KR20080101988A - 인간 간암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래 간암면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법 - Google Patents

인간 간암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래 간암면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20080101988A
KR20080101988A KR1020070048213A KR20070048213A KR20080101988A KR 20080101988 A KR20080101988 A KR 20080101988A KR 1020070048213 A KR1020070048213 A KR 1020070048213A KR 20070048213 A KR20070048213 A KR 20070048213A KR 20080101988 A KR20080101988 A KR 20080101988A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
liver cancer
leu
glu
ala
ser
Prior art date
Application number
KR1020070048213A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100900742B1 (ko
Inventor
배용수
이현수
민미경
정철웅
강규호
Original Assignee
크레아젠 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 크레아젠 주식회사 filed Critical 크레아젠 주식회사
Priority to KR1020070048213A priority Critical patent/KR100900742B1/ko
Priority to EP08723457A priority patent/EP2145013A4/en
Priority to PCT/KR2008/001420 priority patent/WO2008143400A1/en
Priority to US12/451,508 priority patent/US20100235932A1/en
Priority to JP2010506034A priority patent/JP2010527234A/ja
Priority to CN2008800164235A priority patent/CN101680016B/zh
Publication of KR20080101988A publication Critical patent/KR20080101988A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100900742B1 publication Critical patent/KR100900742B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001148—Regulators of development
    • A61K39/00115—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
    • A61K39/001151—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K39/001181—Alpha-feto protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001188—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464448—Regulators of development
    • A61K39/46445—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
    • A61K39/464451—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464474—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46448—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K39/464481—Alpha-feto protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/464488—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/53—Liver
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 간암 동물모델을 개발하고 이를 이용한 간암 면역치료제 또는 예방제로서의 수지상 세포의 효능을 분석하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 다음의 단계를 포함하는 인간 간암 동물모델을 이용한 간암 면역치료제 또는 예방제로서의 수지상 세포의 효능을 분석하는 방법에 관한 것이다. (a) 인간 간암항원을 마우스 세포주에 항구적으로 발현시켜 인간 간암항원을 발현하는 재조합 마우스 암 세포주를 만드는 단계 (b) (b‘) 분석 대상의 수지상 세포를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계 또는 (b“) 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하여 암을 유발시키는 단계, (c) (c’) 상기 단계 (b)에서 (b‘)을 실시한 경우, 상기 동물에게 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 투여하는 단계 또는 (c”) 상기 단계 (b)에서 (b“)을 실시한 경우, 상기 암이 유발된 동물에게 분석 대상의 수지상 세포를 투여하는 단계; 및 (d) 상기 동물에서 암 세포의 형성 또는 성장을 측정하여 간암 면역치료제 또는 예방제로서의 수지상 세포의 효능을 결정하는 단계.
간암 면역치료제, 세포치료제, 수지상세포, 간암특이항원, 인간간암 동물모델, 수지상세포 효능결정

Description

인간 간암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래 간암 면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법{Animal Models Carrying Tumors Expressing Human Liver Cancer-Specific Antigen and Method for Analyzing Prevention and Treatment Efficacy of Dendritic Cells-Derived Immunotherapeutics Using the Above}
도 1은 간암-특이 항원, AFP(ALPHA-FETOPROTEIN), MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53), GPC3(GLYPICAN3) 및 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)의 PCR 증폭 산물을 보여주는 젤 사진이다. 재조합 항원 단백질을 얻기 위하여, HepG2, ZR-75-1(인간 간암 세포주), Sk-BR3(인간 유방암 세포주)로부터 cDNA를 합성하여 AFP(ALPHA- FETOPROTEIN), MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53), GPC3(GLYPICAN3) 및 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)를 PCR 증폭하였다. M 레인은 마커; 1 레인은 AFP(ALPHA- FETOPROTEIN) 1/2N (1040 bp); 2 레인은 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN) 2/3N (1454 bp); 3 레인은 GPC3(GLYPICAN3) 1/2N (998 bp); 4 레인은 P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 2/3N (980 bp); 5 레인은 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1) (540 bp); 6 레인은 MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)(929 bp)에 해당하는 것이다.
도 2는 간암-특이 항원을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 유전자 지도이다. HepG2, ZR-75-1(인간 간암 세포주), Sk-BR3(인간 유방암 세포주)로부터 합성된 cDNA를 주형으로 하여 AFP, MAGE1, P53, GPC3(GLYPICAN3) 및 NY-ESO-1를 PCR 증폭하였다. 이들의 발현을 위하여, 진핵세포용 벡터(pcDNA3.1-36A) 및 원핵세포용 벡터(pCTP)에 클로닝 하였다. 벡터의 유전자 지도에서, 36A는 36A Tag을 코딩하는 서열이며, CMV promoter는 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus)의 프로모터이고, BGH pA는 소성장호르몬 유전자의 폴리 아데닐화 서열이며, f1 ori는 f1 복제원점을 나타내고, SV40 ori는 SV40 복제원점을 나타내며, 항생제 이름이 기재된 것은 그 항생제-내성 유전자를 나타낸다. 진핵세포 벡터에서 발현된 단백질의 확인을 용이하게 하기 위해 (주) 크레아젠에서 개발된 36A Tag 유전자를 삽입하였다. Tag 도입에 사용한 프라이머는, Tag-XhoI/s(5'-ACCCTCGAGGTCCATGACCGGAGGTCAGCAGATGGGTCGCGACCTGTACGACGA-3') 및 Tag-XbaI/as(5'-ACCTC TAGATTAGCTTCCCCATCTGTCCTTGTCGTCATCGTCGTACAGGTCGCG-3')이었고, 94℃, 30sec; 52℃, 30sec; 및 72℃, 5min, 총 1 사이클을 수행하여 tag DNA 단편을 확보하였다. 36A Tag의 아미노산 서열은 SMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGS 이고, 뉴클레오타이드 서열은 TCC ATG ACC GGA GGT CAG CAG ATG GGT CGC GAC CTG TAC GAC GAT GAC GAC AAG GAC AGA TGG GGA AGC 이다. 36A 서열의 경우 MCS 와 BGH pA 사이에 (XhoI- 36A-Stop-XbaI)의 형태로 삽입되어 있다. 36A Tag의 보다 자세한 내용은 대한민국 등록특허 제10-0295558호에 기재되어 있다.
도 3은 형질전환 세포에서 발현된 간암 항원에 대한 웨스턴 블롯팅 분석결과를 보여준다. pcDNA3.1-HA-36A/AFP(ALPHA-FETOPROTEIN), pcDNA3.1-HA-36A/MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1), pcDNA3.1-HA-36A/P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 및 pcDNA3.1-HA-36A/GPC3(GLYPICAN3) 재조합 플라스미드를 MH134 세포주에 형질감염시켜 G418으로 선별 후 안정화된 세포주에서 도입된 항원 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 분석 항체는 유전자 특이적 항체를 각각 사용하였다(항-AFP 항체, H-140 SantaCruz; 항-MAGE1 항체, ab3211 Abcam; 항-P53 항체, MAB1355 R&D systems; 항-GPC3 항체, AF2199 R&D systems).
도 4는 MH134 세포에 도입된 간암 항원(AFP, P53, MAGE1 및 GPC3)의 발현 안정성을 보여주는 RT-PCR 분석 결과이다. 제작된 안정화 세포주 각각을 G418이 첨가되지 않은 배지에서 배양하였고, 20일째 1 × 106 세포를 수거하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 음성 대조군(Negative Control)으로서, 형질전환 되지 않은 MH134 세포를 사용하였다.
도 5는 간암 항원 단백질(AFP, MAGE1, GPC3, P53 및 NY-ESO-1)의 SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블롯팅 결과를 보여준다. pCTP 벡터에 각각의 항원 유전자를 클로닝하고 BL21-gold(DE3)에서 발현시켰다. 발현된 CTP-결합 재조합 단백질을 12 ％ SDS-PAGE와 웨스턴 블롯팅 방법으로 확인하였다. 레인 M은 분자량 마커; 레인 1, 2는 CTP-AFP 1/2N 펠릿과 상등액; 레인 3, 4는 CTP-AFP 2/3N 펠릿과 상등액; 레인 5, 6은 CTP-GPC3 1/2N 펠릿과 상등액; 레인 7, 8은 CTP-P53 2/3N 펠릿과 상등액; 레인 9, 10은 CTP-NY-ESO1 펠릿과 상등액; 레인 11, 12는 CTP-MAGE1 펠릿과 상등액; 레인 13, 14는 CTP-MAGE3 펠릿과 상등액에 대한 것이다.
도 6a 및 6b는 C3H/HeN 마우스에서 대조군 MH134 세포 및 인간 간암 특이 항원을 발현하는 재조합 MH134 를 투여 시 유도된 고형암의 상대적 성장속도를 보여준다. C3H/HeN 마우스에 3×105 의 대조군 MH134 세포 및 재조합 MH134 를 피하(SC, subcutaneous) 주사 하고, 30일 이후에 암의 형성 및 성장을 관찰하였다(도 6a). C3H/HeN 마우스에 5×105 의 대조군 MH134 세포 및 재조합 MH134를 피하 주사하고 30일 이후에 암의 형성 및 성장을 관찰하였다(도 6b). 재조합 암세포주 접종 후 3일 간격으로 암의 크기를 측정하였다.
도 7은 수지상세포(DC, dendritic cell) 백신 투여 시 재조합 MH134 세포주에 의한 종양형성 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 종양항원에 감작된 수지상세포에 의한 종양 예방 효과를 확인하기 위하여, 1주 간격으로 1× 106 항원감작 DC/ 마우스의 투여량으로 2회 피하(SC, subcutaneous) 주사하였고, 1주일 후에 각각의 안정된 재조합 암세포주를 3× 105 세포/마우스의 투여량으로 피하 주사하였다. 주사 후 2일 간격으로 종양 크기를 측정하였다.
도 8은 수지상세포에 의한 암 예방모델에서 생존기간을 그래프로 보여주는 결과이다. 수지상세포(DC) 백신 2회 투여 후 각각의 재조합 종양세포주를 챌린징하고 이후 살아남은 마우스 수를 수치화 한 그래프이다. 50 일째 까지의 관찰 결과 대조군의 모든 마우스가 사망한 이후에도 수지상 세포를 주사한 실험군의 생존을 확인할 수 있었다.
도 9은 수지상세포 백신 투여 후 재조합 종양세포주의 폐전이(pulmonary metastasis) 도전 실험에서 수지상세포 백신의 폐전이 예방 효과를 보여주는 사진이다. CTP-AFP1 으로 감작된(pulsed) 수지상세포를 1주 간격으로 2회 투여한 후 1주째에, 마우스 피내로 재조합 간암 세포주 (MH134/AFP) 를 접종하고 20일 후 폐를 추출하여 촬영한 사진이다.
도 10은 종양이 형성된 마우스에서 종양 성장에 대한 수지상세포 백신의 치료 효과를 보여준다. 인간 간암 항원을 발현하는 마우스 암 세포주를 3× 105 세포/마우스로 피하에 접종하고, 3일 후, CTP-MAGE1 또는 CTP-AFP 재조합 간암 항원으 로 감작한 골수 유래 수지상세포(Bm-DC)를 각 마우스군의 1 × 106 항원감작 DC/마우스의 투여량으로 피하에 1주 간격으로 2차례 접종하였다. 접종 2일째부터 매 2일 간격으로 암의 형성 및 크기를 조사하고 20일째 사진을 촬영하였다.
도 11a는 수지상세포 백신으로 치료한 마우스에서 암항원-특이적인 세포독성임파구(CTL) 생성정도를 보여주는 그래프이다. 수지상세포 백신을 투여받은 마우스에서 비장을 분리하여 T 세포를 분리하였고, 각각의 CTP-항원으로 처리된 항원제시세포(APC)와 5 : 1 (T세포 : APC)로 혼합하여 5일간 배양한 후 각각의 해당 간암 항원 발현 재조합 세포주를 표적세포(target cell)로 세포 독성 임파구 생성정도를 측정한 그래프이다. 이때 배양 상등액에서 IFN-γ 와 IL-4의 발현을 ELISA로 확인하였으며(도 11b), T-세포 증식능을 MTT assay로 확인하였다(도 11c).
본 발명은 간암 면역치료제 또는 예방제로서의 수지상 세포의 효능을 분석하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 간암 동물모델을 이용한 간암 면역치료제 또는 예방제로서의 수지상 세포의 효능을 분석하는 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 간암의 연간 발병율은 전체 암의 4 ％인 56 만명 수준이며 이 중 39 만명 이상의 환자가 아시아에 거주한다. 우리나라에서는 매년 1만2천명 - 1만5천명의 간암환자가 발생하는데 이는 위암에 이어 2위로 폐암과 비슷한 발생률이며 사망률에 있어서도 폐암, 위암에 이어 3위 이므로 국가적으로 간과할 수 없는 중요 질환이다. 한국인 간암의 70％는 B형 간염바이러스 감염에 기인하고, C형 간염바이러스에 의한 것이 13％ 정도, 기타가 18％ 정도를 차지한다고 알려져 있다.
