KR20090021655A - 참깨의 모상근 유래 디하이드로아스코르베이트 리덕타제유전자로 형질전환된 감자 - Google Patents

참깨의 모상근 유래 디하이드로아스코르베이트 리덕타제유전자로 형질전환된 감자 Download PDF

Info

Publication number
KR20090021655A
KR20090021655A KR1020070086341A KR20070086341A KR20090021655A KR 20090021655 A KR20090021655 A KR 20090021655A KR 1020070086341 A KR1020070086341 A KR 1020070086341A KR 20070086341 A KR20070086341 A KR 20070086341A KR 20090021655 A KR20090021655 A KR 20090021655A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
potato
promoter
transformed
dhar
Prior art date
Application number
KR1020070086341A
Other languages
English (en)
Inventor
구영민
전현진
김태원
이철호
배신철
조강진
천재안
정정한
이신우
Original Assignee
진주산업대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 진주산업대학교 산학협력단 filed Critical 진주산업대학교 산학협력단
Priority to KR1020070086341A priority Critical patent/KR20090021655A/ko
Publication of KR20090021655A publication Critical patent/KR20090021655A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y108/00—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8)
    • C12Y108/05—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with a quinone or similar compound as acceptor (1.8.5)
    • C12Y108/05001—Glutathione dehydrogenase (ascorbate) (1.8.5.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

본 발명은 감자의 비타민 C 함량을 증가시키기 위한 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 (dehydroascorbate reductase) 유전자로 형질전환된 감자 및 (1) 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 포함한 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 벡터로 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시키는 단계; (3) 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감자 조직을 형질전환시키는 단계; (4) 상기 형질전환된 감자 조직을 배양하여 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자를 분리하는 단계를 포함한 형질전환된 감자의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 감자가 잎에서 비타민 C의 함량이 증가된 경우에는 외부 스트레스에 대한 저항성이 증가되어 생육이 개선되고 척박한 환경에서도 생장할 수 있으며, 괴경에서 비타민 C의 함량이 증가된 경우에는 섭취하는 사람에게 더욱 많은 양의 비타민 C를 공급할 수 있다.
비타민 Ｃ, 감자, 디하이드로아스코르베이트 리덕타제, 참깨의 모상근

