KR20090036028A - 원 종양유전자 단백질 ｄｅｋ를 이용하여 세포사멸을유도하는 조성물 및 방법 및 ｄｅｋ를 발현하는 형질전환초파리 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DEK 단백질 또는 DEK 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 세포사멸을 유발하기 위한 조성물 및 DEK를 과발현시켜 세포사멸 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 DEK 단백질을 과발현하는 형질전환된 초파리를 제공한다.

Description

원 종양유전자 단백질 ＤＥＫ를 이용하여 세포사멸을 유도하는 조성물 및 방법 및 ＤＥＫ를 발현하는 형질전환 초파리{A COMPOSITION AND A METHOD FOR INDUCING APOTOSIS OF CANCER CELL USING DEK OVEREXPRESSION AND A DROSOPHILA MELANOGASTER OVEREXPRESSING DEK}

본 발명은 DEK 단백질 또는 DEK 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 세포사멸을 유발하기 위한 조성물, 및 DEK 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 DEK 단백질을 과발현하는 형질전환된 초파리와 이의 제조방법을 제공한다.

원 종양유전자 단백질로 알려진 DEK는 DNA의 전하를 바꾸어 양성 슈퍼코일을 유발하여 염색질 내의 DNA 위상변화를 일으키고, 염색체 상에서 6번과 9번의 전좌로 인한 급성 골수성 혈액 종양과 관련된 단백질이다. 예를 들어, 급성 골수성 백혈병에서는 DEK가 CAN 단백질과 융합하여 DEK-CAN 단백질의 형태로 발견되며, 간암, 악성신경교종, 흑색종 등에서는 DEK의 mRNA가 증가된다. 또한, 산성 도메인을 포함하는 DEK 단백질은 히스톤에 결합하여 H3 및 H4의 아세틸화 현상을 저해하여 히스톤 아세틸화 효소로 알려진 p300 및 PCAF의 활성을 억제함으로써 전사조절에 관여한다(문헌[Ko SI, Lee IS, Kim JY, Kim SM, Kim DW, Lee KS, Woo KM, Baek JH, Choo JK, Seo SB. "Regulation of histone acetyltransferase activity of p300 and PCAF by proto-oncogene protein DEK", FEBS LETTERS 580, 3217~3222 (2006, May 29)] 참고).

또한, DEK는 NF-κB의 서브유니트인 p65와 결합하여 자가면역에 관련된 질병 및 암을 조절하는데, 이 때 DEK는 NF-κB의 활성 및 NF-κB 관련 유전자의 발현을 억제하고, NF-κB의 조절을 받는 clAP2 및 IL-8 유전자의 프로모터 부위에 결합함으로써 NF-κB 리포터 유전자, Mcp-1 및 IkBa 유전자의 발현을 억제한다. DEK 발현을 감소시킨 세포에서 이들 유전자의 프로모터 부위의 활성자인 P/CAF의 결합이 증가되는 것을 통하여 DEK가 세포내에서의 전사 억제와 관련이 있음이 확인되었다(문헌[Sammons M, Wan SS, Vogel NL, Mientjes EJ, Grosveld G, Ashburner BP. "Negative regulation of the RelA/p65 transactivation function by the product of the DEK proto-oncogene", J. Biol. Chem. 281, 26802~26812 (2006, Sep. 15)] 참고).

이와 같이 DEK와 관련이 있는 암의 종류는 증가하고 있는 추세이지만 DEK의 역할에 대해서는 아직도 명확히 알려지지 않고 있는 실정이다. 또한 세포내 유전자의 전사조절에 있어서 중요한 역할을 하는 히스톤 단백질의 수식화에 관한 역할과 세포사멸에 관한 역할간의 연관성에 대해서는 현재 보고된 바 없다.

최근 산성 도메인을 포함하는 단백질의 세포내 다양한 역할이 제시되고 있으며, 특히 INHAT(inhibitor of histone acetyltransferase)의 서브유니트인 pp32 및 SET/TAF-Ibeta가 세포사멸의 조절에 관여한다는 것이 보고된 바 있다.

산성 단백질 pp32는 단백질 분해효소의 복합체인 아폽토좀(apoptosome)의 형성을 촉진시켜 카스파아제(Caspase)-9 및 카스파아제-3의 활성을 촉진하여 카스파아제 의존성 세포사멸을 유도한다. 특히, INHAT 복합체와 함께 정제된, 산성 단백질 프로타이모신-알파(prothymosin-alpha) 또한 세포사멸 경로에서 중요한 역할을 함이 밝혀져 있다(문헌[Jiang X, Kim HE, Shu H, Zhao Y, Zhang H, Kofron J, Donnelly J, Burns D, Ng SC, Rosenberg S, Wang X. "Distinctive roles of PHAP proteins and prothymosin-alpha in a death regulatory pathway", Science 299, 223-226 (2003, Jan. 10)] 참고).

INHAT 복합체의 또다른 산성 단백질인 SET/TAF-Ibeta는, 세포독성 T 림프구로부터 분비되는 그랜자임 A(granzyme A)가 DNA 분해효소에 의한 단일가닥 DNA의 절단을 유발하여 카스파아제 의존성 경로에 의한 세포사멸을 일으킬 때, 상기의 DNA 분해효소를 억제하여 세포사멸의 억제 활성을 나타냄으로써 세포사멸 경로에 중요한 역할을 한다는 것이 보고된 바 있다(문헌[Fan Z, Beresford PJ, Oh DY, Zhang D, Lieberman J. "Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-activated DNase during CTL-mediated apoptosis, and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor", Cell 112, 659~672 (2003 Mar. 7)] 참고).

본 발명에서는, DEK 단백질이 기존에 보고된 유전자의 프로모터 부위 외에도 bcl-2의 프로모터 부위에 작용하여 히스톤 H3 및 H4의 아세틸화를 저해하여 발현을 억제하고, 나아가 이를 통하여 미토콘드리아에서 싸이토크롬 C의 방출을 유도하여 카스파아제-9 및 카스파아제-3의 활성을 유도함으로써, 세포내에서 세포사멸을 유발하는 기능을 더 규명하였다.

