KR20080108503A - 녹내장을 치료하기 위한 ｊｕｎ ｎ－말단 키나아제 억제제의 용도 - Google Patents

Abstract

IOP의 저하 및/또는 신경보호의 제공을 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 상기 조성물 및 방법은 특히 IOP의 저하 및/또는 신경보호의 제공을 위한 Jun N-말단 키나아제(JNK) 억제제의 용도에 관한 것이다.

Description

녹내장을 치료하기 위한 ＪＵＮ Ｎ－말단 키나아제 억제제의 용도{USE OF INHIBITORS OF JUN N-TERMINAL KINASES TO TREAT GLAUCOMA}

본 출원은 2004년 10월 29일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/623,755호를 우선권으로 주장하는, 2005년 10월 26일자로 출원된 11/259,566호의 일부 계속 출원인, 2006년 3월 31일자로 출원된 미국 출원 번호 11/394,893호를 우선권으로 주장한다.

본 발명은 일반적으로 녹내장 분야에 관한 것이고, 더욱 구체적으로 녹내장을 겪는 환자에서 안압을 저하시키고 신경을 보호하기 위한 Jun N-말단 키나아제(JNK) 억제제의 용도에 관한 것이다.

눈에서의 많은 병리학적 변화, 예컨대, 녹내장, 급성 허혈성 시신경장애, 황반변성, 망막색소변성증, 망막박리, 망막열공 또는 망막원공 및 다른 허혈성 망막증 또는 시신경병증, 망막 뉴런의 사멸 또는 손상 원인은 시력 상실을 초래할 수 있다. 예를 들어, 원발성 개방각 녹내장(POAG)은 시신경 손상 및 결국에는 실명에 이르게 하는 진행성 질환이다. 이 질환의 원인은 수년간 많은 연구의 대상이었지만, 여전히 완벽하게 이해되지 않았다. 녹내장은 망막 및 시신경의 뉴런 변성을 일으킨다. 최상의 의료 및 외과적 치료에도 불구하고, 이는 여전히 망막 신경절 세포(RGC)의 점진적인 상실과 관련되고, 시력 기능의 쇠퇴를 일으킨다(Van Buskirk et al. (1993); Schumer et al. (1994)).

안압(IOP)의 비정상적인 증가는 녹내장의 주요 위험 인자이다. 현재, 녹내장의 유일하게 이용가능한 치료는 약제 또는 수술로 IOP를 저하시키는 것이다. IOP의 저하는 POAG의 진행을 늦추고 그의 손상 효과를 지연시키는데 효과적이다. 그럼에도 불구하고, 녹내장 환자에서의 시각 상실이 언제나 IOP와 관련된 것은 아니며, 단지 IOP만의 저하는 질병 진행을 완전히 멈추게 하지는 않는다.

녹내장 환자에서 일반적으로 관찰되는 병리학 변화의 광범위한 스펙트럼 및 패턴을 단독으로 설명하는데 충분한 하나의 메커니즘은 없다. 녹내장은 하나 이상의 병인론과 관련된 것이 거의 확실하고 여러가지 메커니즘이 다른 환자 및/또는 질환의 다른 단계에서 증명되었다. 더욱 중요한 몇몇의 제안은 신경영양 인자의 부족, 혈관 이상(허혈성) 및 글루타메이트 독성이다. 이들 메커니즘은 실질적으로 RGC의 아포토시스를 유도한다(Clark & Pang (2002)).

동일한 메커니즘이 다른 안구 질환과 관련 있다고 제안되어 왔다. 예를 들어, 신경영양 인자에서 감소는 망막색소변성증의 랫트 모델과 관련 있다(Amendola et al. (2003)). 특정 신경영양 인자를 망막으로 도입 하는 것은 망막색소변성증(Tao et al. (2002)), 망막 박리(Hisatomi et al., (2002); Lewis et al. (1999)) 및 실험적 황반변성(Yamada et al. (2001))에 관련된 망막 손상을 감소시킬 수 있다. 망막 허혈성은 급성 허혈성 시신경장애, 황반변성(Harris et al. (1999)) 및 다른 허혈성 망막증 또는 시신경병증과 관련 있다. 유사하게, 글루타메이트 독성은 망막 박리에서 보여지는 망막 손상에 기여할 수 있다(Sherry & Townes-Anderson (2000)).

