KR20080105034A - 고수준으로 단백질을 발현하는 숙주세포의 선택 - Google Patents

Abstract

본 발명은 i)관심의 폴리펩티드, 및 ii) 진핵 숙주세포에서 작용하는 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 다중시스트론성 전사 유니트를 포함하는 DNA 분자를 제공하고, 여기서 관심의 폴리펩티드는 선택가능한 마커 폴리펩티드의 것과 구별되는 전사 개시 서열을 갖고, 여기서 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 상기 다중시스트론성 전사 유니트의 선택가능한 마커 폴리펩티드를 위한 암호화 서열로부터 상류에 있고, 여기서 내부 리보솜 엔트리 부위(IRES)는 관심의 폴리펩티드에 대한 암호화 서열로부터 하류에 그리고 선택가능한 마커 폴리펩티드를 위한 암호화 서열로부터 상류에 존재하고, 여기서 암호화 가닥에서 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 GTG 또는 TTG 시작 코돈을 포함한다. 본 발명은 또한 관심의 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포를 얻는 방법을 제공하고, 상기 숙주세포는 본 발명의 DNA 분자를 포함한다. 본 발명은 추가로 관심의 폴리펩티드의 제조방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 숙주세포를 배양하는 것을 포함한다.

다중시스트론성 전사 유니트, 단백질 발현 숙주세포, 폴리펩티드 암호화서열

Description

고수준으로 단백질을 발현하는 숙주세포의 선택{Selection of host cells expressing protein at high levels}

본 발명은 분자생물학과 생물공학 분야에 관한 것이다. 더욱 특별히는 본 발명은 고수준으로 단백질을 발현하는 숙주세포의 선택을 개선하기 위한 수단 및 방법에 관한 것이다.

단백질은 예를 들면 생물약제학과 같이, 생물과 생물공학에서 광범위한 적용을 위해 다양한 숙주세포에서 생산될 수 있다. 진핵세포와 특히 포유동물 숙주세포는, 예를 들면, 단백질이 글리코실화와 같은 특정 후번역 변형 (posttranslational modifications)을 가질 때, 이와 같은 여러 단백질을 발현하기 위한 본 목적에 바람직하다. 이와 같은 생산 방법은 잘 확립되어있고, 일반적으로 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산의 숙주세포(또한 "트란스유전자"로도 언급된다)에서 발현을 필요로 한다. 일반적으로, 트란스유전자는 선택가능한 마커 유전자와 함께 전구체 세포에 도입되고, 세포들은 선택가능한 마커 유전자의 발현을 위해 선택되고, 고수준으로 관심있는 단백질을 발현하는 하나 이상의 클론이 동정되고, 관심의 단백질의 발현에 사용된다.

트란스유전자의 발현과 관련된 하나의 문제는, 트란스유전자가 유전자 침 묵(McBurney et al., 2002)으로 인해 불활성화될 것이라는 높은 가능성으로부터 유래하는 것을 예상할 수 없고, 그러므로 많은 숙주세포 클론은 트란스유전자의 높은 발현에 대해 시험되어야 한다.

비교적 높은 수준의 원하는 단백질을 발현하는 재조합 숙주세포가 알려져 있고, 여러 이와 같은 방법은 WO 2006/048459에 논의되었고, 본 명세서에 참조로 병합된다.

선행기술의 어느 유리한 방법에서, 이중시스트론성(bicistronic) 발현벡터는 재조합 단백질을 발현하는 안전한 포유동물 세포주의 신속하고 효율적인 생산에 대해 기재하고 있다. 이들 벡터는 관심의 단백질에 대한 상류 암호화 서열과 선택 마커의 하류 암호화 서열 사이에 내부 리보솜 엔트리 부위(IRES)를 함유한다(Rees et al, 1996). 이와 같은 벡터는 시판되고 있고, 예를 들면, Clontech 사의 pIRES1 벡터이다(CLONTECHniques, October 1996). 숙주세포에 도입하기 위해 이와 같은 벡터를 사용하는, 하류 마커 단백질의 충분한 발현의 선택은 그리고 나서 다중시스트론성 mRNA의 높은 전사 수준을 자동적으로 선택하고, 따라서 크게 증가된, 관심의 단백질의 고발현 가능성은 이와 같은 벡터를 사용하는 것으로 예상된다. 바람직하기는 이와 같은 방법에서, 사용된 IRES는, 선택 마커 단백질의 발현을 선택함으로써 관심의 단백질의 고발현 수준을 갖는 숙주세포를 선택하는 기회를 더욱 증가시키기 위해, 선택 마커 유전자의 비교적 낮은 수준의 전사를 제공하는 IRES이다 (예를 들면, WO 03/106684 및 WO 2006/005718 참조).

본 발명은 고수준의 관심의 단백질을 발현하는 숙주세포의 선택을 위한 개선 된 수단 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

WO 2006/048459는 가출원의 우선일 전에 출원되고 우선일 후에 공개되었고, 그 전체는 참조에 의해 본 명세서에 병합된다. WO 2006/048459는 관심의 폴리펩티드의 고수준을 발현하는 숙주세포를 선택하기 위한 개념을 기재하고, 이 개념은 본 명세서에서 '상호 의존적 번역'으로 불리운다. 이 개념에서, 다중시스트론성 전사 유니트가 사용되고, 여기서 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 상류에 있고, 여기서 선택가능한 마커 폴리펩티드의 번역은 그 안의 돌연변이에 의해 약화되고, 반면 관심의 폴리펩티드의 번역은 매우 높다(예를 들면, 도해로서 도 13 참조). 본 발명은 폴리펩티드를 고수준으로 발현하는 숙주세포를 선택하는 대체적 수단과 방법을 제공한다.

한 면에서, 본 발명은 i) 관심의 폴리펩티드 및 ii) 진핵 숙주세포에서 기능성인 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 다중시스트론성 전사 유니트를 포함하는 DNA 분자를 제공하고, 여기서 관심의 폴리펩티드는 선택가능한 마커 폴리펩티드의 것과 구별되는 전사 개시 서열을 갖고, 여기서 관심의 폴리펩티드에 대한 암호화 서열은 상기 다중시스트론성 전사 유니트에서 선택가능한 마커 폴리펩티드의 암호화 서열의 상류에 있고, 그리고 여기서 내부 리보솜 엔트리 부위(IRES)는 관심의 폴리펩티드의 암호화 서열로부터 하류 및 선택가능한 마커 폴리펩티드의 암호화 서열로부터 상류에 존재하고, 여기서 암호화 가닥에서 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 a) GTG 시작 코돈; b) TTG 시작 코돈; c) CTG 시작 코돈; d) ATT 시작 코돈; 및 e) ACG 시작 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 시작 서열을 포함한다.

선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 암호화 가닥 중의 전사 시작 서열은 GTG, TTG, CTG, ATT, 또는 ACG 서열과 같은 ATG 시작 서열과 다른 시작 코돈을 포함하고, 그들 중 처음 두 개가 가장 바람직하다. 이와 같은 비-ATG 시작 코돈은 바람직하기는 시작코돈으로서 비-ATG 서열의 비교적 양호한 인식을 제공하는 서열로 플랭크되고, 적어도 몇몇 리보솜은 이들 시작코돈으로부터 번역을 시작하고, 즉 번역 시작 서열은 바람직하기는 서열 ACC[비-ATG 시작코돈]G 또는 GCC[비-ATG 시작코돈]G을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 선택가능한 마커 단백질은 항생물질과 같이, 선택제의 치사 및/또는 성장-억제 효과에 대한 내성을 제공한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트를 제공하고, 상기 발현 카세트는 추가로 다중시스트론성 발현 유니트의 상류의 프로모터를 포함하고 다중시스트론성 발현 유니트의 초기 전사를 위한 진핵 숙주 세포에서의 작용성이고, 그리고 상기 발현 카세트는 추가로 다중시스트론성 발현 유니트의 하류에 전사 중단 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 이와 같은 발현 카세트는 추가로, 매트릭스 또는 골격 부착 영역(MAR/SAR), 절연체 서열, 편재성 크로마틴 개방 요소(UCOE), 및 항-억제제 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 크로마틴 조절 요소를 포함한다. 이 면에서 항-억제제 서열이 바람직하고, 특정 구현예에서 상기 항-억제제 서열은: a) SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66 중 어느 하나; b) SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66 중 어느 하나의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제제 활성을 갖는다; c) a) 또는 b)와 핵산 서열이 적어도 70% 동일한 서열, 여기서 상기 서열은 항-억제제 활성을 갖는다; 및 d) a) 내지 c)중 어느 하나의 보체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 추가로, 관심의 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포를 발생시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은: 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 발현 카세트를 다수의 전구체 숙주 세포에 도입하는 단계, 선택가능한 마커 폴리펩티드의 발현을 위해 선택된 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 및 관심의 폴리펩티드를 생산하는 적어도 하나의 숙주세포를 선택하는 단계를 포함한다.

추가의 면에서, 본 발명은 관심의 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 숙주 세포를 배양하고, 상기 숙주 세포는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하고, 그리고 상기 발현 카세트로부터 관심의 폴리펩티드를 발현하는 것을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 관심의 폴리펩티드는 추가로 숙주세포 및/또는 숙주세포 배지로부터 단리된다.

도 1은 본 발명에 따른 발현 구조물에 의한 결과를 나타낸다. 상기 발현 구조물은 IRES의 상류에 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 서열(d2EGFP로 예시된다)을 함유하고, 이것은 본 발명에 따른 선택가능한 마커를 암호화하는 서열의 상류이 다(TTG 시작코돈을 갖는 제오신 내성 유전자(TTG Zeo) (또는 대조로 그것의 정상 ATG 시작 코돈을 갖는 제오신 내성 유전자(ATG Zeo)로 예시된다). 더욱 상세히는 실시예 1을 참조하라. 점은 개별적인 데이터 점을 나타내고; 선은 평균 발현 수준을 나타내고; 사용된 구조물은 수평축에 표시하였고 그리고 상기 그래프 위에 개략적으로 표시하였고; 수직축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.

도 2는 유지 마커로서 dhfr을 갖는 삼중시스트론성 발현 벡터에 의한 결과를 나타낸다. 발현 구조물은 TTG 시작코돈을 갖고 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 상류의 내부 ATG 서열이 없는 제오신 선택가능한 마커 유전자(d2EGFP로 예시됨)를 함유하고, 이것은 추가로 IRES를 거쳐 (ATG 시작 코돈을 갖는) 하류 대사성 선택 마커 dhfr 유전자에 기능적으로 연결된다. 점은 개별적인 데이터 점( 수직축 상의 Zeo^R 콜로니에서 GFP 형광 신호), 선은 평균 발현 수준을 나타낸다. 사용된 구조물을 상기 그래프에 나타내었고, 조건은 수평 축에 표시하였다(d: 일). 더욱 상세히는 실시예 2를 참조하라.

도 3은 도 2와 같으나, GTG 시작코돈을 갖는 dhfr 유전자를 사용한 것이다.

도 4는 도 2와 같으나, TTG 시작코돈을 갖는 dhfr 유전자를 사용한 것이다.

도 5는 다양한 조건하에서, dhfr 효소 (ATG 시작 코돈)을 갖는 클론에서의 사본의 수이다. 더욱 상세히는 실시예 3을 참조하라.

도 6은 도 5와 같으나, GTG 시작코돈을 갖는 dhfr 유전자를 사용한 것이다.

도 7는 도 5와 같으나, TTG 시작코돈을 갖는 dhfr 유전자를 사용한 것이다.

한 면에서, 본 발명은 청구항 1에 따른 DNA 분자를 제공한다. 이와 같은 DNA 분자는 본 발명에 따라, 선택가능한 마커 폴리펩티드의 발현을 위해 선택함으로써, 관심의 폴리펩티드의 고수준을 발현하는 진핵 숙주세포를 얻는데 사용될 수 있다. 순차적으로 또는 동시에, 관심의 폴리펩티드를 발현하는 하나 이상의 숙주세포(들)를 동정할 수 있고, 추가로 관심의 폴리펩티드의 고수준 발현을 위해 사용될 수 있다.

용어 "단일시스트론성 유전자"는 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA 분자를 제공할 수 있는 유전자로 정의된다. "다중시스트론성 전사 유니트"는, 또한 다중시스트론성 유전자로도 언급되고, 적어도 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA 분자를 제공할 수 있는 유전자로 정의된다. 용어 "이중시스트론성 유전자"는 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA 분자를 제공할 수 있는 유전자로 정의된다. 그러므로, 이중시스트론성 유전자는 다중시스트론성 유전자의 정의 내에 포함된다. 본 명세서에 사용되는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 5개의 아미노산을 포함하고, 예를 들면, 단백질 또는 서브유니트로서 그것의 일부일 수 있다. 주로, 용어 폴리펩티드와 단백질은 본 명세서에서 서로 교환되어 사용된다. 본 발명에 사용되는 "유전자" 또는 "전사 유니트"는 염색체 DNA, cDNA, 인공 DNA, 그들의 결합물 등을 포함할 수 있다. 여러 시스트론을 포함하는 전사 유니트는 단일 mRNA로서 전사된다.

본 발명에 따른 다중시스트론성 전사 유니트는 바람직하기는 관심의 폴리펩 티드에 대해 그리고 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대해 5' 내지 3'을 암호화하는 이중시스트론성 전사 유니트이다. 따라서, 관심의 폴리펩티드는 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대해 암호화 서열로부터 상류를 암호화한다. IREA는 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 기능적으로 연결되고, 따라서, 선택가능한 마커 폴리펩티드는 번역을 위해 IRES에 의존한다.

다양한 관심의 폴리펩티드의 발현을 위해, 또한 이들이 다중결합 단백질의 일부를 형성할 때, 개별적인 전사 유니트를 사용하는 것이 바람직하다 (예를 들면, 본 명세서에 참조로서 병합된 WO 2006/048459를 참조하라: 각 항체의 중사슬과 경사슬은 개별적인 전사 유니트에 의해 암호화되고, 이들 각각의 발현 유니트는 이중시스트론성 발현 유니트이다).

본 발명의 DNA 분자는 선택가능한 마커 폴리펩티드와 관심의 폴리펩티드에 대해 암호화 가닥과 비-암호화 가닥을 갖는, 이중가닥 DNA의 형태로 존재할 수 있고, 암호화 가닥은 U 대신 T가 존재하는 것을 제외하고는 번역된 RNA와 동일한 서열을 갖는 가닥이다. 그러므로, AUG 시작코돈은 ATG 서열에 의해 암호화 가닥에서 암호하되고 RNA에서 AUG 시작코돈에 상응하는 ATG 서열을 함유하는 가닥은 DNA의 암호화 가닥으로 언급된다. 시작코돈 또는 번역 개시 서열이 실제로 RNA 분자에 존재하지만, 이들은 이와 같은 RNA 분자를 암호화하는 DNA 분자에 동등하게 구체화된다고 고려될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다; 그러므로, 본 발명이 시작코돈 또는 번역 개시 서열을 언급하는 경우, DNA 분자의 암호화 가닥에서 U 대신 T가 존재하지 않는다면, RNA 서열과 동일한 서열을 갖는 상응하는 DNA 분자를 포함 하는 것을 의미하고, 그리고 명백히 다르다고 특정되는 경우를 제외하고, 그 반대도 같다. 다시 말하면, 시작 코돈은 예를 들면, RNA 중의 AUG 서열이지만, DNA의 암호화 가닥의 상응하는 ATG 서열은 본 발명에서 시작코돈으로도 언급된다. 동일한 것이 '인 프레임(in frame)' 암호화 서열의 참조로 사용되고, 아미노산으로 번역되는 RNA 분자의 3중체(3개의 염기)를 의미하고, 또한 DNA 분자의 암호화 가닥에서 트리뉴클레오티드 서열로 해석될 수 있다.

선택가능한 마커 폴리펩티드와 다중시스트론성 유전자에 의해 암호화된 관심의 폴리펩티드는 각각 그들 자신의 (정지코돈 뿐 아니라) 시작코돈을 갖는다, 즉, 그들은 개별적인 개방형 해독틀에 의해 암호화된다.

용어 "선택 마커" 또는 "선택가능한 마커"는 통상적으로 존재가 직접 또는 간접적으로 세포에서 검출될 수 있는 유전자 및/또는 단백질, 예를 들면 선택 약제를 불활성화하고 상기 약제의 치사 또는 성장-억제 효과로부터 숙주세포를 보호하는 폴리펩티드(예를 들면, 항생물질 내성 유전자 및/또는 단백질)를 말한다. 또 다른 가능성은 상기 선택 마커가 형광 또는 착색을 유도하는 것으로(예를 들면, 녹색형광단백질(GFP) 및 그 유도체 (예를 들면, d2EGFP), 루시페라제, lacZ, 알칼라인 포스파타제 등), 이것은 GFP를 발현하는 세포를 선택하기 위해, 예를 들면 형광 활성화 세포 분별기(FACS)를 사용하여 색의 침착을 유도하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 바람직하기는, 본 발명에 따른 선택가능한 마커 폴리펩티드는 선택 약제의 치사 및/또는 성장-억제 효과에 대한 내성을 제공한다. 선택가능한 마커 폴리펩티드는 본 발명의 DNA에 의해 암호화된다. 본 발명에 따른 선택가능한 마커 폴리펩티드는 진핵 숙주세포에서 기능성이어야 하고, 따라서 진핵 숙주세포에서 선택될 수 있어야 한다. 이 기준을 만족하는 어느 선택가능한 마커 폴리펩티드는 기본적으로 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이와 같은 선택가능한 마커 폴리펩티드는 본 분야에 잘 알려져 있고 진핵 숙주세포를 얻으려 할 때 일상적으로 사용되고, 몇몇 예가 본 명세서에 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 선택 마커는 제오신이다. 다른 구현예에서는 블라스티시딘이 사용된다. 본 분야의 당업자는 다른 선택 마커, 예를 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 블레오마이신, 히그로마이신 등이 이용가능하고 사용될 수 있음을 알 것이다. 다른 구현예에서, 카나마이신이 사용된다. 또 다른 구현예에서, DHFR 유전자가 선택가능한 마커로서 사용되고, 이것은 메토트렉세이트(methotrexate)에 의해, 특히 메토트렉세이트의 농도를 증가시킴에 의해 선택될 수 있고 세포는 DHFR 유전자의 증가된 사본 수에 대해 선택될 수 있다. DHFR 유전자는, 예를 들면, dhfr^- 표현형을 갖는 CHO 세포에서 그리고 폴레이트를 갖고 글리신, 히로크산틴 및 티미딘이 부족한 배지에서, dhfr-부족을 보충하기 위해 사용될 수 있다. 유사하기는, 글루타민 합성효소(GS) 유전자가 사용될 수 있고, 그것을 위해 선택은 불충분한 GS(예를 들면, NS-O 세포)를 갖는 세포에서 글루타민 없이 매질에서 배양함에 의해, 또는 선택적으로 GS가 충분한 세포에서(예를 들면, CHO 세포) GS에 대한 억제제, 메티오닌 술폭시민(MSX)을 첨가함에 의해 가능하다. 다른 사용할 수 있는 선택적인 마커 유전자, 및 그들의 선택 약제는 예를 들면, 본 명세서에 참조로서 병합된 미국특허 제 5,561,053호의 표1에 기재되어 있고; 또한 이들을 검토하기 위해 Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990)을 참조하라. 선택가능한 마커 폴리펩티드가 dhfr이면, 바람직하 구현예의 숙주세포는 폴레이트를 함유하는 배지에서 배양되고, 그 배지는 본질적으로 히포크산틴과 티미드, 바람직하기는 또한 글리신이 전혀 없다.

