WO2013027905A1 - 식물 유래의 ｄｈａｒ 또는 ｍｄｈａｒ 유전자의 수확량 및 환경 스트레스 조절자로서의 용도 - Google Patents

식물 유래의 ｄｈａｒ 또는 ｍｄｈａｒ 유전자의 수확량 및 환경 스트레스 조절자로서의 용도 Download PDF

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mdhar
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윤호성
김일섭
김영생
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Definitions

  • the present invention relates to the use as dhar gene or cabbage-derived rice derived mdhar yields and environmental stress regulation of gene chair, and more particularly, rice (Oryza sativa) derived dhar (dehydroascorbate reductase) gene or Chinese cabbage (Brassica rapa) derived mdhar monodehydroascorbate reductase gene to increase the yield of plants, rice-derived dhar genes or cabbage-derived mdhar genes for increased yields plants and their seeds, rice-derived dhar gene or cabbage-derived mdhar method of increasing the environmental stress resistance of plants using the yields increased composition of the plant containing the gene, rice-derived dhar gene or cabbage-derived mdhar gene, rice-derived dhar gene or a ring with a cabbage-derived gene mdhar For environmental stress resistance increase of the plant including the stress tolerance manufacturing method of the increased transgenic plant, transformed with the environmental stress resistance produced by the above method increases conversion plant and their seeds and rice-derived
  • Rice gene sequencing was carried out with the Rice Genome Program established in Japan (International Rice Genome Sequencing Projects 2005). As sequencing and annotations are now over, competition for gene function is fierce. However, since rice is grown in the East, the center of rice research is taking place in the East. Particularly in Japan, systematic studies at the national level have been organized to analyze gene function through the construction of a full-length cDNA library and genome wide full length cDNA ectopic expression. Competitive laboratories are conducting rice research in the US, Europe and Australia. This is because rice is used as a model system to study major traits such as disease and then apply it to wheat or corn. China lags behind Japan, but in terms of size, China is beginning a major research into rice gene function.
  • Korean Patent Publication No. 2009-0119884 discloses 'plants having improved yield-related traits and methods for producing the same', and Korean Patent Application Publication No. 2009-0027219 has a yield-related trait improved by regulating expression of NAC transcription factors. Plants and methods for their preparation.
  • the present invention is derived from the above-mentioned demands, and the present inventors have confirmed that the yield of the transformed rice plants in which the rice-derived dhar gene or the cabbage-derived mdhar gene was introduced was increased, and the resistance to environmental stress was increased.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides a method of increasing the yield of the plant by using the dehydroascorbate reductase ( dhar ) gene derived from rice ( Oryza sativa ) or the mdhar (monodehydroascorbate reductase) gene derived from Brassica rapa .
  • dhar dehydroascorbate reductase
  • mdhar monodehydroascorbate reductase
  • the present invention also provides a method for producing a transgenic plant having an increased yield using a rice-derived dhar gene or a cabbage-derived mdhar gene.
  • the present invention also provides a transgenic plant with increased yield produced by the above method and its seeds.
  • the present invention also provides a composition for increasing yield of a plant comprising a rice-derived dhar gene or a cabbage-derived mdhar gene.
  • the present invention also provides a method of increasing the environmental stress resistance of plants using a rice-derived dhar gene or a cabbage-derived mdhar gene.
  • the present invention also provides a method for producing a transgenic plant having increased environmental stress resistance using a rice derived dhar gene or a cabbage derived mdhar gene.
  • the present invention also provides a transgenic plant and its seed having increased environmental stress resistance produced by the above method.
  • the present invention also provides a composition for enhancing environmental stress resistance of a plant comprising a rice-derived dhar gene or a cabbage-derived mdhar gene.
  • the rice plants transformed from the rice-derived dhar gene or the cabbage-derived mdhar gene developed through the present invention are characterized by increased environmental stress tolerance, and the yield is increased, so that the yield can be increased even under conditions in which the rice crop is unfavorable. It can be very useful.
  • T 2 transgenic rice plants pHY105, Ubi :: OsDHAR; pHY102, SWPA2 :: BrMdhar.
  • Figure 2 shows RT-PCR analysis of transgenic rice plants overexpressed OsDHAR gene or Brmdhar .
  • Figure 5 shows the enzyme activity analysis of transformed rice plants.
  • Fig. 8 shows the number of cereals directly related to the yield of the transformed rice plant.
  • Figure 12 shows the growth rate of the transgenic plant from the seeding in June 2010 until the harvest season.
  • Figure 13 shows the transformed rice plant antioxidant activity and lipid oxidation analysis.
  • FIG. 14 shows organ characterization of T 3 and T 4 transgenic rice plants (TPW, total plants weight; CW, culm weight; RW, root weight; NP, number of panicles per hill; NSP, number of spikelets per panicle ; FR, filling rate; TGW, total grain weight; 1000 GW, 1000 grain weight).
  • TPW total plants weight
  • CW culm weight
  • RW root weight
  • NP number of panicles per hill
  • NSP number of spikelets per panicle
  • FR filling rate
  • TGW total grain weight
  • 1000 GW 1000 grain weight
  • Figure 16 shows the molecular biological function analysis of T-DNA insertion mutant rice plants (A: semi RT-PCR analysis of T-DNA insertion mutant rice plants # 1-4 ( OsMdhar ) and # 6-3 ( OsDhar ) Confirmation of expression of antioxidant genes through B, Enzyme activity analysis of T-DNA insertion mutant rice plant # 1-4 ( OsMdhar ).
  • Figure 17 shows the morphology analysis in T-DNA insert mutant rice plant experimental packaging (A: effective number of inserted mutant rice plants after sowing).
  • Figure 18 shows the growth rate of T-DNA insertion mutant rice plants from May 2010 sowing to harvesting.
  • Figure 19 shows the organ-specific characterization of experimental plants of T-DNA insert mutant rice plants (TPW, total plants weight; CW, culm weight; RW, root weight; NP, number of panicles per hill; NSP, number of spikelets per panicle; FR, filling rate; TGW, total grain weight; 1000 GW, 1000 grain weight).
  • TPW total plants weight
  • CW culm weight
  • RW root weight
  • NP number of panicles per hill
  • NSP number of spikelets per panicle
  • FR filling rate
  • TGW total grain weight
  • 1000 GW 1000 grain weight
  • the present invention is a dhar ( dehydroascorbate reductase ) gene derived from rice ( Oryza sativa ) or a recombinant vector comprising a mdhar ( monodehydroascorbate reductase ) gene derived from Chinese cabbage ( Brasica rapa ) transformed to plant cells dhar It provides a method for increasing the yield of a plant comprising overexpressing a gene or mdhar gene.
  • the dhar gene or mdhar gene may be present in a multigene family, respectively, and preferably, each of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • variants of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention.
  • the gene has at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% sequence homology with the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • Branches can include base sequences.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • the increase in yield of the plant may be, but is not limited to, an increase in the number of plants.
  • recombinant refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in their natural form in either the sense or antisense form.
  • Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes are modified and reintroduced into cells by artificial means.
  • the dhar gene or mdhar gene sequence can be inserted into a recombinant expression vector.
  • recombinant expression vector means a bacterial plasmid, phage, yeast plasmid, plant cell virus, mammalian cell virus, or other vector. In principle, any plasmid and vector can be used as long as it can replicate and stabilize in the host.
  • An important feature of the expression vector is that it has an origin of replication, a promoter, a marker gene and a translation control element.
  • Expression vectors comprising dhar gene or mdhar gene sequences and appropriate transcriptional / translational control signals can be constructed by methods well known to those skilled in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA techniques, DNA synthesis techniques, in vivo recombinant techniques, and the like. The DNA sequence can be effectively linked to a suitable promoter in the expression vector to drive mRNA synthesis. Expression vectors may also include ribosomal binding sites and transcription terminators as translation initiation sites.
  • Preferred examples of recombinant vectors of the invention are Ti-plasmid vectors capable of transferring part of themselves, the so-called T-region, to plant cells when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens.
  • Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0 116 718 B1) is currently used to transfer hybrid DNA sequences to protoplasts from which plant cells or new plants can be produced that properly insert hybrid DNA into the plant's genome. have.
  • a particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is the so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838.
  • viral vectors such as those that can be derived from double stranded plant viruses (eg CaMV) and single stranded viruses, gemini viruses, etc.
  • CaMV double stranded plant viruses
  • gemini viruses single stranded viruses
  • it may be selected from an incomplete plant viral vector.
  • the use of such vectors can be advantageous especially when it is difficult to properly transform a plant host.
  • the expression vector will preferably comprise one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by a chemical method, which corresponds to all genes capable of distinguishing transformed cells from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol. Resistance gene, aadA gene, and the like, but are not limited thereto.
  • the promoter may be, but is not limited to, CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS, histone promoter, SWPA2 promoter, Clp promoter.
  • the term "promoter” refers to a region of DNA upstream from a structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription.
  • a "plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in plant cells.
