 배양할 경우, 유전자의 복제가 일어나지 않아 세포분열하는 방선균내 벡터 수가 점점 줄어 들어 나중에는 벡터가 없어진다. 이런 과정에서 카나마이신이라는 항생제가 존재하면 크로모좀 DNA 염기서열과 벡터의 염기서열이 같은 유전자 부위가 두자리 상동 조합(double crossing over homologous recombination)이 일어난 균주만이 살아남게 된다.
따라서, 상기 두자리 상동 조합이 일어난 균주 중에서 카나마이신에는 내성을 갖고, 아프라마이신에는 민감한 균주를 선별하면, 상기 균주는 gel19 유전자 부위에 카나마이신 내성 유전자가 삽입된 균주일 것이다.
이런 유전자 삽입(chromosomal integration)을 하기 위해, pKC-G19 벡터가 컨쥬게이션된 형질전환 균주를 YEME/카나마이신 액체 배지에서 37℃에서 4일간 배양하였다. 이때 상기 pKC1139 벡터의 유전적 특징으로 인해 37℃에서 벡터의 복제가 정지하고 염색체상의 gel19 유전자 부위와 pKC-G19 벡터의 gel19 유전자 부위가 두자리 상동 조합된 균주만이 생존하였다. 이들 생존 균주를 카나마이신과 아프라마이신이 각각 첨가된 고체 배지에 배양한 후, 카나마이신에서만 내성을 가진 균주를 선택하였다(도 3 참조).
상기 카나마이신 내성 균주의 염색체 DNA를 분리하여 카나마이신 내성 유전자 부위의 프라이머 neoL(5'-CAA TCC ATC TTG TTC AAT CAT GCG AAA-3')(서열번호: 7)와 gel19 유전자 부위 프라이머 g19con(5'-CGA ATC GAG TCC GCC GAG TCC TGG CTC-3')(서열번호: 8)과 PCR 중합을 수행한 결과, 예측한 크기의 단편인 1.4 Kbp을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
이렇게 gel19 부위에 카나마이신이 삽입된 것을 확인한 균주를 '스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨19(Streptomyces hygroscopicus AC19; S. hyg-g19)'이라 명명하고 2009년 2월 19일자로 KCTC에 기탁하였다(기탁번호: KCTC11469BP).
<실시예 3> AraC 계열 젤다나마이신 생합성 조절유전자 orf10 비활성 균주의 제조
AraC 계열의 조절 유전자 중 유일하게 orf10이 PKS 유전자(gelA)의 앞쪽에 위치한다. AraC 계열 조절 유전자는 주로 대장균(E. coli)에서 당 이화작용(sugar catabolism)과 스트레스(stress) 반응에 관여하고 주로 C-말단에 DNA 결합 도메인(binding domain)과 N-말단에 당 결합 도메인(sugar-binding domain)을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 도 5에서 보는 바와 같이 orf10 유전자가 알려진 AraC 계열 조절자와 C-말단 부분의 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix; HTH) 부분에 높은 상동성을 가지고 있음이 확인되었다(도 5 참조). 특히, 3차 구조가 밝혀진 AraC 계열 조절자 MarA인 경우는 HTH 부분만을 가지고 있는 것으로 알려져 있는 orf10의 HTH 부위와 상동성을 보였다. 또한, SCO00266는 C-말단 부분만 43.3%의 상동성을 보이고 전체적으로도 36.9% 상동성을 확인할 수 있었다. 그러나 다른 AraC 계열 유전자들과는 N-말단 부위는 상동성을 확인할 수 없었다.
<3-1> pKC-O10 벡터의 제조
본 발명자들은 AraC 계열 중 orf10 유전자의 기능을 확인하기 위해, 다음과 같은 방법으로 유전자 파괴 돌연변이(gene-disruption mutant)(S. hyg-Δo10=AC20)를 제작하였다. 우선, orf10 유전자 변이 벡터를 제작하기 위해, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고 하기 두 쌍의 프라이머를 사용하여 orf10 유전자를 포함하는 두 조각의 DNA 분획을 PCR 증폭하였다. 첫번째 프라이머 쌍, EcoRI와 SalI 제한 효소사이트를 도입한 5'-GAA TTC CTC GTC ATG GCG GGC GGC T-3'(정방향 프라이머)(서열번호: 9)와 5'-GTC GAC GGG GGATGC AGG CGT GGT GTG TG-3'(역방향 프라이머)(서열번호: 10); 다른 프라이머 쌍, 5'- GTC GAC CTA CCG AAG TGT TCC GCG CCT AT-3'(정방향 프라이머)(서열번호: 11), 5'-AAG CTT CAA CCA GGT CTC GGT GGC CCA GG-3'(역방향 프라이머)(서열번호: 12).