두 개의 다중시스트론성 전사 유니트가 단일 숙주세포에서 본 발명에 따라 선택되어질 때, 각각은 바람직하기는 다른 선택가능한 마커에 대한 암호화 서열을 함유하여, 둘 다의 다중시스트론성 전사 유니트에 대한 선택을 허용한다. 물론, 둘 다의 다중시스트론성 전사 유니트가 하나의 핵산 분자에 존재할 수 있고, 선택적으로 각각이 개별적인 핵산 분자에 존재할 수 있다.

용어 "선택"은 통상적으로 선택 마커/선택가능한 마커 및 선택 약제를 사용하여 특정 유전적 특성을 갖는 숙주세포를 동정하는 방법으로 정의된다 (예를 들면, 숙주세포는 그것의 게놈으로 집적된 트란스유전자를 함유한다). 본 분야의 당업자에게 수많은 선택 마커의 결합이 가능하다는 것이 명확하다. 특히 유리한 하나의 항생물질은 제오신으로, 제오신-내성 단백질(zeocin-R)은 약물과 결합하여 약물을 무해하게 작용한다. 그러므로, 고-발현자는 생존시키면서, 낮은 수준의 제오신-R 발현을 갖는 세포를 사멸하는 약물의 양을 적정하는 것을 용이하게 한다. 일반적으로 사용되는 모든 다른 항생물질-내성 단백질은 효소이고, 그러므로, 촉매적으로 작용한다(약물과 1:1이 아니다). 따라서, 항생물질 제오신은 바람직한 선택 마커이다. 또 다른 바람직한 선택 마커는 5,6,7,8-테트라히드로폴레이트 합성 효소(dhfr) 이다. 그러나, 본 발명은 또한 다른 선택 마커에 의해서도 작업된다.

본 발명에 따른 선택가능한 마커 폴리펩티드는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 단백질로, 상기 폴리펩티드는, 예를 들면, 이것은 항생물질과 같은 선택 약물에 내성을 제공하므로, 선택을 위해 기능적으로 사용될 수 있다. 그러므로, 항생물질이 선택 약물로 사용되면, DNA는 선택 약물에 대한 내성을 제공하는 폴리펩티드를 암호화하고, 상기 폴리펩티드는 선택가능한 마커 폴리펩티드이다. 이와 같은 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열이 알려져 있고, 선택가능한 마커 단백질을 암호화하는 DNA의 야생형 서열의 여러 예가 본 명세서에 제공된다 (예를 들면, 본 명세서에 참조로서 병합된, WO 2006/048459의 도 26 ~ 도 32를 참조하라). 선택가능한 마커의 돌연변이 또는 유도체가 또한 본 발명에 따라 사용하기에 적합하다는 것이 명백하고, 그러므로, 상기 선택가능한 마커 단백질이 여전히 기능적인 한, 용어 '선택가능한 마커 폴리펩티드'의 범위에 속한다.

편리함을 위해 그리고 당업자에게 일반적으로 허용되는 바와 같이, 본 명세서뿐만 아니라 많은 문헌에서, 종종 선택 약제에 대한 내성을 암호화하는 유전자와 단백질은 비록 공식 명칭은 다르지만, 각각 '선택가능한 약물 (내성) 유전자' 또는 '선택 약물 (내성) 단백질'로 불리고, 예를 들면 네오마이신(뿐 아니라 G418와 카나마이신)에 대한 내성을 제공하는 단백질을 암호화하는 유전자는 종종 네오마이신 (내성) (또는 neo^r) 유전자로 언급되는 반면, 공식적 명칭은 아미노글리코시드 3'-포스포트란스퍼라제이다.

본 발명의 경우, 선택가능한 마커 폴리펩티드의 발현 수준이 낮은 것이 유리하고, 따라서 엄격한 선택이 가능하다. 본 발명에서, 비-ATG 시작코돈을 갖는 선택가능한 마커 암호화 서열을 사용하여 얻어진다. 선택 후, 그럼에도 불구하고 선택가능한 마커 폴리펩티드의 충분한 수준을 갖는 세포들만이 선택될 수 있고, 이것은 이와 같은 세포가 다중시스트론성 전사 유니트의 충분한 전사와 선택가능한 마커 폴리펩티드의 충분한 번역을 가져야 하고, 이것은 다중시스트론성 전사 유니트가 집적된 또는 그렇지 않으면 이 전사 유니트로부터의 발현 수준이 높은 곳에서 숙주세포에 존재하는 세포에 대한 선택을 제공한다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 DNA 분자는 관심의 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 선택가능한 마커 폴리펩티드 하류에 대한 암호화 서열을 갖는다. 따라서, 다중시스트론성 전사 유니트는 5'에서 3' 방향으로(DNA의 전사된 가닥과 그 결과 전사된 RNA 모두에서) 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 서열과 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 암호화 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 관심의 유전자의 암호화 영역은 바람직하기는 cap-의존 ORF로부터 번역되고, 그리고 관심의 폴리펩티드는 충분히 생성된다. 선택가능한 마커 폴리펩티드는 IRES로부터 번역된다. 선택가능한 마커 시스트론의 번역을 감소시키기 위해, 본 발명에 따라, 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대해 암호화하는 핵산 서열은 진핵 숙주세포에서 선택가능한 마커 폴리펩티드의 번역 개시 효율을 감소시키는 시작코돈에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직하기는, GTG 시작코돈 또는 더욱 바람직하기는 TTG 시작코돈은 선택가능한 마커 폴리펩티드로 설계된다. 번역 효율 은 동일 세포에서 상응하는 야생형 서열의 효율보다 낮고, 즉 돌연변이는 세포/시간 당 폴리펩티드를 덜 가져오고, 따라서 선택가능한 마커 폴리펩티드를 덜 가져온다.

번역 시작 서열은 종종 본 분야에서 '코자크(Kozak) 서열'로 불리고, 최적의 코자크 서열은 RCCATGG이고, 시작코돈은 밑줄그어졌고, R은 퓨린이고, 즉 A 또는 G이다 (Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002 참조). 그러므로, 개시코돈 자체 이외에, 그것의 컨텍스트, 특히 뉴클레오티드 -3 내지 -1 그리고 +4이 중요하고, 최적의 번역 시작서열은 최적의 컨텍스트(즉, RCC가 직접 선행되고 G가 바로 뒤따르는 ATG)에 최적의 시작코돈(즉, ATG)를 포함한다. 리보솜에 의한 번역은 최적 코자크 서열이 존재할 때 가장 효율적이다(Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002 참조). 그러나, 사상의 작은 비율에서, 비-최적 번역 개시 서열이 인식되고 리보솜에 의해 번역을 개시하도록 사용된다. 본 발명은 이 원리를 사용하고 번역의 양을 감소시키고 심지어 미세조정하여 선택가능한 마커 폴리펩티드를 발현시키고, 이것은 그러므로 선택 시스템의 엄격성을 증가시킨다.

본 발명의 선택가능한 마커 폴리펩티드의 ATG 시작코돈은 또 다른 코돈, 예를 들면, GTG, TTG, CTG, ATT, 또는 ACG (본 명세서에서 모두 함께 '비-ATG 시작 코돈'으로 불린다)로 돌연변이되고, 이것은 약간의 번역 개시를 제공하는 것으로 보고된 바 있다. 바람직한 구현예에서, ATG 시작코돈은 GTG 시작코돈으로 돌연변이된다. 이것은 비-최적 컨텍스트인 것을 제외하고는 손상되지 않은 ATG 시작코돈에 의한 것보다 여전히 낮은 발현 수준(낮은 번역)을 제공한다. 더욱 바람직하기는, ATG 시작코돈은 TTG 시작코돈으로 돌연변이되고, 이것은 GTG 시작코돈에 의한 것 보다도 더 낮은 선택가능한 마커 폴리펩티드의 발현수준을 제공한다((Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002; 또한 본 명세서에 참조로 병합된 WO 2006/048459의 실시예 9~13 참조). 본 발명에 따른 다중시스트론성 전사 유니트에서 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 암호화 서열에서의 비-ATG 시작코돈의 사용은 선행기술분야에 기재되지도 제안되지도 않았고, 본 명세서에 참조로서 기재된 WO 2006/048459에 나타난 바와 같이, 바람직하기는 크로마틴 조절 요소와 결합하여, 관심의 폴리펩티드의 매우 높은 수준의 발현을 가져왔다

본 발명에 따른 비-ATG 시작코돈의 사용을 위해, 이와 같은 시작코돈에 대한 최적의 컨텍스트를 제공하는 것이 매우 바람직하고, 즉, 비-ATG 시작코돈은 바람직하기는 위치 -3 에서 -1의 뉴클레오티드 RCC가 직접 선행되고 G 뉴클레오티드(위치 +4)가 바로 따라오는 것이 바람직하다. 그러나, 서열 TTTGTGG (시작코돈은 밑줄그어짐)을 사용하여, 비록 비-ATG 시작 코돈을 위한 최적의 컨텍스트를 제공하기 위해 절대적으로 요구되는 것이 매우 바람직하지만, 몇몇 개시가 적어도 인 비트로에서 관찰된다는 것이 보고되어 왔다.

ATG 시작코돈을 제외하고, 폴리펩티드에 대한 암호화 서열 내의 ATG 서열은 '내부 ATG'로 불리고, 이들이 ORF를 갖는 프레임에 있고 따라서 메티오닌에 대해 암호화한다면, 폴리펩티드 중의 생성된 메티오닌은 '내부 메티오닌'으로 언급된다. WO 2006/048459의 발명에서, 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 암호 영역(시작코돈을 뒤따르고, 시작코돈을 반드시 포함하지 않음)은, 관심의 폴리펩티드의 시작코돈까지(그러나 포함하지는 않고) DNA의 암호화 가닥의 어느 ATG 서열이 전혀 없다. WO 2006/048459호는 이것을 가져오는 방법과 생성된 선택가능한 마커 폴리펩티드를 기능성에 대해 시험하는 방법을 기재한다. 본 발명을 위해, 선택가능한 마커 폴리펩티드 암호화 서열이 IRES의 하류이고 관심의 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 하류에 있는 경우, 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 서열에서의 내부 ATG는 손상되지 않고 남을 수 있다.

분명하게, 본 발명에 따라, 관심의 폴리펩티드의 번역 시작 서열이 최적 번역 개시 서열, 즉 합의 서열 RCCATGG (시작코돈은 밑줄)을 갖는 서열을 포함하는 것이 매우 바람직하다. 이것은 관심의 폴리펩티드의 매우 효율적인 번역을 가져올 것이다.

마커의 암호화 서열에 감소된 번역 효율의 여러 수준을 가져오는 다양한 돌연변이를 제공함에 의해, 선택의 엄격성이 증가된다. 따라서, 선택 시스템의 미세조정은 본 발명에 따른 다중시스트론성 전사 유니트를 사용하여 가능하다: 예를 들면, 선택 마커 폴리펩티드에 대한 GTG 시작코돈을 사용하여, 이 시작코돈으로부터 극소의 리보솜이 번역되어, 선택가능한 마커 단백질의 낮은 수준, 따라서 엄격성이 높은 선택을 생성하고; 더 적은 리보솜이 이 시작코돈으로부터 선택가능한 마커 폴리펩티드를 번역할 것이기 때문에 TTG 시작 코돈을 사용하여 선택의 엄격성을 더욱 증가시킨다.

본 명세서에 참조로서 병합된 WO 2006/048459에서, 기재된 다중시스트론성 발현 유니트는 매우 확실한 선택 시스템에서 사용되어, 필요에 따라 높은 수준으로 관심의 폴리펩티드를 발현하는 클론을 매우 큰 비율로 가져온다는 것이 증명되었다. 이에 더하여, 관심의 폴리펩티드에 대해 얻어진 발현 수준은 더 많은 수의 클론이 지금까지 알려진 선택 시스템을 사용하여 스크린 되었을 때 얻어진 것보다 상당히 높을 것이다.

감소된 번역 개시 효율에 더하여, 필요에 따라 마커 폴리펩티드의 번역 수준을 더욱 감소시키고 여전히 더욱 엄격한 선택 조건을 허용하도록 하기 위해, 숙주 세포의 여러 바람직하지 않은 코돈을 포함하도록, 예를 들면 그것의 암호화 서열을 돌연변이하여 선택가능한 마커 폴리펩티드의 감소된 번역 연장 효율을 제공하도록 하는 것이 더욱 유리할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 번역 효율을 감소시키는 돌연변이 이외에, 선택가능한 마커 폴리펩티드는 추가로, 선택가능한 마커 폴리펩티드의 활성을 그것의 야생형 등가물(counterpart)에 비교해 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 이것은 선택의 엄격성을 더욱 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 비-제한적 예로서, 제오신 내성 폴리펩티드의 위치 9에서의 프롤린은 예를 들면, Thr 또는 Phe으로 돌연변이될 수 있고 (예를 들면, 본 명세서에 참조로서 병합된 WO 2006/048459의 실시예 14를 참조), 그리고 네오마이신 내성 폴리펩티드인 경우, 아미노산 잔기 182 또는 261 또는 둘 다가 더욱 돌연변일 될 수 있다(예를 들면, WO 01/32901 참조).

본 발명의 몇몇 구현예에서, 소위 스페이서 서열이 선택가능한 마커 폴리펩티드의 시작코돈을 암호화하는 서열의 하류에 놓이고, 그 스페이서 서열은 바람직하기는 프레임에 시작코돈을 갖고 약간의 아미노산을 암호화하는 서열이고, 이차 구조를 함유하지 않는 것이다(Kozak, 1990). 이와 같은 스페이서 서열은, 2차 구조물이 선택가능한 마커 폴리펩티드의 RNA(Kozak, 1990)에 존재한다면, 번역 개시 빈도를 더욱 감소시키고(예를 들면, 제오신의 경우, 가능하기는 블라스티시딘의 경우), 따라서 본 발명에 따른 선택 시스템의 엄격성을 증가시키는데 사용될 수 있다(예를 들면, 본 명세서에 참조로서 병합된 WO 2006/048459의 실시예 14를 참조).

선택가능한 마커 단백질을 암호화하는 제1 ATG(시작코돈)의 하류방향 서열에 돌연변이를 갖는 것을 제외하고는 기재된 바와 같은 어느 DNA 분자가 또한 사용될 수 있고 그러므로 또한 각각의 암호화된 선택가능한 마커 단백질이 여전히 활성인 한, 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 유전적 코드의 과잉 때문에 암호화된 단백질을 변화시키지 않는 어느 무증상 돌연변이가 또한 포함될 수 있다. 또한 온전한 아미노산 돌연변이를 가져오거나 또는 다른 돌연변이를 가져오는 추가의 돌연변이가, 암호화된 단백질이 여전히 활성인 한, 포함될 수 있고, 이것은 표시된 서열에 의해 암호화된 바와 같이 야생형 단백질의 활성보다 낮거나 또는 낮지 않을 수 있다. 특히, 암호화된 단백질은 각각의 표시된 서열에 의해 암호화된 단백질(예를 들면, 본 발명의 서열 목록에서 SEQ ID NOs. 68-80로 제공된 바와 같이)에 대해 적어도 70%, 바람직하기는 적어도 80%, 더욱 바람직하기는 적어도 90%, 더욱 바람직하기는 적어도 95% 동일한 것이 바람직하다. 선택가능한 마커 단백질의 활성에 대한 시험은 일상적인 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 면은 다중시스트론성 전사 유니트를 갖는, 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트를 제공하는 것이다. 이와 같은 발현 카세트는 예를 들면, 숙주 세포에서 관심의 서열을 발현하는데 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 발현 카세트는 발현이 요구되는 서열에 기능적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 핵산이다. 바람직하기는, 발현 카세트는 추가로 전사 종결과 폴리아데닐화 반응 서열을 함유한다. 인핸서와 같은 다른 조절 서열이 또한 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다음의 순서로 포함하는 발현 카세트를 제공한다: 5'-프로모터-본 발명에 따른 다중시스트론성 전사 유니트-전사 종결 서열-3'. 프로모터는 진핵 숙주세포에서 작용할 수 있고, 즉, 다중시스트론성 전사 유니트의 전사를 구동할 수 있어야 한다. 그러므로 프로모터는 다중시스트론성 전사 유니트에 기능적으로 연결된다. 발현 카세트는 임의로 본 분야에 알려진 다른 요소들, 예를 들면 인트론 등을 포함하기 위한 접합부위를 추가로 함유할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 인트론은 프로모터의 뒤 그리고 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 앞에 존재한다. IRES는 선택가능한 마커 폴리펩티드 암호화 서열을 함유하는 시스트론에 기능적으로 연결된다. 추가의 구현예에서, 제2의 선택가능한 마커를 암호화하기 위한 서열이 다중시스트론성 전사 유니트에 존재한다(즉, 이것은 이들 구현예에서 적어도 삼중시스트론성 전사 유니트이다). 그것의 바람직한 구현예에서, 제2 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 상기 서열은: a) 관심의 폴리펩티드의 것과 구별되는 전사 개시 서열을 갖고, b) 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 상기 서열의 상류에 위치하고, c) 상기 제2 선택가능한 마커 폴리펩티드의 시작코돈에 이어진 암호화 가닥에서 관심의 폴리펩티드의 시작 코돈까지 ATG 서열이 없고, 그리고 d) 비-최적 전사 시작 서열, 예를 들면, GTG 시작코돈 또는 TTG 시작코 돈을 갖는다. 이와 같은 구현예에서, 바람직한 선택가능한 마커 폴리펩티드는 5,6,7,8-테트라히드로폴레이트 합성 효소(dhfr)이다. 이것은, 실시예 2의 예시와 같이, 관심의 폴리펩티드의 고수준 발현을 연속적으로 선택할 수 있게 한다.