  • a “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constitutive promoters may be preferred in the present invention because selection of the transformants may be made by various tissues at various stages. Thus, the constitutive promoter does not limit the possibility of selection.
  • terminators can be used, for example nopalin synthase (NOS), rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens) Terminator of the octopine gene, and the rrnB1 / B2 terminator of E. coli, but are not limited thereto.
  • NOS nopalin synthase
  • rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator phaseoline terminator
  • Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
  • Terminator of the octopine gene and the rrnB1 / B2 terminator of E. coli, but are not limited thereto.
  • terminators With regard to the need for terminators, such regions are generally known to increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of terminators is highly desirable in the context of the present invention.
  • the host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a prokaryotic cell while being stable can be used in any host cell known in the art, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1. , Bacillus genus strains, such as E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia marcensons, and various Pseudomonas Enterobacteria such as species and strains.
  • E. coli JM109 E. coli BL21
  • Bacillus genus strains such as E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium,
  • yeast Saccharomyce cerevisiae
  • insect cells human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293) as host cells.
  • human cells e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293) as host cells.
  • HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines and plant cells and the like can be used.
  • the host cell is preferably a plant cell.
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by using the CaCl 2 method or one method (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) when the host cell is a prokaryotic cell. And the electroporation method.
  • the vector may be injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, gene bombardment, or the like. Can be.
  • the present invention is a rice ( Oryza sativa Origin dhar ( dehydroascorbate reductase) gene or cabbage ( Brassica rapa Origin mdhar ( monodehydroascorbate reductase).
  • the present invention provides a method for producing a plant having an increased yield, the method comprising transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene) and regenerating the plant from the transformed plant cell.
  • the dhar Gene or mdhar The gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the yield increase may be an increase in the number of grains of the plant, but is not limited thereto.
  • the method of the present invention comprises transforming plant cells with a recombinant vector according to the present invention, which transformation can be mediated by, for example, Agrobacterium tumefiaciens .
  • the method also includes the step of regenerating the transgenic plant from said transformed plant cell.
  • the method for regenerating the transformed plant from the transformed plant cell may use any method known in the art.
  • Transformed plant cells should be re-differentiated into whole plants. Techniques for regeneration of mature plants from callus or protoplast cultures are well known in the art for many different species (Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1-5, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
  • the present invention also provides a transgenic plant with increased yield produced by the above method and its seeds.
  • the plant may be a monocotyledonous plant, but is not limited thereto.
  • the monocotyledonous plants are Alismataceae, Hydrocharitaceae, Juncaginaceae, Schuchzeriaceae, Potamogetonaceae, Najadaceae, Zosteraceae, Liaceae Liliaceae, Haemodoraceae, Agavaceae, Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Pontederiaceae, Iridaceae, Burmanniaceae, Jupaceae, Jucaceae (Commelinaceae), Eriocaulaceae, Flower Family (Grapeaceae, Gramineae, Poaceae), Araceae, Lemnaceae, Black Spareaceae (Sparganiaceae), Typhaceae, Cycloaceae, Cyperaceae It may
  • the present invention also provides a composition for increasing yield of a plant, comprising a rice ( Oryza sativa ) -derived dhar ( dehydroascorbate reductase) gene or a Chinese cabbage ( Brasica rapa ) -derived mdhar ( monodehydroascorbate reductase ) gene.
  • the dhar gene or mdhar gene may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the composition includes a rice-derived dhar gene or a cabbage-derived mdhar gene as an active ingredient, which is capable of increasing the yield of the plant by transforming the gene into the plant.
  • the present invention transforms a recombinant vector comprising a rice ( Oryza sativa ) -derived dhar ( dehydroascorbate reductase) gene or a Chinese cabbage ( Brasica rapa ) -derived mdhar ( monodehydroascorbate reductase ) gene to overexpress the dhar gene or mdhar gene.
  • a rice Oryza sativa
  • dhar dehydroascorbate reductase
  • Chinese cabbage Brasica rapa
  • mdhar monodehydroascorbate reductase
  • the dhar gene or mdhar gene may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the environmental stress may be, but is not limited to, salt, low temperature or oxidative stress.
  • the present invention is a step of transforming plant cells with a recombinant vector comprising a rice ( Oryza sativa ) -derived dhar ( dehydroascorbate reductase) gene or Chinese cabbage ( Brasica rapa ) -derived mdhar ( monodehydroascorbate reductase ) gene and the transformed plant cells
  • a recombinant vector comprising a rice ( Oryza sativa ) -derived dhar ( dehydroascorbate reductase) gene or Chinese cabbage ( Brasica rapa ) -derived mdhar ( monodehydroascorbate reductase ) gene and the transformed plant cells
  • the dhar gene or mdhar gene may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the environmental stress may be salt, low temperature or oxidative stress, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a transgenic plant and its seed having increased environmental stress resistance produced by the above method.
  • the plant may be a monocotyledonous plant, but is not limited thereto.
  • the present invention is a rice ( Oryza sativa Origin dhar ( dehydroascorbate reductase) gene or cabbage ( Brassica rapa Origin mdhar ( monodehydroascorbate reductase Provides a composition for enhancing environmental stress resistance of plants, including the gene.
  • the dhar Gene or mdhar The gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the composition is derived from rice as an active ingredient dhar Gene or Cabbage Origin mdhar Genes are included, and each of the genes can be transformed into a plant to enhance the plant's resistance to environmental stress.
  • Total length cDNA (AY074786 / Os05g0116100) encoding dehydroascorbate reductase ( DHAR ) was obtained from the total RNA of Oryza sativa cv. Ilmi by RT-PCR method and was called OsDHAR1.
  • OsDHAR1 Cloning between the corn ubiquitin promoter and nos terminator of pGA1611. POsDHAR1 was prepared by cloning a 3.6.kb fragment containing the ubiquitin promoter :: OsDHAR1 :: nos terminator into pCAMBIA3300.
  • the pOsDHAR1 binary vector was transduced into Agrobacterium strain LBA4404.
  • Ilmi strain of Oryza sativa L. japonica was used as a host for overexpression of pOsDHAR1.
  • the T-DNA insertion mutant (3A-03259) knocked out of any dehydroascorbate reductase gene (OsDHAR2, Os06g0232600) is a homologous variant.
  • 3A-03259 can be found on the RiceGE website (http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE).
  • transgenic rice plants were grown from June to October with nontransgenic rice plants in the GMO field of Kyungpook National University (Daegu, Korea).
  • T 3 generation rice plants were used to investigate resistance to abiotic stresses such as salt, low temperature, H 2 O 2 and PEG (polyethylene glycol).
  • Ubiquitin promoter Rice plants transformed with OsDHAR1 were PCR by Ubi-F (5'-tgccttcatacgctatttatttgcttg-3 ': SEQ ID NO: 3) and OsDHAR-R2 (5'-ccttgctcttcaagaacgttgtgaagc-3': SEQ ID NO: 4) primers Confirmed.
  • 3A-03259 was identified by gene specific primers RP (5'-ccgttaataaatggaccctgc-3 ': SEQ ID NO: 5) and LP (5'-aagcgcaattttacagctgag-3': SEQ ID NO: 6).
  • CDNA encoding cabbage cytoplasmic MDHAR (NCBI Accession No. AY039786) was obtained by RT-PCR from total RNA of Brassica rapa var. Pekinensis .
  • TOPO-TA vector (Invitrogen) in the insert was confirmed by sequencing, comprising the bar gene to produce the construct containing the BrMDHAR gene, SWPA2 a BrMDHAR gene cut with NcoI and KpnI promoters, nos terminator, and selection marker is PCAMBIA3300 was inserted in the corresponding position of the plant insertion vector.
  • This construct (pCAMBIA3300 :: BrMDHAR ) was transduced into Agrobacterium strain LBA4404 by electroporation.
  • This construct (pGA1611 :: BrMDHAR ) was inserted into the pCAMBIA3300 plant insertion vector containing the nos terminator and selection marker bar gene using BamH I and Sac II by blunt end ligation to construct the construct (Ubi :: BrMDHAR ).
  • T 0 transgenic rice plants Fifty independent T 0 transgenic rice plants (TP) expressing BrMDHAR were grown to maturity. T 1 seed was harvested, and T 1 progeny from 5 independent T 0 rice plants were SWPA2-F (5'-caatcaagcattctacttctattgcagc-3 ': SEQ ID NO: 7) and BrMDHAR-R (5'-caatctcagaacagtagagccagttgc-3': SEQ ID NO: 8) A separation pattern analysis was performed using primers. About 1000 T 2 seeds harvested from T 1 rice plants were germinated in kanamycin containing rooting medium.
  • T 2 seeds derived from T 1 rice plants in rooting medium containing kanamycin was performed repeatedly until all T 2 seeds harvested from germinated T 1 plants were analyzed.
  • PCR analysis, western blot and enzyme activity analysis were performed.
