KR20080106894A

KR20080106894A - 물질의 핵생성을 유도하는 방법

Info

Publication number: KR20080106894A
Application number: KR1020087019455A
Authority: KR
Inventors: 테오도어 홀 3세 가스테이어; 로버트 렉스 세버; 발라즈 후네크; 니겔 그린테르; 멜린다 리 버돈
Original assignee: 프랙스에어 테크놀로지, 인코포레이티드
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2008-12-09
Also published as: KR101265382B1; US9453675B2; CA2640833A1; BRPI0707390A2; JP5301288B2; CA2640833C; BRPI0707390B1; WO2007095034A3; IL192479A0; JP2009525867A; AU2007215419B2; NO20083550L; US20070186567A1; AU2007215419A1; WO2007095034A2; ES2542993T3; EP1982133A2; EP1982133B1

Abstract

본 발명은 물질의 핵생성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, 상기 물질을 상전이 온도 부근의 온도 또는 상전이 온도 미만의 온도로 만드는 단계, 및 압력을 저하시켜서 상기 물질의 핵생성을 유도하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 냉동 건조 과정, 특히 의약의 냉동 건조 과정에 유용하다.

핵생성, 동결건조, 냉동 건조, 상전이 온도, 감압

Description

물질의 핵생성을 유도하는 방법{METHOD OF INDUCING NUCLEATION OF A MATERIAL}

관련 출원에 대한 고찰

본 출원은 2006년 2월 10일자 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 제60/771,868호에 대한 우선권을 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 핵생성(nucleation) 방법, 더욱 구체적으로는 물질을 먼저 상 전이 온도 부근 또는 상 전이 온도 미만의 온도에 도달하게 한 후에 물질의 핵생성을 유도하도록 감압시켜서 물질에서 상전이의 핵생성을 유도하는 방법에 관한 것이다.

당해 기술 분야에서, 냉동 건조(freeze-drying)를 완결하는데 필요한 처리 시간을 줄이고, 최종 제품에서 바이알 사이의 제품 균일성을 증가시키기 위해서, 동결 건조(lyophilization) 또는 냉동 건조 방법의 냉동 단계에서 일반적으로는 랜덤한 핵생성 과정을 제어하는 것이 매우 바람직하다. 전형적인 의약의 냉동 건조 방법에서는, 공통된 수용액을 함유하는 여러 개의 바이알들을, 일반적으로 제어된 속도하에 저온으로 냉각되는 선반상에 배치한다. 각 바이알내의 수용액은 당해 용액의 열역학적 빙점 미만으로 냉각되며, 핵생성이 일어날 때까지 과냉각된(sub- cooled) 준안정 액체 상태로 유지된다.

바이알 사이의 핵생성 온도 범위는 열역학적 빙점 부근의 온도에서 열역학적 빙점보다 현저하게(예를 들면, 약 30℃에 이르는 온도만큼) 더 낮은 값 사이에 무작위 분포된다. 이러한 핵생성 온도의 분포는 얼음 결정 구조면에서 바이알 사이의 변화를 유발하고 결국에는 동결 건조된 제품의 물리적 특성 사이의 변화를 유발한다. 더욱이, 냉동 건조 방법의 건조 단계는 자연적인 확률적 핵생성 현상에 의해 생성된 얼음 결정 크기 및 구조의 범위를 수용할 정도로 극히 길어야 한다.

과냉각된 용액의 핵생성 온도를 증가시키기 위해서 첨가제를 사용한 바 있다. 이러한 첨가제들은 여러 가지 형태를 취할 수 있다. 특정의 박테리아(예: 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae)는 과냉각된 수용액에서 핵생성 얼음 형성을 보조하는 단백질을 합성하는 것으로 알려져 있다. 상기 박테리아 또는 이들의 단리된 단백질을 용액에 첨가하여 핵생성 온도를 상승시킬 수 있다. 또한, 몇 가지 무기 첨가제들도 핵생성 효과를 갖는 것으로 입증되었으며; 이러한 첨가제중 가장 흔하게 사용되는 것은 요오드화은, 즉, AgI이다. 일반적으로, 어떠한 첨가제 또는 오염물질이라도 핵생성제로서 작용할 가능성을 갖는다. 고농도의 입자들을 함유하는 환경에서 제조된 동결건조 바이알들은 저농도의 입자 환경에서 제조된 바이알들보다 낮은 과냉각도에서 핵을 생성하고 냉동될 것이다.

전술한 바와 같은 모든 핵생성제들은 "첨가제"로서 표기되는데, 그 이유는 이러한 핵생성제들이 상 전이에서 핵생성을 하는 매체의 조성을 변화시키기 때문이다. 이러한 첨가제들은 FDA에 의해 규제 및 승인되는 냉동 건조 의약품에는 허용 되지 않는다. 또한, 이러한 첨가제들은 바이알이 핵을 생성하고 냉동할 때 시간 및 온도에 대한 제어 수단을 제공하지 않는다. 오히려, 상기 첨가제들은 바이알의 평균 핵생성 온도를 증가시키는 작용을 할 뿐이다.

얼음 결정 자체는 과냉각된 수용액에서 얼음 형성을 위한 핵생성제로서 작용할 수 있다. "얼음 안개(ice fog)" 방법에서, 습한 냉동 건조기에 저온의 기체를 충전하여 얼음 소립자의 증기 현탁물을 생성한다. 얼음 입자들을 바이알로 옮겨서 그 입자들이 유체 계면과 접촉될 때 핵생성을 개시한다.

"얼음 안개" 방법은 제어된 시간 및 온도하에 동시에 여러 개의 바이알들의 핵생성을 제어하지는 못한다. 다시 말하면, 냉동 건조기내로 저온의 증기를 주입할 때 모든 바이알 내부에서 동시에 또는 즉각적으로 핵생성이 일어나지 않는다. 얼음 결정들은 그 자체가 각각의 바이알에 작용하여 핵 형성을 개시하기 위해서는 얼마간의 시간을 소요할 것이며, 냉동 건조기 내부의 위치에 따라서 바이알들에 대한 이동 시간이 상이할 것으로 보인다. 대규모의 공업용 냉동 건조기의 경우에, "얼음 안개" 방법을 실시하기 위해서는 냉동 건조기 전반에 걸쳐 "얼음 안개"의 균일한 분포를 도모하기 위해서 내부 대류 장치가 필요할 수 있기 때문에 시스템 설계의 변경이 필요할 것이다. 냉동 건조기 선반이 연속적으로 냉각될 경우에, 제 1 바이알이 냉동할 때와 최종 바이알이 냉동할 때 사이의 시간 차이가 바이알들간의 온도 차이를 유발하여, 냉동 건조된 제품에서 바이알간의 비균일성을 증가시킬 것이다.

핵생성에 필요한 과냉각 정도를 낮추기 위해 바이알에 선을 긋거나, 스크래 치를 만들거나 표면을 거칠게 함으로써 전처리하는 방법을 사용한 바 있다. 다른 종래 기술의 방법들과 마찬가지로, 바이알의 전처리 방법도 각각의 바이알이 핵을 생성하여 냉동할 때 시간 및 온도에 대한 제어를 전혀 제공하지 않으며, 그 대신에 모든 바이알의 평균 핵생성 온도를 증가시킬 뿐이다.

준안정 물질에서 상전이의 핵생성을 유도하기 위해 진동법을 사용한 바 있다. 핵생성을 유도하는데 충분한 진동은 10 kHz를 넘는 주파수에서 일어나며, 다양한 장치를 사용하여 진동을 발생시킬 수 있다. 일반적으로는 10 kHz 내지 20 kHz 범위내의 주파수가 사람의 가청 범위내에 존재하지만, 상기 주파수 범위내의 진동은 "초음파"로 명명되는 경우가 많다. 초음파 진동은 과냉각된 용액중에 캐비테이션(cavitation) 또는 작은 기포 형성을 일으키는 경우가 많다. 일시적이거나 관성적인 캐비테이션 상황에서, 기포는 빠르게 성장하고 충돌함으로써 매우 높은 국소 압력 및 온도 변동을 유발한다. 초음파 진동이 준안정 물질에서 핵생성을 유도하는 능력은 흔히 일시적인 캐비테이션에 의해 유발되는 교란에 기인한다. 안정하거나 비관성적인 것으로 일컬어지는 다른 캐비테이션 상황은 기포들이 충돌없이 안정한 용적 또는 형태의 진동을 나타낸다는 것을 특징으로 한다. 미국 특허 출원 제 20020031577 A1호는 초음파 진동이 안정한 캐비테이션 상황에서도 핵생성을 유도할 수 있다고 개시하고 있지만, 이러한 현상에 대한 설명은 제공되어 있지 않다. 또한, 영국 특허 출원 제 2400901A호는 10 kHz를 넘는 주파수에서의 진동을 사용하여 용액중에서 캐비테이션, 따라서 핵생성을 일으킬 수 있는 가능성이 상기 용액 주위의 압력을 감소시키거나, 상기 용액에 휘발성 유체를 용해시킴으로써 증가될 수 있다고 개시하고 있다.

종래 전자냉동(electrofreezing) 방법을 사용하여 과냉각된 액체에서 핵생성을 유도한 바 있다. 전자냉동 방법은 일반적으로 비교적 높은 전기장(~ 1 V/nm)을 과냉각된 액체 또는 용액중에 좁은 간격으로 침지된 전극들 사이에 연속적으로 또는 펄스식으로 전달함으로써 수행된다. 전형적인 동결건조 용도에서 전자냉동 방법과 관련된 단점으로는, 특히 여러 개의 바이알 또는 용기를 사용하는 동결건조 용도에서 실시 및 유지하기가 비교적 복잡하고 비용이 많이 든다는 점을 들 수 있다. 또한, 전자냉동 방법은 이온성 화학종(예: NaCl)을 함유하는 용액에는 직접 적용할 수 없다.

최근에, '진공 유도 표면 냉동(vacuum-induced surface freezing)"의 개념을 조사한 연구가 발표되었다(미국 특허 제 6,684,524호 참조). 이와 같은 '진공 유도 표면 냉동" 방법에서, 수용액을 함유한 바이알들을 냉동 건조기내의 온도 제어된 선반상에 배치하고 초기에는 섭씨 약 10도로 유지시킨다. 이어서, 냉동 건조 챔버를 진공 압력 부근으로(예: 1 mbar) 배기시켜서, 수용액의 표면을 수 밀리미터 깊이까지 냉동시킨다. 이어서 진공을 해제하고 선반 온도를 용액의 빙점 미만으로 감소시키면, 용액의 나머지 부분을 통해서 미리 냉동된 표면층으로부터 얼음 결정들이 성장할 수 있다. 전형적인 동결건조 용도에서 상기 '진공 유도 표면 냉동' 방법을 실시함에 있어서 주요 단점은, 전술한 조건하에서 용액이 돌비하거나 기체를 방출할 위험이 높다는 것이다.

핵생성 방법의 개선된 제어 방법이 있다면, 보다 좁은 온도 및 시간 범위내 에서 냉동 건조기내의 모든 냉동되지 않은 의약 용액 바이알들의 냉동이 일어날 수 있도록 함으로써, 바이알 사이의 균일성이 보다 큰 동결건조 제품을 제조할 수 있을 것이다. 최저 핵생성 온도를 제어하면 바이알 내부에서 형성된 얼음 결정 구조에 영향을 미칠 수 있으며, 냉동 건조 방법을 더욱 촉진할 수 있다.

