CN101379356B

CN101379356B - 诱导材料成核的方法

Info

Publication number: CN101379356B
Application number: CN200780004628.7A
Authority: CN
Inventors: T·H·加斯泰尔三世; R·R·塞弗; B·哈内克; N·格林特; M·L·维尔东
Original assignee: Praxair Technology Inc
Current assignee: SP Industries Inc
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2027-02-07
Also published as: CN101379357B; CN101379356A; CN101379357A

Abstract

提供了诱导材料成核的方法。公开的方法包括使材料达到接近或低于相变温度的温度和改变压力诱导材料成核的步骤。公开的方法用于冷冻干燥过程，尤其是药物冷冻干燥过程。

Description

诱导材料成核的方法

相关申请交叉参考

本申请要求2006年2月10日提交的美国临时专利申请序列号60/771868的优先权。

发明领域

本发明涉及一种成核方法，更具体地，涉及一种诱导材料中相变成核的方法，其中最初使材料达到接近或低于相变温度的温度，随后减压以便诱导材料的成核。

发明背景

控制冻干或冷冻干燥法冷冻阶段中成核的通常随机过程以同时减少完成冷冻干燥所需处理时间和增加成品中瓶与瓶之间产品均匀性在本领域中是非常希望的。在典型的药物冷冻干燥法中，将包含普通水溶液的多个瓶放在架上，架通常以控制速度被冷却到低温。每个瓶中的水溶液被冷却到低于溶液的热力学冻结温度并保持在过冷亚稳液态直到成核发生。

瓶上成核温度范围随机分布在接近热力学冻结温度的温度和明显低于热力学冻结温度(例如，直到约30℃)的一些值之间。这种成核温度分布导致冰晶结构和最终冻干产品的物理性质的瓶与瓶差异。另外，冷冻干燥法的干燥阶段必须非常长以适应自然随机成核现象产生的冰晶尺寸范围和结构。

已使用添加剂增加过冷溶液的成核温度。这些添加剂可呈现多种形式。众所周知，某些细菌(例如丁香假单胞菌)合成能在过冷水溶液中帮助有核冰形成的蛋白质。可将细菌或它们的分离蛋白加入到溶液中提高成核温度。几种无机添加剂也表现出成核作用；最常见的这类添加剂为碘化银AgI。通常，任何添加剂或污染物都具有用作成核剂的可能。在包含高的颗粒物水平的环境中制备的冻干瓶通常在比低颗粒物环境中制备的瓶低的过冷程度下成核和冻结。

所有上述成核剂都被列为“添加剂”，因为它们改变了它们相变成核所在介质的组成。对于FDA规定和认可的冻干药物产品，这些添加剂一般不能被接受。当瓶成核和冻结时，这些添加剂也不能提供对时间和温度的控制。相反，添加剂仅仅对提高瓶的平均成核温度起作用。

冰晶可自身用作过冷水溶液中冰形成的成核剂。在“冰雾”方法中，湿的冷冻干燥机充满冷气体以产生小冰粒的气相悬浮体。冰粒被转移到瓶内并在它们接触流体界面时引发成核。

“冰雾”方法不能以控制的时间和温度同时控制多个瓶的成核。换句话说，当引入冷蒸汽到冻干机内时，成核事件不能在所有瓶内同时或瞬时发生。冰晶将用一定时间进入每个瓶以引发成核，并且对于冻干机内不同位置的瓶，迁移时间可能不同。对于大型工业冻干机，“冰雾”方法的实施将要求系统设计变化，因为可能需要内部对流装置来帮助“冰雾”在整个冻干机内内的更均匀分布。当冻干机架被连续冷却时，第一个瓶冻结时和最后一个瓶冻结时之间的时间差将在瓶之间产生温度差异，这将增加冻干产品中瓶与瓶之间不均匀性。

利用刻划、刮擦或粗糙化的瓶预处理也用于降低成核所需要的过冷程度。同其它现有技术方法一样，瓶预处理也不能在单个瓶成核和冻结时提供对时间和温度的任何程度控制，而是仅仅提高了所有瓶的平均成核温度。

振动也用于亚稳材料中的相变成核。足以诱导成核的振动发生在超过10kHz的频率下，并可使用各种设备产生。通常这种频率范围内的振动被称为“超声”，但在10kHz-20kHz范围内的频率一般在人的听觉范围内。超声振动经常在过冷溶液中产生气穴现象或形成小气泡。在瞬时或惯性气穴现象状态下，气泡迅速长大并破裂，导致非常高的局部压力和温度波动。超声振动诱导亚稳材料成核的能力通常归因于瞬时气穴现象引起的扰动。命名为稳定或非惯性的其它气穴现象状态特征在于表现出稳定体积或形状振荡而不破裂的气泡。美国专利申请20020031577A1公开了超声振动可诱导成核，即使在稳定气穴现象状态下，但没有提供这种现象的解释。GB专利申请2400901A也公开了可通过降低溶液附近的环境压力或在溶液中溶解挥发性流体来增加使用频率超过10kHz的振动在溶液中引起气穴现象并因此成核的可能性。

过去还使用电冷冻法诱导过冷液体中的成核。通常通过在浸没于过冷液体或溶液中的间隔窄的电极之间以连续或脉冲方式输送相对高的电场(～1V/nm)实现电冷冻。与典型冻干应用中的电冷冻方法有关的不足包括实施和维护的相对复杂性和成本，尤其对于使用多个瓶或容器的冻干应用。而且，电冷冻不能直接应用于包含离子物种的溶液(例如NaCl)。

最近，存在检查“真空诱导表面冷冻”原理的研究(参见例如美国专利6684524)。在这种“真空诱导表面冷冻”中，将包含水溶液的瓶装载在冷冻干燥机中的温度控制架上并最初保持在约10℃下。然后对冷冻干燥室抽真空至近真空压力(例如1mbar)，这使水溶液表面冻结至几毫米的深度。随后释放真空和降低架温度到溶液凝固点以下允许通过溶液的剩余部分从预冻结的表面层生长冰晶。在典型冻结应用中实施这种“真空诱导表面冷冻”方法的主要缺陷在于在指定条件下使溶液剧烈沸腾或脱气的高风险。

对成核方法的改进控制能使冷冻干燥机中所有解冻药物溶液瓶的冻结在更窄的温度和时间范围内发生，从而产生在瓶与瓶之间具有更大均匀性的冻干产品。控制最小成核温度能影响瓶内形成的冰晶结构并允许大大加速的冷冻干燥过程。

因此，需要在包括冷冻干燥的冷冻阶段的各种冷冻过程或冻干过程中控制成核随机过程以减少完成冷冻干燥所需的处理时间和提高最终产品中瓶与瓶之间的产品均匀性。因此希望提供具有部分或优选全部上述特征的方法。

发明概述

本发明特征在于诱导材料中相变成核的方法，方法包括使材料达到接近或低于材料相变温度的温度和降低压力诱导材料中相变成核的步骤。

本发明特征还在于控制溶液冷冻过程的方法，包括步骤：以指定的冷却速度冷却溶液；快速降低压力以诱导溶液成核；和继续冷却成核的溶液到指定最终温度以冷冻溶液。当溶液达到所需的成核温度或在开始冷却步骤后在所需的时间开始减压。