  • pHY101 transgenic homoline 2 objects pHY102 transgenic homoline 1 Object and pHY104 transgenic homoline 2 after seeding the T 2 seeds of object stress the plants grown for three weeks Conditions ( Salt, low temperature, oxidation) RNA expression, enzyme activity and microanalysis were performed.
  • RNAs of pHY101, pHY102, pHY104 and rice were extracted using RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, USA).
  • Genotypes were analyzed to determine the isolation rates of two pHY103 transformant homoline, seven pHY105 transformant homoline, and seven pHY106 transformant homoline seeded in greenhouse in February 2009.
  • PCR conditions were 95 ° C., 5 min; 94 ° C., 1 min; 57 ° C., 1 min; 72 ° C., 1 min (35 cycles); It carried out at 72 degreeC and 7 min.
  • pHY101 transformants pHY102 transformants and pHY104 transformants were seeded in greenhouses to investigate stress (salt and cold) resistance.
  • the phenotype of the transformed rice plants sown in the greenhouse was observed. Phenotypic observation after 100 mM salt stress treatment and 10 ° C. low temperature treatment after seeding in a greenhouse was analyzed in comparison with ilmibap which is a control group according to the salt cold stress treatment period.
  • RNA, protein expression, and enzyme activity were analyzed in the salt and cold-resistant pHY101 transformants, pHY102 transformants, and pHY104 transformants sown in greenhouses and military experimental packaging in February and June 2009.
  • Protein extraction was performed using an extraction buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 1 mM MgCl 2 , 1 mM PMSF, protease inhibitor cocktails.
  • the T-DNA insertion mutant was developed in a greenhouse, and then genomic DNA of seedlings grown for about two weeks at about 30 ° C. was separated and genotyping was performed to confirm the separation ratio of the development line using PCR.
  • Genomic DNA isolation was performed with homogenization buffer (0.1 M NaCl, 0.2 M sucrose, 0.01 M EDTA, 0.03 M Tris-HCl, pH 8.0) and lysis buffer (0.25 M EDTA, 2.5% (w / v) SDS, 0.5 M Tris- HCl, pH 9.2) was used to mix grind buffer 4: 1, and 0.2 g of plant tissue was frozen in liquid nitrogen and ground in a 1.5 ml tube. Thereafter, 400 ⁇ l grind buffer was added and the mixture was placed at 70 ° C.
  • PCR conditions were 93 ° C., 3 min; 93 ° C., 1 min; 54 ° C., 1 min; 72 ° C., 1 min (35 cycles); It carried out at 72 degreeC and 7 min.
  • RNA expression and enzymatic activity analysis of two OsMdhar knockdowns and four OsDhar knockouts sown in greenhouses and experimental packaging in February and June 2008 were performed.
  • the seedlings grown for about 3 weeks at around 30 ° C were treated with salt and cold stress, and after about 6 days, samples were taken to isolate proteins and to express protein and enzyme activity. It was confirmed.
  • 0.2 g plant tissue was ground using a mortar and pestle. The ground tissue was divided into E-tubes using a baked spatula or all at once in a 15 ml conical tube. Protein extraction in plants was extracted by adding homogenization buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF, protease inhibitor cocktails). Vortex was performed after addition of the homogenization buffer.
  • homogenization buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF, protease inhibitor cocktails. Vortex was performed after addition of the homogenization buffer.
  • RNA, protein expression and enzyme activity assays were performed in OsMdhar knockdown and OsDhar knockout individuals sown in greenhouses in February and June 2009.
  • PCR was used to identify the inserted genes of plants by extracting the DNA of pHY101, pHY102, pHY104, and pHY105 individuals that seeded T 1 transgenic rice plants overexpressed in February 2008 in MDHAR and DHAR genes. Attempted genotyping. Experimental results showed that there is a correlation with the insertion gene and the individuals having salt stress resistance (Fig. 1). As a result of genotyping by extracting DNA from individuals of pHY105 and pHY102, genes inserted in all individuals of the pHY105 strain and the pHY102 strain except for the control (one rice) were identified.
  • RNAs of pHY101, pHY102, pHY104, and pHY105 individuals sown in greenhouses in February 2008 were extracted and semi-quantitative RT-PCR expression analysis was performed to determine whether transgenic rice plants had increased transgene expression. .
  • transgenic rice plants with oxidative stress resistance were analyzed to have high expression level of transgene RNA. It was confirmed that the RNA expression level of the transgene was low in the transgenic plants grown in the salt stress-free state, and the RNA expression level gradually increased with the salt stress treatment period.
  • the experimental results showed that the transgenic rice plants were resistant to salt stress (FIG. 2).
  • the expression of antioxidant genes was higher in the transgenic rice plants than in WT (Ilmi).
  • the phenotype of the transformed rice plants sown in the greenhouse and the group was observed. Phenotypic observation after salt stress treatment after seeding in greenhouse was confirmed that transformed rice plants were more resistant to stress than ilmi rice compared to ilmi rice, which is a control group, according to the salt stress treatment period.
  • the salt stress treatment period was treated 15 days after seeding, and treated with 100 mM for about 40 days after salt stress treatment (FIG. 3).
  • Transformed rice plants pHY105, pHY106 and pHY102 show higher salt stress resistance than WT. 100 mM salt stress was treated for about 40 days and then regenerated for 10 days.
  • the control group (ilmi rice), # 53-1 (pHY101), # 53-5 (pHY101), # 58-2 (pHY102), # 64-4 (pHY104) and # 65-2 (pHY104) were the initial growth and late stage
  • the transformed rice plants showed faster growth than the control group Ilmi rice (Fig. 4A), and the transgenic rice plants were about 10-20 days earlier than the control group Ilmi rice (Fig. 4B).
  • 4C shows that the number of dialects of transformants was higher than that of the control group as a result of examining the number of dialets directly related to the productivity of the transformants (Red, control; Green, transformants).
  • the phenotype of the transformed rice plants sown in the greenhouse was observed. Phenotypic observation after cold stress treatment after seeding in greenhouse was confirmed that transgenic rice plants were more resistant to cold stress than ilmi rice compared to ilmi rice, which is a control group, according to the cold stress treatment period. Cold stress treatment period was treated after about 30 days after sowing seeds, was treated at 10 °C for about 50 days after cold stress treatment (Fig. 6).
  • the 10 ° C. cold stress was treated for about 50 days and then regenerated for 10 days.
  • the transformed rice plants pHY105, pHY106 and pHY102 showed higher cold stress resistance than WT (Ilmi rice).
  • the phenotype of the transgenic plants sown in the greenhouse was observed. Phenotypic observation after cold stress treatment after seeding in the greenhouse was confirmed that the transgenic rice plants showed a higher resistance to cold stress than ilmi rice and grown in length according to the cold stress treatment period. Cold stress treatment period was treated after about 10 days after sowing seeds, was treated at 10 °C for about 2 weeks after cold stress treatment (Fig. 10). Phenotypes were observed under normal conditions 10 days after sowing of control varieties ilmibap and # 58-2 (pHY102), and after treatment with cold stress at 10 ° C. for about 2 weeks, the phenotypes are the same as in FIGS. 10A and 10B. The control varieties ilmibap and # 58-2 (pHY102), and # 65-2 (pHY104) measured the growth length at 10 °C, the transgenic rice plants were longer than the control variety (Fig. 10C).
  • the phenotype of the transformed rice plants sown in the greenhouse was observed. Phenotypic observation after salt stress treatment after seeding in greenhouse was confirmed that transgenic rice plants were more resistant to salt stress than ilmi rice compared to ilmi rice, which is a control group, according to the salt stress treatment period.
  • the salt stress treatment period was treated about 30 days after seeding, and about 40 days after salt stress treatment.
  • the recovery period was then treated for about 14 days (FIG. 11). Regeneration for 14 days after treatment of 100 mM salt stress for about 40 days showed that the transformed rice plants pHY105 and pHY106 showed higher salt stress resistance than WT.
  • the transgenic rice plants After planting in the greenhouse, after salt stress treatment, the leaves were harvested, and proteins were extracted, and antioxidant activity and lipid oxidation were analyzed. As a result of analyzing the antioxidant activity, it was confirmed that the transgenic rice plants expressed higher antioxidant activity-related proteins than ilmi rice, which is a control group, according to the salt stress treatment period. As a result of analyzing the amount of lipid oxidation by analyzing the content of malondialdehyde used as an indicator of lipid oxide, it was confirmed that the transgenic rice plants had lower lipid oxidation than ilmi rice, which is a control group, according to the salt stress treatment period.
  • transgenic rice plants showed higher antioxidant activity and lower lipid oxidation than ilmi rice, which is a control group, under stress.
  • the transformed rice plants had higher resistance to salt stress than ilmi rice, which was the control group (FIG. 13).
  • Salt stress was collected for 12 days after growth at 100 mM, and the samples were collected, and the antioxidant activity and lipid oxidation analysis of the control group (ilmi rice), pHY105, pHY102 and pHY104 were higher in salt stress than that of ilmi rice in which the transformed rice plants were the control group. And low lipid oxidation.