미국 특허 출원 번호 US2005/0069893에 녹내장을 진단하기 위한 수단으로서 JNK 유전자 발현의 측정을 기재하고 있지만 녹내장을 겪는 환자에서 안압을 낮추거나 신경을 보호하기 위한 JNK 억제제의 사용을 언급하고 있지는 않다.

현재, 질환 과정에서 안구 조직이 손상됨으로써 메커니즘을 방해하는 녹내장에 대하여 이용가능한 요법은 없다. 또한 고안압증을 저하시키는 능력을 갖는 다양한 치료제가 제안되었지만, 이들 제제의 대부분은 안구 치료제로서 바람직하지 않을 수 있는 부작용을 수반한다. 질환의 기본적인 병리학 원인을 파악하여, IOP를 저하시키는데 사용되는 제제와 관련 있는 바람직하지 못한 부작용 없이 IOP의 감소 및 신경을 보호하는 녹내장 치료가 요망된다.

발명의 요약

본 발명은 녹내장을 겪는 환자에게 고안압증을 감소시키고 신경을 보호하기 위한 조성물 및 방법을 제공함으로써 상기 및 종래 기술의 기타 단점을 해결한다. 상기 조성물 및 방법은 IOP를 저하시키고 신경을 보호하는 적어도 하나의 JNK 억제제를 포함한다.

하기에 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 측면을 더욱 설명하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본원에서 나타낸 특정 구체예의 상세한 설명과 함께 이들 도면을 참조함으로서 더욱 잘 이해될 수 있다.

도 1은 배양된 인간 잔기둥 그물(GTM-3) 세포의 상청액에서 TGFβ2로 자극된(24 시간) 피브로넥틴 수준의 증가에 대한 SP600125의 용량 의존 효과를 나타낸다.

도 2는 선택적 세포 투과성 펩티드 억제제(JNKi-III; Calbiochem cat. # 420130)에 대한 반응 대 세포 투과성 네가티브(스크램블 서열) 대조군 펩티드 (Calbiochem, cat. # 420131)에 대한 반응을 나타낸다. 두개의 시약을 배양된 인간 잔기둥 그물(GTM-3) 세포의 상청액에서 TGFβ2로 자극된(24 시간) 피브로넥틴 수준의 증가에 대한 효과에 대하여 시험하였다.

도 3은 영양 인자와 함께 또는 없이, 글루타메이트(100 μM)와 함께 또는 없이 랫트 RGC 생존에 대한 SP600125의 효과를 나타낸다. 세포를 3일 동안 각각의 조건으로 배양하였다. 생존율을 모든 Thy-1 파지티브 건강 세포를 계수하여 정량하였다.

도 4는 허혈/재관류로 유도된 시신경장애에 대한 SP600125의 효과를 나타낸다. 시신경 손상 지수 1은 손상이 없음을 나타내고, 지수 5는 완전 손상을 나타낸 다. ^*: 스튜던트 t-검정에 의한 비히클로 처리된 그룹에 대한 p < 0.05

도 5는 배양된 성숙 랫트 RGC 생존에 대한 SP600125의 효과를 나타낸다. 세포를 3일 동안 SP600125와 함께 또는 없이 글루타메이트(100 μM)로 처리하였다.

도 6은 배양된 성숙 랫트 RGC 생존에 대한 SP600125의 효과를 나타낸다. 선택된 영양 인자(bFGF, BDNF, CNTF)를 대조군을 제외하고 모든 웰로부터 회수하였다. 세포를 3일 동안 지정된 SP600125의 농축물로 처리하였다(TF = 영양 인자).

바람직한 구체예의 상세한 설명

본 발명은 녹내장을 겪는 환자에게 고안압증을 감소시키고, 안압을 저하시키고/시키거나 신경을 보호하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클 중 하나 이상의 JNK 억제제(들)를 포함한다.

