CN101379357A

CN101379357A - 冷冻干燥系统和方法

Info

Publication number: CN101379357A
Application number: CNA2007800049139A
Authority: CN
Inventors: T·H·加斯泰尔; R·R·塞弗; B·赫内克; N·格林特; M·L·费尔东
Original assignee: Praxair Technology Inc
Current assignee: SP Industries Inc
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2027-02-07
Also published as: CN101379357B; CN101379356A; CN101379356B

Abstract

本发明提供了用于冷冻干燥或冻干的系统和方法。在冷冻步骤中，待冷冻的材料或溶液首先置于接近或低于其冷冻温度的温度，随后冷冻干燥室中的压力下降以诱导材料形核。

Description

冷冻干燥系统和方法

相关申请交叉引用

[0001]本申请要求2006年2月10日提交的美国临时专利申请系列号60/771868的优先权。

技术领域

[0002]本发明涉及冷冻干燥方法，尤其涉及诱导材料冷冻形核的方法，其中所述材料初始冷却到低于相变温度的温度，然后减压以在材料中诱导冷冻形核。

背景技术

[0003]对冷冻干燥或冻干过程的冷冻阶段中通常随机的形核过程进行控制，以减少完成冷冻干燥所需的加工时间和增加最终产物中瓶与瓶之间的产物均匀性，在本领域中会是非常理想的。在典型的药物冷冻干燥过程中，含有共同的水溶液的多个小瓶被放置在架子上，所述架子通常以受控速度冷却到低温。每个小瓶中的水溶液冷却到低于该溶液的热力学冷冻温度，保持在过冷的亚稳液体状态直到发生形核。

[0004]所有小瓶的形核温度范围在接近所述热力学冷冻温度的温度和明显低于所述热力学冷冻温度的某个值(例如，至多大约30℃)之间随机分布。这种形核温度分布导致冷冻干燥制品的冰晶结构和最终的物理性质在瓶与瓶之间有变化。而且，冷冻干燥过程的干燥阶段必须过分长以包容由所述自然随机形核现象带来的冰晶尺寸和结构的范围。

[0005]已经采用添加剂来增加过冷溶液的形核温度。这些添加剂可以采用许多形式。公知的是一些细菌(比如，假单胞菌)合成有助于在过冷水溶液中形成冰核的蛋白质。细菌或者其分离蛋白质可以加入到溶液中以增加形核温度。多种无机添加剂也显示出形核效应；最常见的这类添加剂是碘化银，AgI。一般而言，任何添加剂或污染物具有充当形核剂的潜力。在含有高颗粒水平的环境中制备的冷冻干燥小瓶通常比在低颗粒环境中制备的小瓶在更低的过冷度下形核和冷冻。

[0006]所有上述形核剂标记为“添加剂”，因为它们改变于其中它们成为相变核心的介质的组成。对于FDA规定和许可的冷冻干燥药物制品而言，这些添加剂通常是不能接受的。这些添加剂也不提供对小瓶形核和冷冻时的时间和温度的控制。相反，添加剂仅仅提高小瓶的平均形核温度。

[0007]冰晶自身能够在过冷水溶液中充当形成冰的形核剂。在“冰雾”方法中，湿的冷冻干燥器填充有冷气体以制备小冰颗粒的蒸气悬浮体。冰颗粒输送到小瓶中，当它们接触流体界面时引发形核。

[0008]“冰雾”方法并不在受控的时间和温度来同时控制多个小瓶的形核。换而言之，在引入冷蒸气进入冷冻干燥器中时，形核事件并不同时或者瞬时在所有小瓶中发生。冰晶将花费一些时间进入到每个小瓶中来引发形核，对于在冷冻干燥器中不同位置的小瓶而言输送时间可能不同。对于大规模的工业冷冻干燥器而言，“冰雾”方法的实施会要求系统设计变化，因为需要内部对流设备来辅助在冷冻干燥器中获得“冰雾”的更均匀分布。当冷冻干燥器架子连续冷却时，第一个小瓶冷冻和最后一个小瓶冷冻之间的时间差在小瓶之间形成温度差，这增加了冷冻干燥制品中小瓶和小瓶之间的不均匀性。

[0009]通过刻划、刮擦或者粗糙化对小瓶进行预处理，也已经用来降低形核所需的过冷度。对于其它现有技术方法而言，小瓶预处理也并不在各个小瓶形核和冷冻时对时间和温度进行任何程度的控制，而是仅仅提高所有小瓶的平均形核温度。

[0010]也采用振动来在亚稳材料中引发相变。足以引发形核的振动在频率高于10kHz时发生，并可以采用各种装置制备。通常将该频率范围内的振动称为“超声”，但是在10kHz-20kHz范围内的频率通常在人类的听力范围内。超声振动通常在过冷溶液中产生气穴现象，或者形成小气泡。在该短暂的或者惯性的(inertial)气穴现象中，气泡快速长大和坍塌，导致非常高的局部压力和温度波动。在亚稳材料中超声振动引发形核的能力通常归因于短暂气穴现象导致的紊乱。其它称作稳定的或者非惯性的气穴现象，特征在于气泡显示出稳定的体积或者形状振荡，而没有坍塌。美国专利申请20020031577A1公开了超声振动即使在稳定的气穴现象中也能够诱发形核，但是没有对该现象进行解释。GB专利申请2400901A也公开了采用频率高于10kHz的振动在溶液中造成气穴并因而形核的可能性可以通过减低溶液周围的环境压力或者在溶液中熔解挥发性流体而增加。

[0011]电冷冻方法在过去也用于在过冷液体中诱导形核。电冷冻通常如下完成:在浸没在过冷液体或溶液中的分开很窄的电极之间以连续方式或脉冲方式传递相对高的电场(～1V/nm)。在典型冷冻干燥应用中和电冷冻方法相关的缺点包括实现和保持的相对复杂性和成本，尤其对于采用多个小瓶或容器的冷冻干燥应用而言。同样，电冷冻不能直接用于含有离子物种(例如NaCl)的溶液中。

[0012]最近，有研究实验了“真空诱导表面冷冻”的概念(参见例如美国专利No.6684524)。在所述“真空诱导表面冷冻”中，含有水溶液的小瓶被加载到冷冻干燥器中的温控架子上，开始保持在大约10摄氏度。冷冻干燥室随后抽空至接近真空压力(例如，1mbar)，这导致水溶液的表面冷冻至数毫米的深度。随后释放真空和将架子温度降到低于溶液凝固点，使得冰晶体可以从预先冷冻的表面层生长通过溶液的剩余部分。在典型冷冻干燥应用中实施这种“真空诱导表面冷冻”过程的主要不足在于在所述条件下溶液出现剧烈沸腾或者排气的高风险。

[0013]改善对形核过程的控制能够使冷冻干燥器中的所有未冷冻的药物溶液小瓶在更窄的温度和时间范围内冷冻，由此产生瓶与瓶之间均匀性更大的冷冻干燥制品。对最小形核温度的控制能够在小瓶中形成冰晶体结构，并使得冷冻干燥过程显著加速。

[0014]所以，需要在各种冷冻过程，包括冷冻干燥或冻干过程的冷冻阶段，中对随机形核过程进行控制，以减少完成冷冻干燥所需的加工时间和改善最终制品中瓶与瓶之间的制品均匀性。所以，提供具有一些或优选所有上述特征的方法会是合意的。

发明内容

[0015]本发明可以表征为冷冻干燥材料的方法，包括如下步骤:(i)以规定的冷却速率冷却室中的材料；(ii)降低室干燥器中的压力，以在材料中诱导冷冻形核；(iii)进一步冷却所述形核的材料到最终温度或以下以冷冻材料；和(iv)干燥材料以制备具有减少的水分或溶剂的干燥制品。

[0016]本发明也可以表征为包含如下的冷冻干燥系统:具有受控气氛和一个或更多个用于夹持一个或多个材料容器或小瓶的架子的室；对室内的架子温度进行控制以控制材料温度的机构；连接到所述室并用于从室中去除任何溶剂或水分的冷凝器；和用于控制所述室的压力的机构，以在冷冻过程中使所述室快速减压以在材料中诱导相变和在干燥过程中保持低压。

附图说明

[0017]根据结合附图给出的下列更详细描述，本发明的上述和其它方面、特征和优点将更加显而易见，其中:

