BRPI0707390B1 - Método de induzir a nucleação de uma transição de fase em uma solução de base aquosa - Google Patents

Abstract

métodos de induzir a nucleação de uma transição de fase em um material, e de controlar o processo de congelamento de um material. métodos de induzir a nucleação de um material são fornecidos. os métodos divulgados compreendem as etapas de levar o material a uma temperatura próxima ou abaixo de uma temperatura de transição de fase e alterar a pressão para induzir a nucleação do material. o métodos divulgados são úteis em processos de secagem por congelamento, particularmente processos de secagem por congelamento farmacêuticos.

Description

“MÉTODO DE INDUZIR A NUCLEAÇÃO DE UMA TRANSIÇÃO DE FASE EM UMA SOLUÇÃO DE BASE AQUOSA”

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade ao pedido de patente provisório dos Estados Unidos serial número 60/771.868 depositado em 10 de Fevereiro de 2006.

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a um processo de nucleação, e mais particularmente, a um método de induzir a nucleação de uma transição de fase em um material em que o material é inicialmente levado a uma temperatura próxima ou abaixo de uma temperatura de transição de fase e subseqüentemente despressurizado de modo a induzir a nucleação do material.

Fundamentos da Invenção

O controle do processo geralmente aleatório de nucleação no estágio de congelamento de um processo de liofilização ou secagem por congelamento tanto para diminuir o tempo de processamento necessário para completar a secagem por congelamento quanto para aumentar a uniformidade do produto de frasco-a-frasco no produto acabado seria altamente desejável na técnica. Em um processo de secagem por congelamento farmacêutico típico, frascos múltiplos contendo uma solução aquosa comum são colocados em prateleiras que são esfriadas, geralmente em uma taxa controlada, até temperaturas baixas. A solução aquosa em cada frasco é esfriada abaixo da temperatura de congelamento termodinâmico da solução e permanece em um estado líquido metaestável sub-frio até que a nucleação ocorra.

A faixa de temperaturas de nucleação através dos frascos é distribuída aleatoriamente entre uma temperatura próxima à temperatura de congelamento termodinâmico e algum valor significantemente mais baixo

Petição 870190003302, de 11/01/2019, pág. 10/50 (por exemplo, até cerca de 30 °C) do que a temperatura de congelamento termodinâmico. Esta distribuição de temperaturas de nucleação induz variação de frasco-a-frasco em estrutura de cristal de gelo e enfim as propriedades físicas do produto liofilizado. Além disso, o estágio de secagem do processo de secagem por congelamento deve ser excessivamente longo para suprir a faixa de tamanhos de cristal de gelo e estruturas produzidas pelo fenômeno de nucleação estocástica natural.

Aditivos foram usados para aumentar a temperatura de nucleação de soluções sub-frias. Estes aditivos podem tomar muitas formas. E bem conhecido que certas bactérias (por exemplo, Pseudomonas syringae) sintetizam proteínas que ajudam a nuclear a formação de gelo em soluções aquosas sub-frias. As bactérias ou suas proteínas isoladas podem ser adicionadas a soluções para aumentar a temperatura de nucleação. Vários aditivos inorgânicos também demonstram um efeito de nucleação; o tal aditivo mais comum é iodeto de prata, Agí. Em geral, qualquer aditivo ou contaminante tem o potencial para servir como um agente de nucleação. Frascos de liofilização preparados em ambientes contendo níveis de particulado elevados geralmente nuclearão e congelarão em um grau mais baixo de sub-resffiamento do que os frascos preparados em ambientes com baixo teor de particulado.

Todos os agentes de nucleação descritos acima são rotulados “aditivos,” porque eles mudam a composição do meio em que eles nucleiam uma transição de fase. Estes aditivos não são tipicamente aceitáveis para produtos farmacêuticos secos por congelamento regulamentados e aprovados pelo FDA. Estes aditivos também não fornecem controle sobre o tempo e temperatura quando os frascos nucleiam e congelam. De preferência, os aditivos apenas operam para aumentar a temperatura de nucleação média dos frascos.

Cristais de gelo por si só podem agir como agentes de nucleação para a formação de gelo em soluções aquosas sub-frias. No método de “neblina”, um secador por congelamento úmido é enchido com um gás frio para produzir uma suspensão de vapor de partículas de gelo pequenas. As partículas de gelo são transportadas nos frascos e iniciam a nucleação quando elas contatam a interface do fluido.

O método de “neblina” não controla a nucleação de frascos múltiplos simultaneamente em um tempo e temperatura controlados. Em outras palavras, o evento de nucleação não ocorre concorrente ou instantaneamente dentro de todos os frascos na introdução do vapor frio no secador por congelamento. Os cristais de gelo levarão algum tempo para trabalhar de seu modo em cada um dos frascos para iniciar a nucleação, e tempos de transporte provavelmente devem ser diferentes para frascos em diferentes locais dentro do secador por congelamento. Para secadores por congelamento industriais em grande escala, a implementação do método de “neblina” requerería mudanças no projeto de sistema visto que dispositivos de convecção interna podem ser necessários para auxiliar em uma distribuição mais uniforme da “neblina” por todo o secador por congelamento. Quando as prateleiras do secador por congelamento são continuamente esfriadas, a diferença de tempo entre quando o primeiro frasco congela e o último frasco congela criará uma diferença de temperatura entre os frascos, que aumentará a não uniformidade frasco-a-frasco em produtos secos por congelamento.

Pré tratamento do frasco por arranhadura, raspagem, ou aspereza também foi usado para diminuir o grau de sub-resfriamento necessário para a nucleação. Como com os outros métodos da técnica anterior, o pré tratamento do frasco também não comunica nenhum grau de controle sobre o tempo e temperatura quando os frascos individuais nucleiam e congelam, mas ao invés, apenas aumenta a temperatura de nucleação média de todos os frascos.

Vibração também foi usada para nuclear uma transição de fase em um material metaestável. Vibração suficiente para induzir a nucleação ocorre em freqüências acima de 10 kHz e pode ser produzida usando uma variedade de equipamento. Freqüentemente vibrações nesta faixa de freqüência são denominadas “ultrassônicas,” embora freqüências na faixa de 10 kHz a 20 kHz estão tipicamente dentro da faixa audível de seres humanos. A vibração ultrassônica freqüentemente produz cavitação, ou a formação de pequenas bolhas de gás, em uma solução sub-fria. No regime de cavitação transitório ou inercial, as bolhas de gás rapidamente crescem e colapsam, causando variações de pressão e temperatura localizadas muito altas. A capacidade da vibração ultrassônica induzir a nucleação em um material metaestável é freqüentemente atribuída às perturbações causadas por cavitação transitória. O outro regime de cavitação, denominado estável ou não-inercial, é caracterizado por bolhas que exibem oscilações de volume e forma estáveis sem colapso. O Pedido de Patente U.S. 20020031577 Al divulga que a vibração ultrassônica pode induzir nucleação mesmo no regime de cavitação estável, mas nenhuma explicação do fenômeno é proposta. O Pedido de Patente GB 2400901A também divulga que a probabilidade de causar cavitação, e conseqüentemente nucleação, em uma solução usando vibrações com freqüências acima de 10 kHz pode ser aumentada reduzindo-se a pressão ambiente em tomo da solução ou dissolvendo-se um fluido volátil na solução.

Um método de eletrocongelamento também foi usado no passado para induzir a nucleação em líquidos sub-frios. O eletrocongelamento é geralmente realizado liberando-se campos elétricos relativamente altos (~ 1 V/nm) em uma maneira contínua ou pulsada entre eletrodos estreitamente espaçados imersos em um líquido ou solução sub-frios. Desvantagens associadas com um processo de eletrocongelamento em aplicações de liofilização típicas incluem a complexidade relativa e custo para implementar e manter, particularmente para aplicações de liofilização usando frascos ou recipientes múltiplos. Também, o eletrocongelamento não pode ser diretamente aplicado a soluções contendo espécies iônicas (por exemplo, NaCl).

Recentemente, existem estudos que examinam o conceito de ‘congelamento de superfície induzido por vácuo’ (Ver por exemplo, Patente U.S. N^s 6.684.524). Em tal ‘congelamento de superfície induzido por vácuo’, frascos contendo uma solução aquosa são carregados em uma prateleira de temperatura controlada em um secador por congelamento e mantidos inicialmente em tomo de 10 graus Celsius. A câmara de secagem por congelamento depois é evacuada até próxima a pressão de vácuo (por exemplo, 1 mbar) que causa o congelamento de superfície das soluções aquosas até profundidades de alguns milímetros. A liberação subseqüente do vácuo e diminuição da temperatura da prateleira abaixo do ponto de congelamento da solução permite o crescimento de cristais de gelo da camada de superfície pré congelada através do restante da solução. Uma desvantagem principal para implementar este processo de ‘congelamento de superfície induzido por vácuo’ em uma aplicação de liofilização típica é o alto risco de intensamente ferver ou desgaseificar a solução sob condições estabelecidas.

O controle melhorado do processo de nucleação pode permitir que o congelamento de todos os frascos de solução farmacêutica não congelados em um secador por congelamento ocorra dentro de uma faixa de temperatura e tempo mais estreita, produzindo deste modo um produto liofilizado com maior uniformidade de frasco-a-frasco. O controle da temperatura de nucleação mínima pode afetar a estrutura de cristal de gelo formada dentro do frasco e levar em consideração um processo de secagem por congelamento muito acelerado.

Portanto, uma necessidade existe para controlar o processo aleatório de nucleação em vários processos de congelamento incluindo o estágio de congelamento de um processo de secagem por congelamento ou liofilização tanto para diminuir o tempo de processamento necessário para completar a secagem por congelamento quanto para melhorar a uniformidade do produto de frasco-a-frasco no produto acabado. Portanto seria desejável fornecer um processo que possui algumas, ou preferivelmente todas as características acima.

Sumário da Invenção

A presente invenção pode ser caracterizada como um método para induzir a nucleação de uma transição de fase em um material, o método compreendendo as etapas de levar o material a uma temperatura próxima ou abaixo de uma temperatura de transição de fase do material e diminuir a pressão para induzir a nucleação da transição de fase no material.

A invenção também pode ser caracterizada como um método de controlar o processo de congelamento de uma solução compreendendo as etapas de: resfriar a solução em uma taxa de resfriamento prescrita; diminuir rapidamente a pressão para induzir a nucleação da solução; e continuar o resfriamento da solução nucleada até uma temperatura final prescrita para congelar a solução. A despressurização é iniciada quando a solução atinge uma temperatura de nucleação desejada ou em um tempo desejado depois do início da etapa de resfriamento.

