KR20090047444A - 지방산 합성효소의 유전자형을 토대로 소 근육내 지방에 있어서의 지방산 함유량의 많고 적음을 판정하는 방법 및 그 결과를 토대로 쇠고기의 식미의 좋음을 판정하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소의 유전자형을 토대로 근육내 지방 중에 포함되는 지방산 조성을 판정하는 방법, 특히 올레산 함유량의 많고 적음을 간편하고 용이하게 또한 높은 정밀도로 판정하기 위한 판정방법을 제공하는 것, 더욱이 그 판정결과를 토대로, 쇠고기의 식미를 보다 객관적으로 판정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 하기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 검정함으로써 결정되는 지방산 합성효소의 유전자형을 토대로, 소의 근육내 지방에 있어서의 지방산 함유량의 많고 적음을 판정하는 방법 및 그 결과를 토대로 우수한 식미를 구비한 쇠고기를 얻을 수 있는 소인지의 여부를 판정하는 방법을 제공한다.

<1> 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열 중, 아데닌(A) 또는 구아닌(G) 중 어느 하나인 다형부위에 상당하는 제16,024번째의 염기

<2> 동 염기서열 중, 티민(T) 또는 시토신(C) 중 어느 하나인 다형부위에 상당하는 제16,039번째의 염기

Description

지방산 합성효소의 유전자형을 토대로 소 근육내 지방에 있어서의 지방산 함유량의 많고 적음을 판정하는 방법 및 그 결과를 토대로 쇠고기의 식미의 좋음을 판정하는 방법{Method of determining size of fatty acid content in intramuscular fat of cattle based on genotype of fatty acid synthase and method of determining eating quality of beef based on the result}

본 발명은 지방산 합성효소(Fatty acid synthase; FASN)의 유전자형을 토대로, 근육내 지방에 포함되는 지방산의 조성 중 특히 올레산의 많고 적음을 판정함으로써, 우수한 식미를 구비한 소 또는 쇠고기인지를 판정하는 방법에 관한 것이다. 또한 동 판정결과를 토대로, 우수한 식미를 구비한 쇠고기를 얻을 수 있는 소를 선발·육종(育種)하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 축산(소의 사육·번식·육종·개량 등)이나 쇠고기의 생산가공 등의 분야에 유효한 기술을 제공하는 것이다.

쇠고기의 근육내 지방에 포함되는 지방산 중, 가장 많이 포함되어 있는 것이 탄소수 18의 1가 불포화지방산(올레산)으로, 특히 흑모화종(黑毛和種, Japanese Black breed)의 고기는, 외국 품종의 그것과 비교한 경우, 올레산 함유량이 유의하게 높은 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1 참조). 일반적으로 흑모화종의 고기는, 외국 품종의 그것과 비교하여, 일본인이 선호하는 우수한 식미를 구비하는 것으로 말하여지나, 그 요인의 하나로서, 외국 품종의 고기와 비교한 경우의 화우육(和牛肉, Japanese Black cattle beef)에 포함되는 올레산 함유량의 높음이 관계하고 있는 것으로 생각되고 있다(비특허문헌 2 참조).

올레산도 포함한 쇠고기의 지방산 조성을 측정하기 위해서는, 드래프트(draft) 등 규모가 커다란 실험설비를 필요로 하고, 또한 정확한 데이터를 내기 위해서는, 기술적인 습숙(習熟)도 불가결하다. 또한, 이 측정에는 많은 시간을 요하기 때문에, 한번에 다수의 샘플을 처리하는 것이 곤란하고, 또한 지방산 추출 등의 단계에 있어서 다량의 유기 용매를 사용하기 때문에, 측정자의 건강에 미치는 악영향도 무시할 수 없는 등, 많은 문제를 포함하고 있다.

한편, 현재, 일본국 내의 육용우(고기소, beef cattle) 육종은, 일본식육격부협회(日本食肉格付協會)에 의해 등급이 매겨진 지육 성적(carcass grade)을 토대로 행하여지고 있다.

그러나, 식미에 관여하는 지방산 조성 등의 형질은, 상기와 같이 번잡한 이화학 분석을 거쳐야만 하기 때문에, 지육 성적과 달리, 데이터를 용이하게 얻을 수 없다. 이 때문에, 지금까지 이 형질이 개량 목표로 되어지는 경우는 없어, 이대로의 상황이 계속되는 한, 향후에도 그것에 채용될 가능성이 낮은 것은 상상하기 어렵지 않다.

따라서, 간편한 장치로 실시할 수 있고, 또한 기술적인 습숙도 그다지 필요로 하지 않는, 유전자의 염기서열을 토대로 쇠고기의 지방산 조성을 판정하는 방법 의 개발이 요구되고 있었다.

지금까지, 스테아로일-CoA 불포화화 효소(stearoyl-CoA desaturase; SCD)의 유전자형을 이용하여 쇠고기의 지방 융점 및 지방산의 불포화도를 판정함으로써, 쇠고기의 식미를 평가하는 기술이 이미 특허화되어 있다(특허문헌 1).

특허문헌 1에 기재되어 있는, SCD 유전자를 이용한 쇠고기의 식미의 판정은, 쇠고기 중에 포함되는 지방 융점과의 관계, 및 지방산의 불포화도와의 관계를 토대로 이루어지는 것이다. 이 경우의 지방산 조성의 불포화도는, 쇠고기 중에 포함되는 지방산의 포화지방산 함유율과 1가 불포화지방산 함유율의 각 총합의 비에 의해 산출되는 것으로, 지방산의 종류별로 각각의 많고 적음을 알 수는 없다.

그런데, 소 근육내의 지방산을 합성하는 효소로서, 지방산 합성효소(FASN) 유전자가 알려져 있다. 이 효소는, 생체내에 있어서의 지방산 합성을 담당하는 효소의 하나로서, 그 소(Bos taurus) 유래 전체 유전자 서열, 및 추정되는 아미노산 서열에 대해서는, 하기의 비특허문헌 3에 기재되어 있다.

그러나, 지방산 합성효소의 유전자형을 토대로 지방산 조성의 판정을 행하는 방법은 지금까지 알려져 있지 않았다.

비특허문헌 1 : May S.G. et al., Comparison of sensory characteristics and fatty acid composition between Wagyu crossbred and Angus steers., Meat Science 35, 289-298(1993)

비특허문헌 2 : 마쯔바라등, 시판 쇠고기의 등급별 분석평가와 소비성향, 효고현 농업기술센터 연구보고(축산편) 34, 10-15(1998)

비특허문헌 3 : DDBJ/EMBL/GenBank databases : 액세션번호 AF285607

특허문헌 1 : 일본국 특허공개 제2004-261014호 공보

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

전술한 바와 같이, 소의 근육내 지방의 지방산 조성은 쇠고기의 식미에 관계하고 있고, 그 중에서도 특히 올레산 함유율이 높은 쇠고기의 식미가 우수한 것으로 말하여지는 것으로부터, 만일 소의 특정 유전자의 염기서열을 토대로 그 많고 적음을 판정하는 것이 가능하다면, 그 쇠고기의 식미를 간편하고 용이하게 검사 가능해진다. 또한, 이 정보를 육종 선발에 이용함으로써, 지금까지 불가능에 가까웠던 쇠고기의 식미를 개량하는 것도 가능해진다.

본 발명은, 상기 사정을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, 소의 유전자형을 토대로 근육내 지방 중에 포함되는 지방산 조성을 판정하는 방법, 특히 올레산 함유량의 많고 적음을 간편하고 용이하게 또한 높은 정밀도로 판정하기 위한 판정방법을 제공하는 것, 추가적으로 그 판정결과를 토대로, 쇠고기의 식미를 보다 객관적으로 판정하는 방법을 제공하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은, 상기 과제를 감안하여, 특히 상기 지방산 합성효소 유전자에 착안하여, 동 유전자와 소 근육내 지방에 포함되는 지방산 조성, 특히 올레산 함유량의 많고 적음의 관련에 대해서 예의 연구한 결과, (1) 동 유전자에 있어서 2개소의 1염기다형(SNP)이 존재하는 것, (2) 이들 1염기다형은 각각의 사이에 겨우 14염기를 두고 있을 뿐으로 매우 근접해 있어, 2종류의 하플로타입(haplotype)이 존재하는 것, 또한, (3) 이 2개의 하플로타입 사이에서, 소 근육내 지방에 포함되는 올레산 함유량이 유의하게 상이한 것 등을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

특허문헌 1에 기재되어 있는, SCD 유전자를 이용한 쇠고기의 식미의 판정에 있어서는, 전술한 바와 같이 지방산의 종류별로 각각의 많고 적음을 알 수는 없다.

이에 대해, 본 발명의 FASN 유전자의 유전자형을 이용하는 방법에 따르면, 쇠고기 중에 포함되는 지방산의 불포화도에 그치지 않고, 지방산의 각 종류의 많고 적음까지도 판정할 수 있다. 즉, 예를 들면 쇠고기의 식미와의 관계가 시사되어 있는, 올레산을 비롯한 탄소수 18의 1가 불포화지방산의 함유율의 많고 적음을 판정할 수 있고, 또한, 그 이외의 지방산(C14, C16의 각 지방산; 포화·불포화 모두 포함) 각각의 함유율에 대해서도 판정이 가능하다.

우체(牛體)가 자기의 체내에 있어서 생합성 가능한 지방산 중, 현재는 상기의 올레산에 대해서 그 식미와의 관계가 시사되어 있으나, 향후의 연구 진전에 따라 식미에 영향을 미칠 것으로 생각되는 올레산 이외의 지방산, 또는 인간의 건강에 있어서 바람직한(또는 바람직하지 않은) 지방산 등이 명확해질 가능성이 있다.

본 발명은 이러한 지방산의 종류별로 각각의 많고 적음을 판정할 수 있는 점에 있어서, 특허문헌 1의 발명 보다도 우수하다고 할 수 있다.

즉, 본 발명은 산업상 유용한 방법(方法)·물(物)로서 하기의 발명을 포함하는 것이다.

청구항 1의 본 발명은, 하기의 <1> 및/또는 <2>의 염기를 검정함으로써 결정되는 지방산 합성효소의 유전자형을 토대로, 소의 근육내 지방에 있어서의 지방산 함유량의 많고 적음을 판정하는 방법이다.

<1> 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열 중, 아데닌(A) 또는 구아닌(G) 중 어느 하나인 다형부위(polymorphic site)에 상당하는 제16,024번째의 염기

<2> 동 염기서열 중, 티민(T) 또는 시토신(C) 중 어느 하나인 다형부위에 상당하는 제16,039번째의 염기

청구항 2의 본 발명은, 지방산이 올레산인, 청구항 1에 기재된 방법이다.

청구항 3의 본 발명은, 하기의 공정(a) 및 (b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 1 또는 2에 기재된 판정방법이다.

(a) 피검체의 소로부터 조제한 게놈 DNA 또는 cDNA를 주형으로 하는 유전자 증폭반응에 의해, 상기 <1> 및 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역을 증폭하는 공정

(b) 상기 공정(a)에서 얻어진 증폭 단편을 제한효소에 의해 소화하고, 그 절단 유무를 토대로 지방산 합성효소의 유전자형을 판정하는 공정

청구항 4의 본 발명은, 상기 공정(a)에 있어서의 유전자 증폭반응이, 서열표의 서열번호 3에 나타내어지는 염기서열로 되는 포워드 프라이머 및 서열표의 서열번호 4에 나타내어지는 염기서열로 되는 리버스 프라이머를 사용하여, 폴리머라아제 연쇄반응법에 의해 행해지고, 또한, 상기 공정(b)에 있어서의 제한효소로서, HhaI 및 NciI를 사용하는 것을 특징으로 하는 청구항 3에 기재된 판정방법이다.

