KR20080099636A - 유해 활성산소 소거효과가 있는 참당귀 추출물의 추출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유해 활성산소(free radical) 소거 효과가 있는 참당귀 추출물의 추출방법에 관한 것이다.
유해 활성산소(free radical) 소거효과가 있는 참당귀 추출물은 그 주성분이 데커신과 데커시놀 안젤레이트가 90% 이상으로 구성된 액체 농축물이며, 본 발명은 참당귀 추출물은 인체에 투여 가능한 형태로 물과 에탄올로만 추출하였고, 또한 고 순도를 위하여 온도와 용해도 차이를 이용한 정제방법을 이용한 것이다.
Angelica gigas Nakai, Decursin, Decursinol angelate, antioxidant, free radical
Description
도1는 추출 정제된 96% 순도의 참당귀 추출 농축 정제물
도2은 참당귀(Angelica gigas Nakai)에서 추출 분리 정제한 데커시놀, 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 HPLC분석자료 및 구조
참당귀는 한국이 원산지로서 그 사용 범위가 보혈제로서 한방약제로 이용되어져 왔으며 최근에는 한국산 지표물질인 데커신과 주요 성분인 데커시놀이 혈류개선 작용과 항 헬리코박터 작용이 있다고 보고되어 있으며 본 발명자 등이 밝힌 순수 정제된 데커신이 신장독성 억제와 당뇨합병증에 의한 신부전증의 예방 효과 및 당뇨성 고혈압에 효과가 있음을 동물실험을 통하여 밝힌 바 있다.
(PCT/ KR99 /00632).
"강" 등이 밝힌 참당귀 추출물의 항산화 효과에 대한 연구결과가 발표되었는데 이 경우에는 열수 추출물을 사용한 추출물의 항산화 효과와 70%메탄올을 사용하여 3회추출하여 단순 농축하여 사용한 사례가 발표되어 있다. ( 한국식품영양과학회지, Vol.33, No.7, page 1112~1118, 2004년, 2004년 대한지역사회영양학회 춘계학술대회 poster 발표 )
“강 ” 등의 연구결과는 열수 추출물 또는 70% 메탄올 추출물을 단순 농축하여 항산화 효과를 실험한 것으로 그 결과는 참당귀 열수 추출물 1mg/ml의 free radical 소거효과는 66.3%이며 , 70%메탄올 추출물 1mg/㎖의 소거효과는 81.5%로 보고되어 있으나 약효성분에 대한 분석결과는 표시되지 않았다. 즉 Decursin과 Decursinol angelate를 고 정제하여 실험한 것은 아니다.
그리고 본 발명자는 기존의 방법보다 간편하고 추출량을 다량 확보할 수 있는 농축 방법을 확보하여 제조하였고 이것을 액제로 제조하여 실험동물에 경구적으로 투여 할 때 장관에서 용이하게 흡수되는 것을 확인 할 수 있었다.
데커신과 데커시놀 안젤레이트는 구조 이성질체로서 현재까지 잘 알려져 있지 않았으나 본 발명자 등이 그 작용을 연구하여 왔으며 그 분석법에 관한 것도 확립하여 밝힌바 있다.(한국특허 등록번호:0509843)
데커신은 실온에서 고체로 존재할 수 있으나 데커시놀 안젤레이트는 영하 70도에서도 액체로 존재하며 참당귀에서는 데커신과 데커신놀 안젤레이트의 비율이 약 3 : 2정도 인 것으로 본 발명자 등이 이미 밝혔으며, 본 연구를 통하여 정제 후 Mass분석을 통한 정확한 함량 및 비율을 살펴본 결과 추출물(100%) 중 Decursin 50~54.5%, Decursinol angelate 40~42%, Decursinol 0.1~0.3%, 데커시놀 유도체 약 2~3%, 기타 1~2%로 구성된 정제물질을 확보하였다.
이런 결과는 기존의 데커신과 데커시놀 안젤레이트의 비율이 60대 40 즉 3 : 2의 비율과 약간의 차이를 보이는 평균 57 : 43 비율을 나타내었다. 또한 데커신류의 함량은 90%이상으로 기대이상의 결과를 도출하였다. 기존의 알콜 추출방법이나 70%알콜 추출방법으로는 참당귀에 존재하는 데커신의 함량이 추출 농축액의 35%내외인 것으로 알려져 왔고 그 양이 50%를 넘지 않았지만 본 연구자의 결과로서 99%이상의 주정 알콜 및 약전 에탄올을 사용하였을 때 그 농축된 함유량이 높게 나와 최대 75% 이상 88%까지 함유하는 결과를 도출한 바 있다. (한국특허 등록번호:0509843)
본 연구는 기존방법을 개선하여 온도와 용해도 차이를 이용하여 순도를 높이는 방법을 개발하고자 하였다.
