KR20090035180A

KR20090035180A - 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질 및 이를 포함하는조성물

Info

Publication number: KR20090035180A
Application number: KR1020070100311A
Authority: KR
Inventors: 정재수; 조부선
Original assignee: (주)다미화학; 정재수
Priority date: 2007-10-05
Filing date: 2007-10-05
Publication date: 2009-04-09
Also published as: JP2010540623A; WO2009045064A1; US9084748B2; JP5270680B2; US20130210737A1; CN101883860B; KR100926170B1; US8431364B2; US20110288025A1; CN101883860A

Abstract

본 발명은 미생물을 이용하여 엽산 및 대두추출물을 포함하는 배양물을 발효시켜 생성되는, 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질은 항히스타민, 항알러지, 칼슘흡수촉진, 뼈의 성장촉진, 콜라겐 생합성 촉진, 주름개선 효과가 있다. 따라서 피부외용제 또는 화장료 조성물, 건강보조용 식품 조성물, 사료 조성물 또는 의약조성물의 용도를 갖는다.

Description

엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질 및 이를 포함하는 조성물 {Biopolymer produced by fermenting the extract of soybean with folic acid and a composition containing thereof}

본 발명은 미생물을 이용하여 엽산 및 대두추출물을 포함하는 배양물을 발효시켜 생성되는, 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질 또는 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질 또는 고분자 조성물은 항히스타민, 항알러지, 칼슘흡수촉진, 뼈의 성장촉진, 콜라겐 생합성 촉진, 주름개선 효과가 있음이 확인되었다. 따라서 피부외용제 또는 화장료 조성물, 건강보조용 식품 조성물, 사료조성물 또는 의약조성물의 용도를 갖는다.

대표적인 발효식품인 청국장, 낫도 등은 고초균을 사용하여 대두를 발효시켜 만든다. 대두를 발효시키면 감마폴리글루타메이트(γ-polyglutamate) 및 폴리푸룩탄(polyfurctan) 등의 고분자가 생성된다. 감마폴리글루타메이트는 보습, 세포활성화 기능을 갖으며, 택솔 등 항암제와 함께 사용하면 약제의 효과를 높여준다고 알려져 있다. 폴리푸룩탄은 다이어트용 식이섬유로써 인체에 섭취되었을 때 포만감을 주어 식욕을 억제할 수 있으므로 비만예방효과가 있으며, 장내에서 유해 세균의 증식을 억제하고 유산균의 증식에 도움을 준다고 보고되었다(Journal of Applied Microbiology, 92, 5, p958-963).

대두발효물과 관련한 특허로는 화장품원료 (한국등록특허 제10-0451631호), 피부외용제 (한국공개특허 제2001-0083876호) 등에 관한 것이 있다. 성문희 등은 효소적인 방법으로 분자량 2,000kDa이상의 감마폴리글루타메이트를 생산하는 기술을 개발하였다 (App. And Environ. Microbiol. 2004; 70(7), 4249-4255; 한국등록특허 제10-0399091호). 또한 이들은 상기 고분자량의 감마폴리글루타메이트에 ascorbic acid를 결합시킨 형태의 물질 생산에 관한 연구 결과를 특허 등록하였다 (한국등록특허 제10-0485727호). 그러나 감마폴리글루타메이트에 엽산(folic acid; vitamin B₉)을 혼입시킨 새로운 형태의 대두발효 고분자물질 및 이의 용도에 대한 보고는 전무하다.

엽산은 노인의 심장질환 및 치매에 관여하는 것으로 알려진 호모시스테인을 낮추어 줄 수 있는 물질로 잘 알려져 있으므로 특히 노년층을 위한 식품소재로 사용되었을 때 큰 효과를 나타낼 수 있다. 엽산은 고분자형태로 자연계에 존재하며 이는 동물 및 인체에 흡수되기가 용이한 형태이다.

새로운 형태의 대두 발효물 소재를 개발하여 보다 우수하고, 저렴하며, 다양한 용도를 갖는 소재를 개발하는 것이 본 발명의 과제이다.

이를 위하여 본 발명은 엽산 및 대두추출물을 포함하는 조성물의 발효를 시도하여 이전까지 보고된 바 없는 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질(folyl EFS; folyl extract of fermented soybean)를 제조하여 제공한다.

본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질은 알러지 등 피부 부작용이 심한 사람들에게 나타나는 증상의 하나인 비만세포의 히스타민 방출을 억제하며, 전신성 과민증상을 억제하는 기능이 매우 탁월하다. 또 칼슘 등 미네랄의 소장 내 흡수를 촉진시키며, 포유 동물의 장골길이의 성장 촉진의 효능을 나타내고, 세포활성화 기능에 의한 콜라겐 생합성 촉진효능에 기인하여 인체의 피부에 도포 되었을 때 주름 개선 및 억제 효과를 나타내므로 주름개선 효과를 바탕으로 보습 및 항알러지 등 다양한 기능을 갖는다. 따라서, 본 발명의 고분자 또는 고분자 조성물은 건강기능성 식품, 화장품, 피부외용제, 의약품 그리고 사료로써 산업에서 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질은 유사한 효과를 갖는 다른 제품과 비교할 때 낮은 생산단가 및 높은 생산성을 갖으므로 보다 경제성이 우수하다.