청구항 5의 본 발명은, DNA 칩을 사용하여 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 검정하는 것을 특징으로 하는 청구항 1 또는 2에 기재된 판정방법이다.

청구항 6의 본 발명은, 서멀 사이클러(thermal cycler)와 형광 검출기를 구비한 폴리머라아제 연쇄반응장치를 사용하여 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 검정하는 것을 특징으로 하는 청구항 1 또는 2에 기재된 판정방법이다.

청구항 7의 본 발명은, 소가 육용종(beef breed)인 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 판정방법이다.

청구항 8의 본 발명은, 소가, 육용으로서도 이용되는 유용종(dairy breed)인 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 판정방법이다.

청구항 9의 본 발명은, 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열 중, 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역에 대해 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 청구항 1, 2, 5 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 판정방법에 있어서 사용되는 유전자다형 검출용 키트이다.

청구항 10의 본 발명은, 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열 중, 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역을, 유전자 증폭반응에 의해 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는, 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 판정방법에 있어서 사용되는 유전자다형 검출용 키트이다.

청구항 11의 본 발명은, 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역을, 유전자 증폭반응에 의해 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머이다.

청구항 12의 본 발명은, 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역에 대해 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 프로브이다.

청구항 13의 본 발명은, 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 판정방법의 결과를 토대로, 우수한 식미를 구비한 쇠고기를 얻을 수 있는 소인지의 여부를 판정하는 방법이다.

청구항 14의 본 발명은, 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 판정방법의 결과를 토대로, 우수한 식미를 구비한 쇠고기를 얻을 수 있는 소를 선발·육종하는 방법이다.

발명의 효과

본 발명에 따르면, 지방산 합성효소(FASN) 유전자형을 토대로, 쇠고기 중에 포함되는 지방산의 불포화도에 그치지 않고, 지방산의 각 종류의 많고 적음까지도 판정할 수 있다. 또한, 그를 토대로 식미가 우수한 쇠고기를 생산하는 쇠고기인지의 여부 등의 판정, 추가적으로 소의 육종이나 품종개량 등을 행하는 방법을 제공할 수 있어, 각종 유용성을 갖는 것이다.

또한, 종래의 쇠고기의 지방산 조성 측정이 번잡하고 숙련을 요하는 것이었던 것에 반하여, 본 발명에 따르면, 서멀 사이클러, 전기영동조 등 취급도 간편하고, 조작의 습숙 등도 그다지 필요로 하지 않는 실험기구를 사용하는 것만으로 지방산 함유량의 많고 적음을 판정할 수 있다. 또한, 다수의 샘플을 효율적으로 또한 높은 정밀도로 판정할 수 있다.

또한, 현재 지방산 조성을 측정하기 위해서는, 도축 후 샘플을 채취할 필요가 있지만, 본 발명에 따르면, 생체 중에(채혈 또는 모근 채취 등에 의해) DNA 샘플을 확보하면 되기에, 대략 30개월에나 이르는 육우의 사양(飼養)기간을 기다리지 않고 지방산 조성을 판정할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 소 지방산 합성효소 유전자의 제34 엑손 상에 발견된 2개소의 1염기다형(SNP), 및 이들 SNP를 검출하기 위한 PCR 프라이머의 대략 그 위치를 설명하는 도면이다.

도 2는 PCR-RFLP법을 이용한 본 발명의 판정방법에 있어서의 전기영동결과를 나타내는 도면이다.

부호의 설명

도 1 중, 오른방향을 향한 흰색 화살표 기호는 포워드 프라이머(서열표의 서열번호 1)를, 왼방향을 향한 흰색 화살표 기호는 리버스 프라이머(서열표의 서열번호 2)를, 각각 나타내고 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명의 구체적 태양, 기술적 범위 등에 대해서 상세하게 설명한다.

(1) 본 발명의 판정방법

청구항 1에 기재된 본 발명은, 전술한 바와 같이, 지방산 합성효소의 유전자형을 토대로, 소의 근육내 지방에 있어서의 지방산 함유량의 많고 적음을 판정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에 있어서, 「소(牛)」란, 유럽 소(Bos taurus)를 의미하는 것으로 한다. 이 유럽 소에는 흑모화종(Japanese Black) 등의 화우(和牛), 및, 홀스타인종, 헤리퍼드종, 애버딘앵거스종, 리무진종 등의 유럽 가축소가 포함되는 것으로 한다. 판정대상(피검체)이 되는 「소(牛)」는 육용종(육우), 또는 육용으로서도 이용되는 유용종(유우) 중 어느 것이어도 된다.

또한, 본 명세서에 있어서 「지방산 합성효소(Fatty Acid Synthase: 이하, 「FASN」으로 약칭하는 경우도 있다.)」란, 생체내에 있어서 지방산을 생합성하는 소 유래의 효소이다. 서열표의 서열번호 1에는, 비특허문헌 3에 의해 나타내어지는 FASN 유전자의 전체 게놈 DNA 서열이, 서열번호 2에는, 동 서열에 의해 코드되는 FASN 단백질의 아미노산 서열이, 각각 나타내어진다. 서열번호 1의 DNA 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열은, 비특허문헌 3에 의해 나타내어지는 서열과 동일하나, 후술하는 1염기다형(SNP)의 표기 측면에서 상이하다.

도 1은, 상기 FASN 유전자의 제34 엑손 및 제35 엑손을 포함하는 게놈 DNA 부분서열을 모식적으로 나타내고 있다. 도면 중, 커다란 사각형은 각 엑손을 나타내고, 작은 사각형은 이를 사이에 끼우는 각 인트론영역을 나타낸다. 도면 중의 각 숫자는, 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 FASN 유전자의 게놈 DNA 서열의 제1번째 뉴클레오티드를 기점으로 하여, 각 위치가 몇 번째 뉴클레오티드에 상당하는지를 나타내고 있다.

도 1의 아래쪽에는, 본 발명자들이 상세하게 조사검토한 결과, FASN 유전자(비번역영역은 포함하지 않음) 상에서 발견한 2개의 아미노산 치환을 수반하는 1염기다형(SNP)이 나타내어진다.

본 발명자들이 동 유전자에 주목하여, 상세한 해석을 행하기에 이른 배경에는, 흑모화종과 리무진종으로 되는 유전자 해석용의 F2 가계집단의 해석에 의해, 소 19번 염색체에 지방산 조성에 관여하는 유전자영역을 특정했다고 하는 경위가 있다. 동 영역내에 있어서 보다 강하게 형질과 연쇄하는 부위에 FASN 유전자가 존재하여, 그 기능으로부터 지방산 조성으로의 관여를 추정하였다. 이 때문에, 동 유전자의 해석에 있어서는, F2 가계집단의 P세대(시조가 되는 세대)인 흑모화종·리무진종 각 2마리, 합계 4마리에 있어서의 FASN 유전자 cDNA의 전체 서열을 결정하고, 그 차이를 상세하게 조사하였다.

도 1의 아래쪽에 나타낸 2개소의 1염기다형(SNP)은, 따라서 이들 4마리 사이에서 맨먼저 관찰된 것이다. 이하에서는, 이들 2개소의 1염기다형(SNP)을 각각 5'측으로부터 차례로 하기 <1>, <2>의 염기라 칭하기로 한다.

<1> 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열 중, 아데닌(A) 또는 구아닌(G) 중 어느 하나인 다형부위에 상당하는 제16,024번째의 염기

<2> 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열 중, 티민(T) 또는 시토신(C) 중 어느 하나인 다형부위에 상당하는 제16,039번째의 염기

서열표의 서열번호 1의 염기서열에 있어서는, 상기 2개의 다형부위의 염기 각각을, 유니버설 코드 「r」 또는 「y」로 표기하고 있다.

또한, 상기 <1>, <2>의 염기에 부여되어 있는 번호는, 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 FASN 유전자의 게놈 DNA 서열의 제1번째 뉴클레오티드로부터 세어서 몇 번째에 해당하는지를 나타내는 것이다.

다른 한편으로, cDNA 서열에는 인트론부분이 포함되지 않고, 엑손부분만이 연결된 상태에 있기 때문에, FASN 유전자의 cDNA 서열에 있어서의 상기 <1>, <2>의 염기에 상당하는 염기의 번호는, 상기 <1>, <2>에 기재된 번호와는 당연히 상이한 것이 된다.

따라서, 본 발명의 판정방법에 있어서 판정대상인 소의 cDNA를 판정시료로서 사용하는 경우는, 상기 <1>, <2>의 염기의 각 위치를 나타내는 번호에 대해서, 제34 엑손 이전의 인트론 서열을 고려하여 계수하여 해석하는 것으로 한다.

또한, 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 서열은, 비특허문헌 3의 저자들이 조사한, 어떠한 유럽 소 품종으로부터 단리된 FASN 유전자의 게놈 DNA 서열로, 이것 이외의 소 품종에서는, 돌연변이 등에 의해, 서열번호 1에 나타내어지는 서열에 있어서 1~수개의 염기의 결실 또는 삽입 등이 발생하였을 가능성이 있다. 이 경우, 상기 <1>, <2>의 염기의 각 위치를 나타내는 번호에 대해서는, 이러한 염기의 결실 또는 삽입 등을 고려하여 계수하여 해석하는 것으로 한다.

도 1에 나타내는 바와 같이, 상기 <1>, <2>의 염기는 모두 제34 엑손에 포함되고, 모두 오픈 리딩 프레임에 포함되어 있는 것을 알 수 있었다.

<1>의 염기가 아데닌(A)인지 구아닌(G)인지에 따라, 코드하는 아미노산의 치환을 초래하는 것이 판명되었다. 상기 <1>의 염기가 아데닌(A)일 때는, 코드하는 아미노산은 트레오닌(Thr)이고, 구아닌(G)일 때는, 코드하는 아미노산은 알라닌(Ala)이다.

또한, <2>의 염기가 티민(T)인지 시토신(C)인지에 따라서도, 코드하는 아미노산의 치환을 초래하는 것이 판명되었다. 상기 <2>의 염기가 티민(T)일 때는, 코드하는 아미노산은 트립토판(Trp)이고, 시토신(C)일 때는, 코드하는 아미노산은 아르기닌(Arg)이다.

이와 같이, 상기 <1>, <2>의 염기의 치환은 아미노산 치환을 발생시킨다.

또한, 상기 <1>, <2>의 1염기다형(SNP)은 서로 독립된 관계에 있는 것이 아니라, 원칙적으로 연쇄되어 있는 것이, 그 후의 다수의 유전자해석의 결과 판명되었다. 즉,

(i) 상기 <1>의 염기가 아데닌(A)일 때는 상기 <2>의 염기는 티민(T)

인 것에 반하여,

(ii) 상기 <1>의 염기가 구아닌(G)일 때는 상기 <2>의 염기는 시토신(C)

이었다. 본 발명자들은, 편의상 이들 2종류의 하플로타입을, 각각의 염기 치환에 수반하여 코드되는 아미노산의 1문자 표기로 표현하기로 하였다. 즉, (i)의 하플로타입을 트레오닌(Thr=T)-트립토판(Trp=W)형(TW형)으로 하고, 또한 (ii)의 하플로타입을 알라닌(Ala=A)-아르기닌(Arg=R)형(AR형)으로 부르기로 하였다.