Description

참깨의 모상근 유래 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자 {Potatoes Transformed with Dehydroascorbate Reductase Gene Derived from Sesame Hairy Root}
본 발명은 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 (dehydroascorbate reductase) 유전자로 형질전환된 감자 및 (1) 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 포함한 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 벡터로 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시키는 단계; (3) 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감자 조직을 형질전환시키는 단계; (4) 상기 형질전환된 감자 조직을 배양하여 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자를 분리하는 단계를 포함한 형질전환된 감자의 제조방법에 관한 것이다.
비타민 C는 심장혈관 기능의 강화, 면역세포 및 결합조직의 발달, 철분의 흡수 등에 주요한 역할을 하는 미량 영양소이다. 비타민 C는 동물 뿐만 아니라 식물에서 특정 호르몬이나 콜라겐의 주성분인 하이드록시프롤린의 합성과정에서 보조효 소로 작용한다. 비타민 C의 결핍증상으로 나타나는 괴혈병은 콜라겐 합성반응의 이상 현상과 연관이 있는 것으로 알려져 있다 (Hallwell, Trends Biochem. Sci. 1999, vol.24, pp.255-259). 또한, 비타민 C는 항산화제로 작용하여 암을 비롯한 각종 질병을 예방하고 노화를 지연시킨다는 연구 결과도 보고된 바 있다.
비타민 C의 농도가 낮은 식물 돌연변이체는 오존 또는 고염 상태에서 산화에 의한 피해가 심각한 것으로 확인되면서 비타민 C가 항산화제로서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려지게 되었다 (Conklin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol.93, pp.9970-9974; Smirnoff, Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2001, vol.355. pp.1455-1464). 비타민 C는 대부분의 동물과 식물에서 합성이 가능하지만, 사람의 경우 비타민 C 합성 경로의 최종 단계에 관여하는 효소인 L-굴로노-1,4-락톤 옥시도리덕타제 (L-gulono-1,4-lactone oxidoreductase)가 없어 자체적으로 합성할 수 없기 때문에 반드시 외부에서 섭취하여야 한다.
사람은 비타민 C를 대부분 식물로부터 섭취하며, 비타민 C는 주로 과채류에 풍부하게 함유되어 있다. 현재 비타민 C의 일일 섭취 권장량은 75 - 90㎎으로 정해져 있으나, 권장량을 200㎎으로 증가시키자고 제안된 바 있다 (Levine et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol.93, pp.3704-3709). 2002년 전 세계 비타민 C의 연간 총 생산량은 80,000톤이며, 시장은 약 6억 달러에 이르고, 해마다 3 - 4%씩 증가하고 있는 추세이다 (Hancock & Viola, Trends in Biotechnol. 2002, vol.20, pp.299-305).
한편, 사람을 제외한 동물의 경우 D-글루쿠론산 경로 (글루코오스, 글루쿠론산, 굴론산, 굴로노-1,4,락톤)에 의하여 비타민 C를 합성하는 것으로 알려져 있다 (Burns, Metabolic Pathways, 1960, vol.1, pp.341-356). 반면에 식물은 두 가지의 경로가 알려져 있으며, 한 경로는 D-갈락토오스로부터 비타민 C로 전환되기 직전의 전구물질인 L-갈락토노-1,4-락톤이 생성되는 경로이며 이는 GDP-D-만노오스와 GDP-L-갈락토오스를 거쳐 합성된다 (Wheeler et al. Nature, 1998, vol. 393, pp.365-369). 또 다른 경로는 D-갈락트우론산으로부터 여러 단계를 거쳐 L-갈락토노-1,4-락톤으로 전환되는 경로이다 (Isherwood et al. Biochem. J, 1954. vol.56, pp.1-4; Conklin, Plant Cell Environ. 2001, vol.24, pp.383-394).
식물에서 합성된 비타민 C (즉, 아스코르브산)의 주된 기능은 항산화제로서의 역할이며, 특히 엽록체에서는 아스코르베이트 퍼옥시다제 (ascorbate peroxidase)와 비올라크산틴 데-에폭시다제 (violaxanthin de-epoxidase)의 기질로 작용하여 활성산소를 제거하거나, 광합성 과정에 있어서 광계 Ⅱ(photosystem Ⅱ)의 활성을 억제하여 여분의 빛 에너지를 소진시키고 산화 스트레스로부터 식물을 보호하는 역할을 한다 (Asada, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999, vol.50, pp.601-639; Niyogi, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999, vol.50, pp.330-359).
이러한 일련의 생화학 반응 과정에서 아스코르브산은 모노데하이드로아스코르베이트 (monodehydroascorbate, MDA)로 산화되며, 이는 다시 자발적으로 데하이드로아스코르베이트 (dehydroascorbate, DHA)로 전환된다. DHA는 DHAR (데하이드 로아스코르베이트 리덕타제)에 의하여 아스코르브산으로 재생되거나, 비가역적으로 분해된다 (Hossain et al. Plant Cell Physiol. 1984, vol.25, pp.385-395). DHAR은 글루타치온 (glutathione, GSH)을 전자공여체로 사용하여 DHA를 환원시켜 아스코르브산으로 재생할 수 있으며, 이 효소는 식물 뿐만 아니라 동물에도 존재한다 (Vethanayagam et al. Free Rad. Biol. med. 1999, vol.26, pp.1591-1598). 따라서 DHAR은 DHA를 재활용하여 가장 주요한 환원제인 아스코르브산을 재생시킴으로써 식물의 산화-환원 상태를 조절하는 역할을 한다.
식물에서 비타민 C의 함량을 높이기 위한 최초의 시도는 동물 (쥐)로부터 분리한 L-굴로노-γ-락톤 옥시다제 cDNA를 형질전환시킨 기술로서, 담배와 상추에서 비타민 C가 7배 이상의 높은 농도로 축적된 것으로 보고되었다 (Jain & Nessler, Molecular Breeding, 2000, vol.6, pp.73-78). 그러나 동물과 식물의 비타민 C의 합성 경로가 동일하지 않기 때문에 어떠한 대사경로를 통하여 L-아스코르브산의 농도가 증가되었는지에 관한 것은 충분히 밝히지 못하였다.
Agius 등 (Agius et al. Nature Biotech. 2003, vol.21, pp.177-181)은 딸기의 NADPH-의존성 D-갈락트우론산 리덕타제 (GalUR) cDNA를 애기장대에 도입하여 그 발현양의 증가와 함께 잎에서 비타민 C의 함량이 2 - 3 배 증대되었음을 확인하였다. 이는 잎에서 D-갈락트우론산이 공급된다는 것을 의미하며, 또한 저장 조직의 경우에도 비타민 C의 집적 유도가 충분한 가능성이 있다는 것을 암시한다. 식물에서 NDP-D-갈락트우론산은 NDP-D-갈락토오스로부터 합성되며, 이후 골지체내의 펙틴과 결합하여 세포벽으로 이동하는 것으로 예상된다. 유리 상태의 D-갈락트우론산 은 NDP-D-갈락트우론산의 가수분해 또는 세포벽의 펙틴 성분의 분해 결과로 생성된다. 따라서 펙테이트 리아제, 폴리갈락우로나제 등 펙틴 성분의 합성 및 분해와 관련된 유전자를 이용한 대사공학기술에 의해서도 비타민 C의 함량을 높일 수 있다는 가능성을 제시하였다고 할 수 있다.