그러므로, 냉동 건조를 완결하는데 필요한 처리 시간을 줄이고 최종 제품에서 바이알 사이의 제품 균일성을 향상시키기 위해서, 냉동 건조 또는 동결건조 방법의 냉동 단계를 비롯한 다양한 냉동 방법에서 핵생성의 랜덤한 과정을 제어할 필요성이 있다. 따라서, 전술한 바와 같은 특징들을 어느 정도, 바람직하게는 전부 갖는 방법을 제공하는 것이 바람직하다.

발명의 개요

본 발명은 물질에서 상전이의 핵생성을 유도하는 방법을 제공하며, 본 발명의 방법은 물질을 당해 물질의 상전이 온도 부근 또는 미만의 온도로 만드는 단계, 및 압력을 감소시켜서 상기 물질의 상전이의 핵생성을 유도하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 용액을 정해진 냉각 속도로 냉각시키는 단계; 압력을 급속 저하시켜서 상기 용액의 핵생성을 유도하는 단계; 및 핵생성된 용액을 계속해서 정해진 최종 온도까지 냉각시켜서 상기 용액을 냉동시키는 단계를 포함하는, 용액의 냉동 과정을 제어하는 방법을 제공한다. 감압 단계는 상기 용액이 소정의 핵생성 온도에 도달하였을 때 또는 상기 냉각 단계를 개시한 후 소정의 시간이 경과하였을 때 개시한다.

이외에도, 본 발명은 물질을 상전이 온도 부근 또는 미만으로 냉각시키는 단계; 상기 물질 근처의 압력을 급속 저하시켜 상기 물질의 핵생성을 유도하는 단계; 및 상기 핵생성된 물질을 소정의 최종 온도까지 계속해서 냉각시켜 상기 물질의 응고를 도모하는 단계를 포함하는, 응고 방법이 제공된다.

마지막으로, 본 발명은 기체를 상전이 온도 부근 또는 미만으로 냉각시키는 단계; 압력을 급속 저하시켜서 상기 기체 내부에 핵생성을 유도하는 단계; 및 상기 핵생성된 기체를 소정의 최종 온도까지 계속해서 냉각시켜 상기 기체를 응축시키는 단계를 포함하는, 기체의 응축 과정을 제어하는 방법이 제공된다.

이하에서는 본 발명의 상기 특징과 다른 특징, 실시양태 및 장점을 첨부 도면과 관련하여 더욱 상세히 설명하고자 한다.

도 1은 확률적인 핵생성 과정을 거치는 용액의 온도 대비 시간 그래프를 상기 용액의 핵생성 온도 범위와 함께 도시한 도면이다.

도 2는 본 발명의 방법에 따라서 감압 핵생성을 이용한 평형 냉각 과정을 거치는 용액의 온도 대비 시간 그래프이다.

도 3은 본 발명의 방법에 따라서 감압 핵생성을 이용한 동적 냉각 과정을 거치는 용액의 온도 대비 시간 그래프이다.

발명의 상세한 설명

핵생성은 물질의 작은 영역에서 상전이가 시작되는 것이다. 예를 들면, 이와 같은 상전이는 액체로부터 결정이 형성되는 것일 수 있다. 흔히 용액의 냉동과 관련된 이러한 결정화 과정(즉, 용액으로부터 고체 결정이 형성되는 것)은 핵생성 단계로 시작한 후에 결정 성장이 이루어진다.

이와 같은 결정화 과정에 있어서, 핵생성은 상기 용액 또는 다른 물질에 분산된 선택된 분자들이 모여서 당해 작업 조건하에 안정화될 정도의 나노미터 수준의 클러스터(cluster)를 형성하기 시작하는 단계이다. 이러한 안정한 클러스터들이 핵을 구성한다. 클러스터들은 안정한 핵이 되기 위해서는 임계 크기에 도달할 필요가 있다. 이러한 임계 크기는 일반적으로 온도, 오염물질, 포화도 등과 같은 작업 조건에 의해 정해지며, 용액의 샘플마다 달라질 수 있다. 핵생성 단계 동안에 용액중의 원자들이 결정 구조를 정하는 한정된 주기적인 방식으로 배열한다.

결정 성장은 임계 클러스터 크기에 도달하는데 성공한 핵들이 후속해서 성장하는 것이다. 조건에 따라서 핵생성 또는 결정 성장중 어느 하나가 다른 하나보다 우위에 있을 수 있으며, 그 결과 크기와 형태가 상이한 결정들이 얻어진다. 결정 크기 및 형태를 제어하는 것이 제약과 같은 공업적인 제조 방법에서 주요 과제중 하나이다.

본 발명의 방법은 물질에서 핵생성된 상전이가 일어나는 시간 및/또는 온도를 제어하는 방법에 관한 것이다. 냉동 용도에서, 물질이 자발적으로 핵을 생성하고 상 변화를 일으키기 시작할 가능성은 물질의 과냉각도 및 핵생성에 사용되는 부위 또는 표면을 제공하는 오염물질, 첨가제, 구조 또는 교란의 존재 여부와 관련이 있다.

냉동 또는 응고 단계는 기존의 기법들이 여러 개의 바이알 또는 용기 사이에 서 핵생성 온도 차이를 유발하는 냉동 건조 방법에서 특히 중요하다. 핵생성 온도 차이는 균일하지 않은 제품을 생성하고 과도하게 긴 건조 시간을 필요로 하는 경향이 있다. 이와 달리, 본 발명의 방법은 회분식 응고 방법(예: 냉동 건조)에서 공정 제어도가 높고 보다 균일한 구조 및 특성을 갖는 제품을 생성한다. 핵생성을 유도하기 위한 일부 종래 기술의 기법들과는 달리, 본 발명의 방법은 실시하는데는 최소의 장치와 작업 변화만이 필요하다.

원칙적으로, 본 발명의 방법은 핵생성 상전이를 포함하는 어떠한 물질 가공 단계에라도 적용될 수 있다. 이와 같은 가공의 예로서는, 액체의 냉동, 수용액으로부터 얼음의 결정화, 용융물로부터 중합체 및 금속의 결정화, 과포화 용액으로부터 무기 물질의 결정화, 단백질의 결정화, 인공 눈 제조, 증기로부터 얼음의 석출, 냉동 농축, 분별 결정, 저온보존 또는 증기를 액체로 응축시키는 것을 들 수 있다. 개념적인 관점에서 볼 때 본 발명의 방법은 용융 및 비등과 같은 상 전이에도 적용될 수 있다.

본 발명의 방법은 기존의 제약 동결건조 방법에 비해 개선된 효과를 나타낸다. 예를 들면, 거대한 공업용 냉동 건조기 내부에는, 냉동 건조를 필요로 하는 의약품을 함유하는 100,000개 이상의 바이알들이 존재할 수 있다. 현재 공업 시행 규칙은, 냉동 건조기내의 모든 바이알 또는 용기내의 용액이 확실히 냉동될 수 있도록 상기 용액을 고도로 냉각시키는 것이다. 그러나, 핵생성 과정이 제어되지 않기 때문에 각각의 바이알 또는 용기의 내용물은 빙점 미만의 온도 범위에서 랜덤하게 냉동된다.

도면중 도 1을 참조하면, 통상의 확률적 핵생성 과정을 거치는 수용액을 함유하는 6개의 바이알에 대하여 온도 대비 시간 그래프가 바이알 내부의 용액의 대표적인 핵생성 온도 범위(11, 12, 13, 14, 15 및 16)과 함께 도시되어 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 바이알 내용물의 열역학적 빙점은 약 0℃이지만, 영역(18)로 표시된 바와 같이, 각 바이알 내부의 용액은 약 -7℃ 내지 -20℃ 또는 그 이상의 넓은 온도 범위에 걸쳐서 자연적으로 핵을 생성한다. 그래프(19)는 냉동 건조 챔버 내부의 선반 온도를 나타낸 것이다.

이와는 달리, 도 2 및 도 3은 본 발명의 방법에 따른 감압 핵생성을 이용한 냉동 과정을 거치는 용액의 온도 대비 시간 그래프를 도시한 것이다. 구체적으로, 도 2는 챔버(21, 22, 23, 24, 25 및 26)의 감압을 통해 유도된 핵생성을 이용한 평형 냉각 과정(실시예 2 참조)을 거치는 수용액을 함유하는 6개의 바이알에 대한 온도 대비 시간 그래프를 나타낸 것이다. 바이알 내용물의 열역학적 빙점은 약 0℃이지만, 영역 28에서 보여지는 바와 같이, 바이알 내부의 용액은 감압시 동시에 매우 좁은 온도 범위(즉, -4℃ 내지 -5℃) 내에서 핵을 생성한다. 그래프(29)는 냉동 건조 챔버 내부의 선반 온도를 나타낸 것이며, 감압시키기 전에 선반들의 온도를 어느 정도 정류 상태로 유지시키는 과정인 평형 냉동 과정을 도시한 것이다.

유사하게, 도 3은 챔버(31, 32 및 33)의 감압을 통해서 유도된 핵생성을 이용하는 동적 냉각 과정(실시예 7 참조)을 거치는 수용액을 함유하는 3개의 바이알에 대한 온도 대비 시간 그래프를 도시한 것이다. 여기서도, 바이알 내용물의 열역학적 빙점은 약 0℃이지만, 영역 38에서 보여지는 바와 같이 각 바이알 내부의 용액은 감압시에 약 -7℃ 내지 -10℃의 좁은 온도 범위에서 동시에 핵을 생성한다. 그래프(39)는 냉동 건조 챔버 내부의 선반 온도를 나타낸 것이며, 일반적으로 감압 과정중에 또는 감압시키기 전에 선반들의 온도를 능동적으로 저하시키는 과정인 동적 냉동 과정을 도시한 것이다.

도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 냉동 건조기내의 의약 용액들이 보다 좁은 온도 범위(예: 약 0℃ 내지 -10℃)에서 및/또는 동시에 냉동될 수 있도록 함으로써 핵생성 과정을 개선된 형태로 제어하여, 바이알 사이의 균일성이 증가된 동결건조 제품을 생성한다. 입증된 것은 아니지만, 유도된 핵생성 온도 범위는 상전이 온도 약간 위까지 확장되며 약 40℃의 과냉각 온도까지 확장될 수 있다.

본 발명의 방법과 관련된 또 다른 장점은 최저 핵생성 온도 및/또는 핵생성의 정확한 시간을 제어함으로써, 냉동된 바이알 또는 용기 내부에 형성된 얼음 결정 구조에 영향을 미칠 수 있다는 점이다. 얼음 결정 구조는 얼음이 승화하는데 소요되는 시간에 영향을 미치는 변수이다. 따라서, 얼음 결정 구조를 제어함으로써, 전체적인 냉동 건조 과정을 크게 촉진할 수 있다.

넓은 견지에서, 물질 내부에서 상전이의 핵생성을 유도하기 위한 본 발명의 방법은, (i) 물질을 당해 물질의 상전이 온도 부근 또는 미만으로 냉각시키는 단계; 및 (ii) 압력을 급속 저하시켜서 상기 물질의 핵생성을 유도하는 단계를 포함한다. 이러한 주요 단계들을 각각 이하에서 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단계 1- 물질의 냉각 단계

본 발명의 방법에 유용한 물질들의 구체적인 예로서는 순수한 물질, 기체, 현탁액, 겔, 액체, 용액, 혼합물 또는 용액 또는 혼합물내의 성분들을 들 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하는데 적합한 물질들의 예로서는 의약 물질, 바이오약물 물질, 식품, 화학 물질, 및 제품, 예컨대 상처 치료용 제품, 화장품, 수의학적 제품 및 생체내/시험관내 진단 관련 제품 등을 들 수 있다. 상기 물질이 액체일 경우에, 기체를 상기 액체내에 용해시키는 것이 바람직할 수 있다. 제어된 기체 환경에 존재하는 액체들은 일반적으로 그 내부에 용해된 기체를 함유할 것이다.