또한, 예외적으로, <1>의 염기와 <2>의 염기의 조합이 전술한 바와 같지 않은 개체도 존재하는 듯 하다. 비특허문헌 3에 기재된 FASN 유전자 염기서열에 있어서는, 상기 <1>에 상당하는 부분의 염기가 아데닌(A)호모인 것에 반하여, 상기 <2>에 상당하는 부분의 염기가 시토신(C)호모였다. 본 발명자들이 조사한 범위내에 있어서 이러한 케이스는 존재하지 않았기 때문에, 이들 하플로타입을 가진 경우의 형질과의 관련에 대해서는 확인되어 있지 않다.

따라서, 만일 이들 하플로타입을 보유하는 소가 존재한 경우는, 쇠고기의 근육내 지방에 있어서의 지방산 함량의 많고 적음을 판정하는 것은 불가능하다.

그러나, 본 발명자들은, 일본국 내의 흑모화종·홀스타인종의 각종 수소군, 흑모화종 비육우군(肥育牛群), 또한 일본국 내에서 계양(繫養)되는 육용 외국 품종군 등, 합쳐서 1,000마리를 초과하는 샘플에 대해서 FASN 유전자형의 타이핑을 행하였으나, <1>의 염기와 <2>의 염기 사이에서 재조합을 일으키고 있는 개체를 검출한 예가 없는 것으로부터, 존재하지 않는다고 단언할 수는 없지만, 일본국 내에 있어서는 이러한 재조합을 일으킨 FASN 유전자형을 보유하는 소를 검출할 가능성은 매우 낮은 것으로 생각해도 좋을 것으로 생각된다(비특허문헌 3의 저자들은 해외의 연구그룹으로, 그들이 일본국 내의 소의 염기서열을 결정하고, 그것을 등록했다고는 생각하기 어렵다).

따라서, 본 발명에 있어서 판정대상(피검체)이 되는 소로서는, 일본국 내에서 번양(繁養)되는 소, 즉, 일본국 내에서 태어나, 사육되고 있는 소가 바람직하다. 또한, 본 발명자들은 일본국 내에서 번양되는 소만을 조사하였기 때문에, 해외에서 번양되는 외국 품종에 있어서의 FASN 유전자형의 빈도 등을 알 수는 없지만, 해외에서 번양되는 외국 품종에 대해서도, 하플로타입형이 일본국 내에서 관찰된 것과 동형(즉, TW형 또는 AR형)인 경우에는, 본 발명의 판정대상(피검체)으로 할 수 있다.

또한, 전술한 바와 같이 <1>과 <2>의 염기 사이에서 재조합을 일으키고 있는 예가 검출되지 않은 것으로부터, 본 발명에 있어서는, <1> 또는 <2>의 염기를 검정함으로써 FASN 유전자형을 결정할 수 있지만, <1>, <2> 모두 검정하는 것이 바람직하다.

이와 같이, FASN 유전자의 유전자형에는 2개의 하플로타입이 존재하는 것을 알 수 있었는데, 추가적으로 조사 검토한 결과, 상기 FASN 유전자의 유전자형과, 소의 근육내 지방에 포함되는 지방산 중, 올레산 함유량의 많고 적음의 사이에, 특히 유의한 관계가 존재하는 것을 발견하였다.

즉, 상기 「TW형」과 「AR형」 사이에서, 소의 근육내 지방에 포함되는 올레산 등의 지방산 함량이 유의하게 상이한 것을 명확하게 하였다. 결과의 상세는 후술하는 실시예에 있어서도 설명하겠으나, 올레산 함유량의 비율은, TW형의 FASN 유전자를 호모로 갖는 경우(TW/TW), TW형과 AR형의 FASN 유전자를 헤테로로 갖는 경우(TW/AR), AR형의 FASN 유전자를 호모로 갖는 경우(AR/AR)의 차례로 높은 값을 나타내었다.

따라서, 본 발명에 있어서는, 판정대상의 소가 갖는 FASN 유전자에 있어서의 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 검정하고, 유전자형이 상기 TW/TW형, TW/AR형 및 AR/AR형 중 어느 것인지 결정함으로써, 소의 근육내 지방에 있어서의 지방산 함유량의 많고 적음을 판정할 수 있다.

본 발명에 의해 판정할 수 있는 지방산으로서는 특별히 제한되지 않고, 불포화지방산이어도 되고 포화지방산이어도 된다. 불포화지방산으로서는, 올레산(oleic acid), 엘라이드산(elaidic acid), 바세닉산(vaccenic acid) 등 탄소수가 18인 1가 불포화지방산 등을 들 수 있다. 포화지방산으로서는, 미리스트산(myristic acid) 등 탄소수가 14인 것이나, 팔미트산(palmitic acid) 등 탄소수가 16인 것 등을 들 수 있다.

상기한 바와 같이, 소 근육내 지방에 포함되는 지방산 중 올레산은 가장 많이 포함되는 지방산이며, 또한 쇠고기의 식미와의 관계가 시사되어 있는 지방산이다. 따라서, FASN 유전자의 유전자형이 TW/TW형인 소는, AR/AR형인 소에 비해 보다 식미가 좋은 육질을 갖는다고 평가할 수 있다.

이와 같이, FASN 유전자의 유전자형을 조사함으로써, 소 근육내 지방에 포함되는 지방산 조성 뿐 아니라, 보다 우수한 식미를 구비한 쇠고기를 얻을 수 있는 소인지 여부를 판정하는 것이 가능해진다.

또한, 각종 지방산 함량은, 예를 들면 이하의 방법으로 측정할 수 있다.

시료인 쇠고기 약 1 g에 메탄올클로로포름용액 40 ㎖를 첨가하고, 호모지나이즈한 후 7분간 진탕 추출한다. 그 후, 상청을 회전식 증발기(rotary evaporator)로 감압 건고하여, 지질 시료로 한다.

다음으로, 기준 유지 분석법에 따라, 비누화한 후, 메틸에스테르화한다. 즉, 시료에 1규정 수산화칼륨메탄올용액을 첨가하고, 수욕(water bath) 상에서 환류 가열하여, 비누화하고, 계속해서, 삼플루오르화붕소메탄올시약을 첨가하고, 메틸화한다. 헥산으로 전용(轉溶)한 후, 분리하고, 무수 황산나트륨으로 탈수하여, 가스크로마토그래프로 제공한다.

또한, 가스크로마토그래프의 조건은, 이하에 나타내는 바와 같다.

(가스크로마토그래프의 분석조건)

칼럼 CP-Sil88Wcot 0.25 mm×50 m

캐리어가스 헬륨

주입온도 220℃

칼럼온도 160℃ 항온

검출 FID

본 발명의 판정방법에 있어서, FASN 유전자의 유전자형을 조사하는 방법은 특별히 한정된 것은 아니고, FASN 유전자 상의 상기 <1>의 염기가 아데닌(A)인지 구아닌(G)인지, 및 상기 <2>의 염기가 티민(T)인지 시토신(C)인지를, 직접적 또는 간접적으로 조사하는 것이 가능한 종래 공지의 방법을 적용할 수 있다.

PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)법을 사용하여 상기 <1>, <2>의 염기를 검정함으로써 FASN 유전자의 유전자형을 조사하는 방법은 가장 간편·용이하고, 또한 정밀도도 양호하기 때문에, 이하는 이 방법에 대해서 간단하게 설명한다.

(2) PCR-RFLP법에 의한 FASN 유전자형의 판정방법

PCR-RFLP법이란, 검출하고자 하는 변이부위를 포함하는 유전자영역을 PCR법에 의해 증폭하고, PCR 산물을 당해 변이부위를 인식하는 제한효소로 소화한 후, 전기영동에 의해 DNA 단편의 분자량을 조사함으로써, 제한효소에 의한 절단의 유무, 즉 변이의 유무를 검출하는 방법이다.

먼저, 피검체의 소로부터 유전자시료를 조제한다.

판정에 제공하는 유전자시료는, 게놈 DNA여도 되고 cDNA여도 된다. 게놈 DNA의 경우는, 피검체의 소(도살 전후를 불문)의 임의의 기관·조직·세포(혈액, 양수 중의 세포, 채취한 조직 등을 배양한 세포를 포함)로부터 정법(定法)에 따라 DNA를 정제·추출하면 된다. 후술하는 실시예에서는 근육 조직으로부터 게놈 DNA를 조제하고 있다. cDNA의 경우는, 피검체의 소(도살 전후를 불문)의 임의의 기관·조직·세포(혈액, 양수 중의 세포, 채취한 조직 등을 배양한 세포를 포함)로부터 정법에 따라 mRNA를 정제·추출한 후, 역전사효소에 의해 cDNA를 합성하면 된다.

다음으로, 1염기다형(SNP)에 있어서의 염기의 동정(SNP 타이핑)을 위해, 상기의 방법으로 조제한 게놈 DNA 또는 cDNA를 주형으로 하여 PCR법을 행하고, 상기 <1> 및/또는 <2>, 바람직하게는 <1> 및 <2>의 2개소의 염기를 포함하는 유전자영역을 증폭한다. 그 후, 얻어진 증폭 단편을 적당한 제한효소에 의해 소화하고, 그 절단 유무에 따라 FASN 유전자의 유전자형을 판정한다.

상기 PCR법에 있어서의 각 조건, 사용하는 시약·프라이머 및 제한효소 등은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 이하에서는 후술하는 실시예에 있어서 사용한 조건 등에 대해서, 유전자시료로서 게놈 DNA를 이용한 경우 또는 cDNA를 이용한 경우로 나눠 설명한다.

[A] 유전자시료가 게놈 DNA인 경우

PCR 반응액으로서는, 게놈 DNA 20 ng에 AB gene Taq polymerase 0.25 Unit, 10×Taq polymerase buffer 1.5 ㎕, 10 mM dNTP mix 1.25 ㎕, 포워드 프라이머(6.25 pmol) 및 리버스 프라이머(6.25 pmol) 각 0.25 ㎕를 첨가한 물(物)을 초순수로 15 ㎕로 질량을 증가시킨 것을 사용할 수 있다.

여기서, 상기 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머로서는, 상기 <1> 및/또는 <2>, 바람직하게는 <1> 및 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드이면 된다.

예를 들면, 포워드 프라이머는, 서열표의 서열번호 1에 나타내는 염기서열의 일부이고, 또한, 검출하고자 하는 변이부위보다도 5'말단측에 위치하는 임의의 염기서열로 되는 올리고뉴클레오티드로 할 수 있다. 또한, 리버스 프라이머는, 서열표의 서열번호 1에 나타내는 염기서열의 일부이고, 또한, 검출하고자 하는 변이부위보다도 3'말단측에 위치하는 임의의 염기서열에 대한 상보적 염기서열로 되는 올리고뉴클레오티드로 할 수 있다.