식물에서 DHA의 재생능력을 보강시킴으로써 비타민 C의 함량을 증가시키기 위한 기술은 Chen 등 (Chen et al. PNAS, 2003, vol.100(6), pp.3525-3530)에 의하여 처음으로 시도되었다. 밀에서 분리한 dhar cDNA를 담배와 옥수수에 도입한 경우 32 - 100배로 그 유전자의 발현도가 증가되었으며 잎 조직과 옥수수의 낟알에서 비타민 C 함량이 2 - 4배까지 증가한 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 이들의 산화 환원능의 증가와 함께 GSH의 농도가 크게 증가한 것으로 조사되어 비타민 C의 재생에 필요한 핵심효소인 dhar의 발현 증가로 비타민 C의 농도를 증가시킬 수 있음을 암시하였다. 그러나 그 이후 영양분의 저장 기관 즉 감자의 괴경 또는 과채류의 과실 등에 비타민 C 함량을 특이적으로 증가시키기 위한 연구는 아직 보고된 바가 없다.
특히, 감자는 전 세계 인구의 상당수가 주식으로 또는 다른 야채에 비하여 많은 양으로 섭취하고 있으며, 비타민 C의 주요한 공급원으로 작용하고 있다. 최근에는 감자 칩 등 감자를 소재로 제조한 각종 식품의 소비가 급격하게 증가하면서 그 소비량이 지속적으로 증가하고 있는 추세이다. 따라서 감자를 비롯한 식물의 저장 조직 또는 기관에 비타민 C의 함량을 증가시키는 기술이 요구된다.
더 나아가, 감자의 비타민 C는 전분입자에 둘려 싸여 있어 열에도 훨씬 안정하여 조리시 쉽게 파괴되지 않는다. 생감자는 약 36㎎/100g생체중 농도로 많은 비타민 C를 함유하고 있으며, 찌거나 삶은 감자도 약 26 - 30㎎/100g생체중의 높은 비타민 C 함량을 유지하는 것으로 알려져 있다 (2000년 식품성분분석표, 농업생활연구소). 따라서 생감자의 비타민 C 함량을 증가시킬 수 있다면 영양적 가치는 크게 증가시킬 수 있으며, 가열에 의한 조리과정에서도 쉽게 파괴되지 않아 건강식품으로 보다 가치를 높일 수 있다.
본 발명자들은 감자의 비타민 C 함량을 높이기 위하여 CaMV35S 프로모터의 조절을 받는 참깨의 모상근으로부터 분리한 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자를 제조하여 감자의 잎에서 상기 유전자의 발현량을 증가시키는 한편 감자의 파타틴 유전자의 프로모터의 조절을 받는 참깨의 모상근으로부터 분리한 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자를 제조하여 감자의 괴경에서 상기 유전자의 발현량을 증가시킨 결과, 전자의 경우에는 감자의 잎에서 비타민 C 함량이 높아져 외부 스트레스에 대한 저항력이 개선되고 후자의 경우에는 감자의 괴경에서 비타민 C 함량이 높아져 사람이 섭취할 경우 비타민 C의 공급량을 증진시킬 수 있다는 가능성을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 (dehydroascorbate reductase, dhar) 유전자로 형질전환된 감자에 관한 것이다.
식물에서 비타민 C (즉, 아스코르브산)는 모노디하이드로아스코르베이트 (monodehydroascorbate, MDA)로 산화되고, 다시 자발적으로 디하이드로아스코르베이트 (dehydroascorbate, DHA)로 전환되는데, "디하이드로아스코르베이트 리덕제"는 글루타치온(glutathione, GSH)을 전자공여체로 사용하여 상기 디하이드로아스코르베이트를 아스코르브산으로 재생하는 활성을 갖는 단백질이다. 따라서, 식물에서 디하이드로아스코르베이트 리덕타제의 양이 증가한다면 디하이드로아스코르베이 트의 아스코르브산으로의 환원 반응이 증가되어 비타민 C의 함량이 높아질 것으로 예상된다.
"모상근"은 식물이 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)에 의해 감염된 경우 감염 부위에서 유도 발생되는 미세한 뿌리들을 지칭한다. 모상근은 배양 세포보다 생장이 훨씬 빠르고 계대 배양시에도 배양세포와는 달리 정상 조직과 동일한 생화학적 및 유전적인 특성을 유지하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자는 아그로박테리움 리조게네스로 감염된 참깨의 모상근으로부터 분리된 것이다.
"형질전환"은 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 감자로 도입하여 상기 유전자가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합에 의해 복제 및 발현 가능하게 되는 것을 의미한다. 즉, 본 발명에 따른 형질전환된 감자는 천연적으로 보유한 유전자와 마찬가지로 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 복제 및 발현할 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명에서 형질전환은 아그로박테리움 튜메파시엔스 또는 전자총 (particle bombardment)을 이용하여 실시할 수 있지만, 아그로박테리움 튜메파시엔스를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 감자의 한 양태는 상기 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자가 전신 발현용 유전자의 프로모터 조절 하에 있어 야생형 감자와 비교하였을 때 감자의 잎에서 보다 증가된 양의 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 것이다. 전신 발현용 유전자의 프로모터란 감자 의 뿌리, 잎, 줄기 및 괴경 등 모든 기관에서 발현되는 유전자의 프로모터를 의미하는 것으로서, 본 발명에서는 CaMV35S 프로모터 또는 유비퀴틴 프로모터를 이용할 수 있지만, CaMV35S 프로모터를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 감자의 다른 양태는 상기 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자가 괴경 특이적 발현용 유전자의 프로모터 조절 하에 있어 야생형 감자와 비교하였을 때 감자의 괴경에서 보다 증가된 양의 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 감자이다. 괴경 특이적 발현용 유전자의 프로모터란 감자의 괴경에서만 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터를 의미하는 것으로서, 본 발명에서는 감자의 파타틴 (Patatin) 프로모터 또는 고구마에서 유래된 ADP-글루코오스 인산화효소의 프로모터를 이용할 수 있지만, 감자의 파타틴 (Patatin) 프로모터를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자는 (1) 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 포함한 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 벡터로 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시키는 단계; (3) 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감자 조직을 형질전환시키는 단계; (4) 상기 형질전환된 감자 조직을 배양하여 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자를 분리하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.