A invenção pode ser caracterizada ainda como um processo de solidificação compreendendo as etapas de: resfriar um material até uma temperatura próxima ou abaixo de uma temperatura de transição de fase; diminuir rapidamente a pressão próxima ao material para induzir a nucleação do material; e continuar o resfriamento do material nucleado até uma temperatura final prescrita para facilitar a solidificação do material.

Finalmente, a invenção pode ser caracterizada como um método de controlar o processo de condensação de um gás compreendendo as etapas de: resfriar o gás até uma temperatura próxima ou abaixo de uma temperatura de transição de fase; diminuir rapidamente a pressão para induzir a nucleação dentro do gás; e continuar o resfriamento do gás nucleado até uma temperatura final prescrita para condensar o gás.

Breve Descrição dos Desenhos

Os aspectos, características, e vantagens acima e outros da presente invenção serão mais evidentes a partir da descrição seguinte, mais detalhada desta apresentada em combinação com os desenhos seguintes, em que:

A Fig. 1 é um gráfico que representa o gráfico de temperatura versus tempo de uma solução que sofre um processo de nucleação estocástica e que mostra ainda a faixa de temperaturas de nucleação da solução;

A Fig. 2 é um gráfico que representa o gráfico de temperatura versus tempo de uma solução que sofre um processo de resfriamento equilibrado com nucleação despressurizada de acordo com os presentes métodos; e

A Fig. 3 é um gráfico que representa o gráfico de temperatura versus tempo de uma solução que sofre um processo de resfriamento dinâmico com nucleação despressurizada de acordo com os presentes métodos.

Descrição Detalhada da Invenção

A nucleação é o início de uma transição de fase em uma região pequena de um material. Por exemplo, a transição de fase pode ser a formação de um cristal a partir de um líquido. O processo de cristalização (isto é, formação de cristais sólidos a partir de uma solução) freqüentemente associado com o congelamento de uma solução começa com um evento de nucleação seguido por crescimento de cristal.

No processo de cristalização, nucleação é a etapa onde moléculas selecionadas dispersas na solução ou outro material começam a agrupar-se para criar grupos na escala nanométrica como para tomar-se estável sob as condições de operação correntes. Estes grupos estáveis constituem os núcleos. Os grupos precisam alcançar um tamanho crítico de modo a tomarem-se núcleos estáveis. Tal tamanho crítico é usualmente imposto pelas condições de operação tais como temperatura, contaminantes, grau de supersaturação, etc. e pode variar de uma amostra da solução a uma outra. Ele é durante a nucleação o evento que os átomos na solução arranjamse em uma maneira definida e periódica que define a estrutura de cristal.

Crescimento de cristal é o crescimento subseqüente dos núcleos que sucedem em obter o tamanho de grupo crítico. Dependendo das condições a nucleação ou crescimento de cristal podem predominar sobre o outro, e como um resultado, cristais com tamanhos e formas diferentes são obtidos. O controle de tamanho e forma de cristal constitui um dos principais desafios na fabricação industrial, tal como para produtos farmacêuticos.

O presente método diz respeito a um processo para controlar o tempo e/ou temperatura em que uma transição de fase nucleada ocorre em um material. Em aplicações de congelamento, a probabilidade de que um material espontaneamente nucleie e comece a mudança de fase é relacionada ao grau de sub-resfriamento do material e à ausência ou presença de contaminantes, aditivos, estruturas, ou perturbações que fornecem um sítio ou superfície para nucleação.

A etapa de congelamento ou solidificação é particularmente importante no processo de secagem por congelamento onde técnicas existentes resultam em diferenças de temperatura de nucleação através de uma grande quantidade de frascos ou recipientes. As diferenças de temperatura de nucleação tendem a produzir um produto não uniforme e um tempo de secagem excessivamente longo. Os presentes métodos, por outro lado, fornecem um grau mais alto de controle de processo em processos de solidificação por lote (por exemplo, secagem por congelamento) e produzem um produto com estrutura e propriedades mais uniformes. Diferente de algumas das técnicas da técnica anterior para induzir a nucleação, os presentes métodos requerem mudanças mínimas de equipamento e operacionais para a implementação.

Em princípio, os presentes métodos podem ser aplicados a qualquer etapa de processamento de material que envolve uma transição de fase nucleada. Exemplos de tais processos incluem o congelamento de um líquido, cristalização de gelo de uma solução aquosa, cristalização de polímeros e metais a partir de fundições, cristalização de materiais inorgânicos a partir de soluções supersaturadas, cristalização de proteínas, produção de neve artificial, deposição de gelo a partir de vapor, congelamento de alimentos, concentração do congelamento, cristalização fracionada, criopreservação, ou condensação de vapores a líquidos. A partir de um ponto de vista conceituai, os presentes métodos também podem ser aplicados a transições de fase tais como fusão e ebulição.

O método presentemente divulgado representa uma melhora para processos de liofilização farmacêutica correntes. Por exemplo, dentro de um secador por congelamento industrial grande podem haver mais de 100.000 frascos contendo um produto farmacêutico que precisa ser congelado e seco. A prática corrente na indústria é resfriar a solução a um grau muito alto de modo que a solução em todos os frascos ou recipientes no secador por congelamento seja garantida a congelar. O conteúdo de cada frasco ou recipiente, entretanto, congela aleatoriamente em uma faixa de temperaturas abaixo do ponto de congelamento, porque o processo de nucleação é descontrolado.

Voltando-se agora às Figuras, e em particular Fig. 1, é representado um gráfico de temperatura versus tempo de seis frascos de uma solução aquosa que sofre um processo de nucleação estocástica convencional que mostra a faixa típica de temperaturas de nucleação da solução dentro dos frascos (11, 12, 13, 14, 15, e 16). Como observado nesta, os conteúdos do frasco têm uma temperatura de congelamento termodinâmico de cerca de 0 °C no entanto a solução dentro de cada frasco naturalmente nucleia na faixa de temperatura ampla de cerca de -7 °C a -20 °C ou mais, como destacado pela área 18. O gráfico 19 representa a temperatura da prateleira dentro da câmara de secagem por congelamento.

Reciprocamente, as Fig. 2 e Fig. 3 representam gráficos de temperatura versus tempo de uma solução que sofre um processo de congelamento com nucleação despressurizada de acordo com os presentes métodos. Em particular, a Fig. 2 mostra o gráfico de temperatura versus tempo de seis frascos de uma solução aquosa que sofre um processo de resfriamento equilibrado (Ver o Exemplo 2) com a nucleação induzida por intermédio de despressurização da câmara (21, 22, 23, 24, 25, e 26). Os conteúdos do frasco têm uma temperatura de congelamento termodinâmico de cerca de 0 °C no entanto a solução dentro de cada frasco nucleia ao mesmo tempo em despressurização e dentro de uma faixa de temperatura muito estreita (isto é, -4 °C a -5 °C) como observado na área 28. O gráfico 29 representa a temperatura da prateleira dentro da câmara de secagem por congelamento e representa um processo de congelamento equilibrado, um onde a temperatura das prateleiras é mantida mais ou menos estável antes da despressurização.

Similarmente, a Fig. 3 mostra o gráfico de temperatura versus tempo de três frascos de uma solução aquosa que sofre um processo de resfriamento dinâmico (Ver o Exemplo 7) com nucleação induzida por intermédio de despressurização da câmara (31, 32, e 33). Novamente, os conteúdos do frasco têm uma temperatura de congelamento termodinâmico de cerca de 0 °C no entanto a solução dentro de cada frasco nucleia ao mesmo tempo em despressurização em uma faixa de temperatura de cerca de -7 °C a 10 °C como observado na área 38. O gráfico 39 representa a temperatura da prateleira dentro da câmara de secagem por congelamento e geralmente representa um processo de resfriamento dinâmico, um onde a temperatura das prateleiras é ativamente diminuída durante ou antes da despressurização.

Como ilustrado nas Figuras, os presentes métodos fornecem controle melhorado do processo de nucleação permitindo-se que o congelamento de soluções farmacêuticas em um secador por congelamento ocorra dentro de uma faixa de temperatura mais estreita (por exemplo, cerca de 0 °C a -10 °C) e/ou concorrentemente, produzindo deste modo um produto liofilizado com maior uniformidade de frasco-a-frasco. Embora não demonstrado, é previsível que a faixa de temperatura de nucleação induzida possa estender-se ainda levemente acima da temperatura de transição de fase e também possa estender-se até cerca de 40 °C de sub-resfriamento.

Um outro benefício associado com os presentes métodos é que controlando-se a temperatura de nucleação mais baixa e/ou o tempo exato de nucleação um pode afetar a estrutura de cristal de gelo formado dentro dos frascos ou recipientes congelados. A estrutura de cristal de gelo é uma variável que afeta o tempo que leva para o gelo sublimar. Assim, controlandose a estrutura de cristal de gelo, é possível acelerar muito o processo de secagem por congelamento global.

Em um sentido amplo, os métodos presentemente divulgados para induzir a nucleação de uma transição de fase dentro do material compreendem as etapas de: (i) resfriar o material a uma temperatura próxima ou abaixo de uma temperatura de transição de fase do material; e (ii) diminuir rapidamente a pressão para induzir a nucleação do material. Cada uma destas etapas importantes será debatida em mais detalhe abaixo.

ETAPA 1 - RESFRIAR O MATERIAL

Materiais ilustrativos útil no presente método incluem substâncias puras, gases, suspensões, géis, líquidos, soluções, misturas, ou componentes dentro de uma solução ou mistura. Materiais adequados para o uso no presente método podem incluir, por exemplo, materiais farmacêuticos, materiais biofarmacêuticos, gêneros alimentícios, materiais químicos, e podem incluir produtos tais como produtos de cuidado do ferimento, cosméticos, produtos veterinários e produtos relacionados a diagnósticos in vivo/in vitro e semelhantes. Quando o material é um líquido, pode ser desejável dissolver gases no líquido. Líquidos em um ambiente gasoso controlado geralmente terão gases dissolvidos neles.

Outros materiais ilustrativos úteis no presente método incluem material biológico ou biofarmacêutico tal como tecidos, órgãos e estruturas multi-celulares. Para certas aplicações biológicas e farmacêuticas, o material pode ser uma solução ou mistura que inclui: um vírus vivo ou atenuado; ácidos nucleicos; anticorpos monoclonais; anticorpos policlonais; biomoléculas; análogos de não peptídeo; peptídeos, incluindo polipeptídeos, miméticos de peptídeo e peptídeos modificados; proteínas, incluindo proteínas de fusão e modificadas; RNA, DNA e subclasses destes; oligonucleotídeos; partículas virais; e tais materiais similares ou componentes destes.