[0018]图1示出了发生随机冷冻过程的溶液的温度和时间的关系图，并进一步示出了溶液的形核温度范围；

[0019]图2示出了根据本发明的方法承受伴随着减压形核的平衡冷冻过程的溶液的温度时间关系图；

[0020]图3示出了根据本发明的方法承受伴随着减压形核的动态冷冻过程的溶液的温度时间关系图；和

[0021]图4示意性示出了根据本发明的冷冻干燥系统。

发明详述

[0022]形核是在材料小区域中相变的开始。例如，相变可以是由液体形成晶体。通常和溶液冷冻相关的结晶过程(即，由溶液形成固体晶体)开始于形核事件，然后是晶体生长。

[0023]在结晶过程中，形核是如下步骤:其中分散在溶液或其它材料中的所选分子开始聚集起来形成纳米尺度的簇，从而在目前的操作环境下变得稳定。这些稳定的簇构成核。簇需要达到临界尺寸以便变成稳定的核。所述临界尺寸通常由操作条件比如温度、污染、超饱和度等来确定，能够在溶液的样品之间变化。正是在形核事件过程中溶液中的原子以预定周期方式排列限定了该晶体结构。

[0024]晶体生长是成功获得临界簇尺寸的核的后续长大。取决于具体条件，形核或晶体生长可以互相占主导地位，结果，获得了具有不同尺寸和形状的晶体。对晶体尺寸和形状的控制构成了工业生产比如制药工业中的一个主要挑战。

[0025]本发明方法涉及对在材料中发生形核相变的时间和/或温度进行控制的过程。在冷冻应用中，材料自发形核并开始变相的概率和材料的过冷度以及是否存在提供形核位点或表面的污染物、添加剂、结构或扰动有关。

[0026]在现有技术导致多个小瓶或容器之间存在形核温度差的情况下，在冷冻干燥过程中冷冻或固化步骤特别重要。形核温度差往往导致产物不均匀以及干燥时间过长。另一方面，本发明方法提供对间歇凝固过程(例如，冷冻干燥)的更高程度的过程控制，并形成具有更均匀结构和性能的产物。和一些诱导形核的现有技术不同，本发明方法在实施时要求最少的设备和操作上的变化。

[0027]理论上，本发明方法能用于涉及形核相变的任何材料加工步骤。所述过程的示例包括液体冷冻、由水溶液结晶冰、由熔体结晶聚合物和金属、由超饱和溶液结晶无机材料、蛋白质结晶、人工生产雪花、由蒸气沉积冰、食物冷冻、冷冻浓缩、分级结晶、低温贮藏、或者蒸气冷凝成液体。从概念上看，本发明方法也可以应用到相变比如熔融和沸腾上。

[0028]本发明公开的方法代表对现有药物冷冻干燥过程的改进。例如，在大型工业冷冻干燥器内，能够有超过100000个包含需要冷冻干燥的药物制品的小瓶。该行业中的当前实践是使溶液冷却到极高程度，以使该冷冻干燥器中的所有小瓶或容器确保冷冻。但是，每个小瓶或容器的内含物在低于凝固点的温度范围内随机冷冻，这是因为形核过程没有控制。

[0029]现在转向附图，尤其是图1，示出了经受常规随机形核过程的6小瓶水溶液的温度时间关系图，示出了小瓶(11、12、13、14、15和16)内的溶液的形核温度的典型范围。如图所见，小瓶内含物的热力学冷冻温度是大约0摄氏度，而每个小瓶内的溶液在大约-7℃--20℃或更多的宽温度范围内自然形核，如图区域18所突出显示的那样。曲线19表示冷冻干燥室内的架子温度。

[0030]相反，图2和3示出了根据本发明方法经受伴随着减压形核的冷冻过程的溶液的温度时间关系图。具体而言，图2示出了六小瓶经历平衡冷却过程(参见实施例2)的水溶液的温度时间关系图(21、22、23、24、25和26)，其中所述平衡冷却过程伴随着经由室的减压而诱导的形核。小瓶内含物的热力学冷冻温度为大约0摄氏度，而每个小瓶内的溶液在减压时在非常窄的温度范围(即，-4℃--5℃)内同时形核，如同区域28中所示。曲线29代表冷冻干燥室内的架子温度，表示平衡冷冻过程，即其中架子的温度在减压之前保持或多或少稳态的过程。

[0031]相似地，图3示出了经历动态冷却过程(参见实施例7)的三小瓶水溶液的温度时间关系图(31、32和33)，所述动态冷却过程伴随着经由室减压诱导的形核。再次，小瓶内含物的热力学冷冻温度为大约0摄氏度，而每个小瓶内的溶液在减压时在大约-7℃--10℃温度范围内同时形核，如同区域38中所示。曲线39代表冷冻干燥室内的架子温度，一般表示动态冷冻过程，即其中架子的温度在减压之前或之中主动降低的过程。

[0032]如图所示，本发明的方法通过能够使冷冻干燥器中的药物溶液在更窄温度范围(例如，大约0℃--10℃)和/或同时冷冻，改善对形核过程的控制，由此得到瓶-瓶之间更均匀的冷冻干燥制品。尽管没有证实，能够预见诱导形核温度范围甚至可以扩展到略微在相变温度以上，并还可以扩展到大约40℃的过冷。

[0033]和本发明方法相关的另一个益处是通过控制最小形核温度和/或精确形核时间，能够影响在冷冻小瓶或容器中形成的冰晶结构。冰晶结构是影响冰升华所需时间的变量。因此，通过控制冰晶结构，能够显著加速整个冷冻干燥过程。

[0034]现在参见图4，示出的冷冻干燥装置(200)具有各种主部件加上另外的辅助系统来执行冷冻干燥循环。具体而言，冷冻干燥装置(200)包括冷冻干燥室(202)，所述室包含用于夹持待冷冻干燥的溶液的小瓶或容器(未示出)的架子(204)。待冷冻干燥的溶液经过特别配置，典型地含有活性成分、溶剂系统和数种稳定剂或者其它药物可接受载体或添加剂。这种配方的冷冻干燥从位于中空架子上的专门容器发生。这些容器可以包括具有塞子、安瓿、注射器或者，在大量冷冻干燥的情况下，盘子的小瓶。

[0035]示出的冷冻干燥装置(200)也包括冷凝器(206)，其用于通过将升华的和解吸的溶剂以冰的形式冷凝或冷冻出来而从蒸气相中去除所述溶剂，从而在冷冻干燥器内保持合适的真空。冷冻器(206)可以位于冷冻干燥室(202)的内部，或者作为分离的外部装置通过所谓的隔离阀和冷冻干燥室(202)连通。所述冷冻干燥装置(200)也优选包括真空泵(208)，所述真空泵可操作地连接到冷凝器(206)并用于对冷冻干燥室(202)和冷凝器(206)抽真空。

[0036]低温致冷系统(210)提供用于冷冻干燥装置(200)的通过冷却规定的传热流体实现的温控机构，其中所述传热流体循环到冷冻干燥室(202)内的架子(204)和冷凝器(206)。如图所示，低温致冷系统(210)包含低温源(218)，比如液体氮、低温换热器(220)和传热流体回路(222)、通风孔(224)、加热器(226)和泵(227、228)。

[0037]低温换热器(220)优选是得自Praxair，Inc.的NCOOL^TMNon-Freezing Cryogenic Heat Exchange System。低温换热器(220)的重要方面是在换热器内部的或内在的液氮蒸发，但是其蒸发方式避免所述液氮直接接触暴露到传热流体的冷却表面。所述换热器的结构和操作的细节能够见于美国专利No.5937656(Cheng等)，其内容在此通过引用结合进来。

[0038]规定的传热流体回路(222)用于循环传热流体，并可操作地连接到冷冻干燥室(202)和冷凝器(206)上。更具体地，传热流体在冷冻干燥室(202)内的中空架子(204)内循环，以精确地如需将所述冷却或加热通过架子(204)传到所述溶液。另外，规定的传热流体也流过冷凝器(206)以提供使冰升华并进一步使溶剂解吸所需要的冷却机构。

[0039]泵(227)和加热器(226)沿着位于冷冻干燥室(202)上游和低温换热器(220)下游的传热流体回路(222)设置。泵(227)的尺寸经设计以将传热流体以所需的流动速率移动通过传热回路(222)。加热器(226)优选是用于为传热流体和冷冻干燥室(202)提供补充热量的电加热器，而这可能是在干燥过程中需要的。