상기 단계 (1)에서는 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 포함한 벡터를 제조한다. 본 발명의 벡터는 T-DNA의 양 말단에 위치한 오른쪽 전이 필수 영역 (25 bp, Right Border, RB) 및 왼쪽 전이 필수 영역 (25 bp, Left Border, LB)을 필수적으로 포함하고, 상기 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자는 상기 RB와 LB내에 존재한다. 또한, 상기 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자는 그의 발현을 조절하는 프로모터와 작동가능하게 연결되어야 한다. 상기 프로모터는 전신 발현용 유전자의 프로모터 또는 괴경 특이적 발현용 유전자의 프로모터일 수 있다. 전신 발현용 유전자의 프로모터로는 CaMV35S가 바람직하고, 괴경 특이적 발현용 유전자의 프로모터로는 감자의 파타틴 유전자의 프로모터가 바람직하다. 또한, 상기 벡터는 감자가 상기 벡터로 형질전환되었는지 여부를 확인시켜 줄 선별 유전자를 포함하여야 하고, 선별 유전자도 상기 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자와 같이 RB 및 LB 내에 존재한다. 선별 유전자로는 당업계에 공지된 하이그로마이신 (hygromycin)에 저항성을 갖는 유전자 (hyg), 가나마이신 (kanamycin)에 저항성을 갖는 유전자 (nptII) 등이 사용될 수 있으나, 본 발명에서는 포스피노트리신(phosphinothricin 또는 PPT)에 저항성을 갖는 유전자 (bar, phosphinothricin acetyltransferase)를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 한 양태에 따라 제조된 CaMV35S 프로모터와 이에 작동 가능하게 연결된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 포함한 벡터 "CaMV35S::DHAR"이 바람직하다 (실시예 1 참조). 본 발명의 다른 양태에 따라 제조된 감자의 파타 틴 유전자의 프로모터와 이에 작동 가능하게 연결된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 포함한 벡터 "Patatin::DHAR"이 바람직하다 (실시예 1 참조).
단계 (2)에서는 상기 벡터로 아그로박테리움 튜메파시엔스를 형질전환시킨다. 여기서는 상기 벡터와 아그로박테리움 튜메파시엔스를 혼합한 후 냉동 및 해동시키 방법으로 형질전환하는 것이 적합하다 (freeze & thaw method, Gynheung An. Methods in enzymology. 1987, Vol. 153, pp.292-305).
단계 (3)에서는 단계 (2)에 의하여 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 포함한 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감자 조직을 형질전환시킨다. 감자 조직으로는 시험관 내에서 증식한 감자 줄기의 절편이 바람직하다. 감자의 조직과 아그로박테리움 튜메파시엔스를 접촉시켜, 예를 들면 아그로박테리움 튜메파시엔스의 배양물에 감자의 조직을 침지시켜 형질전환시킨다. 여기서, 형질전환 효율을 높이기 위하여 아세토시린곤 (acetosyringone)도 함께 처리하는 것이 바람직하다.
단계 (4)에서는 단계 (3)을 통하여 수득한 형질전환된 감자 조직을 배양하여 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자를 분리한다. 즉, 앞서 형질전환된 감자 조직을 먼저 재분화 배지로 배양하여 캘러스 (callus) 형성을 유도하고, 캘러스로부터 유기된 신초들을 대상으로 형질전환 유무를 확인한 후 형질전환된 것으로 확인된 신초들을 뿌리 유기 배지에서 배양하는 과정을 거쳐 뿌리와 싹이 자라난 (즉, 감자의 성체로 생장할 수 있는) 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자를 분리할 수 있다. 여기서, 형질전환 유무는 단계 (1)에서 제조된 벡터에 포함된 선별 유전자를 이용하여 이루어진다. 일례로 벡터가 bar 유전자를 포함한 경우 포스피노트리신에 저항성을 보일 경우 형질전환이 이루어진 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에 의해 잎에 비타민 C의 함량을 증가된 감자는 외부의 스트레스에 대한 저항력이 개선되어 생육이 개선되고 척박한 환경에서도 생장 가능하다.
본 발명에 의해 괴경에 비타민 C의 함량이 증가된 감자는 사람이 섭취하였을 때 더욱 많은 비타민 C를 공급받을 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 감자로부터 파타틴 프로모터의 분리 및 참깨의 모상근 유래 dhar cDNA를 포함한 벡터의 제조
감자의 괴경에서 특이적으로 발현하는 파타틴 유전자의 프로모터를 분리하기 위하여 공지된 S. tuberosum B33 유전자 업스트림 영역 (GenBank, accession number X14483)의 염기서열 정보를 참조하여 후술된 서열번호: 1 및 2의 프라이머 들을 합성하였다. 상기 프라이머와 감자 (S. tuberosum L. var. Dejima)의 잎으로부터 분리한 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 실시하였으며, 증폭된 파타틴 프로모터의 단편을 PCR 정제 시스템 키트 (Bioneer)를 이용하여 정제하였다. 정제된 파타틴 프로모터의 단편은 pGEM-T easy 벡터 (Promega)에 DNA 라이게이션 키트 버전 2.1 (DNA Ligation Kit Ver.2.1, Takara)을 사용하여 16℃에서 1시간 동안 반응시켜 연결시킨 후 E.coli TOP10F'로 형질전환하였다.
감자로부터 파타틴 유전자의 프로모터를 분리하기 위한 프라이머
5'-프라이머 5'-ATGTTGCCATATAGAGTAGTTTGTGATGG-3' 서열번호: 1
3'-프라이머 5'-TTTGCAAATGTTCAAAGTGTTTTTAAATTTTGTTGGTGCTTT-3' 서열번호: 2
이렇게 분리된 파타틴 프로모터를 식물 형질전환용 벡터인 pSJ001에 본래 포함된 CaMV 35S 프로모터를 제거하고 그 위치에 삽입하기 위하여 먼저 상기 파타틴 프로모터가 제한효소 (Eco RI, Sac I)의 인식부위를 갖도록 후술된 서열번호: 3 및 4의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였으며, 증폭된 파타틴 프로모터 단편을 Eco RI과 Sac I으로 절단한 후 pSJ001의 동일한 제한효소 위치에 클로닝하였다.
여기서 사용된 벡터인 pSJ001은 고려대학교 생명공학원 안지훈 교수팀으로부터 분양받은 것으로서, 도입될 유전자가 CaMV35S 프로모터에 의해 조절되도록 하고, 포스피노트리신(phosphinothricin 또는 PPT)에 저항성을 나타내는 bar 유전자가 마노파인 신타제 (mannopine synthase, Mas) 유전자의 프로모터에 의하여 조절되도록 제조된 것이다.
감자의 파티틴 프로모터에 Eco RI, Sac I 인식부위를 도입하기 위한 프로모터
5'-프라이머 5'-GGCGAATTCAAATCATTGTTTTATTTTCTC-3' 서열번호: 3
3'-프라이머 5'-GGCGAGCTCTTTGCAAATGTTGAAAGTGTT-3' 서열번호: 4
pSJ001 벡터와 CaMV35S 프로모터가 파타틴 프로모터로 치환된 'pSJpatatin01 벡터'에 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)로 형질전환된 참깨 모상근으로부터 분리된 dhar cDNA를 삽입하기 위하여 먼저 상기 dhar cDNA가 제한효소 (Sal I, Pst I)의 인식부위를 갖도록 후술된 서열번호: 5 및 6의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였으며, 증폭된 dhar cDNA와 함께 pSJ001과 pSJpatatin01 벡터들을 각각 Sal I와 Pst I으로 절단한 후 연결하여 dhar cDNA가 삽입된 두 종류의 벡터 "CaMV35S::DHAR"와 "Patatin::DHAR"을 제조하였다 (도 1 참조).
dhar cDNA에 Sal I, Pst I의 인식부위를 도입하기 위한 프로모터
5'-프라이머 5'-GCGTCGACATGGCTGTGGAAGTATGCGTC-3' 서열번호: 5
3'-프라이머 5'-GGGCTGCAGTCATGCATTAACTTTGGGTG-3' 서열번호: 6
CaMV35S::DHAR 및 Patatin::DHAR 벡터와 아그로박테리움 튜메파시엔스 ASE를 혼합한 후 냉동 및 해동시키는 방법 (freeze & thaw method, Gynheung An. Methods in enzymology. 1987, Vol. 153, pp.292-305)으로 형질전환하였다.
실시예 2: CaMV35S::DHAR 및 Patatin::DHAR 벡터의 형질전환