도 1은 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 항히스타민 효과를 보기 위하여 현미경을 사용하여 비만세포를 관찰한 결과로써, 도 1a는 정상 세포의 형태, 도1b는 자극제 처리 후 30분 후의 세포의 형태, 도1c는 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질 및 자극제 처리 후 30분 후의 세포의 형태이다.

도 2는 히스타민 정량을 통한 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 히스타민 분비억제 효능실험 결과로써 천식치료제로 알려진 크로몰린의 히스타민 분비억제 효능과 비교하였다.

도 3은 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 전신성과민증상(anaphylaxis)에 대한 효능실험의 결과로써 자극제의 복강투입에 의한 각 군의 사멸율로 나타내었다.

도 4는 동물의 소장에서의 칼슘흡수에 대한 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 영향을 나타낸다. 동물에게 시험물질을 일정기간 섭취하게 한 후 소장을 적출하여 각 군의 칼슘을 정량하고, 무첨가군에 대한 비율로 나타내었다.

도 5는 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질이 동물의 혈중 성장인자(IGF-1)d의 농도에 미치는 영향에 대한 실험결과이다. 일정기간 상기 고분자물질을 래트에 섭취하게 한 후 각 군의 래트의 혈액을 채취하고 ELISA법으로 IGF-1을 정량하였다.

도 6은 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 콜라겐 생합성 촉진효능에 대한 결과로써, 인간피부 섬유아세포 초대배양체를 이용하여 상기 고분자물질첨가군, 무첨가군, 그리고 비교군으로써 콜라겐 생합성 촉진물질로 알려진 TGF-β 첨가군의 콜라겐 함량을 ELISA법으로 정량하고, 무첨가군의 콜라겐 함량 평균값과 대비한 각군의 비율로 나타내었다.

본 발명은 미생물을 이용하여 엽산 및 대두추출물을 포함하는 배양물을 발효시켜 생성되는, 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질 및 이의 용도에 관한 것이다.

대두를 미생물로 발효시킬 때 생성되는 감마폴리글루타메이트는 글루타민산의 아민 그룹과 감마-카복실그룹이 펩티드연결을 이루며 존재하는 고분자이다. 한편 엽산(folic acid, Vitamin B₉, pteolyl glutamic acid)은 글루타민산에 aromatic ring이 결합된 형태의 글루타민산 유사체이다. 본 발명자는 전통적인 대두 발효 시 생산되는 감마폴리글루타메이트가 바실러스(Bacillus ) 속 미생물이 생산하는 합성효소에 의한 것임을 확인하고, 이러한 합성효소들은 pteolyl ring에 글루타민산이 결합된 구조의 엽산을 접했을 때 이를 고분자화하려는 경향을 나타낼 수 있다는 것에 착안하여 실험한 결과, 대두를 미생물로 발효시킬 때 엽산을 첨가하면 미생물이 생산하는 효소에 의해 감마폴리글루타메이트에 혼입되어 엽산과 글루타민산으로 구성된 새로운 형태(folyl polyglutamate)의 고분자를 대량으로 생산하는 것이 가능하다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에서는 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질 및 이의 대량생산 방법을 제공한다. 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질은 folyl polyglutamate 를 포함한다. 또한 본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질에는 대두 발효시 생성되는 레반(폴리푸룩탄)이 포함될 수 있다.

고분자 물질에 혼입된 엽산은 단독으로 존재하는 엽산과 매우 다른 독특한 효능을 나타내며, 물에 대한 수용성이 높아져서 산업적 이용성이 향상되고, 동물의 소장에서 흡수율도 향상된다.

또한 본 발명의 고분자물질에는 대두 발효시에 생성되는 레반(microbial polyfructan)도 함께 포함될 수 있기 때문에 비피더스 유산균의 증식촉진에 의한 정장효과 및 비만예방 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질은 시험관 내 실험 및 동물실험 수준의 연구에서 확인한 결과, 엽산 단독으로는 갖지 않았던 면역증강 및 항알러지 기능이 농도에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 본 발명의 고분자 물질은 히스타민의 분비를 억제하였으며(도1 및 도2), 전신성 과민증상을 감소시켰다(도3). 따라서 본 발명의 고분자물질은 유아 및 소아의 급성 알러지 예방 및 성인의 체질개선을 위한 식품소재로 이용이 가능하다. 또한 아토피성피부염 또는 항알러지용 피부외용제 또는 화장료 조성물로 이용이 가능하다.