상기 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터(pCR2.1-TOPO, InvitrogenTM life technologies, USA)에 클로닝하여 pTA-o10-ES(1011 bp) 및 pTA-o10-SH(987 bp)을 제조하였다. 카나마이신 내성 유전자인 aphII 유전자를 포함하는 pFD-neoS의 SalI 제한효소 절단 1.1-kb DNA 분획을 선택 마커 및 유전자-파괴 컨스트럭트를 구성하기 위하여 사용했다. pTA-o10-ES의 1.0-kb EcoRI/SalI 절단 분획, pTA-o10-SH의 SalI/HindIII 1.0-kb 절단 분획, 및 pFD-neoS의 1.1-kb SalI 절단 분획(aphII 유전자)을 미리 EcoRI 및 HindIII로 잘려진 대장균-방선균 셔틀 벡터인 pKC1139(Bierman, M.; Logan, R.; O'Brien, K.; Seno, E. T.; Rao, R. N.; Schoner, B. E. Gene 1992, 116, 43-49) 벡터에 연결하여, 'pKC-o10 벡터'를 제조하였다. 상기 pKC-o10 벡터는 orf10 유전자 부위를 양말단에 가지고 중간에 카나마이신 내성 유전자를 가지고 있는 형태를 가진다(도 7 참조).
<3-2> AC20 균주의 제조
상기 실시예 <3-1>에서 제조한 pKC-o10를 대장균 균주인 ET12567(pUZ8002)에 도입하고, 상기 형질전환 대장균을 젤다나마이신 생산균주 S. hygroscopicus JCM4427와 혼합하여 컨쥬게이트이 되도록 하였다. 대장균과 방선균 간의 상호 유전적 컨쥬게이션(intergeneric conjugation)은 Flett, F.; Mersinias, V.; Smith, C. P. FEMS Microbiol. Lett. 1997, 155, 223-229에 개시된 방법으로 수행하였다. 컨쥬게이션 형질전환체는 아프라마이신과 카나마이신 양자에 내성을 나타내었다(도 6 참조).
상기 pKC-o10 벡터는 pKC1139의 방선균 온도 감수성 오리진(origin)을 가지고 있어 37℃ 이상에서 배양할 경우, 유전자의 복제가 일어나지 않아 세포 분열하는 방선균내 벡터 수가 점점 줄어 들어 나중에는 벡터가 없어진다. 상기 과정에서 카나마이신이라는 항생제가 존재하면 크로모좀 DNA 염기서열과 벡터의 염기서열이 같은 유전자 부위가 두자리 상동 조합(double crossing over homologous recombination)이 일어난 균주만이 살아 남게 된다.
따라서, 상기 두자리 상동 조합이 일어난 균주 중에서 카나마이신에는 내성을 갖고, 아프라마이신에는 민감한 균주를 선별하면, 상기 균주는 orf10 유전자 부 위에 카나마이신 내성 유전자가 삽입된 균주일 것이다.
이런 유전자 삽입(chromosomal integration)을 하기 위해, pKC-o10 벡터가 컨쥬게이션된 형질전환 균주를 YEME/카나마이신 액체 배지에서 37℃에서 4일간 배양하였다. 이때 상기 표기한 pKC1139 벡터의 유전적 특징으로 인해 37℃에서 벡터의 레브리켄이션이 정지하고 염색체상의 orf10 부위와 pKC-o10 벡터의 orf10 유전자 부위가 두자리 상동 조합한 균주만이 생존하였다. 이들 생존 균주를 카나마이신과 아프라마이신이 각각 첨가된 고체 배지에 배양한 후 카나마이신에서만 내성을 가진 균주를 선별였다(도 6 참조).
상기 카나마이신 내성 균주의 염색체 DNA를 분리하여 카나마이신 내성 유전자 부위의 프라이머 neoR(5'-CGC ATC GCC TTC TAT CGC CTT CTT G-3')(서열번호: 13)와 gel19 유전자 부위 프라이머 o10con(5'-GAT TCC ACG CAG GGG CCA CTC CTG CCG-3')(서열번호: 14)와 PCR 중합을 하게 되면 예측한 크기의 단편인 1.27 Kbp을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9 참조).