단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현을 얻기 위해, 본 분야의 당업자들에게 이와 같은 발현을 구동할 수 있는 서열이 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 기능적으로 연결되어 있고, 발현가능한 포맷에서 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 분자를 가져온다는 것이 잘 알려져 있다. 본 발명에서, 발현 카세트는 다중시스트론성 전사 유니트를 포함한다. 일반적으로, 프로모터 서열은 발현되어질 서열의 상류에 위치한다. 더 많이 사용된 발현벡터가 본 분야에 이용가능하고, 예를 들면, 인비트로겐의 pcDNA 및 pEF 벡터 시리즈, BD Sciences의 pMSCV와 pTK-Hyg, Stratagene 등의 pCMV-스크립트 등으로, 이것은 적합한 프로모터 및/또는 전사 종결 서열, polyA 서열 등을 얻는데 사용될 수 있다.

관심의 폴리펩티드를 암호화하는 서열이 암호화된 폴리펩티드의 전사 및 번역을 지배하는 서열에 대해 적절히 삽입된 경우, 생성된 발현 카세트는 발현으로 불리는, 관심의 폴리펩티드의 생산에 유용하다. 발현을 구동하는 서열은 프로모터, 인핸서 등, 그리고 그들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이들은 숙주세포에서 작용할 수 있어야 하고, 그것에 의해 그들에 기능적으로 연결된 핵산 서열의 발현을 구동한다. 본 분야의 당업자는 여러 프로모터가 숙주세포에서 유전자의 발현을 얻기 위해 사용된다는 것을 이해할 것이다. 프로모터는 본질적이거나 또는 조절되고, 바이러스, 원핵생물 또는 진핵생물 기원, 또는 인공적으로 고안된 것을 포함하여 여러 기원으로부터 얻을 수 있다. 관심의 핵산의 발현은 천연 프로모터 또는 그들의 유도체로부터 또는 전적으로 이형성 프로모터로부터 일 수 있다(Kaufman, 2000). 본 발명에 따르면, 진핵 세포에서 높은 전사 수준을 제공하는 강한 프로모터가 바람직하다. 적합한 프로모터는 당업자들에게 잘 알려져 있고 이용가능하고, 몇몇은 본 명세서에 참조로서 병합된 WO 2006/048459 (예를 들면, page 28-29)에 기재되어 있고, CMV 중간체 초기 (IE) 프로모터(CMV 프로모터로 명명) (예를 들면, pcDNA, Invitrogen으로부터 얻을 수 있다)와 다른 여러 가지를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 분자는 벡터의 일부, 예를 들면, 플라스미드이다. 이와 같은 벡터는 본 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 용이하게 조작되고, 예를 들면, 원핵 및/또는 진핵 세포에서 복제될 수 있도록 고안될 수 있다. 이에 더하여, 많은 벡터들이 직접적으로 또는 그로부터 단리된 원하는 단편의 형태로 진핵세포의 변형에 사용되고 그리고 이와 같은 세포의 게놈으로 전체 또는 일부가 병합되어, 그들의 게놈에 원하는 핵산을 포함하는 안정한 숙주세포를 가져온다.

통상의 발현 시스템은 재조합 플라스미드 또는 재조합 바이러스성 게놈 형태의 DNA 분자이다. 플라스미드 또는 바이러스성 게놈은 (진핵 숙주)세포에 도입되고 바람직하기는 본 분야에 알려진 방법에 의해 그들의 게놈에 병합되고, 그들의 여러 면은 본 명세서에 참조로서 병합된 WO 2006/048459 (예를 들면, page. 30-31)에 기재되어 있다.

크로마틴 구조와 다른 후생적 조절 메카니즘은 진핵세포에서의 트란스유전자 의 발현에 영향을 미칠 수 있다는 것이 널리 이해된다(예를 들면, Whitelaw et al, 2001). 본 발명에 따른 다중 시스트론성 발현 유니트는 오히려 엄격한 선택 상황을 갖는 선택 시스템의 일부를 형성한다. 이것은 일반적으로 선택의 숙주세포에서 높은 전사 수준을 요구한다. 엄격한 선택 상황을 생존하는 숙주세포의 클론을 발견할 기회를 증가시키기 위해, 그리고 가능하기는 얻어진 클론에서 발현의 안정성을 증가시키기 위해, 전사의 예측가능성을 증가시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 추가로 적어도 하나의 크로마틴 조절 요소를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 크로마틴 조절 요소는 크로마틴 구조 및 진핵세포 내에서 그들의 부근(그들은 '인 시스' 작용을 하고, 그러므로 트란스 유전자로부터 바람직하기는 5kb 이내, 더욱 바람직하기는 2kb 이내, 더욱 바람직하기는 1kb 이내에 놓인다)에서 발현수준 및/또는 트란스유전자의 발현 안정성에 어느 정도 영향을 미칠 수 있다. 이와 같은 요소들은 때때로 원하는 수준의 트란스 유전자 발현을 갖는 클론의 수를 증가시키는데 사용되었다. 본 명세서에 따라 사용될 수 있는 이와 같은 요소들의 몇몇 타입은, 본 명세서에 참조로서 병합된 WO 2006/048459(예를 들면, page 32-34)에 기재되고, 그리고 본 발명의 목적을 위해, 크로마틴 조절 요소는, 매트릭스 또는 골격 부착 영역(MARs/SARs), 베타-글로빈 절연체 요소(닭 베타-글로빈 로커스의 5'HS4), scs, scs' 등과 같은 절연체, 편재성 크로마틴 개방 요소(UCOE), 및 항-억제제 서열(또한, 'STAR' 서열로도 불리운다)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하기는, 상기 크로마틴 조절 요소는 항-억제제 서열이고, 바람직하기 는: a) SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66 중 어느 하나; b) SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66 중 어느 하나의 단편 (여기서 상기 단편은 항-억제제 활성을 갖는다) ('기능적 단편'); c) 뉴클레오티드 서열에서 a) 또는 b)와 적어도 70% 동일한 서열 (여기서 상기 서열은 항-억제 활성을 갖는다) ('기능적 단편'); 및 d) a) 내지 c) 중 어느 하나의 보체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하기는, 상기 크로마틴 조절 요소는 STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), STAR9 (SEQ. ID. NO. 9), STAR17 (SEQ. ID. NO. 17), STAR27 (SEQ. ID. NO. 27), STAR29 (SEQ. ID. NO. 29), STAR43 (SEQ. ID. NO. 43), STAR44 (SEQ. ID. NO. 44), STAR45 (SEQ. ID. NO. 45), STAR47 (SEQ. ID. NO. 47), STAR61 (SEQ. ID. NO. 61), 또는 상기 STAR 서열의 기능적 단편 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 STAR 서열은 STAR 67 (SEQ. ID. NO. 66) 또는 그것의 기능적 단편 또는 유도체이다. 특정의 바람직한 구현예에서, STAR 67 또는 그것의 기능적 단편 또는 유도체는 다중시스트론성 전사 유니트의 발현을 구동하는 프로모터의 상류에 위치한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 적어도 하나의 항-억제제 서열에 의해, 예를 들면, 두 측면에서 SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 65 중 하나에 의해, 바람직하기는 각각이 전사 유니트를 향하고 있는 이들 서열의 3' 말단에 의해 두 측면에서 모두 플랭크된다. 특정 구현예에서, 5'에서 3'의 순서로: 항-억제제 서열 A - 항-억제제 서열 B -[프로모터 - 본 발명에 따른 다중시스트론성 전사 유니트(관심의 폴리펩티드 및 그것의 하류의 기능적으로 선택가능한 마커 단백질을 암호화하는) - 전사 종결 서열] - 항-억제제 서열 C (여기서, A, B 및 C는 같거나 또는 다르다)를 포함하는, 본 발명에 따른 발현 카세트가 제공된다.

본 발명에 유용한, 항-억제제 활성(항-억제제 서열)을 갖는 서열 및 그것의 특질, 뿐 아니라 그것의 단편 또는 유도체의 기능, 그들의 구조적 및 기능적 정의, 그리고 그들을 얻는 그리고 사용하는 방법이 본 명세서에 참조로 병합된 WO 2006/048459 (예를 들면, page 34-38)에 기재되어 있다.

다중합체 단백질을 생산하기 위해, 2개 이상의 발현 카세트가 사용될 수 있다. 바람직하기는, 두 발현카세트 모두가 본 발명에 따른 다중시스트론성 발현 카세트이고, 각각은 다른 선택가능한 마커 단백질을 암호화하여, 두개의 발현 카세트에 대한 선택이 가능하다. 이 구현예는 예를 들면 항체의 중사슬 및 경사슬의 발현에 대해 양호한 결과를 주는 것으로 증명되었다. 둘 다의 발현 카세트는 이들이 숙주세포에 도입되기 전에, 하나의 핵산에 놓일 수 있고 또는 개별적인 핵산 분자에 존재할 수 있다. 이들을 하나의 핵산 분자에 놓는 것의 이점은 두 발현 카세트가 숙주세포에 도입될 때 단일의 미리 정해진 비율 (예를 들면, 1:1)로 존재하는 것이다. 한편, 두 개의 다른 핵산 분자에 존재하는 경우에는, 그들을 숙주세포에 도입할 때 두 개의 발현 카세트의 몰비를 변화시키는 것이 가능하고, 이것은 바람직한 몰 비가 1:1과 다르거나 바람직한 몰비를 미리 알지 못할 때 유리하고, 따라서 그것의 변화 및 최적의 실험적 발견은 당업자에게 쉽게 수행될 수 있다. 본 발명에 따라, 바람직하기는 발현카세트의 적어도 하나, 더욱 바람직하기는 그들 각각은 크로마틴 조절요소, 더욱 바람직하기는 항-억제제 서열을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 다중합성 단백질의 다양한 서브유니트 또는 일부가 단일 발현 카세트 상에 존재한다.

발현 카세트와 결합된 항-억제제의 유용한 배열은 본 명세서에 참조로 병합된 WO 2006/048459 (예를 들면, page 40 참조)에 기재되어 있다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 유니트 또는 발현 카세트가 제공되고, 이것은 추가로 본 명세서에 참조로 병합된 WO 2006/048459의 page 40-41에 본질적으로 기재된 바와 같은, 전사 휴지(TRAP) 서열을 포함한다. TRAP 서열의 비-제한적 예는 SEQ. ID. NO. 81로 주어진다. 다른 TRAP 서열, 이들을 찾기 위한 방법, 및 그들의 용도에 대한 예는 WO 2004/055215에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 다중시스트론성 전사 유니트 및/또는 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자는 바람직하기는 숙주세포에서 핵산의 발현을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "세포"/"숙주세포" 및 "세포주"/"숙주세포주"는 각각 본 분야에 알려진 방법에 의해 세포 배양에 유지될 수 있고, 그리고 이형 또는 동형 단백질을 발현하는 능력을 갖는 세포 및 그들의 동형의 개체군으로 정의된다.

사용될 수 있는 여러 예시적인 숙주 세포는 본 명세서에 참조로서 병합된 WO 2006/048459 (예를 들면, page 41-42)에 기재되어 있고, 이와 같은 세포는 예를 들면, dhfr^- 표현형을 갖는 CHO 세포를 포함하여 CHO 세포, 예를 들면, CHO-K1, CHO-S, CHO-DG44, CHO-DUKXB11, 뿐 아니라 골수종 세포(예를 들면, Sp2/0, NS0), HEK 293 세포, 및 PER.C6 세포를 포함하여, 포유동물의 세포를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

이와 같은 진핵 숙주세포는 필요한 폴리펩티드를 발현할 수 있고 그 목적을 위해 종종 사용된다. 이들은 본 발명의 DNA 분자를, 발현 카세트의 형태로, 세포에 도입시킴으로써 얻을 수 있다. 바람직하기는, 발현 카세트는 숙주세포의 게놈에 병합되고, 이것은 여러 숙주세포의 다른 위치에 있을 수 있고, 선택은 트란스유전자가 적절한 위치에 병합된 클론을 제공하여, 발현 수준, 안정성, 성장 특질 등의 면에서 원하는 특성을 갖는 숙주 세포 클론을 가져올 수 있다. 선택적으로 다중시스트론성 전사 유니트는 표적화하여 또는 임의로, 전사적으로 활성인 염색체 영역, 예를 들면 게놈에 존재하는 프로모터의 뒤에 병합되도록 선택될 수 있다. 본 발명의 DNA를 함유하는 세포의 선택은, 본 분야의 당업자에 의해 알려진 통상의 방법을 사용하여 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대해 선택함으로써 수행될 수 있다. 이와 같은 다중시스트론성 전사 유니트가 게놈의 프로모터 뒤에 병합되면, 본 발명의 발현 카세트는 그 자리에서, 즉 숙주세포의 게놈 내에서 생성될 수 있다.

바람직하게, 숙주세포는 본 분야의 당업자에게 알려진 표준 공정에 따라 선택되고 증식될 수 있는 안정한 클론에서 나올 수 있다. 이와 같은 클론의 배양은, 세포가 본 발명의 다중시스트론성 전사 유니트를 포함한다면, 관심의 폴리펩티드를 생성할 수 있다.

세포에서 발현되어질 핵산의 도입은 여러 방법 중 하나에 의해 실시될 수 있고, 이것은 도입될 핵산의 포맷에 따라, 본 발명의 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 방법은 트란스펙션, 감염, 삽입, 변형 등을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것 은 아니다. 관심의 폴리펩티드를 발현하는 적합한 숙주 세포는 선택에 의해 얻어질 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 다중시스트론성 전사 유니트를, 바람직하기는 발현 카세트의 형태로 포함하는 DNA 분자는 본 발명에 따른 진핵 숙주 세포로 변합된다. 이것은 다중시스트론성 전사 유니트의 안정한 유전성을 제공할 것이다.

선택가능한 마커 폴리펩티드의 존재를 위한, 그리고 따라서 발현을 위한 선택은 세포의 초기 획득 중에 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 선택제는 선택가능한 마커 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택하기에 충분한 농도로 또는 낮은 농도로, 배양 시간의 적어도 일부에 배지 중에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 선택제는 폴리펩티드가 발현될 때 생산 단계 중 배지에 더 이상 존재하지 않는다.

본 발명에 따른 관심의 폴리펩티드는 어느 단백질일 수 있고, 그리고 단일중합성(monomeric) 단백질 또는 다중합성 단백질(의 일부)일 수 있다. 다중합성 단백질은 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 본 발명에 따른 관심의 폴리펩티드의 비-제한적 예는 효소, 호르몬, 면역글로불린 사슬, 항암 단백질과 같은 치료적 단백질 인자 VIII와 같은 혈액응고 단백질, 에리트로포이에틴과 같은 다-기능성 단백질, 진단 단백질, 또는 백신화 목적에 유용한 단백질 또는 그것의 단편이고, 모두 본 분야의 당업자에게 알려져 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 발현 카세트는 면역글로불린 중사슬 또는 경사슬 또는 그들의 항원 결합 부분, 유도체 및/또는 동형체를 암호화한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 단백질 발현 유니트가 제공되고, 여기서 상기 관심의 단백질은 면역글로불린 중사슬이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 단백질 발현 유니트가 제공되고, 여기서 상기 관심의 단백질은 면역글로불린 경사슬이다. 이들 두 단백질 발현 유니트가 동일한 (숙주) 세포에 존재할 때, 다중합성 단백질과 더욱 특별히는 면역글로불린이 조립된다. 따라서 특정 구현예에서, 관심의 단백질은 항체와 같은 면역글로불린이고, 이것은 다중합성 단백질이다. 바람직하기는, 이와 같은 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 그것의 특정 구현예에서, 이것은 IgG, IgA, 또는 IgM 항체이다. 면역글로불린은 다른 발현 카세트 상에서 또는 단일 발현 카세트 상에서 중사슬 및 경사슬에 의해 암호화될 수 있다. 바람직하기는, 중사슬과 경사슬은 각각 개별적인 발현 카세트에 존재하고, 각각은 자신의 프로모터를 갖고(두 개의 발현 카세트에 대해 같거나 또는 다를 수 있다), 각각은 본 발명에 따른 다중시스트론성 전사 유니트를 포함하고, 중사슬과 경사슬은 관심의 폴리펩티드이고, 바람직하기는 각각 다른 선택가능한 마커 단백질을 암호화하여, 두 중사슬과 경사슬 발현 카세트 모두는 발현카세트가 진핵 숙주세포에 도입 및/또는 존재할 때 수행될 수 있다.

관심의 폴리펩티드는 어느 기원으로부터일 수 있고, 특정 구현예에서는 포유동물 단백질, 인공 단백질(예를 들면, 융합 단백질 또는 돌연변이 단백질), 그리고 바람직하기는 인간 단백질이다.

명백하게, 본 발명의 발현 카세트의 배열은, 궁극적 목적이 관심의 폴리펩티드의 생산이 아니고, RNA 자체일 때 사용될 수 있는 것으로, 예를 들면, 발현카세트로부터 RNA의 증가된 양을 생산하는 것으로, 이것은 다른 유전자의 조절(예를 들 면, RNAi, 안티센스 RNA), 유전자 치료법, 인비트로 단백질 생성 등의 목적으로 사용될 수 있다.