Jun N-말단 키나아제(JNK)는 3개의 유전자, JNK1, JNK2 및 JNK3(Gupta et al. (1996))으로부터 유도된 mRNA 전사물의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 적어도 10개의 아이소형을 포함하는 스트레스로 활성화되는 단백질(stress-activated protein) 키나아제의 일원이다. JNK의 활성은 스트레스로 유도되는 아포토시스의 특정 형태에 요구되고(Tournier et al. (2000)), 이는 세포 내 단백질 및 많은 전사 인자의 인산화반응을 유도하고, 특히 아포토시스(예: Bcl2, Bcl-X_L, p53 등)와 관련 있다. 세포 배양에서, JNK의 활성은 다양한 손상으로 유도되는 뉴런의 아포토시스와 관련 있다(Xia et al. (1995); Le-Niculescu et al. (1999)). JNK3은 영양 인자 제거에 따른 교감 뉴런 사멸에 요구된다(Bruckner et al. (2001)). JNK3결핍 마우스는 카인산으로 유도되는 해마 신경독성에 내성이 있다(Yang et al. (1997)). 이들의 신경보호 작용 때문에, JNK 억제제는 뇌의 퇴행성 질환, 예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 발작 및 허혈성으로 유도되는 뇌 기능장애를 위한 치료제로서 제안되고 있다. 게다가, JNK 신호 전달 경로는 또한 염증과 관련된 일부 분자의 활성 및 물질대사를 조절(Manning & Mercurio (1997))하므로, JNK 억제제는 면역 질환, 예컨대, 류머티즘성 관절염, 천식, 만성 이식 거부, 염증 창자병 및 다발성 경화증의 치료제로서 제안되었다. 추가의 다른 연구는 JNK 억제제는 비만, 제2형 당뇨병의 효능 있는 치료제로서 유용할 것이라고 제시한다[Hirosumi et al. (2002)), 및 cancer(Adjei (2001)].

JNK 억제제는 상기 열거한 다중의 약물학적 작용을 갖지만, 안압을 저하시키고 신경을 보호하는데에 유용하다는 것은 분명하지 않다. 상술한 질병은 녹내장, 증가된 안압 또는 안구 신경보호와 어떠한 관련도 없다. 또한, 뇌에서의 약물의 유용성은 눈에서의 그의 유용성을 보장하는 것이 아니므로, 뇌에서 퇴행성 질환에 유용한 치료제는 다른 안구 질환 또는 RGC의 녹내장의 세포사를 늘 보호하는 것은 아니다. 염증, 면역 이상, 당뇨병, 비만 또는 암은 녹내장, 증가된 안압 또는 안구 신경보호의 병인론으로서 광범위하게 승인되지 않는다.

놀랍게도, 본 발명자들은 Jun N-말단 키나아제의 억제(JNKi)가 인간 잔기둥 그물(TM) 세포주에 의해 변이 성장 인자-베타2(TGFβ2)로 유도된 피브로넥틴 발현을 유의하게 감소시키는 것을 발견하였다(도 1 및 도 2). 피브로넥틴은 TM의 세포 외 기질(ECM)의 성분으로 공지되어 있고 TM 영역에서 ECM의 과도한 축적은 녹내장의 다수 형태의 특징이다. 이러한 증가는 방수 유출의 저항을 증가시킴으로써 안압(IOP)을 상승시킨다고 여겨진다. JNK는 또한 결합 조직 성장 인자(CTGF)의 TGFβ-중재 생산에 대한 신호 전달 경로와 관련 있다(Utsugi et al. 2003). CTGF는 IOP 상승에 중요한 역할을 하고 피브로넥틴을 포함하는 다양한 ECM 성분의 축적을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

비펩티드 JNK 억제제, SP-600125는 배양시 글루타메이트로 유도되거나 영양 인자 제거로 유도된 랫트 망막 뉴런의 사멸, RGC에 대하여 보호적인 것으로 나타났다(공동 계류 중인 미국 출원 번호 11/259.566호 참조). 화합물은 또한 랫트에서 허혈/재관류로 유도된 시신경장애를 보호하는 것으로 발견되었다. 허혈성, 글루타메이트 독성 및 영양 인자의 부족은 녹내장 및 다양한 안구 질환의 잠재적인 기작으로서 제안된 이래, 이들 데이터는 비펩티드 JNK 억제제가 안구 조직에 대한 신경을 보호하기 위한 치료제로서 유용하다는 것을 지적한다.