본 발명의 방법에 유용한 다른 구체적인 물질들로서는 생물학적 또는 바이오약물 물질, 예컨대 조직, 기관 및 다세포 구조를 들 수 있다. 특정한 생물학적 용도 및 의약 용도에 있어서, 상기 물질은 생바이러스 또는 약독화된 바이러스; 핵산; 모노클론 항체; 폴리클론 항체; 바이오분자; 비펩티드 유사체; 폴리펩티드, 유사 펩티드 및 변형된 펩티드를 비롯한 펩티드; 융합 단백질 및 변성 단백질을 비롯한 단백질; RNA, DNA 및 이의 아류; 올리고누클레오티드; 바이러스 입자; 및 이의 유사 물질 또는 이의 성분을 포함하는 용액 또는 혼합물일 수 있다.

냉동 건조용 바이알 또는 용기내에 함유된 의약 또는 바이오약물 용액은 본 발명의 방법에 의해 유리한 효과를 얻을 수 있는 물질의 좋은 예가 될 것이다. 상기 용액들은 대부분이 물이고 거의 압축 불가능하다. 또한, 이와 같은 의약 또는 바이오약물 용액들은 매우 순수하고 일반적으로 핵생성을 위한 부위를 형성할 수 있는 미립자가 존재하지 않는다. 바이알 사이에서 또는 용기 사이에서 일정하고 균일한 얼음 결정 구조를 형성하기 위해서는 균일한 핵생성 온도가 중요하다. 또 한, 이와 같이 발생된 얼음 결정 구조는 건조에 소요되는 시간에도 크게 영향을 미친다.

냉동 건조 방법에 적용할 경우, 상기 물질은 냉동 건조 챔버와 같은 챔버에 배치하는 것이 바람직하다. 상기 챔버는 챔버 내부의 온도, 압력 및 기체 대기의 제어가 가능하도록 구성되는 것이 바람직하다. 상기 기체 대기로서는 아르곤, 질소, 헬륨, 공기, 수증기, 산소, 이산화탄소, 일산화탄소, 아산화질소, 산화질소, 네온, 제논, 크립톤, 메탄, 수소, 프로판, 부탄 및 형성 가능한 이들의 혼합물을 들 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 기체 대기는 비활성 기체, 예컨대 약 7 내지 약 50 psig 또는 그 이상의 압력하의 아르곤을 포함한다. 냉동 건조기 챔버 내부의 온도는 냉동 건조 공정에 좌우되는 경우가 많으며, 바이알 또는 용기 및 각 바이알 또는 용기 내부의 물질의 온도를 조작하기 위해 챔버 내부의 선반들을 냉각시키거나 승온시키는 열 전달 유체를 사용함으로써 쉽게 제어된다.

본 발명에 의하면, 상기 물질을 그것의 상 전이 온도 부근 또는 미만의 온도로 냉각한다. 냉동 건조 과정을 거치는 수계 용액의 경우에, 상 전이 온도는 상기 용액의 열역학적 빙점이다. 상기 용액이 그 용액의 열역학적 빙점 미만의 온도에 도달할 경우에, 상기 용액은 과냉각되었다고 한다. 수계 용액의 냉동 과정에 적용할 경우, 본 발명의 방법은 과냉각 온도가 상 전이 온도 부근 또는 미만의 온도에서부터 약 40℃에 이르는 과냉각 온도, 더욱 바람직하게는 약 3℃의 과냉각 온도 내지 10℃의 과냉각 온도 사이의 범위일 때 효과적이다. 후술하는 일부의 실시예에서, 핵생성 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 상기 용액이 그것의 열역학적 빙 점 아래로 단지 약 1℃의 과냉각 온도로 존재할 경우에도 바람직한 결과를 제공한다.

상기 물질이 그것의 상 전이 온도 미만의 온도로 존재할 경우에, 상기 물질은 준안정 상태로 존재하는 것으로 흔히 언급된다. 준안정 상태는 불안정하고 일시적이지만, 비교적 수명이 긴 화학적 또는 생물학적 계의 상태를 말한다. 준안정 물질은 일시적으로 그것의 평형 상 또는 상태가 아닌 상 또는 상태로 존재한다. 상기 물질 또는 그 주변 환경에 어떠한 변화도 없을 때에는, 준안정 물질은 결국 그것의 비평형 상태로부터 그것의 평형 상태로 전이한다. 구체적인 준안정 물질로서는 과포화 용액 및 과냉각 액체를 들 수 있다.

준안정 물질의 전형적인 일례는 대기압하에 -10℃의 온도로 존재하는 액상의 물이다. 표준 빙점이 0℃라면, 상기 온도와 압력하에 액상의 물은 열역학적으로 존재하지 않아야 하지만, 액상의 물은 핵생성 현상 또는 얼음 결정화 과정을 개시하는 구조의 부재시에 존재할 수 있다. 매우 순수한 물은 대기압하에 매우 낮은 온도(-30℃ 내지 -40℃)로 냉각되어도 여전히 액체 상태로 유지될 수 있다. 이와 같이 과냉각된 물은 비평형의 열역학적 준안정 상태로 존재한다. 이러한 물은 상 전이를 개시하도록 하는 핵생성 현상이 없을 뿐이므로, 평형 상태로 복귀할 것이다.

전술한 바와 같이, 물질 내부의 상전이의 핵생성 또는 물질의 냉동 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 다양한 냉각 프로파일, 예를 들면 평형을 이룬 냉각 환경 또는 동적 냉각 환경을 비롯한 냉각 프로파일과 함께 사용될 수 있다(도 2 및 도 3 참조).

단계 2- 압력을 급속 저하시키는 단계

상기 물질이 상 전이 온도 부근 또는 미만의 소정의 온도에 도달하였을 때, 챔버를 빠르게 또는 급속 감압시킨다. 이와 같은 감압 단계는 바이알 또는 용기 내부의 용액의 핵생성 및 상전이를 자극한다. 바람직한 실시양태에서, 챔버의 감압은 고압 챔버를 주위 환경의 챔버 또는 저압 챔버 또는 환경으로부터 분리시키는 대형 제어 밸브를 개방하거나 부분적으로 개방함으로써 수행된다. 챔버 밖으로 기체 대기의 질량 유동에 의해 고온이 빠르게 저하된다. 감압 단계는 핵생성을 유도할 만큼 충분히 빠를 필요가 있다. 감압 단계는 수초 이하의 기간내에, 바람직하게는 40초 이하, 더욱 바람직하게는 20초 이하, 가장 바람직하게는 10초 이하의 기간내에 완료되어야 한다.

전형적인 냉동 건조 용도에서, 감압 단계 이후에 초기 챔버 압력과 최종 챔버 압력 사이의 압력차는 약 7 psi보다 커야 하지만, 상황에 따라서는 그보다 낮은 압력 강하도 핵생성을 유도할 수 있다. 대부분의 시판되는 냉동 건조기들은 핵생성을 제어하는데 필요한 압력 강하 범위를 용이하게 수용할 수 있다. 다수의 냉동 건조기들은 121℃에서 포화 증기를 사용하는 통상의 멸균 절차를 견딜 수 있도록 25 psig를 초과하는 압력 등급으로 설계된다. 이와 같은 장치의 등급은 주위 압력 또는 주위 환경내의 압력보다 높은 초기 압력으로부터 감압시키는 프로토콜에 따라서 핵생성을 유도하는 충분한 여지를 제공한다. 고온 및 후속하는 감압 단계는 공지의 수단(예: 공기압, 유압 또는 기계적 수단)을 통해서 달성할 수 있다. 바람직 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 대한 작동 압력은 사용된 기체의 초임계 압력보다 낮은 상태로 유지되어야 하며, 상기 물질의 핵생성 과정중에 상기 물질을 극히 낮은 압력(즉, 약 10 mTorr 이하)으로 감압시키는 것은 피해야 한다.

특정한 메카니즘에 결부시키려는 의도는 아니지만, 본 발명을 실시할 때 관찰되는 제어된 핵생성 단계를 설명할 수 있는 한 가지 메카니즘은 상기 물질에서 용액중의 기체가 감압시에 용액으로부터 배출되어 물질의 핵을 생성하는 기포를 형성한다는 것이다. 초기 고압은 용액중에 용해된 기체의 농도를 증가시킨다. 냉각 단계 이후에 압력을 급감시키면 기체 용해도가 감소되고, 과냉각된 용액으로부터 기체가 방출되어 상전이의 핵생성을 자극한다.

다른 가능한 메카니즘은 감압 단계동안에 상기 물질 근처의 기체 온도가 저하되어 물질의 표면상에 핵생성을 개시하는 저온점(cold spot)을 유도한다는 것이다. 또 다른 가능한 메카니즘은 감압 단계가 상기 물질내의 일부 액체의 증발을 유도하여 흡열 증발 과정으로 말미암은 냉각 현상이 핵생성을 개시할 수 있다는 것이다. 또 다른 가능한 메카니즘은 상기 물질 근처의 감압된 저온 기체가 감압 단계 이전에 상기 물질과 평형을 이루거나 감압 단계 동안에 증발에 의해서 상기 물질로부터 방출되는 일부의 증기를 냉동시키고; 그 결과 형성된 고체 입자들이 다시 상기 물질에 주입되어 핵생성을 개시하는 시드(seed) 또는 표면으로서 작용한다는 것이다. 전술한 메카니즘들중 하나 이상이 물질의 속성, 그 주위 환경 및 핵생성이 이루어지는 상전이에 따라 상이한 정도로 냉동 또는 응고의 핵생성을 개시할 수 있다.

본 발명의 방법은 전체적으로 주위 압력보다 높은 압력하에, 또는 주위 압력에 이르는 압력 범위에 걸쳐서 수행할 수 있다. 예를 들면, 초기 챔버 압력은 주위 압력보다 높을 수 있고, 감압 단계 이후의 최종 챔버 압력은 주위 압력보다 높지만 초기 챔버 압력보다는 낮을 수 있으며; 상기 초기 챔버 압력은 주위 압력보다 높고, 감압 단계 이후의 최종 챔버 압력은 대략 주위 압력이거나 주위 압력보다 약간 낮을 수도 있다.

압력 강하 속도 및 정도는 본 발명의 방법의 중요한 특징으로 생각된다. 실험을 통해서, 압력 강하(△P)가 약 7 psi보다 클 때 핵생성이 유도된다는 사실이 밝혀졌다. 다른 예로서, 압력 강하 정도는 절대 압력 비율, 즉, R= P_i/P_f로 표시할 수 있으며, 여기서 P_i는 초기 절대 압력이고, P_f는 최종 절대 압력이다. 본 발명의 방법을 여러 가지로 실제 적용할 때 상기 절대 압력 비율 R이 약 1.2보다 클 때 감압시에 핵생성이 유도될 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 압력 강하 속도도 본 발명의 방법에서 중요한 역할을 한다. 압력 강하 속도를 규명하는 한 방법은 파라미터 A의 사용을 통한 방법으로서, 이때 A는 △P/△t이다. 마찬가지로, A 값이 소정의 값, 예컨대 약 0.2 psi/초보다 클 경우에 핵생성이 유도될 것으로 생각된다. 실험에서 얻은 실험 데이터를 통해서 바람직한 압력 강하 및 압력 강하 속도를 확정할 수 있다.