한 면에서, 본 발명은 관심의 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 복수 개의 전구체 세포에 DNA 분자 또는 본 발명에 따른 발현 카세트를 도입하고, 선택된 조건하에서 생성된 세포를 배양하고 그리고 관심의 폴리펩티드를 생성하는 적어도 하나의 숙주세포를 선택하는 것을 포함한다. 이러한 신규의 방법의 이점은 본 명세서에 병합된 WO 2006/048459 (예를 들면, page 46-47)에 기재된 선택적 방법에 대한 기재와 유사하다.

상대적으로 적은 사본 수의 다중시스트론성 전사 유니트와 고발현 수준을 갖는 클론을 얻을 수 있는 반면, 본 발명의 선택 시스템은 발현 수준을 더욱 개선하기 위해 증폭법과 결합할 수 있다. 이것은, 예를 들면 메토트렉세이트를 이용한 공동-집적된 dhfr 유전자의 증폭에 의해, 예를 들면 본 발명의 다중시스트론성 전사 유니트와 동일한 핵산 분자에 dhfr을 놓음으로써, 또는 dhfr이 개별적인 DNA 분자에 있을 때 공동-트란스펙션에 의해 수행될 수 있다. dhfr 유전자는 또한 본 발명의 다중시스트론성 발현 유니트의 일부일 수 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 관심의 폴리펩티드의 제조방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 숙주세포를 배양하는 것을 포함한다.

세포를 배양하는 것은 세포가 대사, 및/또는 성장 및/또는 분할 및/또는 관심의 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 행해진다. 이것은 본 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있고, 세포에 영양을 제공하는 것을 포함하지만, 이 것으로 제한되는 것은 아니다. 본 방법은 표면에 부착된 성장, 현탁물 중의 성장 또는 이들의 결합을 포함한다. 배양은 예를 들면, 접시, 회전병 또는 생물반응기에서, 배치, 공급-배치, 살포 시스템과 같은 연속 시스템 등을 이용하여 행해질 수 있다. 세포배양을 통해 재조합 단백질을 대량 (연속) 생산하기 위해, 현탁물 중 성장할 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하고, 동물- 또는 인간-유래 혈청 또는 동물- 또는 인간-유래 혈청 성분의 부재 중에 배양될 수 있는 것이 바람직하다.

세포의 성장 또는 복수화의 조건(예를 들면, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973) 참조)과 재조합 산물의 발현 조건은 본 분야의 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로, 포유동물 세포 배양의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜, 및 실제적 기술들은 Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991)에서 찾을 수 있다.

바람직한 구현예에서, 발현 단백질은 세포로부터 또는 배지로부터 또는 두개 모두로부터 수집(단리)된다. 그리고 나서 공지의 방법, 예를 들면 여과, 칼럼크로마토그래피 등과 같은 공지의 방법을 사용하여, 본 분야의 당업자에게 일반적으로 알려진 방법에 의해 더욱 정제될 수 있다.

본 발명에 따른 선택법은 크로마틴 조절 요소가 없을 때 얻어지고, 그러나 개선된 결과는 다중시스트론성 발현 유니트가 이와 같은 요소로 제공될 때 얻어진다. 본 발명에 따른 선택법은 적어도 하나의 항-억제제 서열을 포함하는 본 발명에 따른 발현 카세트가 사용될 때 특히 잘 작업된다. 선택 약제와 조건에 따라, 선택 은 특정 경우에 매우 엄격하여, 항-억제제 서열이 존재하지 않는 한, 선택을 견기는 숙주세포는 거의 없거나 또는 전혀 없다. 따라서, 신규의 선택방법과 항-억제제 서열의 결합은, 그 안에 관심의 폴리펩티드의 고발현 기회가 크게 증가한 콜로니의 제한된 수를 얻는데 매력적인 방법을 제공하는 반면, 동시에 항-억제제 서열을 갖는 발현 카세트를 포함하는 얻어진 클론은 관심의 폴리펩티드의 안정한 발현을 제공하고, 즉 그들은 통상의 발현 카세트보다 발현을 낮추는 침묵 또는 다른 메카니즘의 경향이 덜하다.

본 발명의 한 면은 WO 2006/048459에 기재된 배열과 비교하여 대체의 배열을 갖는 다중시스트론성 전사 유니트를 제공하고: 본 발명의 대체의 배열에서, 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 상류에 있고, 그리고 선택가능한 마커 폴리펩티드는 캡-독립적 번역 개시 서열, 바람직하기는 내부 리보솜 엔트리 부위(IRES)에 기능적으로 연결된다. 이와 같은 다중시스트론성 전사 유니트가 알려져 있지만(예를 들면, Rees et al, 1996, WO 03/106684), 비-ATG 시작코돈에 결합되지 않았다. 본 발명의 선택적인 면에 따라, 선택가능한 마커 폴리펩티드의 시작코돈은 비-ATG 시작코돈으로 변하였고, 더욱 선택가능한 마커에 대한 번역 개시 속도를 더욱 감소시킨다. 그러므로, 이것은 선택가능한 마커 폴리펩티드의 원하는 감소된 발현 수준을 가져오고, WO 2006/048459에 기재된 구현예와 마찬가지로, 관심의 폴리펩티드를 고수준으로 발현하는 숙주세포를 매우 효율적으로 선택할 수 있게 한다. WO 2006/048459에 약술된 구현예와 비교하여, 본 발명의 이 대체적인 면의 하나의 잠재적 이점은, 그 안의 내부 ATG 서열 이, 추가의 하류방향 폴리펩티드의 번역에 더 이상 관여하지 않기 때문에 손상됨 없이 남을 수 있으므로, 항 선택가능한 마커 폴리펩티드의 암호화 서열이 내부 ATG 서열의 추가 변형을 필요로 하지 않는다는 것이다. 특히 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 암호화 서열이 여러 내부 ATG 서열을 함유할 때 유리하고, 이들을 변화시키고 생성된 구조를 기능성에 대해 시험하는 노력이 본 발명에 대해 수행되어야만 하는 것이 아니기 때문이다: 이 경우 ATG 시작 코돈의 돌연변이만이 충분하다. 본 발명에 의해 제공된 이 대안은 또한 매우 양호한 결과를 가져왔다는 것이 아래(실시예 1)에 나타내었다.

본 발명의 DNA 분자에서 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 암호화 서열은 IRES의 번역 조절하에 있고, 여기서, 관심의 단백질의 암호화 서열은 바람직하기는 캡-의존 방법으로 번역된다. 관심의 폴리펩티드에 대한 암호화서열은 시작코돈을 포함하여, 제1 시스트론의 번역은 IRES의 상류를 끝내고, 이 IRES는 제2 시스트론에 기능적으로 연결된다.

본 명세서를 읽은 후 당업자에게 쉽게 이해될 수 있는 바와 같이, 이들 다중시스트론성 발현 유니트의 대부분은 유리하기는 관심의 폴리펩티드와 선택가능한 마커 폴리펩티드(즉, 본 명세서에 참조로 병합된 WO 2006/048459의 다중시스트론성 전사 유니트)에 대한 암호화 서열의 반대 순서를 갖는 다중시스트론성 발현 유니트에 관하여 동일한 라인을 따라 변할 수 있다. 예를 들면, 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 바람직한 시작코돈, 발현 카세트로의 병합, 숙주 세포, 프로모터, 크로마틴 조절 요소의 존재 등은 변할 수 있고 바람직한 구현예에서 상기와 같이 사 용될 수 있다. 또한, 다중시스트론성 발현 유니트와 발현 카세트의 사용은 상기와 같다. 그러므로, 이면은 병합된 WO 2006/048459에 기재된 수단과 방법에 대한 용이한 대안이고, 중요한 차이는 다중시스트론성 발현 유니트의 폴리펩티드의 순서가 반대이고, IRES가 선택가능한 마커 폴리펩티드의 번역에 요구된다는 것이다.

여기서 사용된 바에 따르면, "내부 리보솜 엔트리 부위" 또는 "IRES"는 시작 코돈으로의 직접 내부 리보솜 엔트리를 촉진하는 요소로, 일반적으로 ATG이지만, 본 발명에서는 시스트론의 GTG 또는 TTG이고(단백질 암호화 영역), 그것에 의해 유전자의 캡-독립적 번역을 가져온다. 예를 들면, Jackson R J, Howell M T, Kaminski A (1990) Trends Biochem Sci 15 (12): 477-83) 및 Jackson R J and Kaminski, A. (1995) RNA 1 (10): 985-1000을 참조. 본 발명은 캡-독립적 번역 개시 서열, 특히 시스트론의 개시코돈으로의 직접 개시 리보솜 엔트리를 촉진할 수 있는 어느 IRES의 사용을 포함한다. 여기서 사용되는 바에 따르면 "IRES의 번역 조절 하에서"는 번역이 IRES와 연관되고 캡-독립적 방법으로 진행된다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바에 따르면, 용어 "IRES"는 변화가 시스트론의 개시 코돈으로 직접 내부 리보솜 엔트리를 촉진할 수 있는 한 IRES 서열의 기능적 변화를 포함한다. 여기서 사용되는 바에 따르면, "시스트론"은 관심의 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 말한다. "기능적으로 연결된"은 기재된 성분들이 그들의 의도된 방법으로 작용하도록 허용하는 관계인 상황을 말한다. 그러므로, 예를 들면, 시스트론에 "기능적으로 연결된"은 시스트론의 발현이 프로모터와 양립가능한 조건에서 얻어지는 방법으로 결찰된다. 유사하기 는, 시스트론에 기능적으로 연결된 IRES의 뉴클레오티드 서열은 시스트론의 번역이 IRES와 양립가능한 조건하에서 얻어지는 방법으로 결찰된다.

내부 리보솜 결합 부위(IRES) 요소는 바이러스와 포유동물 유전자로부터 알려지고(Martinez-Salas, 1999), 그리고 작은 합성 올리고뉴클레오티드의 스크린으로 동정되어왔다(Venkatesan & Dasgupta, 2001). 뇌척수 심근염 바이러스로부터의 IRES는 상세히 분석되어졌다(Mizuguchi et al., 2000). IRES는 전사된 RNA의 구조를 가져오는 DNA에 암호화된 요소로, 여기서 진핵성 리보솜은 결합되고 번역을 개시할 수 있다. IRES는 두 개 이상의 단백질이 단일 RNA 분자로부터 생산되도록 한다(제1 단백질은 그것의 5' 터미날의 캡 구조에서 RNA에 결합되는 리보솜에 의해 번역된다(Martinez-Salas, 1999)). IRES 요소로부터의 단백질의 번역은 캡-의존 번역보다 덜 효율적이다: IRES-의존 개방형 해독틀(ORF)로부터의 단백질의 양은 제1 ORF로부터의 양의 20% 미만 내지 50%의 범위이다(Mizuguchi et al., 2000). IRES-의존 번역의 감소된 효율은 본 발명의 이 구현예에 의해 이용되는 장점을 제공한다. 더우기, IRES 요소의 돌연변이는 그들의 활성을 감쇄시킬 수 있고, IRES-의존 ORF로부터의 발현을 제1 ORF의 10% 이하로 줄일 수 있다(Lopez de Quinto & Martinez-Salas, 1998, Rees et al., 1996). 그러므로, 본 분야의 당업자에게 IRES의 기능의 본질을 변화시킴 없이 IRES에 대한 변화를 가져올 수 있고 (따라서, 감소된 번역 효율을 갖는 단백질 번역 개시 부위를 제공), 이것은 변형된 IRES를 가져온다는 것은 명백하다. 그러므로, 여전히 (5' 캡 번역과 비교하여) 적은 비율의 번역을 제공할 수 있는 변형된 IRES의 사용은 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 선택가능한 마커 ORF의 번역 개시를 상당히 추가로 감소시키고, 그것과 함께 바람직한 숙주 세포를 얻는, 즉 숙주세포가 관심의 재조합 단백질의 고발현하는 기회를 더욱 개선하기 위해 비-ATG 시작코돈을 사용한다.

미국 특허 5,648,267 및 5,733,779는 손상된 컨센서스 코작 서열([Py]xxATG[Py], 여기서 [Py]는 피리미딘 뉴클레오티드이고 (즉, C 또는 T), x는 뉴클레오티드이고(즉, G, A, T, 또는 C), 그리고 ATG 시작코돈은 밑줄그었다)을 갖는 우세한 선택가능한 마커 서열의 사용을 기재한다. 미국 특허 6,107,477는 선택가능한 마커 유전자의 비-최적 코작 서열의 사용을 기재한다(AGATCTTTATGGACC, 여기서, ATG 시작코돈은 밑줄그었다). 이들 중 어느 것도 비-ATG 시작코돈의 사용을 기재하지 않고, 그것을 제안하지도 않았다. 더우기, 그들은 IRES와의 결합도 언급하지 않았다. 더우기, IRES 자체는 이미 캡-의존 번역과 비교하여 감소되었기 때문에, IRES와 선택가능한 마커에 대한 비-ATG 시작코돈의 결합이 선택가능한 마커 폴리펩티드의 충분한 번역이 그것의 어느 선택가능한 수준을 제공하는지를 본 발명 보다 앞서 예상할 수 없었다. 본 발명은 또한 이 경우를 나타내고, 놀랍게도 효율적인 선택 시스템을 제공한다.

본 발명은 또한 IRES 서열에 기능적으로 연결된 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대해 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공하고, 여기서 선택가능한 마커에 대해 암호화하는 암호화 서열은 a) GTG 시작 코돈; b) TTG 시작 코돈; c) CTG 시작 코돈; d) ATT 시작 코돈; 그리고 e) ACG 시작 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된 번역 시작 서열을 포함한다.

당업자는 예를 들면 본 명세서에 참조로 병합된 US 2006/0195935, 특히 실시예 20 ~27에 제공된, 본 발명의 추가의 변경이 가능하다는 것을 이해할 것이다.

특정 구현예에서, 효소 디히드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 합성하는 포유동물 5,6,7,8-테트라히드로폴레이트는, 배지에서 히포크산틴과 티미딘(그리고 바람직하기는 글리신)을 생략함으로써 그리고 폴레이트 (또는 디히드록시폴릭산)를 배지에 포함함으로써, a dhfr ^- 표현형을 갖는 세포에서 선택 마커로 사용될 수 있다(예를 들면, CHO-DG44 세포)(Simonsen et al, 1988). dhfr 게놈 유전자는 예를 들면, 마우스 게놈 또는 마우스 cDNA로부터 유래될 수 있고, 그리고 바람직하기는 GTG 또는 TTG 시작코돈을 제공함으로써 본 발명에 따라 사용될 수 있다(dhfr 게놈의 서열에 대해 SEQ. ID. NO. 73을 참조). 이들 구현예 모두에서, '배지로부터 생략하여'는 배지가 표시된 성분(들)을 필수적으로 갖지 않아야 한다는 것으로, 배지에 세포의 성장을 지지하기 위해 존재하는 표시성분이 불충분하고, 따라서 양호한 선택은 표시된 효소에 대한 유전 정보가 세포에 발현되고 표시된 전구체 성분이 배지에 있을 때 가능하다는 것을 의미한다. 예를 들면, 표시된 성분은 특정 세포형에 대한 배지에 일반적으로 사용되는 성분의 농도의 0.1% 미만의 농도로 존재한다. 바람직하기는, 표시된 성분은 배지에 존재하지 않는다. 표시 성분이 부족한 배지는 당업자에 의해 표준 방법에 따라 제조될 수 있거나 또는 시판 매질 공급자로부터 얻을 수 있다. 선택가능한 마커 폴리펩티드로서 이들 타입의 대사성 효소의 사용의 잠재적 이점은 이들을 연속 선택하에서 다중시스트론성 전사 유니트를 유지하는데 사용 할 수 있고, 이것은 관심의 폴리펩티드의 고발현을 가져온다는 것이다.

또 다른 면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 다중시스트론성 전사 유니트에 추가의 선택마커로서 dhfr 대사성 선택마커를 사용한다. 이와 같은 구현예에서, 고발현을 갖는 숙주세포 클론의 선택은 예를 들면 항생물질 선택 마커, 예를 들면, 제오신, 네노마이신 등의 사용에 의해 우선 확립되고, 그것의 암호화 서열은 본 발명에 따른 GTG 또는 TTG 시작코돈을 가질 것이다. 적합한 클론의 선택 후, 항생물질 선택이 중단되고, 대사성 효소 선택을 이용한 연속적 또는 간헐적 선택이 상기의 적합한 동정된 성분이 부족하고 상기의 적합한 전구체 성분을 함유하는 매질에서 세포를 배양함으로써 수행될 수 있다. 이 면에서, 대사성 선택마커는 IRES에 기능적으로 연결되고, 정상적인 ATG 내용물을 가질 수 있고, 시작코돈은 GTG 또는 TTG로부터 적절히 선택된다. 이 면에서 다중 시스트론성 전사 유니트는 적어도 삼중시스트론성이다.

본 발명의 실시는 다른 언급이 없는 한, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상의 기술을 적용할 것이고, 이것은 본 분야에 속한다 (예를 들면, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al, eds, 1987; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds, 1988를 참조 하라).

본 발명은 다음의 실시예에서 더욱 설명된다. 실시예들은 어느 방법으로도 본 발명을 제한하지 않는다. 그들은 단지 본 발명을 명확히 하기 위한 것이다.

실시예

실시예 1은 본 발명의 다중시스트론성 전사 유니트를 갖는 선택 시스템을 기재하고, 또한 본 명세서에 참조로서 병합된 WO 2006/048459의 실시예 8~26에 기재된 변화를 본 발명의 다중시스트론성 전사 유니트에 대해 적용하고 시험할 수 있다는 것은 명백하다.

실시예 1 : 변형된 제오신 내성 유전자를 IRES 서열 뒤에 놓음에 의한 엄격한 선택

WO 2006/048459의 실시예 8-26(모두 본 명세서에 참조로서 병합되어 있다)는 선택가능한 마커 단백질을 암호화하는 서열이 다중시스트론성 전사 유니트의 관심의 단백질을 암호화하는 서열의 상류인 선택 시스템을 나타내고, 여기서 선택가능한 마커의 번역 개시 서열은 비-최적이고, 그리고 추가로 내부 ATG는 선택할 수 있는 마커 암호화 서열로부터 제거된다. 이 시스템은 매우 엄격한 선택 시스템을 가져온다. 예를 들면, 번역 개시 코돈이 TTG로 변하는 Zeo 선택마커는 매우 높은 번역 엄격성을 제공하는 것으로 나타났고, 관심의 암호화된 하류의 단백질의 매우 낮은 발현을 가져온다.