本发明特征又在于一种凝固方法，包括步骤：冷却材料到接近或低于相变温度的温度；快速降低材料附近的压力以诱导材料成核；和继续冷却成核的材料到指定最终温度以促进材料凝固。

最后，本发明特征在于一种控制气体冷凝过程的方法，包括步骤：冷却气体到接近或低于相变温度的温度；快速降低压力以诱导气体内的成核；和继续冷却成核的气体到指定最终温度以冷凝气体。

附图简述

从结合附图提供的以下更详细描述中将更清楚本发明的上述和其它方面、特征和优点，其中：

图1为描绘进行随机成核过程的溶液的温度对时间曲线并另外显示溶液成核温度范围的图；

图2为描绘根据本发明方法利用减压成核进行平衡冷却过程的溶液的温度对时间曲线的图；和

图3为描绘根据本发明方法利用减压成核进行动态冷却过程的溶液的温度对时间曲线的图。

发明详述

成核是材料小区域中相变的开始。例如，相变可为从液体形成晶体。通常与溶液冷冻有关的结晶过程(即由溶液形成固体晶体)以成核事件开始然后是晶体生长。

在结晶过程中，成核为其中溶液或其它材料中分散的所选分子开始聚集形成纳米尺度的簇以便在当前操作条件下变得稳定的步骤。这些稳定的簇构成核。簇需要达到临界尺寸以便变成稳定的核。这种临界尺寸通常用操作条件如温度、污染物、过饱和程度等来指示，并可在一个溶液样品到另一个之间变化。正是在成核事件中，溶液中的原子以限定晶体结构的规定周期方式排列。

晶体生长为成功获得临界簇尺寸的核的后续生长。取决于条件，成核或晶体生长可互相占优势，结果，得到具有不同尺寸和形状的晶体。晶体尺寸和形状的控制构成工业制造如药物工业制造中的主要挑战。

本发明方法涉及一种控制材料中发生成核相变的时间和/或温度的方法。在冷冻应用中，材料能自发成核并开始改变相的概率与材料的过冷程度和是否存在提供成核部位或表面的污染物、添加剂、结构或扰动物有关。

冷冻或凝固步骤在现有技术于大量瓶或容器上产生成核温度差异的冷冻干燥方法中尤其重要。成核温度差异往往产生不均匀的产品和过长的干燥时间。另一方面，本发明的方法在间歇凝固过程(例如冷冻干燥)中提高更高程度的过程控制和产生具有更均匀结构和性质的产品。与诱导成核的一些现有技术不同，本发明方法要求最少的设备和操作变化用于实施。

原则上，本发明方法可应用于包括成核相变的任何材料处理步骤。这类过程的例子包括液体冷冻、由水溶液结晶冰、由熔体结晶聚合物和金属、由过饱和溶液结晶无机材料、蛋白质的结晶、人工造雪、由蒸汽沉积冰、食物冷冻、冷冻浓缩、分级结晶、超低温保存或蒸汽凝结成液体。从原理角度出发，本发明方法还适用于相变如熔化和沸腾。

本文公开的方法表示对当前药物冻干法的改进。例如，在大的工业冷冻干燥机内，存在100000个包含需要冷冻和干燥的药物产品的瓶。工业中目前的做法是冷却溶液到非常高的程度以便保证冷冻干燥机中所有瓶或容器中的溶液冷冻。但是，每个瓶或容器的内含物在低于凝固点的温度范围内随机冻结，因为成核过程是不受控制的。

现在转到图，尤其是图1，描绘了进行常规随机成核过程的水溶液的六个瓶的温度对时间曲线，并显示了瓶(11，12，13，14，15和16)内溶液的成核温度典型范围。如其中所看到，瓶内含物具有约0℃的热力学冻结温度，但每个瓶内的溶液在约-7℃至-20℃或以上的宽温度范围内自然成核，如区域18所标记的。曲线19代表冷冻干燥室内的架温度。

相反，图2和图3描绘了根据本发明方法利用减压成核进行冷冻过程的溶液的温度对时间曲线。特别地，图2显示了利用室(21，22，23，24，25和26)减压诱导的成核进行平衡冷却过程(见实施例2)的水溶液的六个瓶的温度对时间曲线。瓶内含物具有约0℃的热力学冻结温度，但每个瓶内的溶液在减压的同时在非常窄的温度范围(即-4℃至-5℃)内成核，如区域28所示。曲线29代表冷冻干燥室内的架温度并描绘了平衡冷冻过程，一种在减压前保持架温度大致稳定的过程。

类似地，图3显示了利用室(31，32和33)减压诱导的成核进行动态冷却过程(见实施例7)的水溶液的三个瓶的温度对时间曲线。同样，瓶内含物具有约0℃的热力学冻结温度，但每个瓶内的溶液在减压的同时在约-7℃至-10℃的温度范围内成核，如区域38所示。曲线39代表冷冻干燥室内的架温度并通常描绘了动态冷却过程，一种在减压过程中或减压前主动降低架温度的过程。

如图中所示，本发明的方法通过能使冷冻干燥机中药物溶液的冷冻在较窄温度范围(例如约0℃至-10℃)内发生和/或同时借此产生具有更大瓶与瓶之间均匀性的冻干产品来提供成核过程的改进控制。尽管没有证明，但可预测到诱导成核温度范围可甚至扩展到稍微超过相变温度并还可扩展到过冷约40℃。

与本发明方法有关的另一益处在于通过控制最低成核温度和/或精确的成核时间，可影响冷冻的瓶或容器内形成的冰晶结构。冰晶结构为能影响冰升华所需时间的变量。因此，通过控制冰晶结构，可以大大加速整个冷冻干燥过程。

在宽泛意义上，本文公开的诱导材料内相变成核的方法包括步骤：(i)冷却材料到接近或低于材料相变温度的温度；和(ii)快速降低压力以诱导材料成核。下面将更详细地讨论这些重要步骤的每一个。

步骤1冷却材料

用在本发明方法中的示例性材料包括纯物质、气体、悬浮液、凝胶、液体、溶液、混合物或溶液或混合物内的组分。用于本发明方法的合适材料包括例如药物材料、生物药物材料、食品、化学材料，并可包括产品如伤口护理产品、化妆品、兽医产品和体内/体外诊断相关产品等。当材料为液体时，可能需要将气体溶解到液体内。受控气体环境中的液体通常使气体溶解在它们中。

用于本发明方法的其它示例性材料包括生物或生物药物材料如组织、器官和多细胞结构。对于某些生物和药物应用，材料可为包括以下的溶液或混合物：活病毒或减毒病毒；核酸；单克隆抗体；多克隆抗体；生物分子；非肽类似物；肽，包括多肽、肽模拟物和改性肽；蛋白质，包括融合蛋白和改性蛋白；RNA，DNA和它们的子类；寡核苷酸；病毒颗粒；和它们的类似这类材料或组分。

用于冷冻干燥的瓶或容器中包含的药物或生物药物溶液将是能从本发明方法受益的材料的一个好例子。溶液主要是水，并且基本上不可压缩。这类药物或生物药物溶液也非常纯，通常没有会形成成核部位的颗粒。均匀的成核温度对于在瓶与瓶之间或容器与容器之间形成一致均匀的冰晶结构很重要。形成的冰晶结构还大大影响干燥所需的时间。