본원에서 사용된 "JNK 억제제"는 대조군 값보다 50% 이하로 JNK의 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 의미한다. JNK 활성에 대한 화합물의 효능 있는 억제 효과는 당업자에 의해 쉽게 평가될 수 있다. 많은 JNK 활성 어세이 키트는 예를 들어, Stratagene catalog # 205140, Upstate catalog # 17-166 등으로 상업적으로 이용가능하다. 바람직한 관점에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용을 위한 JNK 억제제는 저분자, 펩티드, 펩티드 모방체, 항체 등일 수 있다. 더욱 바람직하게, JNK 억제제는 저분자일 것이다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 유용할 것으로 기대되는 JNK 억제제의 예시는 한정하는 것은 아니나, SP600125 및 모두 참조로 본원에 인용된 특허 출원 번호 WO200035906, WO200035909, WO200035921, WO200064872, WO200112609, WO200112621, WO200123378, WO200123379, WO200123382, WO200147920, WO200191749, WO2002046170, WO2002062792, WO2002081475, WO2002083648, WO2003024967에 기재된 약물학적 활성 화합물을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 유용할 것으로 기대되는 추가적인 바람직한 JNK 억제제는

,

,

를 포함한다.

상기 방법은 인간 환자에 하나 이상의 JNK 억제제를 투여하여 고안압증을 감소시키거나 안압을 저하시키고 신경을 보호하는 것을 포함한다.

본 발명의 JNK 억제제는 당업자에게 공지된 제제 기술에 따라 약제학적 조성물의 다양한 타입에 포함될 수 있다. 일반적으로, JNK 억제제는 국소적 안구 또는 안구내 투여를 위한 용액 또는 현탁액, 또는 전신 투여(예; 경구 또는 정맥 내)를 위한 정제, 캡슐 또는 용액으로서 제제화될 것이다.

JNK 억제제의 경구 제제가 투여의 용이성 때문에 바람직하다. 경구 제제는 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 일반적으로, 경구 제제는 활성 JNK 억제제 및 비활성 부형제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 고체 정제 또는 캡슐 복용형은 다양한 부형제, 예컨대, 벌킹제(bulking agent), 결합제, 서방형 코팅 등을 첨가할 수 있다. 액체 복용형은 담체, 버퍼, 등장화제, 용화제 등을 포함할 것이다.

일반적으로, 상술한 목적을 위하여 사용되는 용량은 변화될 것이지만, 망막 신경장애를 억제 또는 개선시키는 유효량일 것이다. 본원에서 사용된 용어 "약제학적 유효량"은 안압을 저하시키고 망막 신경장애를 억제 또는 개선하는 양을 의미한다. JNK 억제제는 일반적으로 약 0.01 내지 약 10.0 중량/퍼센트의 양으로 이들 제제에 포함될 것이다. 바람직한 농도는 약 0.1 내지 약 5.0 중량/퍼센트의 범위이다. 국소 투여를 위하여, 이들 제제는 숙련된 임상의의 통상적인 처방에 따라, 하루에 1 내지 6회 질환 부위에 전달된다. 치료에 유용한 전신 투여, 예를 들어, 정제 또는 액체의 형태는 약 10-1000 mg의 JNK 억제제를 포함할 수 있고, 숙련된 임상의의 처방에 따라, 하루에 1-4회 섭취될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 본 발명의 유효량의 적어도 하나의 JNK 억제제의 바람직한 투여 경로에 대하여 적절한 전달을 제공하고, 안전한 임의의 제제를 의미한다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위하여 포함된다. 이후 실시예에 기재된 기술은 본 발명을 수행하는데 충분히 작용하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 이의 수행을 위하여 바람직한 모드의 구성이 고려될 수 있음을 당업자들은 이해할 것이다. 그러나 당업자들은 본 발명의 기재에서 많은 변화가 개시된 특정 구체예에서 이루어질 수 있으며, 본 발명의 관점 및 범위에서 벗어나는 일 없이 동일하거나 유사한 결과가 수득될 수 있음을 이해할 것이다.