또 다른 가능한 선택 시스템에서 (즉, 본 발명의 시스템), 선택 마커, 즉 Zeo는 IRES 서열의 하류에 놓인다. 이것은 Zeo 유전자 산물이 IRES-의존 개시에 의 해 번역되는 다중시스트론성 mRNA를 생성한다. 통상의 d2EGFP-IRES-Zeo 구조물(즉, 선행기술의 구조물, 예를 들면, WO 2006/005718)에서, Zeo 시작코돈은 최적 ATG이다. 본 발명자들은 Zeo ATG 시작 코돈을 예를 들면, (IRES-TTG Zeo로 언급되는) TTG로 변경하는 것이 통상의 IRES-ATG Zeo과 비교하여 증가된 선택 엄격성을 가져오는지를 시험하였다.

결과

사용된 구조물은 도 1에 개략적으로 나타내었다. 조절 구조물은 CMV 프로모터, d2EGFP 유전자, IRES 서열(이 실시예에서 사용된 IRES의 서열 (Rees et al, 1996)은:GCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCCCGGGATA; SEQ. ID. NO. 82), 및 TTG Zeo 선택 마커, 즉 TTG 시작 코돈을 갖는 제오신 내성 유전자('d2EGFP-IRES-TTG Zeo')로 이루어졌다. 다른 구조물은 발현 카세트의 상류에 놓인 STAR 7과 STAR 67의 조합물 및 카세트 하류의 STAR 7를 갖는 것을 제외하고는 동일하다('STAR7/67 d2EGFP-IRES-TTG Zeo STAR7'). 두 구조물 모두는 CHO-K1 세포 로 트란스펙트되고 선택은 배지 중의 100㎍/㎖ 제오신으로 수행되었다. 4개의 클로니가 대조 구조물로 트란스펙션 후 나타났고 6개가 STAR 함유 구조물로 나타났다. 이들 독립적인 클로니들을 단리하고 d2EGFP 발현 수준의 분석 전에 증식시켰다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 구조물에서 STAR 요소의 병합은 높은 d2EGFP 발현수준을 갖는 콜로니들을 형성시켰다. STAR 요소가 없는 대조 콜로니 중에서('d2EGFP-IRES-TTG Zeo') 오직 하나의 콜로니만이 약간의 d2EGFP의 발현을 보였다. 발현 수준은 또한, STAR 요소를 갖거나 갖지 않는, 표준 ATG 시작코돈을 갖는 정상 Zeo를 갖는 IRES를 함유하는 다른 대조 구조물로 얻은 것보다 훨씬 높았다 ('d2EGFP-IRES-ATG Zeo' 및 STAR 7/67 d2EGFP-IRES-ATG Zeo STAR7'; 또한 이들 ATG Zeo 구조물에서, STAR 요소의 효과가 강화되었고, 그러나 신규한 TTG Zeo 변이체와 비교하여 온순하였다).

이 결과는 TTG 시작코돈을 갖는 Zeo 선택 마커를 IRES 서열의 하류방향에 놓는 것은, STAR 요소와 결합하여, 엄격한 선택 시스템을 잘 작동시키고 확립한다는 것을 나타낸다.

이들 자료와 WO 2006/048459의 실시예 8 ~26 및 US 2006/0195935의 실시예 20~27로부터, 마커는 WO 2006/048459의 실시예 8 ~26 및 US 2006/0195935의 실시예 20~27의 동일한 세포주에서 변할 수 있다는 것이 명백하다. 예를 들면, TTG 시작코돈 대신에, GTG 시작코돈이 사용될 수 있고, 마커는 Zeo에서 다른 마커, 예를 들면, Neo, Blas, dhfr, puro 등으로 변할 수 있고, 모두 시작코돈으로 GTG 또는 TTG를 갖는다. STAR 요소는 다른 STAR 서열 또는 그것의 다른 배치를 사용함에 의해, 또는 그들은 다른 크로마틴 대조 요소, 예를 들면 MAR 서열로 대체함에 의해 변할 수 있다. 이것은 정상 ATG 시작코돈을 갖는 마커로 IRES를 갖는 선행기술의 선택 시스템을 넘는 개선을 가져온다.

비-제한 실시예로서, 변형된 Zeo 내성 유전자(TTG Zeo) 대신에, 변형된 네오마이신 내성 유전자가 IRES 서열의 하류방향에 놓인다. 변형은 TTG Neo를 생성하는, Neo 암호화 서열의 ATG 번역 개시 코돈의 대체로 이루어진다. STAR 요소에 의해 둘러싸이거나 또는 둘러싸이지 않은 V-d2EGF-IRES-TTG Neo 구조물은 CHO-K1 세포로 트란스펙션된다. 콜로니들을 선택하고, 세포를 증식시키고 d2EGFP 값을 측정한다. 이것은('IRES-TTG Neo') IRES('IRES-ATG-Neo')의 ATG 시작코돈 하류에 Neo를 갖는 공지의 선택 시스템을 넘는 개선을 가져온다. 개선은 본질적으로 TTG Neo 구조물이 STAR 요소를 포함할 때 명백하다.

실시예 2: 변형된 dhfr 유전자를 IRES 서열 뒤에 놓음에 의한 발현의 안정성

제오신 선택 마커의 번역 개시 코돈을, 통상의 ATG 코돈보다 훨씬 덜 자주 사용되는 번역 개시 코돈으로 변형시키는 것은 매우 엄격한 선택 시스템을 가져온다. WO 2006/048459의 기재된 선택 시스템에서, TTG Zeo는 관심의 유전자의 상류에 놓인다. 또 다른 가능한 선택 시스템에서, Zeo 선택 마커는 IRES 서열의 하류에 놓인다(본 출원, 실시예 1 참조). 이것은 IRES 서열의 번역 개시 코돈으로부터 Zeo 유전자 산물이 번역되는 이중시스트론성 mRNA를 생성한다.

이 실험에서, 본 발명자들은 이들 두 시스템의 구현예를 결합하였다. 본 발명자들은 리포터 유전자의 상류에 TTG 마커를 놓고 GTG 또는 TTG 변형 대사성 마커 는 IRES와 리포터 유전자에 결합하였다. 제오신과 네오마이신 내성 유전자 뿐 아니라 dhfr 유전자와 같은, 다양한 선택 마커 유전자를 사용할 수 있다. 여기서, 본 발명자들은 변형된 제오신 내성 유전자, TTG Zeo (WO 2006/048459 참조)를 관심의 유전자의 상류 및 dhfr 선택 유전자를 관심의 유전자의 하류에 놓고 IRES로 연결하였다(도 2). 이 발현 카세트의 목적은 우선 제오신에서의 선택에 의해 고수준으로 단백질을 생산하는 포유동물 세포 클론을 선택하는 것이다. 관심의 배열의 TTG Zeo-유전자는 이 목적을 가장 효과적으로 달성한다. 이 초기 선택 단계 후, dhfr-단백질의 특질은 제오신 항생물질의 부재시 고발현 수준의 유지를 달성하기 위해 적용된다.

활성 선택 압력은 연장된 시간에 걸쳐 동일한 고수준으로 TTG Zeo 선택된 클로니에서 단백질 발현 수준을 유지하는데 유익한 것으로 보인다. 이것은 예를 들면, 배지에서 제오신의 양을 최소로 유지함으로써 수행될 수 있지만, 경제적 그리고 잠재적으로 조절 목적에서 현장에 유리하지 않다(제오신은 독성이고 비싸다).

또 다른 접근은 관심의 유전자를 대사 경로에서 하나 이상의 필수적 단계를 신진대사 시키는 효소인 선택마커에 연결하는 것이다. 본질적으로 세포는 특이 본질적 대사성 빌딩블록 자체를 합성할 수 없다고 생각되므로, 이들 빌딩블록은 세포가 생존하도록 하기 위해 배지에 존재하여야 한다는 것을 의미한다. 잘 알려진 예는, 포유동물에서 합성될 수 없고 세포가 생존하기 위해서는 배지에 존재하여만 하는 필수 아미노산이다. 또 다른 예는 5,6,7,8-테트라히드로폴레이트 합성 dhfr 유전자이다. 상응하는 dhfr 단백질은 폴레이트 경로의 효소이다. dhfr 단백질은 특이 적으로 폴레이트를 5,6,7,8-테트라히드로폴레이트, 퓨린(히포크산틴), 티미딜산 (티미딘) 그리고 아미노산 글리신의 재합성에 요구되는 메틸기 셔틀로 전환시킨다. 작동을 위해, 비-독성 물질 폴레이트는 배지에 존재하여야 한다(Urlaub et al, 1980). 더우기, 매질은 히포크산틴과 티미딘이 부족해야 하고, 이들이 세포에 이용가능하면, dhfr 효소에 대한 요구가 무시되기 때문이다. CHO-DG44 세포는 dhfr 유전자가 부족하고, 그러므로 이들 세포는 생존을 위해 배지에 글리신, 히포크산틴 그리고 티미딘이 요구된다. 그러나, 최종-산물 글리신, 히포크산틴 및 티미딘이 배지에 없고 폴레이트가 존재하면, 그리고 dhfr 유전자가 제공되면 이것은 세포의 발현 카세트에 존재하기 때문에, 세포는 폴레이트를 5,6,7,8-테트라히드로폴레이트로 전환시킬 수 있고, 그러므로, 배지에서 생존할 수 있다. 이 원리는 수년 동안 안정적으로 트란스펙트된 포유동물 세포주를 생성하기 위한 선택방법론으로 사용되어 왔다.

여기서, 본 발명자들은 이 원리를 처음에 안정한 클론을 선택하는 것이 아니라(이것은 제오신으로 수행된다), 세포를 대사성 선택 압력하에 유지하는데 사용한다. 이 장점은 초기 매우 높은 단백질 발현이 TTG Zeo 선택 시스템을 통해 얻어질 수 있고, 이런 고발현 수준은, 배지에 제오신을 유지할 필요없이, 유지될 수 있다는 것이다. 대신에, 제오신은 매질에서 제거될 수 있고, 배지에서 글리신, 히포크산틴 및 티미딘(GHT) 또는 단지 히포크산틴과 티미딘의 부재는 높은 단백질 발현 수준을 보장하는데 충분히 높은 선택 압력을 유지하는데 충분하다. 이와 같은 배열은 두 개의 선택 마커의 존재를 필요로 하고, 제오신 내성 유전자와 dhfr 유전자 모두는 발현카세트에 존재할 필요가 있다. 위에 약술한 바와 같이, 두 유전자 모두가 관심의 유전자를 가지고 삼중시스트론성 mRNA가 전사되는 배열이 단일 프로모터를 형성하는 것을 충분히 달성한다. 변형된 제오신 내성 유전자(TTG Zeo)가 d2EGFP 유전자의 상류에 적용되면, dhfr 유전자는 예를 들면, IRES 서열을 통해 d2EGFP 유전자에 연결되기 위해 하류에 존재하여야 한다(도 1).

결과

본 발명자들은 TTG Zeo 선택 마커가 d2EGFP 수용체 유전자의 상류에 놓이고 dhfr 선택마커는 d2EGFP 유전자의 하류에 놓이고, IRES 서열을 통해 연결된 구조물을 만들었다(도 2). 이들 구조물을 STARs 7/67/7로 플랭크하였다. 이들 구조물의 3가지 버전을 만들었다: ATG dhfr, GTG dhfr 또는 TTG dhfr, 각각의 이름은 dhfr 유전자에 사용된 시작코돈을 나타낸다. 구조물을 CHO-DG44 세포에 트란스펙트시켰다. DNA를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)과 세포를 사용하여 트란스펙트시키고, 세포를 IMDM 매질(Gibco) + 10% FBS (Gibco) + HT-보충물 중에서 제오신 비보충물 400㎍/㎖ 의 존재하에 성장시켰다.

14 TTG Zeo IRES ATG dhfr clones에서 평균 d2EGFP 값은, 제오신 400㎍/㎖의 존재에서 측정하였을 때 341이었다(도 2). 이 측정 후, 세포를 쪼개고, 추가로 3가지 조건에서 배양하였다:

(1) 매질에서 400㎍/㎖ 제오신 및 히포크산틴과 티미딘(HT-보충),

(2) 제오신은 없이, 그러나 매질에서 HT-보충으로,

(3) 제오신 없이 그리고 HT-보충 없이.

요약하면, 조건 1에서, 세포는 오직 제오신 선택 압력하에 있고, 조건 2에서 세포는 어느 선택 압력하에도 있지 않고 그리고 조건 3에서 세포는 DHFR 선택 압력하에 남는다. 후자의 조건 3은 그 결과, dhfr 단백질의 발현과 세포 생존을 허용하기 위해 dhfr 유전자의 연속 발현을 허용한다.

65일 후, 본 발명자들은 d2EGFP 값을 다시 측정하였다. 제오신 선택하에서 TTG Zeo IRES ATG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 값은 이제 159였다(도 2). 제오신 없이 그리고 HT 보충물로 TTG Zeo IRES ATG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 값은 20이었다(도 2). 제오신 선택없이 그리고 HT 보충물 없이, TTG Zeo IRES ATG dhfr 클론의 평균 d2EGFP 값은 37이었다(도 2). 전체적으로, 그러므로 본 발명자는 d2EGFP 값의 하락을 관찰하였고, 그러나 HT 보충물의 존재 여부에 상관없이 제오신의 부재에서 가장 심각하였다.

본 발명자들은 TTG Zeo IRES GTG dhfr 구조물로 동일한 프로토콜을 따랐다. 15 TTG Zeo IRES GTG dhfr 클론에서 제오신 400㎍/㎖의 존재하에 측정하였을 때 평균 d2EGFP 값은 455였다 (제1일) (도 3). 이들 측정 후, 세포를 쪼개고 상기의 세가지 조건하에서 더욱 배양하였다. 65일 후, 본 발명자들은 d2EGFP 값을 다시 측정하였다. 제오신 선택하에서 TTG Zeo IRES GTG dhfr 클론의 평균 d2EGFP 값은 356 이었다(도 3). 제오신 선택없이 그리고 HT 보충물을 갖는 TTG Zeo IRES GTG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 값은 39였다 (도 3). 제오신 선택없이 그리고 HT 보충물 없이 TTG Zeo IRES GTG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 값은 705였다 (도 3).

그러므로, 이 경우, 본 발명자들은 제오신이 없고 HT 보충물이 존재하는 경 우에만 d2EGFP 값의 하락을 관찰하였다(조건 2). 제오신의 부재시, 그러나 HT 보충물 역시 없는 경우, d2EGFP 값은 실제적으로 상당히 높았다(조건 3). 이것은 dhfr단백질의 발현 수준이 GTG dhfr mRNA의 악화된 번역 빈도로 인해 매우 높은 선택 엄격성을 제공하기에 충분히 낮다는 것을 나타낼 수 있다. 이 선택 압력은, 어느 독성약제의 부재시, 시간에 걸쳐 높은 단백질 발현 수준을 유지하는데 충분히 높고, 외관상 시간에 걸친 이들 발현 수준을 개선한다.

본 발명자들은 TTG Zeo IRES TTG dhfr 구조물에도 동일한 것을 행하였다. 18 TTG Zeo IRES TTG dhfr 클론에서, 제오신 400㎍/㎖의 존재하에 측정하였을 때 평균 d2EGFP 값은 531 이었다(제1일)(도 4). 이들 측정 후, 세포를 쪼개고 상기의 세가지 조건하에서 더욱 배양하였다. 65일 후, 본 발명자들은 d2EGFP 값을 다시 측정하였다. 제오신 선택하에서 TTG Zeo IRES GTG dhfr 클론의 평균 d2EGFP 값은 324였다(도 4). 제오신 선택없이 그리고 HT 보충물을 갖는 TTG Zeo IRES TTG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 값은 33이었다 (도 4). 제오신 선택없이 그리고 HT 보충물 없이 TTG Zeo IRES TTG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 값은 1124였다 (도 4).

다시, 본 발명자들은 제오신이 없고 HT 보충물이 존재하는 경우 d2EGFP 값의 하락을 관찰하였다(조건 2). 제오신의 부재시, 그러나 HT 보충물 역시 없는 경우, d2EGFP 값은 TTG Zeo IRES GTG dhfr 구조물의 경우보다 더 높았다(조건 3). TTG 변이체는 GTG 변이체보다 더 엄격하므로 dhfr 단백질이 TTG dhfr으로 GTG dhfr 변이체로보다 훨씬 덜 번역될 것으로 예상된다. 어느 독성 약물의 부재시, 증가된 선택 압력은 시간에 걸쳐 높은 단백질 발현 수준을 유지하는데 충분히 높고, 외관상 시 간에 걸친 이들 발현 수준을 더욱 개선한다.

자료는 dhfr 유전자의 비-ATG 시작코돈-변이체가 IRES를 통해 d2EGFP 유전자에 결합하는 것이 CHO-DG44 세포에서 d2EGFP 발현의 높은 안정성을 허용한다는 것을 나타낸다. 이것은 제오신이 없고 필수적인 대사성 최종산물이 없는 배지에서 일어난다. 변형된 TTG를 통한 제오신에서 대한 선택 전에, Zeo 선택 마커는 높은 d2EGFP 발현 수준을 갖는 콜로니의 효과적인 확립을 허용한다. 단지 배지의 단순한 변화는(제오신과 HT의 제거) 높은 d2EGFP 발현 수준을 유지하고 그리고 이들 발현 수준을 더욱 개선하는데 요구된다.

실시예 3: 약해진 IRES 서열 뒤에 변형된 dhfr 유전자를 놓음에 의해 증가된 발현은 유전자 증폭 결과를 가져오지 않는다.