[0040]如图4中的实施方案所示，冷凝器(206)也通过循环低温传热流体冷却。流过冷凝器(206)的传热流体的致冷也通过低温换热器(220)来提供。低温换热器(220)能够连续冷却传热流体而不冷冻。在干燥过程中，低温换热器(220)经设置或用于获得冷凝器(206)所需的最低温度。如上所述，低温换热器(220)使液氮预先蒸发成低温冷气体，以传热到传热流体。通过液氮的预蒸发，确保了液氮避免直接在其中另一侧上设置有传热流体的换热表面上沸腾。由于液氮在大气压在大约-195摄氏度沸腾，所以这种设置避免了低温换热器(220)的冷冻。

[0041]图4所示的实施方案也包括用于控制冷冻干燥室(250)的气体气氛，尤其是室(202)内的气体组成和压力，的机构。控制室(202)的压力允许所示室的加压和快速减压，以诱导溶液形核。该公开的实施方案优选使用一个或多个流动控制阀(252)，其可控地用于促进将加压气氛从气体源(未示出)引入到室(202)和通过以受控的，优选快速的方式使所述加压气氛排出室(202)而使所述室减压，由此诱导在各个容器或小瓶中溶液的形核。

[0042]虽然没有示出，但是冷冻干燥装置(200)也包括各种控制硬件和软件系统，用于命令和协调冷冻干燥设备的各个部件和执行预先编程的冷冻干燥循环。各种控制硬件和软件系统也可以提供文件管理、数据记录、报警和系统安全能力。另外，冷冻干燥装置(200)的辅助系统可以包括各种子系统来清洁和消毒冷冻干燥室(202)、在冷冻干燥室(202)中自动加载和卸载所述制品；和相关的低温系统附件，比如致冷制动器(refrigeration skid)、液氮罐、管道、阀门、传感器等。

[0043]从广义来看，本发明公开的用于在材料内诱导相变形核的方法包括如下步骤:(i)将材料冷却到其相变温度附近或以下；和(ii)快速减压以在材料中诱导相变形核。这些重要步骤的每一个将在下面更详细讨论。

步骤1-材料冷却

[0044]可用于本发明方法的示例性材料包括纯物质、气体、悬浮液、凝胶、液体、溶液、混合物、或者溶液或混合物内的组分。用于本发明方法的合适材料可以包括例如药物材料、生物药物材料、食品、化学材料，并可以包括制品比如伤口护理制品、美容品、兽医制品、体内/体外诊断相关制品等。当材料是液体时，可能合意的是将气体溶解在该液体中。在受控气体环境中的液体一般其中溶解有气体。

[0045]可用于本发明方法的其它示例性材料包括生物材料或者生物药物材料，比如组织、器官和多细胞结构。对于某些生物和药物应用而言，材料可以是包括下列组分的溶液或混合物:活的或减毒的病毒；核酸；单克隆抗体；多克隆抗体；生物分子；非肽类似物；肽，包括多肽、肽模拟和改性肽；蛋白质，包括融合蛋白和改性蛋白；RNA、DNA和其子类；寡核苷酸；病毒粒子；和类似的这种材料或其组分。

[0046]容纳在小瓶或容器中供冷冻干燥的药物或生物药物溶液会是会从本发明方法受益的材料的好例子。该溶液大部分是水，并且基本不可压缩。这种药物溶液或生物药物溶液也是非常纯的，通常不含可能形成形核位点的颗粒。均匀的形核温度对于在瓶瓶之间或者容器容器之间创建一致性的、均匀的冰晶结构是重要的。形成的冰晶结构也显著影响干燥所需的时间。

[0047]当应用到冷冻干燥过程时，材料优选置于室比如冷冻干燥室中。优选地，所述室经过构造以允许控制室内的温度、压力和气氛。气氛可以包括但不限于氩气、氮气、氦气、空气、水蒸气、氧气、二氧化碳、一氧化碳、一氧化二氮、氧化一氮、氖气、氙气、氪气、甲烷、氢气、丙烷、和丁烷等，包括其许可的混合物。优选的气氛包括压力为大约7-大约50psig或以上的惰性气体，比如氩气。在冷冻干燥室内的温度通常由冷冻干燥过程来规定，很容易通过使用传热流体来控制，所述传热流体将室内的架子冷却或加热以驱动所述小瓶或容器的温度和每个小瓶或容器内的材料。

[0048]根据本发明方法，材料冷却到其相变温度附近或更低的温度。在经历冷冻干燥过程的水基溶液的情况下，相变温度是溶液的热力学凝固点。在溶液达到低于该溶液的热力学凝固点的温度的情况下，称为过冷的。当应用于水基溶液的冷冻过程时，当过冷度范围是从相变温度附近或以下到大约40℃过冷时，更优选是从大约3℃过冷到10℃过冷时，本发明的方法是有效的。在下述的一些实施例中，即使在溶液仅仅是其热力学凝固点以下大约1℃过冷时，本发明的诱导形核方法也理想地工作。

[0049]在材料处于低于其相变温度的温度时，通常称为处于亚稳态。亚稳态是化学系统或生物系统的不稳定的、暂时性的(但是相对长时间存在的)状态。亚稳材料临时存在于不处于其平衡相或状态的相或者状态。在材料或其环境没有任何变化的情况下，亚稳材料最终从其非平衡状态转变成其平衡态。示例性的亚稳材料包括超饱和溶液和过冷液体。

[0050]亚稳材料的典型例子会是处于大气压和-10℃的液态水。由于具有为0℃的正常凝固点，液态水在热力学上不应在该温度和压力存在，但是它能够在没有形核事件或结构的情况下存在以开始冰结晶过程。极纯的水可以在大气压下冷却到极低温度(-30℃--40℃)并仍旧保持液态。这种过冷水处于非平衡的热力学亚稳态。它仅仅缺乏形核事件来使其开始相变，由所述相变它返回平衡态。

[0051]如上所讨论的，本发明的在材料内诱导相变形核或冷冻材料的方法可以用于各种冷却环境中，包括例如平衡冷却环境或者动态冷却环境(参见图2和3)。

步骤2-快速降压

[0052]当材料达到相变温度附近或以下的所需温度时，所述室快速或者很快减压。该减压触发在小瓶或容器内的溶液的形核和相变。在优选实施方案中，通过打开或部分打开将高压室和周围环境或者低压室或环境分开的大控制阀实现室减压。该升高的压力通过气体大量流出所述室来快速下降。减压需要相当快以诱发形核。所述减压应该在数秒或更少的事件内完成，优选40秒或更少，更优选20秒或更少，最优选10秒或更少。

[0053]在典型的冷冻干燥应用中，初始室压和最终室压之间的压差在减压后应该大于大约7psi，但是更小的压降可能在一些情况下诱导形核。大多数市售冷冻干燥器能够很容易容纳控制形核所需的压降范围。许多冷冻干燥器设计成具有超过25psig的压力等级，以承受采用121℃饱和蒸汽的常规消毒程序。所述设备等级提供了遵循从高于环境压力或者紧邻周围环境中的压力的初始压力减压的协议来诱导形核的宽广窗口。该升高的压力和随后的减压可以通过任何已知的手段(例如，气动、液动或者机械方式)实现。在优选实施方案中，本发明方法的操作压力应该保持低于任何施用气体的超临界压力，将所述材料承受极低压力(即，大约10mTorr或以下)应该在材料形核过程中得以避免。

[0054]尽管不想受到任何特定机制的束缚，用于解释在在本发明方法实践中观察到的受控形核的一种可能的机制是溶在材料中的气体在减压时从溶液出跑出来，形成使材料形核的气泡。初始升高的压力增加了溶解气体在溶液中的浓度。在冷却后压力的快速下降减少了气体溶解度，气体随后从过冷溶液中的释放触发了相变形核。

[0055]另一种可能的机制是在减压过程中邻近所述材料的气体的温度下降导致在材料表面上形成冷点，其诱导形核。另一种可能的机制是减压导致材料中的一些液体蒸发，源自该吸热性蒸发过程的最终冷却可以引发形核。另一种可能的机制是邻近所述材料的减压的冷气体使得或者在减压前和所述材料处于平衡的一些蒸气凝固，或者在减压过程中通过蒸发从所述材料释放的一些蒸气凝固；所得到的固体颗粒重新进入所述材料并充当种子或表面以引发形核。这些机制中的一种或更多种可以有助于引发凝固或固化形核到不同的程度，具体取决于材料的本质、其环境和正形核的相变。