이렇게 orf10 부위에 카나마이신이 삽입된 것을 확인한 균주를 '스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨20(Streptomyces hygroscopicus AC20)'이라 명명하고 2009년 2월 19일자로 KCTC에 기탁하였다(기탁번호: KCTC11470BP)..
<실시예 4> orf10 또는 gel19 비활성 변이주의 젤다나마이신 생산량 분석
<4-1> AC19 균주의 젤다나마이신 생산량 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 제조한 AC19 균주의 젤다나마이신 생산 과의 상관성을 확인하기 위해, 30 ml YEME 배지를 포함하는 250 ml 배플 엘른메이어 플라스크(baffled Erlenmeyer flask)에 상기 변이주를 접종하고, 28℃에서 7일간 170 rpm으로 배양한 후, 배양 브로쓰를 EtOAc로 두 번 추출하고, 이들 추출물은 여과하여 불용물을 제거하고, 농축한 후에, EtOAc와 H2O로 분획하여 유기상 추출물을 HPLC 분석을 통해 야생 균주의 배양 추출물과 비교하였다.
그 결과, 상기 AC19 균주는 젤다나마이신 생산이 되지 않는 것을 확인하였다(도 8 참조).
또한, 상기 변이주에 gel19 유전자를 다시 첨가하는 상보성(complementation) 실험을 수행한 결과, 젤다나미이신 생산이 회복되는 것을 확인하였다. 따라서 gel19 유전자는 LAL 계열 조절자와 같이 젤다나마이신 생합성에 중요한 역할을 하는 것임을 알 수 있었다.
<4-2> AC20 균주의 젤다나마이신 생산량 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 3>에서 제조한 AC20 균주의 젤다나마이신 생산과의 상관성을 확인하기 위해, 30 ml YEME 배지를 포함하는 250 ml 배플 엘른메이어 플라스크(baffled Erlenmeyer flask)에 상기 변이주를 접종하고, 28℃에서 7일간 170 rpm으로 배양하고, 배양 브로쓰를 EtOAc로 두 번 추출하고, 이들 추출물은 여과하여 불용물을 제거하고, 농축한 후에 EtOAc와 H2O로 분획하여 유기상 추출물을 HPLC 분석을 통해 야생 균주의 배양 추출물과 비교하였다.
그 결과, 상기 AC20 균주는 야생 균주에 비해 젤다나마이신 생산량이 현저히 높은 경향을 보이는 것을 확인하였다(도 10 참조).
또한, 젤다나마이신 생산량을 정량화하기 위해, AC20 균주를 3개의 500 ml 배플 엘른메이어 플라스크에 50 ml의 YEME 배지에 접종한 후 8일간 배양하면서 1일에서 8일간 채취한 후 건조세포 중량(dry cell weight)과 젤다나마이신의 생산량을 측정하였다.
그 결과, AC20 변이주가 전반적으로 야생 균주 보다 세포 중량은 약간 증가하는 현상을 보였지만, 접종 후 3일 이후부터 9일 후 사이에 젤다나마이신 생산량이 약 4배 이상 증가하였다. 즉, 젤다나마이신 생산량은 야생 균주가 500 μg/50 ml(10 mg/l)인 반면에 orf10 유전자 비활성 변이주인 AC20 균주가 2 mg/50 ml(40 mg/l) 생산하였다(도 10 참조).
본 발명은 젤다나마이신 생합성 조절에 관여하는 유전자들의 기능 연구, 상기 유전자들의 유전자 조작을 통한 젤다나마이신 생산량 조절 방법 연구, 및 젤다나마이신의 대량 생산을 통한 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 항염증제 또는 항암제 등의 약제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 게놈 코스미드 DNA를 염기서열 결정함에 의해 얻어진 젤다나마이신 생합성 유전자 클러스터의 유전자 배열도 및 배열도 내에 존재하는 절다나마이신 생산에 관여 할 것로 예상되는 유전자들의 이름, 크기 및 특징을 나타내는 그림이다.
도 2는 gel19 유전자 내 카나마이신 유전자를 삽입한 gel19 유전자 파괴 벡터(pKC-g19)를 제조한 후, 여러 제한 효소를 통해 카나마이신 삽입을 확인한 결과를 나타내는 그림이다:
M 레인: 1 kb DNA 레더(ladder); 1 레인: EcoRI/HindIII; 2 레인: BamHI/BglII; 3 레인: BamHI/KpnⅠ.
