KR20090007333A - 자궁경부암의 예방 및 치료를 위한 사람 파필로마바이러스폴리펩타이드와 면역 증강제를 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 파필로마바이러스 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드, 이를 세포 외로 분비시키기 위한 신호 펩타이드 및 개체내 면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 상기 벡터를 포함하는 약제학적 조성물 및 이들 약제학적 조성물을 이용하여 개체에서 상기 사람 파필로마바이러스에 의한 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

자궁경부암의 예방 및 치료를 위한 사람 파필로마바이러스 폴리펩타이드와 면역 증강제를 포함하는 조성물{COMPOSITIONS COMPRISING HPV POLYPEPTIDES AND IMMUNOENHANCEMENT PEPTIDES FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF CERVICAL CANCER}
본 발명은 사람 파필로마바이러스(human papillomavirus; HPV) E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드, 이를 세포외로 분비시키기 위한 신호 펩타이드 및 개체내 면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 융합 단백질 또는 상기 벡터를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 약제학적 조성물을 이용하여 사람 파필로마바이러스에 의한 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
자궁경부암(cervical cancer)은 전 세계적으로 해마다 250,000명의 사망의 원인이 되는 것으로 종양 관련 사망의 두 번째 주된 이유이다. 자궁경부암은 대부분 사람 파필로마바이러스(Human papillomavirus, HPV)의 감염에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다(zur Hausen, H et al. Biochem Biophys Acta 1996, 1288; F55-F78). 100종류의 HPV 중 HPV16이 가장 자궁경부암의 유발과 관계가 높은 것으로 알려져 있다(Mark H et al. J Natl Cancer Inst 1993, 85; 958-964). HPV 단백질 중 에서 E6 와 E7 단백질이 자궁경부암 형성에 주요한 역할을 하며, 또한 HPV에 의해 발병되는 종양의 약 99％에서 발현되는 주요 단백질이라는 것이 알려지면서 자궁 경부암 치료 및 예방 백신을 제조하는데 주요한 목표 물질이 되었다(von Knebel Doeberitz et al. Int. J. Cancer 1992, 51; 831-834). E6은 종양 억제 단백질 p53의 분해를 유도하여 세포가 세포사멸(apoptosis)되는 것을 방지하며, E7은 세포성 종양 억제인자 망막모세포종 단백질(Rb)에 결합하여 이를 불활성화시키고, 세포가 세포주기의 S기로 진행되도록 한다(Cobrinik et al., Trends Biochem Sci 1992, 17:312-5).
자궁경부암을 치료하기 위해 HPV16 E6과 E7 단백질을 동시에 발현하는 핵산 염기서열을 발현하는 조성물을 사용하여 임상실험을 행하였으나 치료효과가 미미하였다(Garcia F et al. Obstet Gynecol 2004, 103; 317-326). 또한 국제공개특허 WO 2004/030636호는 E6이 아미노 말단 또는 카복시 말단에 있는 E6 및 E7을 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관하여 개시하고 있다. 그러나, 상기 문헌에 개시된 폴리펩타이드는 여전히 HPV에 의하여 야기되는 자궁경부암 등의 질환을 치료하는데 한계가 있다.