간암은 원발성 암과 전이암으로 분류되며 원발성 간암 중 가장 흔한 것은 간세포암 (hepatocellular carcinoma 또는 HCC)으로 만성간질환 환자에게서 가장 빈번하게 발병하는 악성질환이며 간문맥을 통한 전이암의 발생률도 높다. 현재 간질환 치료제로 개발되어 사용 중인 것은 주로 간염치료제이며 Interferon과 라미뷰딘이 대표적이다. 라미뷰딘은 인터페론과는 달리 부작용이 별로 없고, 먹는 약으로 사용이 간편하나 시판 후 3년이 된 현재 약제에 내성을 가진 바이러스의 출현이 거의 50%에 달한다고 보고되고 있고 간암으로 진전된 환자에게는 거의 효과가 없다. 간암은 초기에는 증상이 거의 없으며 이미 증상이 나타난 후에 발견되는 간암은 상당히 진전된 경우가 대부분이며 간암치료 방법은 간 절제술이 일차적이나 간암 환자 중 간절제술이 가능한 경우는 일부에 지나지 않으며 기타 치료방법으로 간이식, 전신적 화학요법, 방사선치료, 고주파열 치료법들의 사용이 가능하지만 재발률이 높고 이식 후 거부 반응 등의 부작용이 심해 도움을 주지 못하는 경우가 많다. 성공적인 절제라 하더라도 연간 재발률이 25%이며, 크기 2-3 cm인 소간암 경우 가장 좋은 수술 성적을 보이는 것으로 알려져 있으나, 이러한 소간암 경우에 있어서도 수술 후 3년 이내에 재발할 가능성이 50% 이상이다.
이러한 간암재발의 원인은 첫째, 수술시 전신적으로 퍼져 발생하는 미세전이(micrometastasis)의 진행으로 인해, 둘째, 거의 대부분 간경변증을 동반하고 있기 때문에 새로이 간암이 발생할 위험이 높기 때문으로 알려져 있다. 이와 같이 기존의 암 치료법으로 예후가 개선되지 아니하는 국내 암환자들을 위한 치료법으로서 기존 항암 치료와는 달리 부작용이나 환자 고통이 거의 없는 최첨단의 세포면역 치료법의 개발은 절실히 요구되는 추세이다.
수지상세포(dendritic cell) 를 이용한 항암백신치료는 최근에 개발된 적극적 면역 치료법(active immunotherapy) 으로서 기존의 사멸암세포 백신을 이용한 면역 치료법보다 강력하고, 환자의 T 세포를 체외에서 증식시킨 후 주입하는 소극적 면역 치료(passive immunotherapy)보다 효과가 장기적이며, IL-2 와 IFN-α 등의 사이토카인을 다량 직접 투여하는 것보다 훨씬 안전한 것으로 평가되고 있다. 또한 전이성 혹은 재발성 말기 암의 초기 치료에 매우 효과가 있을 뿐 아니라, 시술 과정에서 조직 적합항원의 문제가 없어, 환자에게 거의 고통을 주지 않고 부작용도 없는 무독성의 치료법이다. 수지상세포(DC)를 이용한 항암백신치료는 그 약리기전상, 일시에 거대한 암조직을 축소시키는 효과는 적지만, 몸의 항암면역을 유도하여 일차 치료 후 최소 질환의 상태에서나 미세전이(micrometastasis) 와 같은 전이 초기단계에서, 재발이나 심각한 전이(overt metastasis)를 억제하는데 매우 효과가 높은 것으로 평가된다. 이러한 수지상세포를 이용한 면역치료의 임상시험을 위해서는 우선 동물모델에서 효과성과 안전성이 확인되어야 하지만, 현재까지 사람 간암에 대한 수지상세포 백신의 효능을 평가할 만한 간암 동물모델이 없는 실 정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 상술한 당업계의 요구를 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 인간 간암-특이 항원을 발현하는 이종(xenogenic) 암 세포주를 구축하고 이를 이용하여 간암 동물모델을 구축한 다음 이를 이용하여 수지상 세포의 효능을 검사하였으며, 그 결과 수지상 세포의 간암 면역치료제 또는 면역예방제로서의 효능을 정확하게 분석할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 목적은 인간 간암 면역치료제 또는 예방제로서의 수지상 세포의 효능을 분석하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인간 간암-특이 항원 발현 마우스-유래 간암세포주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 간암 마우스(Mus musculus) 모델을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인간 간암 동물모델을 이용한 수지상세포-유래 간암 면역치료제의 간암 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법을 제공한다: (a) (a') 분석 대상의 수지상세포를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계 또는 (a") 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하여 암을 유발시키는 단계; (b) (b') 상기 단계 (a)에서 (a')을 실시한 경우, 상기 동물에게 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 투여하는 단계 또는 (b") 상기 단계 (a)에서 (a")을 실시한 경우, 상기 암이 유발된 동물에 분석 대상의 수지상 세포를 투여하는 단계; 및 (c) 상기 동물에서 암 세포의 형성 또는 성장을 측정하여 수지상세포-유래 간암면역치료제의 예방 및 치료 효능을 결정하는 단계.
본 발명은 (i) 인간 간암항원을 마우스 세포주에 항구적으로 발현시켜 인간 간암항원을 발현하는 재조합 마우스 세포주, (ii) 수지상 세포-유래 간암 면역치료제의 효능을 분석하는 방법 및 (iii) 수지상 세포-유래 간암 면역예방제의 효능을 분석하는 방법으로 크게 구별될 수 있다.
따라서, 본 발명의 수지상 세포-유래 간암 면역치료제의 효능을 분석하는 방법은, (a") 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 인간을 제외한 정상동물 에 투여하여 암을 유발시키는 단계; (b") 상기 암이 유발된 동물에게 분석 대상의 수지상 세포를 투여하는 단계; 및 (c) 상기 동물에서 암 세포의 형성 또는 성장을 측정하여 수지상 세포-유래 간암면역치료제의 효능을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 간암 면역예방제로서의 수지상세포의 효능을 분석하는 방법은, (a') 분석 대상의 수지상 세포를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계; (b') 상기 동물에게 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 투여하는 단계; 및 (c) 상기 동물에서 암 세포의 형성 또는 성장을 측정하여 수지상 세포-유래 간암 면역치료제의 효능을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 인간 수지상 세포-유래 간암 면역 치료제 또는 예방제의 효능을 동물모델을 이용하여 처음으로 분석한 것이다. 종래에는, 이러한 효능 분석을 위해 적합한 동물모델이 제시된 바 없다.
본 발명의 방법에 있어서, 이용되는 동물은 인간을 제외한 어떠한 동물도 가능하며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 설치류 동물이며, 보다 더 바람직하게는 마우스(Mus musculus)이고, 가장 바람직하게는 C3H/HeN 마우스이다. 본 명세서에서, 용어 “정상동물”은 암이 발생되지 않은 동물을 의미한다.
본 발명의 방법에 있어서, 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 구축하기 위하여 이용되는 항원은 인간 간암에서 특이적으로 발현되는 어떠한 항원도 이용 가능하다. 바람직하게는, 상기 인간 간암-특이 항원은 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN), GPC3(GLYPICAN3), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53), MGAE1 또는 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1; CTAG1)이고, 보다 바람직하게는 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN), GPC3(GLYPICAN3), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 또는 MGAE1이며, 보다 더 바람직하게는 AFP(ALPHA- FETOPROTEIN) 또는 GPC3(GLYPICAN3)이고, 가장 바람직하게는 AFP(ALPHA- FETOPROTEIN)이다. 상기 항원들은 자연의(natural-occurring) 전장을 이용할 수 있지만, 전장의 일부일 수도 있다.
바람직하게는, AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)의 경우 아미노산 서열 1-346 또는 1-484 (참조: 서열목록 제13서열 또는 제14서열), GPC3(GLYPICAN3)의 경우 아미노산 1-332 (참조: 서열목록 제15서열), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)의 경우 아미노산 1-326 (참조: 서열목록 제16서열), NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1; CTAG1)의 경우 아미노산 1-180 (참조: 서열목록 제17서열), 그리고 MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)의 경우 아미노산 1-309 (참조: 서열목록 제18서열)에 해당하는 서열을 항원으로 이용한다.
정상동물에서 암을 유발하는 데 이용되는 암 세포주는 다양한 동물에서 유래된 것이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 암세포의 수용자(recipient)인 동물에 대하여 동종이질(allogeneic) 또는 동종동질(syngeneic)의 암 세포주이고, 보다 바람직하게는 동종동질의 암 세포주이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 정상동물로서 마우스가 이용되고 암 세포주로서 마우스-유래 암 세포주가 이용되며, 보다 바람직한 구현예에서, 정상동물로서 C3H/HeN 마우스가 이용되고 암 세포주로 MH134 마우스-유래 암 세포주가 이용된다.
본 발명에서 이용되는 암 세포주는 간암 세포주, 위암 세포주, 뇌암 세포주, 폐암 세포주, 유방암 세포주, 난소암 세포주, 기관지암 세포주, 비인두암 세포주, 후두암 세포주, 췌장암 세포주, 방광암 세포주, 결장암 세포주 및 자궁경부암 세포주 등을 포함한다. 가장 바람직하게는, 동일 암세포주인 간암 세포주 (예컨대, MH134 세포주)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주는 간암세포에서 유래된 것이다. 한편, 마우스 유래 간암 세포주(C57BL/6 마우스, C3H/HeN 마우스 및 BALB/c 마우스 유래 간암 세포주)가 있기는 하지만, 상기 보고된 간암-특이 항원의 발현이 확인되지 않아 간암 항원 특이적인 수지상세포-유래 면역치료제의 효과를 확인할 수 없는 단점이 있기 때문에, 본 발명의 방법에 직접 사용하기에는 적합하지 않다. 만일, 암세포주로서 간암 세포주가 이용되고, 암 세포주의 수용자로서 C3H/HeN 마우스가 이용되는 경우에는, 동종동질의 간암세포주인 MH134를 이용하는 것이 가장 바람직하다.
인간 간암-특이 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 마우스 유래 간암 세포주를 형질전환하여 본 발명의 암 세포주로 이용한다. 인간 간암-특이 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 자연의(natural-occurring) 전장을 이용할 수 있지만, 전장의 일부일 수도 있다. 바람직하게는, AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)의 경우 아미노산 서열 1-346 또는 1-484를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, GPC3(GLYPICAN3)의 경우 아미노산 1-332을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)의 경우 아미노산 1-326를 인코딩하는 뉴 클레오타이드 서열, NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1; CTAG1)의 경우 아미노산 1-180을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 그리고 MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)의 경우 아미노산 1-309를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 보다 바람직하게는 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)의 경우는 서열목록 제1서열의 7-1044 뉴클레오타이드 또는 서열목록 제2서열의 7-1458 뉴클레오타이드, GPC3(GLYPICAN3)의 경우는 서열목록 제3서열의 7-1002 뉴클레오타이드, P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)의 경우는 서열목록 제4서열의 7-984 뉴클레오타이드, NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)의 경우는 서열목록 제5서열의 7-546 뉴클레오타이드, 그리고 MAGE 1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)의 경우는 서열목록 제6서열의 7-933 뉴클레오타이드이다.
이러한 인간 간암-특이 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 다양한 방법을 통하여 얻을 수 있으며, 예를 들어, 인간-유래 간암 세포주(예컨대, HepG2, ZR75-1, SK-BR-3)의 총 RNA를 분리한 다음, 공지의 인간 간암- 특이 항원의 서열을 참조하여 제작된 프라이머를 이용하여 cDNA를 제조한다. 이어, 상기 cDNA를 적합한 동물세포 발현용 벡터(예컨대, pcDNA3.1(+))에 클로닝한 다음, 마우스 간암 세포(예컨대, MH134 세포주)에 형질감염시킨다. 형질감염된 암 세포 중 인간 간암-특이 항원을 발현하는 세포를 선별하여 최종적으로 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 확립한다.
상술한 바와 같이, 인간 간암-특이 항원을 발현하는 마우스 유래 간암 세포 주는 본 발명자들이 최초로 구축한 것이다. 이러한 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주는, 발현된 인간 간암항원을 프로세싱하여 (펩타이드 형태로 분해되어) 조직적합항원인 클래스 I 분자에 실어 세포 표면에 제시(presentation)한다. 결국, 이러한 암 세포주는 인간 간암 항원에 특이적으로 반응하는 T 세포에 의해 인식되는 특성을 갖게 된다.
한편, 본 발명에서 분석 대상으로 사용되는 수지상 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 얻는다. 예를 들어, 수지상 세포는 단핵구, 조혈 모세포 또는 골수세포를 이용하여 수득할 수 있다.
구체적인 실시예로서, 골수세포를 이용하여 수지상 세포를 수득하는 과정은 다음과 같다: 우선, 마우스의 대퇴골과 경골로부터 골수세포를 추출한 다음, 골수세포를 수지상 세포로 분화시키기 위하여, 적합한 사이토카인(예컨대, IL-4 및 GM-CSF)을 포함하는 배지에서 골수세포를 배양한다. 이어, 분화 유도된 미성숙 수지상 세포를 인간 간암 특이 항원으로 감작(pulsing)시키고 적합한 사이토카인이 포함된 배지에서 배양하여 성숙 수지상 세포를 얻고 이를 분석 대상으로 이용한다. 상기 감작시키는 과정에서, 바람직하게는, 인간 간암 특이 항원에 본 발명자들이 이전에 개발한 CTP(cytoplasmic transduction peptide)가 결합된 것으로 감작시킨다. CTP는 인간 간암 특이 항원을 핵이 아닌 세포질로 운반하기 때문에, 수지상 세포가 보다 효과적으로 도입된 항원을 클레스 I 분자를 통해 제시할 수 있게 되어 DC 백신 투여 시 강력한 항원특이 CTL을 유도하는데 매우 유리하다. CTP의 상세한 내용은 대한민국 등록특허 제10-0608558호 에 개시되어 있으며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입되어 있다.
