JP2009527240A - 高レベルでタンパク質を発現する宿主細胞の選択 - Google Patents
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Abstract
Description
使用したコンストラクトを図1に概略して示す。制御コンストラクトは、CMVプロモーター、d2EGFP遺伝子、IRES配列(本実施例において使用したIRESの配列(Reesら,1996)は:GCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCCCGGGATA;配列番号82である)、及びTTG Zeo選択マーカー、すなわちTTG開始コドンを有するゼオシン耐性遺伝子からなる(「d2EGFP-IRES-TTG Zeo」)。他のコンストラクトは同様であるが、発現カセットの上流にSTAR7及びSTAR67を組み合わせたものを配置し、カセットの下流にSTAR7を配置した(「STAR7/67 d2EGFP-IRES-TTG Zeo STAR7」)。両コンストラクトをCHO-K1細胞にトランスフェクトし、培地中100μg/mlのゼオシンで選択を行った。制御コンストラクトでトランスフェクションした後、4つのコロニーが現れ、STAR含有コンストラクトでは6つのコロニーが現れた。これらの独立したコロニーを分離し、d2EGFPの発現レベルの分析前に増殖させた。図1に示すように、コンストラクトにおけるSTARエレメントの組み込みによって、d2EGFPの高い発現レベルを有するコロニーが形成された。STARエレメントがないコントロールのコロニー(「d2EGFP-IRES-TTG Zeo」)のうち1つのコロニーのみ、いくらかのd2EGFPの発現を示した。また、発現レベルは、STARエレメントを有するか又は有さない、標準のATG開始コドンを有する、通常のZeoとともにIRESを含有する他の制御コンストラクト(「d2EGFP-IRES-ATG Zeo」及び「STAR 7/67 d2EGFP-IRES-ATG Zeo STAR7」;これらのATG Zeoコンストラクトにおいても、STARエレメントの増大効果があるが、これらは、新規のTTG Zeoバリアントと比較して小幅である」)で得られたものより、はるかに高い。
TTG Zeo選択マーカーがd2EGFPレポーター遺伝子の上流に配置され、dhfr選択マーカーがd2EGFP遺伝子の下流に配置され、IRES配列によって連結されているコンストラクトを作製した(図2)。これらのコンストラクトは、STARs 7/67/7によって挟まれている。これらのコンストラクトの3つのバージョン:ATG dhfr、GTG dhfr又はTTG dhfr(各々の名前はdhfr遺伝子に使用した開始コドンを示す)を作製した。コンストラクトをCHO-DG44細胞にトランスフェクトした。DNAを、リポフェクタミン 2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクトし、細胞を、IMDM培地(Gibco)+10%FBS(Gibco)+HT-補充において400μg/mlのゼオシンの存在下で増殖させた。
(1)培地中、400μg/mlのゼオシンあり、ヒポキサンチン及びチミジンあり(HT-補充)
(2)培地中、ゼオシンなし、HT補充あり、
(3)ゼオシンなし、HT補充なし
の下で培養した。
先行技術におけるdhfr遺伝子の選択マーカーとしての使用は、多くの場合、dhfr遺伝子の増幅に依存する。毒性物質であるメトトレキサートをそのようなシステムに用いて、dhfr遺伝子を増幅させ、それとともに、付随して、望ましい導入遺伝子を増幅させ、該導入遺伝子の最大で何千ものコピーが、そのような増幅の後、CHO細胞のゲノムに組み込まれているのを見ることができる。これらの高いコピー数によって、高い発現レベルがもたらされるが、それらは、非常に多くのコピーがゲノムの不安定性の増加を引き起こし、さらに、培地からのメトトレキサートの除去によって増幅した遺伝子座の多くが急速に除去されるようになるので、不利益であるとも考えられている。
d2EGFP値を測定した同じ日(65)において、実施例2に記載したクローンからDNAを単離した。このDNAを用いて、d2EGFPのコピー数を決定した。
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Claims (15)
- i)所定のポリペプチドと、
ii)真核宿主細胞において機能する選択可能なマーカーポリペプチドとの両方をコードするマルチシストロニックな転写ユニットを含み、
前記所定のポリペプチドが前記選択可能なマーカーポリペプチドとは別に翻訳開始配列を有し、
前記所定のポリペプチドのコード配列の少なくとも1つが、前記マルチシストロニックな転写ユニットにおいて前記選択可能なマーカーポリペプチドのコード配列の少なくとも1つから上流にあり、