이에, 본 발명자들은 HPV의 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드에 분비 펩타이드 및 면역 증강 펩타이드를 결합한 융합 단백질이 면역 반응을 향상시키고, HPV에 의해 유발되는 종양의 치료 및 예방 효과에 효과가 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Technical Problem
본 발명의 하나의 목적은 HPV에 의해 야기되는 질환의 치료 및 예방 효과가 우수한 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 융합 단백질 및 재조합 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 약제학적 조성물을 이용한 개체에서 HPV에 의하여 야기되는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 쥐 C57BL/6 모델에서 tE67Co, tFCoE67Co 및 tE67CoLCo을 발현하는 플라스미드 DNA (plasmid DNA)를 예방 접종 (vaccination)하고 생성되는 E7 특이적 CD8+ T 세포 반응을 Mock, E6Co, E7Co, E67및 E67Co 와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 쥐 C57BL/6 모델에서 tE67Co, tFCoE67Co 및 tE67CoLCo을 예방 접종(vaccination)후 생성되는 E6 특이적 CD8+ T 세포 반응을 Mock, E6Co, E7Co, E67및 E67Co 와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 쥐 C57BL/6 모델에서 tE67Co, tFCoE67Co 및 tE67CoLCo을 예방 접종(vaccination)후 종양세포주인 TC-1을 피하주입 (subcutaneous injection)하고 그 부피 증감을 비교하여 나타나는 항암 예방 효과를 Mock, E6Co, E7Co, E67및 E67Co 와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 쥐 C57BL/6 모델에서 종양세포주인 TC-1을 이식한 후 mock, tE67Co, tFCoE67Co 및 tE67CoLCo 의 치료를 통해 나타나는 E7 특이적 CD8+ T 세포 반응을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6에 종양세포주인 TC-1을 피하주입한 후 mock, tE67Co, tFCoE67Co 및 tE67CoLCo 의 치료를 통해 나타나는 E6 특이적 CD8+ T 세포 반응을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 치료모델 (therapeutic model)에서 쥐 C57BL/6 모델에서 종양세포주인 TC-1을 피하주입한 후 mock, tE67Co, tFCoE67Co 및 tE67CoLCo 의 치료를 통해 나타나는 항암효과를 비교하여 나타낸 그래프이다.
Best Mode for Carrying Out the Invention
하나의 양태로서, 본 발명은 사람 파필로마바이러스 E6과 E7의 융합 폴리펩타이드, 이를 세포외로 분비시키기 위한 신호 펩타이드 및 개체내 면역 증강 펩타 이드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드를 구성하는 E6과 E7은 사람 파필로마바이러스(HPV) 타입 16, 18, 31, 33, 45 및 51 등에서 유래하는 항원단백질이며, 바람직하게는 사람 파필로마바이러스 타입 16(HPV16) 또는 18(HPV18)에서 유래되는 E6 및 E7 항원단백질이다.
본 발명에 있어서, "사람 파필로마바이러스 E6과 E7의 융합 폴리펩타이드"는 E6와 E7의 각각이 천연형 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이거나 또는 E6 및 E7 중 하나 이상이 상기의 천연형 아미노산 서열의 아미노산 변이체를 갖는 폴리펩타이드가 융합된 단백질이다. 본 발명에서 사용된 용어 "변이체"란 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 보전적 치환되거나 또는 이들의 조합에 의하여 천연 아미노산 서열과 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드로서 천연형 E6와 E7 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 면역원성을 가지며, 자연적으로 발생하거나 인위적으로 발생시킬 수 있다. 구체적인 양태로서, 상기 변이체는 사람 파필로마바이러스 타입 16(HPV16)의 E6 폴리펩타이드를 코딩하는 아미노산 서열에서 63번째 및 106번째 시스테인(Cysteine)이 글라이신(Glycine)으로 치환된 서열번호 4, HPV16의 E7 폴리펩타이드를 코딩하는 아미노산 서열에서 24번째 시스테인(Cysteine) 및 26번째 글루탐산(Glutamic acid)이 글라이신(Glycine)으로 치환된 서열번호 6, HPV18의 E6 폴리펩타이드를 코딩하는 아미노산 서열에서 65번째 및 108번째 시스테인(Cysteine)이 글라이신(Glycine)으로 치환된 서열번호 10 또는 HPV18의 E7 폴리펩타이드를 코딩하는 아미노산 서열에서 27번째 시스테인(Cysteine) 및 29번째 글루탐산 (Glutamic acid)이 글라이신(Glycine)으로 치환된 서열번호 12가 있다.
본 발명의 사람 파필로마바이러스 E6과 E7의 융합 폴리펩타이드는 E6이 E7에 대해 아미노 말단에 있는, 즉 E6이 E7 다음에 존재하는 융합 폴리펩타이드 형태(E7E6 융합 폴리펩타이드) 또는 E6이 E7에 대해 카르복시 말단에 있는, 즉 E7이 E6 다음에 존재하는 융합 폴리펩타이드 형태(E6E7 융합 폴리펩타이드)를 가질 수 있다. 구체적인 양태로서, 서열번호 8의 HPV16 E6E7 융합 폴리펩타이드 또는 서열번호 14의 HPV18 E6E7 융합 폴리펩타이드가 있다.