본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질은 콜라겐 생합성 촉진효과가 있으며(도6), 주름개선효과가 있다(표5). 따라서 본 발명의 고분자물질은 피부세포의 대사활성화, 주름개선 및 이의 효과를 바탕으로하는 보습, 피부개선용 외용제 또는 화장료 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질은 동물의 소장에서 칼슘흡수를 촉진하였다(도4). 이는 칼슘 및 철, 망간 등 의약품 소재인 금속 이온에 적용할 수 있어서, 다양한 제품을 생산할 수 있으므로 기능성 식품뿐만 아니라 의약품 산업에서도 영양제 및 임산부를 위한 빈혈치료제, 당뇨환자를 위한 보조제 등으로 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질은 뼈의 성장을 촉진하였으며(표4), 혈중의 성장인자 (IGF-10)를 증가시켰다(도5). 현재 상용화된 성장촉진 소재는 KI-180(하이키한의원 및 한국식품개발연구원 공동개발)등이 있는데 이는 천연한약재로부터 추출하였기에 고가이기 때문에 식품 소재가 아닌 의약품 등 고가의 제품에 이용해야 하는 등 산업화 시 어려움이 있으나, 본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질은 미생물 발효를 통하여 대량생산이 가능하므로 성장기 어린이를 위한 기능성 식품 및 폐경 여성을 위한 골다공증 예방 기능성 식품, 영양제의 소재로써 폭 넓게 이용할 수 있어서 산업화의 가능성은 보다 높다.

이와 같은 실험결과를 바탕으로 본 발명에서는 다음에 기재된 것을 제공한다.

[1] 미생물을 이용하여 엽산 및 대두추출물을 포함하는 배양물을 발효시켜 생성되는, 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자 물질.

[2] [1]에 있어서, 상기 미생물이 바실러스속 미생물인 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자 물질.

[3] [1]에 있어서, 상기 미생물이 바실러스 서브틸리스인 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자 물질.

[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 항히스타민 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.

[5] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 항알러지 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.

[6] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 칼슘흡수촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.

[7] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 뼈의 성장촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.

[8] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 콜라겐 생합성 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.

[9] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.

[10] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 피부외용제 또는 화장료 조성물.

[11] [10]에 있어서, 항알러지 또는 아토피성 피부염 개선을 위한 피부외용제 또는 화장료 조성물.

[12] [10]에 있어서, 피부세포의 대사활성화, 주름방지 또는 주름개선용 피부외용제 또는 화장료 조성물.

[13] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 건강보조용 식품 조성물.

[14] [13]에 있어서, 음료용 조성물인 것을 특징으로 하는 건강보조용 식품 조성물.

[15] [13]에 있어서, 상기 건강보조용 식품 조성물이 성장촉진효과를 갖는 것인 식품조성물.

[16] [13]에 있어서, 상기 건강보조용 식품 조성물이 골다공증 예방효과를 갖는 것인 식품조성물.

[17] [13]에 있어서, 상기 건강보조용 식품 조성물이 칼슘흡수촉진효과를 갖는 것인 식품조성물.

[18] [13]에 있어서, 상기 건강보조용 식품 조성물이 알러지예방 또는 체질개선효과를 갖는 것인 식품조성물.

[19] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 사료조성물.

[20] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 성장촉진용 의약조성물.

[21] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 골다공증 치료 또는 예방용 의약조성물.

[22] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 칼슘흡수촉진제용 의약조성물.

본 발명의 엽산함유 대두발효 고분자물질은 대두 추출물을 사용하여 제조할 수 있다. 대두 추출물은 정제수에 대두 0.1~50%를 넣고 100℃에서 1-2시간 동안 가열하고 서서히 냉각시킨 후 고형분을 제거하여 제조한다. 0.1~25% 포도당, 0.01~10% Na₂HPO₄, 0.01~10% NaH₂PO₄의 성분으로 배지를 제조하고, 배지에 0.1~90% 대두 추출물, 엽산 0.01%~10%을 첨가하고 살균한 후 식품으로부터 분리된 Bacillus subtilis를 접종하고, 10~60℃, 바람직하게는 35~55℃, pH 5.5~8.5 및 통성 혐기적인 발효 조건에서 48~96시간 동안 발효를 진행한다. 발효 후 연속원심분리를 통하여 균체 등 불용성 물질을 제거하고, 2M HCl을 사용하여 pH3-5, 바람직하게는 pH4로 조정한다. 여기에 에탄올을 2배 이상 첨가하여 고분자물질을 회수하고 동결건조하여 분말상으로 보관한다. 분자량에 따른 그룹화는 이 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 적용하여 실시한다. 예를 들어 크로마토그래피, 한외여과방법 등을 사용할 수 있다.