当应用于冷冻干燥过程时，优选将材料放置在室中，如冷冻干燥室中。优选地，设计室以便允许控制室内的温度、压力和气体氛围。气体氛围可包括但不限于氩气、氮气、氦气、空气、水蒸气、氧气、二氧化碳、一氧化碳、一氧化二氮、氧化一氮、氖气、氙气、氪气、甲烷、氢气、丙烷、丁烷等，包括它们的可允许的混合物。优选的气体氛围包括惰性气体，如氩气，压力在约7至约50psig或以上之间。冷冻干燥器室内的温度通常由冷冻干燥过程规定，并可容易地通过使用能冷却或加热室内架以推动瓶或容器以及每个瓶或容器内材料的温度的传热流体来控制。

根据本发明的方法，将材料冷却到接近或低于其相变温度的温度。在进行冷冻干燥过程的水基溶液的情况下，相变温度为溶液的热力学凝固点。在溶液达到低于溶液热力学凝固点的温度时，认为是过冷。当应用于水基溶液的冷冻过程时，当过冷程度从接近或低于相变温度直到过冷约40℃时，更优选在过冷约3℃和过冷10℃之间时，本发明方法是有效的。在下面所述例子的一部分中，本发明的诱导成核的方法能理想地工作，即使溶液在其热力学凝固点以下仅仅过冷约1℃。

在材料处于低于其相变温度的温度时，经常被称为处于亚稳状态。亚稳状态是化学或生物体系的不稳定和短暂但相对长命的状态。亚稳材料临时以不是其平衡相或状态的相或状态存在。在材料或其环境没有任何变化时，亚稳材料将最终从其非平衡态转变到其平衡态。示例性的亚稳材料包括过饱和溶液和过冷液体。

亚稳材料的一个典型例子是处于大气压和-10℃温度下的液体水。由于0℃的正常凝固点，液体水不应在这个温度和压力下热力学存在，但它可以在没有开始冰结晶过程的成核事件或结构时存在。超纯水可在大气压下被冷却到非常低的温度(-30℃至-40℃)并仍保持为液态。这种过冷水处于非平衡热力学亚稳状态。只要缺少成核事件使它开始相变，它就会返回到平衡。

如上所述，本发明的诱导材料内相变成核或冷冻材料的方法可与各种冷却曲线一起使用，包括例如平衡冷却环境或动态冷却环境(见图2和3)。

步骤2快速降低压力

当材料达到接近或低于相变温度的所需温度时，对室迅速或快速减压。这种减压触发瓶或容器内溶液的成核和相变。在优选实施方案中，通过打开或部分打开使高压室与周围环境或较低压力室或环境分开的大控制阀实现室减压。升高的压力被离开室的气体氛围质量流出快速降低。减压需要相当快以诱导成核。应在几秒或更少内完成减压，优选40秒或以下，更优选20秒或以下，最优选10秒或以下。

在典型的冷冻干燥应用中，初始室压力和减压后最终室压力之间的压力差应大于约7psi，尽管较小的压降在一些情况下也可能诱导成核。大多数商业冷冻干燥机可容易地适应控制成核需要的压降范围。许多冷冻干燥机被设计具有超过25psig的压力定额以承受使用121℃的饱和蒸汽的常规杀菌过程。这种设备定额提供了足够的窗口来按照从超过环境压力或周围环境压力的起始压力减压的规程诱导成核。可通过任何已知的手段(例如气动、水力或机械)实现升高的压力和随后的减压。在优选实施方案中，本发明方法的工作压力应保持在任何施加气体的超临界压力以下，并且在材料成核过程中应避免对材料施加极低压力(即约10mTorr或以下)。

尽管不希望受任何特殊机理约束，但解释本发明方法实施中观察到的控制成核的一个可能机理是材料中溶液中的气体在减压时离开溶液并形成使材料成核的气泡。初始的升高压力增加了溶液中溶解气体的浓度。冷却后压力的快速降低减少了气体溶解度，并且气体从过冷溶液中的随后释放触发了相变成核。

另一个可能的机理是减压过程中材料周围气体的温度降低造成引发成核的材料表面上的冷点。另一个可能的机理是减压导致材料中部分液体的蒸发并且由于吸热蒸发过程产生的冷却引发成核。另一个可能的机理是材料附近的减压冷气体使减压前与材料平衡或在减压过程中通过蒸发从材料中释放的部分蒸汽冻结；得到的固体颗粒重新进入材料并用作引发成核的晶种或表面。这些机理中的一个或多个有助于引发冻结或凝固成核至不同程度，取决于材料性质、其环境和正被成核的相变。

过程可整个在大于环境压力的压力下或在跨越环境压力的压力范围内进行。例如，初始室压力可超过环境压力，减压后的最终室压力可超过环境压力但低于初始室压力；初始室压力可超过环境压力，减压后的最终室压力可为大致环境压力或稍微低于环境压力。

压降的速度和大小也被认为是本发明方法的重要方面。实验表明，在压降(ΔP)大于约7psi时，将诱导成核。或者，压降的大小可表示为绝对压力比R＝P_i/P_f，其中P_i为初始绝对压力，P_f为最终绝对压力。在本发明方法的许多实际应用中，认为在绝对压力比R大于约1.2时，减压时可诱导成核。压降速度也在本发明方法中起重要作用。表征压降速度的一种方法是通过使用参数A，其中A＝ΔP/Δt。同样，推测对于大于指定值如约0.2psi/s的A值将诱导成核。通过实验的经验数据应帮助确定优选的压降和压降速度。

下面的实施例突出了本文公开的诱导材料成核的方法的各种方面和特征，并且不从限制意义上理解。相反，这些实施例仅仅是说明性的，本发明的范围应只相对于附加的权利要求来确定。

实施例

本文描述的所有实施例都在小规模VirTis 51-SRC冷冻干燥机中进行，其具有总架空间大约1.0m²的四个架和内部冷凝器。对这种装置改型以保持不超过约15psig的正压。还增加1.5”直径圆形开孔到冷冻干燥室的后壁上，穿过后壁绝缘体从孔中伸出的1.5”直径不锈钢管从冷冻干燥机的后面出来。用卫生设备配件将两个1.5”全口气动球阀连接到这个管上。一个球阀允许气体流入到冷冻干燥室内并借此提供不超过15psig的正压。第二个球阀允许气体流出冷冻干燥室并借此降低室压力至大气条件(0psig)。通过使用PraxairNCoolTM-HX系统用液氮冷却的Dynalene MV传热流体的循环实现冷冻干燥机架和冷凝器的全部制冷。

所有溶液都在级别100清洁室中制备。定位冷冻干燥机，使得门、架和控制装置全部可从清洁室出入，而其它部件(泵、加热器等)位于非清洁室环境中。所有溶液都用HPLC级水(Fisher Scientific，通过0.10μm膜过滤)制备。在装入到瓶或冻干容器前通过0.22μm膜过滤最终溶液。所有气体经气瓶供应并通过0.22μm过滤器过滤除去颗粒。从Wheaton Science Products得到预清洗颗粒的玻璃容器(5mL瓶和60mL瓶)。适当时使用药学可接受载体。采取上述步骤以确保材料和方法满足用作成核剂的颗粒的常规药物制造标准。