본 발명은 유해 활성산소(free radical) 소거에 탁월한 효과가 있는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 유효성분으로 하는 참당귀추출물을 의약품이나 식품에 직접 사용할 수 있는 실용성이 있는 에탄올을 이용하여 순도 90%이상의 고 순도물로서 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 함유하는 참당귀 추출농축물을 생산하는 방법을 제공하는 것에 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 이미 개발된 정제법을 개선하여, 이번에 개발된 정제법은 주성분함량이 90%이상을 가질 수 있도록 에탄올과 물 그리고 온도, 용해도를 이용하여 참당귀 추출농축물을 생산하는 것을 특징으로 하며, 또한 본발명은 이렇게 해서 생산된 참당귀 추출농축물이 유해 활성산소(free radical) 소거에 탁월한 효능을 가지며 안정성면에서 우수한 항산화제(anti oxidant)로서 이용하는 것을 특징으로 한다.
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기존의 정제방법으로는 90% 이상의 정제를 위해서는 유기용매 등을 사용해야하는데 유기용매는 잔류성이나 독성 및 역한 냄새가 존재하나 이번에 개발된 방법은 이런 문제를 발생시키지 않는 간단하면서도 경제적인 방법이며 정제 후 식품용이나 의약품용으로 직접 사용가능하다. 참당귀 추출 농축 정제 혼합물인 데커신 및 데커시놀 안젤레이트와의 병용 사용에 의해 효과적으로 유해 활성산소(free radical)을 제거할 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명에서 주장하는 것은 의약품이나 식품에 직접 사용할 수 있는 실용성이 있는 에탄올을 이용하여 순도 90%이상의 고 순도물로서 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 함유하는 복합물을 제조하여 이용하는 것이다. 또한 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 유효성분으로 하는 참당귀추출물을 이용하여 항산화효과 등이 탁월하고 안전성면에서도 우수하여 항산화제(anti oxidant)로 사용하고자 한다.
일반적으로 한국산 참당귀 (Angelica gigas Nakai)의 주요 성분인 데커신 (decursin), 데커시놀 안젤레이트 (decursinol angelate), 데커시놀 (decursinol), 및/ 또는 이들을 2종 이상 포함하는 당귀추출물의 효과에 대하여는 많은 연구가 있어 왔는데, 참당귀 (Angelica gigas Nakai)로부터의 추출물은 전통적으로 빈혈치료, 진정제, 진통제 등으로 사용되어져 왔다.(D.J. Jung, A. Porzel, S. Huneck, Gigasol and other coumarins from Angelica gigas. Phytochemistry, 30, 710-712, 1991)
큐마린 유도체인 데커신과 데커시놀 안젤레이트의 다양한 생리활성이 보고되고 있음에도 불구하고 이들의 체내동태에 대한 정보가 부족한 이유는 보다 순수하게 분리 정제하는 기술이 보유되지 않았고, 혈중에서의 정량법의 개발이 어려웠기 때문이라 사료된다.
세포내에서 발생하는 유해 활성산소(free radical)가 지질, 단백질, 핵산 등의 생체 분자들을 변화시켜 노화현상을 초래한다. 이러한 유해 활성산소(free radical)는 정상적인 대사과정에서도 소량 생성되며, 흡연, 세균감염, 공해, 질병상태나 과도한 스트레스, 자외선 노출 시 과잉으로 생성될 수 있다. 이렇게 체내에서 과잉으로 생성된 유해 활성산소(free radical)는 생체의 항산화방어 메카니즘을 깨트려 지질과산화, DNA 변형, 병리 생리학적인 이상상태를 초래한다. 따라서 이러한 항산화 메카니즘을 견고히 하는 것은 결국 건강을 유지하고 노화를 지연시킨다고 볼 수 있다.
본 발명에서 실시한 참당귀 추출농축물의 유해 활성산소(free radical) 소거작용을 조사하였다. 그 결과 참당귀 추출농축물은 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 에탄올 농도의 50%를 감소시키는데 필요한 시료농도 (SC50)가 0.047 중량%정도였고 이것은 항산화 효과가 뛰어나다고 알려진 상황버섯 추출물(특허 등록공고 제10-0206538호)의 SC50 값이 0.23 중량%인 것과 chondroitin (Purity 90%) (특허 등록공고 제 10-0365242)의 SC50 값이 0.56 중량%인 것과 약콩 사포닌 (특허 등록공고 제 10-0566857)의 SC50 값이 약 0.34 중량%인 것과 비교해 매우 우수한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 결과로 참당귀 추출농축물의 항산화 효과는 다른 어떤 물질보다도 우수하였다.
(
실시예
)
이하, 본 발명의 실제 실험 예를 상세히 설명한다.