선행기술에서 선택 마커로서 dhfr 유전자의 사용은 종종 dhfr 유전자의 증폭에 의존한다. 독성 약제, 메토트렉세이트가 이와 같은 시스템에서 dhfr 유전자와 부수적으로 그것과 함께 원하는 트란스유전자를 증폭하는데 사용되었고 이와 같은 증폭 후 최대 수천개의 사본이 CHO 세포의 게놈에 병합되는 것을 발견할 수 있다. 비록 이들 많은 수의 사본이 높은 발현 수준을 가져오지만, 이들은 또한 게놈성 불안정성을 가져오고, 배지로부터 메토트렉세이트의 제거는 증폭된 많은 유전자 자리의 제거를 가져온다.

실시예 2에서, dhfr 효소 활성을 억제하는데 메토트렉세이트를 사용하지 않았다. 오직 히포크산틴과 티미딘 전구체를 배지로부터 제거하였고, 이것은 단백질 발현과 증가된 발현 수준 모두를 얻는데 충분하였다. 그러므로, 본 발명자는 본 세 팅에서 dhfr 효소의 사용이 유전자 증폭을 가져왔다고 결정하였다.

결과

본 발명자들은 실시예 2에 기재된 클론으로부터 DNA를 단리하였고, 같은 날(65) d2EGFP 값을 측정하였다. 이 DNA를 가지고, 본 발명자들은 d2EGFP 사본 수를 측정하였다.

제오신 선택하에서 TTG Zeo IRES ATG dhfr 선택에서의 평균 d2EGFP 사본 수는 86이었다(조건 1)(도 5). 제오신 선택이 없고 HT 보충물의 존재시 TTG Zeo IRES ATG dhfr 클로니의 평균 d2EGFP 사본 수는 53이었다(조건 2)(도 5). 제오신 선택이없고 HT 보충물이 없이 TTG Zeo IRES ATG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 사본 수는 59였다 (조건 3)(도 5).

제오신 선택하의 TTG Zeo IRES GTG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 사본 수는 23이었다 (조건 1)(도 6). 제오신 선택이 없고 HT 보충물의 존재에서 TTG Zeo IRES GTG dhfr 클론의 평균 d2EGFP 사본 수는 14였다 (조건 2)(도 6). 제오신 선택이 없고 HT 보충물이 없이 TTG Zeo IRES GTG dhfr 클론에서의 평균 d2EGFP 사본 수는 37 이었다(조건 3)(도 6).

제오신 선택하에서 TTG Zeo IRES TTG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 사본 수는 33이었다 (조건 1)(도 7). 제오신 선택 없이 HT 보충물의 존재에서 TTG Zeo IRES TTG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 사본 수는 26이었다 (조건 2)(도 7). 제오신 선택 없이 그리고 HT 보충물 없이 TTG Zeo IRES TTG dhfr 클론에서 평균 d2EGFP 사본 수는 32였다 (조건 3)(도 7).

본 발명자들이 관찰한 어느 경우에도 HT 보충물의 제거 후 d2EGFP 사본 수의 큰 증가가 없었고, 이것은 GTG dhfr 및 TTG dhfr 변이체에서 d2EGFP 값의 증가를 가져왔다. 두 구조물을 갖는 d2EGFP 값은 시간에 걸쳐 안정하였고 상당히 증가되었다는 사실은 dhfr 단백질의 작용에 기인한 것임에 틀림없다. 여전히 TTG Zeo TTG dhfr 클론에서 전혀 증가된 d2EGFP 사본 수가 관찰되지 않았고, 오직 TTG Zeo GTG dhfr 클론에 적당한 증가가 있었다. 흥미롭기는, 가장 낮은 생산자에서 전체 d2EGFP 사본 수, TTG Zeo ATG dhfr 클론은 다른 두 개의 변이체에서보다 높은 반면, 이들 클론은 초기의 높은 d2EGFP 형광값을 유지하지 않았다(실시예 2 참조). 본 발명자들은 이들 자료로부터 메토트렉세이트의 첨가와 결합하여 dhfr 단백질을 사용할 때 관찰된, 통상적으로 알려진 유전자 증폭은 시간에 걸친 d2EGFP 발현 수준을 안정하게 유지하는 것과 이들 발현 수준에서 관찰된 증가에 대해 책임이 없다는 결론을 얻었다. 대신, d2EGFP에 의하여 더 많은 d2EGFP 단백질이 GTG and TTG dhfr 변이체와 함께 발현되는 것으로 나타난다.

본 발명자들은 다양한 클론에 대해 상기와 같은 다양한 조건하에서 d2EGFP mRNA 수준을 더욱 분석하였고, 이들 mRNA 수준이 d2EGFP 형광값의 경향을 대체로 따른다는 것을 발견하였다. 그러므로, 본 발명자들은 d2EGFP 형광값의 증가가 증가된 mRNA 수준에 기인하고, 변형된 번역 효율에 기인하는 것이 아니라고 결론지었다.