本文使用的“药学可接受载体”包括任意溶剂、分散介质、抗氧化剂、盐、涂料、表面活性剂、防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸、抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、溶液缓凝剂(例如石蜡)、吸收剂(例如高岭土、膨润土)、药物稳定剂(例如十二烷基硫酸钠)、凝胶、粘合剂(例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基甲基纤维素、藻酸盐)、赋形剂(例如乳糖、奶糖、聚乙二醇)、崩解剂(例如琼脂、淀粉、乳糖、磷酸钙、碳酸钙、褐藻酸、山梨糖醇、甘氨酸)、润湿剂(例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯)、润滑剂、吸收促进剂(例如季铵盐)、食用油(例如杏仁油、椰子油、油脂或丙二醇)、甜味剂、风味剂、着色剂、填充剂(例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇)、压片润滑剂(例如硬脂酸镁、淀粉、葡萄糖、乳糖、大米花、白垩)、吸入用载体(例如烃推进剂)、缓冲剂或此类材料和它们的组合，这是本领域普通技术人员所知的。

对于本文描述的实验条件和研究的所有冻干配方，一般观察到随机成核在约-8℃和-20℃之间的容器温度下发生，有时在暖至-5℃下发生。通常可将容器保持在比-8℃暖的温度长的时间而不成核。通过容器温度响应融合放热潜热快速增加的点的温度测量确定成核开始和随后的晶体生长(即冻结)。还可通过冷冻干燥机室门上的观察镜目视确定冻结的开始。

实施例1控制成核温度

四个单独的瓶装有2.5mL 5wt％的甘露醇溶液。5wt％的甘露醇溶液的预计热力学凝固点为大约-0.5℃。将四个瓶彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上。使用表面安装的热电偶监测四个瓶的温度。用氩气对冷冻干燥机增压到14psig。

冷却冷冻干燥机架得到在大约-1.3℃和约-2.3℃之间的瓶温度(热电偶的测量精度为+/-1℃)。然后在少于5秒内将冷冻干燥机从约14psig减压到约大气压以诱导瓶内溶液的成核。全部四个瓶都在减压后立即成核并开始冻结。结果汇总在下面表1中。

从表1中看到，这个实施例中控制的成核温度(即初始瓶温度)相当接近预测的溶液热力学凝固点。因此，本方法允许控制成核在具有非常低的过冷程度或处于接近或仅仅稍微比它们的凝固点冷的成核温度下的溶液中发生。

气体初始瓶温度压降减压结

瓶# 溶液

氛围 [℃] [psi] 果

1 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -2.3 14 成核

2 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -1.3 14 成核

3 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -2.1 14 成核

4 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -1.7 14 成核

表1.控制成核温度

实施例2控制成核温度

在这个实施例中，95个瓶装有2.5mL 5wt％的甘露醇溶液。5wt％的甘露醇溶液的热力学凝固点为大约-0.5℃。将95个瓶彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上。使用表面安装的热电偶连续监测位于冷冻干燥机架上不同位置的六个瓶的温度。在氩气气氛中对冷冻干燥机增压到14psig。然后冷却冷冻干燥机架得到接近-5℃的瓶温度。然后在少于5秒内将冷冻干燥机从约14psig减压到约大气压以诱导瓶内溶液的成核。目视观察到全部95个瓶都在减压后立即成核并开始冻结。六个被监测瓶的热电偶数据证实视觉观察。结果汇总在表2中。

从其中看出，这个实施例中的控制成核温度(即初始瓶温度)略微低于预测的溶液热力学凝固点。因此，本发明的方法允许控制成核在具有中等过冷程度的溶液中发生。这个实施例还说明了本方法对多个瓶应用的可扩缩性。

气体初始瓶温度压降减压结

瓶# 溶液

氛围 [℃] [psi] 果

1 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.2 14 成核

2 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.4 14 成核

3 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.6 14 成核

4 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.4 14 成核

5 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.6 14 成核

6 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.1 14 成核

表2.控制成核温度

实施例3控制减压大小

在这个实施例中，多个瓶装有2.5mL 5wt％的甘露醇溶液。同样，5wt％的甘露醇溶液的预计热力学凝固点为大约-0.5℃。对于每次试验运行，都将瓶彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上。与前面描述的实施例一样，使用表面安装的热电偶监测瓶的温度。将冷冻干燥机中的氩气气氛加压到不同压力并冷却冷冻干燥机架得到约-5℃的瓶温度。在每次试验运行中，然后将冷冻干燥机从选定压力快速减压(即在少于5秒内)至大气压以诱导瓶内溶液的成核。结果汇总在表3中。

从表3中看出，在压降为约7psi或更大并且成核温度(即初始瓶温度)在约-4.7℃和-5.8℃之间时发生控制成核。

气体初始瓶温度压降减压结

瓶# 溶液

氛围 [℃] [psi] 果

1 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.7 7 成核

2 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.1 7 成核

3 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.3 7 成核

4 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.6 7 未成核

5 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.6 7 成核

6 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.8 7 成核

7 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.4 6 未成核

8 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.7 6 未成核

9 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.8 6 未成核

10 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.1 5 未成核

11 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.4 5 未成核

12 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.5 5 未成核

13 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.7 4 未成核

14 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.1 4 未成核

15 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.3 4 未成核

表3.减压大小的影响

实施例4控制减压速度

对于这个实施例，多个瓶装有约2.5mL预计热力学凝固点为大约-0.5℃的5wt％的甘露醇溶液。对于不同减压时间的每次试验运行，都将瓶彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上。与前面描述的实施例一样，使用表面安装的热电偶监测瓶的温度。类似上述实施例，将冷冻干燥机中的氩气气氛加压到14psig并冷却架得到约-5℃的瓶温度。在每次试验运行中，然后以不同的减压速度将冷冻干燥机从14psig减压到大气压以便诱导瓶内溶液的成核。

为了研究减压速度或减压时间的影响，在冷冻干燥机后部的减压控制阀出口上放置限制球阀。当限制阀完全打开时，在大约2.5秒内实现从约14psig到约0psig的减压。通过仅仅部分关闭限制阀，可以变化地增加室减压时间。使用限制球阀，以不同速度对冷冻干燥机室减压来进行几次试验运行以确认或确定减压速度对成核的影响。结果汇总在表4中。

气体初始瓶温压降时间减压结

瓶# 溶液

氛围度 [℃] [psi] [s] 果

1 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.6 14 300 未成核

2 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.4 14 300 未成核

3 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.8 14 300 未成核

4 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.6 14 200 未成核

5 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.4 14 200 未成核

6 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.4 14 200 未成核

7 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.6 14 100 未成核

8 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.2 14 100 未成核

9 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.2 14 100 未成核

10 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.7 14 60 未成核

11 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.1 14 60 未成核

12 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.1 14 60 未成核

13 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.1 14 50 未成核

14 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.3 14 50 未成核

15 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.9 14 50 未成核

16 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.4 14 42 未成核

17 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.5 14 42 未成核

18 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.0 14 42 未成核

19 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.1 14 32 成核

20 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.7 14 32 成核

21 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.6 14 32 成核

22 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.7 14 13 成核

23 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.3 14 13 成核

24 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.5 14 13 成核

表4.减压时间的影响

从表4中看出，成核仅仅在减压时间少于42秒、压降为约14psi或更大并且成核温度(即初始瓶温度)在约-4.6℃和约-5.8℃之间时发生。这些结果表明，为了方法有效，减压需要相对快地完成。