Soluções farmacêuticas ou biofarmacêuticas contidas em frascos ou recipientes para secagem por congelamento seriam um bom exemplo de um material que beneficiaria-se do presente método. As soluções são na maioria das vezes água e são substancialmente incompressíveis. Tais soluções farmacêuticas ou biofarmacêuticas também são altamente puras e geralmente livres de particulados que podem formar sítios para nucleação. A temperatura de nucleação uniforme é importante para a criação de uma estrutura de cristal de gelo consistente e uniforme de frasco a frasco ou recipiente a recipiente. A estrutura de cristal de gelo desenvolvida também afeta muito o tempo necessário para secar.

Como aplicado a um processo de secagem por congelamento, o material é preferivelmente colocado em uma câmara, tal como uma câmara de secagem por congelamento. Preferivelmente, a câmara é configurada de modo a permitir controle da temperatura, pressão, e atmosfera gasosa dentro da câmara. A atmosfera gasosa pode incluir, mas não é limitada a: argônio, nitrogênio, hélio, ar, água vapor, oxigênio, dióxido de carbono, monóxido de carbono, óxido nitroso, óxido nítrico, neônio, xenônio, criptônio, metano, hidrogênio, propano, butano, e semelhantes, incluindo misturas permissíveis destes. A atmosfera gasosa preferida compreende um gás inerte, tal como argônio, em uma pressão entre cerca de 7 (48,2 kPa) a cerca de 50 psig (0,35 MPa) ou mais. Temperaturas dentro da câmara do secador por congelamento são ffeqüentemente impostas pelo processo de secagem por congelamento e são facilmente controladas por intermédio do uso de um fluido de transferência de calor que esfria ou aquece as prateleiras dentro da câmara para conduzir a temperatura dos frascos ou recipientes e do material dentro de cada frasco ou recipiente.

De acordo com os presentes métodos, o material é esfriado a uma temperatura próxima ou abaixo de sua temperatura de transição de fase. No caso de uma solução de base aquosa que sofre um processo de secagem por congelamento, a temperatura de transição de fase é o ponto de congelamento termodinâmico da solução. Onde a solução atinge temperaturas abaixo do ponto de congelamento termodinâmico da solução, ela é dita ser sub-esfriada. Quando aplicado a um processo de congelamento de uma solução de base aquosa, o presente método é eficaz quando o grau de subresfriamento varia de próximo ou abaixo da temperatura de transição de fase até cerca de 40 °C de sub-resfriamento, e mais preferivelmente entre cerca de 3 °C de sub-resfriamento e 10 °C de sub-resfriamento. Em alguns dos exemplos descritos abaixo, o presente método de induzir a nucleação trabalha desejavelmente mesmo onde a solução tem apenas cerca de 1 °C de subresfriamento abaixo de seu ponto de congelamento termodinâmico.

Onde o material está em uma temperatura abaixo de sua temperatura de transição de fase, ele é freqüentemente referido como estando em um estado metaestável. Um estado metaestável é um estado instável e transitório, mas relativamente duradouro de um sistema químico ou biológico. Um material metaestável temporariamente existe em uma fase ou estado que não é sua fase ou estado de equilíbrio. Na ausência de quaisquer mudanças no material ou seu ambiente, um material metaestável eventualmente passará de seu estado de não equilíbrio ao seu estado de equilíbrio. Materiais metaestáveis ilustrativos incluem soluções super-saturadas e líquidos subffios.

Um exemplo típico de um material metaestável seria água líquida em pressão atmosférica e uma temperatura de -10 °C. Com um ponto de congelamento normal de 0 °C, a água líquida não deve existir termodinamicamente nesta temperatura e pressão, mas ela pode existir na ausência de um evento de nucleação ou estrutura para começar o processo de cristalização de gelo. A água extremamente pura pode ser esfriada a temperaturas muito baixas (-30 °C a -40 °C) em pressão atmosférica e ainda permanecer no estado líquido. Tal água sub-ffia está em um estado termodinamicamente metaestável não equilibrado. Ela apenas carece de um evento de nucleação para fazer com que ela comece a transição de fase por meio da qual ela voltará ao equilíbrio.

Como debatido acima, os presentes métodos de induzir a nucleação de uma transição de fase dentro de um material ou congelar um material podem ser utilizados com vários perfis de resfriamento, incluindo, por exemplo, um ambiente de resfriamento equilibrado ou um ambiente de resfriamento dinâmico (Ver as Figs. 2 e 3).

ETAPA 2 - DIMINUIR RAPIDAMENTE A PRESSÃO

Quando o material atingiu a temperatura desejada próxima ou abaixo da temperatura de transição de fase, a câmara é prontamente ou rapidamente despressurizada. Esta despressurização provoca a nucleação e transição de fase da solução dentro dos frascos ou recipientes. Na forma de realização preferida, a despressurização da câmara é realizada abrindo-se ou parcialmente abrindo-se uma válvula de controle grande que separa a câmara de alta pressão do ambiente local ou uma câmara ou ambiente de pressão mais baixa. A pressão elevada é rapidamente diminuída por fluxo de massa de atmosfera gasosa fora da câmara. A despressurização precisa ser razoavelmente rápida para induzir a nucleação. A despressurização deve ser acabada em vários segundos ou menos, preferivelmente 40 segundos ou menos, mais preferivelmente 20 segundos ou menos, e o mais preferivelmente 10 segundos ou menos.

Em aplicações de secagem por congelamento típicas, a diferença de pressão entre a pressão inicial da câmara e a pressão final da câmara, depois da despressurização, deve ser maior do que cerca de 7 psi (48,2 kPa), embora quedas de pressão menores podem induzir a nucleação em algumas situações. A maioria dos secadores por congelamento comerciais podem adaptar facilmente a faixa de quedas de pressão necessárias para controlar a nucleação. Muitos secadores por congelamento são designados com classificações de pressão em excesso de 25 psig (0,17 MPa) para opor-se a procedimentos de esterilização convencionais que utilizam vapor saturado a 121 °C. Tais classificações de equipamento fornecem uma janela ampla para induzir a nucleação seguindo protocolos que despressurizam a partir de pressões de partida acima da pressão ambiente ou da pressão no ambiente local. A pressão elevada e despressurização subseqüente podem ser obtidas através de quaisquer meios conhecidos (por exemplo, pneumático, hidráulico, ou mecânico). Nas formas de realização preferidas, pressões operantes para os presentes métodos devem permanecer abaixo da pressão supercrítica de qualquer gás aplicado, e submeter o material a pressões baixas extremas (isto é, cerca de 10 mTorr ou menos) deve ser evitado durante a nucleação do material.

Embora não desejando estar ligado a qualquer mecanismo particular, um mecanismo possível para explicar a nucleação controlada observada na prática do presente método é que gases em solução no material saem da solução em despressurização e formam bolhas que nucleiam o material. Uma pressão elevada inicial aumenta a concentração de gás dissolvido na solução. A diminuição rápida em pressão depois do resfriamento reduz a solubilidade do gás, e a liberação subseqüente de gás da solução sub-ffia provoca a nucleação da transição de fase.

Um outro mecanismo possível é que a diminuição da temperatura do gás próximo ao material durante a despressurização causa uma mancha fria na superfície do material que inicia a nucleação. Um outro mecanismo possível é que a despressurização causa a evaporação de algum líquido no material e o resfriamento resultante do processo de evaporação endotérmico pode iniciar a nucleação. Um outro mecanismo possível é que o gás frio despressurizado próximo ao material congela algum vapor em equilíbrio com o material antes da despressurização ou liberado do material por evaporação durante a despressurização; as partículas sólidas resultantes entram novamente no material e agem como sementes ou superfícies para iniciar a nucleação. Um ou mais destes mecanismos podem contribuir para o início da nucleação de congelamento ou solidificação até extensões diferentes dependendo da natureza do material, seu ambiente e da transição de fase que é nucleada.

O processo pode ser realizado inteiramente em uma pressão maior do que a pressão ambiente ou sobre uma faixa de pressões que estendem-se sobre a pressão ambiente. Por exemplo, a pressão inicial da câmara pode estar acima da pressão ambiente e da pressão final da câmara, depois da despressurização, pode estar acima da pressão ambiente mas ser menos do que a pressão inicial da câmara; a pressão inicial da câmara pode estar acima da pressão ambiente e da pressão final da câmara, depois da despressurização, pode estar em tomo da pressão ambiente ou levemente abaixo da pressão ambiente.

Acredita-se que a taxa e magnitude da queda de pressão também sejam um aspecto importante dos presentes métodos. Experimentos têm mostrado que a nucleação será induzida onde a queda de pressão (AP) é maior do que cerca de 7 psi (48,2 kPa). Altemativamente, a magnitude da queda de pressão pode ser expressada como uma razão de pressão absoluta, R = Pj/Pf, onde Pj é a pressão absoluta inicial e P_f é pressão absoluta final. Acredita-se que a nucleação possa ser induzida na despressurização onde a razão de pressão absoluta, R, é maior do que cerca de 1,2 em muitas aplicações práticas dos presentes métodos. A taxa de queda de pressão também desempenha um papel importante nos presentes métodos. Um método de caracterizar a taxa de queda de pressão é através do uso de um parâmetro, A, onde A = ΔΡ/At. Novamente, é suposto que a nucleação será induzida para valores de A maiores do que um valor prescrito, tal como cerca de 0,2 psi (1,38 kPa)/s. Dados empíricos através da experimentação devem ajudar uma pessoa a determinar a queda de pressão preferida e taxa de queda de pressão.

Os exemplos seguintes destacam vários aspectos e características dos métodos presentemente divulgados de induzir a nucleação em um material e não devem ser tomados em um sentido limitante. De preferência, estes exemplos são ilustrativos apenas e o escopo da invenção deve ser determinado apenas com respeito às reivindicações, anexas à esta.

EXEMPLOS

Todos os exemplos descritos aqui foram realizados em um secador por congelamento VirTis 51-SRC em escala piloto tendo quatro prateleiras com aproximadamente 1,0 m de espaço de prateleira total e um condensador interno. Esta unidade foi aperfeiçoada para manter pressões positivas de até cerca de 15 psig (0,10 MPa). Uma abertura circular de 1,5” de diâmetro também foi adicionada à parede traseira da câmara de secagem por congelamento com tubulação de aço inoxidável de 1,5” (3,81 cm) de diâmetro estendendo-se do furo através do isolamento da parede traseira para emergir da parte traseira do secador por congelamento. Duas válvulas de esfera acionadas por ar com passagem integral de 1,5” (3,81 cm), foram ligadas à esta tubulação por intermédio de conexões sanitárias. Uma válvula de esfera deixou o gás fluir na câmara de secagem por congelamento e deste modo fornece pressões positivas de até 15 psig (0,10 MPa). A segunda válvula de esfera deixou o gás fluir para fora da câmara de secagem por congelamento e deste modo reduz a pressão da câmara a condições atmosféricas (0 psig) (0 MPa). Toda a refrigeração das prateleiras e condensador do secador por congelamento foi realizada por intermédio da circulação de fluido de transferência de calor Dynalene MV resfriado por nitrogênio líquido usando o sistema Praxair Ncool®-HX.