감자의 형질전환은 시험관에서 증식된 감자 조직을 새로운 증식배지[MS (10.4g), Sucroase (30.0 g), GA3 (0.1mg)/L]에 옮겨 3주 배양한 후 수득한 줄기의 절편을 이용하여 Visser 등 (Visser et al. Plant. Mol. Biol. 1989, vol.12, pp.329-337)이 확립한 아그로박테리움을 이용하는 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 수행하였다. 먼저 아그로박테리움 튜메파시엔스 ASE (Agrobacterium tumefaciens ASE)를 클로람페니콜 (chloramphenicol, 25㎎/ℓ), 가나마이신 (kanamycin, 50㎎/ℓ), 스펙티노마이신 (spectinomycin, 50㎎/ℓ)이 함유된 3㎖의 YEP 배지를 이용하여 28℃에서 36 내지 48시간 동안 배양한 후 상기 배양물 250㎕를 새로운 25㎖ YEP 배지에 넣고, 동일한 온도에서 8 내지 10시간 동안 계대 배양하였다. 적정 농도 (OD=0.6-0.7)로 자란 아그로박테리움 튜메파시엔스 ASE의 배양액에 앞서 준비된 감자 조직을 침지시켜 15분간 감염시켰다. 이 때 형질전환 효율을 높이는 아세토시린곤도 함께 처리하였다.
감염된 감자 조직은 여과지 위에 치상하여 여분의 균을 제거한 후에 먼저 재분화 배지 [PRM: MS, NAA 0.01㎎/ℓ, Zeatin 2.0㎎/ℓ, GA3 0.1㎎/ℓ, carbenicillin 500㎎/ℓ, 0.5 - 1.0 ㎎/ℓphosphinothricin (PPT)]로 옮겨 2주 간격으로 새로운 배지로 계대 배양하는 방식으로 총 8주 동안 배양하면서 캘러스로부터 유기된 신초들을 선발한 후 발근을 유도하기 위하여 호르몬이 없는 뿌리 유기 배지 [PRRM: MS, carbenicillin 250㎎/ℓ]에서 2 내지 3주 동안 순화과정을 거치도록 하여 뿌리까지 완전하게 자란 식물체로 키웠다. 상기 식물체로부터 뿌리를 포함한 일부 줄기를 절단하여 제거한 후 남은 줄기조직 절편을 사용하여 다시 2.5 mg/ℓ의 PPT를 포함하는 뿌리 유기 배지에서 배양하여 PPT에 확실한 저항성을 가지며 성장하는 식물체를 확보하는 2단계 선발방법으로 형질전환체 선발효과를 높였다.
이들 식물체로부터 게놈 DNA를 분리한 후 여기에 bar 유전자 또는 dhar 유전자가 삽입되어 있는지 여부를 확인하기 위하여 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고 후술된 표 4에 정리된 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다.
bar 유전자 또는 dhar 유전자의 증폭을 위한 프라이머
고유번호 목표유전자 염기서열 서열번호
18F Bar F 5'-CTCGGTGACGGGCAGGAC-3' 7
19R BarR 5'-GCGGTCTGCACCATCGTC-3' 8
130F DHAR F 5'-GTATGCGTCAAGGCTGCTG-3' 9
131R DHAR R 5'-CGTGGGTCAAGTTTTCAGG-3' 10
형질전환 효율은 표 5에 요약한 바와 같이 최종적으로 2.5mg/ℓ농도의 PPT를 포함하는 배지에서 생존 가능하고 완전한 식물체로서 뿌리와 싹을 형성시키는 형질전환된 감자가 벡터별로 각각 6.38%와 14.28%의 효율로 나타났다.
형질전환 효율 분석 결과
벡터 종 형질전환된 감자 조직의 개수 0.5mg/l의 PPT를 함유한 배지에서 생존하는 식물체의 개수 2.5mg/l의 PPT를 함유한 배지에서 생존하는 식물체의 개수 효율
CaMV35S::DHAR 조원 595 275 38 6.38%
Patatin::DHAR 조원 245 197 38 14.28%
실시예 3 : 형질전환된 감자의 괴경 특이적 발현 분석
실시예 2에서 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자로부터 분리한 게놈 DNA를 사용하여 PCR 반응으로 1차 확인한 후 이들 중 참깨 모상근으로부터 분리된 dhar cDNA의 전사량이 높은 개체를 선발하여 향후 분석에 이용하고자 노던 블롯 하이브리디제이션을 실시하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이 38 개체의 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자 중 21 개체를 분석한 결과 143번을 제외한 나머지에서 모두 dhar cDNA가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 281번, 346번, 358번, 413번, 461번의 형질전환 감자들은 다른 형질전환 감자들 보다 높은 발현양을 보여 추후 삽입 유전자의 카피수, 효소의 활성 등을 비교 조사하기 위한 개체로 사용하였다.
한편, dhar cDNA의 전사량이 높은 것으로 확인된 Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자들과 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자들의 입과 괴경을 대상으로 dhar cDNA의 전사 여부를 확인하기 위하여 노던 블롯 하이브리디제이션을 실시하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자 (13개체)는 모두 잎에서는 전혀 dhar cDNA의 전사체가 검출되지 않았으며 괴경에서만 일정한 수준 이상의 전사체가 축적되었음을 확인하였으며, 이들 중 비교적 발현수준이 높은 5개체 (DP 1, 2, 8, 12, 14)를 향후 분석에 사용하였다. 반면에 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자의 경우 잎 뿐만 아니라 괴경에서도 전사체가 검출되었으나 잎이 괴경보다 적어도 10배 이상의 전사체를 축적시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 281번의 경우 잎에서는 다량의 전사체가 검출되었으나 괴경에서는 거의 전사체가 검출되지 않았다.
실시예 4 : 형질전환된 감자의 게놈 내에 삽입된 dhar cDNA의 카피수 분석
실시예 3에서 노던 블롯 하이브리디제이션을 통하여 확인된 각각의 형질전환된 감자와 대조구로서 형질전환되지 않은 감자의 신선한 잎으로부터 게놈 DNA를 추출하여 도입 유전자 (즉, 참깨 모상근에서 분리한 dhar cDNA 단편)의 내부에 존재하는 제한효소 (Hind Ⅲ)로 절단한 후에 [α-32P] dCTP로 표시된 전장의 dhar cDNA 단편을 프로브로 하여 유전자의 도입 여부 및 카피수를 확인하기 위한 서던 블롯 하이브리디제이션 분석을 수행하였다 (도 4 참조).
본 발명의 벡터를 Hind Ⅲ로 절단할 경우, dhar cDNA 단편의 일부와 Nos 터미네이터 앞부분까지의 단편 (약700bp)이 절단되고 (도 1 참조), 프로브는 참깨 모상근에서 분리한 전장의 Dhar cDNA를 사용하였기 때문에 도 4에서 나타낸 바와 같이 모든 형질전환 감자로부터 크기가 700bp인 단편이 나타난 것을 확인할 수 있었으며, 이보다 큰 단편들은 T-DNA의 right border(RB)쪽에서 연결된 상단부 dhar cDNA를 의미하며, 밴드의 수는 도입된 카피수에 해당한다.
따라서 52번, 164번, 228번, 444번 개체는 단일 카피가 삽입된 것으로 보이며, 나머지는 다수의 카피가 삽입된 것으로 확인되었다. 특히 281번 개체는 7 카피로서 가장 많은 카피가 도입된 것으로 확인되었다.
그리고, 유전자가 정확하게 삽입되었는지를 확인할 수 있는 700bp 단편, 즉 dhar cDNA의 단편의 466bp 뒷부분에 해당하는 부분과 Nos 터미네이터의 바로 앞부분까지의 크기에 해당하는 단편은 모든 형질전환 감자에서 검출되었으며, 카피수가 많을수록 700bp 밴드가 진하게 나타나 상기 결과를 보다 확실하게 증명하여 주었다.
실시예 5: 형질전환된 감자의 조직별 DHAR 단백질의 축적 패턴 분석