实施例5控制气体氛围

同样，多个瓶各自装有约2.5mL 5wt％的甘露醇溶液并彼此紧靠着被放在冷冻干燥机架上。与前述实施例相同，使用表面安装的热电偶监测试验瓶的温度。对于不同的试验运行，改变冷冻干燥机中的气体氛围，但总是保持约14psig的正压。在这个实施例中，冷却冷冻干燥机架得到大约-5℃至-7℃的瓶温度。在每次试验运行中，然后将冷冻干燥机从约14psig快速减压到大气压以便诱导瓶内溶液的成核。结果汇总在表5中。

从其中看出，控制成核发生在除了氦气气氛的所有气体氛围中，其中压降为约14psi和成核温度(即初始瓶温度)在约-4.7℃和约-7.4℃之间。尽管实施例中未示出，但认为替代条件很可能使氦气气氛中的控制成核成为可能。

气体初始瓶温压降

瓶# 溶液减压结果

氛围度[℃] [psi]

1 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -4.9 14 成核

2 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.2 14 成核

3 2.5mL 5wt％的甘露醇氮气 -4.7 14 成核

4 2.5mL 5wt％的甘露醇氮气 -5.1 14 成核

5 2.5mL 5wt％的甘露醇氙气 -4.8 14 成核

6 2.5mL 5wt％的甘露醇氙气 -5.0 14 成核

7 2.5mL 5wt％的甘露醇空气 -7.4 14 成核

8 2.5mL 5wt％的甘露醇空气 -7.214 成核

9 2.5mL 5wt％的甘露醇氦气 -5.814 未成核

10 2.5mL 5wt％的甘露醇氦气 -5.514 未成核

表5.气体氛围组成的影响

实施例6大体积溶液

在这个实施例中，6个冻干瓶(60mL容量)装有约30mL预计热力学凝固点为大约-0.5℃的5wt％的甘露醇溶液。将6个冻干瓶彼此紧靠着放在冷冻干燥机上。使用表面安装的热电偶监测位于冷冻干燥机架中不同位置处的6个瓶的温度。在氩气气氛中将冷冻干燥机加压到约14psig。然后冷却冷冻干燥机架得到接近-5℃的瓶温度。然后在少于5秒内将冷冻干燥机从14psig减压到约大气压以诱导瓶内溶液的成核。结果汇总在表6中。

在另一实验中，塑料制大冷冻干燥盘(Gore LYOGUARD，1800mL容量)装有约1000mL 5wt％的甘露醇溶液。得到预先清洁的盘以满足USP低颗粒物要求。将盘放在冷冻干燥机架上，通过安装在靠近一侧中心的盘外表面上的热电偶监测盘的温度。然后冷却冷冻干燥机架得到接近-7℃的盘温度。然后将冷冻干燥机在少于5秒内从14psig减压到约大气压以诱导盘内溶液的成核。结果也汇总在表6中。

同上述实施例，所有容器都在减压后立即成核并开始冻结。还是同上述实施例，这个实施例中的成核温度(即容器温度)非常可控地在一定程度上接近溶液的热力学冻结温度。更重要地，这个实施例说明了本方法允许控制成核在较大体积溶液中和各种容器形式中发生。应注意，能预料到当配方体积增加时减压方法的效率提高，因为当更多分子存在聚集并形成临界核时成核事件更有可能发生。

气体压降减压结

容器溶液容器温度[℃]

氛围 [psi] 果

瓶#1 30mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.3 14 成核

瓶#2 30mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.1 14 成核

瓶#3 30mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.9 14 成核

瓶#4 30mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.2 14 成核

瓶#5 30mL 5wt％的甘露醇氩气 -5.9 14 成核

瓶#6 30mL 5wt％的甘露醇氩气 -6.1 14 成核

盘 1000mL 5wt％的甘露醇氩气 -6.9 14 成核

表6.溶液体积核容器类型的影响

实施例7动态冷却对平衡冷却

可按各种方式利用本发明的控制成核的方法。上述实施例1-6各自说明了控制在低于热力学凝固点的温度下基本平衡(即非常缓慢地改变温度)的冻干溶液的成核温度的方面。这个实施例说明也可在动态冷却环境(即溶液经历快速温度变化)中在低于热力学凝固点的温度下发生成核。

在这个实施例中，瓶1至6代表上面关于实施例2描述的样品。另外，三个单独的瓶(瓶7-9)也装有2.5mL 5wt％的甘露醇溶液。在单独的试验运行中，将三个附加的瓶彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上。向着-45℃的最终架温度快速冷却冷冻干燥机架。当一个瓶达到约-5℃的温度时，这通过表面安装的热电偶测量，将冷冻干燥机从约14psig快速减压到0psig以便诱导成核。全部三个瓶都在减压后立即成核并开始冻结。由于动态冷却环境，瓶温度在成核前明显下降到-6.8℃和-9.9℃之间。对比结果汇总在下面表7中。

压降减压结

瓶# 溶液方式成核温度[℃]

[psi] 果

1 2.5mL 5wt％的甘露醇平衡 -4.2 14 成核

2 2.5mL 5wt％的甘露醇平衡 -4.4 14 成核

3 2.5mL 5wt％的甘露醇平衡 -4.6 14 成核

4 2.5mL 5wt％的甘露醇平衡 -4.4 14 成核

5 2.5mL 5wt％的甘露醇平衡 -4.6 14 成核

6 2.5mL 5wt％的甘露醇平衡 -5.1 14 成核

7 2.5mL 5wt％的甘露醇动态 -6.8 14 成核

8 2.5mL 5wt％的甘露醇动态 -7.2 14 成核

9 2.5mL 5wt％的甘露醇动态 -9.9 14 成核

表7.试验结果动态冷却对成核的影响

本发明方法对控制在给定温度范围内平衡的冻干溶液或正被急剧冷却的冻干溶液中成核的效力为最终用户提供了具有不同益处和权衡的两种可能应用方式。通过允许冻干溶液平衡，成核温度范围将窄或被最小至冷冻干燥机自身的性能极限。相对于其中室和瓶温度在一个步骤中降低到小于约-40℃的常规或动态规程，冻结平衡步骤需要额外时间来实现。但是，使用平衡步骤应在所有瓶或容器上产生大大改善的成核均匀性以及实现与精确控制材料成核温度有关的其它益处。

或者，如果不需要平衡材料或冻干溶液温度，则可简单地在常规冷冻或动态冷却规程中在合适的时间时实施减压步骤。动态冷却过程中的减压将在冻干容器内产生材料成核温度的较宽分布，但会增加最少时间到冷冻规程并仍允许解决极度过冷的问题。