  • T 3 and T 4 after transfection seeded Transgenic Rice Plant in Gunwi institution characterization was deployed to Kyungpook National University transgenic plant experiments packaging located in North Gyeongsang Gunwi County hyoryeongmyeon in June 2010, in October 2010, 10 days T 3 and T
  • the T 3 transgenic rice plants were found to be superior to those of the control group (ilmi rice) (FIG. 14).
  • the control group (ilmi rice), pHY101, pHY102, pHY103, pHY104, pHY105 and pHY106 were classified by each organ to investigate the properties. Institutional characterization of the rice plants grown in the experimental field showed that the transformed rice plants had higher growth and yield than ilmi rice.
  • T-DNA inserted mutant rice plants After planting T-DNA inserted mutant rice plants in the army, the characteristics of each organ was developed in June 2010 at the experimental packaging plant of Kyungpook National University Transplanted Plant located in Hyoryong-myeon, Gunbuk-gun, Gyeongbuk, Korea. As a result of dividing the plants by each organ and examining the characteristics, it was confirmed that the T-DNA insertion mutant rice plants had poorer characteristics by organ than the control (dongjin rice) (FIG. 19). The characteristics of WT ( Dongjin rice), # 1-4 ( OsMdhar ), # 6-3 ( OsDha r), and # 6-11 ( OsDha r) were classified by each institution. DNA insertion mutant rice plants were found to be very poor in their chronological characteristics.

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Abstract

본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 이용하여 식물의 수확량 또는 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법, 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자를 이용한 수확량 또는 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 수확량 또는 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자를 포함하는 식물체의 수확량 또는 환경 스트레스 내성 증가용 조성물에 관한 것이다.

Description

식물 유래의 ｄｈａｒ 또는 ｍｄｈａｒ 유전자의 수확량 및 환경 스트레스 조절자로서의 용도
본 발명은 벼 유래의 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자의 수확량 및 환경 스트레스 조절자로서의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 이용하여 식물의 수확량을 증가시키는 방법, 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 이용한 수확량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 수확량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 포함하는 식물체의 수확량 증가용 조성물, 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 이용하여 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법, 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.
소득의 증대와 문화 수준의 향상으로 우리는 보다 건강하고 풍요로운 삶을 영유하고 있다. 이러한 시대적 변화에 호응하여 다양한 소비자 기호에 맞는 식량의 생산이 필요하다. 특히 맛과 질 그리고 영양가 등이 높은 고품질의 품종 생산으로 농가와 소비자 모두를 만족시켜야 한다. 최근 벼의 유전체 서열이 판독됨으로써 수많은 벼 유전자 기능을 분석할 수 있는 근간이 성립되었다. 이를 이용하여 유용 유전자를 분리하고 새 시대가 원하는 우수 벼 품종을 생산하는 기술의 개발이 필요하다.
다행이 최근 벼 유전체 서열의 해독으로 대부분의 유전자가 정체를 드러냈고, 이들 유전자의 기능을 보다 손쉽게 분석할 수 있는 자원인 삽입 변이체 집단이 구축되었다. 따라서 이러한 자원을 효과적으로 활용하여 유용 유전자 기능을 분석하고 이를 활용하여 우수 벼 품종을 생산하는 기술을 확보할 필요가 크다.
벼 유전자 서열 분석은 일본을 중심으로 Rice Genome Program이 형성되어 진행되었다 (International Rice Genome Sequencing Projects 2005). 이제 서열 분석 및 annotation이 종료됨에 따라 유전자 기능분석에 대한 경쟁이 치열하다. 그런데 벼는 주로 동양에서 키우는 관계로 벼 연구의 중심은 동양에서 일어나고 있다. 특히 일본에서는 국가차원에서의 체계적인 연구가 조직적으로 이루어져 총 길이 cDNA 라이브러리 제작 및 genome wide full length cDNA ectopic 발현 등을 통해 유전자 기능을 분석하고자 하고 있다. 미국과 유럽 호주에서도 경쟁력이 높은 연구실들이 벼 연구를 진행하고 있다. 이는 벼를 모델 시스템으로 하여 질병 등 주요 형질을 연구한 후 이를 밀이나 옥수수 등에 적용하고자 하기 때문이다. 중국은 일본보다는 뒤져 있으나 규모 면에서는 오히려 우위를 점하며 벼 유전자 기능 연구를 대대적으로 시작하고 있다.
국내에서는 일찍이 벼 유전자 기능 연구가 시작되어 이를 위한 삽입 변이체 집단을 T-DNA 및 Ac/Ds 시스템을 활용하여 생산해 놓았다. 현재까지 개발된 개발한 T-DNA 삽입체는 현재 10만이 넘으며 경상대/농진청에서 구축하고 있는 Ds 삽입체도 5만이 넘어 이들을 합치게 되면 벼 대부분의 유전자에 삽입변이체를 구축한 셈이다 (Jeong et al. 2006 Plant J 45: 123-132). 이들 삽입변이체는 T-DNA 혹은 Ds의 삽입주변 서열 분석을 통해 다양한 유전자 변이체를 보다 용이하게 분리할 수 있도록 하였다. 국외에서도 여러 연구실이 유사한 노력을 하고 있으나 우리나라의 수준에 미치지 못한다. 한편 벼의 형질전환 기술이나 재배기술, 육종기술 등은 국내 수준이 세계 어느 나라와 비교해도 뒤지지 않고, 오히려 대부분의 국가보다 우수하다고 평가된다. 특히 형질전환체에 대한 규제가 매우 높은 일본 유럽 미국 등과 비교하면 우리나라에서 우수 벼 품종을 생산하는데 필요한 기반은 상대적으로 우위에 있다고 생각된다.
한국공개특허 제2009-0119884호에는 '향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0027219호에는 'ＮＡＣ 전사인자의 발현 조절로 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법'이 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 도입시킨 형질전환 벼 식물체의 수확량이 증가되었고, 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 이용하여 식물의 수확량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 이용한 수확량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 수확량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 포함하는 식물체의 수확량 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 이용하여 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명을 통해 개발된 벼 유래의 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자가 형질전환된 벼 식물체는 환경 스트레스 내성이 증가된 특징이 있고, 수확량이 증가되어, 벼 작물이 생육하기 불리한 조건에서도 수확량 증대를 위해 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 T2 형질전환 벼 식물체의 동형접합 식물체 (homozygote lines) 선발을 위한 PCR 분리를 나타낸다 (pHY105, Ubi::OsDHAR ; pHY102, SWPA2::BrMdhar).
도 2는 OsDHAR 유전자 또는 Brmdhar를 과발현시킨 형질전환 벼 식물체의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 3은 형질전환 벼 식물체의 염 스트레스 저항성 분석을 나타낸다.
도 4는 형질전환 벼 식물체의 실험포장에서 표현형 분석을 나타낸다.
도 5는 형질전환 벼 식물체의 효소활성 분석을 나타낸다.
도 6은 형질전환 벼 식물체의 저온 스트레스 저항성 분석을 나타낸다.
도 7은 파종 이후부터 형질전환 식물체의 생장률을 나타낸다.
도 8은 형질전환 벼 식물체의 수확량과 직접적인 관계가 있는 분얼수를 나타낸다.
도 9는 형질전환 벼 식물체의 효소활성 분석을 나타낸다.
도 10은 T3 형질전환 벼 식물체를 저온 스트레스에서 성장 길이 측정을 나타낸다.
도 11은 형질전환 벼 식물체의 염 스트레스 저항성 분석을 나타낸다.
도 12는 2010년 6월 파종 이후부터 수확기까지 형질전환 식물체의 생장률을 나타낸다.
도 13은 형질전환 벼 식물체 항산화활성 및 지질산화 분석을 나타낸다.
도 14는 T3 및 T4 형질전환 벼 식물체의 기관별 특성조사를 나타낸다 (TPW, total plants weight; CW, culm weight; RW, root weight; NP, number of panicles per hill; NSP, number of spikelets per panicle; FR, filling rate; TGW, total grain weight; 1000 GW, 1000 grain weight).
도 15는 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체의 염 스트레스 민감도 확인을 나타낸다.
도 16은 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체의 분자생물학적 기능 분석을 나타낸다 (A: T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체인 #1-4(OsMdhar) 및 #6-3(OsDhar)을 semi RT-PCR 분석을 통한 항산화 관련유전자의 발현 확인, B: T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체인 #1-4(OsMdhar)의 효소활성 분석).
도 17은 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체 실험포장에서 형태 분석을 나타낸다 (A:파종 이후부터 삽입 돌연변이 벼 식물체의 유효분얼수).
도 18은 2010년 5월 파종 이후부터 수확기까지 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체의 생장률을 나타낸다.
도 19는 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체의 실험 포장에서 기관별 특성조사를 나타낸다 (TPW, total plants weight; CW, culm weight; RW, root weight; NP, number of panicles per hill; NSP, number of spikelets per panicle; FR, filling rate; TGW, total grain weight; 1000 GW, 1000 grain weight).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 수확량을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자는 각각 multigene family로 존재할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 각각 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 식물의 수확량 증가는 식물의 분얼수 증가일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
dhar 유전자 또는 mdhar 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, SWPA2 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 수확량이 증가된 식물체의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 각각 이루어질 수 있다.