본 발명에 있어서, "신호 펩타이드"는 약 20 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩타이드로서, 세포 내에서 발현된 단백질, 특히 E6과 E7 융합 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 세포외로 분비하시키는 펩타이드를 말한다. 또한 이를 암호화하고 있는 핵산 서열을 "분비 신호 서열"이라 한다. 본 발명의 E6 및 E7 항원은 바이러스에 감염된 세포의 핵 내에서 발현되는 단백질(nucleus protein)이므로 자체적인 면역성이 약하다. 이에 분비 신호 서열에 의해 발현된 신호 펩타이드(signal peptide)가 E6 및 E7 항원의 세포 외의 분비를 유도함으로써 항원 특이적 체액성 면연반응(humoral immune respons) 및 세포성 면역반응(cellular immune response)의 증가를 가져올 수 있다. 따라서, 본 발명의 신호 펩타이드는 tPA, HSV gDs, 성장 호르몬의 분비 신호 서열 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵세포에서 사용되는 신호 펩타이드를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 tPA(tissue plasminogen activation)를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "면역 증강 펩타이드"는 면역 반응에 관계하는 세포(예로, 수지상 세포 등)를 활성화시켜 면역 반응을 증가시키는 펩타이드를 말한다. 이러한 면역 증강 펩타이드에는 CD40 리간드, Flt3 리간드, Flagellin, OX40 등이 있다. 본 발명에서는 이들 면역 증강 펩타이드를 하나 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 각각의 펩타이드를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는 CD40 리간드 및 Flt3 리간드를 각각 또는 함께 사용하였다. 본 발명의 "Flt3 리간드"는 수지상 세포(dendritic cell, DC)의 증식(proliferation)과 성숙(maturation)을 유도하는 인자(factor)로서, 항원에 의한 면역반응을 증가시키고 종양 항원과 융합된 상태에서 우수한 종양 감소 효과를 나타낸다. 본 발명의 "CD40 리간드"는 수지상 세포 등의 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)의 표면에 위치한 CD40과 상호작용하여 수지상 세포 등을 활성화시킨다.
본 발명에서 "개체"는 인간, 원숭이, 생쥐, 돼지, 소 및 토끼 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 융합 단백질은 항원 특이적 면역 반응 및 종양 억제 효과가 우수하다. 종래에 사람 파필로마바이러스 E6 및 E7 각각의 항원 특이적 면역 반응보다 사람 파필로마바이러스 E6과 E7의 융합 폴리펩타이드가 항원 특이적 면역 반응이 우수하다는 것이 알려져 있다. 그러나, 이들 사람 파필로마바이러스 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드에 신호 펩타이드 및 면역 증강 펩타이드를 결합한 융합 단백질의 형태가 종래에 기대할 수 있었던 항원 특이적 면역 반응 및 종양 억제 효과에 비하여 우수한 효과가 있음을 밝혀냈다. 구체적인 실시에서, 사람 파필로마바이러스 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드에 신호 펩타이드로서 tPa, 면역 증강 물질로서 Flt3 리간드 및/또는 CD40 리간드가 융합된 형태가 사람 파필로마바이러스 E6 및 E7 각각 또는 이의 융합 폴리펩타이드에 비하여 항원 특이적 면역 반응, 종양 크기 억제 및 종양 생성 억제에 있어서 우수한 효과를 나타내었다. 이에 의하여 본 발명의 융합 단백질은 종양의 치료 및 예방을 위하여 사용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성법 또는 유전자 조작 기술에 의하여 제조될 수 있다. 화학적 합성법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다. 또한, 상업적 핵산 합성 및 제공사에 의하여 의뢰하여 구입할 수도 있다. 유전자 조작 기술에 의하여 제조하는 경우, 예를 들면, 종래에 알려진 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드, 신호 펩타이드 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 단편을 각각 얻고, 이들 단편을 프레임에 맞게 연결함으로써 제작할 수 있다. 상기 핵산 단편을 얻는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자라면 적절한 제한 효소를 이용하여 용이하게 연결할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는 화학적 합성법에 의하여 제조하는 방법이 개시되어 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "벡터"란 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명과 관련된 발현 벡터는 분비 신호 서열, 인간 파필로마바이러스 E6과 E7 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 등이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 예로 들수 있다.