또한 상기 엽산함유 대두발효 고분자물질은 항알러지 및 성장촉진, 비피더스 유산균 증식촉진 등의 효능은 가축의 매출향상 및 육질의 향상의 기능을 나타낼 수 있으므로 사료산업에서 사료첨가물로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 엽산혼입 대두 발효 고분자물질을 고분자 총 중량에 대하여 0.01-60 중량 %, 바람직하게는 0.1-50중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 성분, 예를 들면, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 필요한 만큼 적용하여 배합하는 것이 가능하다. 본 발명의 엽산혼입 대두 발효 고분자물질을 함유하는 화장료 조성물은 보습용 화장품, 세안제, 바디용 화장품 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로서는 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 본 발명의 화장료의 구체예로서는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스터로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌진크림, 바디로션, 바디클린저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이새도우 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약조성물은 고형제, 반고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀 등의 형태로 사용될 수 있고, 여기서 얻어진 조성물은 장내 또는 비경구 적용하기에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제와 함께 활성 성분으로서 본 발명의 엽산혼입 대두발효 고분자물질을 포함한다. 활성 성분은, 예를 들면 정제, 펠렛제, 캡슐제, 좌약제, 용액제, 유제, 현탁제, 연고제 및 사용하기에 적합한 임의의 기타 형태에 대해 일반적으로 비독성인 제약상 허용되는 담체와 함께 혼합될 수 있다. 사용 가능한 담체에는 고체상, 반고체상 또는 액체상의 포도당, 유당, 아라비아 고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 삼규산 마그네슘염, 활석, 옥수수 전분, 각질 (角質), 코로이드성 실리카, 감자 전분, 우레아, 쇄 길이가 중간 정도인 트리글리세리드, 덱스트란, 및 제제의 제조에 사용하기에 적합한 기타 담체가 포함된다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제 및 착색 제 및 향료제가 사용될 수 있다. 활성 성분을 포함하는 의약 조성물은 경구용으로 사용하기에 적합한 형태, 예를 들면 정제, 구내정제, 마름모꼴 정제, 수성 또는 유성 현탁제, 분산성 분말제 또는 과립제, 유제, 경질 또는 연질 캡슐제, 또는 시럽제 또는 엘릭시르제(elixir)일 수 있다. 경구용으로 사용되는 조성물은 제약 조성물의 제조를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있고, 이들 조성물은 제약적으로 우수하고 입에 맞는 제제를 제공하기 위해 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 박하, 노루발풀 또는 체리와 같은 조미제, 착색제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 또한, 비독성의 제약상 허용되는 부형제와 함께 활성 성분을 포함하는 정제는 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 사용되는 부형제는, 예를 들면 (1) 탄산 칼슘, 유당, 인산 칼슘 또는 인산 나트륨과 같은 비활성 부형제; (2) 옥수수 전분, 감자 전분 또는 알긴산과 같은 과립화제 및 분해제 ; (3) 트래거캔스 고무, 옥수수 전분, 젤라틴 또는 아카시아와 같은 결합제 및 (4) 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제일 수 있다. 정제는 피복되지 않거나 또는 위장 관에서의 분해 및 흡수를 지연시키기 위해 공지의 방법으로 피복되어 보다 긴 기간 동안 작용이 유지될 수 있다. 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 사용할 수 있다. 이들은 또한 피복되어 방출을 제어하기 위한 삼투성 치료 정제를 형성할 수 있다.

일부의 경우에서, 경구용 제제는 활성 성분이 비활성 고체상 희석제, 예를 들면 탄산 칼슘, 인산 칼슘 또는 카올린과 혼합되는 경질 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 이들은 활성 성분이 물 또는 유상 매질, 예를 들면 땅콩유, 액상 파라핀 또는 올리브유와 혼합되는 연성 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있다.

각각의 치료 대상은 징후의 정도가 다양하고 각 약제는 독특한 치료적 특성을 가지므로, 치료에 대한 치료 대상의 반응을 결정하고 그에 따른 투약량을 변화시키는 것은 전문가가 해야 할 일이다. 전형적인 일일 투여량은 일반적으로 약 10μg 내지 약 200 mg/체중 kg의 범위, 바람직하게는 약 50μg 내지 약 100 mg/체중 kg 범위이며, 일일 4회 이하로 투여될 수 있다.

본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 포함하는 식품조성물로 제조되는 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 기술하고자 한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로서, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.