实施例8不同赋形剂的影响

本发明的控制或诱导材料成核的方法可用于控制包含不同冻干赋形剂的过冷溶液的成核温度。这个实施例说明本发明的方法与以下赋形剂共同使用：甘露醇；羟基乙基淀粉(HES)；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)；葡聚糖；甘氨酸；山梨糖醇；蔗糖；和海藻糖。对于每种赋形剂，用包含5wt％赋形剂的2.5mL溶液装填2个瓶。将瓶彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上。在氩气气氛中将冷冻干燥机加压到约14psig。冷却冷冻干燥机架得到接近-3℃的瓶温度，然后快速减压诱导成核。结果汇总在表8中。

气体初始瓶温度压降减压结

瓶# 溶液

氛围 [℃] [psi] 果

1 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -3.3 14 成核

2 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -3.0 14 成核

3 2.5mL 5wt％的HES 氩气 -3.1 14 成核

4 2.5mL 5wt％的HES 氩气 -3.7 14 成核

5 2.5mL 5wt％的PEG 氩气 -3.8 14 成核

6 2.5mL 5wt％的PEG 氩气 -3.4 14 成核

7 2.5mL 5wt％的PVP 氩气 -3.5 14 成核

8 2.5mL 5wt％的PVP 氩气 -3.3 14 成核

9 2.5mL 5wt％的葡聚糖氩气 -4.0 14 成核

10 2.5mL 5wt％的葡聚糖氩气 -3.1 14 成核

11 2.5mL 5wt％的甘氨酸氩气 -3.8 14 成核

12 2.5mL 5wt％的甘氨酸氩气 -3.9 14 成核

13 2.5mL 5wt％的山梨糖醇氩气 -3.6 14 成核

14 2.5mL 5wt％的山梨糖醇氩气 -3.4 14 成核

15 2.5mL 5wt％的蔗糖氩气 -3.3 14 成核

16 2.5mL 5wt％的蔗糖氩气 -3.4 14 成核

17 2.5mL 5wt％的海藻糖氩气 -3.7 14 成核

18 2.5mL 5wt％的海藻糖氩气 -3.1 14 成核

表8.不同冻干赋形剂的影响

实施例9控制蛋白质溶液的成核

本文公开的方法可用于控制过冷蛋白质溶液的成核温度而没有对蛋白质溶解性或酶活性的负面或反面影响。在这个实施例中使用两种蛋白质，即牛血清白蛋白(BSA)和乳酸盐脱氢酶(LDH)。

将BSA溶解在5wt％甘露醇中，浓度为10mg/mL。3个冻干瓶装有2.5mL BSA-甘露醇溶液并被彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上。在氩气气氛中将冷冻干燥机加压到约14psig。冷却冷冻干燥机架得到接近-5℃的瓶温度。对冷冻干燥机快速减压诱导成核。BSA溶液的全部瓶都在减压后立即成核并开始冻结。解冻时没有观察到蛋白质的沉淀。

从两个不同的供应商得到LDH蛋白质，并出于清楚目的被标记为LDH-1或LDH-2以区分两种不同的批次。将LDH-1溶解在5wt％甘露醇中，浓度为1mg/mL。6个冻干瓶装有2.5mL LDH-1/甘露醇溶液并被彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上。在氩气气氛中将冷冻干燥机加压到约14psig。从室温开始冷却冷冻干燥机架得到接近-4℃的瓶温度。然后对冷冻干燥机快速减压诱导成核。全部瓶都在减压后立即成核并开始冻结。将瓶保持在这个状态下约15分钟。然后以大约1℃/min的速度冷却冷冻干燥机架得到接近-45℃的瓶温度并再保持15分钟以确保冷冻过程完成。在冷冻步骤后，然后以约1℃/min的速度升温冷冻干燥机架以提高瓶温度到接近5℃。解冻时没有观察到蛋白质的沉淀。分析瓶内含物的酶活性，将结果与未冷冻LDH-1/甘露醇溶液对照样品比较。

作为实施例9的一部分，将LDH-1/甘露醇溶液减压成核的样品与随机成核的样品比较。在LDH-1的随机成核样品中，没有加压和减压并且没有氩气气氛地重复冷冻过程。具体地说，将LDH-1溶解在5wt％甘露醇中，浓度为1mg/mL。6个冻干瓶装有2.5mL LDH-1/甘露醇溶液并被彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上。从室温开始以大约1℃/min的速度冷却冷冻干燥机架得到接近-45℃的瓶温度并保持15分钟以确保冷冻过程完成。在冷冻步骤后，以约1℃/min的速度升温冷冻干燥机架以提高瓶温度到接近5℃。解冻时没有观察到蛋白质的沉淀。分析瓶内含物的酶活性，将结果与未冷冻LDH-1/甘露醇溶液的相同对照样品比较。同样作为实施例9的一部分，使用LDH-2重复上面为LDH-1描述的实验。唯一的不同在于LDH-2的成核温度接近-3℃，而不是LDH-1的-4℃。

从表9中看出，相对于可比较的随机成核和冷冻规程，通过减压实现的控制成核和冷冻过程明显没有降低酶活性。事实上，通过减压实现的控制成核过程似乎更好地保存了酶活性，与随机成核后LDH-135.9％和LDH-241.3％的平均活性损失相比，LDH-1的平均活性损失只有17.8％，LDH-2只有26.5％。

初始瓶温压降酶活性减压结

瓶# 溶液气氛

度[℃] [psi] 损失[％] 果

1 2.5mL BSA溶液氩气 -4.9 14 - 成核

2 2.5mL BSA溶液氩气 -4.3 14 - 成核

3 2.5mL BSA溶液氩气 -5.3 14 - 成核

4 2.5mL LDH-1溶液氩气 -3.8 14 9.0 成核

5 2.5mL LDH-1溶液氩气 -4.0 14 16.2 成核

6 2.5mL LDH-1溶液氩气 -3.7 14 18.4 成核

7 2.5mL LDH-1溶液氩气 -4.0 14 23.4 成核

8 2.5mL LDH-1溶液氩气 -3.9 14 18.5 成核

9 2.5mL LDH-1溶液氩气 -4.0 14 21.2 成核

10 2.5mL LDH-1溶液空气 -10.4 0 35.7 成核

11 2.5mL LDH-1溶液空气 -16.5 0 35.4 成核

12 2.5mL LDH-1溶液空气 -15.5 0 36.1 成核

13 2.5mL LDH-1溶液空气 -10.5 0 43.9 成核

14 2.5mL LDH-1溶液空气 -9.8 0 24.9 成核

15 2.5mL LDH-1溶液空气 -11.0 0 39.2 成核

16 2.5mL LDH-2溶液氩气 -3.1 14 29.9 成核

17 2.5mL LDH-2溶液氩气 -2.9 14 18.9 成核

18 2.5mL LDH-2溶液氩气 -3.1 14 23.3 成核

19 2.5mL LDH-2溶液氩气 -2.7 14 19.6 成核

20 2.5mL LDH-2溶液氩气 -3.1 14 32.1 成核

21 2.5mL LDH-2溶液氩气 -2.6 14 35.2 成核

22 2.5mL LDH-2溶液空气 -5.0 0 38.3 成核

23 2.5mL LDH-2溶液空气 -5.5 0 40.0 成核

24 2.5mL LDH-2溶液空气 -2.3 0 36.5 成核

25 2.5mL LDH-2溶液空气 -3.8 0 42.0 成核

26 2.5mL LDH-2溶液空气 -5.1 0 50.2 成核

27 2.5mL LDH-2溶液空气 -5.9 0 40.6 成核

表9.控制过冷蛋白质溶液的成核温度

应注意，观察到的LDH-2的随机成核温度比LDH-1的随机成核温度大很多。这种差异可能是由于LDH-2中用作成核剂的一些污染物。与LDH-1相比，LDH-2的随机成核温度相当接近LDH-2的控制成核温度，但通过LDH-1和LDH-2的控制成核得到的酶活性保留提高是类似的，分别为18.1％和14.8％。这种结果表明，酶活性保留的改善部分归因于控制成核过程本身的特征，不仅仅是通过减压得到的指定较高成核温度。