실시예 1

피브로넥틴 어세이

배양된 형질전환된 인간 TM 세포를 이 연구에 사용하였다. GTM-3 형질전환 세포주의 생성 및 특성은 이미 기재되어 있다[Pang IH, et al., Curr Eye Res. 1994; 13:51-63]. 유지 증식 배지는 10% 우태아혈청(Hyclone, Logan, UT) 및 50 μg/mL 젠타마이신(Gibco/BRL)으로 보충된 글루타맥스(Glutamax) I(Gibco/BRL, Grand Island, NY)를 함유한 둘베코의 변형된 이글(Dulbecco's modified Eagle's) 배지로 구성하였다. 어세이를 위하여, 배양물을 트립신처리하고 24-웰 플레이트(Corning Costar, Acton, MA)에 접종하고 단일층이 약 90% 합류(confluence)에 도달할 때까지 증식시켰다. 이어서 배양 배지를 적절한 시험 화합물(들)을 포함하는, 항생제 무함유 및 0.25 mL 혈청 무함유 배지로 대체하였다. 세포를 5% CO₂ 및 37℃에서 24 시간 배양하였다. 이어서 배양 상청액의 분취물을 ELISA로 피브로넥틴 함량에 대하여 분석하였다.

JNK 억제제, SP600125의 효과 평가 실험에서, 세포를 화합물 및 TGFβ2(5 ng/mL)와 배양하였다. TGFβ2는 TM 세포에 의한 피브로넥틴 생산의 공지된 유도인자이다. SP600125는 TGFβ2로 처리한 GTM-3 세포 상청액에서 피브로넥틴의 수준을 용량 의존적으로 감소시킨다. 이 결과를 도 1에 나타내었다. JNK의 역할은 또한 선택적, 세포 투과성 펩티드 JNK 억제제의 사용으로 명백해졌다. SP600125와 펩티드 억제제의 공동배양은 GFβ2로 처리한 GTM-3 세포 상청액에서 피브로넥틴의 수준을 용량 의존적으로 감소시켰다. 이 결과는 세포 투과성 네가티브(스크램블 서열) 대조군 펩티드의 효과의 결여와 대조를 이룸으로써, 이 연구에서 JNK의 중요한 역할이 확실하게 되었다. 이들 펩티드의 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 2

하기 실시예는 망막 세포에 대한 세포독성 손상에 대하여 JNK 억제제의 보호 효과를 증명한 것이다.

랫트 망막 신경절 세포 생존 어세이

성숙 스프래그-돌리 랫트를 CO₂ 질식으로 안락사시켰다. 그들의 눈을 적출하고 둘베코의 변형된 이글 배지:영양 혼합물 F12(1:1; DMEM/F12)에 두었다. 망막을 37℃에서 25분 동안 DMEM/F12 중의 우혈청 알부민(0.4 mg/㎖), 파파인(34 유닛/mL) 및 DL-시스테인(3.3 mM)을 함유하는 파파인 용액에 선배양하였다. 이어서 망막 조각을 세포가 없어질때까지 분쇄하였다. 세포 현탁액(1.5 ㎖; 약 4.5 x 10⁶ 세포 함유)을 각각 폴리-D-리신이 코팅된 유리 바닥 배양 디쉬에 두었다. 세포를 37℃, 95% 공기/5% CO₂에서 3일 동안 Barres 등(1988)이 앞서 기재한 배양 배지에서 배양하였다.