본 발명에 있어서, "분비 신호 서열"은 세포 내에서 발현된 종양 항원을 세포외로 분비하여 면역 세포들이 인식할 수 있도록 하는 펩타이드를 암호화하고 있는 핵산 서열로서, 예를 들면 tPA, HSV gDs, 성장 호르몬의 분비 신호 서열 등이 있다. 바람직하게는 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵세포에서 사용되는 분비 신호 서열을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 tPA(tissue plasminogen activation)를 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 분비 신호 서열은 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열"은 면역 반응에 관계하는 세포(예로, 수지상 세포 등)를 활성화시켜 면역 반응을 증가시키는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 말한다. 상기 면역 증강 펩타이드에는 CD40 리간드, Flt3 리간드, Flagellin, OX40 등이 있으며, 본 발명에서는 이들 면역 증강 펩타이드를 하나 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 각각의 펩타이드를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는 CD40 리간드 및 Flt3 리간드를 각각 또는 함께 사용하였다. 본 발명의 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 또한 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에 포함되는 상기의 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환된 것" 또는 "코돈 최적화"란 숙주세포 내에서 DNA가 단백질로 전사(transcription) 및 번역(translation)될 때 아미노산을 지령하는 코돈 사이에 숙주에 따라 선호도가 높은 코돈이 존재하는데, 이들 선호도가 높은 코돈으로 치환함으로써 그 핵산이 암호화하는 아미노산 또는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 것을 말한다. 여기서, "숙주세포"란 원핵 또는 진핵 세포를 포함하며, 진핵세포는 진균, 효모 등을 포함하는 하등 진핵 세포뿐만 아니라 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포를 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터에 포함되는 상기의 사람 파필로마바이러스 E6와 E7 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈 최적화 외에 종양원성을 일으키는 성질을 없애기 위하여 E6 및 E7을 코딩하는 핵산 서열 중 일부 서열을 치환할 수 있다.
본 발명의 사람 파필로마바이러스 E6과 E7의 융합 폴리펩타이드는 E6 및 E7을 각각 발현시켜 면역원(immunogen)으로 사용하는 경우보다 E6 및 E7을 융합 폴리펩타이드 형태로 발현시켜 면역원으로 사용하는 경우가 항원 특이적 면역 반응을 보다 효과적으로 유도한다. 또한 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하는 것이 치환하지 않은 경우보다 항원 특이적 면역 반응을 효과적으로 유도하며, E6 및 E7의 일부 핵산 서열에서 종양원성이 삭제되기 위한 돌연변이가 있는 경우에도 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있다. 구체적 양태로서, 이들 코돈 최적화되고 돌연변이된 HPV16 E6 및 E7, 또는 HPV18 E6 및 E7의 폴리펩타이드를 융합한 E6 및 E7 융합 폴리펩타이드의 핵산 서열이 서열번호 7 및 13에 나타내었다. 또한, 상기의 E6과 E7의 융합 폴리펩타이드 외에 분비 신호 서열에 의한 신호 펩타이드 및 면역 증강 펩타이드를 같이 발현시키는 경우가 E6과 E7의 융합 폴리펩타이드를 단독으로 발현하는 경우보다 항원 특이적 면역 반응, 종양의 크기 및 생성을 억제하는 효과가 우수하였다.
본 발명의 재조합 벡터는 숙주 세포에서 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 형태로 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터는 발현에 사용될 숙주 세포에 근거하여 선택되어지는, 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 이들은 발현되어질 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. "작동가능하게 연결되어 있는"이란 목적으로 하는 뉴클레오타이드 서열이 (예를 들면, 인 비트로 전사/번역 시스템에서 또는 숙주 세포에서) 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다. "조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주 세포에서 목적으로 하는 핵산이 구성적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것 및 특정한 숙주 세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절 서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환 될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다.