配列内リボソーム進入部位(IRES)が、前記所定のポリペプチドのコード配列の少なくとも1つから下流に、かつ前記選択可能なマーカーポリペプチドのコード配列の少なくとも1つから上流に存在するDNA分子であって、
前記選択可能なマーカーポリペプチドをコードするコード配列が、
a)GTG開始コドン、
b)TTG開始コドン、
c)CTG開始コドン、
d)ATT開始コドン、及び
e)ACG開始コドン
からなる群より選択される翻訳開始配列を含むことを特徴とする、DNA分子。 - 前記選択可能なマーカーポリペプチドの翻訳開始配列がGTG開始コドン又はTTG開始コドンを含む請求項1記載のDNA分子。
- 前記選択可能なマーカーポリペプチドが、選択薬剤の致死又は成長阻害効果に対する耐性を与える請求項1又は2記載のDNA分子。
- 前記選択薬剤が、ゼオシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキサート、メチオニンスルホキシミン及びカナマイシンからなる群より選択される請求項3記載のDNA分子。
- 前記選択薬剤がゼオシンである請求項3記載のDNA分子。
- 前記選択可能なマーカーポリペプチドが5,6,7,8−テトラヒドロ葉酸合成酵素(dhfr)である請求項1又は2記載のDNA分子。
- 前記マルチシストロニックな転写ユニットが、さらに、真核細胞において機能する第2の選択可能なマーカーポリペプチドをコードする配列を含み、前記第2の選択可能なマーカーポリペプチドをコードする配列が、
a)所定のポリペプチドのものとは別の翻訳開始配列を有し、
b)所定のポリペプチドをコードする前記配列の上流に位置し、
c)前記第2の選択可能なマーカーポリペプチドの開始コドンの後、所定のポリペプチドの開始コドンまでのコード鎖においてATG配列を有さず、
d)GTG開始コドン又はTTG開始コドンを有する
請求項1〜6のいずれか1項に記載のDNA分子。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNA分子を含む発現カセットであって、前記発現カセットが前記マルチシストロニックな転写ユニットの上流にプロモーターを、前記マルチシストロニックな転写ユニットの下流に転写終結配列を含み、前記発現カセットが、前記マルチシストロニックな転写ユニットの翻訳を開始させるために真核宿主細胞において機能する、発現カセット。
- さらに、マトリックス又は足場付着領域(MAR/SAR)、インスレーター配列、遍在性クロマチンオープニングエレメント(ubiquitous chromatin opener element、UCOE)、及び抗リプレッサー(STAR)配列からなる群より選択されるクロマチン制御エレメントを少なくとも1つ含む請求項8記載の発現カセット。
- 前記少なくとも1つのクロマチン制御エレメントが、
a)配列番号1〜配列番号66のいずれか1つ、
b)配列番号1〜配列番号66のいずれか1つの断片であって、抗リプレッサー活性を有する断片、
c)a)又はb)とヌクレオチド配列において少なくとも70%同一である配列であって、抗リプレッサー活性を有する配列、並びに
d)a)〜c)のいずれか1つとの相補体
からなる群より選択される抗リプレッサー配列である請求項9記載の発現カセット。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNA分子又は請求項8〜10のいずれか1項に記載の発現カセットを含み、好ましくは哺乳類細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である宿主細胞。
- 所定のポリペプチドを発現することが可能な宿主細胞を生成する方法であって、
a)請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNA分子又は請求項8〜10のいずれか1項に記載の発現カセットを複数の前駆細胞に導入するステップと、
b)選択可能なマーカーポリペプチドの発現に適した条件下で複数の前駆細胞を培養するステップと、
c)所定のポリペプチドを発現する少なくとも1つの宿主細胞を選択するステップ
とを含む前記宿主細胞を生成する方法。 - 請求項8〜10のいずれか1項に記載の発現カセットを含む宿主細胞を培養することと、前記発現カセットから所定のポリペプチドを発現させることとを含む、所定のポリペプチドを発現させる方法。
- さらに、所定のポリペプチドを回収することを含む請求項13記載の方法。
- 前記宿主細胞が、dhfr-表現型を有するCHO細胞であり、前記発現カセットが、5,6,7,8−テトラヒドロ葉酸合成酵素(dhfr)である選択可能なマーカーポリペプチドのコード配列を含み、前記細胞を、葉酸を含む培地で培養し、該培地がヒポキサンチン及びチミジンを本質的に欠く請求項13又は14記載の方法。
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