본 발명의 식물체의 제조 방법에서, 상기 수확량 증가는 식물의 분얼수 증가일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다 (Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 수확량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 단자엽 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae), 장지채과(Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마과(Dioscoreaceae), 물옥잠과(Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 버먼초과(Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 화본과(벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(방동사니과, Cyperaceae), 파초과(Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae) 또는 난초과(Orchidaceae)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는, 식물체의 수확량 증가용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 각각 이루어질 수 있다. 상기 조성물은 유효성분으로 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 수확량을 증가시킬 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 각각 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염, 저온 또는 산화 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 내성이 증가된 식물체의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 각각 이루어질 수 있다.
본 발명의 식물체의 제조 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염, 저온 또는 산화 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 각각 이루어질 수 있다. 상기 조성물은 유효성분으로 벼 유래 dhar 유전자 또는 배추 유래 mdhar 유전자를 포함하며, 상기 유전자 각각을 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스에 대한 내성을 증진시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
(1) 모노디히드로아스코베이트 리덕타제 (MDHAR) 및 디히드로아스코베이트 리덕타제 (DHAR) 유전자의 과발현 벡터 구축, 상기 벡터로 형질전환된 T1 세대 벼 식물체 및 이의 종자 개발
디히드로아스코베이트 리덕타제 (DHAR)을 코딩하는 총 길이 cDNA (AY074786/Os05g0116100)는 오리자 사티바 재배종 일미 (Oryza sativa cv.Ilmi)의 총 RNA로부터 RT-PCR 방법으로 얻었고, 이를 OsDHAR1이라고 하였다. pGA1611의 옥수수 유비퀴틴 프로모터 및 nos 터미네이터 사이에 클로닝하였다. 유비퀴틴 프로모터:: OsDHAR1::nos 터미네이터를 포함하는 3.6.kb의 절편을 pCAMBIA3300으로 클로닝하여 pOsDHAR1을 제조하였다. pOsDHAR1 바이너리 벡터는 아그로박테리움 균주 LBA4404에 형질도입시켰다. 식물체의 형질전환, 선별, bar-저항성 캘러스의 재분화 및 식물체는 앞서 기술한 방법으로 수행하였다 (Kang et al., 1998 Plant Mol Biol 38:1021-1029). OsDHAR 유전자를 포함하는 다른 구축물을 제조하기 위해, NcoⅠ 및 KpnⅠ으로 절단한 OsDHAR 유전자를 SWPA2 프로모터, nos 터미네이터 및 선별마커인 bar 유전자가 포함된 pCAMBIA3300 식물 삽입 벡터의 일치하는 자리에 삽입시켰다.
pOsDHAR1의 과발현을 위한 숙주로 오리자 사티바 자포니카 (Oryza sativa L.japonica)의 일미 (Ilmi) 변종을 사용하였다. 임의의 디히드로아스코베이트 리덕타제 유전자 (OsDHAR2, Os06g0232600)가 넉아웃된 T-DNA 삽입 돌연변이체 (3A-03259)는 동진 변종이다. 3A-03259는 RiceGE 웹사이트 (http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)에서 검색할 수 있다. Genotyping 및 표현형의 관찰을 위해, 형질전환 벼 식물체는 경북 국립대학교 (대구, 한국)의 GMO 필드에서 비형질전환 벼 식물체와 6월부터 10월까지 재배하였다. T3 세대의 벼 식물체는 염, 저온, H2O2 및 PEG (polyethylene glycol)과 같은 비생물적 스트레스에 대한 내성을 조사하는데 사용되었다.
유비퀴틴 프로모터:: OsDHAR1로 형질전환된 벼 식물체는 Ubi-F (5'-tgccttcatacgctatttatttgcttg-3' : 서열번호 3) 및 OsDHAR-R2 (5'-ccttgctcttcaagaacgttgtgaagc-3' : 서열번호 4) 프라이머를 이용한 PCR로 확인하였다. 3A-03259는 유전자 특이 프라이머 RP (5'-ccgttaataaatggaccctgc-3' : 서열번호 5) 및 LP (5'-aagcgcaattttacagctgag-3' : 서열번호 6)로 확인하였다.
배추 세포질 MDHAR (NCBI 등록번호 AY039786)을 코딩하는 cDNA는 브라시카 라바 변종 페키넨시스 (Brassica rapa var. Pekinensis)의 총 RNA로부터 RT-PCR 방법으로 얻었다. TOPO-TA 벡터 (인비트로젠)에 삽입하여 시퀀싱하여 확인하였고, BrMDHAR 유전자를 포함하는 구축물을 제조하기 위해, NcoⅠ 및 KpnⅠ으로 절단한 BrMDHAR 유전자를 SWPA2 프로모터, nos 터미네이터 및 선별마커인 bar 유전자가 포함된 pCAMBIA3300 식물 삽입 벡터의 일치하는 자리에 삽입시켰다. 이 구축물 (pCAMBIA3300::BrMDHAR)은 전기천공법으로 아그로박테리움 균주 LBA4404에 형질도입시켰다. 오리자 사티바 L. 자포니카 (일미) 식물체의 형질전환, 선별, bar-저항성 캘러스의 재분화 및 식물체는 앞서 기술한 방법으로 수행하였다 (Kang et al., 1998 Plant Mol Biol 38:1021-1029). BrMDHAR 유전자를 포함하는 다른 구축물을 제조하기 위하여, HindIII 및 KpnI 으로 절단한 BrMDHAR 유전자를 Ubi 프로모터, nos 터미네이터 및 선발마커인 hygromycin resistance gene을 selection marker로 가지고 있는 pGA1611 식물 삽입 벡터의 일치하는 자리에 삽입시켰다. 이 구축물 (pGA1611::BrMDHAR)은 nos 터미네이터 및 선발마커인 bar 유전자가 포함된 pCAMBIA3300 식물 삽입 벡터에 BamHI 및 SacII 로 blunt end ligation 법을 이용 하여 구축물 (Ubi::BrMDHAR)을 삽입 하였다.
BrMDHAR를 발현하는 50개의 독립적인 T0 형질전환 벼 식물체 (TP)는 성숙기까지 키웠다. T1 종자를 수확하였고, 5개의 독립적인 T0 벼 식물체로부터 얻은 T1 자손은 SWPA2-F (5'-caatcaagcattctacttctattgcagc-3': 서열번호 7) 및 BrMDHAR-R (5'-caatctcagaacagtagagccagttgc-3' : 서열번호 8) 프라이머를 이용하여 분리 패턴 (segregation pattern) 분석을 수행하였다. T1 벼 식물체로부터 수확한 약 1000개의 T2 종자는 카나마이신 포함 발근 배지에서 발아시켰다. 카나마이신이 포함된 발근 배지에서 T1 벼 식물체로부터 유도된 T2 종자의 발아에 대한 스크리닝은 발아된 T1 식물체로부터 수확된 T2 종자를 모두 분석할 때까지 반복적으로 수행하였다. 동형접합 식물체를 확인하기 위해, PCR 분석, 웨스턴 블럿 및 효소 활성 분석을 수행하였다.
(2) MDHAR와 DHAR 유전자가 과발현된 T2 벼 식물체 종자의 환경 스트레스 내성 조사
2008년 2월에 pHY101(Ubi::BrMdhar) 형질전환체 homoline 2개체, pHY102(SWPA2::BrMdhar) 형질전환체 homoline 1개체 및 pHY104(SWPA2::OsMdhar) 형질전환체 homoline 2개체를 선발한 후 파종하여 유전자형 및 스트레스(염 및 저온) 내성을 조사하였다.
2008년 6월에 pHY101 형질전환체 homoline 2개체, pHY102 형질전환체 homoline 1개체 및 pHY104 형질전환체 homoline 2개체를 선발하여 묘목 12개씩 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환 식물체 실험포장에 전개하고, 형질을 관찰하였으며, 생물학적 분석을 시도하였다.
2008년 12월 온실에 T2 세대 pHY101 형질전환체 homoline 2개체, pHY102 형질전환체 homoline 1개체 및 pHY104 형질전환체 homoline 2개체의 T2 종자를 파종한 후 3주 동안 성장시킨 식물체를 스트레스 조건 (염, 저온, 산화)에서 RNA 발현, 효소 활성 및 미량분석(microanalysis)을 실시하였다.
온실에 파종 후 6일 동안 염 스트레스 처리 이후 잎을 채취하여 단백질을 추출하여 효소활성을 분석하였다. 단백질 추출은 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA , 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, protease inhibitor cocktails이 포함된 추출 버퍼를 사용하여 추출하였다. pHY101, pHY102, pHY104 및 일미벼의 RNA를 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, USA)을 이용하여 추출하였다.