도 3은 S. hyg-4427 균주 및 S. hyg-Δg19 변이주에서 아프라마이신(apramycin; AprR) 및 카나마이신(kanamycin; KmR)에 대한 내성 또는 민감성을 나타내는 그림이다.
도 4는 S. hyg-4427 균주 및 S. hyg-Δg19 변이주 내 유전자 구조, 및 여러 가지 프라이머 쌍을 통해 생성된 S. hyg-Δg19 변이주의 생성을 확인한 PCR 반응 결과를 나타내는 그림이다.
도 5는 MegAlign 프로그램을 이용하여 분석한 AraC 계열 조절 유전자의 C-말단 서열을 비교하여 나타낸 그림이다: HTH 모티프를 음영을 준 박스로 나타내었 고, DNA 결합 부위로 추정되는 위치를 상자로 표시하였다.
도 6은 S. hyg-4427 균주 및 S. hyg-Δo10 변이주에서 아프라마이신(apramycin; AprR) 및 카나마이신(kanamycin; KmR)에 대한 내성 또는 민감성을 나타내는 그림이다.
도 7은 orf10 유전자 내 카나마이신 유전자를 삽입한 orf10 유전자 파괴 벡터(pKC-o10)를 제조한 후, 여러 제한 효소를 통해 카나마이신 삽입을 확인한 결과를 나타내는 그림이다:
M 레인: 1 kb DNA 레더(ladder); 1 레인: EcoRI/HindIII; 2 레인: BamHI/BglII; 3 레인: BamHI; 및 4 레인: BglII.
도 8은 여러 가지 프라이머 쌍을 이용하여 야생 균주(S. hygroscopicus JCM4427) 및 S. hyg-Δo10 변이주의 PCR 결과를 나타내는 그림이다:
M 레인: 1 kb DNA 레더(ladder); 1 레인: orf10-ES 및 orf10-SH 프라이머 세트를 이용한 S. hygroscopicus JCM4427의 PCR 산물; 2 레인: orf10-ES 및 orf10-SH 프라이머 세트를 이용한 S. hyg-Δo10의 PCR 산물; 3 레인: o10 con 및 neo-R 프라이머 세트를 이용한 S. hygroscopicus JCM4427의 PCR 산물; 및 4 레인: o10 con 및 neo-R 프라이머 세트를 이용한 S. hyg-Δo10의 PCR 산물.
도 9는 야생 균주(S. hygroscopicus JCM4427) 및 S. hyg-Δg19 변이주의 배양에 따른 젤다나마이신의 생산량을 나타내는 그래프이다: 1은 S. hygroscopicus JCM4427; 2는 S. hyg-Δg19; 및, 화살표: 젤다나마이신 피크.
도 10은 야생 균주(S. hygroscopicus JCM4427) 및 S. hyg-Δo10 변이주의 배양에 따른 성장곡선(A) 및 젤다나마이신의 생산량(B)을 나타내는 그래프이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Modified microorganisms of geldanamycin biosynthesis regulator genes and the method for producing geldanamycin using the same <130> 9p-02-20 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 1 atggtccccc gaagcccgtc ggtcaatgag gagttgcgcc gccgatccca ggcccgtctg 60 ctggaggcga cggtcgagct gatcgacgag cacggctacg aggcgaccac cctcgcccat 120 atcgccgacc gggccggggc ggcccgcggc ctggtctcgt actacttccc gggcaagcgg 180 cagctactgc agacggccgt ccaccagctg atgcacatgg agttggcccg ggggctcgag 240 cgggagccgc gcccggaggg cgaggagacc gggcgggagc tgatggcgcg ggcgatcgac 300 gcgatcctgg ggctggcccg ggaccggccg cggctgatgc ggacgcatat ggcggggatc 360 ctcacggccg agggcttcat ccagtgcccc gagcagcagc ggctggccgg tctgctgcgg 420 gacaccgtca cgcggtacgg ctccgaggac cccgagaccg actaccggct gctgcgcgcc 480 ctgctgatgg gcgcggtggt cgcggtgctg ctgccgggcg cgccgatgcc gcccgagcgg 540 ctgcgggcgg agctgttcca ccgctacgga ctggactggg agctcgggct cccgccgggc 600 gaggaaccgc ccgacgggag ccggatgagc acgccggagt ga 642 <210> 2 <211> 885 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 2 gtggaaaacg gacacagtgc ggtgcggcaa ctgcgctacc tgcctgccgt gggatcggcg 60 tacggggtgg aggtcctcga tttcgcggcg ctgcgttcga tggacaccca gcgccgtcgt 120 acccagccgc aacgccccga cttccatgtg ttcgcgctgg tcggttccgg aaccggcagc 180 cacgaagcgg acttccacaa ctaccggctg ggggaaggcg gcgccgtgtg gatccggccg 240 ggcatggtgc accgctggag cgatatcgac gcctgcgacg gcccgctgat cctcttccgg 300 cccggcttcc tttccggctt cgcagcgtcg gaggccaccg cgccggcgtg ctggcacctg 360 gaccggcagc gcctgtccct cgccctgctc gcggccgaac atctcggccg cgagcacagc 420 acggcagtgc acacaccacg cctggcatcc cccgtcctgc tgtcccacct gctggcggca 480 ctgatcctgc gcgcactccc cggcacaccg ccctcagtcg gcccggcaag ccccggcagc 540 cgacctaccg aagtgttccg cgcctatcgg gccgccgtcg aagagcgctt caccgactgg 600 caccatgtgg ccgactacgc gcgggcattg