실시예 3에서 노던 블롯 하이브리디제이션 결과 dhar의 전사체 함량이 비교적 높은 것으로 확인된 개체들, 즉 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자인 281, 346, 358, 413, 461번 개체와 Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자인 DP1, DP2, DP8, DP12, DP14 개체 각각으로부터 잎과 괴경에서 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯 하이브리디제이션하여 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이 잎에서 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자의 경우에는 다량의 DHAR 단백질이 축척되었으나, Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자의 경우에는 DHAR 단백질이 전혀 축적되지 않는 결과를 얻어 실시예 3의 노던 블롯 하이브리디제이션 결과와 일치함을 알 수 있었다. 또한, 괴경에서도 상기 노던 블롯 하이브리디제이션 결과와 유사하게 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자는 잎에 비하여 낮은 수준의 DHAR 단백질이 축적되었으나, Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자는 괴경에서만 특이하게 축적되는 경향을 보였다.
실시예 6: 형질전환된 감자의 조직별 DHAR 효소의 활성 증가
DHA가 DHAR에 의해 아스코르브산으로 전환되는 원리를 이용하여 DHAR 효소의 활성을 측정하였다. 노던 블롯 하이브리디제이션과 웨스턴 블롯 하이브리디제이션을 통하여 그 발현양이 높은 수준으로 유지되는 것으로 확인된 개체들로서 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자 개체 281, 346, 358, 413, 461과 Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자 개체 DP1, DP2, DP8, DP12, DP14번으로 부터 잎과 괴경에서 단백질을 분리하여 그 효소 활성을 비교 분석하여 얻은 결과를 각각 도 6과 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 잎에서 DHAR 효소 활성(10-5mol/분/mg단백질)을 측정한 결과를 분석하여 보면, Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자는 형질전환되지 않은 야생형인 조원 품종과 비슷하거나 오히려 낮은 수준의 효소활성을 나타내어 (도 6) 이는 형질전환되지 않은 조원 감자 자체가 보유하고 있는 DHAR 효소의 활성수준이 검출된 것으로 판단되었다. 반면에 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자에서는 전반적으로 높은 수준의 효소 활성을 보였으며 특히, 346번은 형질전환되지 않은 조원에 비하여 4배 까지 증가한 것으로 확인되었다 (도 6).
한편 잎에서의 효소 활성은 단일 카피가 도입된 346번 개체가 다수 카피가 도입된 281번과 358번 개체 보다 높게 나타나 노던 및 웨스턴 블롯 하이브리디제이션 결과와는 대조적인 것으로 나타났다.
반면에 도 7에 나타낸 바와 같이 괴경에서의 효소 활성(10-5mol/분/mg단백질)은 dhar cDNA를 외부에서 도입하지 않은 야생형인 조원에서 잎과 비교하여 상대적으로 3.5배 이상 높은 수준으로 확인되었다. 한편 괴경에서는 Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자 뿐만 아니라 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자에서 1.1배 내지 1.6배 까지 효소활성이 증가한 것으로 확인되었다. 또한 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자 중에서 281번 개체의 경우 노던 블롯 하이브리디제이션 결과에서 이미 설명한 바와 같이 전사체의 축적 수준이 잎에서는 높게 조사되었으나 괴경에서는 야생형인 조원과 비슷한 수준으로 나타났으며 이러한 결과는 웨스턴 블롯 하이브리디제이션 결과 뿐만 아니라 효소 활성 수준 또한 동일한 경향을 나타내었다.
도 1은 본 발명에 따른 전신 발현용 프로모터인 CaMV35S 또는 괴경 특이적 프로모터인 파타틴 프로모터에 참깨의 모상근으로부터 분리한 dhar cDNA가 작동가능하게 연결된 백터 (이하, CaMV35S::DHAR 및 Patatin::DHAR 이라 함)를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자로부터 분리한 RNA에 대한 dhar 유전자의 전사량을 확인하기 위한 노던 블롯 하이브리디제이션의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 CaMV35S::DHAR 벡터 또는 Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자들의 잎과 괴경으로부터 각각 분리한 RNA에 대한 dhar 유전자의 전사량을 확인하기 위한 노던 블롯 하이브리디제이션의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 CaMV35S::DHAR 벡터로 형질전환된 감자로부터 분리한 게놈 DNA에 대한 삽입된 dhar 유전자의 카피수를 확인하기 위한 서던 블롯 하이브리디제이션의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 CaMV35S::DHAR 벡터 또는 Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자들의 잎 및 괴경으로부터 각각 분리한 단백질에 대한 DHAR 효소 단백질의 축적 양상을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 하이브리디제이션의 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 CaMV35S::DHAR 벡터 또는 Patatin::DHAR 벡터로 형질전환된 감자들의 잎에서의 DHAR 효소 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 CaMV35S::DHAR 벡터 또는 Patatin::DHAR 벡터로 형질 전환된 감자들의 괴경에서의 DHAR 효소 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
<110> Jinju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Potatoes Transformed with Dehydroascorbate Reductase Gene Derived from Sesame Hairy Root <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atgttgccat atagagtagt ttgtgatgg 29 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tttgcaaatg ttcaaagtgt ttttaaattt tgttggtgct tt 42 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggcgaattca aatcattgtt ttattttctc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggcgagctct ttgcaaatgt tgaaagtgtt 30 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcgtcgacat ggctgtggaa gtatgcgtc 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gggctgcagt catgcattaa ctttgggtg 29 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctcggtgacg ggcaggac 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcggtctgca ccatcgtc 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtatgcgtca aggctgctg 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgtgggtcaa gttttcagg 19