[0056]该过程可以完全在大于环境压力的压力或者在横跨环境压力的压力范围内进行。例如，初始室压能够高于环境压力，在减压后的最终室压能够高于环境压力但是小于初始室压；初始室压能够高于环境压力，最终室压在减压后能够大约是室压或者略微低于室压。

[0057]也相信压降的速率和大小是本发明方法的重要方面。实验显示在所述压降(ΔP)大于大约7psi的情况下诱导形核。可替换地，压降的大小可以表示为绝对压力比，R＝P_i/P_f，其中P_i是初始绝对压力，P_f是最终绝对压力。相信在本发明方法的许多实际应用中在绝对压力比R大于大约1.2的情况下，一旦减压就可以诱导形核。压降速率也在本发明方法中起到重要作用。表征压降速率的一种方法是通过使用参数A，其中A＝ΔP/Δt。其次，猜测对于大于预定值比如大约0.2psi/sec的A值而言，诱导形核。通过试验获得的经验数据应该帮助确定优选的压降和压降速率。

[0058]下列实施例突出显示了本发明公开的在材料中诱导形核的方法的各种方面和特征，并不是限制意义。相反，这些实施例仅仅是示例性的，本发明的范围仅仅应该根据所附权利要求限定。

[实施例]

[0059]本发明描述的所有实施例在中试规模的VirTis 51-SRC冷冻干燥机中进行，所述冷冻干燥机具有总架子空间为大约1.0m²的四个架子和内部冷凝器。该装置经过更新以保持至多大约15psig的正压。也将1.5”直径的环形开口添加到冷冻干燥室的后壁上，1.5”直径的不锈钢管道从该孔延伸通过所述后壁绝缘层以从所述冷冻干燥器的背部伸出来。两个1.5”全端口(full-port)空气驱动的球阀经由卫生配件连接到该管道上。一个球阀允许气体流入到冷冻干燥室中，由此提供至多15psig的正压。第二球阀允许气体流出冷冻干燥室，并由此降低室压到大气条件(Opsig)。冷冻干燥器架子和冷凝器的所有致冷经由采用PraxairNCool^TM-HX系统通过液氮冷却的Dynalene MV传热流体的循环来完成。

[0060]所有溶液在等级100的清洁室中制备。冷冻干燥器经设置使得门、架子和控件都可以从清洁室访问，而其它部件(泵、加热器等)位于非清洁室环境中。所有溶液都用HPLC等级水(Fisher Scientific，通过0.10微米膜过滤)制备。最终溶液通过0.22微米膜过滤，然后填充小瓶或冷冻干燥容器。所有气体经由气缸供应，并通过0.22微米过滤器过滤以去除颗粒。玻璃容器(5mL小瓶和60mL瓶子)得自WheatonScience Products并针对颗粒进行过预清洁。在合适时使用药物上可接受的载体。采取上述步骤来确保材料和方法满足针对颗粒的常规药物生产标准，所述颗粒充当形核剂。

[0061]在本文中所有的“药物上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、抗氧化剂、盐、涂料、表面活性剂、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸、抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、溶液阻滞剂(例如，石蜡)、吸收剂(例如，高岭土、膨润土)、药物稳定剂(例如，月桂基硫酸钠)、凝胶、粘合剂(例如，糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基-纤维素、海藻酸盐)、赋型剂(例如，乳糖、奶糖、聚乙二醇)、崩解剂(例如，琼脂-琼脂、淀粉、乳糖、磷酸钙、碳酸钙、海藻酸、山梨糖醇、甘氨酸)、润湿剂(例如，十六烷基醇、单硬脂酸甘油酯)、润滑剂、吸收加速剂(例如，季铵盐)、可食用油(例如，杏仁油、可可油、油酯或丙二醇)、甜味剂、香味剂、着色剂、填料(例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇)、压片润滑剂(例如，硬脂酸镁、淀粉、葡萄糖、乳糖、rice flower、白垩)、吸入用载体(例如，烃推进剂)、缓冲剂或者此类材料和组合，这是本领域普通技术人员会知道的。

[0062]对于在本文中描述的试验条件和研究的所有冷冻干燥配方而言，通常在大约-8℃--20℃，偶尔热至-5℃，的容器温度观察到随机形核。容器一般能够长时间保持在高于-8℃的温度而不形核。形核以及后续晶体生长(即，冷冻)的开始通过温度测量确定为容器温度响应熔融放热潜热快速增加的点。冷冻的引发也能够通过冷冻干燥室门上的观察孔来直观确定。

[实施例1]-控制形核温度

[0063]四个独立的小瓶填充有2.5mL的5wt％的甘露醇溶液。所述5wt％甘露醇溶液的预测热力学凝固点是大约-0.5℃。将这四个小瓶彼此相邻放置在冷冻干燥器架子上。这四个小瓶的温度采用表面安装的热电偶监测。冷冻干燥器用氩气加压到14psig。

[0064]冷冻干燥器架子经冷却以得到大约-1.3℃-大约-2.3℃之间的小瓶温度(热电偶测量精度为+/-1℃)。冷冻干燥器然后在小于5秒内从大约14psig减压到大约大气压以诱导小瓶内的溶液形核。所有四个小瓶在加压后立刻形核并开始冷冻。结果总结在下表1中。

[0065]如表1所示，在该实施例中的受控形核温度(即，初始小瓶温度)相当接近溶液的预测热力学凝固点。因此，本发明方法使得可以控制在具有极低过冷度或者处于接近或者仅仅稍微低于其凝固点的形核温度的溶液中发生形核。

初始小瓶温度

小瓶# 溶液气氛压降[psi] 减压结果

[℃]

1 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -2.3 14 形核

2 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -1.3 14 形核

3 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -2.1 14 形核

4 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -1.7 14 形核

表1、控制形核温度

实施例2-控制形核温度

[0066]在该实施例中，95个小瓶填充有2.5mL的5wt％甘露醇溶液。所述5wt％甘露醇溶液的热力学凝固点是大约-0.5℃。所述95个小瓶彼此相邻置于冷冻干燥器架子上。置于所述冷冻干燥器架子中不同位置处的6个小瓶的温度采用表面安装的热电偶连续监测。冷冻干燥器在氩气氛中加压至大约14psig。冷冻干燥器自身随后冷却以获得接近-5℃的小瓶温度。冷冻干燥器随后在小于5秒钟内从大约14psig减压到大约大气压，以诱导小瓶内的溶液形核。所有95个小瓶直观观察到在减压后立刻形核和开始冷冻。这6个监测小瓶的热电偶数据确认了该直观观察结果。结果总结在表2中。

[0067]如本文所示，在该实施例中的受控形核温度(即，初始小瓶温度)稍微低于溶液的预测热力学凝固点。因此，本发明方法使得可以控制在具有中等过冷度的溶液中发生的形核。该实施例也证实了本发明方法可扩展到多个小瓶应用的能力。

小瓶初始小瓶温

溶液气氛压降[psi] 减压结果

# 度[℃]

1 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.2 14 形核

2 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.4 14 形核

3 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.6 14 形核

4 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.4 14 形核

5 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.6 14 形核

6 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.1 14 形核

表2、控制形核温度

实施例3-控制减压大小

[0068]在该实施例中，多个小瓶填充有2.5mL的5wt％甘露醇溶液。再次，所述5wt％甘露醇溶液的预测热力学凝固点是大约-0.5℃。对于每次测试运转而言，小瓶彼此相邻设置在冷冻干燥器架子上。和前述实施例一样，小瓶温度采用表面安装的热电偶监测。冷冻干燥器中的氩气氛加压到不同压力，冷冻干燥器架子冷却以得到大约-5℃的小瓶温度。在每次测试运转中，冷冻干燥器随后快速(即，在小于5秒钟)从所选压力减压到大气压以试图诱导小瓶内的溶液形核。结果总结在表3中。