분석 대상의 수지상 세포를 동물에게 투여하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내 주입 또는 피하 주입(subcutaneous injection)이며, 가장 바람직하게는 피하 주입이다. 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 정상동물에게 투여하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내 주입 또는 피하 주입이며, 가장 바람직하게는 피하 주입이다 (Fong, L. et al., Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients. J. Immunol. 166:4254.(2001)).
본 발명의 방법의 상기 단계 (a)에서 투여되는 수지상 세포의 양은 일반적인 마우스를 기준으로 하여 1×104 - 1×108 세포, 바람직하게는 1×105 - 1 × 107 세포, 보다 바람직하게는 약 1 × 106세포이다. 이러한 수지상 세포의 적합한 투여 간격(예컨대, 1주 간격)으로 2회 이상 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 방법의 상기 단계 (a)에서 투여되는 암 세포주의 양은 일반적인 마우스를 기준으로 하여 1 × 104 - 1 × 108 세포, 바람직하게는 1 × 105 - 1 × 107 세포, 보다 바람직하게는 약 3 × 105 세포이다.
일반적인 기술 상식에 따르면, 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주는 인간을 제외한 동물에게 투여되면, 동물내의 면역 반응을 촉발시켜 투여된 암 세포 가 제거될 것으로 기대된다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명에 따르면, 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 인간을 제외한 동물에게 투여한 경우에도, 그 동물 내에서 암 조직을 형성한다. 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주의 상술한 암 조직 형성능 때문에 본 발명의 방법이 성공적으로 실시된다.
본 발명의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 수지상 세포 또는 암 세포주의 투여방법 및 투여량은 상술한 단계 (a)의 내용이 적용될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 단계 (a')에서 투여된 수지상 세포를 감작하는 데 이용된 인간 간암-특이 항원과 단계 (b')에서 투여된 암 세포주에서 발현되는 인간 간암-특이 항원은 동일한 항원으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 단계 (a')에서 투여된 수지상 세포를 감작하는 데 이용된 인간 간암-특이 항원이 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)인 경우에는 단계 (b')에서 투여되는 암세포주는 AFP를 발현하는 것이다. 따라서, AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)를 제시하는 수지상 세포에 의해 유도된 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocyte)가 AFP를 발현하는 암 세포주를 인식하여 암 세포를 사멸시킨다.
본 발명의 방법에 있어서, 단계 (a")에서 투여된 암 세포주에서 발현되는 인간 간암-특이 항원과 단계 (b")에서 투여된 수지상 세포를 감작하는 데 이용된 인간 간암-특이 항원은 동일한 항원으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 단계 (a")에서 투여된 암 세포주에서 발현되는 인간 간암-특이 항원이 AFP인 경우에는 단계 (b")에서 투여되는 수지상 세포를 감작하는 데 이용된 인간 간암-특이 항원은 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)이다. 따라서, AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)를 제시하는 수지상 세포에 의해 유도된 세포독성 T 세포가 AFP를 발현하는 암 세포주를 인식하여 암 세포를 사멸시킨다.
본 발명의 최종 단계에서, 동물 내에서 암 세포의 형성 또는 성장을 측정하여 간암 면역치료제 또는 예방제로서의 수지상 세포의 효능을 결정한다. 암 세포의 형성 또는 성장은 육안으로 관찰할 수 있고 또는 캘리퍼스 같은 도구를 이용하여 측정할 수 있다. 암 세포의 추가적 형성이 억제되거나 성장이 억제된 경우에는, 분석 대상의 수지상 세포가 면역치료제 또는 예방제로서의 효능을 갖는다고 결정내릴 수 있다.
수지상 세포를 이용한 간암 면역치료 또는 면역예방을 임상 수준에서 실시하기 위해서는, 우선 동물모델에서 수지상 세포의 효능과 안전성이 확인되어야 하는 데, 본 발명은 이러한 동물모델-기초 시험을 가능하게 한다. 본 발명에 의해 스크리닝된 수지상 세포는 간암 면역치료제 또는 면역예방제로서 확실한 후보자(candidate)가 될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간 간암-특이 항원 중 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN), GPC3(GLYPICAN3), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53), MGAE1 또는 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)를 발현하는 마우스(Mus musculus)-유래의 인간 간암-특이 항원 발현 간암 세포주(재조합 MH134 세포주)를 제공한다.
본 발명의 인간 간암-특이 항원 발현 마우스 간암 세포주(재조합 MH134)는 종래에는 없었던 세포주로서, 간암 마우스 모델을 구축하기 위하여 본 발명자들에 의해 처음으로 개발된 것이다.
본 발명의 간암 세포주는 인간 간암-특이 항원 중 AFP(ALPHA- FETOPROTEIN), GPC3(GLYPICAN3), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53), MGAE1 또는 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 형질전환된 것이다. 인간 간암-특이 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 자연의(natural-occurring) 전장을 이용할 수 있지만, 전장의 일부일 수도 있다. 바람직하게는, AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)의 경우 아미노산 서열 1-346 또는 1-484 전장을 인코딩하는 서열, GPC3(GLYPICAN3)의 경우 아미노산 1-332 전장을 인코딩하는 서열, P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)의 경우 아미노산 1-326 전장을 인코딩하는 서열, MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)의 경우 아미노산 1-309 전장을 인코딩하는 서열, 그리고 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)의 경우 아미노산 1-180 전장을 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 것이다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 인간 간암-특이 항원 발현 마우스 유래 간암 세포주는 첨부한 도 2의 pcDNA3.1(+)-Tag (pcDNA3.1(+)-36A) 벡터에 인간 간암-특이 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 삽입한 pcDNA3.1(+)-Tag/AFP(ALPHA-FETOPROTEIN), pcDNA3.1(+)-Tag/GPC3(GLYPICAN3), pcDNA3.1(+)-Tag/P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53), pcDNA3.1(+)-Tag/NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1) 또는 pcDNA3.1(+)-Tag/MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1) 으로 형질전환된 것이다.
도 2의 pcDNA3.1(+)-Tag 벡터에 삽입하는 인간 간암항원 AFP, GPC3, P53, NY-ESO-1 및 MGAE1은 각각 서열목록 제1서열의 7-1044의 1038 뉴클레오타이드, 제2서열의 7-1458의 1452 뉴클레오타이드, 서열목록 제3서열의 7-1002의 996 뉴클레오타이드, 서열목록 제4서열의 7-984의 978 뉴클레오타이드, 서열목록 제5서열의 7-546의 540 뉴클레오타이드 및 서열목록 제6서열의 7-993의 927 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주는, 세포 내에서 발현된 인간 간암-특이 항원이 프로세싱되어(펩타이드 형태로 분해되어) 조직 적합 항원인 클래스 I 단백질에 실려 세포 표면에 인간 간암-특이 항원의 항원을 제시(presentation)한다. 결국, 이러한 암 세포주는 인간 간암 항원에 특이적으로 반응하는 T 세포에 의해 인식되는 특성을 갖게 된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 인간 간암-특이 항원 발현 간암 세포주가 접종되어 암이 형성되어 있고, 간암-특이 항원으로 감작된(pulsing) 수지상 세포를 처리하는 경우에는 암의 전이 또는 성장이 억제되는 특징을 나타내는 간암 마우스(Mus musculus) 모델을 제공한다.
본 발명의 간암 마우스 모델은 인간 간암-특이 항원을 발현하는 마우스 간암 세포주가 이식되어 암이 형성되어 있으며, 수지상 세포의 간암 치료 또는 예방 효능을 검증할 수 있는 동물 모델이다. 이와 같이 인간 간암 치료 또는 예방 효능을 검증할 수 있는 마우스 모델은 개발된 바가 없다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마우스에 주입되는 간암 세포주는 마우스에 대하여 동종동질(syngeneic)의 세포이다.
바람직하게는, 본 발명의 간암 마우스 모델은 상술한 수지상세포-유래 간암 면역치료제의 간암 예방 및 치료 효능을 분석하는 본 발명의 방법을 실시하는 데 이용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마우스 모델은 주입된 암 세포주와 동종동질의 특성을 나타내는 C3H/HeN 마우스이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 사람-유래 간암 항원을 발현하는 마우스 세포주 개발
실시예 1-1: 사람-유래 간암 특이항원 발현벡터의 제작
(a) 사람-유래 간암 특이항원 발현 세포주 HepG2 , ZR75 -1, SK - BR -3 배양
본 실험에 사용된 HepG2, ZR75-1, SK-BR-3는 AFP(ALPHA- FETOPROTEIN)(alpha feto protein1), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53), GPC3(GLYPICAN3)(Glypican3), MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1) 또는 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1; CTAG1) 등의 간암 특이적인 항원을 발현하는 사람-유래 간암 세포주로 한국세포주은행으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 이 간암 세포주는 10％ FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지(GIBCO/BRL)에서 배양/유지하였고, 계대배양 시에는 trypsin-EDTA를 약 1분간 처리하여 비부착성 단일세포로 분리하고 배양 군체가 약 80%가 넘지 않도록 1주일에 2-3 차례 계대배양 하였다.
(b) HepG2 에서 AFP ( ALPHA - FETOPROTEIN ), GPC3 ( GLYPICAN3 ) 및 MAGE1( MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1), ZR -75-1에서 P53 ( TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 그리고 SK - BR -3에서 NY - ESO -1( NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1) cDNA PCR 생성물 확보
간암 세포주를 수확하기 전에 세포의 조건을 최적화하기 위해서 배양군체가 60 ％ 넘지 않도록 유지하며 2-3차례 계대 후 trypsin-EDTA를 처리하여 수거하였다. 수거된 세포에 Trizol(Gibco BRL)을 처리하여 총 RNA를 추출하였고, 이소프로판올 침전 및 70％ 에탄올 세척과정을 통하여 총 RNA를 정제하였다. cDNA합성을 위하여, 10 ㎍의 총 RNA를 1 ㎍의 올리고(dT) 12-18와 혼합시킨 다음, 65℃에서 5 분 간 변성시킨 후, 즉시 얼음에 옮기고, 여기에 역전사효소 반응 완충액, 10 mM DTT, 1 mM dNTP 혼합물 및 20 units RNAsin을 첨가하고, 42℃에서 2분간 전반응시킨 후 200 unit의 MMLV(Molony Murine Leukemia virus) 역전사효소(Invitrogen 사)를 첨가하여 다시 42℃에서 60분간 반응시켰다. 반응이 완전히 끝난 후 70℃에서 15분간 방치하여 효소를 비활성화시켰다. 이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 사람 AFP(ALPHA- FETOPROTEIN), MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1), GPC3(GLYPICAN3), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 그리고 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1; CTAG1)에 대한 cDNA를 확보하였다. 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같다:
[표 1a] 원핵세포용 발현백터에 클로닝하기 위해 사용된 프라이머
타깃 유전자 프라이머 서열
hAFP (ALPHA-FETOPROTEIN) hAFP-partial-F 5’- GGGGTACC ACACTGCATAGAAATGAATATGGAAT -3’
hAFP- partial-R 5’- CGGAATTC TTAAACTCCCAAAGCAGCACGA -3’
hAFP- partial-R-1/2 5’- CGGAATTCTTA TTCCCCTGAAGAAAATTGG -3’
hAFP- partial-R-2/3 5’- CGGAATTCTTA TAAGTGTCCGATAATAATGTCAGC -3’
hGPC3 (GLYPICAN3) h GPC3-partial-F 5’- GGGGTACC CCGGACGCCACCTGTCAC -3’
h GPC3- partial-R 5’- CGGAATTC TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGC -3’
hGPC3- partial-R-1/2 5’- CGGAATTCTCA CTGGATAGAATCATGGATTGTTG-3’
hTP53 (TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) hTP53-partial-F 5’- GGGGTACC GAGGAGCCGCAGTCAGATC -3’
hTP53- partial-R 5’- CGGAATTC TCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCT -3’
hTP53- partial-R-2/3 5’- CGGAATTCTCA TTCTCCATCCAGTGGTTTCTTC -3’
hCTAG1 (NY-ESO-1) hCTAG1-partial-F 5’- GGGGTACC CAGGCCGAAGGCCGGGGCA -3’
hCTAG1- partial-R 5’- CGGAATTC TTAGCGCCTCTGCCCTGAGGGAGGCTG -3’
hMAGE-1 hMAGE1-partial-F 5`- AGGGGTACCTCTCTTGAGCAGAGGAGTCT -3`
hMAGE1-partial-R 5`- AGGGAATTCTCAGACTCCCTCTTCCTCCT -3‘
[표 1b] 진핵세포용 발현백터에 클로닝하기 위해 사용된 프라이머
타깃 유전자 프라이머 서열
hAFP (ALPHA- FETOPROTEIN) hAFP-full-F 5’- GGGGTACC ATGAAGTGGGTGGAATCAATTT -3’
hAFP-full-R 5’- CGGAATTCCC AACTCCCAAAGCAGCACGA -3’
hAFP-full-R-1/2N 5’- CGGAATTCCC TTCCCCTGAAGAAAATTGG -3’
hAFP-full-R-2/3N 5’- CGGAATTCCC TAAGTGTCCGATAATAATGTCAGC -3’
hGPC3 (GLYPICAN3) h GPC3-full-F 5’- GGGGTACC ATGGCCGGGACCGTGCGC -3’
h GPC3-full-R 5’- CGGAATTCCC GTGCACCAGGAAGAAGAAGC -3’
hGPC3-full-R-1/2N 5’- CGGAATTCCC CTGGATAGAATCATGGATTGTTG ?3’
hTP53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) hTP53-full-F 5’- GGGGTACC ATGGAGGAGCCGCAGTCAGA -3’
hTP53-full-R 5’- CGGAATTCCC GTCTGAGTCAGGCCCTTCTGT ?3’
h TP53-full-R-2/3N 5’- CGGAATTCCC TTCTCCATCCAGTGGTTTCTTC -3’
hCTAG1 (NY-ESO-1) hCTAG1-full-F 5’- GGGGTACCATG CAGGCCGAAGGCCGGGGCA -3’
hCTAG1-full-R 5’- CGGAATTCCC GCGCCTCTGCCCTGAGGGAGGCTG ?3’
MAGE-1 hMAGE1-full-F 5`- AGGGGTACCATGTCTCTTGAGCAGAGGAG -3`
hMAGE1-full-R 5`- AGGGAATTCCCGACTCCCTCTTCCTCCTC -3’
상기한 프라이머 세트(Bionics 사) [표 1a] 및 PCR 중합효소(Solgent 사)를 사용하여 94℃, 30sec; 62℃, 30sec; 및 72℃, 50sec, 총 25 사이클의 PCR을 실행하여 원핵세포용 GPC3(GLYPICAN3)(909 bp), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)(978 bp), NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)(540 bp), AFP(ALPHA- FETOPROTEIN)(983 bp) 및 MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)(927 bp)의 DNA 단편을 확보하였고, 프라이머 세트 [표1b]를 사용하여 진핵세포용 발현벡터에 클로닝할 GPC3(GLYPICAN3) (998 bp), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)(980 bp), NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)(542 bp), AFP(ALPHA- FETOPROTEIN)(1040 bp) 및 MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)(929 bp)의 DNA 단편을 확보하였다. 진핵세포 벡터 에서 발현된 단백질의 확인을 용이하게 하기 위해 (주)크레아젠에서 개발된 36A Tag 유전자가 삽입된 벡터를 사용하였다. 진핵세포 벡터에서 발현된 단백질의 확인을 용이하게 하기 위해 (주) 크레아젠에서 개발된 36A Tag 유전자를 삽입하였다. Tag 도입에 사용한 프라이머는, Tag-XhoI/s(5'-ACCCTCGAGGTCCATGACCGGAGGTCAGCAGATGGGTCGCGACCTGTACGACGA-3') 및 Tag-XbaI/as(5'-ACCTC TAGATTAGCTTCCCCATCTGTCCTTGTCGTCATCGTCGTACAGGTCGCG-3')이었고, 94℃, 30sec; 52℃, 30sec; 및 72℃, 5min, 총 1 사이클을 수행하여 tag DNA 단편을 확보하였다. 36A Tag의 아미노산 서열은 SMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGS 이고, 뉴클레오타이드 서열은 TCC ATG ACC GGA GGT CAG CAG ATG GGT CGC GAC CTG TAC GAC GAT GAC GAC AAG GAC AGA TGG GGA AGC 이다. 36A 서열의 경우 MCS 와 BGH pA 사이에 (XhoI-36A-Stop-XbaI)의 형태로 삽입되어 있다. 36A Tag의 보다 자세한 내용은 대한민국 등록특허 제10-0295558호에 기재되어 있다.