이하에서는 실시예에 의거하여 물질에서 핵생성을 유도하는 본 발명의 방법의 여러 가지 실시양태 및 특징을 상세하게 설명하고자 하나, 본 발명의 실시양태 가 후술하는 실시예에만 국한되는 것은 아니다. 하기 실시예는 본 발명을 예시할 목적으로 게재한 것에 불과하며, 본 발명의 보호 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 정해지는 것이다.

하기 실시예는 모두 총 선반 공간이 약 1.0 m²인 4개의 선반과 내부 응축기를 구비한 실험 규모의 비르티스(VirTis) 51-SRC 냉동 건조기에서 수행하였다. 상기 유닛은 약 15 psig에 이르는 양의 압력을 수용하도록 개장된 것이다. 또한, 1.5 인치 직경의 원형 개구부를 냉동 건조 챔버의 후벽에 부가하는 동시에, 후벽 절연재를 통해 구멍으로부터 1.5 인치 직경의 스테인레스 스틸 튜브를 연장시켜서 냉동 건조기의 배면으로부터 빠져 나오도록 하였다. 2개의 1.5 인치 크기의 입구를 완전히 폐쇄하는 공기 작동 볼 밸브를 위생 부품을 통해서 상기 튜브에 부착시켰다. 한 볼 밸브에 의해서 기체가 냉동 건조 챔버내로 유입되도록 함으로써 15 psig에 이르는 양의 압력을 제공하였다. 제 2 볼 밸브에 의해서 기체가 냉동 건조 챔버로부터 유출되도록 함으로써, 챔버 압력을 대기 조건(0 psig)으로 감소시켰다. 냉동 건조기 선반들과 응축기의 냉각은 프락사이어(Praxair) 엔쿨(NCool^TM)-HX 시스템을 사용해서 액상 질소로 냉각시킨 다이날렌(Dynalene) MV 열 전달 유체의 순환을 통해 수행하였다.

모든 용액은 등급 100의 크린룸에서 제조하였다. 냉동 건조기에 도어, 선반, 및 크린룸으로부터 접근 가능한 제어 수단들을 장착시키는 한편, 다른 부품들 (펌프, 가열기 등)은 비-크린룸 환경에 배치하였다. 모든 용액은 HPLC 등급의 물(0.10 ㎛ 막을 통해 여과함, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))을 사용해서 제조하였다. 최종 용액을 바이알 또는 동결 건조 용기에 충전하기 전에 0.22 ㎛ 막을 통해 여과하였다. 모든 기체를 실린더를 통해서 공급하고 0.22 ㎛ 막을 통해서 여과하여 미립자를 제거하였다. 유리 용기(5 mL 바이알 및 60 mL 병)은 위턴 사이언스 프로덕츠(Wheaton Science Products)로부터 미립자가 미리 세정된 상태로 입수하였다. 필요에 따라서 약학적 허용 담체를 사용하였다. 상기 단계들을 실시하여 실시예에 사용된 물질과 방법이 핵생성제로서 작용하는 미립자에 대한 통상의 약제 제조 기준에 확실히 부합하도록 하였다.

본 명세서에서 사용한 용어 "약학적 허용 담체"에는 당업자에게 알려진 모든 용매, 분산매, 항산화제, 염, 코팅, 계면활성제, 방부제(예: 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트, 소르빈산, 항균제, 항진균제), 등장제, 용해 저해제(예: 파라핀, 흡수제(예: 카올린 점토, 벤토나이트 점토), 약물 안정화제(예: 나트륨 라우릴 설페이트), 겔, 결합제(예: 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복시메틸 셀룰로오스, 알기네이트), 부형제(예: 락토오스, 유당, 폴리에틸렌 글리콜), 붕해제(예: 한천, 전분, 락토오스, 인산칼슘, 탄산칼슘, 알긴산, 소르비톨, 글리신), 습윤제(예: 세틸 알코올, 글리세롤 모노스테아레이트), 윤활제, 흡수 촉진제(예: 4급 암모늄 염), 식용유(예: 아몬드유, 코코넛유, 유성 에스테르 또는 프로필렌 글리콜), 감미제, 방향제, 착색제, 충전제(예: 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨), 타정 윤활제(예: 스테아르산 마그네 슘, 전분, 글루코오스, 락토오스, 쌀가루, 초크), 흡입용 담체(예: 탄화수소 추진제), 완충제 또는 이들의 유사 물질과 혼합물이 포함된다.

본 명세서에 기재한 실험 조건 및 조사한 모든 동결건조 제제에 대하여, 확률적인 핵생성은 일반적으로 약 -8℃ 내지 -20℃ 범위의 용기 온도에서 일어나는 것으로 관찰되었고, 때로는 -5℃ 정도의 온난한 온도에서도 일어나는 것으로 관찰되었다. 용기는 일반적으로 핵생성을 일으키는 일 없이 장기간동안 -8℃보다 높은 온도에서 유지될 수 있다. 핵생성의 개시 및 후속하는 결정의 성장(즉, 냉동)은 용기 온도가 발열성인 융해 잠열에 대응하여 빠르게 증가하는 시점으로서 온도 측정에 의해 확인하였다. 또한, 냉동의 개시는 냉동 건조기 챔버 도어상에서 관찰창을 통해 육안으로도 확인할 수 있었다.

실시예 1- 핵생성 온도의 제어

4개의 바이알에 각각 5 중량% 만니톨 용액을 충전하였다. 5 중량% 만니톨 용액의 열역학적 빙점 예측치는 약 -0.5℃이다. 4개의 바이알들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 4개의 바이알의 온도를 표면 장착된 열전대를 사용해서 모니터하였다. 냉동 건조기를 아르곤을 사용해서 14 psig로 가압하였다.

냉동 건조기 선반을 냉각시켜서 바이알 온도가 약 -1.3℃ 내지 약 -2.3℃(열전대 측정 정확도 ±1℃)가 되도록 하였다. 이어서, 냉동 건조기를 약 14 psig로부터 대략 주위 압력까지 5초 미만의 시간내에 감압시켜서 바이알 내부에서 용액의 핵생성을 유도하였다. 4개의 바이알에서 모두 감압 직후에 핵생성이 일어나고 냉 동이 시작되었다. 그 결과를 하기 표 1에 요약하였다.

하기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 실시예에서 제어된 핵생성 온도(즉, 초기 바이알 온도)는 상기 용액의 열역학적 빙점의 예측치와 매우 근사하다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 핵생성이 과냉각도가 매우 낮은 용액에서, 또는 빙점 부근의 핵생성 온도 또는 빙점보다 조금만 더 낮은 온도에서 일어나도록 제어할 수 있다.

핵생성 온도의 제어

바이알 번호	용액	대기	초기 바이알 온도(℃)	압력 강하(psi)	감압 결과
1	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-2.3	14	핵생성
2	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-1.3	14	핵생성
3	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-2.1	14	핵생성
4	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-1.7	14	핵생성

실시예 2- 핵생성 온도의 제어

본 실시예에서는, 95개의 바이알에 5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL를 충전하였다. 5 중량% 만니톨 용액의 열역학적 빙점은 대략 -0.5℃이다. 95개의 바이알을 서로 근접하게 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 냉동 건조기 선반내의 상이한 위치에 배치된 6개의 바이알의 온도를 표면 장착된 열전대를 사용해서 연속적으로 모니터하였다. 냉동 건조기를 아르곤 대기로 약 14 psig까지 가압시켰다. 이어서, 냉동 건조기 선반을 대략 -5℃의 바이알 온도가 얻어질 때까지 냉각시켰다. 이어서, 냉동 건조기를 5초 미만의 기간내에 약 14 psig로부터 대략 대기압으로 감압시켜서 바이알 내부의 용액의 핵생성을 유도하였다. 95개의 바이알을 육안으로 관찰한 결과 감압 직후에 핵생성이 일어나고 냉동이 시작되는 것으로 관찰되었다. 모니터한 6개의 바이알에 대한 열전대 데이터를 통해 육안 관찰 결과를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 2에 요약하였다.

표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 실시예에서 제어된 핵생성 온도(즉, 초기 바이알 온도)는 용액의 열역학적 빙점의 예측치보다 다소 낮다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 과냉각도가 보통 정도인 용액에서 핵생성이 일어나도록 제어할 수 있다. 또한, 본 실시예는 여러 개의 바이알에 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 확장성을 입증한다.

핵생성 온도의 제어

바이알 번호	용액	대기	초기 바이알 온도(℃)	압력 강하(psi)	감압 결과
1	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.2	14	핵생성
2	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.4	14	핵생성
3	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.6	14	핵생성
4	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.4	14	핵생성
5	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.6	14	핵생성
6	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.1	14	핵생성

실시예 3- 감압 크기의 제어

본 실시예에서는, 여러 개의 바이알에 5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL를 충전하였다. 마찬가지로, 5 중량% 만니톨 용액의 열역학적 빙점의 예측치는 대략 -0.5℃이다. 매회 테스트마다, 바이알들을 서로 근접하게 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 앞에서 설명한 실시예들과 마찬가지로, 바이알의 온도는 표면 장착된 열전대를 사용해서 모니터하였다. 냉공 건조기내의 아르곤 대기를 상이한 압력으로 가압시키고, 냉동 건조기 선반을 약 -5℃의 바이알 온도가 얻어질 때까지 냉각시켰다. 매회 테스트에 있어서, 냉동 건조기를 선택된 압력으로부터 대기압까지 급격하게(즉, 5초 미만의 기간내에) 감압시켜서 바이알 내부의 용액의 핵생성을 유도하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 압력 강하가 약 7 psi 이상이고 핵생성 온도(즉, 초기 바이알 온도)가 약 -4.7℃ 내지 -5.8℃일 때 제어된 핵생성이 일어나는 것으로 나타났다.

감압 크기가 미치는 영향

바이알 번호	용액	대기	초기 바이알 온도(℃)	압력 강하(psi)	감압 결과
1	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.7	7	핵생성
2	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.1	7	핵생성
3	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.3	7	핵생성
4	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.6	7	핵생성 없음
5	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.6	7	핵생성
6	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.8	7	핵생성
7	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.4	6	핵생성 없음
8	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.7	6	핵생성 없음
9	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.8	6	핵생성 없음
10	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.1	5	핵생성 없음
11	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.4	5	핵생성 없음
12	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.5	5	핵생성 없음
13	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.7	4	핵생성 없음
14	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.1	4	핵생성 없음
15	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.3	4	핵생성 없음

실시예 4- 감압 속도의 제어

본 실시예에서는, 여러 개의 바이알들에 열역학적 빙점의 예측치가 약 -0.5℃인 5 중량% 만니톨 용액 약 2.5 mL를 충전하였다. 감압 시간을 변화시킨 매회 테스트마다, 바이알들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 앞에서 설명한 실시예들과 마찬가지로, 바이알들의 온도는 표면 장착된 열전대를 사용해서 모니터하였다. 전술한 실시예들과 유사하게, 냉동 건조기내의 아르곤 대기를 약 14 psig로 가압시키고, 선반을 냉각시켜서 바이알 온도가 약 -5℃가 되도록 하였다. 매회 테스트를 할 때마다, 냉동 건조기를 상이한 감압 속도하에 14 psig 로부터 대기압으로 감압시켜서 바이알 내부의 용액의 핵생성을 유도하였다.