Todas as soluções foram preparadas em um espaço limpo de classe 100. O secador por congelamento foi posicionado com a porta, prateleiras, e controla tudo acessível do espaço limpo enquanto os outros componentes (bombas, aquecedores, etc.) foram localizados em um ambiente de espaço não limpo. Todas as soluções foram preparadas com água de grau HPLC (Fisher Scientific, filtrada através de membrana de 0,10 pm). As soluções finais foram filtradas através de uma membrana de 0,22 pm antes de encher os frascos ou recipientes de liofilização. Todos os gases foram fornecidos por intermédio de cilindros e foram filtrados através de filtros de 0,22 pm para remover os particulados. Os recipientes de vidro (frascos de 5 mL e garrafas de 60 mL) foram obtidos pré limpo para particulados da Wheaton Science Products. Carregadores farmaceuticamente aceitáveis foram usados onde apropriado. As etapas acima foram tomadas para garantir que os materiais e métodos satisfaçam padrões de fabricação farmacêutica convencionais para particulados, que agem como agentes de nucleação.

Como usado aqui, “carregador farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, antioxidantes, sais, revestimentos, tensoativos, conservantes (por exemplo, phidroxibenzoato de metila ou propila, ácido sórbico, agentes antibacterianos, agentes antifungicos), agentes isotônicos, agentes de retardo de solução (por exemplo, parafina), absorvedores (por exemplo, argila de caulim, argila de bentonita), estabilizadores de medicamento (por exemplo, lauril sulfato de sódio), géis, aglutinantes (por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinil pirrolidona, carbóxi-metil-celulose, alginatos), excipientes (por exemplo, lactose, açúcar do leite, polietileno glicol), agente de desintegração (por exemplo, ágar-ágar, amido, lactose, fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, ácido algínico, sorbitol, glicina), agentes umectantes (por exemplo, álcool cetílico, monoestearato de glicerol), lubrificantes, aceleradores de absorção (por exemplo, sais de amônio quaternário), óleos comestíveis (por exemplo, óleo de amêndoa, óleo de coco, ésteres oleosos ou propileno glicol), agentes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes colorantes, enchedores, (por exemplo, amido, lactose, sacarose, glicose, manitol), lubrificantes de tabletagem (por exemplo, estearato de magnésio, amido, glicose, lactose, flor de arroz, giz), carregadores para inalação (por exemplo, propulsores de hidrocarboneto), agentes tamponantes, ou como materiais semelhantes e combinações destes, como seria conhecido a uma pessoa de habilidade comum na técnica.

Para as condições experimentais descritas aqui e todas as formulações de liofilização estudadas, a nucleação estocástica foi tipicamente observada ocorrer em temperaturas de recipiente entre cerca de -8 °C e -20 °C e ocasionalmente tão quentes quanto -5 °C. Os recipientes geralmente podem ser mantidos em temperaturas mais quentes do que -8 °C durante períodos longos de tempo sem nucleação. O início da nucleação e crescimento subseqüente de cristal (isto é, congelamento) foi determinado por medição de temperatura como o ponto em que a temperatura do recipiente rapidamente aumentou em resposta ao calor latente exotérmico de fusão. O início do congelamento também pode ser visualmente determinado através de um indicador visual na porta da câmara do secador por congelamento.

Exemplo 1 - Controle da Temperatura de Nucleação

Quatro frascos separados foram enchidos com 2,5 mL de solução de manitol a 5 % em peso. O ponto de congelamento termodinâmico prognosticado da solução de manitol a 5 % em peso é aproximadamente -0,5 °C. Os quatro frascos foram colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. As temperaturas dos quatro frascos foram monitoradas usando termopares montados em superfície. O secador por congelamento foi pressurizado com argônio a 14 psi (95,6 kPa)g.

A prateleira do secador por congelamento foi esfriada para obter temperaturas de frasco entre aproximadamente -1,3 °C e cerca de -2,3 °C (precisão de medição de +/- 1 °C dos termopares). O secador por congelamento depois foi despressurizado de cerca de 14 psi (95,6 kPa)g a cerca da pressão atmosférica em menos do que cinco segundos para induzir a nucleação da solução dentro dos frascos. Todos os quatro frascos nuclearam e começaram o congelamento imediatamente depois da despressurização. Resultados são resumidos na Tabela 1 abaixo.

Como observado na Tabela 1, as temperaturas de nucleação controladas neste exemplo (isto é, Temperaturas de Frasco Iniciais) são muito próximas ao ponto de congelamento termodinâmico prognosticado da solução. Assim o presente método permite que o controle da nucleação ocorra em soluções que têm um grau de sub-resfriamento muito baixo ou em temperaturas de nucleação próximas ou apenas levemente mais frias do que seus pontos de congelamento.

Frasco # Solução Átomos Temp. inicial Queda de Resultado da do frasco Pressão Despressurização [°C] [psi] (6,9 kPa)

1	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Argônio	-2,3	14	Nucleação
2	2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-1,3	14	Nucleação
3	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-2,1	14	Nucleação
4	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-1,7	14	Nucleação

em peso

Tabela 1. Controle da Temperatura de Nucleação.

Exemplo 2 - Controle da Temperatura de Nucleação

Neste exemplo, noventa e cinco frascos foram enchidos com

2,5 mL de solução de manitol a 5 % em peso. O ponto de congelamento termodinâmico da solução de manitol a 5 % em peso é aproximadamente -0,5 °C. Os noventa e cinco frascos foram colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. As temperaturas de seis frascos posicionados em locais diferentes na prateleira do secador por congelamento foram continuamente monitorados usando termopares montados em superfície. O secador por congelamento foi pressurizado em uma atmosfera de argônio a cerca de 14 psig (95,6 kPa). A prateleira do secador por congelamento depois foi esfriada para obter temperaturas de frasco de próximo a -5 °C. O secador por congelamento depois foi despressurizado de cerca de 14 psig (95,6 kPa) a cerca da pressão atmosférica em menos do que cinco segundos para induzir a nucleação da solução dentro dos frascos. Todos os noventa e cinco frascos foram visualmente observados nuclear e começam o congelamento imediatamente depois da despressurização. Dados de termopar para os seis frascos monitorados confirmaram a observação visual. Os resultados são resumidos na Tabela 2.

Como observado nesta, temperaturas de nucleação controladas neste exemplo (isto é, Temperaturas Iniciais do Frasco) estão um pouco abaixo do ponto de congelamento termodinâmico prognosticado da solução. Assim o presente método permite que o controle da nucleação ocorra em soluções que têm um grau moderado de sub-resfriamento. Este exemplo também demonstra escalabilidade do presente método a uma aplicação de frascos múltiplos.

Frasco #	Solução	Átomos	Temp. Inicial do Frasco	Queda de Pressão	Resultado da Despressurização
1	2,5 mL de manitol a	Argônio	[°C] -4,2	[psi] (6,9 kPa) 14	Nucleação
2	5 % em peso 2,5 mL de manitol a	Argônio	-4,4	14	Nucleação
3	5 % em peso 2,5 mL de manitol a	Argônio	-4,6	14	Nucleação
4	5 % em peso .2,5 mL de manitol a	Argônio	-4,4	14	Nucleação
5	5 % em peso 2,5 mL de manitol a	Argônio	-4,6	14	Nucleação
6	5 % em peso 2,5 ml. de manitol a 5	Argônio	-5,1	14	Nucleação

% em peso

Tabela 2. Controle da Temperatura de Nucleação.

Exemplo 3 - Controle da Magnitude de Despressurização

Neste exemplo, frascos múltiplos foram enchidos com 2,5 mL de solução de manitol a 5 % em peso. Novamente, o ponto de congelamento termodinâmico prognosticado da solução de manitol a 5 % em peso é de aproximadamente -0,5 °C. Para cada rodada de teste, os frascos foram colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. Como com os exemplos descritos mais no início, as temperaturas dos frascos foram monitoradas usando termopares montados em superfície. A atmosfera de argônio no secador por congelamento foi pressurizada a pressões diferentes e a prateleira do secador por congelamento foi esfriada para obter temperaturas de frasco de cerca de -5 °C. Em cada rodada de teste, o secador por congelamento depois foi rapidamente despressurizado (isto é, em menos do que cinco segundos) da pressão selecionada à pressão atmosférica em um esforço para induzir a nucleação da solução dentro dos frascos. Os resultados são resumidos na Tabela 3.

Como observado na Tabela 3, a nucleação controlada ocorreu onde a queda de pressão foi de cerca de 7 psi (48,2 kPa) ou maior e a temperatura de nucleação (isto é, temperatura inicial do frasco) estava entre cerca de -4,7 °C e -5,8 °C.

Frasco #	Solução	Átomos	Temperatura Queda de	Resultado da Despressurização
inicial do Frasco [°C]	Pressão [psi] (6,9
1	2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-4,7	kPa) 7	Nucleação
2	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,1	7	Nucleação
3	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,3	7	Nucleação
4	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,6	7	Nenhuma
5	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,6	7	Nucleação Nucleação
6	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,8	7	Nucleação
7	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,4	6	Nenhuma
8	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,7	6	Nucleação Nenhuma
9	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,8	6	Nucleação Nenhuma
10	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,1	5	Nucleação Nenhuma
11	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,4	5	Nucleação Nenhuma
12	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,5	5	Nucleação Nenhuma
13	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-4,7	4	Nucleação Nenhuma
14	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,1	4	Nucleação Nenhuma
15	em peso 2,5 mL de manitol a 5 %	Argônio	-5,3	4	Nucleação Nenhuma
	em peso				Nucleação

Tabela 3. Efeito da Magnitude de Despressurização

Exemplo 4 - Controle das Taxas de Despressurização

Para este exemplo, frascos múltiplos foram enchidos com cerca de 2,5 mL de solução de manitol a 5 % em peso tendo um ponto de congelamento termodinâmico prognosticado de aproximadamente -0,5 °C. Para cada rodada de teste de tempo de despressurização variado, os frascos foram colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. Como com os exemplos descritos mais no 10 início, as temperaturas dos frascos foram monitoradas usando termopares montados em superfície. Como os exemplos descritos acima, a atmosfera de argônio no secador por congelamento foi pressurizada a cerca de 14 psig (95,6 kPa) e a prateleira foi esfriada para obter temperaturas de frasco de aproximadamente -5 °C. Em cada rodada de teste, o secador por 5 congelamento depois foi despressurizado em taxas de despressurização diferentes de 14 psig (95,6 kPa) até a pressão atmosférica em um esforço para induzir a nucleação da solução dentro dos frascos.