(c) 간암 항원 cDNA 를 발현벡터( pCDNA3 .1(+)-36A Tag 벡터 및 pCTP 벡터)에 클로닝
(주) 크레아젠에서 개발된 pcDNA3.1(+)-Tag 벡터에 각각의 인간 간암 항원 유전자 단편을 KpnI/EcoRI 처리하여 pcDNA3.1(+)-Tag 벡터에 클로닝하였고, 재조합 벡터의 뉴클레오타이드 서열은 시퀀싱으로 확인하였다(참조: 도 2 및 서열목록 제1서열 내지 제6서열). 또한, 원핵세포에서도 재조합 간암 항원 단백질을 얻기 위하여 (주)크레아젠에서 개발된 pCTP-Td vector 를 사용하였다. pCTP-Td 벡터는 pTAT-HA 벡터(Washington 대학의 S. Dowdy 박사로부터 분양 받음, H. Nagahara et al., Nature Med. 4:1449(1998))를 유전자 조작하여 제작하였다. 각각의 인간 간암 항원 유전자 단편을 KpnI/EcoRI 처리하여, 상기 제작된 pCTP 벡터에 클로닝하였 다 (참조: 도 2 및 서열목록 제7서열 내지 제12서열).
도입 유전자에 대하여 DNA 염기서열 분석을 수행하여, 도입된 cDNA가 인코딩하는 아미노산 서열이 공지된 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN), MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1), GPC3(GLYPICAN3), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 및 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)의 서열과 100% 일치함을 확인하였다(Blast 2 서열 검색).
원핵세포용 발현벡터에 삽입된 부위는 각 간암 항원의 N-말단 시그널 펩타이드에 해당하는 부위와 C-말단에 인접한 막투과 도메인으로 예상되는 부위가 제외된 부분으로서, AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)의 경우 아미노산 서열 20-346(327 aa)(서열목록 제19서열), GPC3(GLYPICAN3)의 경우 31-331(303 aa)(서열목록 제21서열), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)의 경우 1-326(326 aa)(서열목록 제22서열), NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)의 경우 1-180 (180 aa)(서열목록 제23서열), MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)의 경우 1-308(308 aa)(서열목록 제24서열)에 해당한다. 한편, 진핵세포용 발현벡터에 삽입되는 부위는, AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)의 경우 아미노산 서열 1-346(346 aa)(서열목록 제13서열), GPC3(GLYPICAN3)의 경우 1-332 (332 aa)(서열목록 제15서열), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)의 경우 1-326 (326 aa)(서열목록 제16서열), NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)의 경우 1-180 (180 aa)(서열목록 제17서열), MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)의 경우 1-309 (309 aa)(서열목록 제18서열) 에 해당한다.
실시예 1-2: 사람유래 간암 항원 발현 마우스 세포주 개발
(a) 선별된 간암 항원 발현 세포주로부터 항원 발현 확인
간암 항원 발현 세포주 제작을 위해 pcDNA3.1(+)-Tag/간암 항원(AFP(ALPHA- FETOPROTEIN; 서열목록 제1서열), GPC3(GLYPICAN3; 서열목록 제3서열), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53; 서열목록 제4서열), 또는 MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1; 서열목록 제6서열)) 벡터를 마우스 간암 세포주 MH134 세포에 형질감염시켰다.
포유동물 발현 벡터인 20 μg 의 pcDNA3.1(+)-36A에 클로닝되어 있는 컨스트럭트들을 제한효소(Ssp I, AFP의 경우 Pvu I)을 이용하여 37 ℃에서 2 시간 동안 절단하여 벡터를 선형화시켰다. 효소로 절단된 pcDNA3.1을 PCR 정제 키트를 이용하여 고수율 조건에서 정제하였다. 최종 50 μl로 용출시켰다. 최종 용출된 DNA 50 μl에 2 × 105 cells의 MH134 세포들을 550 μl 의 1 × PBS에 재현탁하여 섞고, 여기에 2 μl의 2M MgCl2 (최종 농도 5 mM)을 첨가한다. 최종 660 μl의 DNA + MH134 세포 혼합물을 일렉트로포레이션 큐벳(electroporation cuvette)에 넣고, 얼음 속에서 7분간 세워 놓았다. 이어서, BIO-RAD gene pulser를 사용하여 280V, 950μF 조건으로 일렉트로포레이션 진행하고 얼음에서 10 분간 인큐베이션하였다. 일렉트로포레이션 큐벳 안의 DNA + MH134 세포 혼합물을 옐로우 팁을 이용하여 조심스럽게 10 ml의 RPMI1640 + 10 ％ FBS이 들어있는 50 ml 튜브로 옮겨주었다. 멀티-채널 피펫을 이용하여 1개의 96 웰 마이크로플레이트로 웰당 100 μl씩 나누어 넣었다. 37 ℃ 인큐베이터에서 2 일간 인큐베이션한 다음, G418 (10 mg/ml)을 각 웰당 첨가하여 최종 G418 농도가 1 mg/ml 이 되도록 하였다. G418 처리 후에 10일에서 14일 동안 세포 콜로니들이 형성되는지를 관찰하였다. 콜로니가 형성된 웰을 선택하여 6 웰 플레이트로 옮긴 다음, 106 cells/ml 이상 으로 자랐을 때 다시 100 mm 디쉬로 옮겨준다. 선별된 세포는 증식 과정 중 수거하여 발현 여부를 웨스턴 블롯팅 방법으로 확인하였다. 수거된 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 단백질 시료 완충액에 부유시켜 끓인 다음 원심 분리하여 지놈 DNA를 제거하고, 상층액을 SDS-PAGE로 분리 하였다. 분리된 단백질 밴드를 니트로셀룰로오스 막에 semi-dry transfer blotter (Bio-Rad 사)를 사용하여 옮긴 다음, 1차 항체인 Tag 항원-특이 일클론항체를 처리하였고, 2차 항체 AP(alkaline phosphatase)-접합 항-마우스 IgG (Sigma)를 처리하였다. 그리고 나서, NBT/BCIP가 함유된 AP 반응용액(Promega 사)에 옮겨 밴드를 확인하였다.
(b) 세포주의 항원 발현 안정성 확인
재조합 세포주를 마우스에 접종 시 항생제(G418)가 없는 조건에서 도입 항원 발현이 유지될 수 있는 지를 검증하기 위하여, 세포주를 G418이 없는 배지에서 지속적으로 계대하면서 도입한 유전자의 발현 안정성을 확인하였다. G418이 없는 조건에서 각각의 재조합 세포주 (MH134/AFP(ALPHA-FETOPROTEIN), MH134/GPC3(GLYPICAN3), MH134/P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 및 MH134/MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1))를 배양하면서 20일 후 1 × 106 세포를 수거하여 항원 발현 여부를 조사하였다. 항원 발현을 확인하기 위해, 각 항원의 특이성을 보이는 부분에 프라이머를 제작하여 RT-PCR 을 수행하였다.
[표 1c]
진핵세포용 발현백터 발현을 확인하기 위해 사용한 프라이머
타깃 유전자 프라이머 서열
MAGE-1
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq
LEFT PRIMER 150 20 60.05 55.00 4.00 0.00 11.00 GTCAACAGATCCTCCCCAGA
RIGHT PRIMER 387 20 59.99 45.00 5.00 1.00 12.00 CAGCATTTCTGCCTTTGTGA
SEQUENCE SIZE: 930
INCLUDED REGION SIZE: 930
PRODUCT SIZE: 238
AFP 1/2N
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq
LEFT PRIMER 381 20 60.15 50.00 2.00 2.00 10.00 ACACAAAAAGCCCACTCCAG
RIGHT PRIMER 595 20 59.75 45.00 5.00 2.00 11.00 CTGCATTTTCAGCTTTGCAG
SEQUENCE SIZE: 900
INCLUDED REGION SIZE: 900
PRODUCT SIZE: 215
TP53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 2/3N
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq
LEFT PRIMER 35 20 60.23 55.00 7.00 2.00 12.00 CCCCTCTGAGTCAGGAAACA
RIGHT PRIMER 185 20 60.05 55.00 6.00 0.00 11.00 TCATCTGGACCTGGGTCTTC
SEQUENCE SIZE: 550
INCLUDED REGION SIZE: 550
PRODUCT SIZE: 151
GPC3 ( GLYPICAN3 ) 1/2N
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq
LEFT PRIMER 562 20 60.07 50.00 7.00 2.00 10.75 CCTGATTCAGCCTTGGACAT
RIGHT PRIMER 801 20 60.01 55.00 5.00 1.00 10.00 TCCCTGGCAGTAAGAGCAGT
SEQUENCE SIZE: 871
INCLUDED REGION SIZE: 871
PRODUCT SIZE: 240
도 4 에서 보듯이, 4 종류 세포주 모두 시간이 경과하면서 도입된 항원유전자의 발현이 20일까지 항원 발현이 지속됨을 확인하였다. 따라서, 상기 실시예에서 제작한 인간 간암 항원-발현 세포주는 마우스 간암 모델 확립에 사용 가능한 세포주임을 알 수 있다.