감압 속도 또는 감압 시간이 미치는 영향을 조사하기 위해서, 제한 볼 밸브를 냉동 건조기 배면에 있는 감압 제어 밸브의 배출구상에 장착시켰다. 제한 밸브가 완전히 개방될 경우, 약 14 psig로부터 약 0 psig로의 감압은 약 2.5초 이내에 이루어졌다. 제한 밸브를 부분적으로만 폐쇄함으로써, 챔버 감압 시간을 다양하게 증가시킬 수 있다. 제한 볼 밸브를 사용하여, 수 회의 테스트를 냉동 건조기 챔버가 상이한 속도하에 감압되도록 수행하여, 감압 속도가 핵생성에 미치는 영향을 확인 또는 측정하였다. 그 결과를 하기 표 4에 요약하였다.

감압 시간이 미치는 영향

바이알 번호	용액	대기	초기 바이알 온도(℃)	압력 강하(psi)	시간(초)	감압 결과
1	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.6	14	300	핵생성 없음
2	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.4	14	300	핵생성 없음
3	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.8	14	300	핵생성 없음
4	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.6	14	200	핵생성 없음
5	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.4	14	200	핵생성 없음
6	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.4	14	200	핵생성 없음
7	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.6	14	100	핵생성 없음
8	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.2	14	100	핵생성 없음
9	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.2	14	100	핵생성 없음
10	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.7	14	60	핵생성 없음
11	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.1	14	60	핵생성 없음
12	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.1	14	60	핵생성 없음
13	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.1	14	50	핵생성 없음
14	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.3	14	50	핵생성 없음
15	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.9	14	50	핵생성 없음
16	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.4	14	42	핵생성 없음
17	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.5	14	42	핵생성 없음
18	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.0	14	42	핵생성 없음
19	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.1	14	32	핵생성
20	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.7	14	32	핵생성
21	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.6	14	32	핵생성
22	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.7	14	13	핵생성
23	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.3	14	13	핵생성
24	5중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.5	14	13	핵생성

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 감압 시간이 42초 미만이고, 압력 강하가 약 14 psi 이상이며 핵생성 온도(즉, 초기 바이알 온도)가 약 -4.6℃ 내지 약 -5.8℃일때만 핵생성이 일어났다. 이러한 결과는 본 발명의 방법을 효과적으로 수행하기 위해서는 감압 단계를 비교적 급속하게 실시할 필요가 있음을 시사한다.

실시예 5- 기체 대기의 제어

본 실시예에서도 마찬가지로, 여러 개의 바이알에 각각 5 중량% 만니톨 용액 약 2.5 mL를 충전하고, 바이알들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 전술한 실시예들의 경우와 마찬가지로, 테스트 바이알들의 온도는 표면 장착된 열전대를 사용해서 모니터하였다. 상이한 테스트 작업마다, 약 14 psig의 양의 압력을 항상 유지시키면서 냉동 건조기내의 기체 대기를 변화시켰다. 본 실시예에서는, 냉동 건조기 선반을 바이알 온도가 약 -5℃ 내지 -7℃가 되도록 냉각시켰다. 매회 테스트할 때마다, 냉동 건조기를 약 14 psig로부터 대기압까지 급속 감압시켜서 바이알 내부의 용액의 핵생성을 유도하였다. 그 결과를 하기 표 5에 요약하였다.

하기 표를 통해 알 수 있는 바와 같이, 압력 강하를 약 14 psi로 하고 핵생성 온도(즉, 초기 바이알 온도)를 약 -4.7℃ 내지 약 -7.4℃로 하는 헬륨 기체 대기를 제외하고는, 모든 기체 대기중에서 제어된 핵생성이 일어났다. 본 실시예에서 입증된 것은 아니지만, 헬륨 대기중에서는 또 다른 조건이 제어된 핵생성을 가능하게 할 것으로 생각된다.

기체 대기 조성이 미치는 영향

바이알 번호	용액	대기	초기 바이알 온도(℃)	압력 강하(psi)	감압 결과
1	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-4.9	14	핵생성
2	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-5.2	14	핵생성
3	5 중량% 만니톨 2.5 mL	질소	-4.7	14	핵생성
4	5 중량% 만니톨 2.5 mL	질소	-5.1	14	핵생성
5	5 중량% 만니톨 2.5 mL	제논	-4.8	14	핵생성
6	5 중량% 만니톨 2.5 mL	제논	-5.0	14	핵생성
7	5 중량% 만니톨 2.5 mL	공기	-7.4	14	핵생성
8	5 중량% 만니톨 2.5 mL	공기	-7.2	14	핵생성
9	5 중량% 만니톨 2.5 mL	헬륨	-5.8	14	핵생성 없음
10	5 중량% 만니톨 2.5 mL	헬륨	-5.5	14	핵생성 없음

실시예 6- 대용량 용액

본 실시예에서는, 6개의 동결 건조 병(60 mL 용량)에 열역학적 빙점의 예측치가 약 -0.5℃인 5 중량% 만니톨 용액 약 30 mL를 충전하였다. 6개의 동결건조 병들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 냉동 건조기 선반내의 상이한 위치에 배치된 6개의 병들의 온도는 표면 장착된 열전대를 사용해서 모니터하였다. 냉동 건조기를 아르곤 대기로 약 14 psig까지 가압시켰다. 이어서, 냉동 건조기 선반을 병 온도가 -5℃ 부근이 되도록 냉각시켰다. 이어서, 냉동 건조기를 5초 미만의 기간내에 14 psig로부터 대략 대기압까지 감압시켜서 병 내부의 용액의 핵생성을 유도하였다. 그 결과를 하기 표 6에 요약하였다.

별도의 실험으로서, 플라스틱 벌크 냉동 건조 트레이(고어 라이오가드(Gore LYOGUARD, 용량 1800 mL)에 5 중량% 만니톨 용액 약 1000 mL를 충전하였다. 상기 트레이는 USP 저미립자 요건에 부합하도록 사전 세정된 상태로 입수하였다. 트레이를 냉동 건조기 선반상에 배치하고, 트레이의 온도를 한 측면의 중심 부근의 트레이 외면상에 장착된 열전대에 의해 모니터하였다. 이어서, 냉동 건조기 선반을 트레이 온도가 -7℃ 부근이 되도록 냉각시켰다. 이어서, 냉동 건조기를 5초 미만의 기간내에 14 psig로부터 대략 대기압으로 감압시켜서 트레이 내부의 용액의 핵생성을 유도하였다. 그 결과도 하기 표 6에 요약하였다.

앞에서 설명한 실시예들과 마찬가지로, 감압 직후에 모든 용기에서 핵생성이 일어나고 냉동이 시작되었다. 또한, 전술한 실시예들과 마찬가지로, 본 실시예에서 핵생성 온도(즉, 용기 온도)는 어느 정도 용액의 열역학적 빙점 부근에서 제어 가능하였다. 보다 중요한 것은, 본 실시예가 본 발명의 방법이 대용량 용액 및 다양한 용기 형태에 대해서도 핵생성의 제어를 가능하게 함을 입증한다는 사실이다. 응집하여 임계적인 핵을 생성할 수 있는 더 많은 분자들이 존재할 경우에 핵생성 현상이 더욱 일어나기 쉽기 때문에, 감압 방법의 효율은 제제의 용량이 증가함에 따라서 향상될 것이라는 점을 알아두어야 한다.

용액의 용량과 용기 형태가 미치는 영향

용기	용액	대기	용기 온도(℃)	압력 강하(psi)	감압 결과
병 1	5 중량% 만니톨 30 mL	아르곤	-5.3	14	핵생성
병 2	5 중량% 만니톨 30 mL	아르곤	-5.1	14	핵생성
병 3	5 중량% 만니톨 30 mL	아르곤	-5.9	14	핵생성
병 4	5 중량% 만니톨 30 mL	아르곤	-5.2	14	핵생성
병 5	5 중량% 만니톨 30 mL	아르곤	-5.9	14	핵생성
병 6	5 중량% 만니톨 30 mL	아르곤	-6.1	14	핵생성
트레이	5 중량% 만니톨 1000 mL	아르곤	-6.9	14	핵생성

실시예 7- 동적 냉각 대비 평형 냉각

본 발명의 핵생성 제어 방법은 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 상기 실시예 1-6은 각각 열역학적 빙점보다 낮은 온도(즉, 매우 느리게 변화하는 온도)에서 실질적으로 평형 상태로 존재하는 동결건조 용액의 핵생성 온도를 제어하는 양상을 입증하고 있다. 본 실시예는 동적 냉각 환경(즉, 용액이 온도의 급변 조건하에 있음)에서 열역학적 빙점보다 낮은 온도에서도 핵생성이 일어날 수 있음을 입증한다.

본 실시예에서, 바이알 1 내지 6은 실시예 2와 관련하여 기재한 샘플을 나타낸다. 또한, 3개의 별도의 바이알(바이알 7-9)에도 5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL를 충전하였다. 별도의 테스트에서, 3개의 추가된 바이알들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 냉동기 선반을 -45℃의 최종 선반 온도까지 급속하게 냉각시켰다. 바이알중 하나가 표면 장착된 열전대로 측정하여 약 -5℃의 온도에 도달하였을 때, 냉동 건조기를 급속하게 약 14 psig로부터 0 psig로 감압시켜서 핵생성을 유도하였다. 3개의 바이알에서 모두 감압 직후에 핵생성이 일어나고 냉동이 시작되었다. 동적 냉각 환경의 결과로서 핵생성이 일어나기 전에 바이알 온도는 -6.8℃ 내지 -9.9℃로 현저하게 저하되었다. 비교 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

테스트 결과-동적 냉각이 핵생성에 미치는 영향

바이알 번호	용액	방식	핵생성 온도(℃)	압력 강하(psi)	감압 결과
1	5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL	평형	-4.2	14	핵생성
2	5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL	평형	-4.4	14	핵생성
3	5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL	평형	-4.6	14	핵생성
4	5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL	평형	-4.4	14	핵생성
5	5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL	평형	-4.6	14	핵생성
6	5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL	평형	-5.1	14	핵생성
7	5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL	동적	-6.8	14	핵생성
8	5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL	동적	-7.2	14	핵생성
9	5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL	동적	-9.9	14	핵생성

주어진 온도 범위에서 평형을 이루는 동결건조 용액 또는 동적으로 냉각되는 동결건조 용액에서 핵생성을 제어하는 본 발명의 방법의 효과에 의하면, 최종 사용자에게 장점과 교환 조건이 상이한 두 가지 가능한 적용 방식을 제공할 수 있다. 동결건조 용액이 평형을 이루도록 하면, 핵생성 온도 범위를 냉동 건조기 자체의 성능 한계까지 좁히거나 최소화할 수 있을 것이다. 이와 같은 평형 단계는, 챔버 및 바이알 온도를 1 단계로 약 -40℃ 미만의 온도까지 하강시키는 통상의 냉동 절차 또는 동적 냉동 절차에 비해서 달성하는데 추가의 시간이 필요할 수 있다. 그러나, 평형 단계를 사용하면 모든 바이알 또는 용기들 사이에 일층 개선된 핵생성 균일성이 제공될 뿐만 아니라, 물질의 핵생성 온도의 정확한 제어와 관련된 다른 장점들을 실현할 수 있다.