Para estudar o efeito da taxa de despressurização ou tempo de despressurização, uma válvula de esfera de restrição foi colocada na saída da 10 válvula de controle de despressurização na parte traseira do secador por congelamento. Quando a válvula de restrição é completamente aberta, a despressurização de cerca de 14 psig (95,6 kPa) a cerca de 0 psig (0 kPa) é realizada em aproximadamente 2,5 segundos. Fechando-se apenas parcialmente a válvula de restrição, é possível aumentar variavelmente o 15 tempo de despressurização da câmara. Usando a válvula de esfera de restrição, várias rodadas de teste foram realizadas com a câmara do secador por congelamento despressurizado em taxas diferentes para verificar ou determinar o efeito da taxa de despressurização sobre a nucleação. Os resultados são resumidos na Tabela 4.

Frasco #	Solução	Átomos	Temp Inicial	Queda de	Tempo	Resultado da
			do Frasco	Pressão	[s]	Despressurização
			[°C]	[psi] (6,9
				kPa)
1	2,5 mL de manitol a	Argônio	-4,6	14	300	Nenhuma
	5 % em peso					Nucleação
2	2,5 mL de manitol a	Argônio	-5,4	14	300	Nenhuma
	5 % em peso					Nucleação
3	2,5 mL de manitol a	Argônio	-5,8	14	300	Nenhuma
	5 % em peso					Nucleação
4	2,5 mL de manitol a	Argônio	-4,6	14	200	Nenhuma
	5 % em peso					Nucleação
5	2,5 mL de manitol a	Argônio	-5,4	14	200	Nenhuma
	5 % em peso					Nucleação
6	2,5 mL de manitol a	Argônio	-5,4	14	200	Nenhuma
	5 % em peso					Nucleação
7	2,5 mL de manitol a	Argônio	-4,6	14	100	Nenhuma
	5 % em peso					Nucleação
8	2,5 ml. de manitol a	Argônio	-5,2	14	100	Nenhuma

% em peso Nucleação

9	2,5 mL de manitol a Argônio	-5,2	14	100	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
10	2,5 ml. de manitol a Argônio	-4,7	14	60	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
11	2,5 na, de manitol a Argônio	-5,1	14	60	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
12	2,5 mL de manitol a Argônio	-5,1	14	60	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
13	2,5 mL de manitol a Argônio	-5,1	14	50.	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
14	2,5 mi, de manitol a Argônio	-5,3	14	50	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
15	2,5 mL de manitol a Argônio	-4,9	14	50	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
16	2,5 ml., de manitol a Argônio	-5,4	14	42	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
17	2,5 ml. de manitol a Argônio	-5,5	14	42	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
18	2,5 mL de manitol a Argônio	-5,0	14	42	Nenhuma
	5 % em peso				Nucleação
19	2,5 mL de manitol a Argônio	-5,1	14	32	Nucleação
	5 % em peso
20	2,5 mL de manitol a Argônio	-5,7	14	32	Nucleação
	5 % em peso
21	2,5 mL de manitol a Argônio	-5,6	14	32	Nucleação
	5 % em peso
22	2,5 mL de manitol a Argônio	-4,7	14	13	Nucleação
	5 % em peso
23	2,5 mL de manitol a Argônio	-5,3	14	13	Nucleação
	5 % em peso
24	2,5 mL de manitol a Argônio	-5,5	14	13	Nucleação

% em peso

Tabela 4. Efeito do Tempo de Despressurização

Como observado na Tabela 4, a nucleação apenas ocorreu onde o tempo de despressurização foi menor do que 42 segundos, a queda de pressão foi cerca de 14 psi (95,6 kPa) ou maior e a temperatura de nucleação 5 (isto é, temperatura inicial do frasco) estava entre cerca de -4,6 °C e cerca de 5,8 °C. Estes resultados indicam que a despressurização precisa ser realizada relativamente de maneira rápida para que o método seja eficaz.

Exemplo 5 - Controle da Atmosfera Gasosa

Novamente, frascos múltiplos foram todos enchidos com cerca 10 de 2,5 mL de solução de manitol a 5 % em peso e colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. Como com os exemplos descritos mais no início, as temperatura dos frascos de teste foram monitoradas usando termopares montados em superfície. Para as rodadas de teste diferentes, a atmosfera gasosa no secador por congelamento foi variada sempre mantendo uma pressão positiva de cerca de 14 psig (95,6 kPa). Neste exemplo, a prateleira do secador por congelamento 5 foi esfriada para obter temperaturas de frasco de aproximadamente -5 °C a -7 °C. Em cada rodada de teste, o secador por congelamento depois foi rapidamente despressurizado de cerca de 14 psig (95,6 kPa) até a pressão atmosférica em um esforço para induzir a nucleação da solução dentro dos frascos. Os resultados são resumidos na Tabela 5.

Como observado nesta, a nucleação controlada ocorreu em todas as atmosferas gasosas exceto para a atmosfera de gás hélio onde a queda de pressão foi de cerca de 14 psi (95,6 kPa) e a temperatura de nucleação (isto é, temperatura inicial do frasco) estava entre -4,7 °C e cerca de -7,4 °C. Embora não mostrado nos exemplos, acredita-se que condições alternativas 15 provavelmente permitirão nucleação controlada em uma atmosfera de hélio.

Frasco #	Solução	Átomos	Temperatura	Queda de	Resultado da
			inicial do frasco [°C]	pressão [psi] (6,9 kPa)	despressurização
1	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Argônio	-4,9	14	Nucleação
2	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Argônio	-5,2	14	Nucleação
3	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Nitrogênio	-4,7	14	Nucleação
4	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Nitrogênio	-5,1	14	Nucleação
5	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Xenônio	-4,8	14	Nucleação
6	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Xenônio	-5,0	14	Nucleação
7	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Ar	-7,4	14	Nucleação
8	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Ar	-7,2	14	Nucleação
9	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Hélio	-5,8	14	Nenhuma Nucleação
10	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Hélio	-5,5	14	Nenhuma Nucleação

Tabela 5. Efeito da Composição da Atmosfera Gasosa

Exemplo 6 - Soluções de Volume Grande

Neste exemplo, seis garrafas de liofilização (capacidade de 60 mL) foram enchidas com cerca de 30 mL de solução de manitol a 5 % em peso tendo um ponto de congelamento termodinâmico prognosticado de aproximadamente -0,5 °C. As seis garrafas de liofilização foram colocadas em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. A temperatura de seis garrafas posicionadas em locais diferentes na prateleira do secador por congelamento foi monitorada usando termopares montados em superfície. O secador por congelamento foi pressurizado em uma atmosfera de argônio a cerca de 14 psig (95,6 kPa). A prateleira do secador por congelamento depois foi esfriada para obter temperaturas da garrafa de aproximadamente -5 °C. O secador por congelamento depois foi despressurizado de 14 psig (95,6 kPa) a cerca da pressão atmosférica em menos do que cinco segundos para induzir a nucleação da solução dentro das garrafas. Os resultados são resumidos na Tabela 6.

Em um experimento separado, uma bandeja plástica de secagem por congelamento em massa (Gore LYOGUARD, capacidade de 1800 mL) foi enchida com cerca de 1000 mL de solução de manitol a 5 % em peso. A bandeja foi obtida pré limpa para satisfazer necessidades de particulado baixas de USP. A bandeja foi colocada em uma prateleira do secador por congelamento, e a temperatura da bandeja foi monitorada por um termopar montado na superfície externa da bandeja próxima ao centro de uma lateral. A prateleira do secador por congelamento depois foi esfriada para obter uma temperatura da bandeja de aproximadamente -7 °C. O secador por congelamento depois foi despressurizado de 14 psig (95,6 kPa) a cerca da pressão atmosférica em menos do que cinco segundos para induzir a nucleação da solução dentro da bandeja. Os resultados também são resumidos na Tabela 6.

Como os exemplos descritos acima, todos os recipientes nuclearam e começaram o congelamento imediatamente depois da despressurização. Também como os exemplos descritos acima, as temperaturas de nucleação (isto é, Temperaturas de Recipiente) neste exemplo foram muito controláveis para serem um pouco próximas à temperatura de congelamento termodinâmico da solução. Mais importantemente, este exemplo ilustra que o presente método permite que o controle da nucleação ocorra em soluções de volume maior e vários formatos de recipiente. Deve ser observado que uma pessoa esperaria que a eficácia do método de despressurização melhore conforme o volume da formulação aumenta, porque o evento de nucleação é mais provável a ocorrer quando mais moléculas estão presentes para agregar e formar núcleos críticos.

Recipiente Solução Átomos Temperatura do Queda de Resultado da recipiente [°C] pressão [psi] despressurização (6,9 kPa)

Garrafa #1 30 mL de manitol a Argônio	-5,3	14	Nucleação
5 % em peso
Garrafa #2 30 mL de manitol a Argônio	-5,1	14	Nucleação
5 % em peso
Garrafa #3 30 mL de manitol a Argônio	-5,9	14	Nucleação
5 % em peso
Garrafa #4 30 mL de manitol a Argônio	-5,2	14	Nucleação
5 % em peso
Garrafa #5 30 mL de manitol a Argônio	-5,9	14	Nucleação
5 % em peso
Garrafa #6 30 mL de manitol a Argônio	-6,1	14	Nucleação
5 % em peso
Bandeja 1000 mL de manitol Argônio	-6,9	14	Nucleação

a 5 % em peso

Tabela 6. Efeito do Volume da Solução e Tipo de Recipiente Exemplo 7 - Resfriamento Dinâmico vs. Resfriamento Equilibrado

Os presentes métodos de controle da nucleação podem ser usados em vários modos. Os Exemplos 1 a 6, descritos acima, todos demonstram o aspecto de controle da temperatura de nucleação de uma solução de liofilização que é essencialmente equilibrada em uma temperatura abaixo de seu ponto de congelamento termodinâmico (isto é, mudando muito lentamente a temperatura). Este exemplo demonstra que a nucleação também pode ocorrer em uma temperatura abaixo do ponto de congelamento termodinâmico em um ambiente de resfriamento dinâmico (isto é, a solução é que sofre mudanças rápidas na temperatura).