또한, 본 발명에서는 생체 내에 존재하는 단백질을 이용한 항암물질을 제조함으로써 본 발명에 따른 항암물질은 화학물질에서는 기대하기 힘든 부작용의 최소화를 달성할 수 있고, 효과적으로 생체 내에서 역할을 수행하여 보다 효과적인 항암효과를 제공할 수 있다.

나아가 본 발명에서는, DEK 단백질을 과발현하는 형질전환된 초파리를 제공할 수 있다. 본 발명의 DEK 단백질을 과발현하는 형질전환된 초파리는 본 발명에 따른 DEK 단백질의 세포사멸 유도 효과를 확인해 줄 수 있을 뿐만 아니라 DEK 단백질의 기능 연구를 위한 모델을 제공할 수 있을 것이다.

[문헌 1] 문헌[Ko SI, Lee IS, Kim JY, Kim SM, Kim DW, Lee KS, Woo KM, Baek JH, Choo JK, Seo SB. "Regulation of histone acetyltransferase activity of p300 and PCAF by proto-oncogene protein DEK", FEBS LETTERS 580, 3217~3222 (2006, May 29)]

[문헌 2] 문헌[Sammons M, Wan SS, Vogel NL, Mientjes EJ, Grosveld G, Ashburner BP. "Negative regulation of the RelA/p65 transactivation function by the product of the DEK proto-oncogene", J. Biol. Chem. 281, 26802~26812 (2006, Sep. 15)]

[문헌 3] 문헌[Jiang X, Kim HE, Shu H, Zhao Y, Zhang H, Kofron J, Donnelly J, Burns D, Ng SC, Rosenberg S, Wang X. "Distinctive roles of PHAP proteins and prothymosin-alpha in a death regulatory pathway", Science 299, 223-226 (2003, Jan. 10)]

[문헌 4] 문헌[Fan Z, Beresford PJ, Oh DY, Zhang D, Lieberman J. "Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-activated DNase during CTL-mediated apoptosis, and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor", Cell 112, 659~672 (2003 Mar. 7)]

이에, 본 발명의 목적은 세포사멸, 특히 암세포의 세포사멸을 유발하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포사멸이 유도된 형질전환된 초파리와 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 DEK 단백질을 과발현하여 암세포의 세포사멸을 유발하는 조성물 및 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 DEK 단백질을 과발현하도록 형질전환된 초파리를 제공한다.

본 발명에 따라 세포내에서 DEK를 과발현함으로써 카스파아제 의존성 세포사멸을 증가시켜 세포 즉 암세포의 이상증식을 억제하는 항암 효과를 나타내므로, 다양한 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서는 DEK 단백질이 세포사멸 억제 유전자인 bcl-2의 프로모터 부위에 존재하는 히스톤 H3 및 H4의 아세틸화를 저해하여 bcl-2의 발현을 억제함으로써 미토콘드리아에서 싸이토크롬 C의 방출을 유도하여 세포사멸 유도 단백질인 카스파아제-9 및 카스파아제-3의 활성을 유도하여 세포사멸을 유발한다는 것을 새로이 밝혀내었다.

이와 같이, DEK 단백질은 세포의 이상증식을 억제할 수 있어 결과적으로 DEK를 과발현하여 세포사멸을 유발함으로써 종양을 억제하는 효과를 가질 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 DEK 단백질 또는 DEK 단백질을 코딩하는 핵산을 활성성분으로 포함하는, 세포사멸을 유발하는 조성물에 관한 것이다.

상기의 DEK 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 단백질을 포함할 수 있다.

또한, 상기의 DEK 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 1의 염기 서열 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 DEK 단백질은 화학적으로 합성하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, DEK 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 DEK 단백질이 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 DEK 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

또한, 유전자요법 치료제로 사용될 때, 본 발명의 DEK 코딩 유전자는 주사제로 직접 투여될 수 있다. 선택적으로 본 발명의 DEK 코딩 유전자를 포함한 벡터가 투여될 수 있으며, 적합한 벡터의 구체적인 예로는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 들 수 있다.

DEK 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 활성성분으로 가지는 세포사멸 유도제, 및 세포사멸관련 질환 치료용 약학적 조성물은 당업계의 공지된 담체 및 희석 제와 함께 적절한 제형으로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하주사, 좌제 등의 제형을 가질 수 있다. 본 발명의 치료제가 경구로 투여될 때, 치료제는 정제, 캡슐, 입자, 분말, 환제, 트로키, 내액제, 현탁제, 유화제, 또는 시럽 등의 제형으로 투여될 수 있다.

상기 제형들은 약학적 조성물에 통상적으로 사용되는 적당한 부형제, 충전물, 결합제, 습윤제, 분해제, 윤활제, 계면활성제, 분산제, 완충액, 방부제, 용해보조제, 소독제, 감미료, 향신료, 진통제, 안정화제, 등장액제 등을 이용한 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 기술된 각각의 제형은 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제의 구체적인 예로는 물, 약학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리딘, 카복시비닐 중합체, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 나트륨 녹말, 펙틴, 잔탄 고무, 아라비아 고무, 카제인, 겔라틴, 한천, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알코올, 스테아린 산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소비톨 및 젖산 등이 있다. 한 개 또는 그 이상의 첨가제가 조제 형태에 따라 선택되거나 또는 적절히 조합될 수 있다. 더 나아가, 유전자요법 치료제 투여방법으로는, 정맥내, 동맥내 투여와 같은 통상적인 전신투여 이외에 표적세포로의 국소적 투여가 행해질 수 있으며, 카테터 기술 및 외과적 수술과 조합된 투여 방법이 사용될 수 있다.

이 때, 본 발명의 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 암으로는 구체적으로 유방암, 난소암, 간암, 폐암, 결장암, 전립선암 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 DEK 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 약제학적으로 유효한 양으로 포함한다.