다른 예로서, 물질 또는 동결건조 용액의 온도의 평형 단계가 필요하지 않을 경우에는, 표준 냉동 또는 동적 냉각 절차가 이루어지는 동안에 적절한 시기에 감압 단계를 간단하게 실시할 수 있다. 동적 냉각 단계 동안의 감압은 동결건조 용기 내부의 물질에 대해 핵생성 온도 범위를 확장시키지만, 냉동 절차에는 최소의 시간을 부가하므로, 과도한 과냉각과 관련된 문제점을 감소시킬 수 있다.

실시예 8- 상이한 부형제들이 미치는 영향

물질의 핵생성을 제어하거나 유도하는 본 발명의 방법을 사용하여 상이한 동결건조 부형제들을 함유하는 과냉각된 용액들의 핵생성 온도를 제어할 수 있다. 본 실시예는 다음과 같은 부형제들과 함께 본 발명의 방법을 사용하는 용도를 입증하는 것이다: 만니톨; 히드록시에틸 전분(HES); 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 폴리비닐피롤리돈(PVP); 덱스트란; 글리신; 소르비톨; 수크로오스; 및 트레할로스. 각각의 부형제에 대해서, 2개의 바이알에 부형제 5 중량%를 함유하는 용액 2.5 mL를 충전하였다. 바이알들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 냉동 건조기를 아르곤 대기로 약 14 psig까지 가압시켰다. 바이알 온도가 -3℃ 부근이 되도록 냉동 건조기 선반을 냉각시킨 후에, 급속 감압시켜서 핵생성을 유도하였다. 그 결과를 하기 표 8에 요약하였다.

상이한 동결건조 부형제들이 미치는 영향

바이알 번호	용액/부형제	대기	초기 바이알 온도(℃)	압력 강하(psi)	감압 결과
1	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-3.3	14	핵생성
2	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-3.0	14	핵생성
3	5 중량% HES 2.5 mL	아르곤	-3.1	14	핵생성
4	5 중량% HES 2.5 mL	아르곤	-3.7	14	핵생성
5	5 중량% PEG 2.5 mL	아르곤	-3.8	14	핵생성
6	5 중량% PEG 2.5 mL	아르곤	-3.4	14	핵생성
7	5 중량% PVP 2.5 mL	아르곤	-3.5	14	핵생성
8	5 중량% PVP 2.5 mL	아르곤	-3.3	14	핵생성
9	5 중량% 덱스트란 2.5 mL	아르곤	-4.0	14	핵생성
10	5 중량% 덱스트란 2.5 mL	아르곤	-3.1	14	핵생성
11	5 중량% 글리신 2.5 mL	아르곤	-3.8	14	핵생성
12	5 중량% 글리신 2.5 mL	아르곤	-3.9	14	핵생성
13	5 중량% 소르비톨 2.5 mL	아르곤	-3.6	14	핵생성
14	5 중량% 소르비톨 2.5 mL	아르곤	-3.4	14	핵생성
15	5 중량% 수크로오스 2.5 mL	아르곤	-3.3	14	핵생성
16	5 중량% 수크로오스 2.5 mL	아르곤	-3.4	14	핵생성
17	5 중량% 트레할로스 2.5 mL	아르곤	-3.7	14	핵생성
18	5 중량% 트레할로스 2.5 mL	아르곤	-3.1	14	핵생성

실시예 9- 단백질 용액의 핵생성 제어

본 발명의 방법을 사용하여 단백질 용해도 또는 효소 활성에 유해하거나 나쁜 영향을 미치는 일 없이, 과냉각된 단백질 용액의 핵생성 온도를 제어할 수 있다. 2종의 단백질, 즉, 소 혈청 알부민(BSA) 및 락테이트 탈수소효소(LDH)를 본 실시예에 사용하였다.

BSA를 10 mg/mL의 농도로 5 중량% 만니톨에 용해시켰다. 3개의 동결건조 바이알에 BSA-만니톨 용액 2.5 mL를 충전하고, 바이알들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 냉동 건조기를 아르곤 대기로 약 14 psig까지 가압시켰다. 냉동 건조기 선반을 바이알 온도가 -5℃ 부근이 되도록 냉각시켰다. 냉동 건조기를 급속 감압시켜서 핵생성을 유도하였다. 모든 BSA 용액의 바이알들은 감압 직후에 핵생성을 이루고 냉동이 시작되었다. 해동시에 단백질의 침전은 관찰되지 않았다.

2개의 상이한 공급업체로부터 LDH 단백질을 입수하였으며, 2개의 구분되는 배치(batch)를 구별하기 위해 간단 명료하게 LDH-1 또는 LDH-2로서 명명하였다. LDH-1은 1 mg/mL의 농도로 5 중량% 만니톨에 용해시켰다. 6개의 동결건조 바이알에 LDH-1/만니톨 용액 2.5 mL를 충전하고, 바이알들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 냉동 건조기를 아르곤 대기로 약 14 psig까지 가압시켰다. 바이알 온도가 -4℃ 부근이 되도록 냉동 건조기 선반을 냉각시켰다. 이어서, 냉동 건조기를 급속 감압시켜서 핵생성을 유도하였다. 모든 바이알들은 감압 직후에 핵생성을 이루고 냉동이 시작되었다. 바이알을 이와 같은 상태로 약 15분 동안 유지시켰다. 이어서, 냉동 건조기 선반을 약 1℃/분의 속도로 냉각시켜서 바이알 온도가 -45℃ 부근이 되도록 하고, 추가로 15분 동안 이 상태로 유지시켜서 냉동 과정을 확실하게 완료하였다. 냉동 단계 이후에, 냉동 건조기 선반을 약 1℃/분의 속도로 가온시켜서 바이알 온도를 5℃ 부근으로 상승시켰다. 해동시에 단백질의 침전은 전혀 관찰되지 않았다. 바이알 내용물을 효소 활성에 대해 분석하고, 그 결과를 냉동시키지 않은 LDH-1/만니톨 용액의 대조 샘플과 비교하였다.

실시예 9의 일부로서, LDH-1/만니톨 용액의 감압되어 핵생성된 샘플을 확률적으로 핵생성된 샘플과 비교하였다. 확률적으로 핵생성된 LDH-1의 샘플에서는, 가압 및 감압 절차 없이 아르곤 대기를 사용하지 않고 냉동 절차를 반복하였다. 구체적으로, LDH-1을 1 mg/mL의 농도로 5 중량% 만니톨에 용해시켰다. 6개의 동결건조 바이알에 LDH-1/만니톨 용액 2.5 mL를 충전하고, 바이알들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상에 배치하였다. 냉동 건조기 선반을 실온에서 출발하여 약 1℃/분의 속도로 바이알 온도가 -45℃ 부근이 되도록 냉각시키고, 15분 동안 유지시켜서 냉돌 과정이 확실히 완료되도록 하였다. 냉동 단계 이후에, 냉동 건조기 선반을 약 1℃/분의 속도로 가온시켜서 바이알 온도를 5℃ 부근으로 상승시켰다. 해동시에 단백질의 침전은 전혀 관찰되지 않았다. 바이알 내용물을 효소 활성에 대해 분석하고, 그 결과를 위와 같은 냉동시키지 않은 LDH-1/만니톨 용액의 대조 샘플과 비교하였다. 또한, 실시예 9의 일부로서, LDH-1에 대해 전술한 바와 같은 실험을 LDH-2를 사용해서 반복하였다. 단 한가지 차이점은 LDH-1의 경우에 핵생성 온도가 -4℃ 부근이었던 것에 반해서, LDH-2의 경우에는 핵생성 온도가 -3℃ 부근이라는 것이다.

하기 표 9를 통해 알 수 있는 바와 같이, 감압 단계를 통해 달성된 제어된 핵생성 및 냉동 과정은 이와 대등한 확률적인 핵생성 및 냉동 과정에 비해서 효소 활성을 저하시키지 않는다. 실제로, 감압 단계를 통해 달성된 제어된 핵생성 과정은, 확률적인 핵생성 이후에 평균 활성 손실이 LDH-1의 경우 35.9%이고 LDH-2의 경우 41.3%인데 비해서, LDH-1의 경우 단 17.8%이고 LDH-2의 경우 26.5%로서 효소 활성을 더욱 잘 보존하는 것으로 나타났다.

과냉각된 단백질 용액의 핵생성 온도 제어

바이알 번호	용액	대기	초기 바이알 온도(℃	압력 강하(psi)	효소 활성 손실(%)	감압 결과
1	BSA 용액 2.5 mL	아르곤	-4.9	14	-	핵생성
2	BSA 용액 2.5 mL	아르곤	-4.3	14	-	핵생성
3	BSA 용액 2.5 mL	아르곤	-5.3	14	-	핵생성
4	LDH-1 용액 2.5 mL	아르곤	-3.8	14	9.0	핵생성
5	LDH-1 용액 2.5 mL	아르곤	-4.0	14	16.2	핵생성
6	LDH-1 용액 2.5 mL	아르곤	-3.7	14	18.4	핵생성
7	LDH-1 용액 2.5 mL	아르곤	-4.0	14	23.4	핵생성
8	LDH-1 용액 2.5 mL	아르곤	-3.9	14	18.5	핵생성
9	LDH-1 용액 2.5 mL	아르곤	-4.0	14	21.2	핵생성
10	LDH-1 용액 2.5 mL	공기	-10.4	0	35.7	핵생성
11	LDH-1 용액 2.5 mL	공기	-16.5	0	35.4	핵생성
12	LDH-1 용액 2.5 mL	공기	-15.5	0	36.1	핵생성
13	LDH-1 용액 2.5 mL	공기	-10.5	0	43.9	핵생성
14	LDH-1 용액 2.5 mL	공기	-9.8	0	24.9	핵생성
15	LDH-1 용액 2.5 mL	공기	-11.0	0	39.2	핵생성
16	LDH-2 용액 2.5 mL	아르곤	-3.1	14	29.9	핵생성
17	LDH-2 용액 2.5 mL	아르곤	-2.9	14	18.9	핵생성
18	LDH-2 용액 2.5 mL	아르곤	-3.1	14	23.3	핵생성
19	LDH-2 용액 2.5 mL	아르곤	-2.7	14	19.6	핵생성
20	LDH-2 용액 2.5 mL	아르곤	-3.1	14	32.1	핵생성
21	LDH-2 용액 2.5 mL	아르곤	-2.6	14	35.2	핵생성
22	LDH-2 용액 2.5 mL	공기	-5.0	0	38.3	핵생성
23	LDH-2 용액 2.5 mL	공기	-5.5	0	40.0	핵생성
24	LDH-2 용액 2.5 mL	공기	-2.3	0	36.5	핵생성
25	LDH-2 용액 2.5 mL	공기	-3.8	0	42.0	핵생성
26	LDH-2 용액 2.5 mL	공기	-5.1	0	50.2	핵생성
27	LDH-2 용액 2.5 mL	공기	-5.9	0	40.6	핵생성

LDH-2의 경우에 관찰된 확률적인 핵생성 온도는 LDH-1의 경우에 관찰된 확률적인 핵생성 온도보다 실질적으로 더 높다는 것을 알아야 한다. 이러한 차이는 LDH-2내의 핵생성제로서 작용하는 일부의 오염물질에 기인한 것일 수 있다. 확률적인 핵생성 온도는 LDH-1에 비해서 LDH-2의 경우에 제어된 핵생성 온도와 훨씬 더 근사하지만, LDH-1 및 LDH-2에 대하여 제어된 핵생성을 통해 얻어진 효소 활성의 보유율의 향상치는 각각 18.1% 및 14.8%로 유사하였다. 이와 같은 결과는 효소 활성의 보유율이 향상된 것이, 감압 단계를 통해서 얻어진 전술한 바와 같은 보다 높은 핵생성 온도에만 기인하는 것이 아니라, 부분적으로는 제어된 핵생성 과정 자체의 특징에 기인한 것일 수 있다는 사실을 시사한다.