세포 생존에 대한 글루타메이트의 독성을 평가하는 실험에서, 세포를 3일 동안 100 μM 글루타메이트와 배양하였다. 세포 생존에 대한 신경영양 인자 제거의 유해 효과를 평가하는 실험에서, 기본 섬유모세포 성장 인자, 뇌-유래의 영양 인자 및 섬모-유래의 신경영양 인자를 배지로부터 제거하고 세포를 3일 동안 배양하였다. JNK 억제제, SP600125의 효능 있는 보호 효과를 평가하는 실험에서, 세포를 글루타메이트 존재 하에 또는 지정된 영양 인자 부재 하에 3일 동안 화합물과 함께 배양하였다. 3일 배양 기간 끝에, 세포를 RGC의 세포 표면 마커, Thy-1에 대하여 면역염색하고, 형광 현미경 하에 관찰하였다. Thy-1-파지티브 세포를 계수하고 평균을 내었다. 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 배양 배지로부터의 신경영양 인자의 제거(TF 제거)가 대조군의 약 50%로 RGC 사멸을 일으키므로, RGC의 생존이 지정된 신경영양 인자의 존재에 좌우된다는 것을 나타낸다. SP600125와 함께 세포를 배양하면 이러한 손상에 대하여 세포는 유의하고 완전하게 보호되었다. 도 3은 또한 배양 배지에 100 μM 글루타메이트의 첨가가 세포 생존을 약 50%까지 감소시키므로, 글루타메이트가 RGC에 대하여 독성임을 나타낸다. 다시 말해, SP600125와 함께 세포를 배양하면 이러한 세포독성에 대하여 세포는 유의하고 완전하게 보호된다.

실시예 3

하기 실시예는 랫트에서 허혈성으로 유도된 시신경장애에 대한 JNK 억제제의 보호 효과를 증명하는 것이다.

랫트에서 허혈/재관류로 유도된 시신경장애

성숙 위스타(Wistar) 랫트를 마취시키고 각 동물의 눈의 전방에 캐뉼러를 꽂았다. 캐뉼러를 그의 높이가 망막 혈류를 멈추게함으로써 망막 허혈성을 생산하는 동물의 수축 기압보다 높은 안압을 생산하도록 조절되는 높아진 살린 저장소에 연결하였다. 허혈 60분 후, 앞방내 캐뉼러를 제거하여 망막을 재관류시켰다. 2주 후, 랫트를 안락사시키고, 그들의 시신경을 분리하고, 0.1 M 카코딜레이트 완충 용 액 중의 2.5% 글루타르알데히드, 2% 파라포름알데히드로 고정하고, 절단하고, Hollander 및 Vaaland (1968)에 의해 기재된 바와 같이 제조된 이소프로판올:메탄올(1:1) 중의 1% p-페닐렌디아민으로 염색하였다. 각 시신경 절단 부분에서 시신경 손상은 Pang 등(1999)에 의해 앞서 보고된 바와 같이 시신경 손상 지수로 분류하였다. 이 분류 시스템에서, 지수 1은 손상이 없음을 나타내고, 지수 5는 완전 손상을 나타낸다.

SP600125의 효능 있는 보호 효과를 시험하기 위하여, 선택된 동물을 허혈성 유도 시작 2일 전에 16일 동안 매일 SP600125로 연속 복강 내 주사(30 mg/kg)로 처리하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 허혈/재관류가 시신경 손상 지수의 현저한 증가에 의해 보여지는 바와 같이 시신경에 대한 유의적인 손상을 일으킴을 나타낸다. 또한 SP600125의 전신적 투여는 시신경 손상 지수의 유의적인 감소에 의해 나타내어지는 바와 같이 망막에 대한 허혈성 손상을 보호할 수 있다는 것을 증명한다.

실시예 4

JNK 억제제, SP600125를 배양된 성숙 랫트 망막 신경절 세포(RGC)에서 시험하였다. 이는 글루타메이트로 유도되는 세포독성 및 영양 인자 제거로 유도되는 세포 독성 모두를 보호하는 것으로 나타났다.