ggctacgacg tacgcaccct cacccggaca 660 acgcgtgccg ccactggcac gggcgccaag acattcctcg accagcgcat cctgctggag 720 gcgaaacggc tgctcgccca caccgacctg ccggtcagcg gctgcgcccg acgcctcggc 780 ttccgggacg tcggcaactt caccacattc ttccgtcgcc aggccggcct gccccccgcc 840 gcgtggcgcg ccgcatacag caccgcaggc gcacaaggcg gctga 885 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 1 <400> 3 cccaagcttc accggtatgg cccgcgagtg c 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 1 <400> 4 ccggtaccat atgcgtccgc atcagccgcg g 31 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 2 <400> 5 aactgcagtg ccccgagcag cagcggctgg 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 2 <400> 6 cggaattccc ggacggcgga aaccccggcg 30 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neoL primer <400> 7 caatccatct tgttcaatca tgcgaaa 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g19con primer <400> 8 cgaatcgagt ccgccgagtc ctggctc 27 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 3 <400> 9 gaattcctcg tcatggcggg cggct 25 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 3 <400> 10 gtcgacgggg gatgcaggcg tggtgtgtg 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 4 <400> 11 gtcgacctac cgaagtgttc cgcgcctat 29 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 4 <400> 12 aagcttcaac caggtctcgg tggcccagg 29 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neoR primer <400> 13 cgcatcgcct tctatcgcct tcttg 25 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> o10con primer <400> 14 gattccacgc aggggccact cctgccg 27

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 orf10 유전자 내에 항생제 내성 유전자가 삽입되어 orf10 유전자가 불활성화된 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트.
  7. 삭제
  8. 제 6항의 orf10 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터.
  9. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)에 상기 제 8항의 재조합 벡터를 삽입시켜 제조한, 젤다나마이신의 생산이 야생 균주에 비해 증가한 형질전환 변이주.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 변이주는 기탁번호가 KCTC11470BP인 것을 특징으로 하는 변이주.
  11. 1) 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 orf10 유전자 내에 항생제 내성 유전자가 삽입된, 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 재조합 벡터를 젤다나마이신을 생산하는 숙주세포에 삽입시켜 형질전환 변이주를 제조하는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)의 형질전환 변이주 중 항생제에 대한 내성 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 젤다나마이신의 생산이 야생 균주에 비해 증가한 형질전환 변이주의 제조 방법.
  12. 삭제
  13. 제 11항에 있어서, 단계 3)의 숙주 세포는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus), 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 17997(Streptomyces hygroscopicus 17997), 스트렙토마이세스 하이그로프코피쿠스 변이종 젤다누스 NRRL 3602(Streptomyces hygroscopicus var. geldanus NRRL 3602) 및 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스 EF-76(Streptomyces melanosporofaciens EF-76)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 균주인 것을 특징으로 하는, 젤다나마이신의 생산이 야생 균주에 비해 증가한 형질전환 변이주의 제조 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 단계 4)의 항생제는 카나마이신(Kanamycin)인 것을 특징으로 하는, 젤다나마이신의 생산이 야생 균주에 비해 증가한 형질전환 변이주의 제조 방법.
  15. 1) 제 9항의 변이주를 배양하는 단계; 및
    2) 상기 배양한 배양액으로부터 젤다나마이신을 수득하는 단계를 포함하는, 젤다나마이신 생산 방법.
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