Claims (11)

  1. 참깨의 모상근 유래의 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자가 전신발현용 유전자의 프로모터 조절 하에 있어 야생형 감자와 비교하였을 때 감자의 잎에서 보다 증가된 양의 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 감자.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 전신발현용 유전자의 프로모터는 CaMV35S 프로모터인 것을 특징으로 하는 감자.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자가 괴경 특이적 발현용 유전자의 프로모터 조절 하에 있어 야생형 감자와 비교하였을 때 감자의 괴경에서 보다 증가된 양의 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 감자.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 괴경 특이적 발현용 유전자의 프로모터는 감자의 파타틴 (patatin) 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 감자.
  6. (1) 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 포함한 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 벡터로 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시키는 단계; (3) 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감자 조직을 형질전환시키는 단계; (4) 상기 형질전환된 감자 조직을 배양하여 참깨의 모상근으로부터 분리된 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자로 형질전환된 감자를 분리하는 단계를 포함한 형질전환된 감자의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 벡터는 전신 발현용 유전자의 프로모터 또는 괴경 특이적 발현용 유전자의 프로모터를 포함하고, 이들 프로모터가 디하이드로아스코르베이트 리덕타제 유전자를 조절하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 전신발현용 유전자의 프로모터는 CaMV35S 프로모터인 것을 특징으로 하 는 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    벡터는 CAMV35S::DHAR인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 괴경 특이적 발현용 유전자의 프로모터는 감자의 파타틴 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    벡터는 Patitin::DHAR인 것을 특징으로 하는 제조방법.
KR1020070086341A 2007-08-28 2007-08-28 참깨의 모상근 유래 디하이드로아스코르베이트 리덕타제유전자로 형질전환된 감자 KR20090021655A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070086341A KR20090021655A (ko) 2007-08-28 2007-08-28 참깨의 모상근 유래 디하이드로아스코르베이트 리덕타제유전자로 형질전환된 감자