방법

A. RGC 배양

성숙 스프래그-돌리 랫트를 CO₂ 질식으로 안락사시켰다. 그들의 눈을 적출하고 망막을 분리하였다. 망막 세포를 37℃에서 25분 동안 파파인 용액으로 처리한 다음, 5 mL RGC 배양 배지[다양한 영양 보충제 + 1% 우태아혈청을 함유한 신경기반(Neurobasal) 배지]로 3회 세정하였다. 망막 세포를 분쇄하여 분산시켰다. 세포 현탁액을 폴리-D-리신 및 라미닌이 코팅된 8-웰 챔버 배양 슬라이드에 두었다. 이어서 세포를 95% 공기/5% CO₂에서 배양하였다.

B. 세포독성 손상

글루타메이트로 유도된 독성 연구를 위하여, 세포를 비히클로 전처리하거나 30분 동안 화합물과 배양한 다음, 3일 동안 100 μM 글루타메이트와 배양하였다.

영양 인자 제거 연구를 위하여, 3개의 영양 인자인 기본 섬유모세포 성장 인자, 뇌-유도 신경영양 인자 및 섬모 신경영양 인자를 배양 배지로부터 제거하였다. 세포를 3일 동안 지정된 화합물과 함께 이 배지에서 배양하였다.

C. 세포 생존성의 정량화

배양 기간 마지막에, 세포를 고정하고 면역 세포 화학에 의해 RGC 마커, Thy-1에 대하여 표지하였다. 세포 생존성을 각각의 웰에서 Thy-1-파지티브 건강 세포를 지침에 따라 계수함으로써 정량하였다.

결과

A. 랫트 RGC에서 글루타메이트로 유도된 독성에 대한 SP600125의 효과

글루타메이트는 랫트 RGC에 대하여 독성이라는 것을 앞서 보여주었다; 세포 의 50-70%만이 100 μM 글루타메이트의 처리 3일 후 생존하였다. 이들 세포에서 글루타메이트로 유도된 독성은 MK801의 전처리에 의해 예방될 수 있다. SP600125는 용량 의존 방식으로 이 손상을 보호하였다(도 5).

B. RGC에서 영양 인자 제거로 유도된 독성에 대한 SP600125의 효과

앞서, 3일 동안 3개의 영양 인자의 제거는 세포의 약 40-50%의 사멸을 일으켰다. SP600125는 용량 의존 방식으로 이 손상을 보호하였다(도 6).

실시예 5

녹내장 및 다른 안구 질환의 치료에 유용한 국소 조성물:

성분	wt.%
JNK 억제제	0.1-5
HPMC	0.01-10
벤즈알코늄 클로라이드	0.005-0.5
소듐 클로라이드	0.5-2.0
에데테이트 디소듐	0.005-0.5
NaOH/HCl	q.s.pH 7.4
정제수	q.s.100 mL

먼저 정제수의 일부를 비이커에 두고 90℃로 가열함으로써 상기 제제를 제조하였다. 이어서 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC)를 가열된 물에 첨가하고 HPMC가 분산될 때까지 교반하면서 격렬히 와동시켜 혼합하였다. 이어서 HPMC을 수화시키기 위하여, 결과의 혼합물을 혼합하면서 냉각시켰다. 이어서 결과의 용액을 액체 주입구 및 소수성, 멸균 공기 벤트 필터가 장착된 용기에서 오토클레이브로 살균시켰다.

이어서 소듐 클로라이드 및 에데테이트 디소듐을 정제수의 제 2 부분에 첨가 하고 용해시켰다. 벤즈알코늄 클로라이드를 용액에 첨가하고, 용액의 pH가 7.4가 되도록 0.1 M NaOH/HCl로 조정하였다. 이어서 용액을 여과하여 살균하였다.

SP600125를 건열 또는 에틸렌 옥사이드로 살균하였다. 에틸렌 옥사이드 살균을 선택할 경우, 50℃에서 적어도 72 시간 동안의 에어레이션(aeration)이 필요하다. 살균된 화합물의 무게를 무균적으로 측정하고 가압된 발밀(ballmill) 컨테이너에 두었다. 이어서 살균된 유리볼을 컨테이너에 첨가한 다음 컨테이너의 내용물을 16 시간 동안 225 rpm에서 또는 모든 입자가 약 5 마이크론의 범위가 될때까지 무균적으로 분쇄하였다.