Neste exemplo, os frascos 1 a 6 representam as amostras descritas acima com referência ao Exemplo 2. Além disso, três frascos 5 separados (Frascos 7 a 9) também foram enchidos com 2,5 mL de solução de manitol a 5 % em peso. Em uma rodada de teste separada, os três frascos adicionais foram colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. A prateleira do secador por congelamento foi esfriada rapidamente para uma temperatura final da prateleira de -45 °C. 10 Quando um dos frascos atingiram uma temperatura de cerca de -5 °C, como medido pelos termopares montados em superfície, o secador por congelamento foi despressurizado rapidamente de cerca de 14 psig (95,6 kPa) a 0 psig (6,9 kPa) em um esforço para induzir a nucleação. Todos os três frascos nuclearam e começaram o congelamento imediatamente depois da despressurização. As 15 temperaturas de frasco diminuíram significantemente entre -6,8 °C e -9,9 °C antes da nucleação como um resultado do ambiente de resfriamento dinâmico.

Resultados comparativos são resumidos na Tabela 7 abaixo.

Frasco #	Solução	Modo	Nucleação	Queda de	Resultado da
1	2,5 mL de manitol a 5	Equilibrado	-4,2	Pressão [psi] (6,9 kPa) 14	Despressurização Nucleação
2	% em peso 2,5 mL de manitol a 5	Equilibrado	-4,4	14	Nucleação
3	% em peso 2,5 mL de manitol a 5	Equilibrado	-4,6	14	Nucleação
4	% em peso 2,5 mL de manitol a 5	Equilibrado	-4,4	14	Nucleação
5	% em peso 2,5 mL de manitol a 5	Equilibrado	-4,6	14	Nucleação
6	% em peso 2,5 mL de manitol a 5	Equilibrado	-5,1	14	Nucleação
7	% em peso 2,5 mL de manitol a 5	Dinâmico	-6,8	14	Nucleação
8	% em peso 2,5 mL de manitol a 5	Dinâmico	-7,2	14	Nucleação
9	% em peso 2,5 mL de manitol a 5	Dinâmico	-9,9	14	Nucleação

% em peso

Tabela 7. Resultados do Teste - Efeito do Resfriamento Dinâmico sobre a Nucleação

A eficácia dos presentes métodos para controlar a nucleação em soluções de liofilização equilibradas em uma faixa de temperatura dada ou soluções de liofilização sendo dinamicamente esfriadas, supre o usuário final com dois modos potenciais de aplicação com diferentes benefícios e escolhas. Permitindo-se que as soluções de liofilização equilibrem, a faixa de temperaturas de nucleação será estreita ou minimizada aos limites de desempenho do secador por congelamento propriamente dito. A etapa de equilíbrio pode requerer tempo extra para obter em relação a protocolos de congelamento convencional ou dinâmico onde as temperaturas da câmara e frasco são diminuídas a menos do que cerca de -40 °C em uma etapa. Entretanto, a utilização da etapa de equilíbrio deve produzir uniformidade de nucleação muito melhorada através de todos os frascos ou recipientes assim como a realização dos outros benefícios associados precisamente com o controle da temperatura de nucleação do material.

Altemativamente, se o equilíbrio das temperaturas do material ou solução de liofilização for indesejável, uma pessoa pode simplesmente implementar a etapa de despressurização em um tempo apropriado durante o protocolo de congelamento normal ou resfriamento dinâmico. A despressurização durante um resfriamento dinâmico produzirá uma expansão mais ampla em temperaturas de nucleação para o material dentro dos recipientes de liofilização, mas adicionará tempo mínimo ao protocolo de congelamento e ainda permitirá que uma pessoa atenue os problemas do subresfriamento extremo.

Exemplo 8 - Efeito de Excipientes Diferentes

O presente método de controlar ou induzir a nucleação em um material pode ser usado para controlar a temperatura de nucleação de soluções sub-frias contendo excipientes de liofilização diferentes. Este exemplo demonstra o uso dos presentes métodos com os excipientes seguintes: manitol; hidroxietil amido (HES); polietileno glicol (PEG); polivinil pirrolidona (PVP); dextrano; glicina; sorbitol; sacarose; e trealose. Para cada excipiente, dois frascos foram enchidos com 2,5 mL de uma solução contendo 5 5 % em peso do excipiente. Os frascos foram colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. O secador por congelamento foi pressurizado em uma atmosfera de argônio a cerca de 14 psig (95,6 kPa). A prateleira do secador por congelamento foi esfriada para obter temperaturas de frasco próximas a -3 °C e depois despressurizada 10 rapidamente para induzir a nucleação. Os resultados são resumidos na Tabela

Frasco # Solução/Excipiente	Átomos	Temperatura Inicial do Frasco [°C]	Queda de Pressão [psi] (6,9 kPa)	Resultado da Despressurização
1	2,5 mL de manitol a 5 % em peso	Argônio	-3,3	14	Nucleação
2	2,5 mL de manitol a Argônio 5 % em peso	-3,0	14	Nucleação
3	2,5 mL de HES a 5 % em peso	Argônio	-3,1	14	Nucleação
4	2,5 mL de HES a 5 % em peso	Argônio	-3,7	14	Nucleação
5	2,5 mL de PEG a 5 % em peso	Argônio	-3,8	14	Nucleação
6	2,5 mL de PEG a 5 % em peso	Argônio	-3,4	14	Nucleação
7	2,5 mL de PVP a 5 % em peso	Argônio	-3,5	14	Nucleação
8	2,5 mL de PVP a 5 % em peso	Argônio	-3,3	14	Nucleação
9	2,5 mL de dextrano a 5 % em peso	Argônio	-4,0	14	Nucleação
10	2,5 mL de dextrano a 5 % em peso	Argônio	-3,1	14	Nucleação ·
11	2,5 mL de glicina a 5 % em peso	Argônio	-3,8	14	Nucleação
12	2,5 mL de glicina a 5 % em peso	Argônio	-3,9	14	Nucleação
13	2,5 mL de sorbitol a 5 % em peso	Argônio	-3,6	14	Nucleação
14	2,5 mL de sorbitol a Argônio	-3,4	14	Nucleação

% em peso

15	2,5 mL de sacarose Argônio a 5 % em peso	-3,3	14	Nucleação
16	2,5 mL de sacarose Argônio a 5 % em peso	-3,4	14	Nucleação
17	2,5 mL de trealose a Argônio 5 % em peso	-3,7	14	Nucleação
18	2,5 mL de trealose a Argônio	-3,1	14	Nucleação

% em peso

Tabela 8. Efeito de Excipientes de Liofilização Diferentes

Exemplo 9 - Controle de Nucleação de Soluções de Proteína Os métodos divulgados aqui podem ser usados para controlar a temperatura de nucleação de soluções de proteína sub-frias sem efeitos negativos ou adversos em solubilidade de proteína ou atividade enzimática. Duas proteínas, albumina sérica bovina (BSA) e lactato desidrogenase (LDH) foram usadas neste exemplo.

BSA foi dissolvido em manitol a 5 % em peso em uma concentração de 10 mg/mL. Três frascos de liofilização foram enchidos com

2,5 mL da solução de BSA-manitol e colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. O secador por congelamento foi pressurizado em uma atmosfera de argônio a cerca de 14 psig (95,6 kPa). A prateleira do secador por congelamento foi esfriada para obter temperaturas de frasco próximas a -5 °C. O secador por congelamento foi despressurizado rapidamente para induzir a nucleação. Todos os frascos de solução de BSA nuclearam e começaram o congelamento imediatamente depois da despressurização. Nenhuma precipitação da proteína foi observada no descongelamento.

As proteínas de LDH foram obtidas de dois fornecedores diferentes e para propósitos de clareza são designadas como LDH-1 ou LDH2 para distinguir os dois lotes distintos. LDH-1 foi dissolvida em manitol a 5 % em peso em um concentração de 1 mg/mL. Seis frascos de liofilização foram enchidos com 2,5 mL da solução de LDH-l/manitol e colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. O secador por congelamento foi pressurizado em uma atmosfera de argônio a cerca de 14 psig (95,6 kPa). A prateleira do secador por congelamento foi esfriada partindo da temperatura ambiente para obter temperaturas de frasco próximas a -4 °C. O secador por congelamento depois foi despressurizado rapidamente para induzir a nucleação. Todos os frascos nuclearam e começaram o congelamento imediatamente depois da despressurização. Os frascos foram mantidos neste estado durante cerca de 15 minutos. A prateleira do secador por congelamento depois foi esfriada em uma taxa de aproximadamente 1 °C/min para obter temperaturas de frasco próximas a -45 °C e mantida durante um adicional de 15 minutos para garantir a conclusão do processo de congelamento. Depois da etapa de congelamento, a prateleira do secador por congelamento depois foi aquecida em uma taxa de cerca de 1 °C/min para elevar as temperaturas de frasco até aproximadamente 5 °C. Nenhuma precipitação da proteína foi observada no descongelamento. Os conteúdos do frasco foram avaliados quanto à atividade enzimática, e os resultados foram comparados a uma amostra de controle de solução de LDH-1/manitol não congelada.

Como parte do Exemplo 9, as amostras nucleadas despressurizadas da solução de LDH-1/manitol foram comparadas às amostras estocasticamente nucleadas. Nas amostras estocasticamente nucleadas de LDH-1, o procedimento de congelamento foi repetido sem pressurização e despressurização e sem a atmosfera de argônio. Especificamente, LDH-1 foi dissolvida em manitol a 5 % em peso em uma concentração de 1 mg/mL. Seis frascos de liofilização foram enchidos com

2,5 mL da solução de LDH-l/manitol e colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. A prateleira do secador por congelamento foi esfriada partindo da temperatura ambiente em uma taxa de cerca de 1 °C/min para obter temperaturas de frasco próximas a 45 °C e mantida durante 15 minutos para garantir a conclusão do processo de congelamento. Depois da etapa de congelamento, a prateleira do secador por congelamento foi aquecida em uma taxa de cerca de 1 °C/min para elevara as temperaturas de frasco até aproximadamente 5 °C. Nenhuma precipitação da proteína foi observada no descongelamento. Os conteúdos do frasco foram avaliadas quanto à atividade enzimática, e os resultados foram comparados à 5 mesma amostra de controle de solução de LDH-1/manitol não congelada.

Também como parte do Exemplo 9, os experimentos descritos acima para LDH-1 foram repetidos usando LDH-2. A única diferença foi uma temperatura de nucleação próxima a -3 °C para LDH-2 ao invés de -4 °C para LDH-1.