본 발명에서 '약제학적으로 유효한 양'이란, 치료하고자 하는 암에 대해 억제, 호전 및/또는 완치효과를 나타내는 활성성분의 양을 말한다. 본 발명의 DEK 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 예를 들면, 치료적으로 유효한 투여량은, 초기에는 세포배양을 통한 시험관내 분석을 사용하여 결정할 수 있으며, 동물모델에서 실험을 수행하여 혈중 DEK 단백질의 농도 범위가 세포배양에서 결정된 IC50(시험관내 분석, 약물 처리 시, 배양 세포의 50%에 대한 치사량의 테스트 화합물의 농도)을 통하여 결정할 수 있다. 당 분야에서 과도한 실험을 거치지 않고도 치료에 유효한 양을 결정할 수 있을 것이며, 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정 할 수 있다.

본 발명은 또한 DEK 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 초파리를 제공한다.

상기 DEK 단백질을 과발현하는 형질전환 초파리는 수정란에 DEK 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터를 유입시켜 DEK의 과발현을 유도하는 방법으로 제조할 수 있다. 구체적으로는 DEK 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터를 배아의 핵으로 미세 주입하는 단계; 상기 배아를 배양하는 단계의 제조방법을 포함하는 형질 전환 초파리를 제공한다.

상기 형질전환 초파리는 산란 후 1시간 이내의 초파리 배아에 DEK 단백질 발현 벡터를 주입한 후 DEK가 삽입된 배아를 배양하여 얻어질 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 전핵에 벡터를 미세모세관에 주입하여 난막에 제거된 배아에 직접 주입하는 미세주입법(microinjection)을 사용할 수 있다.

상기 방법으로 제조된 형질전환 초파리는 DEK의 세포사멸 효과를 확인해 줄 뿐만 아니라, 향후 DEK 단백질의 추가 기능을 탐색하기 위한 모델로 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 암세포에서 DEK 의 과발현에 의한 세포사멸의 유발 확인

암세포에서 DEK 단백질을 과발현 시키기 위한 발현벡터를 제작하여, 이를 세포에 형질감염시킨 후, 역전사 효소중합연쇄반응(RT-PCR, Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 및 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용하여 세포내에서 DEK의 과발현을 확인한 후 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting Analysis) 분석을 통해 세포사멸을 측정하였다. 구체적인 실험은 다음과 같이 수행하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

1-1 DEK 발현벡터의 제조

암세포에서 DEK의 과발현시 세포사멸이 유도되는지 확인하기 위하여 세포내에서 DEK을 발현할 수 있는 pCMX PL1 및 pcDNA3.1 발현벡터를 사용하였다. HeLa 세포주(Manassas, VA 소재의 에이티씨씨(ATCC))를 35mm 디쉬에서 2.5×10⁵개의 세포수가 되도록 세포를 준비하고, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 48시간 배양하고, 이들 세포로부터 트리졸(인비트로젠(Invitrogen)사) 용액을 제조자의 권고대로 사용하여 전체 RNA를 추출한 후, 이를 주형으로 하여 M-MLV 역전사효소(프로메가(Promega)사)를 제조자의 권고대로 사용하여 cDNA를 합성하였다. DEK 유전자를 코딩하는 핵산을 증폭시키기 위하여, pCMX PL1 벡터에 삽입을 핵산을 위해서는 합성으로 정방향 프라이머(5'-CGC GGA TCC GCG ATG TCC GCC TCG GCC CCT GCT GCG-3', 서열번호 3)와 역방향 프라이머(5'-CGC GAA TTC GCG TCA AGA AAT TAG CTC TTT TAC-3', 서열번호 4)를 사용하였고, pcDNA3.1 벡터에 삽입하기 위한 핵산을 위해서는 정방향 프라이머(5'-CGC GGA TCC GCG ATG TCC GCC TCG GCC CCT GCT GCG-3', 서열번호 5)와 역방향 프라이머(5'-CGC GAT ATC GCG TCA AGA AAT TAG CTC TTT TAC-3', 서열번호 6)를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 수행하였으며, 상기 PCR은 94℃에서 5분 동안 초기 변성시킨 후 94℃에서 30초, 61℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초동안 30회 반복하였다. 이후 BamH I과 EcoR I(pCMX PL1) 및 BamH I 과 EcoR V(pcDNA3.1) 제한효소를 사용하여 PCR 생성물과 발현벡터의 양 말단을 특이적으로 절단하여 발현벡터에 삽입함으로써 DEK 발현벡터를 제조하였다.

1-2 세포배양 및 형질감염

HeLa 세포주(Manassas, VA 소재의 에이티씨씨)를 10% 우태아혈청(FBS, fetal bovine serum, 인비트로젠사)과 페니실린-스트렙토마이신(50units/ml)을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, 인비트로젠사)에서 12시간 동안 배양하였다. 상기의 세포들을 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지로 세척하고, 리포펙타민(Lipofectamine, 인비트로젠사사)을 이용하여 pCMX PL1-DEK 및 pcDNA3.1-DEK의 발현 벡터를 HeLa 세포 내로 주입하여 형질감염시켰다. 대조군으로 유전자를 삽입하지 않은 pCMX PL1 및 pcDNA3.1 공벡터(empty vector)를 이용하여 Hela 세포 내로 주입하였다. 이후, 형질감염을 완료한 세포를 37℃, 5% CO₂ 환경에서 72시간 동안 배양하였다.