实施例10减少初步干燥时间

通过混合约10.01克甘露醇与约190.07克水制备5wt％的甘露醇溶液。瓶装入2.5mL 5wt％的甘露醇溶液。称量空瓶和有溶液的瓶以确定加入到瓶的水质量。将20个瓶彼此紧靠着放在冷冻干燥机架上的架中。使用表面安装的热电偶监测6个瓶的温度；所有被监测的瓶都被其它瓶包围以提高瓶行为的均匀性。在氩气控制气体氛围中将冷冻干燥机加压到约14psig。将冷冻干燥机架从室温冷却到约-6℃得到在大约-1℃和-2℃之间的瓶温度。然后在少于5秒内将冷冻干燥机从约14psig减压到约大气压以诱导瓶内溶液的成核。目视观察或通过热电偶监测的所有瓶都在减压后立即成核并开始冻结。

然后快速降低架温度到约-45℃以完成冷冻过程。一旦所有瓶温度都为约-40℃或以下，就抽空冷冻干燥室并开始初步干燥(即升华)过程。在这种干燥过程中，通过1小时匀变升温冷冻干燥机架到约-14℃，并在该温度下保持16小时。在整个干燥过程中都保持冷凝器在约-60℃下。通过关闭真空泵并用氩气回填室至大气压停止干燥过程。从冷冻干燥机中迅速取出瓶并称量确定在初步干燥过程中失去多少水。

在作为实施例10一部分的另一实验中，其它瓶装有2.5mL相同的5wt％的甘露醇溶液。称量空瓶和有溶液的瓶以确定加入到瓶的水质量。按与上述相同的方式将瓶装载到冷冻干燥机内，同样使用表面安装的热电偶监测6个瓶的温度。将冷冻干燥机架从室温快速冷却到约-45℃以冷冻瓶。在冷却步骤中，成核在约-15℃和约-18℃之间随机发生。一旦所有瓶温度都为约-40℃或以下，就按与上述方法相同的方式干燥瓶。当结束初步干燥时，从冷冻干燥机中迅速取出样品并称量确定在初步干燥过程中失去了多少水。

气体初始瓶温压降水损失减压结

瓶# 溶液

氛围度 [℃] [psi] [％] 果

1 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -1.3 14 89.9 成核

2 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -1.9 14 85.2 成核

3 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -1.3 14 87.1 成核

4 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -2.3 14 88.8 成核

5 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -2.1 14 85.0 成核

6 2.5mL 5wt％的甘露醇氩气 -1.1 14 80.7 成核

7 2.5mL 5wt％的甘露醇空气 -15.7 0 65.7 -

8 2.5mL 5wt％的甘露醇空气 -16.7 0 66.9 -

9 2.5mL 5wt％的甘露醇空气 -14.5 0 64.6 -

10 2.5mL 5wt％的甘露醇空气 -15.6 0 64.7 -

11 2.5mL 5wt％的甘露醇空气 -16.5 0 64.1 -

12 2.5mL 5wt％的甘露醇空气 -17.9 0 65.7 -

表10.提高成核温度改善初步干燥

利用控制成核和随机成核的冷冻干燥过程的结果汇总在表10中。应注意到，这两个实验仅仅在增加通过减压步骤的控制成核到一个实验方面不同。从表10中看出，通过减压实现的控制成核过程允许成核在非常低的过冷程度下，在这个实施例中在约-1.1℃和-2.3℃之间。与随机成核情况相比，控制成核情况高得多的成核温度产生干燥性质大大提高的冰结构和得到的冻干块。对于相同量的干燥时间，使用公开的减压方法在约-1.1℃和-2.3℃之间成核的瓶失去它们水的平均86.1％，而在约-14.5℃和-17.9℃之间随机成核的瓶只失去平均65.3％。因此，随机成核的瓶需要多得多的初步干燥时间以获得与按照本文公开的方法以控制方式成核的瓶相同程度的水损失。干燥时间的改善可能归因于较暖成核温度下较大冰晶的形成。这些较大的冰晶在升华时留下较大的孔，较大的孔在进一步升华过程中对水蒸气流提供了较小的阻力。

工业实用性

本发明方法提供了控制过冷物质即液体或溶液成核然后冻结的温度和/或时间的改进方法。尽管这种应用部分集中在冷冻干燥上，但包括成核相变的任何材料处理步骤都会出现类似问题。这类过程的例子包括由熔体结晶聚合物和金属、由过饱和溶液结晶材料、蛋白质的结晶、人工造雪、食物冷冻、冷冻浓缩、分级结晶、超低温保存或蒸汽凝结成液体。

控制液体或溶液成核温度的最直接益处是控制相变产生的固体区域数量和大小的能力。例如，在冷冻水时，成核温度直接控制形成的冰晶的尺寸和数量。一般而言，当成核温度较暖时，冰晶在数量上较少，在尺寸上较大。

控制相变产生的固体区域数量和尺寸的能力可提供额外的益处。例如，在冷冻干燥过程中，冰晶的数量和尺寸强烈影响冻干块的干燥性质。较暖成核温度产生的较大冰晶在升华时留下较大的孔，较大的孔在随后的升华过程中对水蒸气流提供较少的阻力。因此，本发明的方法通过提高成核温度提供了增加冷冻干燥过程中初步干燥(即升华)速度的手段。

在通过冷冻方法保存(即超低温保存)敏感材料的应用中可实现另一可能的益处。例如，在水溶液中冷冻的生物材料包括但不限于哺乳动物组织样品(例如脐血、组织活检、鸡蛋和精子细胞等)、细胞系(例如哺乳动物、酵母、原核的、真菌的等)和生物分子(例如蛋白质、DNA、RNA和它们的子类)可在会损害材料功能或活性的冷冻过程中经历各种应激。冰形成可在物理上破坏材料或在材料经历的界面结合、渗透力、溶质浓度等方面产生剧烈变化。由于成核控制冰形成的结构和动力学，因此它可显著影响这些应激。本文公开的方法因此提供了减少与超低温保存法有关的应激并增强了从超低温保存材料恢复功能或活性的独特手段。本发明方法还提供了超过在为活细胞设计的两步骤超低温保存方法中用于引发细胞外形成的常规成核控制方法(例如接种或接触冷表面)的改进。