< 실시예 1>

엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 생산

엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 생산을 위해 먼저 대두 추출물을 제조하였다. 대두 추출물은 정제수에 대두 5.0%를 넣고 100℃에서 1시간동안 가열하고 서서히 냉각시킨 후 고형분을 제거하여 제조하였다. 2.0% 포도당, 1.0% Na₂HPO₄, 0.5% NaH₂PO₄의 성분으로 배지를 제조하고, 배지에 90% 대두 추출물, 엽산 0.5%을 첨가하고 살균한 후 식품으로부터 분리된 Bacillus subtilis를 접종하고, 45℃에서 72시간 동안 발효를 진행하였다. 발효 후 연속원심분리를 통하여 균체 등 불용성 물질을 제거하고, 2M HCl을 사용하여 pH4까지 조정하였다. 여기에 에탄올을 2배 이상 첨가하여 고분자물질을 회수하고 동결건조하여 분말상으로 보관하였다. 분자량 1000KDa 그룹의 고분자물질을 제조하기 위해서는 Sepharose 4B를 이용하여 500KDa이하의 물질을 제거하였고, 1,000KDa를 한외여과(cross-flow ultrafiltration unit, Vivascience 사)법으로 분자량 1,000KDa이하와 이상의 고분자물질을 분리하였다. 분자량 1,000KDa이상의 물질은 LC를 이용한 GPC분석결과 평균 분자량이 2,500KDa로 나타났다. 이렇게 분리된 두 분획을 건조한 후 동일한 건조물 중량으로 보정하여 실험에 사용하였다.

< 실시예 2>

엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질을 함유하는 조성물의 제조

상기 실시예 1의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질을 0.0~10.0 중량% 함유하고 식품 및 약제학적으로 허용 가능한 부가물을 첨가하여 다양한 조성물을 제조하였다.

(1) 제조예 1: 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 식품 조성물 제조예

하기의 표 1과 같은 조성 성분으로 구성되고, 음료식 건강보조식품을 위해 적합한 식품 조성물을 제조하였다.

엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질 함유 식품 조성물의 조성(중량%)

성　　 분	조성 1	조성2	조성3	조성4	조성5	조성6
실시예 1의 고분자물질 크로몰린 나트륨염 사이클로덱스트린 미네랄 등 소량 첨가물 정제수 천연방부제	--2395적량	-12394적량	0.05-2394적량	0.1-2394적량	0.2-2394적량	0.3-2394적량

(2) 제조예 2: 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 화장품 조성물 제조예

하기의 표 2과 같은 조성 성분으로 구성되는 화장료 조성물과 대조군으로 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질을 첨가하지 않고 증류수를 첨가한 조성물을 제형화하였다. 표 2의 (가)는 수용성이고, (나)는 지용성이다.

엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질 함유 화장료 조성물의 조성(중량%)

	성분	조성 1	조성2
가	에탄올 실시예 1의 발효물 글리세린 1,3-부틸렌글리콜 멸균 정제수	5.0-4.04.068.5	5.01.04.04.067.5
나	에탄올 세틸알코올 밀납 와세린 스쿠알렌 디메틸폴리실록산 POE(10)모노올레인산 에스테르 글리세롤 모노스테아린산 에스테르 방부제 향료 색소	5.01.00.52.06.02.01.01.0적량적량적량	5.01.00.52.06.02.01.01.0적량적량적량

(3) 제조예 3: 엽산함유 대두발효 고분자물질의 사료 첨가 조성물 제조예

하기의 표 3과 같은 조성 성분으로 구성되고 사료 첨가물을 위해 적합한 사료첨가용 조성물을 제조하였다.

엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질 함유 사료 첨가제 조성물의 조성(중량%)

성 분	조성 1	조성2
실시예 1의 고분자물질 탄산칼슘 제오라이트	-7030	17029

< 실시예 3> 항알러지 시험

실시예 3-1 비만세포의 현미경 관찰에 의한 항히스타민 효과관찰

본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 항 히스타민 효과를 관찰하기 위하여, 비만세포(mast cell)에 시험물질을 적용하고 현미경으로 관찰비교하였다(George Chiang et al, The Journal of Urology, Dec., 164, 2000, p2119~2125). 도 1a는 정상 세포의 형태, 도1b는 자극제(stimulator)인 C48/80을 처리하고 30분 후 세포의 형태, 도1c는 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질 및 자극제를 처리하고 30분 후의 세포의 형태이다. 도 1에서 정상적인 상태인 비만세포의 형태는 매끈하게 둥근 형태를 나타내며, 면역반응 시 나타나는 울퉁불퉁한 모습을 거의 나타내지 않는다. 그러나, 자극제인 C48/80을 처리하고 15 분이 경과하면 비만세포는 울퉁불퉁하게 뿔이 난 형태를 나타내게 되고, 30분이 경과하면 본래의 형태를 알아볼 수 없게 되고, 세포가 터지면서 히스타민이 방출된다. 비만세포의 표면이 울퉁불퉁하게 되는 것은 C48/80으로부터 자극을 받은 비만세포의 세포막에서 여러 신호전달물질이 분비되고 세포막의 안정성이 떨어지면서 세포막 표면이 불안정해지기 때문에 발생하는 현상이다. 따라서, 세포의 표면이 C48/80 처리 후 얼마나 본래의 형태를 유지하는가를 확인하는 것은 물질의 항히스타민효과를 가늠할 수 있는 잣대가 될 수 있다. 대조군과 반대로 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질 처리군의 비만세포의 모양은 15분 후까지는 거의 변화를 확인할 수 없었으며, 30분 후에도 일부 세포들만이 히스타민을 방출하면서 세포막이 터진 것을 제외하면 정상적인 상태의 비만세포의 형태와 매우 유사함을 확인할 수 있었다.