1-3 DEK 의 과발현에 의한 세포사멸의 증가 확인

암세포에서 DEK의 과발현시 세포사멸의 유발을 확인하기 위하여 FACS 분석을 실시하였다. 형질감염된 HeLa 세포를 세포용해액(cell lysis buffer: 1% triton X-100, 150mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1% SDS, 1% NP-40, 1mM PMSF, 1X protease inhibitor cocktail)으로 파쇄시킨 후 세포 용해액을 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 단백질의 상층액을 수득하였다. 이 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 형질감염된 세포들에서의 DEK의 과발현을 확인하기 위해 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 통하여 각 시료들의 단백질들을 전기 영동상에서 분리하였다. 상기 전기영동된 단백질을 나이트로셀룰로오 스 막(Nitrocellulose membrane)으로 옮긴 후 항-DEK 항체를 이용하여 블롯팅을 수행하였다. 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제(Horse Radish Peroxidase)가 컨쥬게이트된 항-마우스-IgG HRP를 이용하였으며, 화학형광 기질 (Chemiluminescence, 산타크루즈(Santacruz)사)을 이용하여 X-ray 필름에 현상하여 DEK 과발현을 검출하였다. 또한 DEK의 mRNA량을 확인하기 위하여 상기의 실시예 1-1에서 기술한 방법을 통하여 전체 RNA를 추출한 후 DEK을 특이적으로 증폭할 수 있는 정방향 프라이머(5'-CGC GGA TCC GCG ATG TCC GCC TCG GCC CCT GCT GCG-3', 서열번호 7)와 역방향 프라이머(5'-CGC GAA TTC GCG TCA AGA AAT TAG CTC TTT TAC-3', 서열번호 8)를 이용하여 DEK의 mRNA량의 증가를 확인하였다. 이의 대조군으로서 베타-액틴 유전자를 사용하여 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과 도 1a에 나타난 바와 같이, 형질감염된 세포에서 형질감염되지 않은 세포보다 DEK 유전자가 약 2 내지 3배 정도 과발현되었음을 확인할 수 있었다(도 1a 참고).

DEK의 과발현에 의한 세포사멸의 증가를 확인하기 위하여, 트립신-EDTA를 이용하여 상기의 형질감염된 세포를 디쉬에서 격리시킨 후, 2,000rpm에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 통하여 침전된 세포들을 PBS(phophate buffered saline)로 세척하고, 아넥신-V-플루오스 키트(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)사)를 제조자의 권고대로 사용하여 아넥신-V(annexin-V) 및 프로피디움 아이오다이드(PI)를 세포에 동시 표지하였다. 이어, 10,000개의 세포들의 표지를 레코딩하여 대조군 및 DEK 과발현 세포에서 세포사멸의 증가량을 FACS를 이용하여 분석하였다. 세포사멸의 분석 결과 도 1b에 나타난 바와 같이, pCMX PL1-DEK로 형질감염된 세포와 아무것도 처리하지 않은 세포를 비교하였을 때, pCMX PL1-DEK로 형질감염된 세포에서 세포사멸이 15% 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 상기의 형질감염된 세포와 pCMX-PL1 공벡터를 비교하였을 때 세포사멸이 9.2% 증가되는 것을 확인하였다(도 1b 참고). 따라서, 암세포에서 DEK를 과발현시킴으로써 세포사멸을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 2: DEK 과발현 세포에서의 카스파아제 -9 및 카스파아제 -3의 활성증가 확인

DEK 단백질이 과발현됨으로써 세포사멸을 유도하는 것이, 단백질 분해효소들의 활성증가를 통하여 일어나는 것인지 확인하기 위하여, 세포사멸 경로에서 세포사멸 실행인자 중 강력한 단백질 분해효소인 카스파아제-9 및 3의 활성증가를 DEK 과발현 세포에서 확인하였다. 또한, DEK 과발현 세포에서 활성형 카스파아제-9 단백질 및 카스파아제-9 전구단백질의 양을 웨스턴 블롯을 통하여 확인하였다. 구체적인 실험은 다음과 같이 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

2-1 카스파아제 -9 및 카스파아제 -3의 활성 측정

HeLa 세포주를 35mm 디쉬에서 2.5×10⁵개의 세포수가 되도록 준비하고, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 24시간 배양한 후, pCMX PL1-DEK 또는 pcDNA3.1-DEK로 형질감염시켰다. 형질감염된 HeLa 세포를 실시예 1-3의 세포용해액으로 파괴시킨 후 세포용해액을 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 단백질의 상층액을 수득하였다. 이 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 카스파아제-글로 9 검정 키트(Caspase-Glo 9 assay kit, 프로메가사) 및 아포프로브-3 검정 키트(Apopprobe-3 assay kit, 펩트론(Peptron)사)를 제조자의 권고대로 이용하여 카스파아제-9 및 3의 활성을 측정하였다. 카스파아제-9의 활성은, 프롤루미노선스(proluminesence)가 컨쥬게이트된 LEHD(L:Leucine, E:Glutamic acid, H:Histidine, D:Aspartic acid)를 카스파아제-9에 대한 기질로 하여 플루오스타 옵티마(FLUOstar Optima, 비엠지 렙테크(BMG Labtech)사)를 이용하여 활성의 정도를 수치화하였다. 카스파아제-3의 활성은, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)에 컨쥬게이트된 DEVD(D: Aspartic acid, E:Glutamic, V:Valine)-AMC를 기질로 하여 360nm의 여기파장 및 460nm의 방출파장에서 마이크로플레이트 형광판독기 빅터 3(Victor 3, 페르킨 엘머(Perkin Elmer)사)를 이용하여 활성의 정도를 측정하였다.

2-2 웨스턴 블롯팅

활성형태의 카스파아제-9의 증가 및 카스파아제-9의 전구단백질 감소를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 통해 단백질을 분리하였다. 이를 항-카스파아제-9 전구단백질 항체 또는 항-활성형 카스파아제-9 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 이용하여 실시예 1-3에 기술한 방법과 동일하게 활성형태의 카스파아제-9 및 카스파아제-9 전구단백질을 검출하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 카스파아제-9의 활성은 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 pCMX PL1-DEK 또는 pcDNA3.1-DEK으로 형질전환된 HeLa 세포에서 5.5배 증가됨을 확인하였다. 또한, 카스파아제-3의 활성은 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 pCMX PL1-DEK 또는 pcDNA3.1-DEK으로 형질전환된 HeLa 세포에 서 4배 증가되는 것을 확인하였다(도 2a 참고).