本发明方法还适用于超低温保存和冻干应用中包含几种成分的复杂溶液或混合物。这些配方经常为具有水、有机或混合水-有机溶剂的溶液，其包含药学活性成分(例如合成化学物质、蛋白质、肽或疫苗)，和任选地包含一种或多种缓和成分，包括：有助于防止干燥过程中活性成分有形损失的填充剂(例如右旋糖、葡萄糖、甘氨酸、乳糖、麦芽糖、甘露醇、聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠和山梨糖醇)；有助于保持适宜环境pH或活性成分毒性的缓冲剂或毒性改良剂(例如，乙酸、苯甲酸、柠檬酸、盐酸、乳酸、马来酸、磷酸、酒石酸和上述酸的钠盐)；有助于保留处理过程中或其最终液体或干燥形式中活性成分结构和功能的稳定剂(例如，丙氨酸、二甲基亚砜、甘油、甘氨酸、人血清白蛋白、聚乙二醇、赖氨酸、聚山梨醇酯、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖)；能改变配方玻璃转变行为的试剂(例如，聚乙二醇和糖)，和保护活性成分免于降解的抗氧化剂(例如抗坏血酸盐、亚硫酸氢钠、甲醛钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、次硫酸盐和硫甘油)。

由于成核一般为随机过程，因此经受相同处理条件的多种相同材料可能在不同温度下成核。结果，尽管处理条件相同，但依赖于成核行为的这些材料的性质将可能不同。公开的方法提供了同时控制多种材料的成核温度的手段并因此提供了增加依赖于成核行为的这些产品性质的均匀性的方式。在典型的冷冻干燥过程中，例如，不同瓶中的相同溶液可再宽的温度范围内随机成核，结果，最终的冷冻干燥产品在临界性质如残余水分、活性和重构时间方面具有显著差异。通过利用本文公开的方法控制成核温度，可大大提高冷冻干燥过程中产品性质的瓶与瓶之间均匀性。

控制材料成核行为的能力还可在减少开发由正常未控制成核事件决定的工业过程所需时间方面提供很大益处。例如，经常需要数月来开发可在合理时间量内完成、产生在指定均匀性内的所需产品性质和保持活性药物成分(API)足够活性的成功冷冻干燥循环。通过提供控制成核并因此可能改善初步干燥时间、产品均匀性和API活性的手段，本发明的方法应能大大减少开发成功冷冻干燥规程所需的时间。

特别地，本发明成核方法的潜在益处在指定要被冷冻干燥的配方的组成方面提供提高的灵活性。由于控制成核可在冷冻步骤中更好地保存API，因此用户应能减少添加缓和成分(例如稳定剂)到配方中活选择配方成分的更简单组合以获得组合的稳定性和处理目标。在控制成核减少使用本质上延长初步干燥时间的稳定剂或其它缓和成分(例如通过降低水溶液的玻璃转变温度)的情况下，可能出现协同益处。

公开的方法尤其很好地适用于大规模生产或制造操作，因为可使用能容易地被按比例调整或改变以制造各式各样产品的相同设备和工艺参数来进行。方法考虑使用其中全部操纵可在单个室(例如冷冻干燥机)中进行和其中过程不要求使用真空、添加剂的使用、振动、电冷冻等诱导成核的方法使材料成核。

与现有技术相比，本发明的方法不增加任何东西到冻干产品中。它只要求材料(例如瓶中的液体)开始时被保持在气体环境中的指定压力下和快速降低压力至较低压力。在冻干循环中，将从瓶中取出所有应用的气体。瓶或它们的内含物不接触或触及除气体外的任何东西。环境压力和气体环境的简单操纵本身足以达到该目标。通过仅仅依靠环境压力变化诱导成核，本文公开的方法均匀和同时地影响冷冻干燥机内的所有瓶。

与冻干应用中影响材料成核的现有技术方法相比，本发明的实施方案还不太昂贵并且更容易实施和维护。本发明方法能明显加快冻干过程中的初步干燥，从而减少冷冻干燥药物的处理成本。与现有技术方法相比，本发明方法产生均匀得多的冻干产品，从而减少产品损失并为不能满足更严格均匀性规范的加工者形成进入市场壁垒。这种方法获得这些益处而不污染冻干产品。更大的过程控制应产生改善的产品和缩短的处理时间。

从上文中应认识到，本发明因此提供了诱导材料成核的方法和/或冷冻材料的方法。本发明方法的各种改进、变化和改变对于本领域技术人员将是显而易见的，并要认识到，这种改进、变化和改变都将包括在本申请的界限以及权利要求的精神和范围内。

Claims

1.一种在冷冻干燥室内诱导材料中相变成核的方法，包括步骤：

在压力为7至50psig的冷冻干燥室中使材料达到低于热力学凝固点和亚稳状态；和

在40秒或以下内，快速降低材料附近的在所述冷冻干燥室中的压力以诱导材料中冷冻成核。

2．权利要求1的方法，还包括在减压后冷却成核的材料到或低于确保材料进一步冷冻的最终温度的步骤。

3．权利要求1的方法，其中当材料达到所需的成核温度时开始所述冷冻干燥室中的减压。

4．权利要求1的方法，其中在材料温度低于热力学凝固点温度后在所需的时间下开始所述冷冻干燥室中的减压。

5．权利要求1的方法，其中所述材料还包括生物药物材料。

6. 权利要求1的方法，其中所述材料还包括药物材料。

7. 权利要求1的方法，其中所述材料还包括化学材料。

8. 权利要求1的方法，其中所述材料还包括生物材料。

9．权利要求1的方法，其中压力被降低等于或大于14 psi的数量。

10．权利要求1的方法，其中压力被降低大于7 psi的数量。

11．权利要求1的方法，其中降低压力使得绝对压力比P_i/P_f为1.2或更大。

12．权利要求1的方法，其中以大于0.2 psi每秒的压降速度ΔP/Δt降低压力。

13．权利要求1的方法，其中所述材料包含活病毒或减毒病毒。

14. 权利要求1的方法，其中所述材料还包含核酸。

15. 权利要求1的方法，其中所述材料还包含单克隆抗体或多克隆抗体。

16. 权利要求1的方法，其中所述材料还包含生物分子。

17. 权利要求1的方法，其中所述材料还包含非肽类似物。

18. 权利要求1的方法，其中所述材料还包含肽。

19. 权利要求1的方法，其中所述材料还包含蛋白质。

20．一种在冷冻干燥室内控制在多个容器中的材料冷冻过程的方法，包括步骤：

在压力为7至50psig的冷冻干燥室中以指定的冷却速度冷却材料，以使材料达到低于热力学凝固点和亚稳状态；

在40秒或以下内快速降低所述加压的冷冻干燥室中的压力使所述多个容器中的材料冷冻成核；和

继续冷却所述多个容器中的成核的材料到指定最终温度以进一步冷冻材料。

21．权利要求20的方法，其中当所述多个容器中的材料达到所需的成核温度时开始减压。

22．权利要求20的方法，其中在起始的冷却步骤开始后在所需的时间并且当所述多个容器中的材料温度低于热力学凝固点温度时开始减压。