실시예 3-2 비만세포의 히스타민 정량에 의한 항히스타민 효과 관찰

또한 비만세포를 자극제로 처리한 후 분비되는 히스타민의 양을 본 발명의 고분자물질이 어느정도 감소시키는 가를 확인하고자 ELISA법을 통한 히스타민 정량법으로 분비된 히스타민을 정량하였다. 대조군으로는 천식치료제로 잘 알려진 1% 크로몰린나트륨(sodium cromolyn)을 사용하였으며, C48/80을 자극물질(stimulator)로 사용하여 비만세포(ATCC TIB-64, P815)의 활성화(activation)를 유도하였다.

도2에서 보이는 바와 같이 천식치료제인 크로몰린은 약 0.5%처리하였을 때 히스타민 분비 저해율이 50%가 되어 ED50 값이 0.5%이었으며 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 ED50 값은 약 0.063%로 그 차이가 약 8배에 달하였다. 이와 같이, 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질은 항 히스타민(항 알러지) 효과가 우수하였다.

실시예 3-3 항알러지( 항전신성과민증상 , anti - anaphylaxis )시험

실시예 3-1을 통하여 확인된 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 항히스타민효과를 동물실험으로 확인하였다. 실험에 사용된 동물은 마우스(BALB/C, 수컷)를 군당 10마리씩 사용하였다. 각군의 마우스에 각각 제조예1의 조성1~6을 7일간 섭취하게 한 후, C48/80을 복강에 주사하여 전신성 과민증상을 유발시켰다. 자극제로 사용한 C48/80은 생체 내의 면역기관을 자극할 수 있는 물질로서 복강 내에 주입되었을 때 30분이 내에 급작스러운 전신성 과민증상(anaphylaxis)를 유도할 수 있다. 본 시험은 자극제를 복강에 주입 후 실험에 사용된 동물이 일정시간(24시간) 내에 얼마나 사멸되는 가를 관찰하여 결과를 판정하였으며, 3회 실험의 평균값을 산출하여 비율(%)로 나타내었다.

도 3에서 무첨가군의 조성 1의 사멸율은 93.3%로 C48/80 주입 후 24시간 내에 10마리 중 9마리 정도 사멸하였다. 비교군으로 사용된 조성 2의 크로몰린 나트륨염 첨가군의 사멸율은 20%로 나타났다. 조성3~6까지의 시험군은 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질을 0.05~0.3%까지 다양한 농도로 첨가한 것으로서, 0.05%가 함유된 조성3은 사멸율이 33.3%, 조성4는 20%, 조성5는 6.7%, 조성6은 16.7%로 나타났다. 이러한 결과를 고려할 때 천식치료제로 알려진 크로몰린 나트륨염 1%는 전신성 과민증상을 80%까지 억제한다고 할 수 있으며, 엽산이 혼입된 대두발효물은 0.2%의 농도에서 최대 약 94%까지 억제한다고 할 수 있다. 그러나 자극제인 C48/80 투여 후 24시간 내에 생존한 마우스의 상태를 관찰한 결과 항문이 비정상적으로 부어 오른 상태의 동물이 관찰되었는데, 크로몰린 나트륨염의 조성2는 생존한 마우스의 약 80%, 엽산함유 대두발효 고분자물질이 단계적 농도로 첨가된 조성물3~6은 각각 약 10%, 0%, 0%, 0%의 비율로 나타났다. 따라서 크로몰린 나트륨염은 전신성 과민증상을 억제하여 사멸을 막아주었으나 전신성 과민증상의 후유증은 억제하지 못하지만, 엽산함유 대두발효 고분자물질은 사멸 뿐만 아니라 후유증도 억제하여 줄 수 있는 물질이라고 판단되었다.

< 실시예 4> 칼슘흡수촉진효과

칼슘흡수촉진효과에 대한 실험은 마우스(BALB/C, 수컷)를 사용하였으며, 각 시료는 1일 2회 경구투여법으로 마우스에 주입하였다. 경구투여 기간은 3일이며, 투여종료 후 소장을 적출하여 식염수에 3회 이상 세척한 후, 각 군으로부터 적출된 소장을 각각 모아서 테프론 균질화기(Homogenizer)를 사용하여 조직을 마쇄하였다. 이를 원심분리하고 상등액을 취하여 칼슘정량 kit(Wako사)를 사용하여 장내로 흡수된 칼슘을 양을 측정하였다.