또한, 활성형태의 카스파아제를 웨스턴 블롯팅으로 검출할 경우, pCMX PL1-DEK로 형질감염시킨 세포에서 46Kd의 카스파아제-9 전구단백질의 양이 감소되었으며, 35Kd의 활성형태의 카스파아제-9 단백질이 증가되는 것을 확인하였다(도 2b 참고). 이로부터 DEK가 세포내에서 과발현되었을 경우 카스파아제-3 및 카스파아제-9의 전구단백질이 절단되어 활성형태로 변하게 되며, 이들의 활성이 증가됨으로서, 이들 활성형태의 단백질들이 다른 단백질들에 대한 강력한 분해효소로 작동되어 세포사멸이 유발된다는 것을 확인하였다.

실시예 3: DEK 에 의한 bcl -2의 발현 조절 기작 및 억제 확인

DEK 단백질은 HAT(histone acetyltransferase)의 억제활성을 가져 히스톤의 아세틸화를 억제함으로써 유전자의 전사를 억제하는 조절자로서 알려져 있다. 따라서, 세포사멸을 억제하는 유전자의 전사를 음성적으로 조절하여 세포사멸을 유발하게 되는지를 확인하기 위하여, 대표적인 세포사멸 억제 유전자인 bcl-2의 전사를 조절하는 프로모터 부위에 크로마틴 면역침강법을 이용하여 히스톤의 아세틸화의 정도를 확인하였다. 또한, DEK가 과발현 되었을때 세포내 bcl-2의 mRNA의 발현량을 확인하기 위해 정량적 RT-PCR을 수행하고, 웨스턴 블롯팅을 통하여 bcl-2 단백질의 양을 확인하였다. 구체적인 실험은 다음과 같이 수행하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다.

3-1 크로마틴 면역침강법( Chromatin Immunoprecipitation )

HeLa 세포주를 100mm 디쉬에서 배양하고, pCMX-DEK로 형질감염시켰다. 형질감염 후 72시간 배양하여, 이들 세포를 1% 포름알데하이드(formaldehyde)를 이용하여 37℃에서 10분 동안 단백질과 DNA를 서로 교차결합시켰다. 이어, 10배 글라이신을 상온에서 5분 동안 처리하여 교차결합반응을 중지하였다. 이들 세포를 세포 스크레퍼를 이용하여 SDS 용해 완충액에 옮긴 후 초음파 분쇄기를 통해 단백질과 교차결합되어 있는 DNA의 짧은 절편을 생성하였다. 이후, 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후, 세포 용해액에 항-아세틸 히스톤 H4 항체 및 항-아세틸 히스톤 H3 항체를 첨가하여 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 면역침강을 수행하기 위하여 단백질 A/G 아가로오즈 비드를 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 항체와 결합된 단백질을 침강시키고, 트리스-HCl과 EDTA를 넣어 단백질과 DNA가 서로 결합되어 있는 침강물에서 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 주형으로 사용하여 bcl-2의 프로모터 부위에 대한 특이적인 정방향 프라이머 (5'-CCA GGC AGC TTA ATA CAT TCT TTT TAG-3', 서열번호 9)와 역방향 프라이머(5'-TGA TGC TGA AAG GTT AAA GAA AAA AC-3', 서열번호 10)를 사용하여 PCR을 수행하였다.

3-2 정량적 역전사효소중합연쇄반응

HeLa 세포주들을 35mm 디쉬에서 배양하고, pCMX-DEK로 형질감염시켰다. 형질감염 후 72시간 배양하여, 이들 세포로부터 트리졸(인비트로젠사) 용액을 사용하여 상기 실시예 1-1에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 cDNA를 합성하고, bcl-2 유전자의 프로모터 부위를 증폭시키기 위하여 프라이머의 조합을 이용하여, 정량적 역전사 효소중합연쇄반응을 수행하였다. 이후, ABI 프리즘 7900 시퀀스 디텍션 시스 템(ABI prism 7900 detection system, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사)을 이용하여 분석하였다.

3-3 웨스턴 블롯팅

HeLa 세포주를 35mm 디쉬에 배양하고 pCMX PL1-DEK로 형질감염 시킨 후 72시간동안 배양하였다. 형질감염된 HeLa 세포를 세포 용해액으로 파괴시킨 후 세포용해액에서 단백질의 상층액을 얻기 위하여 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 이의 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 형질감염된 세포에서의 bcl-2 단백질 발현량을 측정하기 위하여 SDS-PAGE를 통해 단백질들을 분리하고, 항-bcl-2 항체를 이용하여 발현량의 차이를 검출하였다. 대조군으로는 항-베타-액틴 항체를 사용하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, 항-아세틸 히스톤 H3 항체 및 항-아세틸 히스톤 H4 항체를 이용한 크로마틴 면역침강법을 수행한 경우, DEK를 과발현한 세포에서 bcl-2 유전자의 프로모터 부위의 히스톤 H3 및 히스톤 H4의 아세틸화가 감소되는 것을 확인하였다(도 3a 참고). 또한, 정량적 역전사 효소중합연쇄반응을 실시한 경우, DEK 과발현 세포에서 bcl-2 유전자의 mRNA 발현량이 급감하는 것을 확인하였으며(도 3b 참고), 웨스턴 블롯을 통하여 bcl-2 단백질의 양이 감소하는 것을 확인하였다(도 3c 참고).

이들 결과를 통하여, DEK는 세포내에서 과발현되었을때 bcl-2 유전자의 프로모터 부위의 히스톤 H3 및 히스톤 H4의 아세틸화를 억제함으로써 bcl-2의 전사활성을 억제함을 확인할 수 있었다. bcl-2는 미토콘드리아에서 싸이토크롬 C의 방출을 저해함으로써 세포사멸을 억제하는 기능을 가지는데, DEK는 이러한 bcl-2의 기능을 억제함으로써 싸이토크롬 C를 방출하여, 카스파아제-9의 활성과 후속하여 카스파아제-3의 활성을 증가시킴으로써 세포사멸을 유발하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: DEK 를 과발현하는 형질전환 초파리의 제작

형질전환 초파리는 P 전이인자를 이용한 미세주입법을 통해 수립하였다 (Spradling and Rubin, 1982). 구체적인 실험은 다음과 같이 수행하였다.