[0069]如表3所示，在压降为大约7psi或更大以及所述形核温度(即，初始小瓶温度)在大约-4.7℃--5.8℃之间的情况下发生受控形核。

小瓶# 溶液气氛初始小瓶温度[℃] 压降[psi] 减压结果

1 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.7 7 形核

2 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.1 7 形核

3 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.3 7 形核

4 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.6 7 不形核

5 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.6 7 形核

6 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.8 7 形核

7 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.4 6 不形核

8 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.7 6 不形核

9 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.8 6 不形核

10 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.1 5 不形核

11 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.4 5 不形核

12 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.5 5 不形核

13 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.7 4 不形核

14 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.1 4 不形核

15 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.3 4 不形核

表3、减压大小的影响

实施例4-控制减压速率

[0070]对于该实施例，多个小瓶填充有大约2.5mL的预测热力学凝固点为大约-0.5℃的5wt％甘露醇溶液。对于变化减压时间的每次试验运转，小瓶彼此相邻放置在冷冻干燥器架子上。和前述实施例一样，小瓶温度采用表面安装的热电偶来监测。和上述实施例一样，冷冻干燥器中的氩气氛加压到大约14psig，架子冷却以得到大约-5℃的小瓶温度。在每个试验运转中，冷冻干燥器随后以不同减压速率从14psig减压到大气压以试图诱导小瓶内的溶液形核。

[0071]为了研究减压速率或减压时间的影响，在冷冻干燥器后部的减压控制阀出口上放置节流球阀(restricting ball valve)。当该节流球阀完全打开时，在大约2.5秒钟内实现从大约14psig到大约0pisg的减压。通过仅仅部分关闭该节流球阀，变化地增加室减压时间是可能的。采用节流球阀，执行了数种测试运转，其中冷冻干燥室以不同速率减压以确定或判定减压速率对形核的影响。结果总结在表4中。

初始小瓶压降时间

小瓶# 溶液气氛减压结果

温度[℃] [psi] [sec]

1 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.6 14 300 不形核

2 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.4 14 300 不形核

3 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.8 14 300 不形核

4 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.6 14 200 不形核

5 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.4 14 200 不形核

6 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.4 14 200 不形核

7 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.6 14 100 不形核

8 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.2 14 100 不形核

9 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.2 14 100 不形核

10 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.7 14 60 不形核

11 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.1 14 60 不形核

12 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.1 14 60 不形核

13 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.1 14 50 不形核

14 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.3 14 50 不形核

15 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.9 14 50 不形核

16 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.4 14 42 不形核

17 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.5 14 42 不形核

18 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.0 14 42 不形核

19 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.1 14 32 形核

20 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.7 14 32 形核

21 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.6 14 32 形核

22 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.7 14 13 形核

23 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.3 14 13 形核

24 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.5 14 13 形核

表4、减压时间的影响

[0072]如表4中所示，仅仅在减压时间小于42秒、压降为大约14psi或更大以及形核温度(即，初始小瓶温度)在大约-4.6℃-大约-5.8℃的情况下发生形核。这些结果说明为了使该方法有效，减压需要相对快速地完成。

实施例5-控制气氛

[0073]再次，多个小瓶每个填充有大约2.5mL的5wt％甘露醇溶液，彼此相邻放置在冷冻干燥器架子上。和前述实施例一样，试验小瓶温度采用表面安装的热电偶来监测。对于不同的试验运转，冷冻干燥器中的气氛变化，通常保持大约14psig的正压。在该实施例中，冷冻干燥器架子冷却以得到大约-5℃--7℃的小瓶温度。在每次试验运转中，冷冻干燥器随后快速从大约14psig减压到大气压以试图诱导小瓶内的溶液形核。结果总结在表5中。

[0074]从表中可以发现，在压降是大约14psi并且形核温度(即，初始小瓶温度)是大约-4.7℃-大约-7.4℃的情况下，在除了氦气的所有气氛中发生受控形核。虽然在实施例中没有示出，但是相信替换性的条件可能能够在氦气氛中实现受控形核。

小瓶初始小瓶温

溶液气氛压降[psi] 减压结果

# 度[℃]

1 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -4.9 14 形核

2 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -5.2 14 形核

3 2.5mL的5wt％甘露醇氮气 -4.7 14 形核

4 2.5mL的5wt％甘露醇氮气 -5.1 14 形核

5 2.5mL的5wt％甘露醇氙气 -4.8 14 形核

6 2.5mL的5wt％甘露醇氙气 -5.0 14 形核

7 2.5mL的5wt％甘露醇空气 -7.4 14 形核

8 2.5mL的5wt％甘露醇空气 -7.2 14 形核

9 2.5mL的5wt％甘露醇氦气 -5.8 14 不形核

10 2.5mL的5wt％甘露醇氦气 -5.5 14 不形核

表5、气氛组成的影响

实施例6-大体积溶液

[0075]在该实施例中，6个冷冻干燥瓶子(60mL容量)填充有大约30mL的预测热力学凝固点为大约-0.5℃的5wt％甘露醇溶液。这6个冷冻干燥瓶子彼此相邻放置在冷冻干燥器架子上。采用表面安装的热电偶来监测放置在冷冻干燥器架子中不同位置处的这6个瓶子的温度。冷冻干燥器在氩气中加压到大约14psig。冷冻干燥器架子随后冷却以得到接近-5℃的瓶子温度。冷冻干燥器随后在小于5秒内从大约14psig减压到大约大气压以诱导小瓶内的溶液形核。结果总结在表6中。

[0076]在独立的试验中，塑料大体积冷冻干燥盘(GoreLYOGUARD，1800mL容量)填充有大约1000mL的5wt％的甘露醇溶液。所述盘子经过了预清洁以满足USP低颗粒要求。盘子放置在冷冻干燥器架子上，盘子温度由安装在盘子外表面上靠近一侧中心位置的热电偶监测。冷冻干燥器架子随后冷却以得到接近-7℃的盘子温度。冷冻干燥器随后在小于5秒内从14psig减压到大约大气压，以诱导盘子内的溶液形核。结果也总结在表6中。

[0077]和上述实施例一样，所有容器都在减压后立刻形核并开始冷冻。同样和上述实施例一样，在该实施例中的形核温度(即，容器温度)极其可控以略微接近溶液的热力学冷冻温度。更重要的是，该实施例示出了本发明方法使得可以在大体积溶液和各种容器形式中发生受控形核。应该提到的是，会预期随着制剂体积的增加减压方法的效率提高，这是因为当存在更多分子以聚集和形成临界核时形核事件更可能发生。

容器溶液气氛容器温度[℃] 压降[psi] 减压结果

瓶子 #1 30mL的5wt％甘露醇氩气 -5.3 14 形核

瓶子 #2 30mL的5wt％甘露醇氩气 -5.1 14 形核

瓶子 #3 30mL的5wt％甘露醇氩气 -5.9 14 形核

瓶子 #4 30mL的5wt％甘露醇氩气 -5.2 14 形核

瓶子 #5 30mL的5wt％甘露醇氩气 -5.9 14 形核

瓶子 #6 30mL的5wt％甘露醇氩气 -6.1 14 形核

盘子 1000mL的5wt％甘露醇氩气 -6.9 14 形核

实施例7-动态冷却与平衡冷却比较

[0078]本发明的控制形核的方法可以以各种方式使用。上述实施例1-6每个验证了对基本平衡在低于其热力学凝固点的温度(即，非常慢地改变温度)的冷冻干燥溶液的形核温度进行控制的方面。该实施例证实形核也能够在动态冷却环境中(即，溶液经历温度的快速变化)在低于其热力学凝固点的温度发生。

[0079]在该实施例中，小瓶1-6代表上面涉及实施例2所述的样品。另外，三个独立的小瓶(小瓶7-9)也填充有2.5mL的5wt％甘露醇溶液。在独立的测试运转中，所述三个另外的小瓶彼此相邻放置在冷冻干燥器架子上。冷冻干燥器自身朝着-45℃的最终架子温度快速冷却。当一个所述小瓶达到大约-5℃时(通过表面安装的热电偶测量)，冷冻干燥器快速从大约14psig减压到0psig以试图诱发形核。所有三个小瓶在减压后立刻形核并开始冷冻。由于动态冷却环境的结果，在形核之前小瓶温度显著下降到-6.8℃和-9.9℃。下表7中总结了比较结果。