도4에서 나타난바와 같이, 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질은 대조군(무첨가군)에 비하여 분자량에 따라 약 84~96%의 칼슘흡수율을 나타내었으며, 칼슘염은 약 4.7%, 칼슘흡수촉진제인 CPP(casein phosphopeptide)는 21%, 감마폴리글루타메이트는 56.8%의 칼슘흡수율을 나타내었다. 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효고분자 물질은 분자량이 500~1,000 KDa인 경우가 그보다 큰 분자량을 갖는 경우보다 칼슘흡수촉진 기능이 더 높은 것을 알 수 있다. 이것은 분자량이 지나치게 높은 경우 2가 이온인 칼슘이온은 음전하를 띠는 고분자물질과 반응하여 용해되기 어려운 심한 침전물 상태로 되기 때문에 나타나는 것으로 여겨지며, 이러한 칼슘-고분자 복합물의 경우 일정 분자량 이상에서 수용화되기 쉬운 상태로 원료를 제조하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다.

< 실시예 5> 성장촉진 효과

실시예 3에서 관찰된 바와 같이 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질은 장내로 칼슘의 흡수를 촉진하였으므로, 장내로 흡수된 칼슘이 동물 뼈의 성장 및 혈중 성장인자(IGF-1)에 영향을 줄 수 있는 가를 확인하고자 포유류 동물에게 본 발명의 고분자물질을 2주간 섭취 시킨 후 장골의 길이 및 무게를 측정하였고, 혈액을 채취하여 성장인자인 IGF-1을 측정하여 그 결과를 대조군(식염수 첨가군)과 비교하였다. 실험에 이용한 동물은 래트(SD rat, 수컷)이며, 성장기인 4주령을 실험에 이용하였으며, 비교군은 성장촉진제로 P사에서 판매하고 있는 K제품 (가시오가피, 홍화씨, 숙지황, 복령, 산약, 산수유, 녹각 등 한약재 추출물을 주요 성분으로 함)을 동일한 조건에서 비교실험하였다.

결과는 표4와 도5에 나타내었다. 장골의 길이 측정결과, 표준오차 5%이하에서 식염수 섭취군인 대조군은 29.22mm, P사의 성장촉진제품 섭취군인 비교군은 29.63mm, 본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질 섭취군인 실험군은 30.14mm를 나타내었다. 대조군에 비하여 비교군은 약 1.4%의 성장촉진효과를 나타내었으나 실험군은 약 3.1%의 성장촉진효과를 나타내었다(표4). 혈중 성장촉진인자로 알려진 IGF-1를 ELISA법으로 정량한 결과 대조군은 1409.5㎍/㎖, 비교군은 1566㎍/㎖, 실험군은 1637.1㎍/㎖의 결과를 나타내었고, 이는 비교군과 실험군은 대조군에 비하여 각각 11.1%, 16.2% 상승된 결과이다(도5). 장골의 무게에서 비교군 및 실험군은 대조군보다 약 1.3%, 약 2.3% 높게 나타났다. 이러한 결과를 고려할 때, 본 발명의 고분자물질은 동물의 성장촉진효과가 있음을 알 수 있다. 또한 P사의 제품과 본 발명의 고분자물질의 제조원가를 비교할 때, P사의 제품은 각종 비타민과 영양원이 함유된 제품이라는 것을 고려하면, 본 발명의 고분자물질의 제조원가는 P사 제품의 약 1/20 수준 밖에 되지 않으므로 효능 뿐만 아니라 경제적 관점에서도 우수한 원료라고 판단된다.

엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 뼈 성장 촉진효능

< 실시예 6> 주름개선 실험

실시예 6-1 세포수준의 콜라겐 생합성 촉진효능 실험

세포활성화 효과라 함은 세포의 증식을 급격하게 활성화하는 것, 또는 대사산물의 생산을 활성화하는 것, 또는 세포 내 미토콘드리아의 기능을 활성화하여 해독작용을 하는 것 등 매우 광범위하고 다양한 의미를 함축적으로 나타낸 표현이다.

엽산은 세포의 분열과 증식 과정에서 DNA와 RNA 합성 시 보조효소로 이용되기 때문에 성장기 청소년 및 임산부에게 필수적인 성분이므로 세포의 활성화에 영향을 줄 수 있을 것이라 예측하였으며, 세포 활성화 효과는 피부에서 상처의 치료 또는 주름개선의 효과를 나타낼 수 있으므로 다음과 같은 실험을 실시하였다.