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070086341A KR20090021655A (ko) 2007-08-28 2007-08-28 참깨의 모상근 유래 디하이드로아스코르베이트 리덕타제유전자로 형질전환된 감자

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20090021655A true KR20090021655A (ko) 2009-03-04

Family

ID=40691665

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070086341A KR20090021655A (ko) 2007-08-28 2007-08-28 참깨의 모상근 유래 디하이드로아스코르베이트 리덕타제유전자로 형질전환된 감자

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20090021655A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013027905A1 (ko) * 2011-08-25 2013-02-28 경북대학교 산학협력단 식물 유래의 ｄｈａｒ 또는 ｍｄｈａｒ 유전자의 수확량 및 환경 스트레스 조절자로서의 용도

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013027905A1 (ko) * 2011-08-25 2013-02-28 경북대학교 산학협력단 식물 유래의 ｄｈａｒ 또는 ｍｄｈａｒ 유전자의 수확량 및 환경 스트레스 조절자로서의 용도

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU682495B2 (en) Mannose or xylose based positive selection
US20200120890A1 (en) Method of enhancing the seed yield and promoting the growth of plants
JP2013511262A (ja) 植物における斑入り
JPH04341126A (ja) 植物細胞内の代謝の変更
US9115338B2 (en) Enhancement of beta-carotene content in plants
US7176351B2 (en) Potatoes having an increased yield of starch per plant body and method for producing the same
KR101209345B1 (ko) 변형된 카로테노이드 수준을 갖는 형질전환 파인애플 식물및 그 생산 방법
JPH10510140A (ja) Ｄｎａ、構築物、細胞およびそれから誘導された植物
CA2218361A1 (en) Soluble solids modification using sucrose phosphate synthase encoding sequences
Chung et al. Modest calcium increase in tomatoes expressing a variant of Arabidopsis cation/H+ antiporter
CN107190015A (zh) 玉米糖基转移酶基因ufgt2在提高植物体内黄酮含量中的应用
EP2314702B1 (en) Plant having resistance to low-temperature stress and method of production thereof
Dong et al. Fructan reduction by downregulation of 1-SST in guayule
KR20090021655A (ko) 참깨의 모상근 유래 디하이드로아스코르베이트 리덕타제유전자로 형질전환된 감자
CN103917087B (zh) 大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法以及由此制备的植物体
JP4189636B2 (ja) アミノ酸含量の増大した植物、窒素含量が増大した植物、窒素制限下での成育抑制が解除された植物、およびそれらの作製法
WO2013148201A1 (en) Increased tuber set in potato
CN108034666B (zh) 沙棘gpd1基因
JPH10507920A (ja) 植物の花の咲き方を改変する方法
CN111154772A (zh) 梨糖转运基因PbSWEET4及其应用
KR101166715B1 (ko) 토코트리에놀 생합성 과정에 관여하는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체
CN116286952B (zh) 大豆GmSAMMT基因在调控植物蛋白含量和/或产量中的应用
KR101677482B1 (ko) 벼 유래의 고친화성 인산운반체 OsPT4 유전자가 과발현된 항생제 마커프리 형질전환 벼
CN114480487B (zh) 水稻转录因子OsMADS61及其应用
KR100781776B1 (ko) 딸기 유래 ＡＤＰ―ＧｌｕｃｏｓｅＰｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ 유전자의 안티센스ＤＮＡ 및 이를 함유하는 과실의 당도 조절용 벡터

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application