小瓶# 溶液模式形核温度[℃] 压降[psi] 减压结果

1 2.5mL的5wt％甘露醇平衡的 -4.2 14 形核

2 2.5mL的5wt％甘露醇平衡的 -4.4 14 形核

3 2.5mL的5wt％甘露醇平衡的 -4.6 14 形核

4 2.5mL的5wt％甘露醇平衡的 -4.4 14 形核

5 2.5mL的5wt％甘露醇平衡的 -4.6 14 形核

6 2.5mL的5wt％甘露醇平衡的 -5.1 14 形核

7 2.5mL的5wt％甘露醇动态的 -6.8 14 形核

8 2.5mL的5wt％甘露醇动态的 -7.2 14 形核

9 2.5mL的5wt％甘露醇动态的 -9.9 14 形核

表7、测试结果-动态冷却对形核的影响

[0080]用于控制在给定温度范围平衡的冷冻干燥溶液或者动态冷却的冷冻干燥溶液的形核的本发明方法的效力为最终用户提供了两种潜在的具有不同优点和折衷之处的应用模式。通过允许冷冻干燥溶液平衡，形核温度范围窄或者最小化到冷冻干燥器自身的性能极限。相对于其中室和小瓶温度在一个步骤中下降到低于大约-40℃的常规或者动态冷冻方案而言，平衡步骤可以要求额外的时间来实现。但是，采用所述平衡步骤应该在所有小瓶或容器中获得改善很多的形核均匀性，并且实现与精确控制材料形核温度相关的其它优点。

[0081]可替换地，如果平衡材料或冷冻干燥溶液的温度是不合意的，那么可以简单地在正常的冷冻或动态冷却方案过程中在合适时间实现所述减压步骤。在动态冷却过程中进行减压将为冷冻干燥容器内的材料产生更宽分布的形核温度，但是将为所述冷冻方案增加最少的时间并仍然允许缓解极度过冷的问题。

实施例8-不同赋型剂的影响

[0082]本发明的控制或诱导材料形核的方法可用于控制含有不同冷冻干燥赋型剂的过冷溶液的形核温度。这个实施例证实本发明方法和下列赋型剂的使用:甘露醇、羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、甘氨酸、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。对于每种赋型剂而言，两个小瓶填充2.5mL的含有5wt％赋型剂的溶液。小瓶彼此相邻放置在冷冻干燥器架子上。冷冻干燥器在氩气氛中加压到大约14psig。冷冻干燥器架子冷却以获得接近-3℃的小瓶温度然后快速减压以诱导形核。结果总结在表8中。

小瓶初始小瓶温度压降[psi]

溶液/赋型剂气氛减压结果

# [℃]

1 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -3.3 14 形核

2 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -3.0 14 形核

3 2.5mL的5wt％HES 氩气 -3.1 14 形核

4 2.5mL的5wt％HES 氩气 -3.7 14 形核

5 2.5mL的5wt％PEG 氩气 -3.8 14 形核

6 2.5mL的5wt％PEG 氩气 -3.4 14 形核

7 2.5mL的5wt％PVP 氩气 -3.5 14 形核

8 2.5mL的5wt％PVP 氩气 -3.3 14 形核

9 2.5mL的5wt％葡聚糖氩气 -4.0 14 形核

10 2.5mL的5wt％葡聚糖氩气 -3.1 14 形核

11 2.5mL的5wt％甘氨酸氩气 -3.8 14 形核

12 2.5mL的5wt％甘氨酸氩气 -3.9 14 形核

13 2.5mL的5wt％山梨糖醇氩气 -3.6 14 形核

14 2.5mL的5wt％山梨糖醇氩气 -3.4 14 形核

15 2.5mL的5wt％蔗糖氩气 -3.3 14 形核

16 2.5mL的5wt％蔗糖氩气 -3.4 14 形核

17 2.5mL的5wt％海藻糖氩气 -3.7 14 形核

18 2.5mL的5wt％海藻糖氩气 -3.1 14 形核

表8、不同冷冻干燥赋型剂的影响

实施例9-控制蛋白质溶液的形核

[0083]本发明公开的本发明方法和系统可用于控制过冷蛋白质溶液的形核温度，而对蛋白质溶解度或酶活性没有负面或消极影响。两种蛋白质，牛血清白蛋白(BSA)和乳酸脱氢酶(LDH)，在本实施例中使用。

[0084]BSA以10mg/mL的浓度溶解在5wt％甘露醇中。三个冷冻干燥小瓶填充2.5mL的所述BSA-甘露醇溶液，并彼此相邻置于冷冻干燥器架子上。冷冻干燥器在氩气氛中加压到大约14psig。冷冻干燥器冷却以获得接近-5℃的小瓶温度。冷冻干燥器快速减压以诱发形核。所有小瓶的BSA溶液在减压后立刻形核和开始冷冻。在解冻时没有观察到蛋白质的沉淀。

[0085]LDH蛋白质得自两个不同的供应商，为了清楚记为LDH-1或LDH-2以区分这两种不同的批料。LDH-1以1mg/mL浓度溶解在5wt％甘露醇中。六个冷冻干燥小瓶填充2.5mL的所述LDH-1/甘露醇溶液，并彼此相邻置于冷冻干燥器架子上。冷冻干燥器在氩气氛中加压到大约14psig。冷冻干燥器架子从室温开始冷却以获得接近-4℃的小瓶温度。然后冷冻干燥器快速减压以诱发形核。所有小瓶在减压后立刻形核和开始冷冻。小瓶保持在此状态大约15分钟。冷冻干燥器架子随后以大约1℃/min的速度冷却以获得接近-45℃的小瓶温度并保持另外的15分钟以确保完成所述冷冻过程。在所述冷冻步骤以后，冷冻干燥器架子随后以大约1℃/min的速度加热以使得小瓶温度升高到接近5℃。在解冻时没有观察到蛋白质的沉淀。测定小瓶内含物的酶活性，结果和没有冷冻的LDH-1/甘露醇溶液的对照样品进行比较。

[0086]作为实施例9的一部分，减压形核的LDH-1/甘露醇溶液样品和随机形核样品进行比较。在所述LDH-1的随机形核样品中，重复冷冻程序，但没有加压和减压以及没有氩气氛。具体而言，LDH-1以1mg/mL的浓度溶解在5wt％甘露醇中。六个冷冻干燥小瓶填充2.5mL的所述LDH-1/甘露醇溶液，并彼此相邻置于冷冻干燥器架子上。冷冻干燥器架子以大约1℃/min的速率从室温开始冷却以获得接近-45℃的小瓶温度，并保持15分钟以确保冷冻过程完成。在所述冷冻步骤以后，冷冻干燥器架子以大约1℃/min的速度加热以使得小瓶温度升高到接近5℃。在解冻时没有观察到蛋白质的沉淀。测定小瓶内含物的酶活性，结果和没有冷冻的LDH-1/甘露醇溶液的相同对照样品进行比较。