본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스파타제 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 사람 파필로마바이러스 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 DNA를 적절한 조절 서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명에서는 대한민국 특허출원공개 제2003-47667호에 개시된 DNA 백신 제조용 벡터인 pGX10을 제조하여 사용하였다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 코돈 최적화되고 일부 아미노산을 코딩하는 핵산이 치환된 서열번호 7 또는 서열번호 13의 E6과 E7 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 서열번호 7 또는 서열번호 13의 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터는 추가로 분비 신호 서열 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기의 분비 신호 서열은 tPA, HSV, gDs, 성장 호르몬의 분비 신호 서열 등이 있으며, 바람직하게는 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵세포에서 사용되는 분비 신호 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 tPa(tissue plasminogen activation)를 포함한다. 상기의 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 서열은 CD40 리간드, Flt3 리간드, Flagellin, OX40 등을 코딩하는 아미노산 서열을 포함하며, 이들 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각의 펩타이드를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는 CD40 리간드 및 Flt3 리간드를 각각 또는 함께 사용하였다. 상기의 분비 신호 서열 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 또한 숙주 세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하는 것이 바람직하다. 구체적 양태로서, tPa는 서열번호 1, Flt3 리간드는 서열번호 15 및 CD40 리간드는 서열번호 17의 핵산 서열을 가지고 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 융합 단백질을 생산하기 위한 세포를 제조하는 용도, 유전자 치료에 있어서 유전자 전달을 위한 벡터 또는 그 자체로서 개체 내에 투여되는 약제학적 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 생쥐 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 바이러스에 의하여 유발되는 질환은 자궁경부암, 곤지롬, 사마귀 등이 포함된다.
본 발명의 조성물에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 담체에는 유당, 포도 당, 자당, 소르비톨, 마니톨, 전분, 검 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이드 및 미네랄 오일 등이 포함된다. 상기 조성물에는 또한, 윤활제, 웨팅제, 풍미제, 유화제 및 방부제 등이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있으나, 이들 방법에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 인 비트로에서 배양된 세포에 투여되고, 상기 배양된 세포를 체내에 투여함으로써 간접적으로 개체 내에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 액제 또는 주사제의 형태일 수 있다.
활성 성분으로서 본 발명의 융합 단백질의 효과적인 양은 약 0.05 내지500mg/kg 체중, 바람직하게는 0.5 내지 50mg/kg 체중일 수 있으며, 단일 투여량 및 배분된 투여량으로 고려될 수 있다. 그러나, 투여되는 활성 성분의 양은 치료될 조건, 환자의 나이 및 체중, 증상의 경중과 같은 다양한 인자를 고려하여 결정하여야 하기 때문에 상기한 범위에 한정되는 것은 아니다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 생쥐 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 바이러스에 의하여 유발되는 질환은 자궁경부암, 곤지롬, 사마귀 등이 포함된다.
본 발명의 조성물에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 담체에는 유당, 포도당, 자당, 소르비톨, 마니톨, 전분, 검 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이드 및 미네랄 오일 등이 포함된다. 상기 조성물에는 또한, 윤활제, 웨팅제, 풍미제, 유화제 및 방부제 등이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있으나, 이들 방법에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 인 비트로에서 배양된 세포에 투여되고, 상기 배양된 세포를 체내에 투여함으로써 간접적으로 개체내에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 액제 또는 주사제의 형태일 수 있다.
활성 성분으로서 본 발명의 벡터의 효과적인 양은 약 0.05 내지 500mg/kg 체중, 바람직하게는 0.5 내지 50mg/kg 체중일 수 있으며, 단일 투여량 및 배분된 투여량으로 고려될 수 있다. 그러나, 투여되는 활성 성분의 양은 치료될 조건, 환자의 나이 및 체중, 증상의 경중과 같은 다양한 인자를 고려하여 결정하여야 하기 때문에 상기한 범위에 한정되는 것은 아니다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 치료학적으로 효과적인 양의 본 발명의 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물, 그의 효능, 투여방법 및 투여량 등에 관한 내용은 상기한 바와 같다. 본 발명의 방법에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 생쥐, 돼지, 소 및 토끼 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Mode for the Invention
실시예 1 : pGX10/tE67 Co DNA의 구성
본 발명의 실시예에서 사용된 약어는 다음과 같이 정의한다. "Co"는 코돈 최 적화된 핵산서열, "tPa" 또는 "t"는 조직 플라스노겐 활성제(tissue plasminogen activator)의 분비 신호 서열(secretory signal sequence), "F"는 Flt3 리간드, "L"은 CD40 리간드를 의미한다.