실시예 10- 1차 건조 시간의 감소

만니톨 약 10.01 g과 물 약 190.07 g을 혼합하여 5 중량% 만니톨 용액을 제조하였다. 바이알에 상기 5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL를 충전하였다. 바이알을 빈 상태에서, 그리고 용액을 채운 상태에서 평량하여 바이알에 첨가된 물의 질량을 측정하였다. 20개의 바이알들을 서로 근접하도록 냉동 건조기 선반상의 랙(rack)에 배치하였다. 6개의 바이알들의 온도를 표면 장착된 열전대를 사용해서 모니터하였으며, 모니터한 바이알들은 모두 다른 바이알들로 둘러싸서 바이알 양상의 균일성을 향상시켰다. 냉동 건조기는 아르곤 가스의 제어된 기체 대기로 약 14 psig까지 가압하였다. 냉동 건조기 선반을 약 -6℃까지 냉각시켜서 바이알 온도가 약 -1℃ 내지 -2℃가 되도록 하였다. 이어서, 냉동 건조기를 5초 미만의 기간내에 약 14 psig로부터 대략 대기압으로 감압시켜서 바이알 내부의 용액의 핵생성을 유도하였다. 육안으로 또는 열전대를 통해 모니터한 모든 바이알들은 감압 직후에 핵을 생성하고 냉동하기 시작하였다.

이어서, 선반 온도를 약 -45℃까지 급속히 저하시켜서 냉동 과정을 완료하였다. 모든 바이알의 온도가 약 -40℃가 되면, 냉동 건조 챔버를 배기시키고 1차 건조(즉, 승화) 단계를 시작하였다. 이와 같은 건조 과정중에, 냉동 건조기 챔버를 1 시간의 기울기를 통해 약 -14℃로 가온시키고, 상기 온도에 16 시간 동안 유지시켰다. 건조 과정 전반에 걸쳐서 응축기를 약 -60℃로 유지시켰다. 진공 펌프를 끄고 챔버에 아르곤을 대기압까지 재충전하여 1차 건조 단계를 종료하였다. 바이알들을 냉동 건조기로부터 빠르게 제거하고 평량하여, 1차 건조 과정중에 얼마나 많은 물이 손실되었는지를 측정하였다.

실시예 10의 일부로서 별도의 실험에서, 다른 바이알들에 동일한 5 중량% 만니톨 용액 2.5 mL를 충전하였다. 바이알을 비어 있는 상태에서, 그리고 용액을 채운 상태에서 평량하여 바이알에 부가된 물의 질량을 측정하였다. 바이알들을 전술한 바와 동일한 방식으로 냉동 건조기내에 장착시키고, 6개의 바이알들의 온도를 마찬가지로 표면 장착된 열전대를 사용해서 모니터하였다. 냉도 건조기 선반을 실온으로부터 약 -45℃로 급속 냉각시켜서 바이알들을 냉동시켰다. 냉각 단계 동안에 약 -15℃ 내지 약 -18℃에서 확률적으로 핵생성이 일어났다. 모든 바이알의 온도가 약 -40℃ 이하가 되면, 바이알을 전술한 방법과 동일한 방식으로 건조시켰다. 1차 건조 단계의 종료시에, 샘플들을 냉동 건조기로부터 빠르게 제거하고 평량하여 1차 건조 과정중에 얼마나 많은 물이 손실되었는지 측정하였다.

핵생성 온도 증가에 의한 1차 건조 단계의 개선

바이알 번호	용액	대기	초기 바이알 온도(℃)	압력 강하(psi)	물 손실(%)	감압 결과
1	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-1.3	14	89.9	핵생성
2	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-1.9	14	85.2	핵생성
3	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-1.3	14	87.1	핵생성
4	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-2.3	14	88.8	핵생성
5	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-2.1	14	85.0	핵생성
6	5 중량% 만니톨 2.5 mL	아르곤	-1.1	14	80.7	핵생성
7	5 중량% 만니톨 2.5 mL	공기	-15.7	0	65.7	-
8	5 중량% 만니톨 2.5 mL	공기	-16.7	0	66.9	-
9	5 중량% 만니톨 2.5 mL	공기	-14.5	0	64.6	-
10	5 중량% 만니톨 2.5 mL	공기	-15.6	0	64.7	-
11	5 중량% 만니톨 2.5 mL	공기	-16.5	0	64.1	-
12	5 중량% 만니톨 2.5 mL	공기	-17.9	0	65.7	-

제어된 핵생성 및 확률적인 핵생성을 이용한 냉동 건조 과정의 결과를 상기 표 10에 요약하였다. 상기 2가지 실험은, 어느 한 실험에 감압 단계를 통해 제어된 핵생성 절차를 부가한다는 점에서만 구별된다. 표 10을 통해 알 수 있는 바와 같이, 감압 단계를 통해 달성되는 제어된 핵생성 과정에 의하면, 본 실시예에서는 약 -1.1℃ 내지 -2.3℃의 매우 낮은 과냉각도에서 핵생성이 가능하다. 제어된 핵생성에 필요한 핵생성 온도가 확률적인 핵생성의 실시예에 비해 더 높기 때문에, 건조 특성이 현저하게 향상된 얼음 구조 및 동결건조 케이크를 얻을 수 있다. 동일한 건조 시간을 이용할 경우에, 약 -1.1℃ 내지 -2.3℃에서 상기 감압 방법을 사용하여 핵생성을 이룬 바이알들은 평균 86.1%의 물을 손실한 반면에, 약 -14.5℃ 내지 -17.9℃에서 확률적으로 핵생성된 바이알들은 평균 65.3%의 물을 손실하였다. 그러므로, 확률적으로 핵생성된 바이알들은 본 발명의 방법에 의해서 제어된 방식으로 핵생성된 바이알들과 동일한 정도의 물 손실을 달성하기 위해서 보다 많은 1차 건조 시간이 필요할 것이다. 건조 시간의 개선은 보다 높은 핵생성 온도에서 보다 큰 얼음 결정들이 형성되는데 기인한 것으로 생각된다. 이러한 큰 얼음 결정들은 승화시에 보다 큰 소공 뒤에 남게 되며, 보다 큰 소공들을 이후 승화 과정에서 수증기가 유동하는데 보다 적은 저항을 제공한다.

본 발명의 방법은 과냉각된 물질, 즉, 액체 또는 용액이 핵생성한 후에 냉동하는 온도 및/또는 시간을 제어하는 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 냉동 건조 부분에만 촛점이 맞추어져 있지만, 핵생성된 상 전이를 포함하는 어떠한 물질 처리 단계에서도 유사한 문제점이 발생한다. 이와 같은 처리 방법의 예로서는, 용융물로부터 중합체 및 금속의 결정화, 과포화 용액으로부터 물질의 결정화, 단백질의 결정화, 인공 눈 제조, 식품 냉동, 냉동 농축, 분별 결정, 저온 보존, 또는 증기의 액체로의 응축을 들 수 있다.

액체 또는 용액의 핵생성 온도를 제어함으로써 얻어지는 가장 즉각적인 효과는, 상전이에 의해서 생성되는 고체 영역들의 수와 크기를 제어할 수 있다는 가능성이다. 예를 들면, 물을 냉동할 때, 핵생성 온도는 형성되는 얼음 결정의 크기와 수를 직접 좌우한다. 일반적으로, 핵생성 온도가 높을수록 얼음 결정의 수가 더 작고 크기가 더 크다.

상전이에 의해 생성되는 고체 영역들의 수와 크기를 제어할 수 있는 가능성은 추가의 장점들을 제공할 수 있다. 예를 들면, 냉동 건조 과정에서. 얼음 결정의 수와 크기는 동결건조 케이크의 건조 특성에 크게 영향을 미친다. 보다 높은 핵생성 온도에 의해서 생성된 보다 큰 얼음 결정들은 승화시에 보다 큰 소공 뒤에 남게되며, 이러한 큰 소공들은 이후 승화 단계동안에 수증기가 유동하는데 대해서 보다 적은 저항을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 방법은 핵생성 온도를 증가시킴으로써 냉동 건조 방법에서 1차 건조(즉, 승화) 속도를 증가시키는 수단을 제공한다.

또 다른 장점은 냉동 건조를 통해서 민감한 물질들을 보존하는 용도(즉, 저온 보존)에서 실현될 수 있다. 예를 들면, 수용액중에 냉동되고 구체적으로 포유류 조직 샘플(예: 제대혈, 조직 생검, 난자 및 정자 세포 등), 세포주(예: 포유류, 효모, 원핵생물, 진균 등) 및 생물학적 분자(예: 단백질, DNA, RNA 및 이의 아류) 등을 포함하는 생물학적 물질은 냉동 과정에서 당해 물질의 기능 또는 활성을 손상시킬 수 있는 다양한 스트레스를 받을 수 있다. 얼음 형성은 상기 물질을 물리적으로 파괴하거나, 상기 물질에서 일어나는 계면 결합, 삼투력, 용액 농도 등에 극심한 변화를 일으킬 수 있다. 핵생성은 얼음 형성의 구조 및 반응속도를 제어하기 때문에, 이와 같은 스트레스에 현저한 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 저온 보존 방법과 관련된 스트레스를 완화시키고 저온 보존된 물질로부터 기능 또는 활성의 회복을 증진시키는 특유한 수단을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 생세포에 사용하도록 설계된 2단계 저온 보존 알고리즘에서 세포외 얼음 형성을 개시하는데 사용되는 통상의 핵생성 제어 방법(예: 종결정 첨가 또는 저온 표면과의 접촉)에 비해서 개선된 결과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 방법은 저온 보존 및 동결건조 용도에서 몇 가지의 구성 성 분들을 함유하는 복합 용액 또는 혼합물에도 적용될 수 있다. 이러한 제제들은 약학적 활성 성분(예: 합성 화학 물질, 단백질, 펩티드 또는 백신) 및 임의로 1종 이상의 완화 성분, 예컨대 건조중에 활성 성분의 물리적 손실을 방지하도록 돕는 벌크제(bulking agent)(예: 덱스트로오스, 글루코오스, 글리신, 락토오스, 말토오스, 만니톨, 폴리비닐 피롤리돈, 염화나트륨 및 소르비톨); 활성 성분에 대한 적절한 주변 pH 또는 독성을 유지하도록 돕는 완충제 또는 독성 조절제(예: 아세트산, 벤조산, 시트르산, 염산, 락트산, 말레인산, 인산, 타르타르산 및 이러한 산들의 나트륨염); 처리중에 또는 최종 액체 또는 건조된 형태에서 활성 성분의 구조 및 기능을 보존하도록 돕는 안정화제(예: 알라닌, 디메틸설폭사이드, 글리세롤, 글리신, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜, 리신, 폴리소르베이트, 소르비톨, 수크로오스 및 트레할로스); 제제의 유리 전이 양상을 조정하는 첨가제(예: 폴리에틸렌 글리콜 및 당); 활성 성분이 분해되는 것을 막는 항산화제(예: 아스코르베이트, 중아황산 나트륨, 나트륨 포름알데히드, 메타아황산 나트륨, 아황산 나트륨, 설폭실레이트 및 티오글리세롤)을 함유하는 수성, 유기 용매 또는 혼합 수성-유기 용매를 사용하는 용액인 경우가 많다.