[0087]还是实施例9的一部分，采用LDH-2重复上述针对LDH-1的试验。唯一区别在于LDH-2的受控形核温度接近-3℃，而LDH-1的是-4℃。

小瓶初始小瓶温压降酶活性损

溶液气氛减压结果

# 度[℃] [psi] 失[％]

1 2.5mL的BSA溶液氩气 -4.9 14 - 形核

2 2.5mL的BSA溶液氩气 -4.3 14 - 形核

3 2.5mL的BSA溶液氩气 -5.3 14 - 形核

4 2.5mL的LDH-1溶液氩气 -3.8 14 9.0 形核

5 2.5mL的LDH-1溶液氩气 -4.0 14 16.2 形核

6 2.5mL的LDH-1溶液氩气 -3.7 14 18.4 形核

7 2.5mL的LDH-1溶液氩气 -4.0 14 23.4 形核

8 2.5mL的LDH-1溶液氩气 -3.9 14 18.5 形核

9 2.5mL的LDH-1溶液氩气 -4.0 14 21.2 形核

10 2.5mL的LDH-1溶液空气 -10.4 0 35.7 形核

11 2.5mL的LDH-1溶液空气 -16.5 0 35.4 形核

12 2.5mL的LDH-1溶液空气 -15.5 0 36.1 形核

13 2.5mL的LDH-1溶液空气 -10.5 0 43.9 形核

14 2.5mL的LDH-1溶液空气 -9.8 0 24.9 形核

15 2.5mL的LDH-1溶液空气 -11.0 0 39.2 形核

16 2.5mL的LDH-2溶液氩气 -3.1 14 29.9 形核

17 2.5mL的LDH-2溶液氩气 -2.9 14 18.9 形核

18 2.5mL的LDH-2溶液氩气 -3.1 14 23.3 形核

19 2.5mL的LDH-2溶液氩气 -2.7 14 19.6 形核

20 2.5mL的LDH-2溶液氩气 -3.1 14 32.1 形核

21 2.5mL的LDH-2溶液氩气 -2.6 14 35.2 形核

22 2.5mL的LDH-2溶液空气 -5.0 0 38.3 形核

23 2.5mL的LDH-2溶液空气 -5.5 0 40.0 形核

24 2.5mL的LDH-2溶液空气 -2.3 0 36.5 形核

25 2.5mL的LDH-2溶液空气 -3.8 0 42.0 形核

26 2.5mL的LDH-2溶液空气 -5.1 0 50.2 形核

27 2.5mL的LDH-2溶液空气 -5.9 0 40.6 形核

表9、控制过冷蛋白质溶液的形核温度

[0088]如表9所示，显然经由减压实现的受控形核冷冻过程相对于相当的随机形核冷冻方案没有降低酶活性。实际上，经由减压获得的受控形核过程看起来更好地保存了酶活性，LDH-1的平均活性损失仅仅是17.8％，LDH-2的为26.5％，而在随机形核之后，LDH-1的平均活性损失是35.9％，LDH-2的是41.3％。

[0089]应该注意的是，LDH-2观察到的随机形核温度明显高于LDH-1观察到的随机形核温度。这个区别可能由于在LDH-2中一些污染物充当了形核剂。和LDH-1相比，LDH-2的随机形核温度更接近于受控形核温度，然而对于LDH-1和LDH-2而言，在经由受控形核获得的酶活性保持方面的改善相似，分别是18.1％和14.8％。这个结果暗示酶活性保持方面的改善能够部分归因于受控形核过程自身的特征，而不仅仅归因于经由减压获得的规定的较高的形核温度。

实施例10-减少一次干燥时间(primary drying time)

[0090]通过混合大约10.01克甘露醇和大约190.07克水，制备5wt％的甘露醇溶液。小瓶填充有2.5mL的所述5wt％甘露醇溶液。称量小瓶的空重和有溶液后的重量，以确定加入到小瓶中的水质量。将20个小瓶彼此相邻放置在冷冻干燥器架子上的小架子上。六个小瓶的温度采用表面安装的热电偶进行监测；所有监测的小瓶被其它小瓶围绕以改善小瓶行为的均匀性。冷冻干燥器在受控氩气氛中加压到大约14psig。冷冻干燥器架子从室温冷却到大约-6℃以得到大约-1℃和-2℃之间的小瓶温度。冷冻干燥器然后在小于5秒内从大约14psig减压到大约大气压，以诱导小瓶内的溶液形核。所有直观观察或者经由热电偶监测的小瓶在减压之后立刻形核和开始冷冻。

[0091]架子温度随后快速下降到大约-45℃以完成所述冷冻过程。一旦所有小瓶温度是大约-40℃或更低，冷冻干燥室被排空，开始一次干燥过程(即，升华)。在此干燥过程中，冷冻干燥架子经由1小时加热到大约-14℃并在温度保持16小时。冷凝器在整个干燥过程中保持在大约-60℃。通过关闭真空泵并用氩气回填所述室至大气压，来终止一次干燥。小瓶立刻从冷冻干燥器中去除并称重，以确定在一次干燥过程中损失了多少水。

[0092]在作为实施例10一部分的独立试验中，其它小瓶填充2.5mL的相同的5wt％甘露醇溶液。称量小瓶的空重和加入溶液后的重量，以确定加入到小瓶中的水质量。小瓶以上述相同方式加入到冷冻干燥器中，再次采用表面安装的热电偶监测六个小瓶的温度。冷冻干燥器架子从室温快速冷却到大约-45℃以冷冻小瓶。在该冷却步骤过程中，在大约-15℃和大约-18℃之间随机发生形核。一旦所有小瓶温度是大约-40℃或以下，将小瓶用和上述方法相同的方式干燥。一旦结束了一次干燥，样品即刻从冷冻干燥器中取出并称重，以确定在所述一次干燥过程中损失了多少水。

小瓶初始小瓶压降水损失

溶液气氛减压结果

# 温度[℃] [psi] [％]

1 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -1.3 14 89.9 形核

2 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -1.9 14 85.2 形核

3 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -1.3 14 87.1 形核

4 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -2.3 14 88.8 形核

5 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -2.1 14 85.0 形核

6 2.5mL的5wt％甘露醇氩气 -1.1 14 80.7 形核

7 2.5mL的5wt％甘露醇空气 -15.7 0 65.7 -

8 2.5mL的5wt％甘露醇空气 -16.7 0 66.9 -

9 2.5mL的5wt％甘露醇空气 -14.5 0 64.6 -

10 2.5mL的5wt％甘露醇空气 -15.6 0 64.7 -

11 2.5mL的5wt％甘露醇空气 -16.5 0 64.1 -

12 2.5mL的5wt％甘露醇空气 -17.9 0 65.7 -

表10、提高形核温度改善了一次干燥

[0093]在下表10中总结了伴随着受控形核和随机形核的冷冻干燥过程的结果。应该注意的是，这两个试验的不同之处仅仅在于在一个试验中加入了经由减压步骤的受控形核。如表10所示，经由减压实现的受控形核过程允许在极低过冷度下形核，在本实施例中是大约-1.1℃--2.3℃。和随机形核情况相比，受控形核的这种高得多的形核温度获得了冰结构以及具有明显改善的干燥性能的最终冷冻干燥饼。对于相同量的干燥时间而言，采用所公开的减压方法在大约-1.1℃--2.3℃之间形核的小瓶平均损失了86.1％的水，而在大约-14.5℃--17.9℃之间随机形核的小瓶仅仅损失平均65.3％。因此，随机形核的小瓶会要求更多的一次干燥时间来获得和根据本发明公开方法以受控方式形核的小瓶相同程度的水损失。干燥时间的改善可能归因于在更高的形核温度形成更大的冰晶。这些更大的冰晶在升华时形成更大的孔，该更大的孔对进一步升华过程中水蒸气的流动提供更小的阻力。

工业实用性

[0094]本发明方法提供了用于控制过冷材料，也即液体或溶液，形核并且随后冷冻的温度和/或时间的改进方法。虽然本申请部分集中在冷冻干燥，但是对于涉及形核相变的任何材料加工步骤而言，出现相似的问题。所述加工的示例包括聚合物和金属从熔体结晶、材料从超饱和溶液结晶、蛋白质结晶、人工造雪、食物冷冻、冷冻浓缩、分馏结晶、低温保藏、或者蒸气冷凝成液体。

[0095]控制液体或溶液的形核温度的最直接益处是能够控制通过相变产生的固体域的数量和尺寸。在冷冻水中，例如，形核温度直接控制形成的冰晶的尺寸和数量。一般而言，当形核温度较高时，冰晶数量更少，尺寸更大。

[0096]控制通过相变产生的固体域的尺寸和数量的能力可以提供另外的优点。在冷冻干燥过程中，例如，冰晶的数量和尺寸强烈影响冷冻干燥的饼的干燥性质。通过较高形核温度产生的较大的冰晶在升华时得到更大的孔，所述更大的孔在后续升华过程中提供对水蒸气流动的更小阻力。因此，所公开的系统和方法提供了通过提高形核温度来增加冷冻干燥过程中一次干燥(即，升华)速率的方法。

[0097]在其中敏感性材料是通过冷冻过程保藏的(即，低温保藏)的应用中，可以实现另一可能的益处。例如，生物材料，包括但不限于哺乳动物组织样品(例如，脐血、组织切片、卵细胞和精子细胞等)、细胞系(例如，哺乳动物的、酵母、原核的、真菌的等)和冷冻在水溶液中的生物分子(例如，蛋白质、DNA、RNA和其亚类)，在冷冻过程中可以经历各种可能损害该材料功能或活性的应激。冰的形成可以物理上中断材料，或者使材料经历界面键合、渗透力、溶质浓度等方面的严重变化。由于形核控制着冰形成的结构和动力学，所以它能够显著影响这些应激。所以，本发明系统和方法提供了缓解与低温保藏过程有关的应激以及改善低温保藏材料的功能或活性恢复的独特的机制。这代表了和用于在针对活细胞设计的两步骤低温保藏算法中引发细胞外冰形成的常规形核控制方法(例如，形成种子或者和冷表面接触)相比的改进。