실시예 2 : 수지상세포 감작용 CTP-결합 재조합 단백질 정제
실시예 2-1 : CTP-결합 간암 재조합 항원의 발현 및 정제
각 간암 항원 cDNA(참조 : 서열목록 제7서열 내지 제12서열)를 도 2의 pCTP-Td 벡터에 도입하고 이를 E. coli BL21-gold(DE3) 컴피턴트 세포(Stratagene 사)에 Hanahan 방법을 이용하여 형질전환시켜 발현 균주를 확보하고, 이 균주를 LB-암피실린 배지에서 대량 배양하였다. 배양 후 원심분리하고, PBS로 세척하여 세포를 수거한 다음, 12 ％ SDS-PAGE로 간암 항원의 발현 여부를 확인하였다. 대량 발현 후 CTP-AFP(ALPHA- FETOPROTEIN), CTP-MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1), CTP-P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53), CTP-GPC3(GLYPICAN3) 및 CTP-NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1) 재조합 단백질은, Ni+-NTA 레진 (Qiagen) 칼럼으로 순수 분리하였다. 확인된 단백질은 벡터 자체의 비게놈 서열에 의해 약 6 kDa 정도 증가된 크기로 확인되었다. 즉 CTP-AFP(ALPHA- FETOPROTEIN)는 약 44 kDa, CTP-MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1)는 약 48 kDa, CTP-GPC3(GLYPICAN3)은 약 41kDa, CTP-P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)는 약 53 kDa 그리고 CTP-NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1)는 약 30 kDa으로 발현되었다.
실시예 3: 간암 동물모델 구축
실시예 3-1: 간암 항원 발현 세포주의 마우스에서의 암 형성 및 성장 확인
인간 간암 항원을 발현하는 마우스 세포주가 마우스에서 암을 형성시킬 수 있는 지 여부와 형성된 고형암의 성장속도를 조사하였다. 제작된 세포주를 6주령 Balb/c 마우스(오리엔트사)의 대퇴부에 주사하였다. 간암 항원 발현 재조합 세포주는 10 ％ FBS와 G418 500 ㎍/㎖이 함유된 RPMI 배지에서 배양/유지하였다. 최적의 성장 상태에서 세포를 PBS로 2-3회 세척 후 트립신-EDTA를 처리하여 단일세포로 떼어내고 3 × 105 세포/100 ㎕, 5 × 105 세포/100 ㎕이 되도록 생리식염수에 현탁하였다. 상기 현탁액 100 ㎕를 마우스의 우측 하복부의 피내 조직에 접종하였다. 세포주 접종 후 3일 간격으로 고형암 형성 유무를 관찰하였다. 고형암의 크기는 칼리퍼스를 사용하여 측정하였다. 도 6b에서 볼 수 있듯이, 간암 세포주를 접종한 모든 마우스에서 고형암이 형성됨을 확인하였다. 그리고 도 6a에서 볼 수 있듯이, 3 × 105 세포만으로도 암을 형성하였으며 이종항원에 대한 자체 면역반응으로 생성된 암이 스스로 소멸되지 않음을 확인하였다. 암 성장속도를 관찰한 결과, 도 6b에서 보듯이 MH134/P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 재조합세포주를 투여한 경우는 다른 경우에 비해 비교적 느린 속도로 성장하였으나, MH134/ MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1) 투여시는 정상의 MH134 투여 시에서와 비슷한 속도로 성장하였다. 이러한 결과는 아마도 P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)의 발현이 다른 항원에 비해 비교적 높아 이종항원에 대한 면역이 다른 것 보다 강하게 유도되었기 때문으로 추측된다. 상술한 실험 결과는, 인간의 간암 항원을 발현하는 마우스 세포주가 비록 이종항원을 발현하고는 있지만 발현되는 이종항원에 대한 체내 기본 면역반응만으로는 간암 세포주의 암 형성을 억제하지 못함을 증명한다. 이로써 본 발명자들이 계획한 간암 마우스 모델이 완성되었으며, 수지상세포 백신을 이용한 암의 예방 및 치료 효능을 연구하는데 이를 활용할 수 있게 되었다.
실시예 4: 수지상세포의 항암 효과 분석
실시예 4-1: 수지상세포 백신에 의한 마우스 간암 예방효과 (Prevention model)
수지상세포 백신에 의한 간암 예방 가능성을 조사하기 위하여, CTP-융합 간암 재조합 항원을 감작시킨 수지상세포를 마우스에 2차례 면역시키고 그 후에 간암 특이 항원을 발현하는 암세포주로 도전시험을 실시하여 고형암 형성 및 폐전이 여부를 조사하였다. 마우스 수지상세포는 대퇴골과 경골의 골수세포를 수지상세포로 분화시켜 사용하였다. 대퇴골과 경골의 양끝을 절단하고 골수세포를 추출하여 50 ㎖ 튜브에 세포를 수거하였다. 수거된 골수세포를 0.83 ％ 염화암모늄 용액으로 현탁시켜 적혈구를 제거하고 골수세포를 수지상세포 생산배지(RPMI-1640, 10 ％ FBS, 10 ng/㎖의 마우스 재조합 IL-4와 10 ng/㎖의 마우스 GM-CSF)에서 2일간 배양하며 비흡착성 세포를 제거하고 용기 바닥에 부착된 세포만을 취하였다. 2-3일 간격으로 신선한 배지로 교체하여 사이토카인의 고갈을 방지하였다. 배양 6일째 미성숙 수지상세포를 수거하고 여기에 재조합 항원인 CTP-AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)을 처리하였다. 각 항원 단백질을 50 ㎍/㎖ 씩 20 시간 처리하여 미성숙 수지상세포를 감작하였으며 24시간부터 수지상세포 성숙화에 필요한 사이토카인(100 ㎍/㎖ IFN-γ와 100 ㎍/㎖ TNF-α)을 첨가하여 수지상세포의 성숙화를 유도하였다. 항원으로 감작된 수지상세포 1× 106 세포를 마우스 피하로 주사하여 항암면역을 유도하였다.
수지상세포 면역은 1 주 간격으로 2 회 접종하였으며, 2차 수지상세포 접종 1주 후에 CTP-AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)가 감작된 수지상세포로 면역한 마우스 실험군에는 MH134/AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)를 각 3× 105 세포/마우스로 피하(SC, subcutaneous) 주사하였다. 암의 크기(가로× 세로)는 매 3일마다 측정하였다. 측정결과 도 7에서와 같이, CTP-AFP(ALPHA- FETOPROTEIN) 항원을 감작시킨 수지상세포로 면역한 마우스군에서 암의 형성이 현저히 지연됨을 관찰할 수 있었다.
한편, 수지상세포에 의한 암 예방모델에서 생존기간을 그래프로 나타내면 도 8과 같다. CTP-AFP(ALPHA- FETOPROTEIN)를 감작시킨 수지상 세포를 주사한 실험군의 경우 MH134/AFP(ALPHA- FETOPROTEIN)주를 투여 후 암 형성이 지연되는 효과는 보이며 48 일 이후까지 모두 생존함을 확인하였다. 반면 PBS 대조군의 경우 25 일째부터 사망을 시작하여 42 일째 6 마리 모두 사망함을 확인하였며, 또한 항원을 감작시키지 않은 수지상 세포만을 주사한 대조군에서는 역시 42 일째 사망하기 시작하여 45 일째 모수 사망함을 확인할 수 있었다. 따라서 간암 특이 항원을 감작시킨 수지상 세포에 의한 암 예방모델의 경우 암 형성의 지연뿐만 아니라 수명 연장에도 그 효과를 보임을 확인할 수 있었다.
실시예 4-2: 수지상세포 백신에 의한 마우스 간암 전이 억제 효과(Prevention model)
상기와 동일한 방법으로 수지상세포 백신을 마우스에 2차례 투여하여 면역을 유도하고 1주 후에 각각의 재조합 간암 항원 발현 세포주를 마우스당 3 × 105 세포가 되게 조정하여 각 마우스에 피하(SC) 주사하였다. MH134 마우스 간암 세포주의 경우 자발적 전이(spontaneous metastasis) 가 일어나는 세포주이다. 그리고 20일 후 마우스를 안락사시켜 폐전이 정도를 관찰하였다. 도 9에서 관찰할 수 있듯이, AFP 인간 간암항원을 감작시킨 수지상세포로 면역한 군에서는 폐전이가 전혀 나타나지 않는 반면, 항원을 감작하지 않은 수지상세포나 PBS로만 투여한 대조군에서는 모두 강한 암의 폐전이 현상이 나타났다. 이는 수지상세포 백신에 의해 강력한 암항원 특이적인 면역이 유도되어 암의 생성 및 전이를 억제하였음을 시사한다.
실시예 4-3: CTP-간암 항원으로 감작된 수지상세포 백신에 의한 마우스 모델에서 간암 치료 효과(Regression model)
간암 항원 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)을 발현하는 재조합 세포주를 3× 105 세포/마우스로 각 마우스 실험군에 피하주사하고, 3일 후에 CTP-결합항원(CTP-MAGE1 및 CTP-AFP)으로 감작된 수지상세포(DC)를 마우스 당 1 × 106 세포가 되게 조절하여 피하에 1 주 간격으로 2회 주사하였다. 2차 수지상세포 투여 후 2일 간격으로 약 한 달 동안 고형암의 형성 및 성장을 관찰하였다. 도 10에서 볼 수 있듯이, MH134/MAGE1 및 MH134/AFP 세포주로 만들어진 마우스 간암 모델 모두에서 암성장 억제 효과가 관찰되었다.
실시예 4-4: 수지상세포 백신 투여로 유도된 항원 특이적인 CTL 확인
상기 폐전이 모델에서 실험된 마우스의 비장을 취하여 T 세포 증식 분석과 CTL 분석을 수행하였다. 각각의 마우스를 경추 탈구법으로 안락사시키고 비장을 채취하였다. 분리된 비장이 건조되지 않도록 RPMI에 보관하였다. 각각의 비장을 취하여 70 ㎛ 그물망에 통과시켜 부유조직을 제거하고 1회 원심 분리하여 세포를 수획한 후 0.83 ％ 염화암모늄 용액으로 현탁시켜 적혈구를 제거하였다. 준비된 비장세포는 나일론 울 컬럼을 통과시켜 T 림프구만을 분리하였고, 효능세포(effector cell) 자극을 위해 준비된 APC(antigen presenting cells)와 5:1 비율로 혼합하여 5일간 배양하였다. APC는 실험일로부터 2일 전에 준비하였다. 정상 마우스의 비장을 취해 적혈구를 제거하고 3 ㎍/㎖의 Con-A로 24시간 자극하였다. 자극 후 1회 세척한 다음 각각의 항원 단백질 CTP-AFP(ALPHA- FETOPROTEIN)을 50 ㎍/㎖로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 시의 세포 농도는 1 × 106 세포/마우스 을 유지하였다. 24시간 배양 후 Mitomycin C 를 40분간 처리하였고, 처리 후 3회 세척하여 APC를 준비하였다.
효능 T 세포(effector T cell)과 APC의 배양 5일중 3일째 일부를 취해 T cell proliferation assay (MTT assay) 를 수행하였다. 배양 4일째 상등액을 취하여 각 상등액에 존재하는 IL-4와 IFN-r 의 양을 확인하였다. R&Dsystems kit을 사용하였으며 방법은 제작자의 방법을 따랐다. MH134 세포의 경우는 현탁 세포(suspension cell) 이므로 CSFE staining 방법을 이용하여 특이적 라이시스(specific lysis)를 확인하였다. 비 타깃(non target)군으로 MH134를 타깃 군으로는 항원을 발현하는 안정화된 세포주를 사용하였다. 먼저 비 타깃 세포주와 타깃 세포주를 구분하기 위하여 세포를 세척후 CSFE를 이용하여 염색하였다 (Target : add 15ul of 1mM CFSE (CSFE high) vs Non target cell : add 10ul of 0.1mM CSFE (CSFE low)). 염색된 두 세포주를 동일 비율로 섞은 후 Histopaque(Sigma)을 이용하여 죽은 세포를 제거하여 효능 T 세포을 분리하여 타깃 세포과 E:T ratio가 1:1, 10:1 그리고 20:1 이 되게 혼합하여 6시간 배양하였다. 이후 FACS 분석을 통해 살아있는 세포의 수를 정하였다.
E:T ratio Effector cells Target mix RPMI-10
0.5:1 25 ul 100 ul 175 ul
1:1 50 ul 100 ul 150 ul
2:1 100 ul 100 ul 100 ul
4:1 200 ul 100 ul
Target only 100 ul 200 ul
그리고 나서 식:
Percent of specific lysis
= (1 - the ratio of target cells only / the ratio of target + effector cells) * 100
을 이용하여 계산하였다.
도 11의 CTL 결과에서 보듯이 3가지 마우스 간암 모델 모두에서 CTL이 효과적으로 유도되었다. 이는 CTP-AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)로 감작된 마우스 골수유래 수지상세포 백신 투여로 각각의 인간 간암항원에 특이적인 CTL이 효과적으로 유도되었으며 이로 인해 치료 및 예방에 항암효과가 나타난 것임을 보여주는 것이다.