상기 프라이머쌍은 바람직하게는 15~50개, 더욱 바람직하게는 18~27개의 뉴클레오티드로 되는 것이 바람직하고, 또한 PCR법에 의해 얻어지는 증폭산물의 길이에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니지만 100~500 염기가 되도록 하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 서열표의 서열번호 3에 나타내는 포워드 프라이머(FASN_F), 및 서열표의 서열번호 4에 나타내는 리버스 프라이머(FASN_R)를 예시할 수 있다. 이 포워드 프라이머는 FASN 유전자 제34 엑손 내의, 또한 리버스 프라이머는 FASN 유전자 제35 엑손 내의, 각 염기서열을 토대로 각각 제작한 것이다.

PCR의 반응조건은, 먼저 (1) 94℃ 4분, 다음으로 (2) 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 1사이클로 하여, 이것을 35사이클 행하고, 마지막으로 (3) 72℃ 7분으로 설정하면 된다.

서열표의 서열번호 3, 4에 나타내는 프라이머쌍을 사용한 상기 PCR법에 의해, 336 bp의 PCR 증폭산물을 얻을 수 있다.

다형의 검출에 사용하는 제한효소 등은, 상기 <1>, <2> 중 어느 염기를 검정하는지에 따라, 이하와 같이 상이하다.

[A-1] 상기 <1>의 염기를 검정하는 경우

상기에서 얻어진 PCR 증폭산물을 제한효소 HhaI로 처리하면, 상기 <1>의 염기가 아데닌인 경우, PCR 산물의 <1>의 다형부위는 동 제한효소로 절단되지 않는다. 이 때, 코드하는 아미노산은 트레오닌에 상당하기 때문에, 유전자형은 T형으로 판정된다.

한편, 상기 <1>의 염기가 구아닌인 경우, PCR 산물의 <1>의 다형부위는 동 제한효소로 절단된다. 이 때, 코드하는 아미노산은 알라닌에 상당하기 때문에, 유전자형은 A형으로 판정된다.

[A-2] 상기 <2>의 염기를 검정하는 경우

상기에서 얻어진 PCR 증폭산물을 제한효소 NciI로 처리하면, 상기 <2>의 염기가 티민인 경우, PCR 산물의 <2>의 다형부위는 동 제한효소로 절단되지 않는다. 이 때, 코드하는 아미노산은 트립토판에 상당하기 때문에, 유전자형은 W형으로 판정된다.

한편, 상기 <2>의 염기가 시토신인 경우, PCR 산물의 <2>의 다형부위는 동 제한효소로 절단된다. 이 때, 코드하는 아미노산은 아르기닌에 상당하기 때문에, 유전자형은 R형으로 판정된다.

[B] 유전자시료가 cDNA인 경우

PCR 반응액으로서는, 게놈 DNA일 때와 마찬가지로, cDNA 20 ng에 AB gene Taq polymerase 0.25 Unit, 10×Taq polymerase buffer 1.5 ㎕, 10 mM dNTP mix 1.25 ㎕, 포워드 프라이머(6.25 pmol) 및 리버스 프라이머(6.25 pmol) 각 0.25 ㎕를 첨가한 물(物)을 초순수로 15 ㎕로 질량을 증가시킨 것을 사용할 수 있다.

이 경우에 있어서도, 사용하는 프라이머는 게놈 DNA일 때와 완전히 동일한 것을 사용해도 된다. 즉, 상기 <1> 및/또는 <2>, 바람직하게는 <1> 및 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 것이면 된다.

구체적으로는, 포워드 프라이머로서 서열표의 서열번호 3에 기재된 염기서열로 되는 올리고뉴클레오티드를, 또한 리버스 프라이머로서 서열번호 4에 기재된 염기서열로 되는 올리고뉴클레오티드를, 각각 사용하면 된다.

전술한 바와 같이, 서열표의 서열번호 3에 기재된 포워드 프라이머는 제34 엑손 내의, 또한 서열표의 서열번호 4에 기재된 리버스 프라이머는 제35 엑손 내의, 각 염기서열을 토대로 제작된 것이나, 유전자시료로서 cDNA를 사용하는 경우, 스플라이싱에 의해 인트론부분이 잘려 있는 만큼, 유전자시료로서 게놈 DNA를 사용하는 경우와 비교하여, 그 PCR 증폭 단편은 짧아진다.

이것에 의해, 만일 사용한 cDNA 중에 게놈 DNA가 소화되지 않고 남아 있었던 경우에는, PCR 반응 후에 있어서 1개의 레인에 2개의 증폭 단편이 검출되게 된다. 즉, 유전자시료로서 cDNA를 사용하는 경우는, 이 포워드 및 리버스 각 프라이머를 사용하여 PCR을 행함으로써, 게놈 DNA의 오염(contamination)의 확인도 가능하다.

PCR의 반응조건은, 이것도 게놈 DNA일 때와 마찬가지로, 먼저 (1) 94℃ 4분, 다음으로 (2) 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 1사이클로 하여, 이것을 35사이클 행하고, 마지막으로 (3) 72℃ 7분으로 설정하면 된다.

서열표의 서열번호 3, 4에 나타내는 프라이머쌍을 사용한 상기 PCR법에 의해, 226 bp의 PCR 증폭산물을 얻을 수 있다.

도 1에는, 이들 PCR 반응에 사용하는 서열번호 3 및 서열번호 4에 나타내어지는 프라이머의 각 위치를, 흰색 화살표 기호로 각각 모식적으로 나타내었다. 오른방향을 향한 흰색 화살표 기호는 포워드 프라이머를, 왼방향을 향한 흰색 화살표 기호는 리버스 프라이머를 각각 나타내고 있다.

유전자시료로서 게놈 DNA를 사용하는 경우, 이들 흰색 화살표에 의해 사이에 끼이는 단편 전체(프라이머부분을 포함)가 증폭되는 것에 반하여, 유전자시료로서 cDNA를 사용하는 경우는 제34 엑손과 제35 엑손에 끼이는 인트론부분이 잘리는 결과, 유전자시료로서 게놈 DNA를 사용하는 경우보다도 짧은 단편이 증폭된다.

다형의 검출에 사용하는 제한효소 등은 상기 <1>, <2> 중 어느 염기를 검정하는지에 따라 상이하나, 상기 [A]에 있어서의 [A-1] 및 [A-2]에 기재된 것과 동일하고, 또한 처리방법 및 검출방법에 대해서도 완전히 동일하게 행할 수 있다. 결과의 판정법에 대해서도 완전히 동일하다.

또한, 유전자시료가 게놈 DNA인 경우 및 cDNA인 경우 중 어느 것에 있어서도, PCR-RFLP 처리는 이하와 같이 행할 수 있다. 즉, HhaI를 사용하는 경우는, PCR 산물 5 ㎕에 버퍼 0.5 ㎕, BSA 1 ㎕, 및 HhaI 5 U를 첨가한 후 초순수로 10 ㎕로 질량을 증가시켜, 반응액으로 한다. 또한, NciI를 사용하는 경우는, PCR 산물 5 ㎕에 버퍼 0.5 ㎕, 및 NciI 5 U를 첨가한 후 초순수로 10 ㎕로 질량을 증가시켜, 반응액으로 한다. 다음으로, 이들 반응액을 37℃하에서 하룻밤 반응시킨다. 전기영동의 조건은 2% 아가로오스 겔을 사용하여, 100 V, 30분간 전기영동을 행한다.

도 2에는 진기영동의 결과가 나타내어진다. 이들 결과는, 서열표의 서열번호 3, 4에 나타내는 프라이머쌍 및 HhaI를 사용하여 상기 <1>의 염기를 검출한 경우의 것으로, 레인 1~3은 유전자시료로서 cDNA를 사용한 결과를 나타내고, 레인 4~6은 유전자시료로서 게놈 DNA를 사용한 결과를 나타낸다.

도면의 레인 1 및 4에 나타내는 바와 같이, 분자량이 큰 밴드(각각 226 bp 및 336 bp)만 출현한 경우, 상기 <1>의 염기는 아데닌의 호모이고, 코드되는 아미노산에 의해 나타내면 T 호모형으로 판정된다. 또한 도면의 레인 3 및 6에 나타내는 바와 같이, 분자량이 작은 밴드(각각 74 bp, 152 bp 및 262 bp)만 출현한 경우, 상기 <1>의 염기는 구아닌의 호모이고, 코드되는 아미노산에 의해 나타내면 A 호모형으로 판정된다. 또한, 도면의 레인 2 및 5에 나타내는 바와 같이, 상기의 크고 작은 2개의 밴드가 출현한 경우는, 유전자형은 헤테로로 판정할 수 있다.

이와 같이, PCR-RFLP법에 의하면, 간편하고 높은 정밀도로 FASN 유전자의 유전자형을 조사할 수 있다.

또한, 전술한 바와 같이, FASN 유전자의 2개의 1염기다형(SNP)은 그 사이에 겨우 14염기를 두고 있을 뿐으로 매우 근접해 있기 때문에, 이들에 의해 형성되는 하플로타입은 거의 고정된 것으로 생각해도 되고, 따라서 기본적으로는 어느 한쪽의 변위를 검출하면 저절로 다른 한쪽의 형(型)도 판정 가능한 것으로 생각해도 된다.

그러나 전술한 바와 같이, TW형 및 AR형 이외의 하플로타입이 존재할 가능성, 즉 2개의 1염기다형(SNP)의 사이에서 재조합을 일으키고 있는 개체가 존재할 가능성을 완전히 부정할 수는 없기 때문에, FASN 유전자형의 판정에 있어서는, 2개소의 1염기다형(SNP)을 모두 확인함으로써 보다 정확성은 높아진다.

(3) 본 발명의 판정방법의 변경 태양

전술한 바와 같이, 본 발명의 판정방법은, 상기 (2)의 PCR-RFLP법에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 PCR-RFLP법에 의해 판정한다 하더라도, 각 반응조건, 사용하는 시약·프라이머·제한효소 등은 다양하게 변경 가능하다.

물론, 본 발명의 판정방법에 있어서는, PCR-RFLP법 이외의 방법을 사용해도 된다. FASN 유전자 상의 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 직접적 또는 간접적으로 검출 가능한 방법이라면, 염기서열 상의 점변이를 검출하는 방법, 1염기다형(SNP)에 있어서의 염기를 검정하는 방법(SNP 타이핑) 등 종래 공지의 각종 방법을 적용할 수 있다.

일례로서, 서멀 사이클러와 형광 검출기를 구비한, 변이검출·실시간 PCR(정량 PCR)이 모두 가능한 PCR 장치(예를 들면, 로슈·다이어그노스틱스사가 개발한 상품명 「라이트사이클러 시스템」이 있다.)를 사용한 판정방법을 들 수 있다.

이 방법에서는, 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역을 PCR법에 의해 증폭하기 위한 프라이머쌍 및, 3'말단이 형광물질 FITC(Fluorescein Iso Thio Cyanate)로 표지된 변이검출용 프로브 및, 5'말단이 형광물질 LC-RED(Light Cycler-Red)로 표지되며, 또한 3'말단이 인산화되어 있는 앵커 프로브를, 각각 적절히 설계해서 사용한다. 이들은, 적절한 업자 등에게 의뢰하여 제작하는 것도 가능하다.