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SEQUENCE LISTING <110> ChromaGenics B.V. Otte, Arie P. Kwaks, Theodorus H.J. Sewalt, Richard G.A.B. van Blokland, Rik <120> Selection of host cells expressing protein at high levels <130> 0117 A WO 01 ORD <150> US 11/359,953 <151> 2006-02-21 <150> US 11/269,525 <151> 2005-11-07 <150> US 60/626,301 <151> 2004-11-08 <150> US 60/696,610 <151> 2005-07-05 <150> EP 04105593.0 <151> 2004-11-08 <160> 82 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 749 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR1 <400> 1 atgcggtggg ggcgcgccag agactcgtgg gatccttggc ttggatgttt ggatctttct 60 gagttgcctg tgccgcgaaa gacaggtaca tttctgatta ggcctgtgaa gcctcctgga 120 ggaccatctc attaagacga tggtattgga gggagagtca cagaaagaac tgtggcccct 180 ccctcactgc aaaacggaag tgattttatt ttaatgggag ttggaatatg tgagggctgc 240 aggaaccagt ctccctcctt cttggttgga aaagctgggg ctggcctcag agacaggttt 300 tttggccccg ctgggctggg cagtctagtc gaccctttgt agactgtgca cacccctaga 360 agagcaacta cccctataca ccaggctggc tcaagtgaaa ggggctctgg gctccagtct 420 ggaaaatctg gtgtcctggg gacctctggt cttgcttctc tcctcccctg cactggctct 480 gggtgcttat ctctgcagaa gcttctcgct agcaaaccca cattcagcgc cctgtagctg 540 aacacagcac aaaaagccct agagatcaaa agcattagta tgggcagttg agcgggaggt 600 gaatatttaa cgcttttgtt catcaataac tcgttggctt tgacctgtct gaacaagtcg 660 agcaataagg tgaaatgcag gtcacagcgt ctaacaaata tgaaaatgtg tatattcacc 720 ccggtctcca gccggcgcgc caggctccc 749 <210> 2 <211> 883 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR2 <400> 2 gggtgcttcc tgaattcttc cctgagaagg atggtggccg gtaaggtccg tgtaggtggg 60 gtgcggctcc ccaggccccg gcccgtggtg gtggccgctg cccagcggcc cggcaccccc 120 atagtccatg gcgcccgagg cagcgtgggg gaggtgagtt agaccaaaga gggctggccc 180 ggagttgctc atgggctcca catagctgcc ccccacgaag acggggcttc cctgtatgtg 240 tggggtccca tagctgccgt tgccctgcag gccatgagcg tgcgggtcat agtcgggggt 300 gccccctgcg cccgcccctg ccgccgtgta gcgcttctgt gggggtggcg ggggtgcgca 360 gctgggcagg gacgcagggt aggaggcggg gggcagcccg taggtaccct gggggggctt 420 ggagaagggc gggggcgact ggggctcata cgggacgctg ttgaccagcg aatgcataga 480 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caactgacct attaaggctg tggtaaaccg attcatagag agaggttcta aatacattgg 420 tccctcacag gcaaactgca gttcgctccg aacgtagtcc ctggaaattt gatgtccagt 480 atagaaaagc agagcagtca aaaaatatag ataaagctga accagatgtt gcctgggcaa 540 tgttagcagc accacactta agatataacc tcaggctgtg gactccctcc ctggggagcg 600 gtgctgccgg cggcgggcgg gctccgcaac tccccggctc tctcgcccgc cctcccgttc 660 tcctcgggcg gcggcggggg ccgggactgc gccgctcaca gcggcggctc ttctgcgccc 720 ggcctcggag gcagtggcgg tggcggccat ggcctcctgc gttcgccgat gtcagcattt 780 cgaactgagg gtcatctcct tgggactggt tagacagtgg gtgcagccca cggagggcga 840 gttgaagcag ggtggggtgt cacctccccc aggaagtcca gtgggtcagg gaactccctc 900 ccctagccaa gggaggccgt gagggactgt gcccggtgag agactgtgcc ctgaggaaag 960 gtgcactctg gcccagatac tacacttttc ccacggtctt caaaacccgc agaccaggag 1020 attccctcgg gttcctacac caccaggacc ctgggtttca accacaaaac cgggccattt 1080 gggcagacac ccagctagct gcaagagttg tttttttttt tatactcctg tggcacctgg 1140 aacgccagcg agagagcacc tttcactccc ctggaaaggg ggctgaaggc agggaccttt 1200 agctgcgggc tagggggttt ggggttgagt gggggagggg agagggaaaa ggcctcgtca 1260 ttggcgtcgt ctgcagccaa taaggctacg ctcctctgct gcgagtagac ccaatccttt 1320 cctagaggtg gagggggcgg gtaggtggaa gtagaggtgg cgcggtatct aggagagaga 1380 aaaagggctg gaccaatagg tgcccggaag aggcggaccc agcggtctgt tgattggtat 1440 tggcagtgga ccctcccccg gggtggtgcc ggaggggggg atgatgggtc gaggggtgtg 1500 tttatgtgga agcgagatga ccggcaggaa cctgccccaa tgggctgcag agtggttagt 1560 gagtgggtga cagacagacc cgtaggccaa cgggtggcct taagtgtctt tggtctcctc 1620 caatggagca gcggcggggc gggaccgcga ctcgggttta atgagactcc attgggctgt 1680 aatcagtgtc atgtcggatt catgtcaacg acaacaacag ggggacacaa aatggcggcg 1740 gcttagtcct acccctggcg gcggcggcag cggtggcgga ggcgacggca ctcctccagg 1800 cggcagccgc agtttctcag gcagcggcag cgcccccggc aggcgcggtg gcggtggcgc 1860 gcagccaggt ctgtcaccca ccccgcgcgt tcccaggggg aggagactgg gcgggagggg 1920 ggaacagacg gggggggatt caggggcttg cgacgcccct cccacaggcc tctgcgcgag 1980 ggtcaccgcg gggccgctcg gggtcaggct gcccctgagc gtgacggtag ggggcggggg 2040 aaaggggagg 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aatgaagacc caaagaagcc attagggtca 720 aaagctcata tgccttttta agtagaaaat gataaatttt aacaatgtga gaagacaaag 780 gtgtttgagc tgagggcaat aaattgtggg acagtgatta agaaatatat gggggaaatg 840 aaatgataag ttattttagt agatttattc ttcatatcta ttttggcttc aacttccagt 900 ctctagtgat aagaatgttc ttctcttcct ggtacagaga gagcaccttt ctcatgggaa 960 attttatgac cttgctgtaa gtagaaaggg gaagatcgat ctcctgtttc ccagcatcag 1020 gatgcaaaca tttccctcca ttccagttct caaccccatg gctgggcctc atggcattcc 1080 agcatcgcta tgagtgcacc tttcctgcag gctgcctcgg gtagctggtg cactgctagg 1140 tcagtctatg tgaccaggag ctgggcctct gggcaatgcc agttggcagc ccccatccct 1200 ccactgctgg gggcctccta tccagaaggg cttggtgtgc agaacgatgg tgcaccatca 1260 tcattcccca cttgccatct ttcaggggac agccagctgc tttgggcgcg gcaaaaaaca 1320 cccaactcac tcctcttcag gggcctctgg tctgatgcca ccacaggaca tccttgagtg 1380 ctgggcagtc tgaggacagg gaaggagtga tgaccacaaa acaggaatgg cagcagcagt 1440 gacaggagga agtcaaaggc ttgtgtgtcc tggccctgct gagggctggc gagggccctg 1500 ggatggcgct cagtgcctgg tcggctgcaa gaggccagcc 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cagatgagaa 720 aagtgacaat tttgagagca tagctaagaa tagctagtaa gtaaaggagc tgggacctaa 780 accaaaccct atctcaccag agtacacact cttttttttt ttccagtgta atttttttta 840 atttttattt tactttaagt tctgggatac atgtgcagaa ggtatggttt gttacatagg 900 tatatgtgtg ccatagtgga ttgctgcacc tatcaacccg tcatctaggt ttaagcccca 960 catgcattag ctatttgtcc tgatgctctc cctcccctcc ccacaccaga caggccttgg 1020 tgtgtgatgt tcccctccct gtgtccatgt gttctcactg ttcagctccc acttatgagt 1080 gagaacgtgt ggtatttggt tttctgttcc tgtgttagtt tgctgaggat gatggcttcc 1140 agcttcatcc atgtccctgc aaaggacacg atc 1173 <210> 7 <211> 2101 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR7 <400> 7 aggtgggtgg atcacccgag gtcaggagtt caagaccagc ctggccaaca tggtaaaacc 60 tcgtctctac taaaaaatac gaaaaattag ctggttgtgg tggtgcgtgc ttgtaatccc 120 agctactcgg gaggctgagg caggagaatc acttgaatct gggaggcaga ggttgcagtg 180 agctgagata gtgccattgc actccagcct gggcaacaga cggagactct gtctccaaaa 240 aaaaaaaaaa aaatcttaga ggacaagaat ggctctctca aacttttgaa gaaagaataa 300 ataaattatg cagttctaga agaagtaatg gggatatagg tgcagctcat gatgaggaag 360 acttagctta actttcataa tgcatctgtc tggcctaaga cgtggtgagc tttttatgtc 420 tgaaaacatt ccaatataga atgataataa taatcacttc tgacccccct tttttttcct 480 ctccctagac tgtgaagcag aaaccccata tttttcttag ggaagtggct acgcactttg 540 tatttatatt aacaactacc ttatcaggaa attcatattg ttgccctttt atggatgggg 600 aaactggaca agtgacagag caaaatccaa acacagctgg ggatttccct cttttagatg 660 atgattttaa aagaatgctg ccagagagat tcttgcagtg ttggaggaca tatatgacct 720 ttaagatatt ttccagctca gagatgctat gaatgtatcc tgagtgcatg gatggacctc 780 agttttgcag attctgtagc ttatacaatt tggtggtttt ctttagaaga aaataacaca 840 tttataaata ttaaaatagg cccaagacct tacaagggca ttcatacaaa tgagaggctc 900 tgaagtttga gtttgttcac tttctagtta attatctcct gcctgtttgt cataaatgcg 960 tttagtaggg agctgctaat gacaggttcc tccaacagag tgtggaagaa ggagatgaca 1020 gctggcttcc cctctgggac agcctcagag ctagtgggga aactatgtta gcagagtgat 1080 gcagtgacca agaaaatagc actaggagaa agctggtcca tgagcagctg gtgagaaaag 1140 gggtggtaat catgtatgcc ctttcctgtt ttatttttta ttgggtttcc ttttgcctct 1200 caattccttc tgacaataca aaatgttggt tggaacatgg agcacctgga agtctggttc 1260 attttctctc agtctcttga tgttctctcg ggttcactgc ctattgttct cagttctaca 1320 cttgagcaat ctcctcaata gctaaagctt ccacaatgca gattttgtga tgacaaattc 1380 agcatcaccc agcagaactt aggttttttt ctgtcctccg tttcctgacc tttttcttct 1440 gagtgcttta tgtcacctcg tgaaccatcc tttccttagt catctaccta gcagtcctga 1500 ttcttttgac ttgtctccct acaccacaat aaatcactaa ttactatgga ttcaatccct 1560 aaaatttgca caaacttgca aatagattac gggttgaaac ttagagattt caaacttgag 1620 aaaaaagttt aaatcaagaa aaatgacctt taccttgaga gtagaggcaa tgtcatttcc 1680 aggaataatt ataataatat tgtgtttaat atttgtatgt aacatttgaa taccttcaat 1740 gttcttattt gtgttatttt aatctcttga tgttactaac tcatttggta gggaagaaaa 1800 catgctaaaa taggcatgag tgtcttatta aatgtgacaa gtgaatagat ggcagaaggt 1860 ggattcatat tcagttttcc atcaccctgg aaatcatgcg gagatgattt ctgcttgcaa 1920 ataaaactaa cccaatgagg ggaacagctg ttcttaggtg aaaacaaaac aaacacgcca 1980 aaaaccttta ttctctttat tatgaatcaa atttttcctc tcagataatt gttttattta 2040 tttattttta ttattattgt tattatgtcc agtctcactc tgtcgcctaa gctggcatga 2100 t 2101 <210> 8 <211> 1821 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR8 <400> 8 gagatcacct cgaagagagt ctaacgtccg taggaacgct ctcgggttca caaggattga 60 ccgaacccca ggatacgtcg ctctccatct gaggcttgct ccaaatggcc ctccactatt 120 ccaggcacgt gggtgtctcc cctaactctc cctgctctcc tgagcccatg ctgcctatca 180 cccatcggtg caggtccttt ctgaagagct cgggtggatt ctctccatcc cacttccttt 240 cccaagaaag aagccaccgt tccaagacac ccaatgggac attccccttc cacctccttc 300 tccaaagttg cccaggtgtt catcacaggt tagggagaga agcccccagg tttcagttac 360 aaggcatagg acgctggcat gaacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 420 acacgactcg aagaggtagc cacaagggtc attaaacact tgacgactgt tttccaaaaa 480 cgtggatgca gttcatccac gccaaagcca agggtgcaaa gcaaacacgg aatggtggag 540 agattccaga ggctcaccaa accctctcag gaatattttc ctgaccctgg gggcagaggt 600 tggaaacatt gaggacattt cttgggacac acggagaagc tgaccgacca ggcattttcc 660 tttccactgc aaatgaccta tggcgggggc atttcacttt cccctgcaaa tcacctatgg 720 cgaggtacct ccccaagccc ccacccccac ttccgcgaat cggcatggct cggcctctat 780 ccgggtgtca ctccaggtag gcttctcaac gctctcggct caaagaagga caatcacagg 840 tccaagccca aagcccacac ctcttccttt tgttataccc acagaagtta gagaaaacgc 900 cacactttga gacaaattaa gagtccttta tttaagccgg cggccaaaga gatggctaac 960 gctcaaaatt ctctgggccc cgaggaaggg gcttgactaa cttctatacc ttggtttagg 1020 aaggggaggg gaactcaaat gcggtaattc tacagaagta aaaacatgca ggaatcaaaa 1080 gaagcaaatg gttatagaga gataaacagt tttaaaaggc aaatggttac aaaaggcaac 1140 ggtaccaggt gcggggctct aaatccttca tgacacttag atataggtgc tatgctggac 1200 acgaactcaa ggctttatgt tgttatctct tcgagaaaaa tcctgggaac ttcatgcact 1260 gtttgtgcca gtatcttatc agttgattgg gctcccttga aatgctgagt atctgcttac 1320 acaggtcaac tccttgcgga agggggttgg gtaaggagcc cttcgtgtct cgtaaattaa 1380 ggggtcgatt ggagtttgtc cagcattccc agctacagag agccttattt acatgagaag 1440 caaggctagg tgattaaaga gaccaacagg gaagattcaa agtagcgact tagagtaaaa 1500 acaaggttag gcatttcact ttcccagaga acgcgcaaac attcaatggg agagaggtcc 1560 cgagtcgtca aagtcccaga tgtggcgagc ccccgggagg aaaaaccgtg tcttccttag 1620 gatgcccgga acaagagcta ggcttccgga gctaggcagc catctatgtc cgtgagccgg 1680 cgggagggag accgccggga ggcgaagtgg ggcggggcca tccttctttc tgctctgctg 1740 ctgccgggga gctcctggct ggcgtccaag cggcaggagg ccgccgtcct gcagggcgcc 1800 gtagagtttg cggtgcagag t 1821 <210> 9 <211> 1929 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR9 <400> 9 cacttcctgg gagtggagca gaggctctgc gtggagcatc catgtgcagt actcttaggt 60 acggaaggga ttgggctaaa ccatggatgg gagctgggaa gggaagggac caacttcagg 120 ccccactggg acactggagc tgccaccctt tagagccctc ctaaccctac accagaggct 180 gagggggacc tcagacatca cacacatgct ttcccatgtt ttcagaaatc tggaaacgta 240 gaacttcagg ggtgagagtg cctagatatt gaatacaagg ctagattggg cttctgtaat 300 atcccaaagg accctccagc tttttcacca gcacctaatg cccatcagat accaaagaca 360 cagcttagga gaggttcacc ctgaagctga ggaggaggca gccggattag agttgactga 420 gcaaggatga ctgccttctc cacctgacga tttcagctgc tgcccttttc ttttcctggg 480 aatgcctgtc gccatggcct tctgtgtcca caggagagtt tgacccagat actcatggac 540 caggcaaagg tgctgttcct cccagcccag ggcccaccat gaagcatgcc tgggagcctg 600 gtaaggaccc agccactcct gggctgttga cattggcttc tcttgcccag cattgtagcc 660 acgccactgc attgtactgt gagataagtc aaggtgggct caccaggacc tgcactaaat 720 tgtgaaattc agctccaaag aactttggaa attacccatg catttaagca aaatgaatga 780 tacctgagca aaccctttca cattggcaca agttacaatc ctgtctcatc ctcttgatta 840 caaattccat ccaggcaaga gctgtatcac cctgaggtct ccccattcat gttttggtca 900 ataatattta gtttcctttt gaaaatagat ttttgtgtta ctccattatg atgggcagag 960 gccagatgct tatattctat ttaaatgact atgtttttct atctgtaact gggtttgtgt 1020 tcaggtggta aatgcttttt ttttgcagtc agaagattcc tggaaggcga ccagaaatta 1080 gctggccgct gtcagacctg aagttacttc taaagggcct ttagaaatga attctttttt 1140 atgccttctc tgaattctga gaagtaggct tgacttcccc taagtgtgga gttgggagtc 1200 aactcttctg aaaagaaagt ttcagagcat tttccaaagc catggtcagc tgtgggaagg 1260 gaagacgatg gatagtacag ttgccggaaa acactgatgg aggcggatgc tccagctcag 1320 ccaaagacct ttgttctgcc caccccagaa atgccccttc ctcaatcgca gaaacgttgc 1380 cccatggctc ctgatactca gaatgcagcc tctgaccagg accatctgca tcctccagga 1440 gctcgtaaga aatgcagcat cgtgggacct gctggcacct ggtgaaccca aacctgcagg 1500 gctcctgggt gtgcttgggg cggctgcagg ggaagaggga gtcagcagcc tcctcctgac 1560 cttcccgggg gctgcttttc tgaggggcca gaatgcaccg gttgaccttg ttgcatcact 1620 ggcccatgac tggctgcttt ggtcaggtgt aaaaaggtgt ttccagaggg tctgctcctc 1680 tcactatcgg accaggtttc catggagagc tcagcctccc agcaaggata gagaacttca 1740 aatggctcaa agaactgaga ggccacacat gtgtgacctg aatagtctct gctgcaaaac 1800 aaagggtttc ttaatgtaaa acgttctctt cctcacagag gggttcccag ctgctagtgg 1860 gcatgttgca ggcatttcct gggctgcatc aggttgtcat aagccagagg atcatttttg 1920 ggggctcat 1929 <210> 10 <211> 1167 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR10 <220> <221> misc_feature <222> (452)..(1143) <223> n is a, c, g, or t on various positions <400> 10 aggtcaggag ttcaagacca gcctggccaa catggtgaaa ccctgtccct acaaaaaata 60 caaaaattag ccgggcgtgg tggggggcgc ctataatccc agctactcag gatgctgaga 120 caggagaatt gtttgaaccc gggaggtgga ggttgcagtg aactgagatc gcgccactgc 180 actccagcct ggtgacagag agagactccg tctcaacaac agacaaacaa acaaacaaac 240 aacaacaaaa atgtttactg acagctttat tgagataaaa ttcacatgcc ataaaggtca 300 ccttctacag tatacaattc agtggattta gtatgttcac aaagttgtac gttgttcacc 360 atctactcca gaacatttac atcaccccta aaagaagctc tttagcagtc acttctcatt 420 ctccccagcc cctgccaacc acgaatctac tntctgtctc tattctgaat atttcatata 480 aaggagtcct atcatatggg ccttttacgt ctaccttctt tcacttagca tcatgttttt 540 aagattcatc cacagtgtag cacgtgtcag ttaattcatt tcatcttatg gctggataat 600 gctctattgt atgcatatcc ctcactttgc ttatccattc atcaactgat tgacatttgg 660 gttatttcta ctttttgact attatgagta atgctgctat gaacattcct gtaccaatcg 720 ttacgtggac atatgctttc aattctcctg agtatgtaac tagggttgga gttgctgggt 780 catatgttaa ctcagtgttt catttttttg aagaactacc aaatggtttt ccaaagtgga 840 tgcaacactt tacattccca ccagcaagat atgaaggttc caatgtctct acatttttgc 900 caacacttgt gattttcttt tatttattta tttatttatt tatttttgag atggagtctc 960 actctgtcac ccaggctgga gtgcagtggc acaatttcag ctcactgcaa tctccacctc 1020 tcgggctcaa gcgatactcc tgcctcaacc tcccgagtaa ctgggattac aggcgcccac 1080 caccacacca agctaatttt ttgtattttt agtagagacg gggtttcatc atgtcggcca 1140 ggntgtactc gaactctgac ctcaagt 1167 <210> 11 <211> 1377 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR11 <400> 11 aggatcactt gagcccagga gttcaagacc agcctgggca acatagcgag aacatgtctc 60 aaaaaggaaa aaaatggggg aaaaaaccct cccagggaca gatatccaca gccagtcttg 120 ataagctcca tcattttaaa gtgcaaggcg gtgcctccca tgtggatgat tatttaatcc 180 tcttgtactt tgtttagtcc tttgtggaaa tgcccatctt ataaattaat agaattctag 240 aatctaatta aaatggttca actctacatt ttactttagg ataatatcag gaccatcaca 300 gaatgtctga gatgtggatt taccctatct gtagctcact tcttcaacca ttcttttagc 360 aaggctagtt atcttcagtg acaacccctt gctgccctct actatctcct ccctcagatg 420 gactactctg attaagcttg agctagaata agcatgttat cccgggattt catatggaat 480 attttataca tgagtgagcc attatgagtt gtttgaaaat ttattatgtt gagggagggt 540 aaccgctgta acaaccatca ccaaatctaa tcgactgaat acatttgacg tttatttctt 600 gttcacctga cagttcagtg ttacctaaat ttacatgaag acccagaggc ccacgctcct 660 tcattttggg ctccaccgac ctccaaggtt tcagggccct ctgccccgcc ttctgcaccc 720 acaggggaag agagtggagg atgcacacgc ccaggcctgg aagtgacgca tgtggcttcc 780 ccgtccacag acttcaccca cagtccattg gccttcttaa gtcatggact cctgctgagc 840 tgccagggtg catgggaaat ccatgtgact gtgtgccctg gaggaagggg agcgtttcgg 900 tgagcacaca ggagtctttg ccactagacg ctgatgagga ttccccacag gcgatgaagc 960 atggagactc atcttgtaac aaacagatga gttgttgaca tctcttaagt ttactttgtg 1020 tgcagttttt attcagatag gaaaggctgt taaaatctta acacctaact ggaagaaggg 1080 ttttagagaa gtgtggtttt cagtaagcca gttctttcca caatccaaga aacgaaataa 1140 atttccagca tggagcagtt ggcaggtaag gtttttgttg tggtctcgcc caggcttgag 1200 tgtaaccggt gtggtcatag ctcactacat tctcaaactc ctggccttaa gtcatcctcc 1260 tgcctcagcc tcccaaaggc aagtaaggtt aagaataggg gaaaggtgaa gtttcacagc 1320 ttttctagaa ttctttttat tcaagggact ctcagatcat caaacccacc cagaatc 1377 <210> 12 <211> 1051 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR12 <400> 12 atcctgcttc tgggaagaga gtggcctccc ttgtgcaggt gactttggca ggaccagcag 60 aaacccaggt ttcctgtcag gaggaagtgc tcagcttatc tctgtgaagg gtcgtgataa 120 ggcacgagga ggcaggggct tgccaggatg ttgcctttct gtgccatatg ggacatctca 180 gcttacgttg ttaagaaata tttggcaaga agatgcacac agaatttctg taacgaatag 240 gatggagttt taagggttac tacgaaaaaa agaaaactac tggagaagag ggaagccaaa 300 caccaccaag tttgaaatcg attttattgg acgaatgtct cactttaaat ttaaatggag 360 tccaacttcc ttttctcacc cagacgtcga gaaggtggca ttcaaaatgt ttacacttgt 420 ttcatctgcc tttttgctaa gtcctggtcc cctacctcct ttccctcact tcacatttgt 480 cgtttcatcg cacacatatg ctcatcttta tatttacata tatataattt ttatatatgg 540 cttgtgaaat atgccagacg agggatgaaa tagtcctgaa aacagctgga aaattatgca 600 acagtgggga gattgggcac atgtacattc tgtactgcaa agttgcacaa cagaccaagt 660 ttgttataag tgaggctggg tggtttttat tttttctcta ggacaacagc ttgcctggtg 720 gagtaggcct cctgcagaag gcattttctt aggagcctca acttccccaa gaagaggaga 780 gggcgagact ggagttgtgc tggcagcaca gagacaaggg ggcacggcag gactgcagcc 840 tgcagagggg ctggagaagc ggaggctggc acccagtggc cagcgaggcc caggtccaag 900 tccagcgagg tcgaggtcta gagtacagca aggccaaggt ccaaggtcag tgagtctaag 960 gtccatggtc agtgaggctg agacccaggg tccaatgagg ccaaggtcca gagtccagta 1020 aggccgagat ccagggtcca gggaggtcaa g 1051 <210> 13 <211> 1291 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR13 <400> 13 agccactgag gtcctaactg cagccaaggg gccgttctgc acatgtcgct caccctctgt 60 gctctgttcc ccacagagca aacgcacatg gcaacgttgg tccgctcagc cactggttct 120 gtggtggaac ggtggatgtc tgcactgtga catcagctga gtaagtaaca acgactgagg 180 atgccgctga cccagggctg gggaagggga ctcccagctc agacaggctt ggctgtggtt 240 tgctttggga ggagagtgaa catcacaggg aatggctcat gtcagcccca ggagggtggg 300 ctggcccctg gtccccgggc tccttctggc cctgcaggcg atagagagcc tcaacctgct 360 gccgcttctc cttggcccgg gtgatggccg tctggaagag cctgcagtag aggtgcacag 420 ccagcggaga gtcgtcattg ccgggtacag ggtaggtgat gaggcagggg ttgcagttgg 480 tgtccacgat gcccactgtg gggatgttca tcttggctgc gtctctcacg gccacgtgtg 540 gctcaaagat gttgttgagc gtgtgcagga agatgatgag gtccggcagg cggaccgtgg 600 ggccaaagag gaggcgcgcg ttggtcagca tgccgcccct gaagtagcga gtgtgggcgt 660 actcgccaca gtcacgggcc atgttctcaa tcaggtacga gaactgccgg ttgcggctta 720 taaacaagat gatgcccttg cggtaggcca tgtgggcggt gaagttcaag gccagctgga 780 ggtgcgtggc tgtctgttcc aggtcgatga tgtcgtggtc caggcggctc ccaaagatgt 840 acggctccat aaacctgcca gagaccccac caaggcaagg gggatgagag ttcacggggc 900 catctccact ggctccttgc aggaacacag acgcccacca gggactcccg ggctcctctg 960 tgggggcact atgggctggg aagcacaatt tgcaacgctc cccgtgtgca tggacagcag 1020 tgcagaccca tccaggccac ccctctgcat gcctcgtctc gtggcttaac ccctcctacc 1080 ctctacctct tcccgaagga atcctaatag aactgacccc atatggatgt gtggacatcc 1140 aacatgacgc caaaaggaca ttctgccccg tgcagctcac agggcagccg cctccgtcac 1200 tgtcctcttc ccgaggcttt gcggatgagg cccctctggg gttggactta gcggggtgct 1260 ctgggccaaa 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tggagctggg gtgagaagta gaggccctgc agggcccacg tgccagccac 840 caggcctcag actaggctca gatgacggag agctgcacac ctgcccaacc caggccctgc 900 agtgcccaca tgccagccgc tggggcccag acttgctcca gagggcggag agctttacac 960 cggcccaacc caggccatgg ctccaaatgc gtgacagttt tgctgttgct tcttttagtc 1020 attgtcaagt tgatgcttgt tttgcagagg accaaggctt tatgaaccta ttaccctgtg 1080 tgaagagttt caccaggtta tggaaatttc tttaaaacca taccacagtt ttttcattat 1140 tcatgtatat ttttaaaaat aattactgca ctcagtagaa taacatgaaa atgttgcctg 1200 ttagcccttt tccagtttgc cccgagaata ctgggggcac ttgtggctgc aatgtttatc 1260 ctgcggcagc tttgccatga agtatctcac ttttattatt atttttgcat tgctcgagta 1320 tattgacttt ggaaacaaaa gacatcattc tatttatagc attatgtttt tagtagtggt 1380 atttccatat acaagataca gtaattttcc gtcaatgaaa atgtcaaatt ctagaaaatg 1440 taacattcct atgcgtggtg ttaacatcgt tctctaacag ttgttggccg aagattcgtt 1500 tgatgaatcc gatttttcca aaatagccga ttctgatgat tcagacgatt ctgatgttct 1560 gtttagaaat aattccaaga acagttttta cattttattt tcacattgaa aatcagtcag 1620 atttgcttca gcctcaaaga gcacgtttat gtaaaattaa atgagtgctg gcagccagct 1680 gcgctttgtt tttctaaatg ggaaaagggt taaatttcac tcagctttta aatgacagcg 1740 cacagcctgt gtcatagagg gttggaggag atgactttaa ctgcctgtgg ttaggatccc 1800 tttcccccag gaatgtctgg gagcccactg ccgggtttgc tgtccgtctc gtttggactc 1860 agttctgcat gtactg 1876 <210> 16 <211> 1282 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR16 <400> 16 cgcccacctc ggctttccaa agtgctggga ttacaggcat gagtcactgc gcccatcctg 60 attccaagtc tttagataat aacttaactt tttcgaccaa ttgccaatca ggcaatcttt 120 gaatctgcct atgacctagg acatccctct ccctacaagt tgccccgcgt ttccagacca 180 aaccaatgta catcttacat gtattgattg aagttttaca tctccctaaa acatataaaa 240 ccaagctata gtctgaccac ctcaggcacg tgttctcagg acctccctgg ggctatggca 300 tgggtcctgg tcctcagatt tggctcagaa taaatctctt caaatatttt ccagaatttt 360 actcttttca tcaccattac ctatcaccca taagtcagag ttttccacaa ccccttcctc 420 agattcagta atttgctaga atggccacca aactcaggaa agtattttac ttacaattac 480 caatttatta tgaagaactc aaatcaggaa tagccaaatg gaagaggcat agggaaaggt 540 atggaggaag gggcacaaag cttccatgcc ctgtgtgcac accaccctct cagcatcttc 600 atgtgttcac caactcagaa gctcttcaaa ctttgtcatt taggggtttt tatggcagtt 660 ccactatgta ggcatggttg ataaatcact ggtcatcggt gatagaactc tgtctccagc 720 tcctctctct ctcctcccca gaagtcctga ggtggggctg aaagtttcac aaggttagtt 780 gctctgacaa ccagccccta tcctgaagct attgaggggt cccccaaaag ttaccttagt 840 atggttggaa gaggcttatt atgaataaca aaagatgctc ctatttttac cactagggag 900 catatccaag tcttgcggga acaaagcatg ttactggtag caaattcata caggtagata 960 gcaatctcaa ttcttgcctt ctcagaagaa agaatttgac caagggggca taaggcagag 1020 tgagggacca agataagttt tagagcagga gtgaaagttt attaaaaagt tttaggcagg 1080 aatgaaagaa agtaaagtac atttggaaga gggccaagtg ggcgacatga gagagtcaaa 1140 caccatgccc tgtttgatgt ttggcttggg gtcttatatg atgacatgct tctgagggtt 1200 gcatccttct cccctgattc ttcccttggg gtgggctgtc cgcatgcaca atggcctgcc 1260 agcagtaggg aggggccgca tg 1282 <210> 17 <211> 793 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR17 <400> 17 atccgagggg aggaggagaa gaggaaggcg agcagggcgc cggagcccga ggtgtctgcg 60 agaactgttt taaatggttg gcttgaaaat gtcactagtg ctaagtggct tttcggattg 120 tcttatttat tactttgtca ggtttcctta aggagagggt gtgttggggg tgggggagga 180 ggtggactgg ggaaacctct gcgtttctcc tcctcggctg cacagggtga gtaggaaacg 240 cctcgctgcc acttaacaat ccctctatta gtaaatctac gcggagactc tatgggaagc 300 cgagaaccag tgtcttcttc cagggcagaa gtcacctgtt gggaacggcc cccgggtccc 360 cctgctgggc tttccggctc ttctaggcgg cctgatttct cctcagccct ccacccagcg 420 tccctcaggg acttttcaca cctccccacc cccatttcca ctacagtctc ccagggcaca 480 gcacttcatt gacagccaca cgagccttct cgttctcttc tcctctgttc cttctctttc 540 tcttctcctc tgttccttct ctttctctgt cataatttcc ttggtgcttt cgccacctta 600 aacaaaaaag agaaaaaaat aaaataaaaa aaacccattc tgagccaaag tattttaaga 660 tgaatccaag aaagcgaccc acatagccct ccccacccac ggagtgcgcc aagacgcacc 720 caggctccat cacagggccg agagcagcgc cactctggtc gtacttttgg gtcaagagat 780 cttgcaaaag agg 793 <210> 18 <211> 492 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> 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1560 ttaatcatta ttattttgtc atcaccgtca ctcttccagg ggactaatgt ccctgctgtt 1620 ctgtccaaat taaacattgt ttatccctgt gggcatctgg cgaggtggct aggaaagcct 1680 ggagctgttt cctgttgacg tgccagacta gt 1712 <210> 37 <211> 1321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR37 <400> 37 aggatcacat ttaaggaagt gtgtggggtc cctggatgac accagcaccc agtgcggctc 60 tgtctggcaa ccgctcccaa ggtggcagga gtgggtgtcc cctgtgtgtc agtgggcagc 120 tcctgctgag cctacagctc actggggagc ctgacagcgg ggccatgtgc ctgacactcc 180 tctctgcttg tggacctggc aaggcaggga gcagaaaaca gagccacttg aaggctttct 240 gtctgcgtct gtgtgcagtg tggatttagt tgtgcttttt tcttgctggg agagcacagc 300 caccatttac aagcagtgtc accctcatgg gtggcgagga cagaacagga gcctctgctc 360 tctgtaccta tctgggcccg gtgggctccc ttgtcctggc ttccatctct gtctcagcga 420 ccattcagcc ctgcgcagga acacatgttg cttagaaaag ccaaattcag cccttgtctc 480 tgcctcctct ggtctcatga tgtgcatctg ttaccttgaa actggaaacc agtctatcaa 540 tgtctgtgcc aattttttat tccctcccca acctccttcc ccatacgact ttttatttat 600 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<223> n is a, c, g, or t on various positions <400> 38 gatctatggg agtagcttcc ttagtgagct ttcccttcaa atactttgca accaggtaga 60 gaattttgga gtgaaggttt tgttcttcgt ttcttcacaa tatggatatg catcttcttt 120 tgaaaatgtt aaagtaaatt acctctcttt tcagatactg tcttcatgcg aacttggtat 180 cctgtttcca tcccagcctt ctataaccca gtaacatctt ttttgaaacc agtgggtgag 240 aaagacacct ggtcaggaac gcggaccaca ggacaactca ggctcaccca cggcatcaga 300 ctaaaggcaa acaaggactc tgtataaagt accggtggca tgtgtatnag tggagatgca 360 gcctgtgctc tgcagacagg gagtcacaca gacacttttc tataatttct taagtgcttt 420 gaatgttcaa gtagaaagtc taacattaaa tttgattgaa caattgtata ttcatggaat 480 attttggaac ggaataccaa aaaatggcaa tagtggttct ttctggatgg aagacaaact 540 tttcttgttt aaaataaatt ttattttata tatttgaggt tgaccacatg accttaagga 600 tacatataga cagtaaactg gttactacag tgaagcaaat taacatatct accatcgtac 660 atagttacat ttttttgtgt gacaggaaca gctaaaatct acgtatttaa caaaaatcct 720 aaagacaata catttttatt aactatagcc ctcatgatgt acattagatc gtgtggttgt 780 ttcttccgtc cccgccacgc cttcctcctg ggatggggat tcattcccta gcaggtgtcg 840 gagaactggc gcccttgcag ggtaggtgcc ccggagcctg aggcgggnac tttaanatca 900 gacgcttggg ggccggctgg gaaaaactgg cggaaaatat tataactgna ctctcaatgc 960 cagctgttgt agaagctcct gggacaagcc gtggaagtcc cctcaggagg cttccgcgat 1020 gtcctaggtg gctgctccgc ccgccacggt catttccatt gactcacacg cgccgcctgg 1080 aggaggaggc tgcgctggac acgccggtgg cgcctttgcc tgggggagcg cagcctggag 1140 ctctggcggc agcgctggga gcggggcctc ggaggctggg cctggggacc caaggttggg 1200 cggggcgcag gaggtgggct cagggttctc cagagaatcc ccatgagctg acccgcaggg 1260 cggccgggcc agtaggcacc gggcccccgc ggtgacctgc ggacccgaag ctggagcagc 1320 cactgcaaat gctgcgctga ccccaaatgc tgtgtccttt aaatgtttta attaagaata 1380 attaataggt ccgggtgtgg aggctcaagc cttaatcccc agcacctggc gaggccgagg 1440 aggga 1445 <210> 39 <211> 2331 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR39 <400> 39 gtgaaataga tcactaaagc tgattcctct tgtctaaatg aaactttcta ccctttgatg 60 gacagctatg ctttccccat cctctcccgt cccccagccc ttggtaacca tcatcctact 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tat cag gac ata 672 Phe Ile Asp Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile 210 215 220 gcg ttg gct acc cgt gat att gct gaa gag ctt ggc ggc gaa tgg gct 720 Ala Leu Ala Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala 225 230 235 240 gac cgc ttc ctc gtg ctt tac ggt atc gcc gct ccc gat tcg cag cgc 768 Asp Arg Phe Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg 245 250 255 atc gcc ttc tat cgc ctt ctt gac gag ttc ttc tga 804 Ile Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe 260 265 <210> 78 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 Met Gly Ser Ala Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ala Trp Val Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile 20 25 30 Gly Cys Ser Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro 35 40 45 Val Leu Phe Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Asp Glu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys 65 70 75 80 Ala Ala Val Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Glu Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro 100 105 110 Ala Glu Lys Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr 115 120 125 Leu Asp Pro Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile 130 135 140 Glu Arg Ala Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp 145 150 155 160 Leu Asp Glu Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg 165 170 175 Leu Lys Ala Arg Met Pro Asp Gly Asp Asp Leu Val Val Thr His Gly 180 185 190 Asp Ala Cys Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly 195 200 205 Phe Ile Asp Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile 210 215 220 Ala Leu Ala Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala 225 230 235 240 Asp Arg Phe Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg 245 250 255 Ile Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe 260 265 <210> 79 <211> 1121 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> wt glutamine synthase gene (human) <220> <221> CDS <222> (1)..(1119) <400> 79 atg acc acc tca gca agt tcc cac tta aat aaa ggc atc aag cag gtg 48 Met Thr Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Gly Ile Lys Gln Val 1 5 10 15 tac atg tcc ctg cct cag ggt gag aaa gtc cag gcc atg tat atc tgg 96 Tyr Met Ser Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp 20 25 30 atc gat ggt act gga gaa gga ctg cgc tgc aag acc cgg acc ctg gac 144 Ile Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp 35 40 45 agt gag ccc aag tgt gtg gaa gag ttg cct gag tgg aat ttc gat ggc 192 Ser Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly 50 55 60 tcc agt act tta cag tct gag ggt tcc aac agt gac atg tat ctc gtg 240 Ser Ser Thr Leu Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu Val 65 70 75 80 cct gct gcc atg ttt cgg gac ccc ttc cgt aag gac cct aac aag ctg 288 Pro Ala Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Lys Asp Pro Asn Lys Leu 85 90 95 gtg tta tgt gaa gtt ttc aag tac aat cga agg cct gca gag acc aat 336 Val Leu Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Arg Pro Ala Glu Thr Asn 100 105 110 ttg agg cac acc tgt aaa cgg ata atg gac atg gtg agc aac cag cac 384 Leu Arg His Thr Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His 115 120 125 ccc tgg ttt ggc atg gag cag gag tat acc ctc atg ggg aca gat ggg 432 Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly 130 135 140 cac ccc ttt ggt tgg cct tcc aac ggc ttc cca ggg ccc cag ggt cca 480 His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro 145 150 155 160 tat tac tgt ggt gtg gga gca gac aga gcc tat ggc agg gac atc gtg 528 Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Arg Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val 165 170 175 gag gcc cat tac cgg gcc tgc ttg tat gct gga gtc aag att gcg ggg 576 Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Ala Gly 180 185 190 act aat gcc gag gtc atg cct gcc cag tgg gaa ttt cag att gga cct 624 Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro 195 200 205 tgt gaa gga atc agc atg gga gat cat ctc tgg gtg gcc cgt ttc atc 672 Cys Glu Gly Ile Ser Met Gly Asp His Leu Trp Val Ala Arg Phe Ile 210 215 220 ttg cat cgt gtg tgt gaa gac ttt gga gtg ata gca acc ttt gat cct 720 Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 aag ccc att cct ggg aac tgg aat ggt gca ggc tgc cat acc aac ttc 768 Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe 245 250 255 agc acc aag gcc atg cgg gag gag aat ggt ctg aag tac atc gag gag 816 Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys Tyr Ile Glu Glu 260 265 270 gcc att gag aaa cta agc aag cgg cac cag tac cac atc cgt gcc tat 864 Ala Ile Glu Lys Leu Ser Lys Arg His Gln Tyr His Ile Arg Ala Tyr 275 280 285 gat ccc aag gga ggc ctg gac aat gcc cga cgt cta act gga ttc cat 912 Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Arg Leu Thr Gly Phe His 290 295 300 gaa acc tcc aac atc aac gac ttt tct ggt ggt gta gcc aat cgt agc 960 Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Gly Gly Val Ala Asn Arg Ser 305 310 315 320 gcc agc ata cgc att ccc cgg act gtt ggc cag gag aag aag ggt tac 1008 Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 ttt gaa gat cgt cgc ccc tct gcc aac tgc gac ccc ttt tcg gtg aca 1056 Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Phe Ser Val Thr 340 345 350 gaa gcc ctc atc cgc acg tgt ctt ctc aat gaa acc ggc gat gag ccc 1104 Glu Ala Leu Ile Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro 355 360 365 ttc cag tac aaa aat ta 1121 Phe Gln Tyr Lys Asn 370 <210> 80 <211> 373 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 Met Thr Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Gly Ile Lys Gln Val 1 5 10 15 Tyr Met Ser Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp 20 25 30 Ile Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp 35 40 45 Ser Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Thr Leu Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu Val 65 70 75 80 Pro Ala Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Lys Asp Pro Asn Lys Leu 85 90 95 Val Leu Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Arg Pro Ala Glu Thr Asn 100 105 110 Leu Arg His Thr Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His 115 120 125 Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly 130 135 140 His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro 145 150 155 160 Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Arg Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val 165 170 175 Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Ala Gly 180 185 190 Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro 195 200 205 Cys Glu Gly Ile Ser Met Gly Asp His Leu Trp Val Ala Arg Phe Ile 210 215 220 Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe 245 250 255 Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys Tyr Ile Glu Glu 260 265 270 Ala Ile Glu Lys Leu Ser Lys Arg His Gln Tyr His Ile Arg Ala Tyr 275 280 285 Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Arg Leu Thr Gly Phe His 290 295 300 Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Gly Gly Val Ala Asn Arg Ser 305 310 315 320 Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Phe Ser Val Thr 340 345 350 Glu Ala Leu Ile Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro 355 360 365 Phe Gln Tyr Lys Asn 370 <210> 81 <211> 154 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> combined synthetic polyadenylation sequence and pausing signal from the human alpha2 globin gene <220> <221> synthetic polyadenylation sequence <222> (1)..(49) <220> <221> cloning site <222> (50)..(62) <220> <221> pausing signal from the human alpha2 globin gene <222> (63)..(154) <400> 81 aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagta 60 ctaacatacg ctctccatca aaacaaaacg aaacaaaaca aactagcaaa ataggctgtc 120 cccagtgcaa gtgcaggtgc cagaacattt ctct 154 <210> 82 <211> 596 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IRES sequence <400> 82 gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60 gtgcgtttgt ctatatgtga ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120 ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180 gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240 aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300 tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360 acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420 aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480 gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540 gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataagcttg ccacaacccc gggata 596