상기에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 인간 간암 동물모델을 이용한 간암 면역치료제 또는 예방제로서의 수지상 세포의 효능을 분석하는 방법을 제공한다. 수지상 세포를 이용한 간암 면역치료 또는 면역예방을 임상 수준에서 실시하기 위해서는, 우선 동물모델에서 수지상 세포의 효능과 안전성이 확인되어야 하는 데, 본 발명은 이러한 동물모델-기초 시험을 가능하게 한다. 본 발명에 의해 효능이 검증된 수지상세포 백신(DC 백신)은 간암 면역치료제 또는 면역예방제로서 확실한 후보자(candidate)가 될 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이 며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Creagene <120> Animal Models Carrying Tumors Expressing Human Liver Cancer-Specific Antigen and Method for Analyzing Prevention and Treatment Efficacy of Dendritic Cells-Derived Immunotherapeutics Using the Aboven <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1052 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggtaccatga agtgggtgga atcaattttt ttaattttcc tactaaattt tactgaatcc 60 agaacactgc atagaaatga atatggaata gcttccatat tggattctta ccaatgtact 120 gcagagataa gtttagctga cctggctacc atattttttg cccagtttgt tcaagaagcc 180 acttacaagg aagtaagcaa aatggtgaaa gatgcattga ctgcaattga gaaacccact 240 ggagatgaac agtcttcagg gtgtttagaa aaccagctac ctgcctttct ggaagaactt 300 tgccatgaga aagaaatttt ggagaagtac ggacattcag actgctgcag ccaaagtgaa 360 gagggaagac ataactgttt tcttgcacac aaaaagccca ctccagcatc gatcccactt 420 ttccaagttc cagaacctgt cacaagctgt gaagcatatg aagaagacag ggagacattc 480 atgaacaaat tcatttatga gatagcaaga aggcatccct tcctgtatgc acctacaatt 540 cttctttggg ctgctcgcta tgacaaaata attccatctt gctgcaaagc tgaaaatgca 600 gttgaatgct tccaaacaaa ggcagcaaca gttacaaaag aattaagaga aagcagcttg 660 ttaaatcaac atgcatgtgc agtaatgaaa aattttggga cccgaacttt ccaagccata 720 actgttacta aactgagtca gaagtttacc aaagttaatt ttactgaaat ccagaaacta 780 gtcctggatg tggcccatgt acatgagcac tgttgcagag gagatgtgct ggattgtctg 840 caggatgggg aaaaaatcat gtcctacata tgttctcaac aagacactct gtcaaacaaa 900 ataacagaat gctgcaaact gaccacgctg gaacgtggtc aatgtataat tcatgcagaa 960 aatgatgaaa aacctgaagg tctatctcca aatctaaaca ggtttttagg agatagagat 1020 tttaaccaat tttcttcagg ggaagggaat tc 1052 <210> 2 <211> 1466 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggtaccatga agtgggtgga atcaattttt ttaattttcc tactaaattt tactgaatcc 60 agaacactgc atagaaatga atatggaata gcttccatat tggattctta ccaatgtact 120 gcagagataa gtttagctga cctggctacc atattttttg cccagtttgt tcaagaagcc 180 acttacaagg aagtaagcaa aatggtgaaa gatgcattga ctgcaattga gaaacccact 240 ggagatgaac agtcttcagg gtgtttagaa aaccagctac ctgcctttct ggaagaactt 300 tgccatgaga aagaaatttt ggagaagtac ggacattcag actgctgcag ccaaagtgaa 360 gagggaagac ataactgttt tcttgcacac aaaaagccca ctccagcatc gatcccactt 420 ttccaagttc cagaacctgt cacaagctgt gaagcatatg aagaagacag ggagacattc 480 atgaacaaat tcatttatga gatagcaaga aggcatccct tcctgtatgc acctacaatt 540 cttctttggg ctgctcgcta tgacaaaata attccatctt gctgcaaagc tgaaaatgca 600 gttgaatgct tccaaacaaa ggcagcaaca gttacaaaag aattaagaga aagcagcttg 660 ttaaatcaac atgcatgtgc agtaatgaaa aattttggga cccgaacttt ccaagccata 720 actgttacta aactgagtca gaagtttacc aaagttaatt ttactgaaat ccagaaacta 780 gtcctggatg tggcccatgt acatgagcac tgttgcagag gagatgtgct ggattgtctg 840 caggatgggg aaaaaatcat gtcctacata tgttctcaac aagacactct gtcaaacaaa 900 ataacagaat gctgcaaact gaccacgctg gaacgtggtc aatgtataat tcatgcagaa 960 aatgatgaaa aacctgaagg tctatctcca aatctaaaca ggtttttagg agatagagat 1020 tttaaccaat tttcttcagg ggaaaaaaat atcttcttgg caagttttgt tcatgaatat 1080 tcaagaagac atcctcagct tgctgtctca gtaattctaa gagttgctaa aggataccag 1140 gagttattgg agaagtgttt ccagactgaa aaccctcttg aatgccaaga taaaggagaa 1200 gaagaattac agaaatacat ccaggagagc caagcattgg caaagcgaag ctgcggcctc 1260 ttccagaaac taggagaata ttacttacaa aatgcgtttc tcgttgctta cacaaagaaa 1320 gccccccagc tgacctcgtc ggagctgatg gccatcacca gaaaaatggc agccacagca 1380 gccacttgtt gccaactcag tgaggacaaa ctattggcct gtggcgaggg agcggctgac 1440 attattatcg gacacttagg gaattc 1466 <210> 3 <211> 1010 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggtaccatgg ccgggaccgt gcgcaccgcg tgcttggtgg tggcgatgct gctcagcttg 60 gacttcccgg gacaggcgca gcccccgccg ccgccgccgg acgccacctg tcaccaagtc 120 cgctccttct tccagagact gcagcccgga ctcaagtggg tgccagaaac tcccgtgcca 180 ggatcagatt tgcaagtatg tctccctaag ggcccaacat gctgctcaag aaagatggaa 240 gaaaaatacc aactaacagc acgattgaac atggaacagc tgcttcagtc tgcaagtatg 300 gagctcaagt tcttaattat tcagaatgct gcggttttcc aagaggcctt tgaaattgtt 360 gttcgccatg ccaagaacta caccaatgcc atgttcaaga acaactaccc aagcctgact 420 ccacaagctt ttgagtttgt gggtgaattt ttcacagatg tgtctctcta catcttgggt 480 tctgacatca atgtagatga catggtcaat gaattgtttg acagcctgtt tccagtcatc 540 tatacccagc taatgaaccc aggcctgcct gattcagcct tggacatcaa tgagtgcctc 600 cgaggagcaa gacgtgacct gaaagtattt gggaatttcc ccaagcttat tatgacccag 660 gtttccaagt cactgcaagt cactaggatc ttccttcagg ctctgaatct tggaattgaa 720 gtgatcaaca caactgatca cctgaagttc agtaaggact gtggccgaat gctcaccaga 780 atgtggtact gctcttactg ccagggactg atgatggtta aaccctgtgg cggttactgc 840 aatgtggtca tgcaaggctg tatggcaggt gtggtggaga ttgacaagta ctggagagaa 900 tacattctgt cccttgaaga acttgtgaat ggcatgtaca gaatctatga catggagaac 960 gtactgcttg gtctcttttc aacaatccat gattctatcc aggggaattc 1010 <210> 4 <211> 992 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggtaccatgg aggagccgca gtcagatcct agcgtcgagc cccctctgag tcaggaaaca 60 ttttcagacc tatggaaact acttcctgaa aacaacgttc tgtccccctt gccgtcccaa 120 gcaatggatg atttgatgct gtccccggac gatattgaac aatggttcac tgaagaccca 180 ggtccagatg aagctcccag aatgccagag gctgctcccc gcgtggcccc tgcaccagca 240 gctcctacac cggcggcccc tgcaccagcc ccctcctggc ccctgtcatc ttctgtccct 300 tcccagaaaa cctaccaggg cagctacggt ttccgtctgg gcttcttgca ttctgggaca 360 gccaagtctg tgacttgcac gtactcccct gccctcaaca agatgttttg ccaactggcc 420 aagacctgcc ctgtgcagct gtgggttgat tccacacccc cgcccggcac ccgcgtccgc 480 gccatggcca tctacaagca gtcacagcac atgacggagg ttgtgaggcg ctgcccccac 540 catgagcgct gctcagatag cgatggtctg gcccctcctc agcatcttat ccgagtggaa 600 ggaaatttgc gtgtggagta tttggatgac agaaacactt ttcgacatag tgtggtggtg 660 ccctatgagc cgcctgaggt tggctctgac tgtaccacca tccactacaa ctacatgtgt 720 aacagttcct gcatgggcgg catgaaccgg aggcccatcc tcaccatcat cacactggaa 780 gactccagtg gtaatctact gggacggaac agctttgagg tgcgtgtttg tgcctgtcct 840 gggagagacc ggcgcacaga ggaagagaat ctccgcaaga aaggggagcc tcaccacgag 900 ctgcccccag ggagcactaa gcgagcactg cccaacaaca ccagctcctc tccccagcca 960 aagaagaaac cactggatgg agaagggaat tc 992 <210> 5 <211> 554 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggtaccatgc aggccgaagg ccggggcaca gggggttcga cgggcgatgc tgatggccca 60 ggaggccctg gcattcctga tggcccaggg ggcaatgctg gcggcccagg agaggcgggt 120 gccacgggcg gcagaggtcc ccggggcgca ggggcagcaa gggcctcggg gccgggagga 180 ggcgccccgc ggggtccgca tggcggcgcg gcttcagggc tgaatggatg ctgcagatgc 240 ggggccaggg ggccggagag ccgcctgctt gagttctacc tcgccatgcc tttcgcgaca 300 cccatggaag cagagttggc ccgcaggagc ctggcccagg atgccccacc gcttcccgtg 360 ccaggggtgc ttctgaagga gttcactgtg tccggcaaca tactgactat ccgactgact 420 gctgcagacc accgccaact gcagctctcc atcagctcct gtctccagca gctttccctg 480 ttgatgtgga tcacgcagtg ctttctgccc gtgtttttgg ctcagcctcc ctcagggcag 540 aggcgcggga attc 554 <210> 6 <211> 941 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggtaccatgt ctcttgagca gaggagtctg cactgcaagc ctgaggaagc ccttgaggcc 60 caacaagagg ccctgggcct ggtgtgtgtg caggctgccg cctcctcctc ctctcctctg 120 gtcctgggca ccctggagga ggtgcccact gctgggtcaa cagatcctcc ccagagtcct 180 cagggagcct ccgcctttcc cactaccatc aacttcactc gacagaggca acccagtgag 240 ggttccagca gccgtgaaga ggaggggcca agcacctctt gtatcctgga gtccttgttc 300 cgagcagtaa tcactaagaa ggtggctgat ttggttggtt ttctgctcct caaatatcga 360 gccagggagc cagtcacaaa ggcagaaatg ctggagagtg tcatcaaaaa ttacaagcac 420 tgttttcctg agatcttcgg caaagcctct gagtccttgc agctggtctt tggcattgac 480 gtgaaggaag cagaccccac cggccactcc tatgtccttg tcacctgcct aggtctctcc 540 tatgatggcc tgctgggtga taatcagatc atgcccaaga caggcttcct gataattgtc 600 ctggtcatga ttgcaatgga gggcggccat gctcctgagg aggaaatctg ggaggagctg 660 agtgtgatgg aggtgtatga tgggagggag cacagtgcct atggggagcc caggaagctg 720 ctcacccaag atttggtgca ggaaaagtac ctggagtacc ggcaggtgcc ggacagtgat 780 cccgcacgct atgagttcct gtggggtcca agggcccttg ctgaaaccag ctatgtgaaa 840 gtccttgagt atgtgatcaa ggtcagtgca agagttcgct ttttcttccc atccctgcgt 900 gaagcagctt tgagagagga ggaagaggga gtcgggaatt c 941 <210> 7 <211> 996 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggtaccacac tgcatagaaa tgaatatgga atagcttcca tattggattc ttaccaatgt 60 actgcagaga taagtttagc tgacctggct accatatttt ttgcccagtt tgttcaagaa 120 gccacttaca aggaagtaag caaaatggtg aaagatgcat tgactgcaat tgagaaaccc 180 actggagatg aacagtcttc agggtgttta gaaaaccagc tacctgcctt tctggaagaa 240 ctttgccatg agaaagaaat tttggagaag tacggacatt cagactgctg cagccaaagt 300 gaagagggaa gacataactg ttttcttgca cacaaaaagc ccactccagc atcgatccca 360 cttttccaag ttccagaacc tgtcacaagc tgtgaagcat atgaagaaga cagggagaca 420 ttcatgaaca aattcattta tgagatagca agaaggcatc ccttcctgta tgcacctaca 480 attcttcttt gggctgctcg ctatgacaaa ataattccat cttgctgcaa agctgaaaat 540 gcagttgaat gcttccaaac aaaggcagca acagttacaa aagaattaag agaaagcagc 600 ttgttaaatc aacatgcatg tgcagtaatg aaaaattttg ggacccgaac tttccaagcc 660 ataactgtta ctaaactgag tcagaagttt accaaagtta attttactga aatccagaaa 720 ctagtcctgg atgtggccca tgtacatgag cactgttgca gaggagatgt gctggattgt 780 ctgcaggatg gggaaaaaat catgtcctac atatgttctc aacaagacac tctgtcaaac 840 aaaataacag aatgctgcaa actgaccacg ctggaacgtg gtcaatgtat aattcatgca 900 gaaaatgatg aaaaacctga aggtctatct ccaaatctaa acaggttttt aggagataga 960 gattttaacc aattttcttc aggggaataa gaattc 996 <210> 8 <211> 1410 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggtaccacac tgcatagaaa tgaatatgga atagcttcca tattggattc ttaccaatgt 60 actgcagaga taagtttagc tgacctggct accatatttt ttgcccagtt tgttcaagaa 120 gccacttaca aggaagtaag caaaatggtg aaagatgcat tgactgcaat tgagaaaccc 180 actggagatg aacagtcttc agggtgttta gaaaaccagc tacctgcctt tctggaagaa 240 ctttgccatg agaaagaaat tttggagaag tacggacatt cagactgctg cagccaaagt 300 gaagagggaa gacataactg ttttcttgca cacaaaaagc ccactccagc atcgatccca 360 cttttccaag ttccagaacc tgtcacaagc tgtgaagcat atgaagaaga cagggagaca 420 ttcatgaaca aattcattta tgagatagca agaaggcatc ccttcctgta tgcacctaca 480 attcttcttt gggctgctcg ctatgacaaa ataattccat cttgctgcaa agctgaaaat 540 gcagttgaat gcttccaaac aaaggcagca acagttacaa aagaattaag agaaagcagc 600 ttgttaaatc aacatgcatg tgcagtaatg aaaaattttg ggacccgaac tttccaagcc 660 ataactgtta ctaaactgag tcagaagttt accaaagtta attttactga aatccagaaa 720 ctagtcctgg atgtggccca tgtacatgag cactgttgca gaggagatgt gctggattgt 780 ctgcaggatg gggaaaaaat catgtcctac atatgttctc aacaagacac tctgtcaaac 840 aaaataacag aatgctgcaa actgaccacg ctggaacgtg gtcaatgtat aattcatgca 900 gaaaatnatg aaaaacctga aggtctatct ccaaatctaa acaggttttt aggagataga 960 gattttaacc aattttcttc aggggaaaaa aatatcttct tggcaagttt tgttcatgaa 1020 tattcaagaa gacatcctca gcttgctgtc tcagtaattc taagagttgc taaaggatac 1080 caggagttat tggagaagtg tttccagact gaaaaccctc ttgaatgcca agataaagga 1140 gaagaagaat tacagaaata catccaggag agccaagcat tggcaaagcg aagctgcggc 1200 ctcttccaga aactaggaga atattactta caaaatgcgt ttctcgttgc ttacacaaag 1260 aaagcccccc agctgacctc gtcggagctg atggccatca ccagaaaaat ggcagccaca 1320 gcagccactt gttgccaact cagtgaggac aaactattgg cctgtggcga gggagcggct 1380 gacattatta tcggacactt ataagaattc 1410 <210> 9 <211> 921 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ggtaccccgg acgccacctg tcaccaagtc cgctccttct tccagagact gcagcccgga 60 ctcaagtggg tgccagaaac tcccgtgcca ggatcagatt tgcaagtatg tctccctaag 120 ggcccaacat gctgctcaag aaagatggaa gaaaaatacc aactaacagc acgattgaac 180 atggaacagc tgcttcagtc tgcaagtatg gagctcaagt tcttaattat tcagaatgct 240 gcggttttcc aagaggcctt tgaaattgtt gttcgccatg ccaagaacta caccaatgcc 300 atgttcaaga acaactaccc aagcctgact ccacaagctt ttgagtttgt gggtgaattt 360 ttcacagatg tgtctctcta catcttgggt tctgacatca atgtagatga catggtcaat 420 gaattgtttg acagcctgtt tccagtcatc tatacccagc taatgaaccc aggcctgcct 480 gattcagcct tggacatcaa tgagtgcctc cgaggagcaa gacgtgacct gaaagtattt 540 gggaatttcc ccaagcttat tatgacccag gtttccaagt cactgcaagt cactaggatc 600 ttccttcagg ctctgaatct tggaattgaa gtgatcaaca caactgatca cctgaagttc 660 agtaaggact gtggccgaat gctcaccaga atgtggtact gctcttactg ccagggactg 720 atgatggtta aaccctgtgg cggttactgc aatgtggtca tgcaaggctg tatggcaggt 780 gtggtggaga ttgacaagta ctggagagaa tacattctgt cccttgaaga acttgtgaat 840 ggcatgtaca gaatctatga catggagaac gtactgcttg gtctcttttc aacaatccat 900 gattctatcc agtgagaatt c 921 <210> 10 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ggtaccgagg agccgcagtc agatcctagc gtcgagcccc ctctgagtca ggaaacattt 60 tcagacctat ggaaactact tcctgaaaac aacgttctgt cccccttgcc gtcccaagca 120 atggatgatt tgatgctgtc cccggacgat attgaacaat ggttcactga agacccaggt 180 ccagatgaag ctcccagaat gccagaggct gctccccgcg tggcccctgc accagcagct 240 cctacaccgg cggcccctgc accagccccc tcctggcccc tgtcatcttc tgtcccttcc 300 cagaaaacct accagggcag ctacggtttc cgtctgggct tcttgcattc tgggacagcc 360 aagtctgtga cttgcacgta ctcccctgcc ctcaacaaga tgttttgcca actggccaag 420 acctgccctg tgcagctgtg ggttgattcc acacccccgc ccggcacccg cgtccgcgcc 480 atggccatct acaagcagtc acagcacatg acggaggttg tgaggcgctg cccccaccat 540 gagcgctgct cagatagcga tggtctggcc cctcctcagc atcttatccg agtggaagga 600 aatttgcgtg tggagtattt ggatgacaga aacacttttc gacatagtgt ggtggtgccc 660 tatgagccgc ctgaggttgg ctctgactgt accaccatcc actacaacta catgtgtaac 720 agttcctgca tgggcggcat gaaccggagg cccatcctca ccatcatcac actggaagac 780 tccagtggta atctactggg acggaacagc tttgaggtgc gtgtttgtgc ctgtcctggg 840 agagaccggc gcacagagga agagaatctc cgcaagaaag gggagcctca ccacgagctg 900 cccccaggga gcactaagcg agcactgccc aacaacacca gctcctctcc ccagccaaag 960 aagaaaccac tggatggaga atgagaattc 990 <210> 11 <211> 555 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ggtaccatgc aggccgaagg ccggggcaca gggggttcga cgggcgatgc tgatggccca 60 ggaggccctg gcattcctga tggcccaggg ggcaatgctg gcggcccagg agaggcgggt 120 gccacgggcg gcagaggtcc ccggggcgca ggggcagcaa gggcctcggg gccgggagga 180 ggcgccccgc ggggtccgca tggcggcgcg gcttcagggc tgaatggatg ctgcagatgc 240 ggggccaggg ggccggagag ccgcctgctt gagttctacc tcgccatgcc tttcgcgaca 300 cccatggaag cagagttggc ccgcaggagc ctggcccagg atgccccacc gcttcccgtg 360 ccaggggtgc ttctgaagga gttcactgtg tccggcaaca tactgactat ccgactgact 420 gctgcagacc accgccaact gcagctctcc atcagctcct gtctccagca gctttccctg 480 ttgatgtgga tcacgcagtg ctttctgccc gtgtttttgg ctcagcctcc ctcagggcag 540 aggcgctaag aattc 555 <210> 12 <211> 939 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggtacctctc ttgagcagag gagtctgcac tgcaagcctg aggaagccct tgaggcccaa 60 caagaggccc tgggcctggt gtgtgtgcag gctgccgcct cctcctcctc tcctctggtc 120 ctgggcaccc tggaggaggt gcccactgct gggtcaacag atcctcccca gagtcctcag 180 ggagcctccg cctttcccac taccatcaac ttcactcgac agaggcaacc cagtgagggt 240 tccagcagcc gtgaagagga ggggccaagc acctcttgta tcctggagtc cttgttccga 300 gcagtaatca ctaagaaggt ggctgatttg gttggttttc tgctcctcaa atatcgagcc 360 agggagccag tcacaaaggc agaaatgctg gagagtgtca tcaaaaatta caagcactgt 420 tttcctgaga tcttcggcaa agcctctgag tccttgcagc tggtctttgg cattgacgtg 480 aaggaagcag accccaccgg ccactcctat gtccttgtca cctgcctagg tctctcctat 540 gatggcctgc tgggtgataa tcagatcatg cccaagacag gcttcctgat aattgtcctg 600 gtcatgattg caatggaggg cggccatgct cctgaggagg aaatctggga ggagctgagt 660 gtgatggagg tgtatgatgg gagggagcac agtgcctatg gggagcccag gaagctgctc 720 acccaagatt