다음으로, 이들 프라이머, 변이검출용 프로브 및 앵커 프로브를, 피검체로부터의 시료 DNA와 함께 DNA 합성효소를 포함하는 적절한 시료와 혼합하고, 라이트사이클러 시스템을 이용한 증폭반응을 행한다. 이 때 사용하는 변이검출용 프로브는, 목적으로 하는 변이부분(즉 <1> 및/또는 <2>의 염기)을 덮도록 설계되어 있기 때문에, 만일 변이가 있었던 경우에서는, 변이가 없었던 경우와 비교하여 DNA의 변성온도에 차가 생기기 때문에, 이를 이용하여 다형을 검출할 수 있다.

상기 판정방법에 이용 가능한 변이검출용 프로브로서는, 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역에 대해 특이적으로 결합하고, 또한, 3'말단이 형광물질 FITC로 표지되어 있는 뉴클레오티드 프로브이면 된다. 그 중에서도, 20~30개의 뉴클레오티드로 되는 것이 바람직하다. 당해 뉴클레오티드 프로브의 서열은, 예를 들면, 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열의 일부이고, 또한, 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 서열 또는 그의 상보서열을 사용할 수 있다.

그 밖에도, 본 발명의 판정방법의 일태양으로서, DNA 칩 등의 유전자다형 검출기구를 사용한 판정방법이나, PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism)법 등의 점변이 검출법을 사용하는 방법을 들 수 있다.

또한, 여기서 「DNA 칩」이란, 주로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 사용하는 합성형 DNA 칩을 의미하나, PCR 산물 등의 cDNA를 프로브로 사용하는 첩부형(貼付型) DNA 마이크로어레이도 포함하는 것으로 한다.

DNA 칩을 사용하여 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 검정하기 위해서는, 이들 중 어느 하나의 염기를 검정하기 위한 프로브를 기반(基盤) 상에 배치한 DNA 칩(또는 동종의 기구)을 제작하여, 이 DNA 칩 등을 사용해서 피검체의 소로부터의 유전자시료와 프로브의 하이브리다이제이션을 행하고, 하이브리다이제이션 시그날의 유무에 따라 1염기다형의 타이핑을 행하면 된다.

상기 DNA 칩 등에 사용하는 프로브에는, 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역에 대해 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 프로브를 사용할 수 있고, 구체적으로는, 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열의 일부이고, 또한, 상기 <1> 및/또는 <2>의 다형부위의 염기를 포함하는 염기서열 또는 그의 상보서열을 사용할 수 있다. 그 중에서도, 20~30개의 뉴클레오티드로 되는 것이 바람직하다.

또한, PCR-RFLP법을 사용하는 본 발명의 판정방법에 있어서, PCR법 대신에 다른 증폭방법(예를 들면 RCA(Rolling Circle Amplification)법 등)을 사용해도 되고, 더 나아가서는 DNA 증폭 후, RFLP법 대신에, 염기서열 결정장치(DNA 시퀀서) 등에 의해 직접 증폭 단편의 염기서열을 결정하고, 1염기다형(SNP)의 타이핑을 행해도 된다.

또한, FASN 유전자의 염기서열은, 유럽 소(Bos taurus)에 속하는 동물 사이에서도, 상기 <1>, <2>의 1염기다형(SNP) 이외에도 변이가 생겨 있을 가능성이 있다. 즉, 엄밀하게는 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열과는 상이한 FASN 유전자 서열을 갖는 소도 존재할 가능성이 있으나, 이러한 소에 대해서도, 전술한 본 발명의 판정방법을 사용해서 FASN 유전자의 유전자형을 조사함으로써, 근육내 지방에 있어서의 지방산 함량의 많고 적음의 판정, 및 이를 토대로 하는 쇠고기의 식미의 좋음의 판정은 가능하다.

또한, 피검체의 소가 유전자 재조합법 등에 의해 인위적으로 만들어진 소인 경우, FASN 유전자도 인위적으로 변이가 도입되어 있을 가능성이 있으나, 이러한 경우도, 상기와 동일하게 본 발명의 판정방법을 적용할 수 있다.

피검체의 소로부터 조제하는 유전자시료는 DNA여도 되고 RNA여도 된다. 또한, 유전자시료의 조제방법에 대해서도 통상적인 방법으로 행하면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다.

(4) 본 발명의 이용분야(유용성)

본 발명의 판정방법은, FASN 유전자의 유전자형을 토대로, 소의 근육내 지방 중에 포함되는 지방산 조성, 특히 올레산 함유량의 많고 적음을 판정하는 방법으로, 축산(소의 사육·번식·육종·개량 등), 쇠고기의 생산가공 등의 분야에 이용 가능하다.

전술한 바와 같이, 소의 근육내 지방에 포함되는 지방산 중 가장 많이 포함되어 있는 것이 올레산이고, 특히 흑모화종의 고기는 외국 품종의 그것과 비교하여 올레산 함유량이 유의하게 높은 것이 알려져, 일본인이 선호하는 쇠고기의 양호한 식미에 크게 영향을 주는 것이 시사되어 있다.

따라서, 본 발명의 판정방법에 의해, 흑모화종 등의 육용종(육우) 또는 육용으로서도 제공되는 홀스타인종 등의 유용종에 대해서, 보다 양호한 식미를 구비한 육질을 갖는 소인지 여부를 평가할 수 있다. 또한, 이 평가결과를 토대로, 유전자형을 토대로 분류된 보다 식미가 우수한 육질을 갖는 소끼리를 교배시키거나 하여, 지금까지 불가능에 가까웠던 쇠고기의 식미를 개량하는 것도 가능해진다.

또한, 유전자 재조합법 등을 사용하여 소의 품종개량을 행하거나, 축산 등의 분야에 유용한 유전자 실험을 행하는 경우에도, 대상이 되는 소와 정자, 수정란 등의 선별에 본 발명의 판정방법을 이용할 수 있다. 그 밖에, 출산 전의 판정도 가능하여, 예를 들면 자궁의 양수로부터 소 태아 유래의 세포를 채취하고, 그 세포로부터 유전자시료를 조제하여, 보다 식미가 우수한 쇠고기를 생산하는 소인지의 여부 등을 판정할 수 있다.

이하에 실시예 등을 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다.

하기 실시예에서는, 피검체의 소(흑모화종, 리무진종, 헤리퍼드종, 앵거스종, 홀스타인종 및, 이들의 교잡종)의 근육조직으로부터 통상적인 방법에 따라 조제한 게놈 DNA를 유전자시료로 사용하여, 전술한 PCR-RFLP법에 의해 판정을 행하였다.

또한, 하기 실시예에서는, 상기 <1>의 염기를 조사함으로써, FASN 유전자의 유전자형(하플로타입형)이 TW형인지, AR형인지를 판정하였다.

PCR법에 사용한 시약, 반응조건 등은 상기에서 예시한 바와 같아, 여기에서 는 그 설명은 생략한다. 또한, PCR법에 있어서 프라이머쌍은 서열표의 서열번호 3, 4에 나타내는 것을 사용하였다.

(1) FASN 유전자형과 각종 지방산 함유량의 관련성

하기 표 1은, 상기 판정방법에 의해, 전술한 흑모화종과 리무진종으로 되는 유전자 해석용 F2 가계집단에 있어서 FASN 유전자의 유전자형 판정을 행한 결과와, 각각의 유전자형에 있어서의 근육내 지방에 포함되는 지방산의 평균값, 표준편차를, 각각 나타낸 것이다. 또한, 유전자형은 각각의 염기 치환에 수반되어 코드되는 아미노산형으로 구성되는 하플로타입으로 나타내었다.

또한, 표 1에 있어서, C14:0은 미리스트산, C16:0은 팔미트산, C18:1은 올레산을 나타낸다.

여기서, 각종 지방산 함유량은 이하의 방법으로 측정하였다.

시료인 쇠고기 약 1 g을 유리 원침관에 덜어, 거기에 생리식염수 20 ㎖와 메탄올클로로포름용액(클로로포름·메탄올·부틸히드록시톨루엔을 각 2리터·1리터·15 ㎎으로 혼합한 스톡용액) 40 ㎖를 각각 투입하고, 호모지나이저에 의해 균질화하였다. 이것을 분액깔때기에 부어 7분간 교반하고, 무수 황산나트륨을 통과시켜 여과하였다. 이것을 증발기로 감압 건고하여, 지질 시료로 하였다.

계속해서 시료에 1규정 수산화칼륨메탄올용액 5 ㎖를 첨가하고, 95℃의 수욕 상에서 1시간 환류 가열하여, 비누화한 후, 디에틸에테르 10 ㎖를 첨가하고, 교반하여, 상청을 버렸다. 거기에 6규정 황산 1 ㎖와 석유에테르 10 ㎖를 넣고 교반하여, 상청을 별도의 시험관으로 옮겼다. 이것을 증발기로 감압 건고하고, 거기에 삼 플루오르화붕소메탄올용액 1 ㎖를 첨가하고, 95℃의 수욕 상에서 5분간 환류 가열하여 메틸화하였다. 헥산을 첨가하고 전용한 후, 분리하고, 무수 황산나트륨으로 탈수하여, 가스크로마토그래프로 제공하고, 지방산 조성의 측정을 행하였다.

또한, 가스크로마토그래프의 조건은 이하에 나타내는 바와 같다.

(가스크로마토그래프의 분석조건)

칼럼 CP-Sil88Wcot 0.25 mm×50 m

캐리어가스 헬륨

주입온도 220℃

칼럼온도 160℃ 항온

검출 FID

상기와 같이, FASN 유전자형을 요인으로 하는 일원배치 분산분석을 행한 결과, 근육내 지방에 있어서의 지방산 함유량은, 하플로타입형의 분류에 따라, 지방산종별로 각각 상이하였다. 탄소수 14 및 16의 각 포화지방산에 있어서는, AR/AR형, TW/AR형, TW/TW형의 순으로 각 함유량은 높은 값을 나타내었다. 이에 대해, 탄소수 18의 1가 불포화지방산(올레산)은, TW/TW형, TW/AR형, AR/AR형의 순으로 그 함유량은 높은 값을 나타내었다.

전술한 바와 같이, 올레산 함유량은 화우육의 식미와의 관련이 시사되어 있는데, 이 결과로부터, FASN 유전자의 2개의 대립유전자 중, TW형 대립유전자를 보유하는 소는 AR형 대립유전자를 보유하는 소 보다도 올레산 함유량이 높고, 반대로 그 이외의 지방산 함유량은 낮아지는 경향을 나타내는 것을 알 수 있었다. 즉, FASN 유전자의 유전자형을 조사함으로써, 쇠고기의 식미의 좋음도 판정하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다.

또한, 표 1 중, 윗첨자 a, b, c는 p<3.93×10^-20이고, 또한 d, e, f는 p<0.002이며, 또한 g, h, i는 p<2.4×10^-6으로, 각각 유의차가 인정되었다.

(2) 흑모화종 A의 반형제집단(half-sibling population)에 있어서의 FASN 유전자형과 올레산 함유량의 관련성

그러나, 상기 (1)에서 얻어진 결과는, 어디까지나 흑모화종과 육용 외국 품종인 리무진종과의 품종간 차이기 때문에, 일본국 내의 흑모화종에 있어서, FASN 유전자형의 근육내 지방에 포함되는 올레산 함유량에 미치는 영향을 확인할 필요가 있었다. 이에, 야마가타켄 내에서 계양(繫養)되는 흑모화종 비육우(肥育牛) 중, 유명종 수소 A의 반형제집단 샘플을 수집하고, 게놈 DNA를 추출하여, FASN 유전자형의 조사를 행하였다.