Claims (15)

1. i) 관심의 폴리펩티드, 및

   ii) 진핵 숙주 세포에서 기능적인 선택가능한 마커 폴리펩티드를

   모두 암호화하기 위한 하나 이상의 암호화 서열을 포함하는 다중시스트론성 전사 유니트를 포함하고,

   (여기서, 상기 관심의 폴리펩티드는 선택가능한 마커 폴리펩티드의 것과 구별되는 전사 개시 서열을 갖고,

   여기서 상기 관심의 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 암호화 서열은 상기 다중시스트론성 전사 유니트 중의 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 암호화 서열의 상류에 있고,

   여기서, 내부 리보솜 엔트리 부위(IRES)는 관심의 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 암호화 서열의 하류 및 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 암호화 서열의 상류에 존재한다), 그리고

   상기 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열은

   a) GTG 시작 코돈;

   b) TTG 시작 코돈;

   c) CTG 시작 코돈;

   d) ATT 시작 코돈; 및

   e) ACG 시작 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 번역 시작 서열을 포함 하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
2. 제1항에 있어서, 상기 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 번역 시작 서열은 GTG 시작 코돈 또는 TTG 시작 코돈을 포함하는 것인 DNA 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 선택가능한 마커 폴리펩티드는 선택제의 치사 또는 성장-억제 효과에 대한 내성을 제공하는 것인 DNA 분자.
4. 제3항에 있어서, 상기 선택제는 제오신, 푸로마이신, 블라스티시딘, 히그로마이신, 네오마이신, 메토트렉세이트, 메티오닌 술폭시민 및 카나마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 분자.
5. 제3항에 있어서, 상기 선택제는 제오신인 DNA 분자.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 선택가능한 마커 폴리펩티드는 5,6,7,8-테트라히드로폴레이트 합성 효소(dhfr)인 DNA 분자.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 다중시스트론성 전사 유니트는 추가로 진핵 세포 중에서 작용하는 제2 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하고, 여기서 상기 제2 선택가능한 마커 폴리펩티드를 암호화 하는 서열은:

   a) 관심의 폴리펩티드의 것과 구별되는 번역 개시 서열을 갖고

   b) 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 상기 서열의 상류에 위치하고,

   c) 관심의 폴리펩티드의 시작코돈까지 상기 제2 선택가능한 마커 폴리펩티드의 시작코돈에 이어진 암호화 가닥에 ATG 서열을 갖지 않고, 그리고

   d) GTG 시작코돈 또는 TTG 시작코돈을 갖는 것인 DNA 분자.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트로, 상기 발현 카세트는 상기 다중시스트론성 전사 유니트의 상류에 프로모터와 다중시스트론성 전자 유니트의 하류에 전사 종결 서열을 포함하고, 여기서 상기 발현 카세트는 다중시스트론성 전사 유니트의 전사를 개시하기 위해 진핵 숙주세포에서 기능적인 발현 카세트.
9. 제8항에 있어서, 추가로 매트릭스 또는 골격 부착 영역(MAR/SAR), 절연 서열, 편재성 크로마틴 개방 요소(UCOE), 및 항-억제제(STAR) 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 크로마틴 조절 요소를 포함하는 것인 발현 카세트.
10. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 크로마틴 조절 요소는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-억제제 서열인 발현 카세트:

    a) SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66 중의 어느 하나;

    b) SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66 중 어느 하나의 단편 (여기서 상기 단편은 항-억제 활성을 갖는다)

    c) a) 또는 b)와 뉴클레오티드 서열에서 최소한 70%가 동일한 서열(여기서, 상기 서열은 항-억제 활성을 갖는다); 및

    d) a) 내지 c)중 어느 하나의 보체.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포로, 상기 숙주세포는 바람직하기는 포유동물 세포이고, 바람직하기는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 숙주 세포.
12. 관심의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 숙주세포를 발생시키는 방법으로, 상기 방법은:

    a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 다수의 전구체 세포에 도입하는 단계, 및

    b) 다수의 전구체 세포를 선택가능한 마커 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 및

    c) 관심의 폴리펩티드를 발현하는 하나 이상의 숙주세포를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
13. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 포함하는 숙주세포를 배양하고, 상기 발현 카세트로부터 관심의 폴리펩티드를 발현하는 것을 포함하는, 관심의 폴리펩티드를 발현하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 추가로 관심의 폴리펩티드를 수확하는 것을 포함하는 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 숙주 세포는 dhfr^- 혈청형을 갖는 CHO 세포이고, 여기서 발현 카세트는 5,6,7,8-테트라히드로폴레이트 합성 효소(dhfr)인 선택가능한 마커 폴리펩티드에 대한 암호화 서열을 포함하고, 여기서 상기 세포는 폴레이트를 함유하는 배지에서 배양되고 상기 배지는 본질적으로 히포크산틴과 티미딘이 없는 것인 방법.

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