Como observado na Tabela 9, o processo de nucleação e congelamento controlado obtido por intermédio de despressurização claramente não diminui a atividade enzimática em relação a um protocolo de nucleação estocástica e congelamento comparável. De fato, o processo de nucleação controlado obtido por intermédio de despressurização parece preservar melhor a atividade enzimática com uma perda de atividade média de apenas 17,8 % para LDH-1 e 26,5 % para LDH-2 comparada à perda de atividade média de 35,9 % para LDH-1 e 41,3 % para LDH-2 depois da nucleação estocástica. Tabela 9. Controle da Temperatura de Nucleação de Soluções de Proteína

Sub-Fnas

Frasco # Solução Átomos Temperatura Queda de Perda de Resultado da Inicial do Pressão Atividade Despressurização Frasco [°C] [psi] (6,9 Enzimática

2,5 mL de solução Argônio -4,9 de BSA

2,5 mL de solução Argônio -4,3 de BSA

2,5 mL de solução Argônio -5,3 de BSA

2,5 mL de solução Argônio -3,8 de LDH-1

2,5 mL de solução Argônio -4,0 de LDH-1

2,5 mL de solução Argônio -3,7 de LDH-1

2,5 mL de solução Argônio -4,0 de LDH-1

kPa) 14	[%]	Nucleação
14	-	Nucleação
14	-	Nucleação
14	9,0	Nucleação
14	16,2	Nucleação
14	18,4	Nucleação
14	23,4	Nucleação

8	2,5 mL de solução Argônio	-3,9	14	18,5	Nucleação
9	de LDH-1 2,5 mL de solução Argônio	-4,0	14	21,2	Nucleação
10	de LDH-1 2,5 mL de solução Ar	-10,4	0	35,7	Nucleação
11	de LDH-1 2,5 mL de solução Ar	-16,5	0	35,4	Nucleação
12	de LDH-1 2,5 mL de solução Ar	-15,5	0	36,1	Nucleação
13	de LDH-1 2,5 mL de solução Ar	-10,5	0	43,9	Nucleação
14	de LDH-1 2,5 mL de solução Ar	-9,8	0	24,9	Nucleação
15	de LDH-1 2,5 mL de solução Ar	-11,0	0	39,2	Nucleação
16	de LDH-1 2,5 mL de solução Argônio	-3,1	14	29,9	Nucleação
17	de LDH-2 2,5 mL de solução Argônio	-2,9	14	18,9	Nucleação
18	de LDH-2 2,5 mL de solução Argônio	-3,1	14	23,3	Nucleação
19	de LDH-2 2,5 mL de solução Argônio	-2,7	14	19,6	Nucleação
20	de LDH-2 2,5 mL de solução Argônio	-3,1	14	32,1	Nucleação
21	de LDH-2 2,5 mL de solução Argônio	-2,6	14	35,2	Nucleação
22	de LDH-2 2,5 mL de solução Ar	-5,0	0	38,3	Nucleação
23	de LDH-2 2,5 mL de solução Ar	-5,5	0	40,0	Nucleação
24	de LDH-2 2,5 mL de solução Ar	-2,3	0	36,5	Nucleação
25	de LDH-2 2,5 mL de solução Ar	-3,8	0	42,0	Nucleação
26	de LDH-2 2,5 mL de solução Ar	-5,1	0	50,2	Nucleação
27	de LDH-2 2,5 mL de solução Ar	-5,9	0	40,6	Nucleação
	de LDH-2 Deve ser observado que	as 1	temperaturas	de nucleação

estocástica observadas para LDH-2 foram substancialmente mais quentes do que as temperaturas de nucleação estocástica para LDH-1. Esta diferença pode ser devido a algum contaminante agindo como um agente de nucleação 5 na LDH-2. As temperaturas de nucleação estocástica são muito mais próximas às temperaturas de nucleação controlada para LDH-2 comparada à

LDH-1, ainda as melhoras em retenção de atividade enzimática obtida por intermédio da nucleação controlada para LDH-1 e LDH-2 são similares em

18,1 % e 14,8 %, respectivamente. Este resultado sugere que as melhoras em retenção de atividade enzimática podem ser parcialmente atribuídas às características do processo de nucleação controlada propriamente dito, não apenas às temperaturas de nucleação mais quentes prescritas obtidas por intermédio da despressurização.

Exemplo 10 - Redução do Tempo de Secagem Primária

Uma solução de manitol a 5 % em peso foi preparada misturando-se cerca de 10,01 gramas de manitol com cerca de 190,07 gramas de água. Frascos foram enchidos com 2,5 mL da solução de manitol a 5 % em peso. Os frascos foram pesados vazios e com a solução para determinar a massa de água adicionada aos frascos. Os vinte frascos foram colocados em uma prateleira do secador por congelamento em proximidade imediata entre si. As temperaturas de seis frascos foram monitoradas usando termopares montados em superfície; todos os frascos monitorados foram circundados por outros frascos para melhorar a uniformidade do comportamento do frasco. O secador por congelamento foi pressurizado a cerca de 14 psig (95,6 kPa) em uma atmosfera gasosa controlada de gás argônio. A prateleira do secador por congelamento foi esfriada da temperatura ambiente a cerca de -6 °C para obter temperaturas de frasco entre aproximadamente -1 °C e -2 °C. O secador por congelamento depois foi despressurizado de cerca de 14 psig (95,6 kPa) a cerca da pressão atmosférica em menos do que cinco segundos para induzir a nucleação da solução dentro dos frascos. Todos os frascos observados visualmente ou monitorados por intermédio de termopares nuclearam e começaram o congelamento imediatamente depois da despressurização.

A temperatura da prateleira depois foi diminuída rapidamente a cerca de -45 °C para completar o processo de congelamento. Uma vez que todas as temperaturas de frasco foram de cerca de -40 °C ou menos, a câmara de secagem por congelamento foi evacuada e o processo de secagem primária (isto é, sublimação) foi iniciado. Durante este processo de secagem, a prateleira do secador por congelamento foi aquecida a cerca de 14 °C por intermédio de uma elevação de uma hora e mantida nesta temperatura durante 16 horas. O condensador foi mantido em tomo de -60 °C por todo o processo de secagem. A secagem primária foi interrompida desligando-se a bomba a vácuo e retro-enchendo a câmara com argônio até a pressão atmosférica. Os frascos foram imediatamente removidos do secador por congelamento e pesados para determinar quanta água foi perdida durante o processo de secagem primária.

Em um experimento separado como parte do Exemplo 10, outros frascos foram enchidos com 2,5 mL da mesma solução de manitol a 5 % em peso. Os frascos foram pesados vazios e com a solução para determinar a massa de água adicionada aos frascos. Os frascos foram carregados no secador por congelamento na mesma maneira descrita acima, e as temperaturas de seis frascos foram mais uma vez monitoradas usando termopares montados em superfície. A prateleira do secador por congelamento foi esfriada rapidamente da temperatura ambiente a cerca de 45 °C para congelar os frascos. A nucleação ocorreu estocasticamente entre cerca de -15 °C e cerca de -18 °C durante a etapa de resfriamento. Uma vez que todos as temperaturas dos frascos foram de cerca de -40 °C ou menos, os frascos foram secos em um maneira idêntico ao método descrito acima. Na conclusão da secagem primária, as amostras foram imediatamente removidas do secador por congelamento e pesadas para determinar quanta água foi perdida durante o processo de secagem primária.

Frasco #	• Solução Átomos	Temp	Queda de	Perda de	Resultado da
		Inicial do Pressão Frasco [°C] [Psi] (6,9 kPa)	Água [%] Despressurização
1	2,5 mL de manitol a Argônio 5 % em peso	-1,3	14	89,9	Nucleação
2	2,5 mL de manitol a Argônio 5 % em peso	-1,9	14	85,2	Nucleação
3	2,5 mL de manitol a Argônio 5 % em peso	-1,3	14	87,1	Nucleação
4	2,5 mL de manitol a Argônio 5 % em peso	-2,3	14	88,8	Nucleação
5	2,5 mL de manitol a Argônio 5 % em peso	-2,1	14	85,0	Nucleação
6	2,5 mL de manitol a Argônio 5 % em peso	-1,1	14	80,7	Nucleação
7	2,5 mL de manitol a Ar 5 % em peso	-15,7	0	65,7
8	2,5 mL de manitol a Ar 5 % em peso	-16,7	0	66,9
9	2,5 mL de manitol a Ar 5 % em peso	-14,5	0	64,6
10	2,5 mL de manitol a Ar 5 % em peso	-15,6	0	64,7
11	2,5 mL de manitol a Ar 5 % em peso	-16,5	0	64,1	-
12	2,5 mL de manitol a Ar 5 % em peso	-17,9	0	65,7

Tabela 10. Aumento da Temperatura de Nucleação Melhora a Secagem

Primária

Os resultados do processo de secagem por congelamento com nucleação controlada e nucleação estocástica são resumidos na Tabela 10.

Deve ser observado que estes dois experimentos apenas diferem na adição da nucleação controlada por intermédio de etapa de despressurização a um experimento. Como observado na Tabela 10, o processo de nucleação controlada obtido por intermédio da despressurização permite nucleação em 10 graus muito baixos de sub-resfriamento, entre cerca de -1,1 °C e -2,3 °C neste exemplo. As temperaturas de nucleação muito mais quentes para o caso de nucleação controlada comparado ao caso de nucleação estocástica produz uma estrutura de gelo e torta liofilizada resultante com propriedades de secagem dramaticamente melhoradas. Para a mesma quantidade de tempo de secagem, os frascos nucleados usando os métodos de despressurização divulgados entre cerca de -1,1 °C e -2,3 °C perderam uma média de 86,1 % de sua água enquanto os frascos nucleados estocasticamente entre cerca de -14,5 °C e -17,9 °C apenas perderam uma média de 65,3 %. Conseqüentemente, os frascos nucleados estocasticamente requereríam muito mais tempo de secagem primária para obter o mesmo grau de perda de água como os frascos nucleados em uma maneira controlada de acordo com os métodos presentemente divulgados. A melhora no tempo de secagem é provavelmente atribuída à formação de cristais de gelo maiores em temperaturas de nucleação mais quentes. Estes cristais de gelo maiores deixam para trás poros maiores na sublimação, e os poros maiores oferecem menos resistência ao fluxo de vapor d’água durante outra sublimação.

Aplicabilidade Industrial

O presente método fornece um método melhorado para controlar a temperatura e/ou tempo em que materiais sub-frios, isto é, líquidos ou soluções, nucleiam e depois congelam. Embora este pedido foque em parte na secagem por congelamento, um problema similar ocorre para qualquer etapa de processamento de material que envolve uma transição de fase nucleada. Exemplos de tais processos incluem a cristalização de polímeros e metais de fundições, cristalização de materiais a partir de soluções supersaturadas, cristalização de proteínas, produção de neve artificial, congelamento de alimento, concentração do congelamento, cristalização fracionada, criopreservação, ou condensação de vapores a líquidos.

O benefício mais imediato de controlar a temperatura de nucleação de um líquido ou solução é a capacidade para controlar o número e tamanho dos domínios sólidos produzidos pela transição de fase. No congelamento da água, por exemplo, a temperatura de nucleação diretamente controla o tamanho e número de cristais de gelo formados. De modo geral, os cristais de gelo são menores em número e maiores no tamanho quando a temperatura de nucleação é mais quente.