4-1 초파리 형질전환체를 위한 벡터의 제작

HeLa 세포주를 35mm 디쉬에 배양하고, 트리졸(인비트로젠사)용액을 제조자의 권고대로 사용하여 이들 세포로부터 전체 RNA를 추출하고 이를 주형으로 하여 M-MLV 역전사 효소(프로메가사)를 제조자의 권고대로 사용하여 cDNA를 합성하였다. DEK 유전자를 증폭할 수 있는 EagI 및 XbaI 제한효소로 절단되는 서열을 갖는 특이적 정방향 프라이머('5-ATG TCC GCC TCG GCC CCT GC-3', 서열번호 11)와 역방향 프라이머('5-TCA AGA AAT TAG CTC TTT ACA-3', 서열번호 12)를 사용하여 PCR을 수행하여, pGEMT 벡터에 TA 클로닝 방법으로 삽입하였다. 상기의 방법으로 제작한 pGEMT-DEK의 1128 bp의 DEK 코딩 염기서열을 EagI과 XbaI 제한효소로 절단하여 동일 제한효소로 절단한 pUAST 벡터에 삽입함으로써, 재조합 벡터 pUAS-hDEK을 제작하였다(도 4A 참고).

4-2 인간 DEK 을 과발현할 수 있는 초파리 형진전환체의 제작

형질전환 초파리를 제작하기 위해 인디아나 대학교의 블루밍턴 스톡 센터 (Bloomington stock center, Indiana University)로부터 분양받은 산란 후 1시간 이내의 초파리(Drosophila Melanogaster)의 배아를 포도원액-건조효모 플레이트를 이용하여 채집한 후, 2.6%의 소듐 하이포클로라이트(sodiumhypochlorite)액을 이용하여 난막을 제거하여, 양면테이프를 붙인 슬라이드에 배열하였다. 배열된 배아는 올림푸스 역상 현미경 하에서 발생단계를 확인하였으며, 올림푸스사의 미세주입용 조작 시스템(IMT-2)을 이용하여 배아의 말단에 직접 형질전환용도의 DNA를 주입하였다. 상기 재조합 벡터인 pUAS-hDEK와 헬퍼 벡터(Δ2-3)를 혼합하여 나리시지(Narishige)사의 PB-7 모세관(내경 0.7 mm) 추출기로부터 제작한 미세모세관에 주입하여 난막이 제거된 야생형의 초파리 배아에 미세 주입하였다. 미세 주입된 배아에 할로카본 오일 700(Halocarbon oil 700, 시그마(Sigma)사)을 도말하여 25℃ 배양기에 24시간 배양한 후, 배아에서 깨어난 1령기 유충을 선별하여 초파리의 표준배지에 옮겨 성체가 될 때까지 배양하였다. 성체가 된 초파리를 다시 흰눈 초파리와 교배하여 붉은 눈의 표현형이 나타난 초파리를 형질전환체를 선별하였다.

실시예 5: 인간 DEK 를 과발현하는 초파리 형질전환체를 통한 세포사멸의 유발 분석

초파리에서 세포사멸을 유발할 것으로 예상되는 인간 DEK의 기능을 확인하기 위해서 인간 DEK 과발현 형질전환체를 이용하여 역전사 효소중합연쇄반응과 웨스턴 블롯팅을 통하여 과발현 계통에서의 인간 DEK의 mRNA 및 단백질의 발현량을 측정하였다. 또한, 표현형 분석과 카스파아제-3의 활성측정을 통하여 과발현 계통에서 세포사멸이 유발되는 것을 확인하였다. 구체적인 실험은 다음과 같이 수행하였으 며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.

5-1 인간 DEK 을 과발현하는 계통의 확립

DEK의 과발현은 UAS-Gal4 시스템(Brand and Perrimon, 1993)을 이용하였다. 인간 DEK의 과발현 유도는 pUAS-hDEK으로 형질전환된 초파리와 초파리의 눈에서 특이적으로 발현을 유도할 수 있는 GMR-Gal4 계통과 교배를 수행하여 GMR>hDEK 계통을 확립하여 실현하였다.

5-2 역전사효소중합연쇄반응( RT - PCR )

야생형(WT), 인간 DEK가 삽입되어 있지만 발현되지 않는 계통(UAS-hDEK) 및 UAS-hDEK 계통과 교배시 초파리의 눈에서 인간 DEK를 발현시킬 수 있는 유도 계통(GMR-Gal4)과 비교하여, UAS-hDEK과 GMR-Gal4 계통을 교배시킨 인간 DEK 과발현 계통(GMR>hDEK)에서 인간 DEK mRNA가 과발현되고 있는지를 확인하기 위하여, 각 계통의 성체를 선별하여 역전사 효소중합연쇄반응을 수행하였다. 선별된 성체에 트리졸을 처리한 후 세포분쇄기로 분쇄하여 전체 RNA를 추출하고, 이를 주형으로 하여 M-MLV 역전사 효소(프로메가사)를 사용하여 cDNA를 합성하고, DEK 유전자에 대한 특이적인 정방향 프라이머 ('5-ATG TCC GCC TCG GCC CCT GC-3', 서열번호 13)와 역방향 프라이머('5-TCA AGA AAT TAG CTC TTT ACA-3', 서열번호 14)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. DEK의 발현량에 대한 대조군으로는, rp49 유전자를 사용하였다(도 5a 참고).

5-3 웨스턴 블롯팅( Western blotting )

실시예 5-2에서 사용한 각 대조군과 비교하여 인간 DEK 과발현 계통에서 인 간 DEK 단백질의 과발현을 확인하기 위하여, 각 계통의 성체를 선별하였으며, 세포용해액을 처리한 후 세포분쇄기로 분쇄하여 원심분리한 후 각 계통의 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 SDS-PAGE를 통하여 분리시킨 후, 항-DEK 항체를 이용하여 과발현 계통에서 DEK의 과발현을 검출하였다. 대조군으로는 항-베타-액틴을 사용하였다(도 5a 참고).