실험에 사용한 세포주는 섬유아세포 초대배양체(human dermal fibroblast neonatal, HDF-N, primary culture)이며, 배지는 섬유아세포 생육배지(FGM, KDR사)를 사용하였고, 3일간 배양 후 상등액을 취하여 Human collagen type-1 ELISA kit(Cosmo Bio사)로 콜라겐을 정량하였다. 실험에 사용된 시료는 제조예 2의 화장료 조성물 2의 농도와 동일하게 1%용액으로 제조되었으며, 1,3-부틸렌글리콜을 4%농도로 첨가하여 보존하였다. 또 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 효능과 비교하기 위하여 동일 농도의 엽산용액을 제조하여 비교실험에 사용하였고, 또한 콜라겐 생합성 촉진인자로 알려진 10ng/㎖ 농도의 TGF-β(Transforming growth factor-beta)용액를 사용하여 비교하였다.

엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 콜라겐 생합성 촉진효능은 도6에 나타내었다. 화장품 원료로 제조된 본 발명의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자 물질은 1% 액상제품이며, 도 6의 x축의 농도(%)는 상기 고분자 물질용액의 부피/전체 배양액 부피(v/v, %)의 비율로 나타낸 것이다. 결과는 무첨가군의 콜라겐 함량 평균값을 100%라고 설정한 후 무첨가군의 콜라겐 함량 평균값에 대비한 각 군의 값의 비율로 나타내었다. 결과적으로 TGF-β는 0.63%(v/v, %)에서 최대 촉진율인 22%를 나타내었으며, 본 발명의 고분자물질은 0.63%(v/v, %)에서 최대 촉진율인 109%를 나타내었다. 이는 비교군인 TGF-β보다 4배 이상 더 상승된 결과로써 본 발명의 고분자물질이 인간의 피부에서 콜라겐을 과량 생산함을 통하여 주름개선 효과를 나타낼 수 있다는 가능성을 보인 것이다. 한편, 엽산은 오차범위 내에서 콜라겐 생합성 촉진효능을 나타낸다고 평가할 수 없었다. 따라서 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질은 화장품 원료 특히 콜라겐 생합성을 통한 주름개선 원료로써 매우 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 6-2 화장료 조성물의 주름개선 실험

본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질의 주름개선 효과를 조사하기 위하여, 30대 여성 29명에게 눈 주위 주름 부위에 실시예 2, 제조예 2에서 조제된 화장료 조성물1(대조군)과 조성물2(실험군)을 각각 1개월간 1일 2회씩 도포하도록 하였다. 1개월 후 주름개선 정도를 피험자의 설문 및 주름의 영상분석으로 평가하고, 피험자의 설문은 실험 전과 비교하여 개선 없음, 약간 개선, 중증도 개선, 상당한 개선의 4단계로 평가하였다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 시험이 시작되기 전에 Visioscan SV600(CK사)을 이용하여 눈 밑의 레플리카를 채취하고, 시험이 종료된 직후 동일 부위에서 레플리카를 채취하여 영상분석을 통해 주름의 밀도를 측정하여 주름의 감소율로 나타내었다.

결과는 표5로 나타내었으며, 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질이 포함된 조성물 2는 조성물 1과 비교하였을 때 주름을 완화 또는 개선시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 조성물을 도포한 경우 주름의 밀도가 사용전보다 약 45% 정도로 감소하는 것을 확인하였다.

이와 같은 시험결과는 본 발명의 조성물이 피부외용제로 사용되었을 때 피부에 생성된 주름을 효과적으로 개선시킬 수 있음을 나타내는 것으로, 본 발명의 엽산이 혼입된 대두발효 고분자물질이 화장품 원료로써 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.

Claims

미생물을 이용하여 엽산 및 대두추출물을 포함하는 배양물을 발효시켜 생성되는, 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자 물질.
제1항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스속 미생물인 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자 물질 .
제1항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스 서브틸리스인 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자 물질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항히스타민 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항알러지 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘흡수촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈의 성장촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 생합성 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 피부외용제 또는 화장료 조성물.
제10항에 있어서, 항알러지 또는 아토피성 피부염 개선을 위한 피부외용제 또는 화장료 조성물.
제10항에 있어서, 피부세포의 대사활성화, 주름방지 또는 주름개선용 피부외용제 또는 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 건강보조용 식품 조성물.
제13항에 있어서, 음료용 조성물인 것을 특징으로 하는 건강보조용 식품 조성물.
제13항에 있어서, 상기 건강보조용 식품 조성물이 성장촉진효과를 갖는 것인 식품조성물.
제13항에 있어서, 상기 건강보조용 식품 조성물이 골다공증 예방효과를 갖는 것인 식품조성물.
제13항에 있어서, 상기 건강보조용 식품 조성물이 칼슘흡수촉진효과를 갖는 것인 식품조성물.
제13항에 있어서, 상기 건강보조용 식품 조성물이 알러지예방 또는 체질개선효과를 갖는 것인 식품조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 사료조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 성장촉진용 의약조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 골다공증 치료 또는 예방용 의약조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 엽산이 혼입된 대두 발효 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 칼슘흡수촉진제용 의약조성물.