A capacidade para controlar o número e tamanho dos domínios sólidos produzidos por uma transição de fase pode fornecer benefícios adicionais. Em um processo de secagem por congelamento, por exemplo, o número e tamanho dos cristais de gelo influencia fortemente as propriedades de secagem da torta liofilizada. Cristais de gelo maiores produzidos por temperaturas de nucleação mais quentes deixam para trás poros maiores em sublimação, e os poros maiores oferecem menos resistência ao fluxo de vapor d’água durante sublimação subseqüente. Conseqüentemente, os presentes métodos fornecem um meio de aumentar as taxas de secagem primária (isto é, sublimação) em processos de secagem por congelamento aumentando-se a temperatura de nucleação.

Um outro benefício possível pode ser entendido em aplicações onde materiais sensíveis são preservados por intermédio de processos de congelamento (isto é, criopreservados). Por exemplo, um material biológico incluindo mas não limitado a, amostras de tecido mamífero (por exemplo, sangue do cordão umbilical, biópsia tecidual, células ovo e espermática, etc.), linhagens celulares (por exemplo, mamífera, levedura, procariótica, fungica, etc.) e moléculas biológicas (por exemplo, proteínas, DNA, RNA e subclasses destas) congelados em uma solução aquosa podem experienciar vários estresses durante o processo de congelamento que pode comunicar a função ou atividade do material. A formação de gelo pode romper fisicamente o material ou criar mudanças severas na ligação interfacial, forças osmóticas, concentrações de soluto, etc. experienciadas pelo material. Visto que a nucleação controla a estrutura e cinética da formação de gelo, ela pode influenciar significantemente estes estresses. Os métodos presentemente divulgados portanto fornecem um único meio de abrandar os estresses associados com processos de criopreservação e realçar a recuperação da função ou atividade de materiais criopreservados. Os presentes métodos também representam melhora sobre métodos de controle de nucleação convencionais (por exemplo, semeadura ou contato com superfícies frias) usados para iniciar a formação de gelo extracelular em algoritmos de criopreservação de etapa dupla designados para células vivas.

Os presentes métodos também podem ser aplicados a soluções complexas ou misturas contendo vários constituintes tanto em criopreservação quanto em aplicações de liofilização. Estas formulações são freqüentemente soluções com um solvente aquoso, orgânico, ou aquoso-orgânico misto contendo um ingrediente farmaceuticamente ativo (por exemplo, um produto químico sintético, proteína, peptídeo, ou vacina) e opcionalmente, um ou mais constituintes de atenuação, incluindo agentes de volume que ajudam a prevenir a perda física do ingrediente ativo durante a secagem (por exemplo, dextrose, glicose, glicina, lactose, maltose, manitol, polivinil pirrolidona, cloreto de sódio, e sorbitol); agentes tamponantes ou modificadores de toxicidade que ajudam a manter o pH ambiental apropriado ou toxicidade para o constituinte ativo (por exemplo, ácido acético, ácido benzóico, ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido láctico, ácido maléico, ácido fosfórico, ácido tartárico, e os sais de sódio dos ácidos anteriormente mencionados); agentes de estabilização que ajudam a preservar a estrutura e função do constituinte ativo durante o processamento ou em sua forma líquida ou seca final (por exemplo, alanina, dimetilsulfóxido, glicerol, glicina, albumina sérica humana, polietileno glicol, lisina, polissorbato, sorbitol, sacarose, e trealose); agentes que modificam o comportamento de transição vítrea da formulação (por exemplo, polietileno glicol e açúcares), e anti-oxidantes que protegem o constituinte ativo da degradação (por exemplo, ascorbato, bissulfito de sódio, formaldeído de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio, sulfoxilato, e tioglicerol).

Visto que a nucleação é tipicamente um processo aleatório, uma pluralidade do mesmo material submetido a condições de processamento idênticas pode nuclear em diferentes temperaturas. Como um resultado, as propriedades daqueles materiais que dependem do comportamento de nucleação provavelmente diferirão não obstante de condições de processamento idênticas. Os métodos divulgados fornecem um meio para controlar as temperaturas de nucleação de uma pluralidade de materiais simultaneamente e deste modo oferece um modo para aumentar a uniformidade daquelas propriedades de produto que dependem do comportamento de nucleação. Em um processo de secagem por congelamento típico, por exemplo, a mesmo solução em frascos separados podem nuclear estocasticamente em uma faixa ampla de temperaturas, e como um resultado, os produtos finais secos por congelamento podem possuir variabilidade significante em propriedades críticas como umidade residual, atividade e tempo de reconstituição. Controlando-se a temperatura de nucleação por intermédio do processo presentemente divulgado, a uniformidade frasco-afrasco de propriedades do produto a partir de um processo de secagem por congelamento pode ser dramaticamente melhorada.

A capacidade para controlar o comportamento de nucleação de um material também pode fornecer benefício substancial em reduzir o tempo necessário para desenvolver um processo industrial que depende de um evento de nucleação normalmente descontrolado. Por exemplo, ele leva freqüentemente muitos meses para desenvolver um ciclo de secagem por congelamento bem sucedido que pode ser realizado em uma quantidade razoável de tempo, produz propriedades de produto desejadas dentro da uniformidade específica, e preserva atividade suficiente do ingrediente farmacêutico ativo (API). Fomecendo-se um meio de controle da nucleação e deste modo melhorando potencialmente o tempo de secagem primária, uniformidade do produto, e atividade de API, os presentes métodos devem reduzir dramaticamente o tempo necessário para desenvolver protocolos de secagem por congelamento bem sucedidos.

Em particular, os benefícios potenciais do presente processo de nucleação fornecem flexibilidade aumentada em especificar a composição da formulação a ser seca por congelamento. Visto que a nucleação controlada pode preservar melhor o API durante a etapa de congelamento, usuários devem ser capazes de minimizar a adição de constituintes de atenuação (por exemplo, agentes de estabilização) à formulação ou escolher combinações mais simples de constituintes de formulação para obter objetivos de estabilidade e processamento combinados. Benefícios sinérgicos podem surgir em casos onde a nucleação controlada minimiza o uso de agentes de estabilização ou outros constituintes de atenuação que prolongam inerentemente tempos de secagem primária (por exemplo, diminuindo-se temperaturas de transição vítrea de soluções aquosas).

Os métodos divulgados são particularmente bem adequados para operações de produção ou fabricação em grande escala visto que eles podem ser conduzidos usando os mesmos parâmetros de equipamento e processo que facilmente podem ser escalados ou adaptados para a fabricação de uma faixa ampla de produtos. O processo leva em consideração a nucleação de materiais usando um processo onde todas as manipulações podem ser realizadas em uma única câmara (por exemplo, um secador por congelamento) e onde o processo não requer o uso de um vácuo, uso de aditivos, vibração, eletrocongelamento ou semelhantes para induzir a nucleação.

Ao contrário da técnica anterior, o presente método não soma nada ao produto liofilizado. Ele apenas requer que os materiais, (por exemplo, líquidos nos frascos), sejam mantidos inicialmente em uma pressão específica sob um ambiente gasoso e que a pressão é rapidamente reduzida a uma pressão mais baixa. Qualquer gás aplicado será removido dos frascos durante o ciclo de liofilização. Os frascos ou seus conteúdos não são contatados ou tocados com nada exceto o gás. A manipulação simples da pressão ambiente e gás ambiente é suficiente por si só para obter este objetivo. Contando-se apenas com a mudança da pressão ambiente para induzir a nucleação, o presente método divulgado aqui uniforme e simultaneamente afeta todos os frascos dentro de um secador por congelamento.

A presente forma de realização também é menos cara e mais fácil para implementar e manter do que os métodos da técnica anterior de influenciar a nucleação em materiais em aplicações de liofilização. O presente método permite secagem primária significantemente mais rápida em processos de liofilização, reduzindo deste modo os custos de processamento para produtos farmacêuticos secos por congelamento. O presente método produz produtos liofilizados muito mais uniformes do que os métodos da técnica anterior, reduzindo deste modo perdas de produto e criando barreiras de entrada para processadores incapazes de satisfazer especificações de uniformidade mais estreitas. Este método obtém estes benefícios sem contaminar o produto liofilizado. Maior controle de processo deve levar a um produto melhorado e tempos de processo diminuídos.

A partir do antecedente, deve ser avaliado que a presente invenção fornece assim um método de induzir a nucleação em um material e/ou um método de congelamento de material. Várias modificações, mudanças, e variações dos presentes métodos estarão evidentes a uma pessoa habilitada na técnica e deve ser entendido que tais modificações, mudanças, e variações devem ser incluídas dentro da competência deste pedido e do espírito e escopo das reivindicações.

Claims (12)

1. Método de induzir a nucleação de uma transição de fase em uma solução de base aquosa, compreendendo as etapas de:

levar a solução de base aquosa a uma temperatura próxima ou abaixo de uma temperatura de transição de fase; e diminuir a pressão próxima à solução de base aquosa para induzir a nucleação da transição de fase na solução de base aquosa;

caracterizado pelo fato de que a solução de base aquosa é resfriada a uma temperatura variando de 3 °C abaixo da temperatura de transição de fase a 20 °C abaixo da temperatura de transição de fase antes da despressurização.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de continuar o resfriamento da solução de base aquosa nucleado depois da despressurização até ou abaixo de uma temperatura final garantindo a transição de fase completa da solução de base aquosa.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a temperatura de transição de fase é o ponto de congelamento termodinâmico da solução.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a solução de base aquosa é uma solução com uma ou mais substâncias dissolvidas e a temperatura de transição de fase é uma temperatura de saturação em que uma substância dissolvida precipitará ou cristalizará fora da solução.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de pressurizar a atmosfera que circunda a solução de base aquosa.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pressão é diminuída por uma

Petição 870190003302, de 11/01/2019, pág. 11/50 quantidade maior do que 48,3 kPa (7 psi).

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pressão é diminuída tal que uma razão de pressão absoluta, Pi/Pf, é 1,2 ou maior.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pressão é diminuída em uma queda de taxa de pressão, ΔΡ/Δΐ, maior do que 1,38 kPa (0,2 psi) por segundo.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pressão é diminuída em 40 segundos ou menos.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a solução de base aquosa contém um componente compreendendo vírus vivos ou atenuados; ácido nucléico; anticorpos monoclonais ou policlonais; biomoléculas; análogos de não peptídeo; peptídeos; e proteínas.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a despressurização é iniciada quando a solução de base aquosa atinge uma temperatura de nucleação desejada.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a despressurização é iniciada em um tempo desejado depois do início da etapa de resfriamento e quando a temperatura da solução de base aquosa está abaixo da temperatura de transição de fase.