tggtgcagga aaagtacctg gagtaccggc aggtgccgga cagtgatccc 780 gcacgctatg agttcctgtg gggtccaagg gcccttgctg aaaccagcta tgtgaaagtc 840 cttgagtatg tgatcaaggt cagtgcaaga gttcgctttt tcttcccatc cctgcgtgaa 900 gcagctttga gagaggagga agagggagtc tgagaattc 939 <210> 13 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu 20 25 30 Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr 35 40 45 Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser 50 55 60 Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp 65 70 75 80 Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu 85 90 95 Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp 100 105 110 Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His 115 120 125 Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro 130 135 140 Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn 145 150 155 160 Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro 165 170 175 Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys 180 185 190 Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr 195 200 205 Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys 210 215 220 Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val 225 230 235 240 Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln 245 250 255 Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly 260 265 270 Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile 275 280 285 Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys 290 295 300 Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp 305 310 315 320 Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp 325 330 335 Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu 340 345 <210> 14 <211> 484 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr 1 5 10 15 Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu 20 25 30 Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr 35 40 45 Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser 50 55 60 Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp 65 70 75 80 Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu 85 90 95 Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp 100 105 110 Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His 115 120 125 Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro 130 135 140 Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn 145 150 155 160 Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro 165 170 175 Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys 180 185 190 Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr 195 200 205 Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys 210 215 220 Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val 225 230 235 240 Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln 245 250 255 Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly 260 265 270 Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile 275 280 285 Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys 290 295 300 Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp 305 310 315 320 Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp 325 330 335 Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala 340 345 350 Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser 355 360 365 Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys 370 375 380 Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu 385 390 395 400 Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys 405 410 415 Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu 420 425 430 Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met 435 440 445 Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu 450 455 460 Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile 465 470 475 480 Ile Gly His Leu <210> 15 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30 Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val 50 55 60 Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala 85 90 95 Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln 100 105 110 Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125 Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe 130 135 140 Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 165 170 175 Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe 195 200 205 Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln 210 215 220 Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile 225 230 235 240 Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 245 250 255 Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys 260 265 270 Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly 275 280 285 Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu 290 295 300 Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu 305 310 315 320 Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln 325 330 <210> 16 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu 325 <210> 17 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly 20 25 30 Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro 50 55 60 His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala 65 70 75 80 Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe 85 90 95 Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp 100 105 110 Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val 115 120 125 Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln 130 135 140 Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met 145 150 155 160 Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser 165 170 175 Gly Gln Arg Arg 180 <210> 18 <211> 309 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu 1 5 10 15 Glu Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Ala 20 25 30 Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr 35 40 45 Ala Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe 50 55 60 Pro Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser 65 70 75 80 Ser Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser 85 90 95 Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe 100 105 110 Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met 115 120 125 Leu Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe 130 135 140 Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys 145 150 155 160 Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly 165 170 175 Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr 180 185 190 Gly Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His 195 200 205 Ala Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr 210 215 220 Asp Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr 225 230 235 240 Gln Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp 245 250 255 Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala 260 265 270 Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala 275 280 285 Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu 290 295 300 Glu Glu Glu Gly Val 305 <210> 19 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr 1 5 10 15 Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe 20 25 30 Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val 35 40 45 Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser 50 55 60 Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys 65 70 75 80 His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser 85 90 95 Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro 100 105 110 Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr Ser 115 120 125 Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe Ile 130 135 140 Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile Leu 145 150 155 160 Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys Ala 165 170 175 Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr Lys 180 185 190 Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met 195 200 205 Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu 210 215 220 Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val 225 230 235 240 Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu 245 250 255 Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln 260 265 270 Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr 275 280 285 Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro 290 295 300 Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe 305 310 315 320 Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu 325 <210> 20 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr 1 5 10 15 Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe 20 25 30 Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val 35 40 45 Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser 50 55 60 Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys 65 70 75 80 His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser 85 90 95 Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro 100 105 110 Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr Ser 115 120 125 Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe Ile 130 135 140 Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile Leu 145 150 155 160 Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys Ala 165 170 175 Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr Lys 180 185 190 Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met 195 200 205 Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu 210 215 220 Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val 225 230 235 240 Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu 245 250 255 Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln 260 265 270 Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr 275 280 285 Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Xaa Glu Lys Pro 290 295 300 Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe 305 310 315 320 Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val 325 330 335 His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu 340 345 350 Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr 355 360 365 Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys 370 375 380 Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe 385 390 395 400 Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala Tyr 405 410 415 Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr 420 425 430 Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp 435 440 445 Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His 450 455 460 Leu 465 <210> 21 <211> 303 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln 1 5 10 15 Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu 20 25 30 Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu 35 40 45 Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln 50 55 60 Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val 65 70 75 80 Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr 85 90 95 Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe 100 105 110 Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly 115 120 125 Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu 130 135 140 Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser 145 150 155 160 Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys 165 170 175 Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser 180 185 190 Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu 195 200 205 Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg 210 215 220 Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met 225 230 235 240 Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met 245 250 255 Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser 260 265 270 Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn 275 280 285 Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Glx 290 295 300 <210> 22 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser 20 25 30 Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp 35 40 45 Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg 50 55 60 Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr 65 70 75 80 Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val 85 90 95 Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe 100 105 110 Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala 115 120 125 Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu 130 135 140 Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala 145 150 155 160 Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro 165 170 175 His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His 180 185 190 Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg 195 200 205 Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val 210 215 220 Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser 225 230 235 240 Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu 245 250 255 Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg 260 265 270 Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu 275 280 285 Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys 290 295 300 Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys 305 310 315 320 Pro Leu Asp Gly Glu Glx 325 <210> 23 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly 20 25 30 Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro 50 55 60 His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala 65 70 75 80 Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe 85 90 95 Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp 100 105 110 Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val 115 120 125 Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln 130 135 140 Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met 145 150 155 160 Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser 165 170 175 Gly Gln Arg Arg 180 <210> 24 <211> 308 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu Glu 1 5 10 15 Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Ala Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Ala 35 40 45 Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe Pro 50 55 60 Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe Leu 100 105 110 Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu 115 120 125 Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe Gly 130 135 140 Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu 145 150 155 160 Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu 165 170 175 Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr Gly 180 185 190 Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His Ala 195 200 205 Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr Asp 210 215 220 Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln 225 230 235 240 Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp Ser 245 250 255 Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu 260 265 270 Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg 275 280 285 Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu Glu 290 295 300 Glu Glu Gly Val 305

Claims (19)

  1. 다음의 단계를 포함하는 인간 간암 동물모델을 이용한 수지상세포-유래 간암 면역치료제의 간암 치료 효능을 분석하는 방법:
    (a) 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하여 암을 유발시키는 단계;
    (b) 상기 암이 유발된 동물에 분석 대상의 수지상 세포를 투여하는 단계; 및
    (c) 상기 동물에서 암 세포의 형성 또는 성장을 측정하여 수지상세포-유래 간암면역치료제의 치료 효능을 결정하는 단계.