이하의 실험 예에서는 참당귀로부터 주성분 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 90%이상 더욱 바람직하게는 95%이상 함유토록 하는 추출방법에 관한 것과 이 추출물을 이용하여 항산화 활성에 대한 시험결과를 예시한 것이다.
[
실시예
1]
데커신의
용해도 산출
순수하게 합성 정제된 데커신을 이용하여 용해도를 산출하였다. 데커신 100 mg을 60% 에탄올 10㎖에 투입 후 잘 섞어주고 녹지 않은 물질을 10,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 침전시키고 상등액을 제거한 후 침전한 물질의 양을 계산하였다. 100 mg에서 침전된 양을 빼주어 계산한 결과로서의 용해도가 6.6 mg/㎖ (60% 에탄올)임을 밝혔다. 또한 같은 방법으로 산출한 100% 에탄올에서의 용해도가 약 4,870 ㎎/㎖ 내외임을 밝혔다. 이 특성을 이용하여 재결정에 사용하여 순도를 높이는데 이용하였다.
[
실시예
2] 고 함유
농축물
제조 방법
참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 분리 농축하는 방법으로서 한국산 및 북한산 당귀인 참당귀를 이용하여 실시하였다. 중국 원산지, 일본 원산지, 베트남 원산지의 경우에는 함량이 적어 경제적으로 가치가 없다.
식품용 및 의약용으로 사용키 위하여 추출 용매는 약전 에탄올 및 주정 알콜을 사용하였고 물을 사용할 때는 정제수를 사용하였다. 원료인 참당귀를 40메시 (40 mesh)이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5% 이하로 건조하고 약전용 알콜 또는 주정알콜 (이하 ‘에탄올’로 표기)로 분쇄 참당귀의 2배에서 4배를 첨가하여 12시간이상 충분히 추출하였고 이것을 여과하여 정량하였다. 이 경우에는 농축물에 함유된 데커신과 데커시놀 안젤레이트의 함량이 33% 이었다.
이 농축물을 증발 건고하여 점성이 높은 물질을 얻었다. 이 물질 1 킬로그람당 에탄올 1리터를 넣어 주성분을 녹이고 영하 20도에서 10시간 방치하여 생성된 침전물을 원심분리하여 제거 후 상등액을 얻었다. 상등액을 증발건고하여 농축물을 얻었다.
이 농축물에 60% 에탄올(희석 에탄올) 50 리터을 넣어 용출하였다. 이 경우에 농축물에 함유된 데커신과 데커시놀 안젤레이트는 330그람으로 60% 에탄올 50 리터에 녹을 수 있는 주성분의 량 또한 330 그람인 것을 이용하였다.
용출 후 원심분리하여 60% 에탄올 층만을 얻었다. 이것을 증발건고하여 농축물을 얻을 수 있었다. 이것을 99% 알코올에 녹여 상등액을 취하여 최종 농축물을 얻었다. (도1참조)
이것을 액체크로마토그램 (HPLC)으로 분석한 대표적인 결과는 다음과 같으며 함량은 데커신 54.52%, 데커시놀 안젤레이트 41.26%, 데커시놀 0.299%로 총 함량은 96%를 보였고 데커신 유도체가 2.5%를 보였다. 확정시험은 Mass spectrophotometer를 이용하여 분자량으로 하였다. 각각의 분자량은 MW 328.35, MW 328.35, MW 246.25 이었다. (도2 참조)
[실시예 3] 유해 활성산소(free radical) 소거 효과
실시예 2에서 추출 정제한 참당귀 추출물을 이용하였다. 즉 96%의 순도를 갖는 데커신, 데커시놀 안젤레이트, 데커시놀을 주성분으로 하는 참당귀 추출물을 이용하였다. 유해 활성산소 소거 작용효과를 관찰한 것이다.
0.2 mM 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ethanol용액 0.5 ㎖ 에 에탄올을 용매로 하여 조제한 여러 농도의 시료를 1 ㎖ 넣 고 37℃에서 30분간 방치 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 유해 활성산소(free radical) 소거능력과 유해 활성산소(free radical)을 50% 감소시키는 농도 (SC50)은 아래식과 같이 구하였다. (시료의 유해 활성산소(free radical) 소거능력은 유해 활성산소 소거활성(scavenging activity, SC50)으로 표시할 수 있으며, 여기서 SC50은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 농도가 50% 감소하는데 필요한 시료의 농도로 나타난다)
본 실시예에서 SC50은 0.047중량% 로 나타났다 (표1). SC50의 수치는 DPPH Inhibition ratio (%) 의 값이 50%를 보이는 지점을 의미한다.