(3) MDHAR와 DHAR 유전자가 과발현된 T2, T3 및 T4 벼 식물체의 환경 스트레스 내성 조사 및 표현형 관찰
① T2 세대 종자의 전개 이후 스트레스 내성 분석, 생물학적 분석 및 유전자 분석
2009년 2월과 6월에 pHY103(Ubi::OsMDHAR) 형질전환체 homoline 2개체, pHY105(Ubi::OsDHAR) 형질전환체 homoline 7개체 및 pHY106(SWPA2::OsDHAR) 형질전환체 homoline 7개체를 선발한 후 온실에 파종하여 스트레스(염 및 저온) 내성에 대해 조사하였다.
2009년 6월에 pHY103 형질전환체 homoline 2개체, pHY105 형질전환체 homoline 7개체 및 pHY106 형질전환체 homoline 7개체를 선발하여 묘목 12개씩 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환 식물체 실험포장에 전개하고, 형질을 관찰하였으며, 생물학적 분석을 시도하였다.
2009년 2월에 온실에 파종한 pHY103 형질전환체 homoline 2개체, pHY105 형질전환체 homoline 7개체 및 pHY106 형질전환체 homoline 7개체의 분리비율을 확인하기 위하여 유전자형을 분석하였다.
T2 종자 15개 정도씩을 논에 전개시킨 다음 PCR을 이용하여 전개라인의 유전자형을 결정한다. PCR 조건은 95℃, 5 min ; 94℃, 1 min ; 57℃, 1 min ; 72℃, 1 min (35 사이클); 72℃, 7 min에서 실시하였다.
② T3 세대 종자의 전개 이후 스트레스 내성 분석, 생물학적 분석 및 유전자 분석
2009년 2월과 6월에 pHY101 형질전환체, pHY102 형질전환체 및 pHY104 형질전환체를 온실에 파종하여 스트레스(염 및 저온) 내성에 대해 조사하였다.
온실에 파종한 형질전환 벼 식물체의 표현형을 관찰하였다. 온실에 파종 후 100 mM 염 스트레스 처리 및 10℃ 저온 처리 이후의 표현형 관찰은 염 저온 스트레스 처리기간에 따라 대조군인 일미벼와 비교하여 분석하였다.
2009년 6월에 pHY101 형질전환체, pHY102 형질전환체 및 pHY104 형질전환체를 묘목 12개씩 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환 식물체 실험포장에 전개하고, 형질을 관찰하였으며, 생물학적 분석을 시도하였다.
2009년 2월과 6월에 온실과 군위 실험포장에 파종한 pHY101 형질전환체, pHY102 형질전환체 및 pHY104 형질전환체를 내염성 및 내한성에서 RNA, 단백질 발현 및 효소 활성 분석을 실시하였다.
RNA는 Tri-reagent 용액 (Molecular Research Center, INC.)을 이용하여 분리하였고, 1st strand cDNA합성은 MMLV 역전사 효소와 올리고 d(T)n (Promega)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
온실에 파종 후 6일 동안 염 스트레스 처리 이후 잎을 채취하여 단백질을 추출하여 효소활성을 분석하였다. 단백질 추출은 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA , 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF, protease inhibitor cocktails이 포함된 추출버퍼를 사용하여 추출하였다.
MDHAR의 활성도 측정은 MDHA가 아스코브산으로 환원되는 양을 340 nm(ε= 6.2 mM-1 cm-1)에서의 흡광도 변화를 50 mM 인산완충용액(pH 7.2, 0.2 mM NADH, 2 mM 아스코르브산염, 1 유닛 아르코르브산 산화효소)에서 측정하였으며, 각각의 조효소액의 단백질 함량은 브래드포드법으로 측정하였다.
③ T2, T3 및 T4 세대 벼 식물체의 실험포장 표현형 조사
2010년 6월에 실험포장에 파종한 형질전환 벼 식물체의 표현형을 관찰하였다. 실험포장에 파종 후 표현형 관찰은 초기생육상태와 후기생육상태를 대조군인 일미벼와 비교하여 유효 분얼수, 무게, 수확량을 분석하였다.
(4) T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체에서 OsMdhar 및 OsDhar 유전자의 발현 조사
OsMdhar 유전자들에 대한 넉다운 (knock-down) 및 OsDhar 유전자들에 대한 넉아웃 (knock-out) 삽입 돌연변이 벼 식물체의 종자를 포항공과대학교에서 분양 받아 실험포장에 전개하여 T-DNA 삽입 유전자형을 조사하고 형질을 관찰하였다.
(5) T-DNA 삽입 벼 식물체들의 특정 산화스트레스 하에서 돌연변이의 스트레스 민감도 분석
T-DNA 삽입 돌연변이체를 온실에 전개시킨 다음 30℃ 전후에서 약 2주 동안 성장시킨 묘목의 게놈 DNA을 분리한 후 PCR을 이용하여 전개라인의 분리비율을 확인하기 위한 genotyping을 실시하였다. 게놈 DNA 분리는 균질화 버퍼 (0.1 M NaCl, 0.2 M 수크로스, 0.01 M EDTA, 0.03 M Tris-HCl, pH 8.0)과 용해 버퍼 (0.25 M EDTA, 2.5%(w/v) SDS, 0.5 M Tris-HCl, pH 9.2)를 4:1로 섞어서 만든 grind buffer를 사용하였으며, 0.2 g 식물조직을 액체 질소에 얼린 것을 1.5ml 튜브에서 분쇄하였다. 이후에 400 ㎕ grind buffer를 넣고 70℃에서 30분 동안 놓아둔 후 원심분리(12000 rpm, 10 min)하였다. 상층액을 70% EtOH로 씻은 후, 원심분리(12000 rpm, 10 min) 후 상층액을 제거하였다. 침전물을 건조시킨 후 증류수 50 ℃에 녹여 게놈 DNA를 추출하였다. PCR 조건은 93℃, 3 min; 93℃, 1 min; 54℃, 1 min; 72℃, 1 min (35 사이클); 72℃, 7 min에서 실시하였다.
2008년 2월과 6월에 온실 및 실험포장에 파종한 OsMdhar 넉다운 2개체 및 OsDhar 넉아웃 4개체의 RNA 발현 및 효소 활성 분석을 실시하였다.
T-DNA 삽입 돌연변이체를 온실에 파종시킨 다음 30℃ 전후에서 약 3주 동안 성장시킨 묘목을 염 및 저온 스트레스를 처리하여 약 6일 정도 후 샘플을 채취하여 단백질을 분리한 후 단백질 발현과 효소활성을 확인하였다. 0.2 g 식물조직을 막자사발과 막대를 이용하여 조직을 분쇄하였다. 갈아진 조직을 baked spatula을 사용하여 E-튜브에 나누어 담거나 15 ml 코니컬 튜브에 한꺼번에 담았다. 식물에서 단백질 추출은 균질화 버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF, protease inhibitor cocktails)를 첨가하여 추출하였다. 균질화 버퍼를 첨가 후 볼텍스를 실시하였다. 이 후에 얼음 위에서 10분간 방치한 다음, 12,000 rpm, 4℃로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 모아 새 튜브로 옮겼다. 추출한 단백질은 단백질 발현과 효소활성 측정에 사용하였다.
2009년 2월과 6월에 온실에 파종한 OsMdhar 넉다운 1계통 및 OsDhar 넉아웃 1계통의 동형접합체 라인 (homozygote lines)을 내염성 및 내한성 스트레스에 민감성 분석을 수행하였다.
2009년 2월과 6월에 온실에 파종한 OsMdhar 넉다운 및 OsDhar 넉아웃 개체의 RNA, 단백질 발현 및 효소 활성 분석을 실시하였다.
2009년 6월에 OsMdhar 넉다운 및 OsDhar 넉아웃 개체를 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환 벼 식물체 실험포장에 12개체씩 전개하였으며 형질 분석을 수행하였다.
2010년 6월 실험포장에 파종한 형질전환 벼 식물체의 표현형을 관찰하였다. 실험포장에 파종 후 표현형 관찰은 초기생육상태와 후기생육상태를 대조군인 동진벼와 비교하여 유효 분얼수, 무게, 수확량을 분석하였다.
실시예 1. MDHAR 및 DHAR 유전자가 과발현된 T1 형질전환 벼 식물체의 종자로부터 유도된 T2 형질전환 벼 식물체의 내염성 조사
2008년 2월에 MDHAR 및 DHAR 유전자가 과발현된 T1 형질전환 벼 식물체의 종자를 온실에 파종한 pHY101, pHY102, pHY104 및 pHY105 개체의 DNA를 추출하여 식물체의 삽입된 유전자를 확인하기 위하여 PCR을 이용하여 genotyping을 시도하였다. 실험 결과 염 스트레스 저항성을 가지는 개체들과 삽입유전자와 상관이 있는 것으로 나타났다 (도 1). pHY105 및 pHY102의 개체에서 DNA를 추출하여 유전자형을 분석한 결과 대조군 (일미벼)를 제외한 pHY105 계통 및 pHY102 계통의 모든 개체에서 삽입된 유전자를 확인할 수 있었다.