하기 표 2에는, 유명종 수소 A의 반형제집단 샘플에 있어서 FASN 유전자형 판정을 행한 결과와, 근육내 지방에 포함되는 올레산 함유량의 평균값, 표준편차를 각각 나타낸 것이다. 또한, 올레산 함유량의 측정은, 상기 (1)과 동일하게 행하였다.

상기와 같이, 표 1에서 유전자 해석용 F2 집단에 있어서 보여진 것과 동일한 경향을, 흑모화종 유명종 수소 A의 반형제집단에 있어서도 확인할 수 있었다. 즉, 근육내 지방에 포함되는 올레산 함유량은, TW/TW형, TW/AR형, AR/AR형의 순으로 높은 값을 나타내었다. 표 2 중의 상이한 윗첨자는, p<2.2×10^-10으로 유의차를 나타낸다. 이 결과로부터, FASN 유전자형은, 흑모화종의 근육내 지방에 포함되는 올레산 함유량에 대해서도 효과를 갖는 것이 나타내어졌다.

또한, 이 유명종 수소 A의 반형제 샘플에 있어서도, 상기 표 1에서 나타낸 유전자 해석용 F2 집단의 결과와 마찬가지로, 올레산 이외의 복수의 지방산종에 있어서 FASN 유전자형과의 유의한 관계를 확인하였으나, 상기 표 2에는 특별히 쇠고기의 식미와의 관계가 시사되는 올레산 함유량과의 관계에 대해서만 나타내었다.

(3) 흑모화종 3마리의 반형제집단에 있어서의 FASN 유전자형과 올레산 함유량의 관련성

그 다음, 계속해서 야마가타켄 내에서 계양되는 흑모화종 비육우집단의 샘플 수집을 거듭한 결과, 전술한 유명종 수소 A와는 상이한, 유명종 수소 3마리로 이루어진 반형제집단 샘플을 확보할 수 있었다. 이들에 대해서도 상기 (1)과 동일하게 게놈 DNA를 추출하여 FASN 유전자형의 조사를 행하였다.

하기 표 3은, 유명종 수소 3마리로 이루어진 반형제집단 샘플에 있어서, FASN 유전자형 판정을 행한 결과와, 근육내 지방에 있어서의 올레산 함유량의 평균값, 표준편차를 각각 나타낸 것이다.

표 3과 같이, 상기 (1), (2)에서 지금까지 확인된 것과 동일한 경향이 나타내어졌다. 다만, 이 집단에 있어서 AR형을 호모로 갖는 개체는 1마리도 존재하지 않았다. 이에 대해서는, 사용한 반형제집단의 부(父)인 3마리의 유명종 수소 각각의 FASN 유전자형이 우연히 모두 TW형 호모였던 것이 판명되어, 그것이 원인임을 알 수 있었다. 표 3 중의 상이한 윗첨자는 p<5.7×10^-4로 유의차를 나타낸다.

또한, 이 경우에 있어서도, 올레산 이외의 복수의 지방산종에 있어서 FASN 유전자형과의 유의한 관계를 확인하였으나, 상기 표 3에는, 특히 쇠고기의 식미와의 관계가 시사되는 올레산 함유량과의 관계에 대해서만 나타내었다.

이상, 표 1~표 3에 나타낸 바와 같이, FASN 유전자형이 흑모화종의 근육내 지방에 포함되는 올레산 함유량의 많고 적음에 대해 효과를 갖는 것이 더욱 명백해졌다.

(4) FASN 유전자의 유전자형 빈도 및 유전자 빈도에 있어서의 품종간 차

다음으로, FASN 유전자의 아미노산 치환을 수반하는 2개의 1염기다형(SNP)에 의해 구성되는 하플로타입형으로 나타낸 유전자형 빈도와, 마찬가지로 하플로타입형으로 나타낸 대립유전자 빈도의, 품종간에 있어서의 차이에 대해서 조사하였다.

즉, 하기 표 4에 나타내는 각 품종의 소의 종 수소 동결 정액으로부터 통상적인 방법에 의해 추출한 게놈 DNA를 샘플로서 사용하여, 상기 (1)과 동일하게 FASN 유전자형의 조사를 행하였다. 또한, 여기서 사용한 흑모화종 및 홀스타인종의 종 수소 동결 정액은, 모두 일본국 내에 유통되고 있는 것을 사용하고 있다. 결과를 표 4에 나타낸다.

상기와 같이, 흑모화종과 유용종인 홀스타인종, 및 육용의 외국 품종 사이에서는, FASN 유전자형 빈도 및 유전자 빈도 모두 커다란 차가 보이는 것을 알 수 있었다. 즉, 근육내 지방에 있어서의 올레산 함유량을 보다 많게 하는 효과를 갖는 FASN 하플로타입형, 즉 TW형이, 흑모화종에서는 타품종과 비교하여 많이 확산되어 있는 것이 명확해졌다.