  2. 다음의 단계를 포함하는 인간 간암 동물모델을 이용한 수지상세포-유래 간암 면역치료제의 간암 예방 효능을 분석하는 방법:
    (a) 분석 대상의 수지상세포를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계;
    (b) 상기 동물에게 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주를 투여하는 단계; 및
    (c) 상기 동물에서 암 세포의 형성 또는 성장을 측정하여 수지상세포- 유래 간암면역치료제의 예방 효능을 결정하는 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 동물은 설치류 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스(Mus musculus)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 인간 간암-특이 항원은 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN), MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1), P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53), GPC3(GLYPICAN3) 또는 NY-ESO-1(NEW YORK ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA 1 OR CANER/TESTIS ANTIGEN1 ; CTAG1))인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 인간 간암-특이 항원은 AFP (ALPHA-FETOPROTEIN)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 암 세포주는 마우스(Mus musculus)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 암 세포주는 상기 동물에 대하여 동종동질(syngeneic)의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a) 또는 단계 (b)에서 암 세포주의 투여는 피하 주입(subcutaneous injection) 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a) 또는 단계 (b)에서 수지상 세포의 투여는 피하 주입(subcutaneous injection) 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 인간 간암-특이 항원을 발현하는 암 세포주는 간암 세포주 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 인간 간암-특이 항원 중 AFP(ALPHA- FETOPROTEIN), GPC3(GLYPICAN3), MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A,1) 또는 P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53)를 발현하며 마우스(Mus musculus)-유래의 인간 간암-특이 항원 발현 간암 세포주(재조합 MH134 세포주).
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 세포주는 서열목록 제13서열, 서열목록 제15서열, 서열목록 제16서열 또는 서열목록 제18서열의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 것을 특징으로 하는 마우스-유래의 인간 간암-특이 항원 발현 간암 세포주(재조합 MH134 세포주).
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 세포주는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 7-1044, 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 7-1002, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 7-984, 또는 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 7-933 서열을 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 것을 특징으로 하는 마우스-유래의 인간 간암-특이 항원 발현 간암 세포주(재조합 MH134 세포주).
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 세포주는 pcDNA3.1(+)-Tag/AFP(ALPHA- FETOPROTEIN), pcDNA3.1(+)-Tag/GPC3(GLYPICAN3), pcDNA3.1(+)-Tag/P53(TRANSFORMATION RELATED PROTEIN 53) 또는 pcDNA3.1(+)-Tag/MAGE1(MELANOMA ANTIGEN FAMILY A, 1)으로 형질전환된 것을 특징으로 하는 마우스-유래의 인간 간암-특이 항원 발현 간암 세포주(재조합 MH134 세포주).
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 세포주는 AFP(ALPHA-FETOPROTEIN) 항원을 발현하는 MH134/AFP(ALPHA-FETOPROTEIN)인 것을 특징으로 하는 마우스-유래의 인간 간암-특이 항원 발현 간암 세포주(재조합 MH134 세포주).
  17. 제 12 항의 인간 간암-특이 항원 발현 간암 세포주가 접종되어 암이 형성되어 있고, 간암-특이 항원으로 감작된 수지상 세포를 처리하는 경우에는 암의 전이 또는 성장이 억제되는 특징을 나타내는 간암 마우스(Mus musculus) 모델.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 간암 세포주는 상기 마우스에 대하여 동종동질(syngeneic)의 세포인 것을 특징으로 하는 간암 마우스 모델.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 간암 마우스 모델은 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 방법을 실시하는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 간암 마우스 모델.
KR1020070048213A 2007-05-17 2007-05-17 인간 간암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래 간암면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법 KR100900742B1 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070048213A KR100900742B1 (ko) 2007-05-17 2007-05-17 인간 간암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래 간암면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법
EP08723457A EP2145013A4 (en) 2007-05-17 2008-03-13 TUMOR-CARRIERING ANIMAL MODELS EXPRESSING AN ANTIGEN SPECIFIC TO HUMAN LIVER CANCER AND METHOD FOR ANALYZING THE EFFECTIVENESS OF PREVENTING AND TREATING IMMUNOTHERAPEUTIC AGENTS DERIVED FROM DENDRITIC CELLS USING THESE MODELS
PCT/KR2008/001420 WO2008143400A1 (en) 2007-05-17 2008-03-13 Animal models carrying tumors expressing human liver cancer-specific antigen and method for analyzing prevention and treatment efficacy of dendritic cells-derived immunotherapeutics using the above
US12/451,508 US20100235932A1 (en) 2007-05-17 2008-03-13 Animal models carrying tumors expressing human liver cancer-specific antigen and method for analyzing prevention and treatment efficacy of dendritic cells-derived immunotherapeutics using the above
JP2010506034A JP2010527234A (ja) 2007-05-17 2008-03-13 ヒト肝癌動物モデル及びこれを利用した樹状細胞由来の肝癌免疫治療剤の予防及び治療効能を分析する方法
CN2008800164235A CN101680016B (zh) 2007-05-17 2008-03-13 携带表达人肝癌特异性抗原的肿瘤的动物模型以及利用所述动物模型分析源于树突状细胞的免疫治疗手段的预防和治疗功效的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070048213A KR100900742B1 (ko) 2007-05-17 2007-05-17 인간 간암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래 간암면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080101988A true KR20080101988A (ko) 2008-11-24
KR100900742B1 KR100900742B1 (ko) 2009-06-08

Family

ID=40032066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070048213A KR100900742B1 (ko) 2007-05-17 2007-05-17 인간 간암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래 간암면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20100235932A1 (ko)
EP (1) EP2145013A4 (ko)
JP (1) JP2010527234A (ko)
KR (1) KR100900742B1 (ko)
CN (1) CN101680016B (ko)
WO (1) WO2008143400A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101518972B1 (ko) * 2014-08-01 2015-05-18 제이더블유크레아젠 주식회사 수지상세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 수지상세포 및 그 용도
WO2016060407A1 (ko) * 2014-10-17 2016-04-21 동국대학교 산학협력단 Emp2 유전자가 결여된 폐암 유발 동물모델의 제조방법 및 이의 용도
CN112674028A (zh) * 2020-12-30 2021-04-20 汉姆德(宁波)智能医疗科技有限公司 促诱癌剂诱发动物癌症模型建立的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8623348B2 (en) * 2009-03-27 2014-01-07 Jw Pharmaceutical Corporation Interferon-α (IFN-α) fused proteins comprising IFN-α and a cytoplasmic transduction peptide (CTP)
WO2017027063A1 (en) * 2015-08-10 2017-02-16 Yanping Kong Method and compound for treatment of cancer using phosphorous-32 labeled dna
CN107604062A (zh) * 2017-09-01 2018-01-19 北京启辰生生物科技有限公司 一种用于肝癌免疫治疗的多抗原检测方法
CN110922492B (zh) * 2019-12-18 2022-02-15 重庆医科大学 融合肽、ctp介导的诱导cml细胞免疫应答的dc疫苗及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6534479B1 (en) 1995-01-24 2003-03-18 Martinex R & D Inc. Recombinant alpha-fetoprotein hybrid cytotoxins for treating and diagnosing cancers
US7098306B2 (en) * 1997-02-13 2006-08-29 The Regents Of The University Of California Method and compositions for treating hepatocellular cancer
AU6435398A (en) * 1997-02-13 1998-09-08 University Of California, Los Angeles Prevention and treatment of hepatocellular cancer
US7208576B2 (en) * 1999-01-06 2007-04-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Non-glycosylated human alpha-fetoprotein, methods of production, and uses thereof
EP1253930A4 (en) * 2000-02-10 2003-05-21 Univ California METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING HEPATOCELLULAR CANCER
KR100647847B1 (ko) 2005-05-27 2006-11-23 크레아젠 주식회사 인간 전립선암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래전립선암 면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101518972B1 (ko) * 2014-08-01 2015-05-18 제이더블유크레아젠 주식회사 수지상세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 수지상세포 및 그 용도
WO2016018053A1 (ko) * 2014-08-01 2016-02-04 제이더블유크레아젠 주식회사 수지상세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 수지상세포 및 그 용도
US10478479B2 (en) 2014-08-01 2019-11-19 Jw Creagene Inc. Method for preparing dendritic cell, dendritic cell prepared thereby, and use thereof
WO2016060407A1 (ko) * 2014-10-17 2016-04-21 동국대학교 산학협력단 Emp2 유전자가 결여된 폐암 유발 동물모델의 제조방법 및 이의 용도
CN112674028A (zh) * 2020-12-30 2021-04-20 汉姆德(宁波)智能医疗科技有限公司 促诱癌剂诱发动物癌症模型建立的方法
CN112674028B (zh) * 2020-12-30 2022-06-28 汉姆德(宁波)智能医疗科技有限公司 促诱癌剂诱发动物癌症模型建立的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008143400A1 (en) 2008-11-27
EP2145013A4 (en) 2012-03-07
CN101680016A (zh) 2010-03-24
JP2010527234A (ja) 2010-08-12
KR100900742B1 (ko) 2009-06-08
EP2145013A1 (en) 2010-01-20
US20100235932A1 (en) 2010-09-16
CN101680016B (zh) 2012-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7086043B2 (ja) Ｍｕｃ１－ｃ癌タンパク質のｈｌａ－ａ２４アゴニストエピトープ及び組成物及び使用方法
FI121710B (fi) Melanooma-antigeeni
FI123050B (fi) Melanooma-antigeeni
KR100900742B1 (ko) 인간 간암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래 간암면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법
JP5291641B2 (ja) 癌抗原及びその利用
Monji et al. Identification of a novel human cancer/testis antigen, KM-HN-1, recognized by cellular and humoral immune responses
US7846651B2 (en) Epitope/peptide recognized by HLA-A2402-restricted Ep-CAM-specific CTL and use of the same
JP6112171B2 (ja) 免疫誘導剤
JP5114403B2 (ja) Ｈｌａ−ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なｓａｒｔ３由来ペプチド
EP2938354A1 (en) Method for preparing an immunogenic lysate, the lysate obtained, dendritic cells loaded with such lysate and a pharmaceutical composition comprising the lysate or the dendritic cells
KR20120119538A (ko) 폴로-유사 키나아제 1의 종양항원 단백질 또는 유전자
KR100647847B1 (ko) 인간 전립선암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래전립선암 면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법
KR20040104464A (ko) 종양을 치료하기 위해 사용되는 세포 항원을 코딩하는뉴클레오티드 서열의 캐리어로서 기능하는 미생물
CN106350578A (zh) Ny-eso-1在微卫星不稳定性肠癌的诊断和治疗中的应用
KR100647844B1 (ko) 인간 전립선암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래전립선암 면역치료제의 예방 효능을 분석하는 방법
Fukui et al. Anti-tumor activity of dendritic cells transfected with mRNA for receptor for hyaluronan-mediated motility is mediated by CD4+ T cells
JP5279063B2 (ja) Ｈｌａ−ａ２拘束性抗原ペプチドおよびその用途
JPWO2003008450A1 (ja) 腫瘍抗原
EP4317441A1 (en) Novel recombinant strain of mycobacterium smegmatis and use of same
KR101203979B1 (ko) Ｒｎａ 전이 항원 제시 세포를 이용한 신규 종양항원의 규명 방법
JP2009035534A (ja) Ｈｌａ−ａ２４拘束性抗原ペプチドおよびその用途
JPWO2017170338A1 (ja) 免疫誘導剤
Minkis Construction of an optimal immunogen using mRNA transfected dendritic cells
WO2003104259A2 (en) PEPTIDES PRESENTED BY HLA-B18 AND Cw16 MOLECULES, AND USES THEREOF
JP2008260689A (ja) Ｈｌａ−ａ２４分子結合性副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを含有する医薬組成物

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130528

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140528

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160309

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170421

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180510

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190514

Year of fee payment: 11