2008년 2월에 온실에 파종한 pHY101, pHY102, pHY104 및 pHY105 개체의 RNA를 추출하여 형질전환 벼 식물체가 삽입유전자 발현이 증가 되었는지를 확인하기 위하여 반정량적인 RT-PCR을 이용한 발현분석을 수행하였다. 실험 결과 산화 스트레스 저항성을 가지는 형질전환 벼 식물체들이 삽입유전자의 RNA 발현양이 높게 발현되는 것으로 분석되었다. 염 스트레스를 처리하지 않은 일반적인 상태에서 자란 형질전환 식물체에서 삽입유전자의 RNA 발현양이 낮게 나타났으며, 염 스트레스 처리 기간에 따라 RNA 발현양이 서서히 증가되는 것을 확인하였다. 이 실험결과로 보아 형질전환 벼 식물체들이 염 스트레스에 저항성을 가지는 것으로 확인되었다 (도 2). WT (일미벼) 보다 형질전환 벼 식물체에서 염 스트레스 처리기간에 따라 항산화 관련 유전자의 발현 정도가 높게 나타나는 것으로 확인되었다.
온실 및 군위에 파종한 형질전환 벼 식물체의 표현형을 관찰하였다. 온실에 파종 후 염 스트레스 처리 이후의 표현형 관찰은 염 스트레스 처리기간에 따라 대조군인 일미벼와 비교하여 형질전환 벼 식물체가 일미벼 보다 스트레스에 저항성이 높은 것으로 확인되었다. 염 스트레스 처리 기간은 종자를 파종한 후 15일 이후에 처리 하였으며, 염 스트레스 처리 후 약 40일 동안 100 mM로 처리하였다 (도 3). 형질전환 벼 식물체 pHY105, pHY106 및 pHY102가 WT(일미벼) 보다 높은 염 스트레스 저항성을 나타낸다. 100 mM 염 스트레스를 약 40일 동안 처리하였으며 이후 10일 동안 회생 하였다.
군위에 파종 후 표현형 관찰은 2008년 6월에 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환 식물체 실험포장에 전개하였고, 파종 이후부터 꾸준히 형질을 관찰한 결과 형질전환체가 대조군(일미벼) 보다 초기생육상태와 후기생육상태가 좋은 것으로 확인되었다. 이 실험결과로 보아 형질전환 식물체들이 일반적인 논 조건에서도 일미벼 보다 성장률이 좋은 것으로 확인되었다 (도 4). 파종 이후부터 형질전환 벼 식물체의 생장률을 조사하였다. 대조군(일미벼), #53-1(pHY101), #53-5(pHY101), #58-2(pHY102), #64-4(pHY104) 및 #65-2(pHY104)를 초기생육상태와 후기생육상태 조사에서 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 생육상태가 빠른 것으로 나타났고 (도 4A), 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 출수시기가 약 10-20일 정도 빨랐다 (도 4B). 도 4C는 형질전환체의 생산성과 직접적인 관계가 있는 분얼수를 조사한 결과로 형질전환체의 분얼수가 대조군에 비해 증가하였다 (Red, 대조군; Green, 형질전환체).
온실에 파종 후 염 스트레스 처리 이후에 잎을 채취하여 DHAR 또는 MDHAR 단백질을 추출, 효소 활성을 분석하였다. DHAR 또는 MDHAR 효소활성을 분석한 결과 염 스트레스 처리기간에 따라서 형질전환 식물체가 대조군인 일미벼 보다 효소활성이 높게 발현되는 것을 확인하였다. 이 실험결과로 보아 형질전환 식물체가 일반적인 상태에서 대조군인 일미벼 보다 높은 효소활성을 보이다가 염 스트레스 조건에서는 효소활성이 더욱 많이 증가하는 것으로 확인되었다. 이것은 형질전환 식물체가 대조군인 일미벼 보다 염 스트레스 조건에서 저항성을 가지는 것으로 확인할 수 있다 (도 5).
대조군인 일미벼와 형질전환 벼 식물체인 pHY105 (Ubi::OsDHAR) 및 pHY102 (SWPA2::BrMDHAR)의 효소 활성 분석에서 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 염 스트레스에서 효소활성이 높게 나타나는 것으로 확인되었다. 100 mM 염을 처리한 후 12일 후의 잎을 사용한 실험 결과이다 (도 5A, 도 5B).
실시예 2. MDHAR 및 DHAR 유전자가 과발현된 T2 및 T3 형질전환 벼 식물체의 저온 스트레스 내성 (내한성) 조사
온실에 파종한 형질전환 벼 식물체의 표현형을 관찰하였다. 온실에 파종 후 저온 스트레스 처리 이후의 표현형 관찰은 저온 스트레스 처리기간에 따라 대조군인 일미벼와 비교하여 형질전환 벼 식물체가 일미벼 보다 저온 스트레스에 저항성이 높은 것으로 확인되었다. 저온 스트레스 처리기간은 종자를 파종한 후 약 30일 이후에 처리하였으며, 저온 스트레스 처리 후 약 50일 동안 10℃로 처리하였다 (도 6).
10℃ 저온 스트레스를 약 50일 동안 처리한 다음 이후 10일 동안 회생시킨 결과 형질전환 벼 식물체 pHY105, pHY106 및 pHY102가 WT(일미벼) 보다 높은 저온 스트레스 저항성을 나타내었다.
T3 형질전환 벼 식물체를 군위에 파종 후 표현형 관찰은 2009년 6월에 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환 식물체 실험포장에 전개하였고, 파종 이후부터 꾸준히 형질을 관찰한 결과 형질전환체가 대조군(일미벼) 보다 초기생육상태와 후기생육상태가 좋은 것으로 확인되었다. 이 실험결과로 보아 형질전환 벼 식물체들이 일반적인 논 조건에서도 일미벼 보다 성장률이 좋은 것이 T2 세대와 마찬가지로 확인되었다 (도 7). 대조군(일미벼), #53-1(pHY101), #53-5(pHY101), #58-2(pHY102), #64-4(pHY104) 및 #65-2(pHY104)의 초기생육상태와 후기생육상태 조사에서 형질전환 식물이 대조군인 일미벼 보다 생육상태가 좋은 것으로 나타났고(도 7A), 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 출수 시기가 약 10-20일 정도 빠른 것으로 나타났다 (도 7B).
T3 형질전환 벼 식물체를 군위에 파종 후 유효분얼수의 측정은 2009년 6월에 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환 식물체 실험포장에 전개하였고, 파종 이후부터 꾸준히 유효분얼수를 관찰한 결과 T3 형질전환 벼 식물체가 대조군(일미벼) 보다 초기분얼수가 좋은 것으로 확인되었다. 이 실험결과로 보아 형질전환 벼 식물체들이 일반적인 논 조건에서 초기 적응능력이 일미벼 보다 좋은 것으로 확인되었다 (도 8). 대조군(일미벼), #53-1(pHY101), #53-5(pHY101), #58-2(pHY102), #64-4(pHY104) 및 #65-2(pHY104)의 초기분얼수 조사에서 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 생육상태가 좋은 것으로 나타났다.
온실에 파종 후 염 스트레스 처리 이후에 잎을 채취하여 단백질을 추출, 효소 활성을 분석하였다. 효소활성을 분석한 결과 염 스트레스 처리 기간에 따라서 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 효소활성이 높게 발현되는 것을 확인하였다. 이 실험결과로 보아 형질전환 벼 식물체가 일반적인 상태에서 대조군인 일미벼 보다 높은 효소활성을 보이다가 염 스트레스 조건에서는 효소활성이 더욱 많이 증가하는 것으로 확인되었다. 이 결과로 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 염 스트레스에 저항성을 높게 가지는 것으로 확인되었다 (도 9). 염 스트레스는 10℃에서 6일 동안 성장시킨 후 샘플을 채집하였다. 대조군 (일미벼), OsDHAR1(pHY105), #58-2(pHY102) 및 #65-2(pHY104)의 효소활성 분석에서 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 염 스트레스 조건에서 효소활성(GR, APX)이 높은 것으로 나타났다.
온실에 파종한 형질전환 식물체의 표현형을 관찰하였다. 온실에 파종 후 저온 스트레스 처리 이후의 표현형 관찰은 저온 스트레스 처리기간에 따라 대조군인 일미벼와 비교하여 형질전환 벼 식물체가 일미벼 보다 저온 스트레스에 높은 저항성을 보이면서 길이성장을 하는 것으로 확인되었다. 저온 스트레스 처리 기간은 종자를 파종한 후 약 10일 이후에 처리하였으며, 저온 스트레스 처리 후 약 2주 동안 10℃로 처리하였다 (도 10). 대조품종 일미벼와 #58-2 (pHY102)를 파종 10일 후 일반적인 조건에서 표현형을 관찰하였고, 10℃에서 약 2주 동안 저온 스트레스를 처리한 후 표현형은 도 10A 및 도 10B와 같다. 대조품종 일미벼와 #58-2 (pHY102), 및 #65-2 (pHY104)를 10℃에서 성장 길이를 측정한 결과 형질전환 벼 식물체가 대조품종 보다 성장 길이가 길었다 (도 10C).