이어서 무균 조건 하에, 앞선 단계의 방법으로 형성된 미분된 약물 현탁액 또는 용액을 혼합하면서 HPMC 용액에 부었다. 이어서 여기에 포함된 발밀 컨테이너 및 볼을 소듐 클로라이드, 에데테이트 디소듐 및 벤즈알코늄 클로라이드를 함유하는 용액의 일부로 세정하였다. 세정 용액을 무균적으로 HPMC 용액에 첨가하였다. 이어서 용액의 최종 부피를 정제수로 조정하고, 경우에 따라, 용액의 pH가 7.4가 되도록 NaOH/HCl로 조정하였다.

실시예 6

국소 투여에 바람직한 제제 :

성분	wt.%
JNK 억제제	0.1-5
HPMC	0.5
벤즈알코늄 클로라이드	0.01
소듐 클로라이드	0.8
에데테이트 디소듐	0.01
NaOH/HCl	q.s.pH 7.4
정제수	q.s.100 mL

실시예 7

경구 투여용 제제 :

정제:

스타치, 락토오스 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 불활성 성분을 함유한 1-1000 mg의 JNK 억제제는 정제 제제의 업자들에게 공지된 절차로 제제화될 수 있다.

본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 명세서의 관점에서 과도한 실험없이 제조될 수 있고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구체예의 용어로 기재되었지만, 변화가 조성물 및/또는 방법 및 본원에서 기재된 방법의 단계 또는 연속적인 단계에서 본 발명의 개념, 관점 및 범위를 벗어나는 일 없이 당업자들에 의해 적용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 이는 화학적 및 구조적으로 관려된 특정 제제가 유사한 결과를 달성하기 위하여 본원에 기재된 제제에 대하여 치환될 수 있음이 자명할 것이다. 당업자들에게 자명한 이러한 모든 치환 및 변경은 첨부된 청구항에 의해 한정되는 본 발명의 개념, 영역 및 취지에 드는 것으로 고려된다.

참조

하기 참조는, 예시적인 절차 또는 본원에 개시된 것에 대한 다른 상세한 보충을 제공하는 정도로, 특히 본원에서 참조로 인용된다.

특허 및 공개된 특허 출원

WO200035906

WO200035909

WO200035921

WO200064872

WO200112609

WO200112621

WO200123378

WO200123379

WO200123382

WO200147920

WO200191749

WO2002046170

WO2002062792

WO2002081475

WO2002083648

WO2003024967

기타 문헌

Claims (12)

1. 유효량의 하나 이상의 Jun N-말단 키나아제(JNK) 억제제 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는, 녹내장을 겪는 환자에서 안압을 저하시키기 위한 조성물.
2. 제 1항에 있어서, JNK 억제제는 SP600125,

   

   

   로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 경구 제제임을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 국소적 안구용 수술 관주액 또는 안구내 제제임을 특징으로 하는 조성물.
5. 유효량의 하나 이상의 JNK 억제제(들) 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 조성물을 인간 환자에 투여하는 것을 포함하는, 고안압증의 감소 방법.
6. 제 5항에 있어서, JNK 억제제는 SP600125,

   

   

   로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5항에 있어서, 조성물은 경구 제제임을 특징으로 하는 방법.
8. 제 5항에 있어서, 조성물은 국소적 안구용 수술 관주액 또는 안구내 제제임을 특징으로 하는 방법.
9. 유효량의 하나 이상의 JNK 억제제(들) 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 조성물을 인간 환자에 투여하는 것을 포함하는, 안압을 저하시키고 신경을 보호하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, JNK 억제제는 SP600125,

    

    

    로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9항에 있어서, 조성물은 경구 제제임을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10항에 있어서, 조성물은 국소적 안구용 수술 관주액 또는 안구내 제제임을 특징으로 하는 방법.

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