5-4 인간 DEK 과발현계통에서의 세포사멸과 관련된 표현형 분석

인간 DEK을 과발현하는 계통에서 DEK의 과발현이 초파리의 눈에서 세포사멸을 유발하게 되는지 확인하기 위하여 대조군(야생형(WT), UAS-hDEK, GMR-Gal4 및 GMR>hDEK+inhibitor) 및 과발현 계통(GMR>hDEK)의 눈에서 나타나는 표현형을 분석하였다. 상기 대조군 중 GMR>hDEK+inhibitor는 인간 DEK 과발현 계통(GMR>hDEK)에서 카스파아제 3에 대한 억제반응을 유도한 계통이다. 각 계통의 성체를 마취시킨 후 주사전자현미경(Leo 1455VP Environmental Scanning Electron Microscope, LEO)으로 정상 대조군의 눈 및 과발현 형질전환체의 눈의 표현형을 관찰하였다(도 5b 참고).

5-5 형질전환체의 카스파아제 -3의 활성증가 확인

상기 각 대조군 계통과 비교하여 인간 DEK을 과발현하는 형질전환체의 카스파아제-3의 활성을 측정하기 위하여 각 계통의 성체에 세포용해액을 처리한 후 세포분쇄기로 분쇄하여 원심분리하였다. 추출된 각 계통의 단백질을 이용하여 아포프로브-3 에세이 키트(Apopprobe-3 assay kit, 펩트론사)를 상기 기술한 방법으로 사용하였으며, 상기 대조군 중 GMR>hDEK+inhibitor는 카스파아제-3의 활성에 대한 억 제자로 알데히드(CHO, aldehyde)에 컨쥬게이트된 DEVD(D: Aspartic acid, E: Glutamic acid, V: Valine)를 GMR>hDEK 대조군으로부터 추출한 세포 용해액에 카스파아제-3-의 기질을 처리하기 5분 전에 0.1mM을 첨가함으로써 카스파아제-3에 대한 억제반응을 유도하였고, 빅터 3 (Victor 3, 페르킨 엘머사)를 이용하여 활성의 정도를 수치화하였다(도 5c 참고).

도 5b에 나타난 바와 같이, 정상 대조군의 눈과 비교하였을 때 인간 DEK을 과발현시킨 형질전환체에서 초파리의 규칙적인 배열의 겹눈을 형성하는 낱눈의 모양과 크기가 파괴되는 비정상적인 세포분화의 표현형을 나타내는 것을 확인하였다 (도 5b 참고). 따라서, 이를 통해 DEK의 과발현에 의한 세포사멸의 유발로 인하여 비정상적인 세포분화가 이루어진다는 것을 알 수 있다. 또한, 과발현 형질전환체에서 세포사멸의 대표적 마커로서 사용되는 카스파아제-3 활성의 측정한 결과 초파리 형질전환체에서 정상 대조군과 비교하였을 때 초파리 형질전환체에서 인간 DEK의 과발현으로 카스파아제-3의 활성이 99% 증가되는 것을 확인하였다(도 5c 참고).

따라서, 이러한 결과를 통하여 인간 DEK를 과발현시킨 형질전환체에서는 세포사멸이 유발되며 이러한 현상은 세포사멸 경로에서 카스파아제 의존성으로 유발된다는 것을 확인할 수 있었다.

도 1a는 본 발명의 DEK를 세포 내로 형질감염시킨 후 과발현된 결과를 역전사 효소중합연쇄반응을 통해 확인한 결과이다.

도 1b는 본 발명의 DEK를 세포 내로 형질감염시킨 후 세포사멸이 유발된 결과를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 그래프이다.

도 2a는 본 발명의 DEK 단백질이 과발현된 세포에서 카스파아제-9 및 카스파아제-3의 활성 증가를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 그래프이다.

도 2b는 본 발명의 DEK 단백질이 과발현된 세포에서 활성형태의 카스파아제-9의 발현량을 검출한 결과이다.

도 3a는 본 발명의 DEK 단백질에 의해서 bcl-2 유전자의 프로모터 부위의 히스톤 아세틸화가 저해되었음을 나타내는 결과이다.

도 3b는 본 발명의 DEK 단백질에 의해서 bcl-2 유전자의 mRNA의 발현량이 감소되었음을 검출한 그래프이다.

도 3c는 본 발명의 DEK 단백질에 의해서 bcl-2 유전자의 단백질의 발현량이 감소되었음을 검출한 결과이다.

도 4는 인간 DEK의 cDNA를 초파리 형질전환 벡터인 pUAST에 Eagl 및 Xbal 제한효소를 이용하여 클로닝한 것을 도시화한 것이다.

도 5a는 인간 DEK를 과발현하는 형질전환체에서의 과발현 여부를 역전사 효소 및 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.

도 5b는 정상 대조군의 눈 및 인간 DEK를 과발현하는 형질전환된 초파리의 눈의 표현형을 관찰한 결과이다.

도 5c는 인간 DEK를 과발현하는 형질전환체의 눈에서의 세포사멸 유발 및 카스파아제-3의 활성을 나타내는 결과이다.