이것은 항산화 효과가 뛰어나다고 알려진 상황버섯 추출물(특허 등록공고 제10-0206538호)의 SC50 값이 0.23 중량%인 것과 chondroitin (Purity 90%) (특허 등록공고 제 10-0365242)의 SC50 값이 0.56 중량%인 것과 약콩 사포닌 (특허 등록공고 제 10-0566857)의 SC50 값이 약 0.34 중량%인 것과 비교해 매우 우수한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 결과로 참당귀 추출농축물의 항산화 효과는 다른 어떤 물질보다도 우수하였다.
<표 1>
* DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) Inhibition ratio (%)
= [1- (E -B)/ C] x 100
. B (Blank) - EtOH 0.5 ㎖ + test sample 1 ㎖
. C (Control) - 0.2 mM DPPH 0.5 ㎖ + solvent 1 ㎖
. E( Experimental) - 0.2 mM DPPH 0.5 ㎖ + test sample 1 ㎖
이상 상기 실시예를 통하여 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명이 제공하는 참당귀(Angelica gigas Nakai)에서 정제된 농축물은 고순도 정제물로서 에탄올과 물만을 사용한 정제법으로 의약품 또는 식품으로 개발할 때 매우 유용한 것이며, 고순도의 데커신과 데커시놀 안젤레이트를 주성분으로 함유토록하기 위하여 온 도에 따른 용해도의 차이 및 에탄올과 물의 혼합비율에 따르는 용해도 차이를 이용하여 고 순도 물질을 얻었다. 참당귀(Angelica gigas Nakai)에서 정제된 농축물( 데커신, 데커시놀 안젤레이트 , 데커시놀 )은 유해 활성산소(free radical) 소거작용을 통한 항산화제(anti oxidant)로서 산업상 이용이 가능한 유용한 발명이 될 것이다.
Claims (7)
- 에탄올과 물을 용매로 사용하고 온도와 용해도 차이를 이용하여 데커신, 데커시놀, 데커시놀 안젤레이트를 주성분으로 하는 참당귀 추출농축물의 생산방법
- 제 1항에 있어서, 상기 참당귀 추출농축물이란 데커신, 데커시놀 안젤레이트, 데커시놀을 순도 90% 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 참당귀 추출농축물의 생산방법
- 제2항에 있어서, 상기 참당귀 추출농축물이란 데커신, 데커시놀 안젤레이트, 데커시놀을 순도 95% 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 참당귀 추출농축물의 생산방법
- 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참당귀 추출농축물은 유해 활성산소(free radical) 소거 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 참당귀 추출농축물의 생산방법
- 제4항에 있어서, 상기 참당귀 추출농축물은 유해 활성산소(free radical) 소거작용 50%(SC50)이 0.047중량%를 나타내는 것을 특징으로 하는 참당귀 추출농축물 의 생산방법
- 제 1항에 있어서, 상기 참당귀 추출농축물의 생산방법은원료인 참당귀의 2배에서 4배의 에탄올을 첨가하여 진탕하에서 추출하고 농축하여 점성이 높은 물질을 얻는 단계 ;이 물질을 에탄올로 주성분을 녹이고 영하의 온도에서 방치하여 생성된 침전물을 제거하여 상등액을 얻고 상등액을 증발건고하여 농축물을 얻는 단계 ;이 농축물에 주성분의 용해도를 이용하여 물로 희석된 에탄올을 사용하여 가용화 시키는 단계 ;희석 에탄올에 녹지 않는 불순물을 원심분리하여 제거하는 단계 ;희석 에탄올층을 취하여 증발 건고하는 단계:증발건고된 물질을 에탄올에 녹여 상등액을 취하는 단계 :이 상등액을 재 증발건고하여 주성분인 데커신과 데커시놀 안젤레이트 혼합물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 참당귀 추출농축물을 생산하는 방법
- 제 1항에 있어서, 상기 참당귀 추출농축물의 생산방법은,원료인 참당귀를 40메시(mesh)이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5%이하로 건조하고 분쇄한 참당귀에 분쇄 참당귀의 2배에서 4배의 에탄올을 첨가하여 진탕하에서 추출하고 농축하여 점성이 높은 물질을 얻는 단계 ;이 물질 1 킬로그람당 에탄올 1리터를 넣어 주성분을 녹이고 영하 20도에서 10시간 방치하여 생성된 침전물을 원심분리하여 제거한 후 상등액을 얻고 상등액을 증발건고하여 농축물을 얻는 단계 ;이 농축물에 주성분의 용해도를 이용하여 물로 희석된 에탄올(60% 에탄올)을 사용하여 가용화 시키는 단계 ;희석 에탄올(60% 에탄올)에 녹지 않는 불순물을 원심분리하여 제거하는 단계 ;희석 에탄올층을 취하여 증발 건고하는 단계:증발건고된 물질을 99% 에탄올에 녹여 상등액을 취하는 단계 :이 상등액을 재 증발건고하여 주성분인 데커신과 데커시놀 안젤레이트 혼합물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 참당귀 추출농축물을 생산하는 방법
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