[0098]本发明方法也可以用于在低温保藏和冷冻干燥应用中的包含数种成分的复合溶液或混合物。这些制剂通常是溶液，所述溶液具有含有药物活性成分(例如，合成化学品、蛋白质、肽、或者疫苗)和任选的一种或多种缓和成分的水性溶剂、有机溶剂或者水性-有机溶剂，其中所述缓和成分包括有助于防止干燥过程中活性成分物理损失的填充剂(例如，右旋糖、葡萄糖、甘氨酸、乳糖、麦芽糖、甘露醇、聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠和山梨糖醇)；有助于为活性成分保持适当环境pH或毒性的缓冲剂或毒性改性剂(例如，乙酸、苯甲酸、柠檬酸、盐酸、乳酸、马来酸、磷酸、酒石酸、和这些酸的钠盐)；有助于保持活性成分在加工过程中或者在其最终液体或干燥形式中的结构和功能的稳定剂(例如，丙氨酸、二甲基亚砜、甘油、甘氨酸、人类血清白蛋白、聚乙二醇、赖氨酸、聚山梨醇酯、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖)；改变制剂玻璃转变行为的试剂(例如，聚乙二醇和糖)，和保护活性成分免遭降解的抗氧化剂(例如，抗坏血酸盐、亚硫酸氢钠、甲醛钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、次硫酸盐和硫甘油)。

[0099]由于形核一般为随机过程，因此经受相同处理条件的多个相同材料可能在不同温度下形核。结果，尽管处理条件相同，但是这些材料的依赖于形核行为的性质可能不同。所公开的系统和方法提供了用于同时控制多种材料的形核温度的方式，由此提供了增加这些制品的依赖于形核温度的性质的均匀性的方式。例如，在典型的冷冻干燥过程中，不同瓶中的相同溶液可在宽的温度范围内随机形核，结果，最终的冷冻干燥制品在临界性质如残余水分、活性和重建时间方面可以具有显著差异。通过利用本文公开的方法控制形核温度，能够大大提高源自冷冻干燥过程的制品性质的瓶与瓶之间均匀性。

[100]控制材料形核行为的能力还可在减少开发由正常未控制形核事件决定的工业过程所需时间方面提供很大益处。例如，经常需要数月来开发可在合理时间量内完成、产生在指定均匀性内的所需制品性质和保持活性药物成分(API)足够活性的成功的冷冻干燥循环。通过提供控制形核并因此可能改善一次干燥时间、制品均匀性和API活性的手段，开发成功的冷冻干燥方案所需的时间应该显著减少。

[101]特别地，本发明形核方法的潜在益处在指定要被冷冻干燥的制剂的组成方面提供提高的灵活性。由于控制形核可在冷冻步骤中更好地保存API，因此用户应能最小化添加缓和成分(例如稳定剂)到制剂中或者选择制剂成分的更简单组合以获得组合的稳定性和加工目标。在控制形核使得对固有地延长一次干燥时间的稳定剂或其它缓和成分的使用最小化(例如通过降低水溶液的玻璃转变温度)的情况下，可能出现协同益处。

[102]公开的方法尤其很好地适用于大规模生产或制造操作，这是因为它能使用能容易地被按比例调整或改变以制造各式各样制品的相同设备和工艺参数来进行。本方法提供了使用如下方法来使材料形核:在所述方法中，全部操纵可在单个室(例如冷冻干燥机)中进行并且该方法不要求使用真空、使用添加剂、振动、电冷冻等来诱导形核。

[103]与现有技术相比，本发明的方法不增加任何东西到冷冻干燥制品中。它只要求材料(例如小瓶中的液体)开始时被保持在气体环境中的指定压力下和快速降低压力至较低压力。在冷冻干燥循环中，将从瓶中取出所有应用的气体。小瓶或它们的内含物不接触或触及除气体外的任何东西。环境压力和气体环境的简单操纵本身足以达到该目标。通过仅仅依靠环境压力变化诱导形核，本文公开的方法均匀和同时地影响冷冻干燥机内的所有小瓶。

[104]与冷冻干燥应用中影响材料形核的现有技术方法相比，本发明的实施方案还不太昂贵并且更容易实施和维护。本发明方法能明显加快冷冻干燥过程中的一次干燥，从而减少冷冻干燥药物的处理成本。与现有技术方法相比，本发明方法产生均匀得多的冷冻干燥制品，从而减少制品损失并为不能满足更严格均匀性规范的加工者形成进入市场的壁垒。这种方法获得这些益处而不污染冷冻干燥制品。更大的过程控制应产生改善的制品和缩短的处理时间。

[105]从上文中应认识到，本发明因此提供了冷冻干燥的系统和方法。本发明方法的各种改变、变化和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，用于控制温度的机构可以是替换性的基于低温的冷却系统或者常规的或先进的机械致冷系统。同样，控制室中压力和气氛的方式经过特别考虑以包括加压和减压技术。应该理解的是，任何所述交替构造、修改、变化和改变都应包括在该说明书的范围以及权利要求的精神和范围之内。

Claims

1、材料冷冻干燥方法，包括如下步骤:

以规定的冷却速率冷却室中的所述材料；

降低所述室中的所述压力以在所述材料中诱导冷冻形核；

进一步冷却所述形核的材料到最终温度或低于最终温度以冷冻所述材料；

干燥所述冷冻的材料以制备具有降低的水分或溶剂的干燥制品。

2、权利要求1的冷冻干燥方法，其中冷却所述材料的步骤进一步包括冷却所述材料到亚稳态。

3、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述进一步冷却所述形核的材料的步骤进一步包括将所述形核的材料冷却到最终温度或低于最终温度，以确保所述材料的冷冻。

4、权利要求1的冷冻干燥方法，其中当所述材料获得所需的形核温度时引发所述降低压力的步骤。

5、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述降低压力的步骤在引发所述冷却步骤之后在所需时间引发，其中所述材料处于相变温度或低于相变温度。

6、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述材料进一步包括生物药物材料、药物材料、化学材料、生物材料、食品或者其组合。

7、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述降低压力步骤在所述室内在加压气氛中进行。

8、权利要求7的冷冻干燥方法，其中所述室内的所述气氛包括氩气、氮气、氦气、空气、水蒸气、氧气、二氧化碳、氖气、氙气、氪气、氢气或其混合物。

9、权利要求7的冷冻干燥方法，其中所述气氛加压到环境压力和高于环境压力25psi之间。

10、权利要求1的冷冻干燥方法，其中在加压之前所述材料初始冷却到从相变温度到低于相变温度20℃之间的温度。

11、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述压力降低大约7psi或更多。

12、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述压力下降以使绝对压力比P_i/P_f为大约1.2或更大。

13、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述压力以大于大约0.2psi每秒的压力下降速率ΔP/Δt下降。

14、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述压力在40秒或更少时间内下降。

15、权利要求6的方法，其中所述材料进一步包括一种或多种组分，所述组分包括活性病毒或减弱病毒、核酸、单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质、肽或多肽。

16、权利要求15的方法，其中重构材料的组分显示出和与来自随机形核材料的重构材料组分相关的功能或活性相比改善的功能或活性。

17、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述材料容纳在多个容器或小瓶中，由所述多个容器或小瓶获得的干燥制品显示出相对均匀的重构时间。

18、权利要求1的冷冻干燥方法，其中所述材料容纳在多个容器或小瓶中，由所述多个容器或小瓶获得的干燥制品显示出相对均匀的残余水分或溶剂水平。

19、权利要求1的方法，其中干燥所述冷冻材料所需的时间小于干燥随机形核的冷冻材料所需的时间。

20、冷冻干燥系统，包括:

室，具有受控的气氛和一个或多个用于夹持一个或多个材料容器或小瓶的架子；

用于控制所述室内的所述架子的温度以便控制所述材料温度的机构；

冷凝器，连接到所述室并用于从所述室去除任何溶剂或水分；和

用于控制所述室的压力以使所述室快速减压从而使所述材料在冷冻过程中形核并在干燥过程中保持低压的机构。