<110> Seoul National University Industry Foundation Chung Ang University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A composition and a method for inducing apotosis of cancer cell using DEK overexpression and a drosophila melanogaster overexpressing DEK <130> FPD/200709-0040 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1128 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtccgcct cggcccctgc tgcggagggg gagggaaccc ccacccagcc cgcgtccgag 60 aaagaacccg aaatgcccgg tcccagagag gagagcgagg aggaagagga cgaggacgac 120 gaggaggagg aggaggagga aaaagaaaag agtctcatcg tggaaggcaa gagggaaaag 180 aaaaaagtag agaggttgac aatgcaagtc tcttccttac agagagagcc atttacaatt 240 gcacaaggaa aggggcagaa actttgtgaa attgagagga tacatttttt tctaagtaag 300 aagaaaaccg atgaacttag aaatctacac aaactgcttt acaacaggcc aggcactgtg 360 tcctcattaa agaagaatgt gggtcagttc agtggctttc catttgaaaa aggaagtgtc 420 caatataaaa agaaggaaga aatgttgaaa aaatttagaa atgccatgtt aaagagcatc 480 tgtgaggttc ttgatttgga gagatcaggt gtaaatagtg aactagtgaa gaggatcttg 540 aatttcttaa tgcatccaaa gccttctggc aaaccattgc cgaaatctaa aaaaacttgt 600 agcaaaggca gtaaaaagga acggaacagt tctggaatgg caaggaaggc taagcgaacc 660 aaatgtcctg aaattctgtc agatgaatct agtagtgatg aagatgaaaa gaaaaacaag 720 gaagagtctt cagatgatga agataaagaa agtgaagagg agccaccaaa aaagacagcc 780 aaaagagaaa aacctaaaca gaaagctact tctaaaagta aaaaatctgt gaaaagtgcc 840 aatgttaaga aagcagatag cagcaccacc aagaagaatc aaaacagttc caaaaaagaa 900 agtgagtctg aggatagttc agatgatgaa cctttaatta aaaagttgaa gaaaccccct 960 acagatgaag agttaaagga aacaataaag aaattactgg ccagtgctaa cttggaagaa 1020 gtcacaatga aacagatttg caaaaaggtc tatgaaaatt atcctactta tgatttaact 1080 gaaagaaaag atttcataaa aacaactgta aaagagctaa tttcttga 1128 <210> 2 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ala Glu Gly Glu Gly Thr Pro Thr Gln 1 5 10 15 Pro Ala Ser Glu Lys Glu Pro Glu Met Pro Gly Pro Arg Glu Glu Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Ser Leu Ile Val Glu Gly Lys Arg Glu Lys Lys Lys Val Glu 50 55 60 Arg Leu Thr Met Gln Val Ser Ser Leu Gln Arg Glu Pro Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ala Gln Gly Lys Gly Gln Lys Leu Cys Glu Ile Glu Arg Ile His Phe 85 90 95 Phe Leu Ser Lys Lys Lys Thr Asp Glu Leu Arg Asn Leu His Lys Leu 100 105 110 Leu Tyr Asn Arg Pro Gly Thr Val Ser Ser Leu Lys Lys Asn Val Gly 115 120 125 Gln Phe Ser Gly Phe Pro Phe Glu Lys Gly Ser Val Gln Tyr Lys Lys 130 135 140 Lys Glu Glu Met Leu Lys Lys Phe Arg Asn Ala Met Leu Lys Ser Ile 145 150 155 160 Cys Glu Val Leu Asp Leu Glu Arg Ser Gly Val Asn Ser Glu Leu Val 165 170 175 Lys Arg Ile Leu Asn Phe Leu Met His Pro Lys Pro Ser Gly Lys Pro 180 185 190 Leu Pro Lys Ser Lys Lys Thr Cys Ser Lys Gly Ser Lys Lys Glu Arg 195 200 205 Asn Ser Ser Gly Met Ala Arg Lys Ala Lys Arg Thr Lys Cys Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Ser Asp Glu Ser Ser Ser Asp Glu Asp Glu Lys Lys Asn Lys 225 230 235 240 Glu Glu Ser Ser Asp Asp Glu Asp Lys Glu Ser Glu Glu Glu Pro Pro 245 250 255 Lys Lys Thr Ala Lys Arg Glu Lys Pro Lys Gln Lys Ala Thr Ser Lys 260 265 270 Ser Lys Lys Ser Val Lys Ser Ala Asn Val Lys Lys Ala Asp Ser Ser 275 280 285 Thr Thr Lys Lys Asn Gln Asn Ser Ser Lys Lys Glu Ser Glu Ser Glu 290 295 300 Asp Ser Ser Asp Asp Glu Pro Leu Ile Lys Lys Leu Lys Lys Pro Pro 305 310 315 320 Thr Asp Glu Glu Leu Lys Glu Thr Ile Lys Lys Leu Leu Ala Ser Ala 325 330 335 Asn Leu Glu Glu Val Thr Met Lys Gln Ile Cys Lys Lys Val Tyr Glu 340 345 350 Asn Tyr Pro Thr Tyr Asp Leu Thr Glu Arg Lys Asp Phe Ile Lys Thr 355 360 365 Thr Val Lys Glu Leu Ile Ser 370 375 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DEK <400> 3 cgcggatccg cgatgtccgc ctcggcccct gctgcg 36 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DEK <400> 4 cgcgaattcg cgtcaagaaa ttagctcttt tac 33 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DEK <400> 5 cgcggatccg cgatgtccgc ctcggcccct gctgcg 36 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DEK <400> 6 cgcgatatcg cgtcaagaaa ttagctcttt tac 33 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DEK <400> 7 cgcggatccg cgatgtccgc ctcggcccct gctgcg 36 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DEK <400> 8 cgcgaattcg cgtcaagaaa ttagctcttt tac 33 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DEK <400> 9 ccaggcagct taatacattc tttttag 27 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DEK <400> 10 tgatgctgaa aggttaaaga aaaaac 26 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DEK <400> 11 atgtccgcct cggcccctgc 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DEK <400> 12 tcaagaaatt agctctttac a 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DEK <400> 13 atgtccgcct cggcccctgc 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DEK <400> 14 tcaagaaatt agctctttac a 21

Claims (8)

1. DEK 단백질 또는 DEK 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 세포사멸을 유발하기 위한 조성물.
2. DEK 단백질 또는 DEK 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 암 치료용 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 DEK 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 핵산이 서열번호 1의 염기 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
5. DEK 유전자를 함유하는, 도 4에 기재된 개열지도를 갖는 pUAS-hDEK 재조합 벡터.
6. 시험관 내에서 DEK 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 유발하는 방법.
7. 인간 DEK 단백질을 과발현하는 형질전환 초파리.
8. 제 7 항에 있어서,

   제 5 항의 pUAS-hDEK 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환 초파리.

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