흑모화종의 고기는 홀스타인종이나 육용의 외국 품종과 비교하여 일본인이 선호하는 우수한 식미를 갖는 것이 일반적으로 널리 인식되어 있고, 또한, 거기에 올레산 함유량의 많고 적음이 관여하는 것도 시사되어 있는데, 상기에서 보여진 FASN 유전자형 빈도 및 유전자 빈도의 차이는, 이 흑모화종이 갖는 우수한 식미의 쇠고기를 생산하는 능력을 뒷받침하고 있다고도 할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> National Livestock Breeding Center, Incorporated Administrative Agency <120> Method for determination of quantity of fatty acid in bovine muscule based on genetic polymorphism associated with bovine fatty acid synthase gene and determination of palatability of beef based on said result <130> A-393 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 19760 <212> DNA <213> Bos Taurus <220> <221> misc_feature <222> (9198)..(9198) <223> unsure <220> <221> misc_feature <222> (11682)..(11682) <223> unsure <400> 1 ccgcggccgt cgcggaaggc ccctgcaggc ctcggagcgt cccccgggtt cccgcactcg 60 ccccgggaat ttggccggca aggcaggaag gacccggggc gttgcgctgc ggtgaccgac 120 agtaaccccg cacggggcac cctcggccgg gtcaatgacc gcgcgcggcc cgcgcagagc 180 ccggggccac ccggcccatc accctatcac ctagcaacgc ccactcgagg ggcgccattg 240 ggccagcgcg cacgcctcgg gcccccgatt ggctccggct gcagagagcc acgcccccgg 300 cccggctccg ctcagcccgg atgctggccg tcaattcgaa cgcctggggg tccgtctagc 360 ccccagtgtg gccccagtat gacccccaga gtgacccaag 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ttggagcccc 1260 cagccgccac accctcgagg gcctcctttt ccggcttggc cgccgaaccc ctccacccac 1320 ggcatcccca tgcctccggg tgcaggatag ccgtctcggc cgaccggagg gcctgagaag 1380 aggggaggga ggtggatgga ggaggcgcag ggccgtataa ggtcggctcc tccaccacgt 1440 gggctccatt tggagccccc agagttctgg ggggagagcc actcctgccg ggtgcaacct 1500 cacggcggcg cgcgcagttt cgccagcgcc gcaggggtct ccaccctttt gcctcgtccc 1560 gccggactcc gcgtgaatag caagtagggg gagaacagag cgggcgcttt ctggagaagc 1620 agccgccccg ggagctggtg cttctgggcc ggcaaagggc tctttattca gcgctggggg 1680 agggggctcc ctctgccgga acgccggggc gatcaggcca cccaaggaag acgctctctc 1740 cactcatact ttcccatgct cagagaaacc ctaaaggccc agtagttgga gagttcacca 1800 gtcatcggcg ccataaggcc ctggagcctt ggtgaaagtt tgcaggacca accttggcct 1860 tgcccacttc ctcaaacagg agccccatcc agggcccaca ggctcagggt agactaggtt 1920 cccccggtgg ggctgggaaa cctggggctg gatggacagg caggctgcac aagtaagcaa 1980 gcgcaagtcc tgaggcctcg acctgtgcaa gatgtgtggg tctgggtagt gcttgcctgg 2040 cagctgagag agtggttctc caggttggag cctgctggag gggccgtaca ggctggggct 2100 ggcccactgt gggacaggga ccaatttttc cccagagccc cgccaggcct tggcactgtt 2160 gaggagacca agctgtggtt ctggcctgga gggcagctcg agatactgag cgcagagcca 2220 gctagtccag tgtgggcact tcttaccacc accacatttg ccctgtatcc ttcgcctact 2280 aaattccctg ggctacctct taacaggctg acggccaggc agtcccttcc tcagaagggt 2340 ttgggccctg cctcccacca tggggccccc tcctgagtct cctgcagcag ggctgtggtg 2400 gggtcacccc aggccaaggc caatgcccag agagcccaat gcgaggtgtt ggcaggctgg 2460 accagagtgg ggactcccct ttcccaacca ccagacatac ccttcacaaa acgttccagc 2520 gggtgcacag ccccagagct ggccatgtgg atctttgttg cagggctttc tgagctgctg 2580 ttctcagacc cttgagtggg ccagatggag gagggagttc atgaagccag ggttgggaag 2640 cagctgggtc tccagcgagg ctgtggactg gcagtgctgg ggcccaggct gactggtgtc 2700 cgggccccca tgccaccctc cttgcagaga gagcagccat ggaggaggtg gtgatcactg 2760 gcatgtctgg gaagctgcct gagtcggaga acctggagga gttctgggcc aatctcattg 2820 gcggtgtgga catggtgaca gatgatgaca ggcggtggaa ggccggtaag cgagcctggg 2880 gcttccccgc ctacttgaga ggttcttttc tcaccccttc tgtggacaca 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ggtgggcgac 6300 ccccaggagc taaacggcat cgtgcaagcc ctgtgtggca cccgccagag ccccctgcgg 6360 attgggtcca ccaagtcgaa catgggacat ccggagcccg cctcagggct cgcggcgctg 6420 gccaaggtag gcaggcgagt ctagggccat cttgtccctg ccccgtcagc gtcttatagc 6480 ctgctggggg aagggtccct tccggctgtt ctgtgggata tgggtcatac tgaggcccgg 6540 agagcaggcc gccagcatgt ggccagcccc tgcctggttt cacagggcca gacattttac 6600 ccaagcactt gttccccaag gggccagcca gagggagcag aagcaacagg gcagcccgtg 6660 tttccaggct cgctctccct gtggcctcct gaccagctgg tagcttggag gacccaggtc 6720 actactggtt gagcttctga gtatgatggg agcttcctgg tggtctcagc tccctgggcc 6780 accatagcca cctgtctgca gctcttagct tgggagatgg ggtggggaat ggctgaggag 6840 cctttgtcta gatccacagc caatgaggct gggaggtggc agggccccag gtgaggccta 6900 gggctgagag gagacagagc atgtggcttg gtcaccaaga ccgctgcatt ggggcaggga 6960 cgagctttgg gggagaatga aattgcttgc agcgggcaag ggcttctggg gtgacacaga 7020 gggtccttag gaggggatgt acctgaagcc catcccgacc agcaggggca gggagcccag 7080 ggccggccgt cttgttgacc gcgaggcacc cacaggtgct gctgtccctg 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Ser Ser Leu Leu Ala Leu Gln Arg Ala Tyr Gln Ala Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Glu Cys Ala Met Ala Ile Val Gly Gly Val Asn Ile Arg Leu 180 185 190 Lys Pro Asn Thr Ser Val Gln Phe Met Lys Leu Gly Met Leu Ser Pro 195 200 205 Glu Gly Thr Cys Lys Phe Phe Asp Ala Ser Gly Asn Gly Tyr Cys Arg 210 215 220 Ala Lys Ala Val Met Ala Ile Leu Leu Thr Lys Lys Ser Leu Ala Arg 225 230 235 240 Arg Val Tyr Ala Thr Ile Leu Asn Ala Gly Thr Asn Thr Asp Gly Cys 245 250 255 Lys Glu Lys Gly Val Thr Phe Pro Ser Gly Glu Ala Gln Glu Gln Leu 260 265 270 Ile Ser Ser Leu Tyr Lys Pro Ala Gly Leu Asp Pro Glu Thr Leu Glu 275 280 285 Tyr Val Glu Ala His Gly Thr Gly Thr Lys Val Gly Asp Pro Gln Glu 290 295 300 Leu Asn Gly Ile Val Gln Ala Leu Cys Gly Thr Arg Gln Ser Pro Leu 305 310 315 320 Arg Ile Gly Ser Thr Lys Ser Asn Met Gly His Pro Glu Pro Ala Ser 325 330 335 Gly Leu Ala Ala Leu Ala Lys Val Leu Leu Ser Leu Glu His Gly Leu 340 345 350 Trp Ala Pro Asn Leu His Phe His Asn Pro Asn Pro Lys Ile Pro Ala 355 360 365 Leu Gln Asp Gly Arg Leu Gln Val Val Asp Arg Pro Leu Pro Val Leu 370 375 380 Gly Gly Asn Val Gly Ile Asn Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ser Asn Val 385 390 395 400 His Val Ile Leu Gln Pro Asn Ser Gln Pro Leu Pro Pro Pro Ala Pro 405 410 415 His Ala Ala Leu Pro Arg Leu Leu Arg Ala Ser Gly Arg Thr Leu Glu 420 425 430 Gly Val Gln Gly Leu Leu Glu Leu Gly Leu Gln His Ser Gln Asn Leu 435 440 445 Ala Phe Val Ser Met Leu Asn Asp Ile Ala Thr Pro Ser Pro Ala Ala 450 455 460 Met Pro Phe Arg Gly Tyr Ala Val Leu Gly Ser Gln Gly Gly Ser Gln 465 470 475 480 Lys Val Gln Gln Val Leu Ala Gly Lys Arg Pro Leu Trp Phe Ile Cys 485 490 495 Ser Gly Met Gly Thr Gln Trp Arg Gly Met Gly Leu Ser Leu Met Arg 500 505 510 Leu Ser Arg Phe Arg Asp Ser Ile Leu Arg Ser Asp Glu Ala Val Lys 515 520 525 Pro Leu Gly Leu Gln Val Ser Gln Leu Leu Leu Ser Thr Asp Glu Ala 530 535 540 Ile Phe Asp Asp Met Val Ile Ser Phe Val Ser Leu Thr Ala Ile Gln 545 550 555 560 Ile Ala Leu Ile Asp Leu Leu Thr Ser Met Gly Leu Gln Pro Asp Gly 565 570 575 Ile Ile Gly His Ser Leu Gly Glu Val Ala Cys Gly Tyr Ala Asp Gly 580 585 590 Cys Ile Ser Gln Glu Glu Ala Ile Leu Ser Ala Tyr Trp Arg Gly Gln 595 600 605 Cys Ile Lys Glu Ala Asn Ile Pro Pro Gly Ala Met Ala Ala Val Gly 610 615 620 Leu Thr Trp Glu Glu Cys Lys Gln Arg Cys Pro Pro Gly Ile Val Pro 625 630 635 640 Ala Cys His Asn Cys Ile Asp Thr Val Thr Ile Ser Gly Pro Gln Ala 645 650 655 Ser Met Leu Glu Phe Val Gln Gln Leu Lys Gln Glu Gly Val Phe Ala 660 665 670 Lys Glu Val Arg Thr Gly Gly Met Ala Phe His Ser Tyr Phe Met Asp 675 680 685 Ala Ile Ala Pro Met Leu Leu Gln Gln Leu Lys Lys Val Ile Arg Glu 690 695 700 Pro Gln Pro Arg Ser Pro Arg Trp Leu Ser Thr Ser Ile Pro Glu Thr 705 710 715 720 Gln Trp Gln Glu Ser Leu Ala Arg Thr Phe Ser Ala Glu Tyr Asn Val 725 730 735 Asn Asn Leu Val Ser Pro Val Leu Phe Gln Glu Ala Leu Trp Arg Val 740 745 750 Pro Glu Asp Ala Val Val Leu Glu Ile Ala Pro His Ala Leu Leu Gln 755 760 765 Ala Val Leu Lys Arg Gly Leu Lys Ser Ser Cys Thr Ile Ile Pro Leu 770 775 780 Met Lys Lys Asp His Arg Asp Asn Leu Glu Phe Phe Leu Ser Asn Val 785 790 795 800 Gly Gln Leu Tyr Leu Thr Gly Ile Asp Val Asn Pro Asn Gly Leu Phe 805 810 815 Pro Pro Val Glu Phe Pro Ala Pro Arg Gly Thr Pro Leu Ile Ser Pro 820 825 830 His Ile Lys Trp Asp His Ser Gln Thr Trp Asp Val Pro Thr Ala Glu 835 840 845 Asp Phe Pro Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ala Thr Ile Tyr Lys Ile 850 855 860 Asp Ile Asn Pro Glu Ser Pro Asp His Tyr Leu Val Asp His Cys Ile 865 870 875 880 Asp Gly Arg Ile Ile Phe Pro Gly Thr Gly Tyr Leu Cys Leu Val Trp 885 890 895 Lys Thr Leu Ala Arg Ala Leu Asp Gln Asn Met Glu His Thr Pro Val 900 905 910 Val Phe Glu Asp Val Thr Leu His Gln Ala Val Ile Leu Pro Lys Thr 915 920 925 Gly Ile Val Leu Leu Lys Val Arg Leu Leu Glu Ala Ser Cys Thr Phe 930 935 940 Glu Val Ser Glu Asn Gly Asn Leu Ile Ala Ser Gly Lys Val Tyr Gln 945 950 955 960 Trp Glu Asp Pro Asn Pro Lys Leu Phe Asp Asn Arg Tyr Gly Pro Asp 965 970 975 Pro Ala Thr Pro Val Asp Pro Thr Thr Ala Ile His Leu Ser Arg Gly 980 985 990 Asp Val Tyr Lys Glu Leu Gln Leu Gln Gly Phe Asn Tyr Gly Pro Tyr 995 1000 1005 Phe Gln Gly Ile Leu Glu Ala Ser Ser Glu Gly Asn Thr Gly Gln 1010 1015 1020 Leu Leu Trp Lys Asp Asn Trp Val Thr Phe Met Asp Thr Met Leu 1025 1030 1035 Gln Met Ser Ile Leu Ala Pro Ser Lys Arg Ser Leu Arg Leu Pro 1040 1045 1050 Thr Arg Ile Thr Ala Ile Tyr Ile His Pro Ala Thr His Gln Gln 1055 1060 1065 Lys Leu Tyr Thr Leu Gln Asp Lys Thr Gln Val Ala Asp Val Val 1070 1075 1080 Ile Asn Arg Cys Leu Asp Thr Thr Val Ala Gly Gly Ile Tyr Ile 1085 1090 1095 Ser Arg Ile His Thr Ser Val Ala Pro Arg His Gln Gln Glu Gln 1100 1105 1110 Leu Val Pro Ile Leu Glu Lys Phe Cys Phe Thr Pro His Val Glu 1115 1120 1125 Thr Gly Cys Leu Ala Gly Asn Leu Ala Leu Gln Glu Glu Leu Gln 1130 1135 1140 Leu Cys Val Gly Leu Ala Gln Ala Leu Gln Thr Arg Val Ala Gln 1145 1150 1155 Gln Gly Ile Lys Met Val Val Pro Gly Leu Asp Gly Ala Gln Ala 1160 1165 1170 Pro Gln Glu Ala Pro Gln Gln Gly Leu Pro Arg Leu Leu Ala Thr 1175 1180 1185 Ala Cys Gln Leu Gln Leu Asn Gly Asn Leu Gln Met Glu Met Gly 1190 1195 1200 Gln Ile Leu Ala Gln Glu Arg Ala Leu Leu Cys Asp Asp Pro Leu 1205 1210 1215 Leu Ser Gly Leu Leu Asn Ser Pro Ala Leu Lys Ala Cys Val Thr 1220 1225 1230 Leu Ala Leu Glu Asn Met Thr Ser Leu Lys Met Lys Val Val Leu 1235 1240 1245 Ala Gly Asp Gly Gln Leu Tyr Ser Arg Ile Pro Thr Leu Leu Asn 1250 1255 1260 Thr Gln Pro Leu Leu Glu Leu Asp Tyr Thr Ala Thr Asp Arg His 1265 1270 1275 Pro Gln Ala Leu Glu Ala Ala Gln Ala Lys Leu Gln Gln Leu Asp 1280 1285 1290 Ile Thr Gln Gly Gln Trp Asp Pro Ser Asp Pro Ala Pro Ser Asn 1295 1300 1305 Leu Gly Gly Ala Asn Leu Val Val Cys Asn Tyr Ala Leu Ala Ser 1310 1315 1320 Leu Gly Asp Pro Ala Thr Ala Val Gly Asn Met Val Ala Ala Leu 1325 1330 1335 Lys Glu Gly Gly Phe Leu Leu Leu His Thr Leu Leu Arg Gly His 1340 1345 1350 Pro Leu Gly Glu Thr Val Thr Phe Leu Thr Cys Pro Glu Pro Gln 1355 1360 1365 Gln Gly Gln Arg His Leu Leu Ser Gln Asp Glu Trp Glu Arg Leu 1370 1375 1380 Phe Ala Gly Ala Ser Leu His Leu Val Ala Leu Lys Lys Ser Phe 1385 1390 1395 Tyr Gly Ser Val Leu Phe Leu Cys Arg Arg Leu Ala Pro Leu Asp 1400 1405 1410 Ser Pro Ile Phe Leu Pro Val Glu Asp Thr Ser Phe Gln Trp Val 1415 1420 1425 Asp Ser Leu Lys Asn Ile Leu Ala Asp Ser Ser Ser Arg Ala Val 1430 1435 1440 Trp Leu Met Ala Val Gly Cys Thr Thr Ser Gly Val Val Gly Leu 1445 1450 1455 Val Asn Cys Leu Arg Lys Glu Pro Asp Gly His Arg Ile Arg Cys 1460 1465 1470 Val Leu Val Ser Asn Leu Asn Ser Thr Ser Pro Ile Pro Glu Thr 1475 1480 1485 Asp Pro Lys Ser Leu Glu Leu Gln Lys Val Leu Gln Ser Asp Leu 1490 1495 1500 Val Met Asn Val Tyr Arg Asp Gly Ala Trp Gly Ala Phe Arg His 1505 1510 1515 Phe Pro Leu Glu Gln Asp Lys Pro Glu Glu Gln Thr Glu His Ala 1520 1525 1530 Phe Ile Asn Val Leu Thr Arg Gly Asp Leu Ser Ser Ile Arg Trp 1535 1540 1545 Val Cys Ser Pro Leu Arg His Ser Gln Pro Thr Ala Pro Gly Phe 1550 1555 1560 Gln Leu Cys Thr Ile Tyr Tyr Ala Ser Leu Asn Phe Lys Arg Asn 1565 1570 1575 His Ala Gly His Gly Gln Ala Val Pro Arg Arg His Pro Arg Asn 1580 1585 1590 Trp Ala Ser Arg Asn Cys Leu Leu Gly Met Glu Phe Ser Gly Arg 1595 1600 1605 Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Met Gly Leu Val Pro Ala Glu Gly 1610 1615 1620 Leu Ala Thr Ser Thr Leu Val Pro Gln Ser Phe Leu Trp Asp Val 1625 1630 1635 Pro Ser Asn Trp Thr Leu Glu Glu Ala Ala Ser Val Pro Val Val 1640 1645 1650 Tyr Ser Thr Ala Tyr Tyr Ala Leu Met Val Arg Gly Arg Met Gln 1655 1660 1665 Pro Gly Glu Thr Val Leu Ile His Ser Gly Ser Gly Gly Val Gly 1670 1675 1680 Gln Ala Ala Ile Ala Ile Ala Leu Ser Leu Gly Cys Arg Val Phe 1685 1690 1695 Pro Leu Val Gly Ser Ala Glu Lys Arg Ala Tyr Leu Gln Ser Arg 1700 1705 1710 Phe Pro Gln Leu Asn Glu Thr Ser Phe Ala Asn Ser Arg Asp Thr 1715 1720 1725 Ser Phe Glu Gln His Val Leu Trp His Thr Ala Gly Lys Gly Ala 1730 1735 1740 Asp Leu Val Leu Asn Ser Leu Ala Glu Glu Lys Leu Gln Ala Ser 1745 1750 1755 Val Arg Cys Leu Ala Gln His Gly Arg Phe Leu Glu Ile Gly Lys 1760 1765 1770 Phe Asp Leu Ser Lys Asn His Pro Leu Gly Met Ala Ile Phe Leu 1775 1780 1785 Lys Asn Val Thr Phe His Gly Ile Leu Leu Asp Ser Leu Phe Glu 1790 1795 1800 Glu Asn Asn Thr Met Trp Gln Glu Val Ser Thr Leu Leu Lys Ala 1805 1810 1815 Gly Ile Arg Lys Gly Val Val Gln Pro Leu Lys Arg Thr Val Phe 1820 1825 1830 Pro Arg Thr Gln Ala Glu Asp Ala Phe Arg Tyr Met Ala Gln Gly 1835 1840 1845 Lys His Ile Gly Lys Val Val Ile Gln Val Arg Glu Glu Glu Gln 1850 1855 1860 Glu Ala Val Leu His Gly Thr Lys Pro Thr Gln Met Val Ala Leu 1865 1870 1875 Cys Lys Thr Phe Cys Pro Ala His Lys Ser Tyr Ile Ile Thr Gly 1880 1885 1890 Gly Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Leu Ala His Trp Leu Val Glu 1895 1900 1905 Arg Gly Ala Gln Lys Leu Val Leu Thr Ser Arg Ser Gly Ile Arg 1910 1915 1920 Thr Gly Tyr Gln Ala Arg Gln Val His Glu Trp Arg Arg Gln Gly 1925 1930 1935 Val Gln Val Leu Val Ser Thr Ser Asp Val Ser Thr Leu Asp Gly 1940 1945 1950 Thr Arg Ser Leu Ile Thr Glu Ala Ala Gln Leu Gly Pro Val Gly 1955 1960 1965 Gly Ile Phe Asn Leu Ala Val Val Leu Arg Asp Ala Met Leu Asp 1970 1975 1980 Asn Gln Thr Pro Glu Phe Phe Gln Asp Val Asn Lys Pro Lys Tyr 1985 1990 1995 Asn Gly Thr Leu Asn Leu Asp Arg Val Thr Arg Glu Ala Cys Pro 2000 2005 2010 Glu Leu Asp Tyr Phe Glu Val Phe Ser Ser Val Ser Cys Gly Arg 2015 2020 2025 Gly Asn Ala Gly Gln Thr Asn Tyr Gly Phe Ala Asn Ser Thr Met 2030 2035 2040 Glu Arg Ile Cys Glu Lys Arg Arg His Asp Gly Leu Pro Gly Leu 2045 2050 2055 Ala Val Gln Trp Gly Ala Ile Ala Asp Val Gly Leu Leu Met Glu 2060 2065 2070 Leu Lys Gly Thr Lys Asp Lys Ala Ile Gly Gly Thr Leu Pro Gln 2075 2080 2085 Arg Ile Thr Ser Cys Met Glu Val Leu Asp Leu Phe Leu Asn Gln 2090 2095 2100 Pro His Pro Val Leu Ser Ser Phe Val Leu Ala Glu Lys Ala Thr 2105 2110 2115 Ser Arg Gly Pro Ser Gly Ser His Gln Asp Leu Val Lys Ala Val 2120 2125 2130 Thr His Ile Leu Gly Ile Arg Asp Leu Ala Thr Val Asn Leu Asp 2135 2140 2145 Ser Ser Leu Ser Asp Leu Gly Leu Asp Ser Leu Met Gly Val Glu 2150 2155 2160 Val Arg Gln Met Leu Glu Arg Glu His Asn Leu Leu Leu Ser Met 2165 2170 2175 Arg Glu Ile Arg Gln Leu Thr Ile His Lys Leu Gln Glu Ile Ser 2180 2185 2190 Ala Gln Ala Gly Thr Ala Asp Glu Leu Thr Asp Ser Thr Pro Lys 2195 2200 2205 Phe Gly Ser Pro Ala Gln Ser His Thr Gln Leu Asn Leu Ser Thr 2210 2215 2220 Leu Leu Val Asn Pro Glu Gly Pro Thr Leu Thr Arg Leu Asn Ser 2225 2230 2235 Val Gln Ser Ser Glu Arg Pro Leu Phe Leu Val His Pro Ile Glu 2240 2245 2250 Gly Ser Thr Thr Val Phe His Ser Leu Ala Thr Lys Leu Ser Ile 2255 2260 2265 Pro Thr Tyr Gly Leu Gln Cys Thr Gly Ala Ala Pro Leu Asp Ser 2270 2275 2280 Ile Gln Ser Leu Ala Thr Tyr Tyr Ile Glu Cys Ile Arg Gln Val 2285 2290 2295 Gln Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Ile Ala Gly Tyr Ser Tyr Gly Ala 2300 2305 2310 Cys Val Ala Phe Glu Met Cys Ser Gln Leu Gln Ala Gln Gln Asn 2315 2320 2325 Ala Gly Pro Thr Asn Asn Ser Leu Phe Leu Phe Asp Gly Ser His 2330 2335 2340 Thr Phe Val Met Ala Tyr Thr Gln Ser Tyr Arg Ala Lys Leu Asn 2345 2350 2355 Pro Gly Cys Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Met Cys Phe Phe 2360 2365 2370 Met Gln Gln Phe Thr Glu Ala Glu His Ser Arg Val Leu Glu Ala 2375 2380 2385 Leu Leu Pro Leu Gly Asp Leu Glu Ala Arg Val Ala Ala Thr Val 2390 2395 2400 Glu Leu Ile Val Gln Ser His Ala Gly Leu Asp Arg His Ala Leu 2405 2410 2415 Ser Phe Ala Ala Arg Ser Phe Tyr His Lys Leu Arg Ala Ala Glu 2420 2425 2430 Glu Tyr Thr Pro Arg Ala Thr Tyr His Gly Asn Val Thr Leu Leu 2435 2440 2445 Arg Ala Lys Met Gly Ser Ala Tyr Gln Glu Gly Leu Gly Ala Asp 2450 2455 2460 Tyr Asn Leu Ser Gln Val Cys Asp Gly Lys Val Ser Val His Ile 2465 2470 2475 Ile Glu Gly Asp His Arg Thr Leu Leu Glu Gly Ser Gly Leu Glu 2480 2485 2490 Ser Ile Leu Ser Ile Ile His Ser Ser Leu Ala Glu Pro Arg Val 2495 2500 2505 Ser Val Arg Glu Gly 2510 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligo nucleotide to act as a forward primer for PCR. <400> 3 ctaccaagcc aggcaggtc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligo nucleotide to act as a reverse primer for PCR. <400> 4 gccattgtac ttgggcttgt 20