서열번호 1의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 tPa 분비 신호 서열은 화학적으로 합성하였다. 말단에 EcoRI-KpnI(5')과 Eco47Ⅲ-NheI(3') 사이트를 첨가하였다. 서열번호 7의 핵산 서열을 가지는 코돈 최적화된 HPV16E6E7은 화학적으로 합성하였으며, 벡터에 삽입하기 용이하게 하기위해 말단에 Eco47Ⅲ-NheI(5'), AscI-XhoI(3')사이트를 첨가하였으며 E6와 E7의 접합부분에 BamHI 사이트를 첨가하였다. 종양원성을 일으키는 성질을 없애기 위하여 E6의 63번 코돈 (cystein)을 glucine으로, 106번 코돈 (cystein)을 glycine을 지령하는 코돈으로 바꾸었으며(서열번호 3), E7은 24번 코돈 (cystein)을 glycine으로 26번 코돈 (glutamine)을 glycine을 지령하는 코돈으로 바꾸었다(서열번호 5). DNA 백신제조용 벡터인 pGX10 (대한민국 특허출원공개 제2003-0047667호)을 EcoRI과 NheI 효소 (enzyme)로 처리한 후 합성한 분비 신호 서열인 tPa을 리가아제 (ligase)로 연결하였다. 이를 다시 NheI 과 XhoI 효소로 자른 후 합성한 HPV16E6E7을 리가아제로 연결하여 pGX10/tE67Co를 제작하였다.
실시예 2 : pGX10/tF Co E67 Co DNA의 구성
서열번호 1의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 tPa 분비 신호 서열과 서열번호 15의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 Flt3L 는 연결된 형태로 화학적으로 합성하였다. 벡터에 삽입하기 용이하게 하기 위해 말단에 KpnI(5'), EcoRV(3')사이트를 첨가하였다. 실시예 1에서 제조한 pGX10/tE67Co를 KpnI과 Eco47Ⅲ 효소로 처리하여 분비 신호 서열인 tPa 만 제거한 다음 tFCo 을 리가아제를 사용하여 붙여 pGX10/tFCoE67Co 을 제작하였다.
실시예 3 : pGX10/tE67 Co L Co DNA의 구성
서열번호 17의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 CD40L 화학적으로 합성하였다. 벡터에 삽입하기 용이하게 하기 위해 말단에 AscI(5'), XhoI(3')사이트를 첨가하였다. 실시예 1에서 제조한 pGX10/tE67Co를 AscI과 XhoI 효소로 처리한 다음 CD40LCo을 리가아제를 사용하여 붙여 pGX10/tE67CoLCo 을 제작하였다.
실시예 4 : pGX10/tE67 Co , pGX10/tF Co E67 Co , pGX10/tE67 Co L Co 의 자궁경부암 예방효과 확인
pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co, pGX10/tE67CoLCo의 자궁경부암 예방효과를 확인하기 위해 쥐 C57BL/6에 4주 간격으로 두 번에 걸쳐 50μg씩 근육주사(intra-muscular injection)하였고 대조군으로 pGX10, pGX10.E6Co, pGX10/E7Co, pGX10/E67Co, pGX10/E67을 같은 투여량과 간격으로 근육 주사하였다. 최초 근육주사한 날로부터 6.5주 후 쥐의 비장(spleen)을 꺼내고 3μg/ml 의 anti-mouse IFN-γ항체(BD Pharmingen, Sandiego, CA) 50μL로 코팅된 plate에 1X106 cells을 IL-2와 E6 또는 E7 CD8 T 세포 항원결정기 (epitope) (E648-57; EVYDFAFRDL, E749-57; RAHYNIVTF, Peptron, Korea.)를 함께 넣고 37℃ 5％CO2 배양기(incubator)(Forma, Minnesota, USA)에서 24시간 배양하였다. plate를 PBST로 세척후 biotin이 달려있는 IFN-γ 탐지(detecting) 항체(BD Pharmingen, Sandiego, CA) 2μg/mL을 5OμL씩 넣고 약 3시간정도 상온에서 배양하였다. 이후 PBST로 세척하고 streptavidin-AKP(alkaline phosphate)을 1:2000으로 희석하여 50μL씩 넣고 상온에서 1시간 배양하였다. PBST로 세척후 10mL의 알칼리성 인산염 완충액(alkaline phosphate buffer)당 66μL의 NBT(Promega, Madison, WT)와 33μL의 BCIP(Promega, Madison, WT)를 첨가하여 50μL씩 넣고 반응시켰다. 반응에 의한 색이 잘 나타나도록 37℃ 배양기에서 약 30분간 넣어둔 후 멸균된 물(distilled water, D.W)로 세척하고 생성된 점의 개수를 판독기로 읽었다(도1 및 도2 참조).