실시예 3. MDHAR 및 DHAR 유전자가 과발현된 T2 및 T3 형질전환 벼 식물체의 항산화 활성 조사
온실에 파종한 형질전환 벼 식물체의 표현형을 관찰하였다. 온실에 파종 후 염 스트레스 처리이후의 표현형 관찰은 염 스트레스 처리기간에 따라 대조군인 일미벼와 비교하여 형질전환 벼 식물체가 일미벼 보다 염 스트레스에 저항성이 높은 것으로 확인되었다. 염 스트레스 처리 기간은 종자를 파종한 후 약 30일 이후에 처리하였으며, 염 스트레스 처리 후 약 40일 동안 처리하였다. 이후 회복기간은 약 14일 처리하였다 (도 11). 100 mM 염 스트레스를 약 40일 동안 처리한 이후 14일 동안 회생시킨 결과, 형질전환 벼 식물체 pHY105 및 pHY106가 WT(일미벼) 보다 높은 염 스트레스 저항성을 나타내었다.
T3 형질전환 벼 식물체를 군위에 파종 후 표현형 관찰은 2010년 6월에 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환 식물체 실험포장에 전개하였고, 파종 이후부터 꾸준히 형질을 관찰한 결과 형질전환체가 대조군(일미벼) 보다 초기생육상태와 후기생육상태가 좋은 것으로 확인되었다. 이 실험결과로 보아 형질전환 벼 식물체들이 일반적인 논 조건에서도 일미벼 보다 성장률이 좋은 것이 T2 세대와 마찬가지로 확인되었다 (도 12). 대조군(일미벼), pHY105 및 pHY106의 생육상태 조사에서 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 생육상태가 좋은 것으로 나타났다.
온실에 파종 후 염 스트레스 처리 이후에 잎을 채취하여 단백질을 추출, 항산화활성 및 지질산화를 분석하였다. 항산화활성을 분석한 결과 염 스트레스 처리 기간에 따라서 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 항산화활성 관련 단백질이 높게 발현되는 것을 확인하였다. 지질산화물의 지표로 사용되는 말론디알데히드 (malondialdehyde) 함량 분석으로 지질산화 정도를 분석한 결과 염 스트레스 처리 기간에 따라서 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 지질산화가 낮게 일어나는 것으로 확인되었다. 이 실험결과로 보아 형질전환 벼 식물체가 스트레스 상태에서 대조군인 일미벼 보다 높은 항산화활성과 낮은 지질산화를 나타나는 것으로 확인되었다. 이 결과로 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 염 스트레스에 저항성을 높게 가지는 것으로 확인되었다 (도 13). 염 스트레스는 100 mM에서 12일 동안 성장시킨 후 샘플을 채집하였고, 대조군 (일미벼), pHY105, pHY102 및 pHY104의 항산화활성 및 지질산화 분석에서 형질전환 벼 식물체가 대조군인 일미벼 보다 염 스트레스에서 높은 항산화활성과 낮은 지질산화로 나타났다.
T3 및 T4 형질전환 벼 식물체를 군위에 파종 후 기관별 특성조사는 2010년 6월에 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환 식물체 실험포장에 전개하였고, 2010년 10월 10일경에 T3 및 T4 형질전환 벼 식물체를 각각의 기관별로 나누어 특성을 조사한 결과 T3 형질전환 벼 식물체가 대조군(일미벼) 보다 기관별 특성이 우월한 것으로 확인되었다 (도 14). 대조군(일미벼), pHY101, pHY102, pHY103, pHY104, pHY105 및 pHY106을 각각의 기관별로 구분하여 특성을 조사하였다. 실험 포장에서 성장시킨 벼 식물체의 기관별 특성 분석은 형질전환 벼 식물체가 일미벼 보다 성장 및 수확량이 높은 것으로 나타났다.
실시예 4. MDHAR 및 DHAR 유전자에 T-DNA가 삽입된 벼 식물체의 내염성 및 분자생물학적 특성 조사
2008년 2월과 6월에 온실 및 군위에 파종한 OsMdhar 넉다운 및 OsDhar 넉아웃 개체를 파종하여 염 스트레스를 처리한 결과 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체가 대조군인 동진벼보다 염 스트레스에 민감한 것으로 확인되었다. 100 mM 염 스트레스를 약 30일 동안 처리하였다. 이 실험결과로 보아 항산화 유전자가 식물의 생장에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 확인했다(도 15). T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체인 #1-4(OsMdhar) 및 #6-11(OsDhar)를 100 mM 염 스트레스를 약 30일 동안 처리하였다. WT(동진벼)보다 각각의 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체들이 염 스트레스에 더욱 민감한 것으로 확인되었다.
2008년 2월과 6월에 온실 및 군위에 파종한 OsMdhar 넉다운 및 OsDhar 넉아웃 개체를 파종하여 염 스트레스를 처리한 후 기간에 따라 샘플을 채취하여 RNA와 단백질을 추출하여 RNA 발현 및 효소 활성 분석을 실시하였다. RNA 발현은 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체의 유전자발현이 감소하였는지 보기 위하여 반정량적 RT-PCR에 의존하여 발현분석을 시도하였다. 이 실험결과 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체의 RNA 발현양이 대조군인 동진벼 보다 감소한 것으로 확인되었고(도 16A), 효소활성은 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체의 효소활성이 대조품종 동진벼 보다 감소한 것으로 나타났다(도 16B). 이 실험결과로 보아 벼 식물체의 항산화유전자가 염 스트레스 조건에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 확인할 수 있다.
T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체를 군위에 파종한 OsMdhar 넉다운 및 OsDhar 넉아웃 개체의 유효분얼수 측정은 2009년 6월에 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환식물체 실험포장에 전개하였고, 파종 이후부터 꾸준히 유효분얼수를 관찰한 결과 T-DNA 삽입 돌연변이 식물체가 대조군인 동진벼 보다 초기분얼수가 나쁜 것으로 확인되었다. 또한 출수시기가 동진벼보다 늦은 것으로 확인되었다. 이 실험결과로 보아 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체들이 일반적인 논 조건에서 적응능력이 동진벼보다 나쁜 것으로 확인되었다(도 17). 대조품종 동진벼, #1-4(OsMdhar), #6-3(OsDhar) 및 #6-11(OsDhar)의 유효분얼수를 조사한 결과, 삽입 돌연변이 벼 식물체가 대조군인 동진벼 보다 유효분얼수가 적은 것으로 나타났고(도 17A), 삽입 돌연변이 벼 식물체가 대조품종 동진벼 보다 출수 시기가 약 10-20일 정도 늦은 것으로 나타났다(도 17B).
T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체를 군위에 파종한 OsDhar 넉아웃 개체의 형태 조사는 2010년 6월에 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환식물체 실험포장에 전개하였고, 파종 이후부터 꾸준히 형질을 관찰한 결과 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체가 대조군(동진벼) 보다 초기생육상태와 후기생육상태가 나쁜 것으로 확인되었다. 이 실험결과로 보아 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체들이 일반적인 논 조건에서도 동진벼보다 성장률이 나쁜 것으로 확인되었다(도 18). 대조군(동진벼), OsDhar 생육상태 조사에서 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체가 대조군인 동진벼 보다 생육상태가 나쁜 것으로 나타났다.
T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체를 군위에 파종 후 기관별 특성조사는 2010년 6월에 경북 군위군 효령면에 위치한 경북대학교 형질전환식물체 실험포장에 전개하였고, 2010년 10월 10일경에 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체를 각각의 기관별로 나누어 특성을 조사한 결과 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체가 대조군(동진벼) 보다 기관별 특성이 빈약한 것으로 확인되었다(도 19). WT(동진벼), #1-4(OsMdhar), #6-3(OsDhar) 및 #6-11(OsDhar)를 각각의 기관별로 구분하여 특성을 조사한 결과, WT(동진벼)와 비교하여 T-DNA 삽입 돌연변이 벼 식물체들이 기간별 특성이 매우 빈약한 것으로 나타났다.

Claims (14)

  1. 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 수확량을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자는 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 수확량이 증가된 식물체의 제조 방법.
  4. 제3항의 방법에 의해 제조된 수확량이 증가된 형질전환 식물체.
  5. 제4항에 따른 식물체의 종자.
  6. 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는, 식물체의 수확량 증가용 조성물.
  7. 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 dhar 유전자 또는 mdhar 유전자는 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 염, 저온 또는 산화 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 내성이 증가된 식물체의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 염, 저온 또는 산화 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체.
  13. 제12항에 따른 식물체의 종자.
  14. 벼 (Oryza sativa) 유래 dhar (dehydroascorbate reductase) 유전자 또는 배추 (Brassica rapa) 유래 mdhar (monodehydroascorbate reductase) 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물.
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