Claims (14)

1. 하기의 <1> 및/또는 <2>의 염기를 검정함으로써 결정되는 지방산 합성효소의 유전자형을 토대로, 소의 근육내 지방에 있어서의 지방산 함유량의 많고 적음을 판정하는 방법.

   <1> 서열표의 서열번호 1에 나타내어지는 염기서열 중, 아데닌(A) 또는 구아닌(G) 중 어느 하나인 다형부위에 상당하는 제16,024번째의 염기

   <2> 동 염기서열 중, 티민(T) 또는 시토신(C) 중 어느 하나인 다형부위에 상당하는 제16,039번째의 염기
2. 제1항에 있어서,

   지방산이 올레산인, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   하기의 공정(a) 및 (b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 판정방법.

   (a) 피검체의 소로부터 조제한 게놈 DNA 또는 cDNA를 주형으로 하는 유전자 증폭반응에 의해, 상기 <1> 및 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역을 증폭하는 공정

   (b) 상기 공정(a)에서 얻어진 증폭 단편을 제한효소에 의해 소화하고, 그 절단 유무를 토대로 지방산 합성효소의 유전자형을 판정하는 공정
4. 제3항에 있어서,

   상기 공정(a)에 있어서의 유전자 증폭반응이, 서열표의 서열번호 3에 나타내어지는 염기서열로 되는 포워드 프라이머 및 서열표의 서열번호 4에 나타내어지는 염기서열로 되는 리버스 프라이머를 사용하여, 폴리머라아제 연쇄반응법에 의해 행해지고, 또한, 상기 공정(b)에 있어서의 제한효소로서, HhaI 및 NciI를 사용하는 것을 특징으로 하는 판정방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   DNA 칩을 사용하여 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 검정하는 것을 특징으로 하는 판정방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   서멀 사이클러와 형광 검출기를 구비한 폴리머라아제 연쇄반응장치를 사용하여 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 검정하는 것을 특징으로 하는 판정방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   소가 육용종인 판정방법.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   소가, 육용으로서도 이용되는 유용종인 판정방법.
9. 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역에 대해 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 제1항, 제2항, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 판정방법에 있어서 사용되는 유전자다형 검출용 키트.
10. 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역을, 유전자 증폭반응에 의해 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 판정방법에 있어서 사용되는 유전자다형 검출용 키트.
11. 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역을, 유전자 증폭반응에 의해 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머.
12. 상기 <1> 및/또는 <2>의 염기를 포함하는 유전자영역에 대해 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 프로브.
13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 판정방법의 결과를 토대로, 우수한 식미를 구비한 쇠고기를 얻을 수 있는 소인지의 여부를 판정하는 방법.
14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 판정방법의 결과를 토대로, 우수한 식미를 구비한 쇠고기를 얻을 수 있는 소를 선발·육종하는 방법.

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