E6 CD8 T 세포 항원결정기 (epitope)와 E7 CD8 T 세포 항원결정기를 사용하여 E6와 E7에 대한 특이적 T 세포 면역반응을 ELISPOT으로 측정한 결과 pGX10/E67Co는 pGX10/E67 보다 더 높은 항원 특이적 면역 반응이 유도되었으며 이는 코돈최적화가 항원 특이적 면역반응을 증진시키는 데 효과적이라는 것은 보여주고 있다. 또한 pGX10/tE67Co 가 pGX10/E67Co 보다 더욱 높은 CD8 T 세포 면역반응을 유도하는 것으로 보아 분비신호 서열인 tPa 역시 항원 특이적 면역반응을 향상시키는 데 효과 적이라는 것을 확인하였다. pGX10/tE67CoLCo 의 경우 E6 특이적 면역반응의 유도는 pGX10/tE67Co 에 비하여 다고 낮게 유도되었으나 다른 대조군들에 비해서는 높게 유도되었으며, E7 특이적 반응은 거의 같은 수준으로 유도되어 면역반응증진에 효과적이라는 것을 확인하였다. pGX10/tFE67Co 의 경우는 E6 및 E7 특이적 면역반응의 유도에 있어서 가장 높은 효과가 있음을 확인하였다.
최초 주사 후 6.5주에 HPV16 E6와 E7을 발현하는 종양세포인 TC-1을 개체 당 5x105 cells를 피하주사(subcutaneous injection)하고 종양세포의 부피증가를 측정하였다(도3 참고). 특이하게도 E6과 E7 특이적인 면역 반응에서 융합체인 E67Co가 각각 E6Co와 E7Co보다 면역 반응이 낮게 유도되었지만(도1 및 도2 참조), 주입된 TC-1 종양세포에 대해서는 보다 뛰어난 항암 예방 효과를 나타내었다. 이를 통해 항암 효과에 있어 종양 항원인 E6과 E7에 대한 각각의 강한 면역 반응보다는 두 항원에 대한 면역 반응이 동시에 유도될 수 있는 E67 융합체가 더 우수하다는 것을 알 수 있었다. pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co, pGX10/tE67CoLCo 을 주사한 쥐에서는 종양세포를 주사한 후 24일 째 까지 종양의 생성이 없었으며 다른 대조군은 종양세포를 주사한 후 9일째 되는 시점부터 종양의 부피가 급격히 증가하는 것이 관찰 되었다. 따라서 pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co, pGX10/tE67CoLCo 이 자궁경부암을 예방하는 능력이 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실시예 5 : pGX10/tE67 Co , pGX10/tF Co E67 Co , pGX10/tE67 Co L Co 의 자궁경부암 치료효과 확인
pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co, pGX10/tE67CoLCo의 자궁경부암 치료효과를 확인하기 위해 쥐 C57BL/6에 TC-1 종양세포 5x105 cells를 피하주사하고 3일째, 8일째 되는 날 50μg의 양으로 근육 주사하였다. 종양세포를 주사한 날로부터 21일째 되는 날 까지 종양세포의 부피변화를 관찰하고 22일 째 되는 날 쥐의 비장을 꺼내어 실시예 4에서 서술한 바와 같은 방법(ELISPOT)으로 E6 및 E7에 대한 항원 특이적 CD8 T 세포 면역반응의 유도 정도를 측정하였다. 대조군인 pGX10에 비하여 pGX10/tE67 Co, pGX10/tFCoE67Co, pGX10/tE67CoLCo 으로 치료한 쥐에서 높은 항원 특이적 면역반응이 유도되었으며 특히 pGX10/tFCoE67Co 으로 치료한 쥐에서의 면역반응이 가장 높게 측정되어 항암 면역반응을 유도하는 데 탁월한 효능이 있음을 확인하였다(도4 및 도5 참조).
pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co, pGX10/tE67CoLCo 로 TC-1 종양세포에 대한 면역치료를 한 쥐에서는 대조군인 pGX10 을 주입한 쥐에 비하여 현격한 종양부피의 감소를 확인할 수 있었다. 종양세포 주사 후 12일째 까지 계속적인 종양부피의 증가를 보이다가 12일째 이후로는 부피가 감소하기 시작하였으며 특히 pGX10/tFCoE67Co 과 pGX10/tE67CoLCo 로 면역치료를 한 쥐에서는 21일째에 종양부피가 거의 사라지는 것을 확인하여 자궁경부암에 대한 치료효과를 확인하였다(도6 참조).

Claims (41)

  1. 사람 파필로마바이러스 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드, 이를 세포외로 분비시키기 위한 신호 펩타이드 및 개체내 면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드가 사람 파릴로마바이러스 타입 16(HPV16) 또는 18(HPV18)에서 유래된 것인 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드가 서열번호 8인 융합 단백질.
  4. 제2항에 있어서, E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드가 서열번호 14인 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 신호 펩타이드가 tPa, HSV gDs 또는 성장 호르몬 분비 신호 펩타이드인 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, tPa가 서열번호 2인 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 면역 증강 펩타이드가 CD40 리간드, Flt3 리간드, Flagellin 또는 OX40인 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, Flt3 리간드가 서열번호 16인 융합 단백질.
  9. 제7항에 있어서, CD40 리간드가 서열번호 18인 융합 단백질.
  10. 제1항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제10항에 있어서, E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 서열이 사람 파릴로마바이러스 타입 16(HPV16) 또는 18(HPV18)에서 유래된 것인 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제11항에 있어서, E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 서열이 유전자의 발현율을 높이기 위해 포유류에 최적화된 코돈으로 변형된 것인 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제12항에 있어서, E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드가 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제12항에 있어서, E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드가 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제10항에 있어서, 신호 펩타이드가 tPa, HSV gDs 또는 성장 호르몬 분비 신호 펩타이드인 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제15항에 있어서, 신호 펩타이드를 코딩하는 서열이 유전자의 발현율을 높이기 위해 포유류에 최적화된 코돈으로 변형된 것인 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제16항에 있어서, tPa가 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제10항에 있어서, 면역 증강 펩타이드가 CD40 리간드, Flt3 리간드, Flagellin 또는 OX40인 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제18항에 있어서, 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 서열이 유전자의 발현율을 높이기 위해 포유류에 최적화된 코돈으로 변형된 것인 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제19항에 있어서, Flt3 리간드가 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제19항에 있어서, CD40 리간드가 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  22. 제20항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  23. 서열번호 7 또는 서열번호 13의 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 분비 신호 서열 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 분비 신호 서열이 tPa, HSV gDs 또는 성장 호르몬 분비 신호 서열인 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 분비 신호 서열이 코돈 최적화된 벡터.
  27. 제26항에 있어서, tPa가 서열번호 1인 벡터,
  28. 제24항에 있어서, 면역 증강 펩타이드가 CD40 리간드, Flt3 리간드, Flagellin 또는 OX40에서 하나 이상 선택되는 것인 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 서열이 코돈 최적화된 벡터.
  30. 제29항에 있어서, Flt3 리간드가 서열번호 15인 벡터.
  31. 제29항에 있어서, CD40 리간드가 서열번호 17인 벡터.
  32. 제22항의 벡터로 형질전환된 숙주세포
  33. 제23항의 벡터로 형질전환된 숙주세포
  34. 제1항의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 질환이 자궁경부암인 조성물.
  36. 제22항의 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체에서 사람 파필로바이러스에 의하여 야기되는 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 질환이 자궁경부암인 조성물.
  38. 제23항의 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체에서 사람 파필로바이러스에 의하여 야기되는 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 질환이 자궁경부암인 조성물.
  40. 치료학적인 양의 제34항, 제36항 또는 제38항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 치료 또는 예방하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 질환이 자궁경부암인 방법.
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