핵생성은 일반적으로 랜덤한 과정이므로, 동일한 처리 조건하에 있는 여러 가지 동일한 물질들도 상이한 온도에서 핵생성을 이룰 수 있다. 그 결과, 핵생성 양상에 좌우되는 상기 물질들의 특성은 동일한 처리 조건에도 불구하고 달라질 것이다. 본 발명의 방법은 여러 가지 물질들의 핵생성 온도를 동시에 제어하는 수단을 제공함으로써, 핵생성 양상에 좌우되는 상기 제품을 특성들의 균일성을 증가시 키는 방법을 제공한다. 예를 들면, 전형적인 냉동 건조 방법에서, 분리된 바이알들에 함유된 동일한 용액들은 광범위한 온도에 걸쳐서 확률적으로 핵을 생성할 수 있으므로, 최종 냉동 건조된 생성물은 잔류 수분 함량, 활성 및 재구성 시간 등과 같은 임계 특성 면에서 현저한 다양성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 방법에 의해서 핵생성 온도를 제어함으로써, 냉동 건조 과정으로부터 바이알 사이의 생성물 특성의 균일성을 크게 향상시킬 수 있다.

물질의 핵생성 양상을 제어할 수 있는 가능성은 통상적으로 제어되지 않는 핵생성 현상에 좌우되는 산업상의 공정을 진행하는데 필요한 시간을 감소시키는데 있어서 상당한 장점을 제공할 수 있다. 예를 들면, 합당한 시간내에 수행될 수 있고 규정된 균일성 내에서 바람직한 제품 특성을 제공하며 활성 제약 성분(API)의 충분한 활성을 보존하는 성공적인 냉동 건조 사이클을 진행하기 위해서는 수 개월이 소요되는 경우가 많다. 핵생성을 제어하는 수단을 제공하여, 1차 건조 시간, 생성물 균일성 및 API 활성을 향상시킴으로써, 본 발명의 방법은 성공적인 냉동 건조 프로토콜을 진행하는데 필요한 시간을 크게 감소시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 유리한 효과는 냉동 건조시키고자 하는 제제의 조성을 정하는데 있어서 융통성을 증가시킨다. 제어된 핵생성은 냉동 단계 동안에 API를 잘 보존할 수 있으므로, 사용자들은 제제에 대한 완화 성분(예: 안정화제)의 첨가량을 최소화시킬 수 있거나, 안정성과 가공성을 모두 달성하기 위해서 제제 구성 성분들의 조합을 더욱 간단하게 선택할 수 있다. 제어된 핵생성이 안정화제 또는 1차 건조 시간을 본질적으로 증가시키는(예를 들 면, 수용액의 유리 전이 온도를 저하시킴으로써) 다른 완화 성분들의 사용량을 최소화하는 경우에 상승 작용이 일어날 수 있다.

본 발명의 방법은 광범위한 제품들을 제조하도록 용이하게 스케일업되거나 개조될 수 있는 동일한 장비 및 공정 파라미터를 사용하여 수행할 수 있기 때문에, 대규모 생산 또는 제조 작업에 특히 적합하다. 본 발명의 방법은 모든 조작을 단일의 챔버(예: 냉동 건조기)에서 수행할 수 있고, 핵생성을 유도하기 위한 진공의 사용, 첨가제의 사용, 진동, 전자냉동 등을 필요로 하지 않는 공정을 이용하는 물질의 핵생성 방법을 제공한다.

종래 기술과 달리, 본 발명의 방법은 동결건조된 제품에 전혀 첨가하는 것이 없다. 본 발명의 방법에서 필요한 것은 물질(예: 바이알내의 액체)을 초기에 기체 환경하에 소정의 압력으로 유지시킨 후에 압력을 저압으로 급속 감압시키는 것 뿐이다. 사용된 기체는 동결건조 사이클을 수행하는 동안에 바이알로부터 제거될 것이다. 바이알 또는 그 내용물은 기체를 제외한 어느 것과도 접촉하지 않는다. 주위 압력 및 기체 환경을 간단히 조작하는 것만으로 소정의 목표를 달성하는데 충분하다. 핵생성을 유도하기 위해 주위 압력만을 변화시킴으로써, 본 발명의 방법은 냉동 건조기 내부의 모든 바이알에 균일하게 동시에 영향을 미친다.

또한, 본 발명의 방법은 동결건조 용도에서 물질의 핵생성에 영향을 미치기 위한 종래 기술의 방법에 비해 실시 및 보수 유지하기가 훨씬 경제적이고 용이하다. 본 발명의 방법은 동결건조 과정에서 1차 건조 속도를 현저하게 증가시킴으로써, 냉동 건조된 약품에 소요되는 처리 비용을 줄일 수 있다. 본 발명의 방법은 종래 기술의 방법보다 더욱 균일한 동결건조된 제품을 제공하므로, 생성물의 손실을 줄일 수 있고 보다 엄격한 균일성 요건에 부합할 수 없게 만드는 공정 요인들이 도입되는 것을 막는 장벽을 형성할 수 있다. 공정을 효과적으로 제어할 수 있으므로, 제품의 품질이 개선되고 처리 시간은 줄어들 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 물질에서 핵생성을 유도하는 방법 및/또는 물질을 냉동시키는 방법을 제공한다. 당업자라면, 본 발명의 방법의 여러 가지 개조예, 변경예 및 변형예를 잘 알 수 있을 것이며, 이와 같은 개조예, 변경예 및 변형예도 첨부된 청구의 범위에 의해서 정해지는 본 발명의 기술 사상과 보호 범위내에 포함된다는 것을 잘 알것이다.

Claims

물질을 상전이 온도 부근의 온도 또는 상전이 온도 미만의 온도로 만드는 단계; 및

상기 물질 근처의 압력을 저하시켜서 상기 물질에서 상전이의 핵생성을 유도하는 단계를 포함하는, 물질에서 상전이의 핵생성을 유도하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 물질을 준안정 상태로 냉각시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 감압 단계 이후에 상기 핵생성된 물질을 상기 물질의 상전이를 확실히 완결하는 최종 온도로 또는 그 미만의 온도로 계속 냉각시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 물질이 소정의 핵생성 온도에 도달한 때에 상기 감압 단계를 개시하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 냉각 단계를 개시한 후 소정의 시간이 경과한 때에, 그리고 상기 물질의 온도가 상기 상전이 온도보다 낮을 때 감압 단계를 개시하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 물질을 재구성하는 단계를 더 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 물질이 기체, 액체, 용액, 현탁액, 혼합물, 또는 현탁액, 용액 또는 혼합물내의 성분들로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 물질이 용액이고, 상기 상전이 온도가 상기 용액의 열역학적 빙점인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 물질이 1종 이상의 물질이 용해된 용액이고, 상기 상전이 온도는 상기 용액으로부터 용해된 물질이 석출 또는 결정화하는 포화 온도인 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 물질이 바이오약물 물질, 의약 물질, 화학 물질, 생물학적 물질, 식품 또는 이들의 혼합물을 더 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 물질이 기체 대기의 존재하에 한정된 것인 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 기체 대기가 아르곤, 질소, 헬륨, 공기, 수증기, 산소, 이산화탄소, 네온, 제논, 크립톤, 수소 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 물질을 둘러싼 대기를 가압하는 단계를 더 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 감압시키기 전에 상기 물질을 먼저 상전이 온도 내지 상기 상전이 온도보다 20℃ 아래인 온도 범위의 온도로 냉각시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 감압시키기 전에 상기 물질을 먼저 상전이 온도 내지 상기 상전이 온도보다 약 5℃ 아래인 온도 범위의 온도로 냉각시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 압력을 약 14 psi 이상의 양만큼 저하시키는 방법,
제 1 항에 있어서, 상기 압력을 약 7 psi 초과의 양만큼 저하시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 압력을 절대 압력 비율 P_i/P_f 가 약 1.2 이상이 되도록 저하시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 압력을 약 0.2 psi/초보다 큰 압력 강하 속도(ΔP/Δt)로 저하시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 압력을 40초 이하의 기간내에 저하시키는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 물질이 생바이러스 또는 약독화된 바이러스; 핵산; 모노클론 또는 폴리클론 항체; 바이오분자; 비펩티드 유사체; 펩티드; 및 단백질을 포함하는 성분을 함유하는 것인 방법.
제 21 항에 있어서, 재구성된 물질의 성분이 출발 물질의 성분과 관련된 기능 또는 활성과 유사한 기능 또는 활성을 나타내는 것인 방법.
제 21 항에 있어서, 재구성된 물질의 성분이 확률적으로 핵생성된 물질의 성분과 관련된 기능 또는 활성에 비해서 향상된 기능 또는 활성을 나타내는 것인 방법.
제 21 항에 있어서, 재구성된 물질의 성분이 출발 물질의 성분과 관련된 구조와 유사한 구조를 나타내는 것인 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 물질이 다수의 용기내에 함유되고, 모든 용기들로부터 재구성된 물질이 균일한 특성을 나타내는 것인 방법.
물질을 소정의 냉각 속도로 냉각시키는 단계;

압력을 급속 저하시켜서 상기 물질을 핵생성시키는 단계; 및

상기 핵생성된 물질을 소정의 최종 온도로 계속 냉각시켜서 상기 물질을 완전히 냉동시키는 단계를 포함하는, 물질의 냉동 과정을 제어하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 물질이 소정의 핵생성 온도에 도달한 때에 감압 단계를 개시하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 냉각 단계를 개시한 후 소정의 시간이 경과한 때에, 그리고 상기 물질의 온도가 상전이 온도보다 낮을 때 감압 단계를 개시하는 방법.
물질을 상전이 온도 부근의 온도 또는 상전이 온도 미만의 온도로 냉각시키는 단계;

상기 물질 근처의 압력을 저하시켜서 상기 물질의 핵생성을 유도하는 단계; 및

상기 핵생성된 물질을 소정의 최종 온도까지 계속 냉각시켜서 상기 물질의 응고를 촉진하는 단계를 포함하는 응고 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 물질이 1종 이상의 물질이 용해된 용액이고, 상기 물질 근처의 압력을 저하시키는 단계가 상기 용액 근처의 압력을 저하시켜서 상기 용액중의 1종 이상의 물질에서 상전이의 핵생성을 유도하는 단계를 더 포함하는 응고 방법.
기체를 상전이 온도 부근의 온도 또는 상전이 온도 미만의 온도로 냉각시키는 단계;

압력을 저하시켜서 상기 기체 내부에서 상전이의 핵생성을 유도하는 단계; 및

상기 핵생성된 기체를 소정의 최종 온도까지 계속 냉각시켜서 상기 기체를 응축시키는 단계를 포함하는, 기체의 응축 과정을 제어하는 방법.
물질을 상전이 온도 부근의 온도 또는 상전이 온도보다 높은 온도로 가온하는 단계; 및

상기 물질 근처의 압력을 저하시켜서 상기 물질의 상전이를 유도하는 단계를 포함하는, 물질의 상전이를 유도하는 방법.
물질을 가압된 기체 대기중에서 상전이 온도 부근의 온도로 만드는 단계; 및

압력을 저하시켜서 상기 물질의 상전이를 유도하는 단계를 포함하는, 물질의 상전이 방법.